CN114469862A - 胆固醇调控包封聚多巴胺的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种胆固醇调控包封聚多巴胺的方法，通过控制球状聚多巴胺纳米颗粒表面电性，配合采用27‑羟基胆固醇，使胆固醇趋向于球状聚多巴胺纳米颗粒表面，并依靠电性及聚多巴胺粘附性附着于球状聚多巴胺纳米颗粒表面；随后，引入磷脂成分，以胆固醇附着位点为基础，球状聚多巴胺纳米颗粒表面组装形成类脂双分子层，实现包封。本申请将类脂双分子层的生物亲和性与聚多巴胺这一优良载体相结合，有助于克服目前脂质体制备工艺瓶颈。
Description
技术领域
本申请涉及类脂双分子层包封技术领域，尤其是涉及一种胆固醇调控包封聚多巴胺的方法。
背景技术
脂质体具有由类脂双分子包裹形成的空囊结构，空囊被用于装载药物、活性物质等功能成分等，利用类脂双分子层的生物相容性，能够将功能成分以接近生物代谢的方式输送至生物体内特定位点，有利于降低药物等的毒性，提高了功能成分输送稳定性。因此，脂质体被广泛用于医疗、美容、食品等领域。
目前，脂质体的制备主要采用高压微射流技术，利用高压将物料运送至振荡反应器中，高速流体在微孔道中发生剪切作用并分散成多股高速流体，进一步在撞击腔内发生高速撞击，流体的动能瞬间转化，形成高达100—300MPa的静压力，并使得物料发生强剪切粉碎、高速撞击、气蚀、振荡和膨化等作用，实现物料的细化、乳化、均质和改性等。高压微射流技术能够保证物料间的充分分散、混合，能够精确控制脂质体粒径范围，并可实现连续生产。然而，高压微射流技术高度依赖设备的稳定性、耐用度，且设备单批次产能较小。
近年来，聚多巴胺因其优异的生物相容性也受到了广泛的关注。聚多巴胺可由多巴胺在碱性溶液、有氧条件下，通过逐步氧化，交联而成；其生物相容性在其对癌细胞毒性方面研究较为深入，现已被用于作为附中抗肿瘤药物的靶向药物载体。
类脂双分子层是由磷脂、胆固醇等在生物体外形成的，其主体结构与细胞膜结构极为接近，因此，当类脂双分子层与细胞膜接触时，极易被细胞误认，通过胞吞、胞饮作用进入细胞内部。因此，采用类脂双分子层对一定粒径的载药物质包封后，可促进药物在细胞层面的释放、治疗，从而提高药效。
发明内容
本申请的目的在于提供一种胆固醇调控包封聚多巴胺的方法，将类脂双分子层的生物亲和性与聚多巴胺这一优良载体相结合，有助于克服目前脂质体制备工艺瓶颈。
本申请提供了一种胆固醇调控包封聚多巴胺的方法，包括以下步骤：
S1. 制取粒径为50nm~200nm的球状聚多巴胺纳米颗粒；
S2. 以体积份数比1：（8~10）将步骤S2获得的聚多巴胺纳米颗粒投入无水乙醇中分散，采用碱性溶液调节分散体系pH值至聚多巴胺纳米颗粒表面的ZETA电位为负；
S3. 以体积份数比1：（8~10）将27-羟基胆固醇投入乙酸乙酯中搅拌溶解；
S4. 以体积份数比（3~50）：1将步骤S3所得溶液缓慢加入步骤S2所得分散体系中混匀，静置不少于10h；
S5. 离心处理步骤S4产物，收集沉淀，并采用纯水、乙醇依次清洗后，浸泡于无水乙醇中备用；
S6. 以体积份数比（5~10）：1将卵磷脂与无水乙醇搅拌混匀；
S7. 以体积份数比1：0.1：（3~5）配置步骤S5产物、PEG-200和步骤S6的液相体系，将步骤S5的产物和PEG-200投入步骤S6液相体系中混匀，振荡2h~4h后，静置10h~12h；
S8. 离心处理步骤S7产物，收集沉淀，采用纯水清洗若干次后，真空干燥即得。
本申请提供了一种采用类脂双分子层包封球状聚多巴胺纳米颗粒的方法。类脂双分子层对球状聚多巴胺纳米颗粒的包封度由形成类脂双分子层的必要物质—胆固醇进行调控。通过控制球状聚多巴胺纳米颗粒表面电性，配合采用具有正电荷的27-羟基胆固醇（CAS号为20380-11-4），使胆固醇趋向于球状聚多巴胺纳米颗粒表面，并依靠电性及聚多巴胺粘附性附着于球状聚多巴胺纳米颗粒表面；随后，引入磷脂成分（本申请采用CAS号为93685-90-6的卵磷脂），即可以胆固醇附着位点为基础，球状聚多巴胺纳米颗粒表面组装形成类脂双分子层，实现包封。
本申请通过调控球状聚多巴胺纳米颗粒液相体系ZETA电位或浓度、27-羟基胆固醇液相体系浓度以及两液相体系间投加比例等，控制球状聚多巴胺纳米颗粒表面的胆固醇分布；同时，配合调控卵磷脂液相体系浓度及其与胆固醇-聚多巴胺纳米微粒的比例关系，控制形成类脂双分子层的磷脂成分的用量，进而控制类脂双分子层的形态。
本申请，除利用了聚多巴胺表面吸附性外，还利用其具有的定型结构，为胆固醇提供了一个稳定的连接基础，即为类脂双分子层提供了一个固定形态的模板，进而限定了所获得的脂质体的构型。由此，本申请所提供的方法完全区别与现有脂质体的构建方法，无须进行精密的工艺调控，解除了工艺对精密设备的依赖，有利于以合理的成本解决现有产能限制。
本申请中，球状聚多巴胺纳米颗粒的制备可采用现有方法制得，包括气相法、液相法、模板法等。出于脂质体的生物应用需求考虑，优选采用毒性可控的二氧化硅模板法制得。采用二氧化硅模板法制备球状聚多巴胺纳米颗粒后，可采用刻蚀方式，将模板去除，从而可在球体内部形成空腔，以便在实际应用中装载功能成分。
为了增强聚多巴胺纳米颗粒表面吸附吸能，优选采用表面具有介孔的聚多巴胺纳米颗粒。
本申请公开的一个实施例中，步骤S2中碱性溶液采用以下方法制得：以质量体积份数比1：（3~5）配置氢氧化钠水溶液后，等体积混合氢氧化钠水溶液与无水乙醇。
本申请中利用了聚多巴胺颗粒的表面电性促进胆固醇在聚多巴胺纳米颗粒表面的均匀分布。通过碱性溶液调控聚多巴胺纳米颗粒-乙醇体系的pH值至碱性，并通过检测体系ZETA电位的方式，以电位为负作为控制条件，充分保证了上述促进作用效果。
本申请所公开的方法中涉及两次离心处理过程，第一次离心处理的目的在于获得表面附着有胆固醇的球状聚多巴胺纳米颗粒，第二次离心处理的目的在于获得表面完成包封的脂质体。其中，第一次离心处理时，胆固醇与聚多巴胺颗粒主要以附着方式连接，连接强度较弱，因此采用相对较低的离心转速（本申请公开的一个实施例中采用12000r/min~15000r/min）进行处理。第二次离心处理时，聚多巴胺颗粒表面已形成了连续的类脂双分子层，类脂双分子层结构内部及其与聚多巴胺颗粒表面结构间均具有一定的连接强度，因此可采用相对较高的离心转速（本申请公开的一个实施例中采用18000r/min~20000r/min）进行处理，以便提高制备效率。
本申请的目的在于提供一种脂质体的替代方案，采用设备要求低、反应相对温和的方法，获得以类脂双分子层包裹药效成分的微球颗粒。
附图说明
为了更清楚地说明本申请的技术方案，下面将对实施例或有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中制得的由类脂双分子层包封的聚多巴胺颗粒的TEM照片。
具体实施方式
在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本申请申请实施例的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。
实施例1
本申请申请实施例提供了一种胆固醇调控包封聚多巴胺的方法，用以实现类脂双分子层对聚多巴胺的包封。该方法具体包括以下步骤：
1、采用二氧化硅模板法制备粒径为50nm~100nm的球状聚多巴胺纳米颗粒，具体包括如下步骤：
① 以体积份数比1:15:70混匀氨水、无水乙醇及去离子水；
② 以体积份数比100:（1~1.2）向①的溶液中投加原硅酸四乙酯并搅拌；
③ 以体积份数比1:10将盐酸多巴胺水溶液注入②中，搅拌后水热处理至少24h后，取出清洗。
2、以体积份数比1：8将步骤1制得的球状聚多巴胺纳米颗粒投入无水乙醇中分散，并采用碱性溶液调节分散体系pH值至8以上；
其中，碱性溶液采用以质量体积份数比1：3配置氢氧化钠水溶液后，等体积混合所述氢氧化钠水溶液与无水乙醇所得；
随碱性溶液添加而取样检测聚多巴胺纳米颗粒表面的ZETA电位，至ZETA电位出现负值为止。
3、以体积份数比1：8将27-羟基胆固醇投入乙酸乙酯中搅拌溶解制备胆固醇溶液体系；
以体积份数比3：1将上述胆固醇溶液体系缓慢加入步骤2所得ZETA电位为负的液相中混匀，静置10h。
4、12000r/min转速下，离心处理步骤3的产物，收集沉淀后，采用纯水、乙醇分别清洗多次后，将收集物浸泡于无水乙醇中备用。
5、以体积份数比1：0.1：3配置步骤4所得产物、PEG-200和磷脂液相体系，将步骤4所得产物和PEG-200投入磷脂液相体系中混匀，振荡2h后，静置10h；
其中，磷脂液相体系为以体积份数比（5~10）：1将卵磷脂与无水乙醇搅拌混匀所得。
6、18000r/min转速下，离心处理步骤5的产物，收集沉淀后，采用纯水清洗多次后，真空干燥处理即得。
图1示出了通过上述步骤制得的产物的透视电镜照片。由图1可见，产物颗粒粒径约为73nm左右，外表面具有一层高亮膜层，该高亮层为类脂双分子层，高亮层内球状颗粒为聚多巴胺微粒。类脂双分子层厚度较为均匀，附着在球状聚多巴胺颗粒外表面，使颗粒表面呈现较为平滑的外观。
在实际实施中，也可采用外购方式，购买粒径匹配的介孔聚多巴胺颗粒。目前，外购的聚多巴胺颗粒粒径多为100nm~200nm范围。
实施例2
本申请申请实施例提供了一种胆固醇调控包封载药聚多巴胺的方法，由聚多巴胺负载药用成分，由类脂双分子层对载药聚多巴胺进行包封。该方法具体包括以下步骤：
1、制备聚多巴胺-阿仑膦酸钠纳米微粒，具体包括如下步骤：
① 以体积份数比1:15:70混匀氨水、无水乙醇及去离子水；
② 以质量体积份数比1:5将盐酸多巴胺投入①项的溶液中搅拌，并逐滴加入阿仑膦酸钠溶液，持续搅拌24h，其中，阿仑膦酸钠加入量与盐酸多巴胺之比为9:1，阿仑膦酸钠溶液体积与①项溶液体积之比为1:5；
③ 0.22μm微孔滤膜抽滤后，冷冻离线15min~20min，分离上清与沉淀。
2、以体积份数比1：10将步骤1收集的沉淀投入无水乙醇中分散，并采用碱性溶液调节分散体系pH值至8以上；
其中，碱性溶液采用以质量体积份数比1：3配置氢氧化钠水溶液后，等体积混合所述氢氧化钠水溶液与无水乙醇所得；
随碱性溶液添加而取样检测液相体系ZETA电位，直至出现负值为止。
3、以体积份数比1：10将27-羟基胆固醇投入乙酸乙酯中搅拌溶解制备胆固醇溶液体系；
以体积份数比50：1将上述胆固醇溶液体系缓慢加入步骤2所得ZETA电位为负的液相中混匀，静置10h。
4、15000r/min转速下，离心处理步骤3的产物，收集沉淀后，采用纯水、乙醇分别清洗多次后，将收集物浸泡于无水乙醇中备用。
5、以体积份数比1：0.1：5配置步骤4所得产物、PEG-200和磷脂液相体系，将步骤4所得产物和PEG-200投入磷脂液相体系中混匀，振荡2h后，静置10h；
其中，磷脂液相体系为以体积份数比（5~10）：1将卵磷脂与无水乙醇搅拌混匀所得。
6、20000r/min转速下，离心处理步骤5的产物，收集沉淀后，采用纯水清洗多次后，真空干燥处理。
7、将步骤6所得产物重新分散于去离子水中，搅拌30min；其中，去离子水体积与步骤1中③项收集的上清体积相同。
分别取样去离子水（对照），步骤1中②项阿仑膦酸钠滴加后、持续搅拌前液相（样品1），③项上清（样品2），以及步骤7搅拌后液相（样品3），以体积比6:1:5与0.01mol/L碳酸氢钠溶液、0.2%水合茚三酮乙醇溶液混合，95摄氏度恒温水浴处理20min。以去离子水为稀释剂，在568nm波长进行比色测定，按外标法计算阿仑膦酸钠含量如下表所示：
| 阿仑膦酸钠含量（mg/ml） | |
| 对照 | - |
| 样品1 | 0.15 |
| 样品2 | 0.08 |
| 样品3 | 0.01 |
样品1可视为制备载药聚多巴胺过程中阿仑膦酸钠总的投加量；样品2与样品1之差值为聚多巴胺所负载的阿仑膦酸钠量；样品3为采用类脂双分子层包封后的聚多巴胺-阿仑膦酸钠微粒中，未包封完全而裸露出的阿仑膦酸钠量。由上表可知，通过本实施例所公开的制备方法，聚多巴胺对阿仑膦酸钠的负载效果良好，类脂双分子层对聚多巴胺-阿仑膦酸钠微粒的包封效果尚可。
Claims (9)
1.胆固醇调控包封聚多巴胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1. 制取粒径为50nm~200nm的球状聚多巴胺纳米颗粒；
S2. 以体积份数比1：（8~10）将步骤S2获得的所述聚多巴胺纳米颗粒投入无水乙醇中分散，采用碱性溶液调节分散体系pH值至所述聚多巴胺纳米颗粒表面的ZETA电位为负；
S3. 以体积份数比1：（8~10）将27-羟基胆固醇投入乙酸乙酯中搅拌溶解；
S4. 以体积份数比（3~50）：1将步骤S3所得溶液缓慢加入步骤S2所得分散体系中混匀，静置不少于10h；
S5. 离心处理步骤S4产物，收集沉淀，并采用纯水、乙醇依次清洗后，浸泡于无水乙醇中备用；
S6. 以体积份数比（5~10）：1将卵磷脂与无水乙醇搅拌混匀；
S7. 以体积份数比1：0.1：（3~5）配置步骤S5产物、PEG-200和步骤S6的液相体系，将步骤S5的产物和PEG-200投入步骤S6液相体系中混匀，振荡2h~4h后，静置10h~12h；
S8. 离心处理步骤S7产物，收集沉淀，采用纯水清洗若干次后，真空干燥即得。
2.根据权利要求1所述的胆固醇调控包封聚多巴胺的方法，其特征在于，步骤S1中所述聚多巴胺纳米颗粒采用二氧化硅模板法制得。
3.根据权利要求1或2所述的胆固醇调控包封聚多巴胺的方法，其特征在于，步骤S1中所述聚多巴胺纳米颗粒内部具有中空结构。
4.根据权利要求1或2所述的胆固醇调控包封聚多巴胺的方法，其特征在于，步骤S1中所述聚多巴胺纳米颗粒表面具有介孔。
5.根据权利要求1所述的胆固醇调控包封聚多巴胺的方法，其特征在于，步骤S2中所述碱性溶液采用以下方法制得：
以质量体积份数比1：（3~5）配置氢氧化钠水溶液后，等体积混合所述氢氧化钠水溶液与无水乙醇。
6.根据权利要求1所述的胆固醇调控包封聚多巴胺的方法，其特征在于，步骤S3中所述27-羟基胆固醇的CAS号为20380-11-4。
7.根据权利要求1所述的胆固醇调控包封聚多巴胺的方法，其特征在于，步骤S5中所述离心转速为12000r/min~15000r/min，处理时间不少于1h。
8.根据权利要求1所述的胆固醇调控包封聚多巴胺的方法，其特征在于，步骤S5中卵磷脂的CAS号为93685-90-6。
9.根据权利要求1所述的胆固醇调控包封聚多巴胺的方法，其特征在于，步骤S8中所述离心转速为18000r/min~20000r/min，处理时间不少于1h。
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