CN115737564A - 一种pmrl脂质体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种PMRL脂质体及其制备方法，属于原位疫苗递送载体领域。本申请制备方法包括：提供PDA纳米颗粒，并将PDA纳米颗粒与Man‑PEG‑SH在Tris‑HCl试剂中反应后，冷却、透析和干燥，得到PM纳米颗粒；将PM纳米颗粒与佐剂R848在Tris‑HCl试剂中避光反应后，超滤、清洗和干燥，得到PMR纳米颗粒；将PMR纳米颗粒通过共挤出工艺包覆于酸敏性脂质体内，得到PMRL脂质体。该PMRL脂质体具备酸响应和光热转化性能，并能够在肿瘤原位捕获肿瘤相关抗原并靶向树突状细胞，可以作为递送载体与原位疫苗结合，有效解决了PDA纳米颗粒在给药后未到达肿瘤部位的非特异性吸附和肿瘤免疫逃逸的问题。

Description

一种PMRL脂质体及其制备方法

技术领域

本申请属于原位疫苗递送载体技术领域，尤其涉及一种PMRL脂质体及其制备方法。

背景技术

原位疫苗是一种特别的疫苗形式，该形式中的抗原来源于肿瘤，在不需要提前识别和分离肿瘤相关抗原的情况下，可以利用肿瘤的较完整的抗原库来诱导特异性免疫反应，并且能够有效改善由于个体差异造成的免疫响应率低的问题。其中，对于原位疫苗来说载体的选择十分重要，而利用纳米粒子与原位疫苗结合可以克服大多数肿瘤治疗的障碍。

目前，与疫苗结合的载体主要为聚多巴胺(PDA)纳米颗粒，PDA纳米颗粒不仅具备稳定性好、生物相容性和光谱吸收性能良好等特点，而且其表面存在大量的活性基团，可以与多种物质进行功能化，能够实现原位捕获抗原的功能。

但是，目前主要将PDA纳米颗粒作为外源性疫苗载体，其在实际应用中的效果并不理想，一是单个外源性肿瘤抗原的疫苗不足以解决肿瘤的异质性和肿瘤免疫逃逸的问题；不同患者之间有高度的差异性，很难让所有肿瘤患者对单一外源性肿瘤相关抗原都产生较好的免疫响应。

发明内容

本申请的目的在于提供一种PMRL脂质体及其制备方法，旨在解决PDA纳米颗粒用作外源性疫苗载体容易产生非特异性吸附、肿瘤免疫逃逸以及免疫响应差异化的技术问题。

为了实现上述目的，本申请的技术方案是：

本申请的第一方面提供了一种PMRL脂质体的制备方法，该制备方法包括下述步骤：

提供PDA纳米颗粒；

将所述PDA纳米颗粒与Man-PEG-SH在Tris-HCl试剂中进行反应，反应完成后，将反应液冷却、透析和干燥，得到PM纳米颗粒；

将所述PM纳米颗粒与佐剂R848在Tris-HCl试剂中进行避光反应，反应完成后，将反应液超滤、清洗和干燥，得到PMR纳米颗粒；

将所述PMR纳米颗粒通过共挤出工艺包覆于酸敏性脂质体内，即可得到PMRL脂质体。

在第一方面优选的实现方式中，所述PDA纳米颗粒的制备方法包括：

配制多巴胺盐酸盐水溶液；

将所述多巴胺盐酸盐水溶液与NaOH溶液进行混合反应，反应完成后，离心并反复洗涤至上清液澄清无色，得到PDA纳米颗粒。

在第一方面更优选的实现方式中，所述配制多巴胺盐酸盐水溶液包括：

将多巴胺盐酸盐加入到去离子水中，50℃的温度下搅拌至多巴胺盐酸盐完全溶解，即得所述多巴胺盐酸盐水溶液。

在第一方面优选的实现方式中，所述Tris-HCl试剂的pH＝8.5。

在第一方面优选的实现方式中，所述PDA纳米颗粒与Man-PEG-SH反应时，所述PDA纳米颗粒与所述Man-PEG-SH的质量比为1:2。

在第一方面优选的实现方式中，所述PM纳米颗粒与佐剂R848反应时，所述PM纳米颗粒与所述佐剂R848的质量比为1:1。

在第一方面优选的实现方式中，所述酸敏性脂质体的制备方法包括：

将HSPC、胆固醇和DSPE-PEG2000在氯仿溶剂中进行反应，并在反应完成后，蒸发氯仿溶剂，即得所述酸敏性脂质体。

在第一方面更优选的实现方式中，所述HSPC、所述胆固醇和所述DSPE-PEG2000的摩尔比为5.8:3.7:0.5。

本申请的第二方面还提供了第一方面所述制备方法制备得到的PMRL脂质体。

与现有技术相比，本申请实施例的优点或有益效果至少包括：

本申请提供的制备方法，将PDA纳米颗粒与Man-PEG-SH反应合成PM纳米颗粒，并将PM纳米颗粒与佐剂R848反应合成PMR纳米颗粒，以及将PMR纳米颗粒包覆于酸敏性脂质体内，从而制备得到PMRL脂质体。该PMRL脂质体具备酸响应和光热转化性能，并能够在肿瘤原位捕获肿瘤相关抗原并靶向树突状细胞，从而可以作为递送载体与原位疫苗结合，不仅有效解决了现有PDA纳米颗粒在给药后未到达肿瘤部位的非特异性吸附和肿瘤免疫逃逸的问题，而且能够使得所有患者对单一肿瘤相关抗原都产生较好的免疫响应。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本申请实施例提供的PDA、PM、PMR和PMRL的DLS粒径分布图；

图2为本申请实施例提供的PDA、PM、PMR和PMRL的Zeta电位图；

图3为本申请实施例提供的PDA和PMRL的TEM图；

图4为图3中A处的放大图；

图5为本申请实施例提供的Man-PEG-SH、PDA、PM的FT-IR谱图；

图6为本申请实施例提供的PMRL在不同功率激光下照射10min的升温曲线图；

图7为本申请实施例提供的不同浓度PMRL在同一功率激光下照射10min的升温曲线图；

图8为本申请实施例提供的浓度为250μg/mL的PMR和PMRL的溶液在1.0W/cm²的激光照射下的热成像图；

图9为本申请实施例提供的PMRL与4T1细胞共孵育后在功率为1.0W/cm²的NIR照射下细胞培养板的红外成像图；

图10为本申请实施例提供的PM、PMR和PMRL与条件培养基共孵育后捕获的蛋白量图；

图11为本申请实施例提供的PDA和PMRL与含有肿瘤相关抗原的上清液共孵育前后的粒径变化图；

图12为本申请实施例提供的PDA和PMRL与含有肿瘤相关抗原的上清液共孵育前后的Zeta电位变化图。

具体实施方式

下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

在本实施例以下描述中，术语“和/或”用于描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，单独存在B和同时存在A和B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

在本实施例以下描述中，术语“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a，b或c中的至少一项(个)”，或，“a，b和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a，b，c，a-b(即a和b)，a-c，b-c，或a-b-c，其中a，b，c分别可以是单个，也可以是多个。

本领域技术人员应当理解，在本申请实施例以下描述中，序号的先后并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。

在本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。

第一方面，本申请实施例提供了一种PMRL脂质体的制备方法，其包括下述步骤S101至S101：

S101：提供PDA纳米颗粒；

S102：将PDA纳米颗粒与Man-PEG-SH在Tris-HCl试剂中进行反应，反应完成后，将反应液冷却、透析和干燥，得到PM纳米颗粒；

S103：将PM纳米颗粒与佐剂R848在Tris-HCl试剂中进行避光反应，反应完成后，将反应液超滤、清洗和干燥，得到PMR纳米颗粒；

S104：将所述PMR纳米颗粒通过共挤出工艺包覆于酸敏性脂质体层内，即可得到PMRL脂质体。

本申请实施例的制备方法，通过PDA纳米颗粒与Man-PEG-SH反应合成PM纳米颗粒，并将PM纳米颗粒与佐剂R848反应合成PMR纳米颗粒，以及将PMR纳米颗粒包覆于酸敏性脂质体内，从而制备得到PMRL脂质体。该PMRL脂质体具备酸响应和光热转化性能，并能够在肿瘤原位捕获肿瘤相关抗原并靶向树突状细胞，从而可以作为递送载体与原位疫苗结合，不仅有效解决了现有PDA纳米颗粒在给药后未到达肿瘤部位的非特异性吸附和肿瘤免疫逃逸的问题，而且能够使得所有患者对单一肿瘤相关抗原都产生较好的免疫响应。

需要说明的是，Man-PEG-SH的中文名称为“甘露糖-聚乙二醇-巯基”；佐剂R848为雷西莫特；PM纳米颗粒具体为PDA-Man纳米颗粒，其中文名称为“甘露糖基聚多巴胺纳米颗粒”；PMR纳米颗粒具体为PDA-Man-R848纳米颗粒，其中文名称为“表面负载R848的甘露糖基聚多巴胺纳米颗粒”；PMRL脂质体中，“P”代表“PDA/聚多巴胺”、“M”代表“Man/甘露糖”、“R”代表“R848/雷西莫特”、“L”代表“Liposomes/脂质体”。

需要说明的是，共挤出工艺为公知已知的共挤出工艺，例如在塑料挤出设备中通过调整后方牵引比以及冷却水温，使得脂质体膜层均匀包覆于PMR纳米颗粒表面或者使PMR纳米颗粒表面被包覆于脂质体的腔室内即可，本申请实施例对于具体的共挤出工艺不作特别限制，凡是能够将实现所述共挤出包覆产物即可。

在本申请实施例中，PDA纳米颗粒的制备方法优选包括：

配制多巴胺盐酸盐水溶液；

将所述多巴胺盐酸盐水溶液与NaOH溶液进行混合反应，反应完成后，离心并反复洗涤至上清液澄清无色，得到PDA纳米颗粒。

在本申请实施例中，配制多巴胺盐酸盐水溶液优选包括：

将多巴胺盐酸盐加入到去离子水中，50℃的温度下搅拌至多巴胺盐酸盐完全溶解，即得所述多巴胺盐酸盐水溶液。

在本申请实施例中，优选Tris-HCl试剂的pH＝8.5。

在本申请实施例中，PDA纳米颗粒与Man-PEG-SH反应时，PDA纳米颗粒与Man-PEG-SH的质量比优选为1:2。

在本申请实施例中，PM纳米颗粒与佐剂R848反应时，PM纳米颗粒与佐剂R848的质量比优选为1:1。

在本申请实施例中，酸敏性脂质体的制备方法优选包括：

将HSPC、胆固醇和DSPE-PEG2000在氯仿溶剂中进行反应，并在反应完成后，蒸发氯仿溶剂，即得酸敏性脂质体。

在本申请实施例中，HSPC、胆固醇和DSPE-PEG2000的摩尔比优选为5.8:3.7:0.5。

第二方面，本申请实施例还提供了第一方面制备方法制备得到的PMRL脂质体。基于第一方面制备方法能够合成PMRL脂质体，该PMRL脂质体结合了PAD、Man、佐剂R848以及脂质体的性能，具备酸响应和光热转化性能的同时能够在肿瘤原位捕获肿瘤相关抗原并靶向树突状细胞，从而可以作为递送载体与原位疫苗结合，不仅有效解决了现有PDA纳米颗粒在给药后未到达肿瘤部位的非特异性吸附和肿瘤免疫逃逸的问题，而且能够使得所有患者对单一肿瘤相关抗原都产生较好的免疫响应。

下面将结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步地阐述。

实施例1

本实施例1提供了PMRL脂质体的制备方法，包括以下步骤S101至S10。

S101：提供PDA纳米颗粒。具体地，将180mg的多巴胺盐酸盐(DA·HCl)加入到90mL的去离子水中，并在50℃的温度下搅拌至多巴胺盐酸盐完全溶解形成多巴胺盐酸盐水溶液后，将多巴胺盐酸盐水溶液与760μL的1M的NaOH溶液进行反应5h，之后12000rpm离心反复洗涤至上清液澄清无色，得到大小均一的PDA纳米颗粒。

S102：称取5.0mg步骤S101制备成的PDA纳米颗粒并溶于25mL的Tris-HCl缓冲溶液(pH＝8.5)中，再按照质量比为1:2的比例加入Man-PEG-SH进行搅拌反应24h，然后将反应液经透析(MWCD＝5kD)24h和冻干，得到PM纳米颗粒。

S103：称取5.0mg步骤S102制备成的PM纳米颗粒并溶于适量的Tris-HCl的缓冲溶液(pH＝8.5)中，再按照质量比为1:1的比例加入佐剂R848进行避光搅拌反应12h，然后将反应液在超滤管(Mw＝50000)超滤并用去离子水清洗3遍、冻干，得到PMR纳米颗粒。

S104：将HSPC、胆固醇和DSPE-PEG2000按照摩尔比为5.8:3.7:0.5的比例溶于氯仿溶剂中进行搅拌反应，并在反应完成后通过旋转蒸发掉氯仿溶剂，得到酸敏性脂质体，最后通过共挤出工艺将PMR纳米颗粒包覆于酸敏性脂质体的腔室内，即可得到PMRL脂质体。

为了验证该PMRL脂质体的实际性能，本申请实施例将PDA纳米颗粒、PM纳米颗粒、PMR纳米颗粒作为对比，对PMRL脂质体的相关性能进行表征，具体如下：

1.粒径、电位和形貌表征

1.1DLS粒径分析

对PDA、PM、PMR和PMRL四种纳米颗粒进行粒径分析，结果为图1所示。其中，图1示出了PDA、PM、PMR和PMRL的DLS粒径分布图。

根据图1可以看出：PDA纳米颗粒的粒径为151.9±0.07nm；PM纳米颗粒的粒径为172.5±0.07nm；PMR纳米颗粒的粒径为184.1±0.09nm；PMRL纳米颗粒的的粒径为195.9±0.08nm，说明本实施例合成的四种纳米颗粒的粒径小于200nm，能够通过EPR效应在肿瘤部位富集。

1.2Zeta电位分析

对PDA、PM、PMR和PMRL四种纳米颗粒进行Zeta电位分析，结果为图2所示。其中，图2示出了PDA、PM、PMR和PMRL的Zeta电位图。

根据图2可以看出：PDA、PM、PMR和PMRL四种纳米颗粒的电位依次从-39.43±0.7mV升高到-14.1±0.5mV，侧面验证了纳米颗粒表面的变化。

1.3形貌表征

对PDA纳米颗粒和PMRL纳米颗粒形貌进行TEM表征，结果为图3至图4所示。其中，图3示出了PDA和PMRL的TEM图；图4示出了图3中A处的放大图。

根据图3至图4可以看出：PDA纳米颗粒被脂质体修饰后，PMRL表面形成有一层膜层结构，通过测量这个膜层结构厚度为9nm左右。

综合以上表征结果，证明本实施例1最终成功制备出了PMRL脂质体。

2.FT-IR表征

对Man-PEG-SH和PDA、PM两种纳米颗粒进行FT-IR表征，结果为图5所示。其中，图5示出了Man-PEG-SH、PDA、PM的FT-IR谱图。

根据图5可以看出：PDA在3250cm^-1处有一个苯环邻位羟基伸缩振动引起的吸收峰，该处吸收峰较宽是由于分子内氢键的形成所导致的。1180cm^-1与1042cm^-1处的吸收峰分别是PDA苯环上C-N和C-O的伸缩振动引起的，相比于Man-PEG-SH，PM上在2550cm^-1处S-H的伸缩振动峰消失，验证了表面甘露糖小分子的成功接枝。

3.光热性能表征

3.1浓度为250μg/mL的PMRL在不同功率激光照射下的温度变化

将浓度为250μg/mL的PMRL分别置于0.5W/cm²、1.0W/cm²、1.5W/cm²、2.0W/cm²的激光下照射10min后，观测PMRL的温度变化情况，结果为图6所示。其中，图6示出了PMRL在不同功率激光下照射10min的升温曲线图。

根据图6可以看出：浓度为250μg/mL的PMRL在0.5W/cm²、1.0W/cm²、1.5W/cm²、2.0W/cm²的不同功率激光下照射10min后，PMRL的温度分别上升了6.7℃、12.4℃、15.4℃和24℃，表明光热效应具有功率依赖性。

3.2不同浓度PMRL在激光照射下的温度变化

将浓度分别为50μg/mL、100μg/mL、250μg/mL、500μg/mL的PMRL在同一功率的NIR激光下照射10min后，观测PMRL的温度变化情况，结果为图7所示。其中，图7示出了不同浓度PMRL在同一功率激光下照射10min的升温曲线图。

根据图7可以看出：浓度分别为50μg/mL、100μg/mL、250μg/mL、500μg/mL的PMRL在同一功率的NIR激光下照射10min后，温度分别升高了5.7℃、7.4℃、12.4℃和18.1℃，并且随着浓度的增加，温度的递增趋势越明显。

3.3热成像分析

体外将浓度为250μg/mL的PMR和PMRL的溶液在1.0W/cm²激光照射10min，并对0min、2min、4min、6min、8min和10min五个时间点用热成像仪拍照记录，结果为图8所示。其中，图8示出了浓度为250μg/mL的PMR和PMRL的溶液在1.0W/cm²的激光照射下的热成像图。

根据图8可以看出，PMR纳米颗粒和PMRL纳米颗粒的热效果没有明显差异，说明脂质体的包覆对于PMR的光热性能并不会产生明显的影响。

同时，为了进一步分析PMRL在细胞内的光热转换效果，通过红外成像仪对含有PMRL和PBS的4T1细胞的温度进行检测，结果为图9所示。其中，图9示出了PMRL与4T1细胞共孵育后在功率为1.0W/cm²的NIR照射下细胞培养板的红外成像图。

根据图9可以看出，PMRL纳米颗粒在被细胞内吞后，在NIR光照射下同样具有明显的光热转换效果。

4.捕获抗原效果的检测

测定PM、PMR和PMRL三种纳米颗粒捕获抗原后上清液的蛋白浓度，结果为图10所示。其中，图10示出了PM、PMR和PMRL与条件培养基共孵育后捕获的蛋白量图。

根据图10计算出与初始条件培养基中蛋白浓度的差值，其中，PPR相比于仅负载了R848的PDA纳米颗粒(PR)吸附蛋白的量减少了73.33μg/mg。同种纳米颗粒仅仅在是否修饰脂质体的变量下三种纳米颗粒PPRL与PPR、PRL与PR、PMRL与PMR蛋白吸附量的差异分别是86.67μg/mg、113.34μg/mg和51.67μg/mg，说明在脂质体包覆前后会对纳米颗粒捕获抗原的效果产生明显影响且具有显著性差异。PMR捕获抗原蛋白含量为174.47±7.41μg/mg，实验结果表明最终修饰的PMR依旧具有良好的捕获抗原的效果。

5.抗原捕获后粒径和电位变化

5.1抗原捕获后粒径变化

通过粒径的变化来侧面验证捕获成功与否，对比PDA和PMRL两种纳米颗粒的粒径的前后变化来侧面验证捕获抗原的效果，结果为图11所示。其中，图11示出了PDA和PMRL与含有肿瘤相关抗原的上清液共孵育前后的粒径变化图。

根据图11可以看出：PDA纳米颗粒和PMRL纳米颗粒的表面性质发生明显改变，PDA纳米颗粒的粒径从151.9nm增加至667.3nm，PMRL纳米颗粒的粒径从189.1nm增加至897.7nm。

5.2抗原捕获后电位变化

通过电位的变化来侧面验证捕获成功与否，对比PDA和PMRL两种纳米颗粒的电位的前后变化来侧面验证捕获抗原的效果，结果为图12所示。其中，图12示出了PDA和PMRL与含有肿瘤相关抗原的上清液共孵育前后的电位变化图。

根据图12可以看出：PDA和PMRL的电位都有所降低，但从测试结果来看PDA的表面电荷没有明显降低，可能是由于PDA表面电荷本身就较低，在抗原捕获后对其电位的影响不会太大。

本说明书中的各个实施方式采用递进的方式描述，各个实施方式之间相同或相似的部分可互相参见，每个实施方式重点说明的都是与其他实施方式的不同之处。

以上实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对本申请限制；尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，本领域普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请技术方案的范围。

Claims (9)

1.一种PMRL脂质体的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：

提供PDA纳米颗粒；

将所述PDA纳米颗粒与Man-PEG-SH在Tris-HCl试剂中进行反应，反应完成后，将反应液冷却、透析和干燥，得到PM纳米颗粒；

将所述PM纳米颗粒与佐剂R848在Tris-HCl试剂中进行避光反应，反应完成后，将反应液超滤、清洗和干燥，得到PMR纳米颗粒；

将所述PMR纳米颗粒通过共挤出工艺包覆于酸敏性脂质体内，即可得到PMRL脂质体。

2.根据权利要求1所述的PMRL脂质体的制备方法，其特征在于，所述PDA纳米颗粒的制备方法包括：

配制多巴胺盐酸盐水溶液；

将所述多巴胺盐酸盐水溶液与NaOH溶液进行混合反应，反应完成后，离心并反复洗涤至上清液澄清无色，得到PDA纳米颗粒。

3.根据权利要求2所述的PMRL脂质体的制备方法，其特征在于，所述配制多巴胺盐酸盐水溶液包括：

将多巴胺盐酸盐加入到去离子水中，50℃的温度下搅拌至多巴胺盐酸盐完全溶解，即得所述多巴胺盐酸盐水溶液。

4.根据权利要求1所述的PMRL脂质体的制备方法，其特征在于，所述Tris-HCl试剂的pH＝8.5。

5.根据权利要求1所述的PMRL脂质体的制备方法，其特征在于，所述PDA纳米颗粒与Man-PEG-SH反应时，所述PDA纳米颗粒与所述Man-PEG-SH的质量比为1:2。

6.根据权利要求1所述的PMRL脂质体的制备方法，其特征在于，所述PM纳米颗粒与佐剂R848反应时，所述PM纳米颗粒与所述佐剂R848的质量比为1:1。

7.根据权利要求1所述的PMRL脂质体的制备方法，其特征在于，所述酸敏性脂质体的制备方法包括：

将HSPC、胆固醇和DSPE-PEG2000在氯仿溶剂中进行反应，并在反应完成后，蒸发氯仿溶剂，即得所述酸敏性脂质体。

8.根据权利要求7所述的PMRL脂质体的制备方法，其特征在于，所述HSPC、所述胆固醇和所述DSPE-PEG2000的摩尔比为5.8:3.7:0.5。

9.一种根据权利要求1-8任一所述的制备方法制备得到的PMRL脂质体。

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