WO2008119855A1 - Procedimiento de obtención de estructuras tridimensionales para ingeniería tisular - Google Patents

Procedimiento de obtención de estructuras tridimensionales para ingeniería tisular Download PDF

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WO2008119855A1
WO2008119855A1 PCT/ES2008/000191 ES2008000191W WO2008119855A1 WO 2008119855 A1 WO2008119855 A1 WO 2008119855A1 ES 2008000191 W ES2008000191 W ES 2008000191W WO 2008119855 A1 WO2008119855 A1 WO 2008119855A1
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albumin
scaffold
tissue
tissue engineering
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Alvaro Meana Infiesta
Eva Garcia Perez
Veronica Garcia Diaz
Jose Luis Jorcano Noval
Marcela Del Rio Nechaevsky
Fernando Larcher Laguzzi
Blanca Duarte Gonzalez
Almudena Holguin Fernandez
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Centro Comunitario De Sangre Y Tejidos De Asturias
Centro De Investigaciones Energeticas, Medioambientales Y Tecnologicas
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Definitions

  • the present invention pertains to the field of tissue engineering specifically refers to a method for obtaining three-dimensional structures for tissue engineering and to the structures obtained by said method.
  • the invention also relates to an ex vivo method for regenerating a tissue using the three-dimensional structures of the invention and the use of the structures thus treated for transplantation to the area to be regenerated by the patient.
  • Cells are an indispensable element in the production of new tissues.
  • the cells constitute the living component of the tissues and are the ones that perform the biological functions characteristic of it (for example
  • the technology of cell culture allows us, from a small number of cells present in a fragment of healthy tissue, to increase their number in logarithmic proportions without these cells losing their characteristics. It also allows us in some cases to transfer cells (for example from fat cells to bone cells) or even orienting undifferentiated cells towards cells of a specific tissue (from embryonic cells to insulin producing cells).
  • tissues cannot be manufactured, since in these cells they are distributed in a three-dimensional structure and this spatial distribution is critical for the development of the function of the organ or tissue .
  • This three-dimensional structure Ia provides the extracellular matrix of the tissues.
  • This matrix is not only a structure to support the cells, but also has adhesion motifs so that the cells are properly fixed.
  • the extracellular matrix is produced and destroyed in a coordinated manner by the cells that make up the organ or tissue. For this reason, in most tissue engineering models, it is necessary to provide previously cultured cells with a structure or support (scaffolds in English literature) so that once introduced into it and placed in three dimensions, the cells begin to behave in the most physiological way possible (Godbey WT and Atala A. Ann NY Acad Sci. 961: 10-26, 2002).
  • the "scaffold” must not only provide a three-dimensional structure, it is necessary that the cells be able to adhere to it.
  • the base product of the "scaffold” must not contain substances toxic to the cells. It also requires other characteristics such as mechanical resistance (variable according to the organ or tissue to be reconstructed) or the degradation capacity.
  • the ideal “scaffold” must be degraded and allowed to be replaced by the normal extracellular matrix of the corresponding tissue.
  • the “scaffold” must have a structure that allows cells to access inside, so that most of these structures are made of porous materials. Many substances have been used as "scaffolds" in Tissue Engineering, this gives us an idea of the complexity of the needs that an ideal "scaffold” must have.
  • biopolymers have been widely used as "scaffold”. These include poly (alpha-hydroxy acids) (Kulkarny et al, Arch Surg, 93: 839-843, 1993) such as polyglycolic (PGA) or poly-L-lactic acid (PLLA) or combinations of both substances (PLGA ).
  • PGA polyglycolic
  • PLLA poly-L-lactic acid
  • scaffold Another possible source of scaffold is the compounds that in mammals are the basis of the extracellular matrix, the clearest example is the use of type I collagen gels for the development of Tissue Engineering models (Maraguchi et al, Plast Reconstr Surg, 93 : 537-544, 1994). Another substance widely used as scaffold is the fibrinogen present in the plasma
  • albumin A biological product widely used in therapeutics is albumin. Human albumin or another mammalian species is obtained from plasma. Albumin is normally used in venous infusion, although it has also been used as a biological glue, mixing it with a cross-linking product that comprises an aldehyde, usually glutaraldehyde. This mixture used in therapeutics produces a tissue adhesive used in surgery and described in the application WO 2005/00925.
  • the glutaraldehyde that remains in the structure is very toxic to the cells and cells seeded on the surface of the albumin-glutaraldehyde compounds, turn badly and / or die.
  • a possibility to place cells inside is to mix the albumin with the cells prior to the use of the crosslinking solution, however this is not possible due to the toxicity referred to above.
  • the development of scaffolds or supports for Tissue Engineering from globular proteins such as albumin requires other systems that eliminate the toxicity of the cross-linking substance, provide a porous structure and if possible include in the same motifs that favor the anchoring of cells .
  • a first object of the present invention is a process for obtaining non-toxic three-dimensional structures, for the development of tissue engineering models, from globular plasma proteins (clearly albumin), cross-linked by a crosslinking agent (preferably glutaraldehyde).
  • the protein-crosslinker mixture will be frozen and subsequently subjected to lyophilization. Once lyophilized, the resulting product must be hydrated so that it has strength and elasticity. Hydration is carried out through the use of ethanol in decreasing concentrations. Finally, the excess ethanol is washed in culture medium or balanced saline. This results in a flexible, porous support, which can be easily cut without breakage.
  • a second object of the invention is the three-dimensional or scaffold structure obtainable by the procedure referred to above.
  • the structure or scaffold thus designed can be used after planting with different cell types in a method to regenerate damaged tissue or organ ex vivo.
  • the cells adhere to this structure and are capable of growing and / or differentiating, starting the synthesis of proteins from the extracellular matrix.
  • the scaffold of the invention with the cells inside it can be transplanted into a living being, where the immune response will produce a progressive reabsorption of the scaffold and the cells will produce the normal extracellular matrix of the tissue.
  • the final result will be the repair of an organ or tissues damaged by Tissue Engineering.
  • Figure 1 The image represents the support or scaffold of the invention observed in the scanning microscope (X500) made from albumin at 20% (left) and a histological section thereof (right).
  • Figure 2 Adhesion of human fibroblasts to a support or scaffold made directly with human plasma. To the right expression of type I collagen (the most important extracellular protein of the dermis) by these fibroblasts.
  • type I collagen the most important extracellular protein of the dermis
  • Figure 3 preadipocytes extracted from rabbit subcutaneous fat, seeded on a structure made directly with rabbit serum. The cells were grown 45 days in an oven in adipogenic medium
  • Figure 4 three-dimensional structure according to the invention observed with scanning electron microscope (X200). On the right support made with 5% albumin and on the left with 20% albumin.
  • Figure 5 Image taken by scanning microscope (X4000). Surface of the different supports. Above and to the left, albumin 20%, to the right support directly made with serum. Down. Support made from plasma.
  • Figure 6 Scheme of a prototype of the support of this invention inside an artificial dermis based on plasma and fibroblasts.
  • the support provides the dermis based on fibrin and fibroblasts a consistency that facilitates the transplantation thereof.
  • Figure 7 Structure of a three-layer skin: in the lower part differentiated adipocytes on the scaffold of this invention, in the middle part fibroblasts in plasma gel and in the upper keratinocytes. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION.
  • the invention relates to a process for obtaining three-dimensional structures for tissue engineering comprising:
  • the source of albumin can be a purified albumin preparation or it can be albumin directly obtained from the patient's own serum or plasma to which the structure or scaffold will subsequently be implanted with the cells.
  • the fact that the patient's own serum or plasma is used has the advantage that the immune response of rejection to the implant will be minimized.
  • the use of plasma or serum of the patient against albumin preparations has the advantage that it provides more reasons for binding or anchoring to the cells that will subsequently be sown in the structure of the invention, since it does not only present the reasons of albumin but the rest of proteins present in the blood.
  • concentration of albumin used for the elaboration of the three-dimensional structures of the invention will depend on the application that will be given to it, that is, on the type of tissue that is intended to be regenerated. Generally, concentrations of 1-50% albumin can be used.
  • crosslinking agent anyone producing the effect of denaturing and crosslinking albumin molecules although the use of aldehyde-like agents such as formaldehyde or glutaraldehyde is preferred. The latter is especially preferred.
  • concentration of the crosslinking agent used in the mixture with the source of albumin may be 0.1-9%, preferably 0.5-7.5%.
  • the reaction of the albumin-crosslinking agent mixture in a mold with a predetermined shape allows the resulting structure to become solid in the mold. In this way, the shape of the structure can be adapted to the defect that is to be replaced or of the damaged tissue that is to be regenerated.
  • a key step of the invention is carried out. This step involves subjecting the solid structure obtained after crosslinking and freezing to lyophilization.
  • the lyophilization produces the cancellation of the toxic effect of the crosslinking agent but also produces a material of wide porosity, since we eliminate all of the aqueous fraction of the scaffold (at the same time the crosslinking agent not fixed to the globular protein is eliminated).
  • the product thus obtained is very friable and does not offer sufficient mechanical resistance for its use. To improve these characteristics, this lyophilized product must be hydrated. This hydration should be performed preferably, slowly and progressively to avoid breakage. The hydration will be carried out by treatment with alcohols in descending graduation, preferably by means of immersion in absolute alcohol, alcohol of 96 °, 90 °, 80 °, 70 ° and 50 °. The structure obtained after the hydration will be washed in culture medium or in a balanced salt solution to eliminate the remaining alcohol residues. The final result of this procedure, which is also the object of the invention, is a porous, elastic, non-toxic three-dimensional structure (Figure 1) in which cultured cells that are capable of adhering to the scaffold of the invention can be sown.
  • Figure 1 three-dimensional structure in which cultured cells that are capable of adhering to the scaffold of the invention can be sown.
  • the scaffold or three-dimensional structure with these cells seeded inside it either by agitation, intermittent agitation or in a bioreactor, can be maintained "in vitro" in cell culture stoves or bioreactors. During this period, the cells can continue to grow, behave in a physiological way ( Figure 2) and according to the growth or differentiation factors present in the culture medium, express the complete phenotype of the sown cell line or be differentiated towards cells of other types of tissues (figure 3). This growth and / or differentiation is carried out without showing a degradation of the structural part of the scaffold of the invention, even for periods of up to 6 months of "in vitro" culture.
  • the sown and cultured and / or differentiated cells are osteoblasts, preadipocytes, chondrocytes or dermal fibroblasts.
  • the product of the invention thus manipulated which is also object of the invention can be transplanted into a living being, where the structure caused by the cross-linking of the albumin will be degraded by the individual's immune system, the cells provided will continue with the production of extracellular matrix that will slowly replace the protein structure initial.
  • the result of this transplant will originate as a final product a new tissue or organ capable of replacing the damaged part, the final objective of the Tissue Engineering processes.
  • the basis of the product of the invention are globular plasma proteins crosslinked with an aldehyde-like substance.
  • Albumin is the main plasma protein and is the structural basis of the product and can be used at different concentrations with different structural results (between 50 and 4%) ( Figure 4).
  • the cross-linking substance for example glutaraldehyde, can also be used at different concentrations, between 0.5 and 7.5% with respect to the volume of albumin.
  • the product After mixing, it is deposited in a mold and rapid solidification occurs.
  • the product is demoulded and subjected to a slow and progressive freezing. Once the product has been frozen, it is freeze-dried, when it is finished the product of this invention has a porous appearance but is extremely friable and breaks under minimal force.
  • the product is introduced in absolute ethyl alcohol (between one and eight hours depending on the size of the structure), then it is introduced in 96 °, 90 ° and 80 ° alcohol, during the same period of time. After step due to the 80 ° alcohol the physical characteristics of the product change, the product is more elastic, the pores are more visible and can be cut into thin sheets.
  • the hydration of the product is continued, leaving it in 70 ° alcohol for 24 hours, 50 ° alcohol and from here in culture medium (DMEM, RPMI ...) or balanced salt solutions.
  • the saline solution is changed at least 3 times to eliminate all the alcohol residues present.
  • the final product is an elastic sponge in which the pores can be seen clearly. This product can be stored in the culture medium for months without losing its functional capacity.
  • the scaffold Once the scaffold is achieved, it can be stored without losing its characteristics, leaving it in the middle of culture, or it can be used. For it the cells of the tissue to be regenerated are sown. For sowing various strategies can be followed (agitation, intermittent agitation, bioreactor ).
  • the scaffold seeded with the cellular component will then remain in the oven or bioreactor until the moment of implantation. This period of time will vary greatly depending on the type of cell used and the degree of differentiation required by the cells. During this period it can be seen how the cells are fixed to the scaffold and how they begin to produce the specific proteins of adult tissue. For example, if a scaffold according to the invention fibroblasts are sown and left in a typical growth medium (for example DMEM, 10 fetal bovine serum) it is observed that within a few days of sowing the fibroblasts begin to synthesize type I collagen (figure 2).
  • a typical growth medium for example DMEM, 10 fetal bovine serum
  • the scaffold of this invention is not digested (or minimally done) and retains the three-dimensional structure without alterations in "ex vivo" culture until 6 months after planting.
  • the scaffold of this invention can be transplanted. After transplantation a scaffold always behaves like a foreign body and will generate an inflammatory response. This response should be moderate and produce a gradual and controlled degradation of the foreign material.
  • the studies "in vivo" with the scaffold of this invention show a very moderate degradation without objectifying a large inflammation in the area of the transplant. While the structure of the original scaffold is degraded, the integration of the new extracellular matrix produced by the cells seeded in the scaffold occurs, generating a new tissue that can reproduce the functions of the originally damaged tissue.
  • the scaffold of this invention allows a series of advantages that clearly differentiate it from what was previously known in the state of the art:
  • the original product is very easy to obtain (albumin concentrates) or whole blood (venipuncture).
  • the possibility of constructing a support for tissue engineering from small amounts of whole blood offers us the possibility of obtaining these structures based on autologous biological products, that is, obtained from the patient who will be implanted.
  • Example 1 Preparation of a scaffold to repair an osteoarthritis in a femoral diaphysis with 20% albumin
  • the scaffold type for pseudoarthrosis in a femoral diaphysis has an approximate dimension of 3 cm in diameter by 2 cm in height.
  • 10 ml of 20% human albumin was used, which is usually used in the clinic for infusion.
  • the albumin was mixed with 1 ml of 25% glutaraldehyde and immediately after it was deposited in a mold of the aforementioned dimensions. The mixture was allowed to solidify at room temperature for 30-45 minutes and subsequently placed in an electric refrigerator at -8O 0 C for 18-24 hours.
  • the scaffold was frozen, it was demolished and without defrosting it was introduced into the lyophilizer until the sample was completely lyophilized. After this process, the sample was placed in absolute ethyl alcohol for 2 hours. Then, the scaffold was transferred to 96% ethanol and left for another 2 hours. The 96% ethanol was replaced by 80% ethanol and subsequently by 70% ethanol where it was left at room temperature for 24 hours. After this incubation the scaffold was introduced for 2 hours in 50% ethanol, in sterile pure water and finally in an isotonic solution type PBS, solution of
  • Example 2 Preparation of a scaffold to repair atrial cartilage with patient plasma
  • the size of the scaffold was adjusted to that of the cartilaginous lesion, cutting this for example with a scalpel.
  • the scaffold was ready to be seeded from cells.
  • a small subcutaneous fat biopsy was used as a cellular source.
  • the fat was digested in collagenase and the cells were seeded in a cell culture flask in growth medium (DMEM, 10% fetal bovine serum).
  • DMEM 10% fetal bovine serum
  • the cultured preadipocytes were seeded on the scaffold and left in the middle of bone differentiation, until signs of differentiation towards osteoblast were observed by monitoring. Subsequently, the scaffold and the cells it contained were transplanted to the maxillary defect to be regenerated.
  • Example 5 Regeneration of a deformity of the auricular pavilion A deformity of the auricular pavilion was repaired by using a patient's serum scaffold.
  • the materials and methods are substantially those used in Example 2 although the scaffold hardened on a mold that reproduced the structure of the cartilage of the ear. At the same time a small healthy sample of the patient's atrial cartilage was taken.
  • the scaffold was frozen, lyophilized and hydrated according to the methodology described in example 2.
  • the cartilage was digested undergoing proteolytic enzymes and the chondrocytes obtained were grown until obtaining a sufficient cell mass to be seeded on the scaffold.
  • the chondrocytes After sowing, the chondrocytes underwent a process of redifferentiation by cultivation in an oven (25-45 days) and finally they were transplanted to the injured area. This same strategy could be followed for the repair of an articular cartilage, changing the origin of the chondrocyte source.
  • Example 6 Regeneration of the subcutaneous fatty tissue Blood was taken from the patient, the scaffold was performed in the manner described in example 2 and seeded with preadipocytes cultured from a biopsy of the patient's fatty tissue. Once planted in scaffold, it was grown in the oven in the middle of fat differentiation until the sown cells began to accumulate triglycerides inside. Subsequently, the region to be rebuilt was transplanted.
  • Example 7 Bone reconstruction A scaffold for reconstruction of bone lesions can be developed as in Example 1. However, some bone reconstructions may require greater consistency of the scaffold than that based on plasma or serum, which would be added to plasma or the patient's serum a percentage of human albumin to reinforce the structure, maintaining the cellular anchoring properties. Finally this scaffold could be seeded with patient cells extracted from a bone biopsy or as in example 4 of subcutaneous fat.
  • Example 8 Dermal regeneration after burn
  • the basis of this treatment consisted in the production of small sheets of the scaffold of this invention, seeded from dermal fibroblasts of the patient and transplanted on the site of the lesion.
  • the fibroblasts could be from another healthy patient since the fibroblasts are cells with little power to generate immune rejection.
  • This sheet-shaped scaffold prototype plus dermal fibroblasts can be associated with semipermeable silicone type membranes that They provide a barrier effect and protect the wound and the implant from possible infections.
  • This type of strategy could be used in other skin lesions (ulcers, surgical amputations in the diabetic foot)
  • the scaffold of this invention can also be used as an internal reinforcement structure for other materials already used in tissue engineering.
  • An example of this application is the association of a sheet of the prototype described herein to a plasma sheet containing living fibroblasts.
  • the human plasma containing fibroblasts is sown on a sheet of the scaffold of the invention, calcium chloride is added to coagulate the plasma and the scaffold is inside the plasma serving as an internal framework and facilitating the transplantation of this artificial dermis.
  • keratinocytes are planted on this artificial dermis, an artificial skin is achieved with an internal framework that provides stiffness and facilitates transplantation.
  • Example 10 Artificial skin prototype This prototype can be associated with an artificial skin model defined in example 9 to generate a three-layer cultured skin that incorporates subcutaneous fat.
  • the model that would be obtained would be a lower part with fat cells fixed to the Scaffold of this invention, attached to it an immediately superior layer of plasma with fibroblasts similar to human dermis and in the upper part an epithelial layer (Figure 7), that is to say a human skin with 3 layers much more similar to the natural one than Ia generated with different strategies.

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Abstract

La presente invención pertenece al campo de la ingeniería tisular concretamente se refiere a un método para obtener estructuras tridimensionales para ingeniería tisular y a las estructuras obtenidas por dicho procedimiento. La invención también se refiere a un método ex vivo para regenerar un tejido usando las estructuras tridimensionales de la invención y al uso de las estructuras así tratadas para su transplante a la zona a regenerar del paciente.

Description

PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN DE ESTRUCTURAS TRIDIMENSIONALES PARA INGENIERÍA TISULAR
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención pertenece al campo de Ia ingeniería tisular concretamente se refiere a un método para obtener estructuras tridimensionales para ingeniería tisular y a las estructuras obtenidas por dicho procedimiento. La invención también se refiere a un método ex vivo para regenerar un tejido usando las estructuras tridimensionales de Ia invención y al uso de las estructuras así tratadas para su transplante a Ia zona a regenerar del paciente.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La obtención de un tejido u órgano nuevo que pueda sustituir el dañado es uno de los objetivos de Ia medicina regenerativa. Para ello hay que recurrir a técnicas de Ingeniería Tisular cuya base es Ia reconstrucción del órgano o tejido dañado a partir de pequeños restos de tejido sano (Sipe J et al, Ann N.
Y. Acad. Sci. 961 : xiü-xiv, 2002). A esta tecnología, se ha añadido en Ia actualidad Ia posibilidad de reconstruir un órgano o tejido dañado a partir de células de otros tejidos del organismo o incluso a partir de células embrionarias multipotentes.
Las células son un elemento indispensable en Ia producción de nuevos tejidos. Las células constituyen el componente vivo de los tejidos y son las que realizan las funciones biológicas características del mismo (por ejemplo
Ia producción de albúmina por los hepatocitos, Ia filtración por las células del glomérulo etc). La tecnología del cultivo celular nos permite a partir de un pequeño número de células presentes en un fragmento de tejido sano, aumentar su número en proporciones logarítmicas sin que estas células pierdan sus características. También nos permite en algunas casos transdtferenciar células (por ejemplo de células grasas a células óseas) o incluso orientar células indiferenciadas hacia células de un tejido determinado (de células embrionarias hacia células productoras de insulina). Sin embargo, a pesar de toda esta tecnología desarrollada, con las células aisladas no se pueden fabricar tejidos, ya que en estos las células se encuentran distribuidas en una estructura tridimensional y esta distribución espacial es crítica para el desarrollo de Ia función del órgano o tejido. Esta estructura tridimensional Ia proporciona Ia matriz extracelular de los tejidos. Esta matriz, no es solo una estructura para sostén de las células, sino que presenta motivos de adhesión para que las células queden convenientemente fijadas. La matriz extracelular es producida y destruida de forma coordinada por las propias células que componen el órgano o tejido. Por este motivo, en Ia mayoría de los modelos de ingeniería tisular, es necesario proporcionar a las células previamente cultivadas una estructura o soporte (scaffolds en Ia literatura inglesa) para que una vez introducidas en ella y colocadas en tres dimensiones, las células comiencen a comportarse de Ia manera más fisiológica posible (Godbey WT and Átala A. Ann N. Y. Acad Sci. 961 : 10-26, 2002).
Desgraciadamente no existe tecnología suficiente para producir matrices extracelulares semejantes a Ia de los tejidos adultos. Siendo Ia búsqueda de estas estructuras tridimensionales, soportes, andamiajes o "scaffolds" uno de los campos de investigación más importantes en el campo de Ia Ingeniería Tisular (Griffith L, Ann N. Y. Acad Sci, 961 : 83-95, 2002).
El "scaffold" no sólo debe aportar una estructura tridimensional, es necesario que las células sean capaces de adherirse a él. El producto base del "scaffold" no debe contener sustancias tóxicas para las células. También precisa otras características como Ia resistencia mecánica (variable según el órgano o tejido a reconstruir) o Ia capacidad de degradación. El "scaffold" ideal debe de degradarse y permitir que sea sustituido por Ia matriz extracelular normal del tejido correspondiente. El "scaffold", debe tener una estructura que permita a las células acceder a su interior, por Io que Ia mayoría de estas estructuras se fabrican de materiales porosos. Multitud de sustancias han sido utilizadas como "scaffolds" en Ingeniería Tisular, esto nos da una ¡dea de Ia complejidad de las necesidades que un "scaffold" ideal debe de tener.
Algunos biopolímeros han sido empleados ampliamente como "scaffold". Entre ellos destacan los poli (alfa-hidroxiácidos) (Kulkarny et al, Arch Surg, 93: 839-843, 1993) como es el poliglicólico (PGA) o el poli-L-láctico (PLLA) o combinaciones de ambas sustancias (PLGA).
Otras sustancias de origen biológico utilizadas en el desarrollo de scaffolds son los hialuronatos (Itay S et al, Clin Orthop, 220: 234-300, 1987), los derivados de Ia quitina de las conchas marinas (chitosán) (Prasitsilp et al, J Mat Sci: Mat in Med, 11 : 773-778, 2000) o los alginatos (Fragonas et al, Biomaterials 21 : 795-801 , 2000).
Otra posible fuente de scaffold son los compuestos que en los mamíferos son Ia base de Ia matriz extracelular, el ejemplo más claro es el uso de geles de colágeno tipo I para desarrollo de modelos de Ingeniería Tisular (Maraguchi et al, Plast Reconstr Surg, 93: 537-544, 1994). Otra sustancia muy utilizada como scaffold es el fibrinógeno presente en el plasma
(Gurevitch O et al, Tissue Engineering 8: 661-672, 2002, Meana et al, Burns 621-630, 1998).
Un producto biológico utilizado ampliamente en terapéutica es Ia albúmina. La albúmina humana o de otra especie de mamífero se obtiene a partir del plasma. La albúmina se utiliza normalmente en infusión venosa, aunque también se ha utilizado como pegamento biológico, mezclándola con un producto entrecruzante que comprende un aldehido, generalmente el glutaraldehído. Esta mezcla utilizada en terapéutica produce un adhesivo tisular utilizado en cirugía y descrito en Ia solicitud WO 2005/00925. También esta descrito un modelo en forma de estructura tridimensional basado en albúmina-glutaraldehído, que podría reforzarse mediante Ia inclusión de fibras y/o otros componentes y que podría implantarse en el organismo (WO 00/70018). Otros usos de este modelo descritos en el estado de Ia técnica es el uso como microesferas para dispensación gradual de fármacos (US 4349530). Sin embargo, el uso de esta estructura como "scaffold" o soporte para técnicas de Ingeniería Tisular no ha sido posible ya que es una estructura maciza, sin poros en su interior al que puedan acceder las células. Además, el glutaraldehído no es producto apropiado en Ia preparación de matrices aptas para cultivar células, ya que hace que Ia matriz sea muy poco degradable y tiende a bloquear las proteínas necesarias para Ia adhesión celular (Biopolymer methods in Tissue Engineering, Hollander P y Haltton PV ed., pg. 11 , Humana Press, 2004). El glutaraldehído que resta en Ia estructura es muy tóxico para las células y las células sembradas en Ia superficie de los compuestos albúmina-glutaraldehído, prenden mal y/o mueren. Una posibilidad para situar células en su interior es mezclar Ia albúmina con las células previamente al empleo de Ia solución entrecruzante, sin embargo esto tampoco es posible por Ia toxicidad antes referida. Existe en el estado de Ia técnica una posibilidad para hacer porosa esta estructura, como es Ia mezcla con partículas tipo carbonato calcico (WO 00/70018), sin embargo esto nos obliga a tratar Ia mezcla con soluciones acidas para eliminar las partículas, el glutaraldehído residual permanece y este producto resulta tóxico y poco recomendable como scaffold para el desarrollo "in vitro" de técnicas de Ingeniería Tisular. El desarrollo de scaffolds o soportes para Ingeniería Tisular a partir de proteínas globulares como Ia albúmina, precisa de otros sistemas que eliminen Ia toxicidad de Ia sustancia entrecruzante, proporcionen una estructura porosa y a ser posible incluyan en Ia misma motivos que favorezcan el anclaje de las células.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN.
Un primer objeto de Ia presente invención, es un procedimiento para Ia obtención de estructuras tridimensionales no tóxicas, para desarrollo de modelos de ingeniería tisular, a partir de las proteínas globulares del plasma (netamente Ia albúmina), entrecruzadas por un agente entrecruzante (preferiblemente glutaraldehído). La mezcla proteína-entrecruzante se congelará y posteriormente se someterá a liofilización. Una vez liofilizado, el producto resultante debe ser hidratado para que tenga resistencia y elasticidad. La hidratación se realiza mediante el empleo de etanol en concentraciones decrecientes. Finalmente se lava el exceso de etanol en medio de cultivo o solución salina balanceada. Se origina así un soporte poroso, flexible, que puede ser cortado con facilidad sin rotura.
Un segundo objeto de Ia invención es Ia estructura tridimensional o scaffold obtenible por el procedimiento referido anteriormente.
El Ia estructura o scaffold así diseñado, se puede utilizar tras su siembra con diferentes tipos celulares en un método para regenerar ex vivo el tejido u órgano dañado. Las células se adhieren a esta estructura y son capaces de crecer y/o diferenciarse, comenzando Ia síntesis de proteínas de Ia matriz extracelular.
Finalmente el scaffold de Ia invención con las células en su interior puede ser trasplantado a un ser vivo, donde Ia respuesta inmune producirá una reabsorción progresiva del scaffold y las células producirán Ia matriz extracelular normal del tejido. El resultado final será Ia reparación de un órgano o tejidos dañados mediante Ingeniería Tisular.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1 : Ia imagen representa el soporte o scaffold de Ia invención observado al microscopio de barrido (X500) realizado a partir de albúmina al 20% (izquierda) y un corte histológico del mismo (derecha).
Figura 2: adhesión de fibroblastos humanos a un soporte o scaffold realizado directamente con plasma humano. A Ia derecha expresión de colágeno tipo I (Ia proteína extracelular más importante de Ia dermis) por estos fibroblastos.
Figura 3: preadipocitos extraídos a partir de grasa subcutánea de conejo, sembrados sobre estructura realizada directamente con suero de conejo. Las células fueron cultivadas 45 días en estufa en medio adipogénico
(izquierda, tinción aceite rojo) y medio osteogénico (derecha, tinción de Von Kossa).
Figura 4: estructura tridimensional de acuerdo con Ia invención observada con microscopio electrónico de barrido (X200). A Ia derecha soporte realizado con albúmina al 5% y a Ia izquierda con albúmina al 20%.
Figura 5: Imagen tomada por microscopio de barrido (X4000). Superficie de los diferentes soportes. Arriba y a Ia izquierda, albúmina 20%, a Ia derecha soporte directamente realizado con suero. Abajo. Soporte realizado a partir de plasma.
Figura 6: esquema de un prototipo del soporte de esta invención en el interior de una dermis artificial basada en plasma y fibroblastos. El soporte proporciona a Ia dermis basada en fibrina y fibroblastos una consistencia que facilita el trasplante de Ia misma.
Figura 7: Estructura de una piel tricapa: en parte inferior adipocitos diferenciados sobre el scaffold de esta invención, en Ia parte media fibroblastos en gel de plasma y en Ia superior queratinocitos. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN.
En primer lugar Ia invención se refiere a un procedimiento para obtener estructuras tridimensionales para ingeniería tisular que comprende:
a) mezclar una fuente de albúmina y un agente entrecruzante e introducir Ia mezcla en un molde con Ia forma de Ia estructura que se desee obtener b) congelar lenta y progresivamente Ia estructura sólida obtenida en a) c) liofilización de Ia estructura de b) d) rehidratación progresiva de Ia estructura de c)
En el contexto de Ia invención Ia fuente de albúmina puede ser un preparado purificado de albúmina o puede ser albúmina directamente obtenida del suero o plasma del propio paciente al que posteriormente se Ie vaya a implantar Ia estructura o scaffold con las células. El hecho de que se use el propio suero o plasma del paciente tiene Ia ventaja de que se minimizara Ia respuesta inmune de rechazo al implante. Además el uso de plasma o suero del paciente frente a preparados de albúmina tiene Ia ventaja de que proporciona más motivos de unión o anclaje a las células que posteriormente se sembrarán en Ia estructura de Ia invención, ya que no sólo presenta los motivos propios de Ia albúmina sino del resto de proteínas presentes en Ia sangre.
La concentración de albúmina utilizada para Ia elaboración de las estructuras tridimensionales de Ia invención dependerá de Ia aplicación que se Ie vaya a dar a Ia misma, es decir, del tipo de tejido que se pretenda regenerar. Por Io general, se pueden usar concentraciones de entre 1-50% de albúmina.
Como agente entrecruzante se puede utilizar cualquiera que produzca el efecto de desnaturalizar y entrecruzar las moléculas de albúmina aunque se prefiere el uso de de agentes tipo aldehido como el formaldehído o glutaraldehido. Este último es especialmente preferido. La concentración del agente entrecruzante usado para en Ia mezcla con Ia fuente de albúmina puede estar al 0,1-9%, preferiblemente al 0,5-7,5%.
La reacción de Ia mezcla albúmina-agente entrecruzante en un molde con forma predeterminada permite que al hacerse solida Ia estructura resultante adquiera Ia forma del molde. De este modo se puede adecuar Ia forma de Ia estructura al defecto que se quiera suplir o del tejido dañado que se quiera regenerar.
Después de Ia congelación lenta y progresiva de Ia estructura tridimensional obtenida, preferiblemente a un ritmo de 1o C/min hasta una temperatura de - 70° C, se lleva a cabo un paso clave de Ia invención. Este pasó supone someter Ia estructura maciza obtenida tras el entrecruzamiento y Ia congelación a una liofilización. La liofilización produce Ia anulación del efecto tóxico del agente entrecruzante pero además, produce un material de amplia porosidad, ya que eliminamos Ia totalidad de Ia fracción acuosa del scaffold (al mismo tiempo se elimina el agente entrecruzante no fijado a Ia proteína globular).
El producto así obtenido es muy friable y no ofrece suficiente resistencia mecánica para su utilización. Para mejorar estas características, este producto liofilizado debe ser hidratado. Esta hidratación se debe realizar preferentemente, de forma lenta y progresiva para evitar roturas. La hidratación se realizará mediante el tratamiento con alcoholes en graduación descendente, preferiblemente mediante Ia inmersión en alcohol absoluto, alcohol de 96°, 90°, 80°, 70° y 50°. La estructura obtenida tras Ia hidratación, será lavada en medio de cultivo o en solución balanceada de sal para eliminar los restos de alcohol que pudieran quedar. El resultado final de este procedimiento que es también objeto de Ia invención, es una estructura tridimensional porosa, elástica, no tóxica (figura 1 ) en Ia que pueden sembrarse células cultivadas que son capaces de adherirse al scaffold de Ia invención.
Gracias a esta capacidad de Ia estructura tridimensional de adherir células se deriva el siguiente objeto de Ia presente invención. Este es método ex vivo para regenerar un tejido que comprende:
a) sembrar células en Ia estructura tridimensional anteriormente descrita; b) incubar las células en un medio de cultivo dentro de una estufa o biorreactor hasta el momento en que Ia estructura se vaya a implantar en el paciente.
El scaffold o estructura tridimensional con estas células sembradas en su interior ya sea por agitación, agitación intermitente o en un biorreactor, se puede mantener "in vitro" en estufas de cultivo celular o en biorreactores. Durante este periodo, las células pueden seguir creciendo, se comportan de una manera fisiológica (figura 2) y según los factores de crecimiento o diferenciación presentes en el medio de cultivo, expresar el fenotipo completo de Ia estirpe celular sembrada o ser diferenciados hacia células de otros tipos de tejidos (figura 3). Este crecimiento y/o diferenciación se realiza sin que se aprecie una degradación de Ia parte estructural del scaffold de Ia invención, incluso por periodos de hasta 6 meses de cultivo "in vitro". En una realización preferida de Ia invención las células sembradas y cultivadas y/o diferenciadas son osteoblastos, preadipocitos, condrocitos o fibroblastos dérmicos.
Finalmente, el producto de Ia invención así manipulado que es también objeto de Ia invención puede ser trasplantado a un ser vivo, donde Ia estructura originada por el entrecruzamiento de Ia albúmina será degradada por parte del sistema inmunitario del individuo, las células aportadas continuarán con Ia producción de matriz extracelular que irá sustituyendo lentamente a Ia estructura proteica inicial. El resultado de este trasplante, originará como producto final un nuevo tejido u órgano capaz de suplir Ia parte dañada, objetivo final de los procesos de Ingeniería Tisular.
MODO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
La base del producto de Ia invención son las proteínas globulares del plasma entrecruzadas con una sustancia tipo aldehido. La albúmina es Ia principal proteína del plasma y es Ia base estructural del producto y puede ser utilizada a diferentes concentraciones con resultados estructurales distintos, (entre el 50 y el 4%) (figura 4). La sustancia entrecruzante, por ejemplo el glutaraldehído puede también utilizarse a diferentes concentraciones, entre el 0.5 y el 7.5% con respecto al volumen de albúmina.
Tras Ia mezcla, esta se deposita en un molde y se produce Ia rápida solidificación. El producto se desmolda y se somete a una congelación lenta y progresiva. Una vez congelado el producto se somete a liofilización, cuando esta finaliza el producto de esta invención tiene un aspecto poroso pero es extremadamente friable y se rompe ante una mínima fuerza. Para lograr un producto utilizable como soporte o scaffold se debe hidratar. La hidratación produce un cambio drástico en las características físicas del producto, volviéndolo elástico y resistente a Ia manipulación. Si este producto se hidrata bruscamente parte de Ia estructura se puede romper, por
Io que es conveniente someterlo a una hidratación progresiva. Para ello, se introduce el producto en alcohol etílico absoluto (entre una y ocho horas dependiendo del tamaño de Ia estructura), posteriormente se introduce en alcohol del 96°, 90° y 80°, durante el mismo periodo de tiempo. Tras el paso por el alcohol de 80° las características físicas del producto cambian, el producto es más elástico, los poros son más visibles y se puede cortar en finas láminas. Se continúa con Ia hidratación del producto, dejándolo en alcohol de 70° durante 24 horas, alcohol de 50° y de aquí en medio de cultivo (DMEM, RPMI...) o soluciones salinas balanceadas. Se cambia Ia solución salina al menos 3 veces para eliminar todos los restos de alcohol presentes. El producto final es una esponja elástica en Ia que pueden verse los poros con claridad. Este producto puede almacenarse en el medio de cultivo durante meses sin perder su capacidad funcional.
Se ha comentado previamente que Ia concentración de albúmina para Ia realización del producto, podría ser muy variable. Cuando se utilizan concentraciones de albúmina bajas (4%), el producto es ligeramente menos resistente que con albúminas al 20%. Sin embargo, cuando se utilizan concentraciones bajas de albúmina el producto sigue siendo estable y elástico. El plasma humano contiene entre el 3 y el 5% de albúmina, por Io que este scaffold se podría realizar directamente a partir de plasma humano. El empleo directo de plasma o suero en Ia producción del scaffold permite Ia posibilidad de fabricar una estructura tridimensional partiendo directamente de Ia sangre del paciente al que será posteriormente implantado. Para ello, mediante venopunción, se extraería una pequeña cantidad de sangre del paciente (entre 10 y 100 mi) dependiendo del tejido a reconstruir, en medio sin anticoagulante (suero) o con él (plasma). Se centrifuga para quitar el componente celular de Ia sangre y se mezcla con el glutaraldehído, se coloca en el molde y se deja que el producto solidifique. A partir de aquí se continúa con Ia congelación lenta, Ia liofilización y Ia hidratación progresiva. El resultado final es un producto aparentemente semejante al preparado con Ia albúmina a bajas concentraciones, una estructura tridimensional, en Ia que células de mamífero pueden ser sembradas. Este soporte ha perdido totalmente su toxicidad. Los soportes/scaffolds generados a partir de plasma o suero son claramente diferentes de las generadas directamente a partir de concentrados de albúmina, ya que en ellas también están presentes otras proteínas normalmente presentes en Ia sangre. Esta diferencia produce también cambios importantes en Ia función del scaffold, que se comentarán en el siguiente párrafo.
Una vez conseguido Ia estructura tridimensional se procede a Ia siembra de células. Uno de los grandes problemas de Ia mayoría de los scaffolds previamente diseñados son que no aportan las señales necesarias para facilitar el anclaje de las mismas al soporte, ya que Ia interacción células soporte es un proceso dinámico en el que Ia células reconoce una superficie favorable y una vez iniciado el contacto físico, las células comienzan a sintetizar las proteínas específicas de unión con Ia matriz extracelular. Los estudios previos, realizados con el scaffold de esta invención muestran que las células tienen una capacidad limitada para unirse directamente a los scaffolds de albúmina, sin embargo esta capacidad aumenta hasta hacerse al menos 10 veces mayor cuando se utilizan scaffolds realizados directamente con suero o preferentemente con plasma. El estudio estructural realizado mediante microscopía electrónica de barrido, demuestra que Ia superficie de estas estructuras es muy diferente (figura 5). Estas claras diferencias son debidas a que en el suero y en el plasma existen muchas más proteínas que en un preparado purificado de albúmina y parte de esas proteínas serán atrapadas dentro del entrecruzamiento producido entre Ia albúmina y el agente entrecruzante.
Esto nos posibilita, dependiendo de Ia estrategia a seguir Ia utilización de scaffolds diferentes dependiendo de Io que nos interese sea una mayor proliferación de las células (preferiblemente las células crecen mejor en adhesión) o una mayor diferenciación de las mismas.
Una vez conseguido el scaffold, este se puede guardar sin perder sus características dejándolo en medio de cultivo, o se puede utilizar. Para ello se procede a sembrar las células propias del tejido a regenerar. Para Ia siembra se pueden seguir diversas estrategias (agitación, agitación intermitente, bioreactor...).
El scaffold sembrado con el componente celular quedará entonces en Ia estufa o biorreactor hasta el momento del implante. Este periodo de tiempo será muy variable según el tipo celular empleado y el grado de diferenciación que las células precisen. Durante este periodo se puede observar como las células se fijan al scaffold y como comienzan a producir las proteínas específicas del tejido adulto. Por ejemplo, si a un scaffold de acuerdo con Ia invención se Ie siembran fibroblastos y se Ie deja en un medio de crecimiento típico (por ejemplo DMEM, 10 suero fetal de bovino) se observa como a los pocos días de Ia siembra los fibroblastos comienzan a sintetizar colágeno tipo I (figura 2). Si por ejemplo se siembran sobre este scaffold células cultivadas a partir de implantes óseos y dejamos estas células en medio de osteogénesis observaremos a los pocos días como las células depositan sales de calcio sobre el scaffold, y expresan el enzima fosfatasa alcalina. Si se siembran condrocitos cultivados y se coloca el scaffold en medio de diferenciación condral se observará Ia producción de colágeno tipo II. Cuando se siembran células más indiferenciadas, los plazos necesarios para el intervalo entre Ia siembra y el scaffold pueden ser mayores. Un ejemplo sería cuando sembramos células madre de mesénquima obtenidas a partir de una biopsia de grasa subcutánea y las dejamos en medio osteogénico, se precisa un periodo superior a los 15-20 días de cultivo "ex vivo" para ver Ia expresión de proteínas propias del hueso. A pesar de estos periodos tan prolongados el scaffold de esta invención no se digiere (o Io hace mínimamente) y conserva Ia estructura tridimensional sin alteraciones en cultivo "ex vivo" hasta 6 meses después de Ia siembra.
Finalmente y una vez conseguida "ex vivo" Ia estructura y diferenciación celular deseada, el scaffold de esta invención puede ser trasplantado. Tras el trasplante un scaffold siempre se comporta como un cuerpo extraño y generará una respuesta inflamatoria. Esta respuesta deberá ser moderada y producir una degradación paulatina y controlada del material extraño. Los estudios relacionados "in vivo" con el scaffold de esta invención muestran una muy moderada degradación sin objetivarse una gran inflamación en Ia zona del trasplante. Mientras Ia estructura del scaffold original es degradada, se produce Ia integración de Ia nueva matriz extracelular producida por las células sembradas en el scaffold generándose un nuevo tejido que puede reproducir las funciones del tejido originalmente dañado.
En resumen el scaffold de esta invención permite una serie de ventajas que Io diferencian claramente de Io previamente conocido en el estado de Ia técnica:
- Aporta una estructura tridimensional para las células, pero también aporta a Ia vez señales de adhesión. Esto confiere al producto, una composición idónea para el desarrollo de modelos de Ingeniería Tisular.
- Es un scaffold que permite el cultivo "in vitro" durante largos periodos (hasta 6 meses), sin pérdida de Ia estructura tridimensional. Esto permite el desarrollo de modelos de diferenciación "in vitro".
- Es un material biológico ampliamente empleado en Ia clínica.
- El producto original es de muy fácil obtención (concentrados de albúmina) o sangre total (venopunción). - La posibilidad de construir un soporte para ingeniería tisular a partir de pequeñas cantidades de sangre total, nos ofrece Ia posibilidad de obtener estas estructuras partiendo de productos biológicos autólogos, es decir, obtenidos del propio paciente al que van a ser implantados.
Los siguientes ejemplos describen Ia utilización de este scaffold en medicina regenerativa, aunque no pretender ser limitativos respecto al ámbito de Ia invención.
Ejemplo 1 : Preparación de un scaffold para reparar una artrosis en una diáfisis femoral con albúmina al 20 % El scaffold tipo para pseudoartrosis en una diáfisis femoral, posee una dimensión aproximada de 3 cm de diámetro por 2 cm de altura. Para su preparación se partió de 10 mi de albúmina humana al 20% de Ia que habitualmente se utiliza en Ia clínica para su infusión. La albúmina se mezcló con 1 mi de glutaraldehído al 25% e inmediatamente después se depositó en un molde de las dimensiones antes referidas. Se dejó solidificar Ia mezcla a temperatura ambiente durante 30-45 minutos y posteriormente se colocó en un refrigerador eléctrico a -8O0C durante 18-24 horas. Una vez congelado el scaffold se desmoldó y sin descongelar se introdujo en el liofilizador hasta que Ia muestra quedó totalmente liofilizada. Finalizado este proceso Ia muestra se colocó en alcohol etílico absoluto durante 2 horas. Entonces, el scaffold se pasó a etanol al 96% y se dejó durante otras 2 horas. El etanol a 96% se sustituyó por etanol al 80% y posteriormente por etanol al 70% donde se dejó a temperatura ambiente durante 24 horas. Tras esta incubación el scaffold se introdujo durante 2 horas en etanol al 50%, en agua pura estéril y finalmente en una solución isotónica tipo PBS, solución de
Ham o incluso medio de cultivo tipo RPMI o DMEM. Se lavó varias veces con esta solución para eliminar todos los restos de etanol que pudieran quedar en el producto. Tras esta incubación se tomó una mínima muestra del scaffold para control bacteriológico y el scaffold se dejó en Ia solución salina hasta su utilización.
Ejemplo 2: Preparación de un scaffold para reparar cartílago auricular con plasma del paciente
Para Ia reparación de una lesión aguda del cartílago articular de Ia rodilla se utilizó directamente plasma procedente del propio paciente. En primer lugar mediante métodos radiográficos (resonancia nuclear magnética) o mejor durante la exploración artroscópica de Ia rodilla lesionada, se midió aproximadamente Ia lesión condral a reparar. Al mismo tiempo esta artroscopia permitió Ia toma de una mínima biopsia del cartílago articular sano para cultivo y expansión "ex vivo" de estas células. También en ese momento se extrajeron 10 mi de sangre en EDTA, esta sangre se centrifugó, por ejemplo a 3000 rpm durante 10 minutos. Tras Ia centrifugación se recogió el plasma, 3 mi de este plasma se mezclaron con 300 μl de glutaraldehído al 25% y se colocó el una placa Petri de 35 mm de diámetro, se dejó que Ia mezcla solidificase (30-60 minutos) y se colocó en un congelador eléctrico a -8O0C hasta el día siguiente. Sin descongelar se desmoldó y se colocó en un liofilizador hasta que el producto quedó completamente liofilizado. Tras esto se introdujo en etanol absoluto unas 2 horas y se pasó por etanol al 96%, al 80% y al 70% en el que quedó unas 18-24 horas. Posteriormente se colocó durante 2 horas en etanol al 50% y en solución salina tipo PBS o medio de cultivo. Se tomó muestra para control bacteriológico del scaffold así preparado. Se lavó al menos 3 veces con Ia solución salina para eliminar los restos de etanol. En esta fase se ajustó el tamaño del scaffold al de Ia lesión cartilaginosa, cortando este por ejemplo con un bisturí. El scaffold quedó listo para ser sembrado de células.
Ejemplo 3: Regeneración de hueso maxilar para implantes dentales
A un paciente que precisaba implantes dentales y no poseía suficiente masa ósea se Ie extrajeron 10 mi de sangre y se llevó a cabo un proceso similar al del ejemplo 2 pero usando un molde muy similar al defecto que debía ser regenerado. Al mismo tiempo se Ie extrajeron unos pequeños fragmentos esponjosos del maxilar. Tras Ia congelación del material, liofilización e hidratación del mismo el scaffold se reservó para Ia siembra de células e implante. Los fragmentos del hueso del paciente se sembraron sobre un frasco de cultivo celular por Ia técnica de explantes y se esperó a que crecieran las células viables presentes. Tras el crecimiento, las células se subcultivaron según las diferentes técnicas descritas. Una vez alcanzó una masa celular de células óseas suficiente, se sembraron sobre el scaffold, se dejaron un periodo de tiempo en Ia estufa para que las células prendiesen y se trasplantaron a Ia zona a reconstruir. El scaffold se fue degradando lentamente y las células que contiene produjeron Ia matriz adulta del hueso.
Ejemplo 4: Regeneración de hueso maxilar para implantes dentales
Se siguió otra estrategia similar a Ia del ejemplo 3 con otro paciente. En vez de extraer un fragmento de hueso, se utilizó como fuente celular una pequeña biopsia de grasa subcutánea. La grasa se digirió en colagenasa y las células se sembraron en un frasco de cultivo celular en medio de crecimiento (DMEM, 10% de suero fetal de bovino). Tras alcanzar una masa crítica, los preadipocitos cultivados se sembraron sobre el scaffold y se dejaron en medio de diferenciación ósea, hasta que por el seguimiento se apreciaron signos de diferenciación hacia osteoblasto. Posteriormente el scaffold y las células que contenían se trasplantaron al defecto maxilar a regenerar.
Ejemplo 5: Regeneración de una deformidad del pabellón auricular Una deformidad del pabellón auricular se reparó mediante el empleo de un scaffold de suero del paciente. Los materiales y métodos son sustancialmente los usados en el ejemplo 2 aunque el scaffold se endureció sobre un molde que reproducía Ia estructura del cartílago de Ia oreja. En el mismo tiempo se tomó una pequeña muestra sana del cartílago auricular del paciente. Por un lado el scaffold se congeló, liofilizó e hidrató según Ia metodología descrita en el ejemplo 2. Por otra parte el cartílago se digirió sometiéndose a enzimas proteolíticos y los condrocitos obtenidos se cultivaron hasta obtener una masa celular suficiente para ser sembradas sobre el scaffold. Tras Ia siembra, los condrocitos sufrieron un proceso de rediferenciación mediante cultivo en estufa (25-45 días) y finalmente se trasplantaron a Ia zona lesionada. Esta misma estrategia podría seguirse para Ia reparación de un cartílago articular, cambiando el origen de Ia fuente de condrocitos.
Ejemplo 6: Regeneración del tejido graso subcutáneo Se tomó sangre de Ia paciente, se realizó el scaffold de Ia forma descrita en el ejemplo 2 y se sembró con preadipocitos cultivados a partir de una biopsia de tejido graso de Ia paciente. Una vez sembrado en scaffold, este se quedó cultivando en Ia estufa en medio de diferenciación adiposa hasta que las células sembradas comenzaron a acumular triglicéridos en su interior. Posteriormente se transplantó a Ia región a reconstruir.
Esta misma estrategia podría seguirse tras las mastectomías secundarias a neoplasias de mama
Ejemplo 7: Reconstrucción ósea Un scaffold para reconstrucción de lesiones óseas se puede desarrollar como en el ejemplo 1. Sin embargo, puede que algunas reconstrucciones óseas requieran una mayor consistencia del scaffold que el basado en plasma o suero, por Io que se añadiría al plasma o suero del paciente un porcentaje de albúmina humana para reforzar Ia estructura, manteniendo las propiedades de anclaje celular. Finalmente este scaffold podría ser sembrado con células del paciente extraídas a partir de una biopsia ósea o como en el ejemplo 4 de grasa subcutánea.
Ejemplo 8. Regeneración dérmica tras quemadura La base de este tratamiento consistió en Ia producción de láminas de pequeño grosor del scaffold de esta invención, sembrados a partir de fibroblastos dérmicos del propio paciente y trasplantados sobre el sitio de Ia lesión. En esta modalidad los fibroblastos podrían ser de otro paciente sano dado que los fibroblastos son células con escaso poder de generar rechazo inmunológico. Este prototipo de scaffold en forma de lámina más fibroblastos dérmicos, se puede asociar a membranas semipermeables tipo silicona que proporcionan un efecto de barrera y protegen Ia herida y el implante de posibles infecciones.
Este tipo de estrategia podría usarse en otras lesiones de Ia piel (úlceras, amputaciones quirúrgicas en el pie diabético)
Ejemplo 9: Estructura de refuerzo
El scaffold de esta invención también puede ser utilizado como estructura interna de refuerzo de otros materiales ya empleados en ingeniería tisular.
Un ejemplo de esta aplicación es Ia asociación de una lámina del prototipo aquí descrito a una lámina de plasma que contiene fibroblastos vivos. En este ejemplo el plasma humano conteniendo fibroblastos se siembra sobre una lámina del scaffold de Ia invención, se añade cloruro calcico para coagular el plasma y el scaffold queda en el interior del plasma sirviendo de armazón interno y facilitando el trasplante de esta dermis artificial. También si se siembran queratinocitos sobre esta dermis artificial se consigue una piel artificial con un armazón interno que Ie aporta rigidez y facilita el trasplante.
En Ia figura 6 se esquematiza este prototipo.
Ejemplo 10: Prototipo de piel artificial Este prototipo puede ser asociado con un modelo de piel artificial definido en el ejemplo 9 para generar una piel cultivada tricapa que incorpore grasa subcutánea.
Para ello a partir de una pequeña biopsia de grasa se obtienen las células que se cultivan en un medio de expansión (DMEM 10% de suero bovino). Cuando se alcanza un número suficiente de células, estas se siembran en el scaffold de esta invención y se cultivan en un medio de diferenciación hacia adipocito. Cuando las células presentan signos de diferenciación grasa (figura 3, izquierda), se añade al scaffold, fibroblastosdérmicos, plasma y se recalcifica para provocar Ia coagulación. Sobre su superficie se siembran los queratinocitos epidérmicos y se cultivan hasta que se hacen confluentes. El modelo que se obtendría sería una parte inferior con células grasas fijadas al scaffold de esta invención, unido al él una capa inmediatamente superior de plasma con fibroblastos semejante a Ia dermis humana y en Ia parte superior una capa epitelial (figura 7), es decir una piel humana con 3 capas mucho más parecida a Ia natural que Ia generada con estrategias diferentes.

Claims

REIVINDICACIONES
1) Procedimiento para obtener estructuras tridimensionales para ingeniería tisular que comprende:
a) mezclar una fuente de albúmina y un agente entrecruzante e introducir Ia mezcla en un molde con Ia forma de Ia estructura que se desee obtener b) congelar lenta y progresivamente Ia estructura sólida obtenida en a) c) liofilización de Ia estructura de b) d) rehidratación progresiva de Ia estructura de c)
2) Procedimiento de acuerdo con Ia reivindicación 1 donde Ia fuente de albúmina se selecciona entre un preparado purificado de albúmina, suero o plasma.
3) Procedimiento de acuerdo con Ia reivindicación 1 donde el agente entrecruzante es un aldehido.
4) Procedimiento de acuerdo con Ia reivindicación 3 donde el aldehido es glutaraldehído.
5) Procedimiento de acuerdo con Ia reivindicación 1 donde Ia fuente de albúmina posee una concentración de albúmina entre el 1% y el 50%.
6) Procedimiento de acuerdo con Ia reivindicación 5 donde Ia fuente de albúmina tiene una concentración de 3-5%.
7) Procedimiento de acuerdo con Ia reivindicación 1 donde el agente entrecruzante posee una concentración entre el 0,1 y el 9%. 8) Procedimiento de acuerdo con Ia reivindicación 7 donde el agente entrecruzante posee una concentración de 0,5-7,5%.
9) Procedimiento de acuerdo con Ia reivindicación 1 en el que Ia congelación se hace a un ritmo de -1o C/min hasta una temperatura de -
7O0 C.
10)Procedimiento de acuerdo con Ia reivindicación 1 donde Ia rehidratación progresiva se lleva a cabo mediante inmersión sucesiva en alcoholes de graduaciones decrecientes.
11 )Procedimiento de acuerdo con Ia reivindicación 10 donde Ia rehidratación progresiva se lleva a cabo por inmersión sucesiva en alcohol absoluto, alcohol de 96°, 90°, 80°, 70°, 50° y por último en medio de cultivo o soluciones salinas balanceadas.
12)Estructura tridimensional para ingeniería tisular obtenible por un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
13)Estructura tridimensional de acuerdo con Ia reivindicación 12 caracterizada porque no es tóxica para las células.
14)Método ex vivo para regenerar un tejido que comprende:
a) sembrar células en Ia estructura tridimensional de las reivindicaciones 12 y 13; b) incubación de las células en un medio de cultivo dentro de una estufa o biorreactor hasta el momento del implante.
15)Método de acuerdo con Ia reivindicación 14 donde las células sembradas son seleccionadas entre osteoblastos, preadipocitos, condrocitos y fibroblatos dérmicos.
16)Método de acuerdo con las reivinidicaciones 14 y 15 donde las células son sembradas por agitación, agitación intermitente, biorreactor.
17)Método de acuerdo con las reivindicaciones 14-16 donde Ia incubación puede comprender Ia proliferación celular de un tejido diferenciado mediante el uso de un medio de cultivo adecuado para el crecimiento del tipo celular incubado o Ia desdifererenciación y proliferación de un tejido indiferenciado mediante el uso de un medio de diferenciación.
18)Método de acuerdo con Ia reivindicación 17 donde se desdiferencia células del mesémquima (grasa subcutánea) a células propias del tejido óseo mediante el uso de un medio osteogénico.
19)Estructura tridimensional obtenible de acuerdo con el método de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18.
20)Una estructura de acuerdo con Ia reivindicación 19 para su uso en Ia regeneración o reparación de tejidos u órganos dañados
PCT/ES2008/000191 2007-03-29 2008-03-31 Procedimiento de obtención de estructuras tridimensionales para ingeniería tisular WO2008119855A1 (es)

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