CN111135293B - 一种基于ova蛋白修饰的氧化铁锰杂化纳米药物与制备方法 - Google Patents
一种基于ova蛋白修饰的氧化铁锰杂化纳米药物与制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种基于OVA蛋白修饰的氧化铁锰杂化纳米药物与制备方法，属于纳米药物领域。本发明用OVA包覆的MnFe2O4 NPs作为杂化纳米平台负载免疫佐剂，制备步骤包括：(1)制备5‑9nm的MnFe2O4纳米种子；(2)制备MnFe2O4 NPs；(3)制备PEG‑MnFe2O4 NPs；(4)制备OVA‑PEG‑MnFe2O4 NPs；(5)制备免疫佐剂‑OVA‑PEG‑MnFe2O4。本发明制备过程简单，解决现有免疫佐剂负载平台存在的负载效率低、免疫抑制等问题，得到的杂化纳米药物具有良好的生物相容性和光热稳定性，能有效引起机体免疫反应，对原位乳腺癌具有良好的光热免疫复合治疗效果，这为发展新型复合疗法的多功能杂化纳米药物开辟了新的思路。
Description
技术领域
本发明属于纳米药物领域，特别涉及一种基于OVA蛋白修饰的氧化铁锰杂化纳米药物与制备方法。
背景技术
近年来，癌症免疫疗法已经彻底改变了癌症晚期患者的治疗方式。值得注意的是，2018年诺贝尔生理学或医学奖颁给了美国科学家James P.Allison和日本科学家TasukuHonjo，因为他们发现了负性免疫调节的癌症免疫疗法(Nat.Immunol.,18(12),2017,1342-1352)。目前癌症免疫疗法主要包括检查点抑制剂法(例如，anti-PD-1/PD-L1和anti-CTLA-4法)、T细胞过继转移法、疫苗法等，其在临床上已显示出良好的治疗效果。然而，单独使用这些免疫疗法在癌症晚期治疗中的效果依然不够理想。一个理想的癌症治疗方式应该是通过其他治疗方式消融局部肿瘤并引起机体免疫消除剩余肿瘤细胞和防止肿瘤复发。基于以上观点，把免疫疗法与其他治疗方式(如光动力治疗、化疗、放疗和光热治疗PTT等)有机结合起来可能显著提高癌症临床治疗效果(ACS Nano,11(5),2017,4463-4474；J.Am.Chem.Soc.,138(38),2016,12502-12510)。
随着纳米技术的发展，各种纳米材料被设计并作为一种强大的工具用于整合免疫治疗和其他治疗方式。例如，核-壳纳米配位聚合物负载oxaliplatin抗肿瘤药、pyrolipid光敏剂和anti-PD-L免疫检查抑制剂构建化疗/光动力治疗/免疫治疗体系，其能有效抑制初始瘤和远端瘤的生长(Nat.Commun.,7,2016,12499)。基于纳米级的金属-有机体系平台构建的放疗/光动力治疗结合免疫检查抑制剂被证明能显著地摧毁局部瘤和远端瘤(Nat.Biomed.Eng.,2(8)2018,600-610)。利用糖化壳聚糖有机整合局部PTT和免疫治疗能有效治疗晚期胰腺癌(Clin.Cancer Res.,24(21),2018,5335-5346)。这些治疗方式通常面临较低的免疫刺激响应速率或因机体免疫抑制受限。
典型的免疫佐剂如R837，作为TLR-7激动剂能显著刺激DC细胞成熟，促进肿瘤相关抗原的传递能力，从而有效激活T细胞，但是同时可能会引起一定的机体免疫抑制(Br.J.Dermatol.,152(1),2005,122-129)。现也有利用负载平台改善免疫佐剂部分性质的研究，但现有负载平台主要通过采用油/水单乳液法(Nature communications,2016,7(1):1-13)或疏水作用(ACS Nano 2017,11,5,4463-4474)负载R837，其负载效率普遍较低，如Liu等报道利用上转化纳米材料负载光敏剂Ce6和免疫佐剂R837，其R837的负载效率仅为10％(ACS Nano2017,11,5,4463-4474)。
检索国内外有关杂化纳米药物方面的文献和专利结果表明：目前，还没有发现基于OVA蛋白修饰的氧化铁锰杂化纳米药物的制备等应用方面的报道。
发明内容
本发明的目的在于，解决现有免疫佐剂负载平台存在的负载效率低、免疫抑制等问题。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种基于OVA蛋白修饰的氧化铁锰杂化纳米药物，用OVA包覆的MnFe2O4NPs作为杂化纳米平台负载免疫佐剂。
卵清蛋白OVA是一种广谱的肿瘤疫苗。MnFe2O4 NPs由氧化铁和氧化锰纳米材料杂化组成，其表现出良好的光热效果和减少机体免疫抑制能力(减少肿瘤细胞逃逸能力，使机体保持良好的免疫反应)。本发明利用OVA包覆的MnFe2O4 NPs将光热治疗和减少机体免疫抑制结合起来，可以实现更好的光热治疗效果。本发明的杂化纳米平台对免疫佐剂有极高的负载率，将MnFe2O4 NPs、OVA蛋白和免疫佐剂有机地结合起来，实现了较好的光热免疫复合治疗效果，能有效地减少机体免疫抑制、刺激DC细胞活化。
优选的，免疫佐剂包括但不限于R837、NLG919、IPI-549等。
R837(imiquimod)、NLG919(navoximod，一种IDO通路抑制剂)、IPI-549等免疫佐剂，具有相近的表面结构。其本身均为有机小分子，表面疏水且带正电荷，能与本发明负载平台的表面负电荷相互吸引，能很好地结合并发挥协同作用，能引起相似的免疫刺激响应效果。
一种上述基于OVA蛋白修饰的氧化铁锰杂化纳米药物的制备方法，包括：
A、把醋酸锰、1,2-十六烷二醇、油酸、油酰胺用二苄醚混合，并在真空环境下搅拌，加热后逐滴滴加醋酸铁，并继续加热，之后冷却，得到MnFe2O4纳米种子；
B、将所述MnFe2O4纳米种子溶于正己烷中，并与醋酸锰、醋酸铁、1-十八醇、油酸、油酰胺、二苄醚混合均匀后在惰性气体气氛下缓慢加热，之后冷却，得到溶有MnFe2O4纳米颗粒的正己烷溶液，之后加入乙醇，离心得到MnFe2O4NPs沉淀；
C、将MnFe2O4 NPs沉淀溶于CH2Cl2中，与DSPE-PEG溶液超声混合，之后冷凝蒸发，水洗得到溶有PEG修饰的MnFe2O4 NPs的水溶液，即得到PEG-MnFe2O4 NPs；
D、将所述PEG-MnFe2O4 NPs的水溶液与OVA水溶液混合搅拌，离心得到OVA-PEG-MnFe2O4 NPs的水溶液。
E、将溶有免疫佐剂的甲醇溶液加入OVA-PEG-MnFe2O4 NPs的水溶液中搅拌，离心得到免疫佐剂-OVA-PEG-MnFe2O4 NPs杂化纳米药物。
优选的，上述基于OVA蛋白修饰的氧化铁锰杂化纳米药物的制备方法，包括：
A、把醋酸锰、1,2-十六烷二醇、油酸、油酰胺等用二苄醚混合，并在20-30℃真空环境下搅拌20-30min，之后加热至230-240℃，再逐滴滴加醋酸铁，并继续加热至260-280℃，持续30-40min，之后自然冷却至室温，得到所述MnFe2O4纳米种子；
B、将所述MnFe2O4纳米种子溶于正己烷中，并与醋酸锰、醋酸铁、1-十八醇、油酸、油酰胺、二苄醚混合均匀后在氩气气氛下缓慢加热至260-280℃，持续30-40min，之后冷却至室温，得到所述溶有MnFe2O4纳米颗粒的正己烷溶液，之后加入乙醇，离心得到所述MnFe2O4NPs沉淀；
C、将MnFe2O4 NPs沉淀溶于CH2Cl2中，与所述DSPE-PEG溶液超声混合20-30min，之后冷凝蒸发，水洗得到所述PEG修饰的MnFe2O4 NPs的水溶液，即得到所述PEG-MnFe2O4 NPs；
D、将所述PEG-MnFe2O4 NPs的水溶液与所述OVA水溶液混合搅拌10-12h，离心得到所述OVA-PEG-MnFe2O4 NPs的水溶液；
E、将溶有免疫佐剂的甲醇溶液加入所述OVA-PEG-MnFe2O4 NPs的水溶液中搅拌20-30h，离心得到免疫佐剂-OVA-PEG-MnFe2O4 NPs杂化纳米药物。
优选的，在所述步骤A中，所述醋酸锰、所述醋酸铁与所述1,2-十六烷二醇的摩尔比为1：2：10，所述醋酸锰的质量为80-120mg，所述油酸和所述油酰胺的体积均为2-3mL，所述二苄醚的体积为20-30mL，所述MnFe2O4纳米种子的粒径为5-9nm。
优选的，在所述步骤B中，所述醋酸锰、所述醋酸铁与所述1-十八醇的摩尔比为1：2：10，所述醋酸锰的质量为100-140mg，所述油酸和所述油酰胺的体积均为4-6mL，所述二苄醚的体积为14-20mL，所述离心的转速为10000-14000rpm，所述乙醇的体积为2-3mL。
优选的，在所述步骤C中，所述MnFe2O4纳米沉淀与所述DSPE-PEG的质量比为1：2，所述MnFe2O4纳米沉淀的质量为50-60mg，所述CH2Cl2的体积为5-7mL，所述DSPE-PEG溶液的浓度为15-20mg/mL。
优选的，在所述步骤D中，所述MnFe2O4 NPs与所述OVA的质量比为1：(1-1.2)，所述OVA水溶液的浓度为8-12mg/mL，离心后所述OVA-PEG-MnFe2O4 NPs的水溶液浓度为10-20mg/mL。
优选的，在所述步骤E中，所述MnFe2O4 NPs与所述免疫佐剂的质量比(50-100):1，所述免疫佐剂的浓度为0.3-0.5mg/mL，溶解所述免疫佐剂的溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、DMSO等，可以根据不同的免疫佐剂选用更匹配的溶剂辅助进行反应；所述离心的转速为10000-14000rpm。
一种上述基于OVA蛋白修饰的氧化铁锰杂化纳米药物的应用，在制备癌症的光热免疫复合治疗药物上的应用。
本发明可以直接用于癌症的光热免疫复合治疗，或者制备相关药物，特别是关于原位乳腺癌一类的光热免疫复合治疗。
实施本发明，具有如下有益效果：
(1)本发明制备过程简单、易于操作，采用种子生长法合成MnFe2O4 NPs，通过在其表面修饰PEG提高生物相容性，OVA物理包裹MnFe2O4 NPs，静电作用负载免疫佐剂，可以实现光热免疫复合疗法，具有重要的使用价值；
(2)本发明用OVA包覆的MnFe2O4 NPs作为杂化纳米平台负载免疫佐剂，如负载R837，形成R837-OVA-PEG-MnFe2O4 NPs用于原位乳腺癌等癌症的光热免疫复合治疗，制备得到的杂化纳米药物具有良好的光热免疫复合治疗效果，为新型多功能纳米药物的开发奠定了良好的基础。
附图说明
图1为本发明合成示意图。
图2本发明效果例1不同阶段制备物质分析图，其中：(a)为MnFe2O4 NPs的TEM图；(b)为OVA-PEG-MnFe2O4和R837-OVA-PEG-MnFe2O4 NPs的UV-vis光谱图；(c)为MnFe2O4，PEG-MnFe2O4和OVA-PEG-MnFe2O4 NPs的FTIR光谱图；(d)为PEG-MnFe2O4和OVA-PEG-MnFe2O4 NPs的热重分析图；(e)为PEG-MnFe2O4 NPs、OVA-PEG-MnFe2O4 NPs、R837-OVA-PEG-MnFe2O4 NPs的表面电势柱状图；(f)为不同浓度的OVA-PEG-MnFe2O4在805nm激光照射(1.2W/cm2)下的升温曲线图。
图3为本发明效果例1的MnFe2O4 NPs的元素mapping分析图。
图4为本发明效果例1的R837标准校准曲线示意图，其中：(a)为不同浓度的R837甲醇溶液的紫外光谱；(b)为R837甲醇溶液的紫外吸收标准曲线。
图5为本发明效果例1的OVA-PEG-MnFe2O4的0.5mg/mL溶液在激光打开-关闭状态下的升温与降温曲线图。
图6为本发明效果例2的细胞毒性评价示意图，其中：(a)为不同浓度的OVA-PEG-MnFe2O4与4T1细胞共培养24h后的相对细胞生存率；(b)为不同浓度的OVA-PEG-MnFe2O4与4T1细胞共培养6h后经805nm激光照射10min(1.2W/cm2)后，再孵育2h后的绝对细胞生存率(n＝3,***p<0.001,vs.PBS组)；(c)为400mg/mL的OVA-PEG-MnFe2O4在有无805nm激光照射的情况下(1.2W/cm2，10min)的活死细胞染色图。
图7为本发明效果例3中，DC2.4细胞经不同样品处理后，不同细胞因子分泌量示意图，其中：(a)为细胞上清液中TNF-α细胞因子分泌量示意图；(b)为细胞上清液中IL-6细胞因子分泌量示意图；(c)细胞上清液中IL-10细胞因子分泌量示意图。
图8为本发明效果例3中，BMDC细胞经不同样品处理后，成熟DC细胞的比例示意图(n＝3,**p<0.01,***p<0.001,vs.PBS组)，其中：(a,d)为CD40细胞量示意图；(b,e)为CD86细胞量示意图；(c,f)为MHC-II细胞量示意图。
图9为本发明效果例4接种4T1原位肿瘤的小鼠经不同方式治疗3天后血清中不同细胞因子含量示意图(n＝3,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs.PBS+光照)，其中：(a)为TNF-α细胞因子含量示意图；(b)为IL-6细胞因子含量示意图；(c)为IL-10细胞因子含量示意图。
图10为本发明效果例4治疗不同时间后，不同细胞活化百分比示意图(n＝3,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,vs.PBS+光照组)，其中：(a,d)为治疗3天后，淋巴细胞中CD11c+CD86+活化DC细胞的百分比；(b,e)为治疗7天后，脾细胞中CD4+IFN-γ+活化T细胞的百分比；(c,f)为治疗7天后，脾细胞中CD8+IFN-γ+活化T细胞的百分比。
图11为本发明效果例5接种原位4T1肿瘤的小鼠给药后，在激光照射下，不同时间点的红外热成像图。
图12为本发明效果例5接种原位4T1肿瘤的小鼠给药后不同数据示意图，其中：(a)为原位4T1肿瘤经不同方式治疗后肿瘤体积变化图；(b)为在接种肿瘤后100天内，原位4T1肿瘤经不同方式治疗后的小鼠存活率的变化曲线；(c)为原位4T1肿瘤经不同方式治疗15天后，肿瘤肺转移数目统计柱状图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例1
R837-OVA-PEG-MnFe2O4 NPs的制备，包括如下步骤(见图1)：
(1)MnFe2O4 NPs的合成采用种子生长法。详细来说是把醋酸锰(101.3mg,0.4mmol)、1,2-十六烷二醇(1033.8mg,4mmol)、2mL油酸(OA)、2mL OLA(油酰胺)用24mL二苄醚混合在25℃真空环境下搅拌30min。真空环境可以防止醋酸锰中的2价锰离子被氧化。加热至240℃后把醋酸铁(282.5mg，0.8mmol,8mL二苄醚)逐步加进去。继续加热至260℃，维持30min，之后自然冷却至室温，即得到5nm的MnFe2O4种子；
(2)将0.2mmol 5nm的MnFe2O4种子溶于5mL正己烷中与醋酸锰(126.6mg,0.5mmol)，醋酸铁(353.1mg,1mmol)，1-十八醇(1352.5mg,5mmol),OA(5mL),OLA(5mL)和二苄醚(16mL)混合均匀。将混合物在氩气气氛下缓慢加热至260℃，加热30min，冷却至室温，得到MnFe2O4NPs的产物；
(3)将制备好的MnFe2O4 NPs正己烷溶液(60mg/mL,1mL)加入2ml乙醇中。然后将混合物离心(12000rpm)15min得到MnFe2O4 NPs沉淀。将MnFe2O4 NPs沉淀溶解于5mL CH2Cl2中，与DSPE-PEG(20mg/mL,6mL CH2Cl2)超声混合20min，蒸发得到PEG修饰的MnFe2O4 NPs(PEG-MnFe2O4 NPs)；
(4)将PEG-MnFe2O4 NPs水溶液与OVA(10mg/mL,6mL超纯水)混合搅拌12h，离心(12000rmp，15min)即得到OVA-PEG-MnFe2O4 NPs；
(5)将R837(0.4mg/mL,3mL甲醇)加入OVA-PEG-MnFe2O4 NPs水溶液中(15mL超纯水)中敞口搅拌过夜，离心(12000rmp，15min)即得到R837-OVA-PEG-MnFe2O4 NPs。
实施例2
NLG919-OVA-PEG-MnFe2O4 NPs的制备，包括如下步骤(见图1)：
(1)MnFe2O4 NPs的合成采用种子生长法。详细来说是把醋酸锰(101.3mg,0.4mmol)、1,2-十六烷二醇(1033.8mg,4mmol)、3mL油酸(OA)、3mL OLA(油酰胺)用20mL二苄醚混合在20℃真空环境下搅拌20min。真空环境可以防止醋酸锰中的2价锰离子被氧化。加热至230℃后把醋酸铁(282.5mg，0.8mmol,8mL二苄醚)逐步加进去。继续加热至280℃，维持40min，之后自然冷却至室温，即得到9nm的MnFe2O4种子；
(2)将0.2mmol 9nm的MnFe2O4种子溶于5mL正己烷中与醋酸锰(126.6mg,0.5mmol)，醋酸铁(353.1mg,1mmol)，1-十八醇(1352.5mg,5mmol),OA(4mL),OLA(4mL)和二苄醚(14mL)混合均匀。将混合物在氩气气氛下缓慢加热至280℃，加热40min，冷却至室温，得到MnFe2O4NPs的产物；
(3)将制备好的MnFe2O4 NPs正己烷溶液(60mg/mL,1mL)加入2ml乙醇中。然后将混合物离心(10000rpm)20min得到MnFe2O4 NPs沉淀。将MnFe2O4 NPs沉淀溶解于6mL CH2Cl2中，与DSPE-PEG(20mg/mL,6mL CH2Cl2)超声混合30min，蒸发得到PEG修饰的MnFe2O4 NPs(PEG-MnFe2O4NPs)；
(4)将PEG-MnFe2O4 NPs水溶液与OVA(10mg/mL,6mL超纯水)混合搅拌10h，离心(10000rmp，20min)即得到OVA-PEG-MnFe2O4 NPs；
(5)将NLG919(0.3mg/mL,4mL乙醇)加入OVA-PEG-MnFe2O4 NPs水溶液中(12mL超纯水)中敞口搅拌过夜，离心(10000rmp，20min)即得到NLG919-OVA-PEG-MnFe2O4 NPs。
实施例3
IPI-549-OVA-PEG-MnFe2O4 NPs的制备，包括如下步骤(见图1)：
(1)MnFe2O4 NPs的合成采用种子生长法。详细来说是把醋酸锰(101.3mg,0.4mmol)、1,2-十六烷二醇(1033.8mg,4mmol)、2mL油酸(OA)、2mL OLA(油酰胺)用30mL二苄醚混合在30℃真空环境下搅拌20min。真空环境可以防止醋酸锰中的2价锰离子被氧化。加热至230℃后把醋酸铁(282.5mg，0.8mmol,8mL二苄醚)逐步加进去。继续加热至280℃，维持40min，之后自然冷却至室温，即得到7nm的MnFe2O4种子；
(2)将0.2mmol 7nm的MnFe2O4种子溶于5mL正己烷中与醋酸锰(126.6mg,0.5mmol)，醋酸铁(353.1mg,1mmol)，1-十八醇(1352.5mg,5mmol),OA(6mL),OLA(6mL)和二苄醚(20mL)混合均匀。将混合物在氩气气氛下缓慢加热至280℃，加热40min，冷却至室温，得到MnFe2O4NPs的产物；
(3)将制备好的MnFe2O4 NPs正己烷溶液(60mg/mL,1mL)加入2ml乙醇中。然后将混合物离心(14000rpm)10min得到MnFe2O4 NPs沉淀。将MnFe2O4 NPs沉淀溶解于7mL CH2Cl2中，与DSPE-PEG(20mg/mL,6mL CH2Cl2)超声混合30min，蒸发得到PEG修饰的MnFe2O4 NPs(PEG-MnFe2O4NPs)；
(4)将PEG-MnFe2O4 NPs水溶液与OVA(10mg/mL,6mL超纯水)混合搅拌10h，离心(14000rmp，10min)即得到OVA-PEG-MnFe2O4 NPs；
(5)将IPI-549(0.6mg/mL,2mL DMSO)加入OVA-PEG-MnFe2O4 NPs水溶液中(12mL超纯水)中搅拌过夜，离心(14000rmp，10min)即得到IPI-549-OVA-PEG-MnFe2O4 NPs。
效果例1
以实施例1所制备样品进行观测，经过观测发现，MnFe2O4 NPs分布均匀，粒径为9.3±1.1nm(见图2a)。为了确定样品的元素组成，进行了元素mapping分析，发现该纳米材料包括锰和铁元素(见图3)。紫外-可见光谱显示，MnFe2O4NPs在200～900nm范围内具有全光谱吸收(见图2b)，说明MnFe2O4 NPs可以作为给定近红外区域的光热剂。其负载R837药物之后，出现两个R837特征峰(310-330nm)，表明其成功负载R837(见图2b)。此外，根据R837的标准校准曲线(见图4)，R837的负载效率为76.3％。可见，相对于现有负载平台10％左右的负载效率，本发明负载效率有了质的飞跃，这可能与本发明利用OVA蛋白的表面负电性和R837的正电性相互吸引，通过静电作用有效地负载R837有关。通过红外光谱和热重分析(TGA)进一步证实了DSPE-PEG和OVA的修饰。对于OA包裹的MnFe2O4 NPs,C-H拉伸振动位于2920和2851cm-1处，1550和1427cm-1处的强峰值与油酸分子的不对称和对称COO-拉伸振动有关(见图2c)。配体交换后，PEG-MnFe2O4 NPs的红外光谱中出现了两个新的谱带，分别为1732和1107cm-1，分别对应于PEG链C＝O和C-O的拉伸振动(见图2c)。TGA测定了该纳米材料表面OVA含量为8.4％(见图2d)。OVA蛋白包覆PEG-MnFe2O4NPs后，其表面电势从-3.99±1.52mV降到-15.37±0.33mV，再次说明OVA蛋白成功修饰在PEG-MnFe2O4 NPs表面(见图2e)。当OVA-PEG-MnFe2O4 NPs负载R837药物后，其表面电势提高到-12.60±0.95mV，说明R837药物成功负载在OVA-PEG-MnFe2O4 NPs的表面(见图2e)。R837-OVA-PEG-MnFe2O4 NPs在不同浓度下激光照射10min，可以快速将近红外光转化为热能(见图2f)。例如，在2mg/mL浓度下，处理过的该杂化纳米药物的温度达到了69℃，而在相同条件下，处理过的水的温度仅为29℃。此外，经过5次激光开/关循环后，升温能力未见明显衰减，说明该杂化纳米药物显示出良好的光热稳定性(见图5)。
效果例2
以实施例1所制备样品为例，采用CCK-8评价了OVA-PEG-MnFe2O4 NPs的细胞毒性(见图6a)，不同浓度的OVA-PEG-MnFe2O4([MnFe2O4]＝0-0.4mg/mL)处理的4T1细胞存活率都超过90％，说明在一定浓度范围内，该纳米材料无明显细胞毒性。我们进一步评价了OVA-PEG-MnFe2O4 NPs的体外PTT(见图6b)，在激光照射下，随着该纳米材料浓度的增加，其细胞存活率逐渐降低。例如，当MnFe2O4 NPs的浓度为400mg/mL时，其绝对细胞存活率为18.0±4.2％，结合图6a，说明该纳米颗粒具有良好的体外PTT能力。活死细胞双染实验进一步证实以上结论，在激光照射下OVA-PEG-MnFe2O4 NPs处理的细胞大多数显示出PI显色的死细胞，而PBS+L或PBS处理的细胞大多数显示出Calcein-AM显色的活细胞(见图6c)。
效果例3
以实施例1所制备样品为例，设计实验如下：
DC细胞是一类抗原传递细胞，传递抗原到初始T细胞。我们用ELISA法分析DC细胞分泌的细胞因子，主要包括TNF-α、IL-6和IL-10等。DC2.4细胞经OVA-PEG-MnFe2O4，R837-OVA-PEG-MnFe2O4或R837都能显著提高TNF-α细胞因子的分泌，尤其是经R837-OVA-PEG-MnFe2O4(652.0±48.0pg/mL)和R837(644.3±52.0pg/mL)；相反，经PBS(60.8±5.8pg/mL)和PEG-MnFe2O4(83.0±12.5pg/mL)处理的DC细胞不能明显提高TNF-α的分泌量(见图7a)。类似的是，当DC2.4细胞经R837-OVA-PEG-MnFe2O4或R837处理后，IL-6的分泌水平也显著提高(见图7b)。这些结果说明，OVA和R837都能增强M1类相关因子的分泌(如TNF-α和IL-6)。另外，R837免疫佐剂可以提高IL-10的分泌，但是MnFe2O4 NPs可以减少IL-10的分泌(见图7c)。因此，MnFe2O4 NPs可以调低M2-相关因子的分泌(如IL-10)，从而减少机体免疫抑制。
接下来，我们用流式细胞仪技术分析BMDC细胞经PBS、PEG-MnFe2O4、OVA-PEG-MnFe2O4或R837-OVA-PEG-MnFe2O4处理后，成熟DC细胞(CD11c+CD40+和CD11c+CD86+)的比例(见图8)。相比于经PBS(27.9±2.5％的CD11c+CD40+和11.9±0.9％的CD11c+CD86+)或PEG-MnFe2O4(38.9±3.7％的CD11c+CD40+和23.9±3.4％的CD11c+CD86+)处理，BMDC细胞经OVA-PEG-MnFe2O4(49.7±6.2％的CD11c+CD40+和30.4±5.7％的CD11c+CD86+)或R837-OVA-PEG-MnFe2O4(70.8±0.2％的CD11c+CD40+和43.2±1.8％的CD11c+CD86+)处理后的成熟DC细胞比例都显著增加(见图8a,8b,8d,8e)。MHC-II是CD4 T细胞抗原呈递的关键成分，我们利用流式细胞仪对BMDC细胞分泌的MHC-II进行了评估。R837-OVA-PEG-MnFe2O4处理的BMDC细胞，MHC-II的表达水平为44.8±1.2％，高于OVA-PEG-MnFe2O4处理的41.8±4.5％、PEG-MnFe2O4处理的38.6±3.5％和PBS处理的20.1±1.3％(见图8c，8f)。以上结果表明，R837-OVA-PEG-MnFe2O4能在体外诱导较强的免疫反应。
效果例4
以实施例1所制备样品为例，设计实验如下：
为了评价R837-OVA-PEG-MnFe2O4在激光照射下诱导的体内免疫反应，4T1荷瘤小鼠的肿瘤经不同方式处理3天后，血液被采集。我们用ELISA法分析血液中TNF-α、IL-6、IL-10等细胞因子。经R837-OVA-PEG-MnFe2O4给药并光照处理后，血清中TNF-α和IL-6的分泌水平要远高于其他治疗组(见图9a，9b)。另外，经PEG-MnFe2O4+光照或OVA-PEG-MnFe2O4+光照处理小鼠血清中IL-10分泌水平低于PBS+光照和R837-OVA-PEG-MnFe2O4+光照处理小鼠(见图9c)。这一结果表明MnFe2O4可以下调体内M2相关细胞因子的表达(如IL-10)，这与体外免疫反应数据一致。因此，基于MnFe2O4的杂化纳米药物可以降低R837诱导的体内免疫抑制。PTT治疗后第3天从小鼠淋巴结中分离淋巴细胞，流式细胞仪技术分析发现在805nm激光照射下，R837-OVA-PEG-MnFe2O4比其他处理方式产生了更高比例的CD11c+DC86+成熟的DC细胞(见图10a，10d)。R837-OVA-PEG-MnFe2O4+光照处理的小鼠DC细胞成熟率最高达21.3±0.1％，高于OVA-PEG-MnFe2O4+光照组的19.3±0.9％，PEG-MnFe2O4+光照组的18.4±0.6％和PBS+光照组的13.6±0.3％。
接下来，我们研究了OVA包覆和R837负载的纳米材料在激光照射的条件下是否会引起机体T细胞的活化。小鼠经不同方式治疗7天后，分析了脾脏中脾细胞中CD4+IFN-γ+(见图10b，10e)和CD8+IFN-γ+(见图10c，10f)活化T细胞情况。相比其他方式处理的小鼠，R837-OVA-PEG-MnFe2O4+光照处理的小脾细胞能产生更多的CD4+IFN-γ+(1.16±0.07％)和CD8+IFN-γ+(1.13±0.17％)。以上结果表明，基于R837-OVA-PEG-MnFe2O4的PTT在体内可以显著增强免疫应答，同时降低R837诱导的机体免疫抑制。
效果例5
以实施例1所制备样品为例，设计实验如下：
我们利用原位4T1乳腺肿瘤模型评估了基于R837-OVA-PEG-MnFe2O4杂化纳米药物的体内光热免疫治疗效果。在激光照射下，这些基于MnFe2O4的纳米药物可以显著地将近红外光转化为热能(见图11)。这些基于MnFe2O4的PTT在治疗肿瘤区域照射2min后温度均在50℃以上，直至结束温度均保持在55℃左右，而PBS+光照10min后温度依旧低于42℃。
基于MnFe2O4类的纳米药物+L组与未受激光照射的R837-OVA-PEG-MnFe2O4或PBS治疗组相比，具有明显的肿瘤抑制作用，尤其是OVA-PEG-MnFe2O4+L组和R837-OVA-PEG-MnFe2O4+L组，其肿瘤基本消失(见图12a)。另外，R837-OVA-PEG-MnFe2O4+L组，相比于其他组，更加有效地提高了小鼠的生存率，治疗100天后仍有33.3％的存活率(见图12b)。肿瘤肺转移实验再次证明R837-OVA-PEG-MnFe2O4+L组更能抑制肺转移(见图12c)。
以上所阐述的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
Claims (10)
1.一种基于OVA蛋白修饰的氧化铁锰杂化纳米药物，其特征在于，用OVA包覆的MnFe2O4NPs作为杂化纳米平台负载免疫佐剂；
包括如下步骤制备：
A、把醋酸锰、1,2-十六烷二醇、油酸、油酰胺用二苄醚混合，并在真空环境下搅拌，加热后逐滴滴加醋酸铁，并继续加热，之后冷却，得到MnFe2O4纳米种子；
B、将所述MnFe2O4纳米种子溶于正己烷中，并与醋酸锰、醋酸铁、1-十八醇、油酸、油酰胺、二苄醚混合均匀后在惰性气体气氛下缓慢加热，之后冷却，得到溶有MnFe2O4纳米颗粒的正己烷溶液，之后加入乙醇，离心得到MnFe2O4NPs沉淀；
C、将所述MnFe2O4 NPs沉淀溶于CH2Cl2中，与DSPE-PEG溶液超声混合，之后冷凝蒸发，水洗得到PEG修饰的MnFe2O4 NPs的水溶液，即得到PEG-MnFe2O4 NPs；
D、将所述PEG-MnFe2O4 NPs的水溶液与OVA水溶液混合搅拌，离心得到OVA-PEG-MnFe2O4NPs的水溶液
E、将溶有所述免疫佐剂的溶液加入所述OVA-PEG-MnFe2O4 NPs的水溶液中搅拌，离心得到免疫佐剂-OVA-PEG-MnFe2O4 NPs杂化纳米药物。
2.权利要求1所述基于OVA蛋白修饰的氧化铁锰杂化纳米药物，其特征在于，所述免疫佐剂包括R837、NLG919、IPI-549中的一种。
3.一种权利要求1所述基于OVA蛋白修饰的氧化铁锰杂化纳米药物的制备方法，其特征在于，包括：
A、把醋酸锰、1,2-十六烷二醇、油酸、油酰胺用二苄醚混合，并在真空环境下搅拌，加热后逐滴滴加醋酸铁，并继续加热，之后冷却，得到MnFe2O4纳米种子；
B、将所述MnFe2O4纳米种子溶于正己烷中，并与醋酸锰、醋酸铁、1-十八醇、油酸、油酰胺、二苄醚混合均匀后在惰性气体气氛下缓慢加热，之后冷却，得到溶有MnFe2O4纳米颗粒的正己烷溶液，之后加入乙醇，离心得到MnFe2O4NPs沉淀；
C、将所述MnFe2O4 NPs沉淀溶于CH2Cl2中，与DSPE-PEG溶液超声混合，之后冷凝蒸发，水洗得到PEG修饰的MnFe2O4 NPs的水溶液，即得到PEG-MnFe2O4 NPs；
D、将所述PEG-MnFe2O4 NPs的水溶液与OVA水溶液混合搅拌，离心得到OVA-PEG-MnFe2O4NPs的水溶液
E、将溶有所述免疫佐剂的溶液加入所述OVA-PEG-MnFe2O4 NPs的水溶液中搅拌，离心得到免疫佐剂-OVA-PEG-MnFe2O4 NPs杂化纳米药物。
4.根据权利要求3所述基于OVA蛋白修饰的氧化铁锰杂化纳米药物的制备方法，其特征在于，包括：
A、把醋酸锰、1,2-十六烷二醇、油酸、油酰胺用二苄醚混合，并在20-30℃真空环境下搅拌20-30min，之后加热至230-240℃，再逐滴滴加醋酸铁，并继续加热至260-280℃，持续30-40min，之后自然冷却至室温，得到所述MnFe2O4纳米种子；
B、将所述MnFe2O4纳米种子溶于正己烷中，并与醋酸锰、醋酸铁、1-十八醇、油酸、油酰胺、二苄醚混合均匀后在氩气气氛下缓慢加热至260-280℃，持续30-40min，之后冷却至室温，得到所述溶有MnFe2O4纳米颗粒的正己烷溶液，之后加入乙醇，离心得到所述MnFe2O4NPs沉淀；
C、将所述MnFe2O4 NPs沉淀溶于CH2Cl2中，与所述DSPE-PEG溶液超声混合20-30min，之后冷凝蒸发，水洗得到所述PEG修饰的MnFe2O4 NPs的水溶液，即得到所述PEG-MnFe2O4 NPs；
D、将所述PEG-MnFe2O4 NPs的水溶液与所述OVA水溶液混合搅拌10-12h，离心得到所述OVA-PEG-MnFe2O4 NPs的水溶液；
E、将溶有所述免疫佐剂的溶液加入所述OVA-PEG-MnFe2O4 NPs的水溶液中搅拌20-30h，离心得到所述免疫佐剂-OVA-PEG-MnFe2O4 NPs杂化纳米药物。
5.根据权利要求3或4所述基于OVA蛋白修饰的氧化铁锰杂化纳米药物的制备方法，其特征在于，在所述步骤A中，所述醋酸锰、所述醋酸铁与所述1,2-十六烷二醇的摩尔比为1：2：10，所述醋酸锰的质量为80-120mg，所述油酸和所述油酰胺的体积均为2-3mL，所述二苄醚的体积为20-30mL，所述MnFe2O4纳米种子的粒径为5-9nm。
6.根据权利要求3或4所述基于OVA蛋白修饰的氧化铁锰杂化纳米药物的制备方法，其特征在于，在所述步骤B中，所述醋酸锰、所述醋酸铁与所述1-十八醇的摩尔比为1：2：10，所述醋酸锰的质量为100-140mg，所述油酸和所述油酰胺的体积均为4-6mL，所述二苄醚的体积为14-20mL，所述离心的转速为10000-14000rpm，所述乙醇的体积为2-3mL。
7.根据权利要求3或4所述基于OVA蛋白修饰的氧化铁锰杂化纳米药物的制备方法，其特征在于，在所述步骤C中，所述MnFe2O4纳米沉淀与所述DSPE-PEG的质量比为1：2，所述MnFe2O4纳米沉淀的质量为50-60mg，所述CH2Cl2的体积为5-7mL，所述DSPE-PEG溶液的浓度为15-20mg/mL。
8.根据权利要求3或4所述基于OVA蛋白修饰的氧化铁锰杂化纳米药物的制备方法，其特征在于，在所述步骤D中，所述PEG-MnFe2O4 NPs与所述OVA的质量比为1：(1-1.2)，所述OVA水溶液的浓度为8-12mg/mL，离心后所述OVA-PEG-MnFe2O4 NPs的水溶液浓度为10-20mg/mL。
9.根据权利要求3或4所述基于OVA蛋白修饰的氧化铁锰杂化纳米药物的制备方法，其特征在于，在所述步骤E中，所述OVA-PEG-MnFe2O4 NPs与所述免疫佐剂的质量比(50-100):1；所述免疫佐剂的浓度为0.3-0.5mg/mL，溶解所述免疫佐剂的溶剂包括甲醇、乙醇、DMSO中的一种；所述离心的转速为10000-14000rpm。
10.一种根据权利要求1所述基于OVA蛋白修饰的氧化铁锰杂化纳米药物的应用，其特征在于，在制备癌症光热免疫复合治疗药物上的应用。
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