WO2015156385A1 - ホウ素化合物を内包および外壁に担持するカーボンナノホーン及びその製造方法 - Google Patents

ホウ素化合物を内包および外壁に担持するカーボンナノホーン及びその製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2015156385A1
WO2015156385A1 PCT/JP2015/061209 JP2015061209W WO2015156385A1 WO 2015156385 A1 WO2015156385 A1 WO 2015156385A1 JP 2015061209 W JP2015061209 W JP 2015061209W WO 2015156385 A1 WO2015156385 A1 WO 2015156385A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cnh
boron
carbon nanohorn
wall
plpeg
Prior art date
Application number
PCT/JP2015/061209
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
陽子 飯泉
俊也 岡崎
湯田坂　雅子
譲 池原
民芳 張
Original Assignee
国立研究開発法人産業技術総合研究所
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立研究開発法人産業技術総合研究所 filed Critical 国立研究開発法人産業技術総合研究所
Priority to JP2016512786A priority Critical patent/JP6281991B2/ja
Publication of WO2015156385A1 publication Critical patent/WO2015156385A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0087—Galenical forms not covered by A61K9/02 - A61K9/7023
    • A61K9/0092—Hollow drug-filled fibres, tubes of the core-shell type, coated fibres, coated rods, microtubules or nanotubes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to a carbon nanohorn having a boron compound supported on an inner wall and an outer wall and a method for producing the same, and more particularly to a carbon nanohorn having a boron compound supported on an inner wall and an outer wall used for boron neutron capture therapy (BNCT). It relates to a manufacturing method.
  • BNCT boron neutron capture therapy
  • boron neutron capture therapy In boron neutron capture therapy, boron compounds that are more likely to collect in cancer tissues than normal tissues are taken into cancer cells in advance and irradiated with thermal neutrons with low energy from the outside. This is a technique that favors neutron capture, causes fission at the same time as capture, generates alpha particles, and kills nearby cancer cells with the alpha particles.
  • Boron neutron capture therapy requires a boron preparation that has high affinity and selectivity for tumors and that can minimize accumulation and damage to normal tissues.
  • Phenylalanine, orthodecaborane, and the like have problems such as insufficient chemical stability and difficulty in increasing the amount accumulated in the tumor, and the effect of boron neutron capture therapy cannot be enhanced.
  • Non-Patent Document 1 carbon nanotubes containing BN nanotubes have been reported (see Non-Patent Document 1).
  • the non-patent document 1 does not mention use as a preparation for boron neutron capture therapy.
  • the diameter of the carbon nanotube is small, it is difficult to increase the amount of inclusion.
  • Carbon nanotubes also have the disadvantage that the tubes are agglomerated by van der Waals forces and difficult to disperse.
  • the present inventors have selected boron compounds as tumor cells by using carbon nanohorns carrying boron compounds on the inner and outer walls as neutron capture therapy preparations. We have obtained the knowledge that it is possible to increase the tumor accumulation amount of boron.
  • a carbon nanohorn characterized in that a boron compound is supported on the inner and outer walls.
  • a carbon nanohorn complex wherein the surface of the carbon nanohorn according to [1] or [2] is modified by physically attaching a phospholipid PEG to which an antibody or folic acid is added.
  • a carbon nanohorn complex characterized in that antibody-added polyethylene glycol is chemically bonded to the functional group introduced into the carbon nanohorn according to [1] or [2].
  • a boron neutron capture therapy preparation comprising the carbon nanohorn according to [1] or [2] or the carbon nanohorn complex according to [5] or [6] as an active ingredient.
  • the carbon nanohorn (hereinafter also referred to as “BN-CNH”) carrying the boron compound of the present invention on the inner wall and the outer wall has a carbon nanohorn (hereinafter also referred to as “CNH”) diameter of 2. Since it is as large as ⁇ 5 nm, it contains a large amount of boron compound, and it is possible to increase the tumor accumulation amount of boron. Further, since the specific surface area is 300-400 m 2 / g, a large amount of boron compound can be supported on the outer wall.
  • BN-CNH when ammonia borane (H 3 N—BH 3 ) is used as a raw material, BN-CNH can be obtained by changing from ammonia borane to BN by heating, and at that time BN stays inside or outside the CNH. it can.
  • CNH since CNH is chemically stable and it is easy to modify its outer wall, the tumor when administered in blood by chemically or physically modifying BN-CNH of the present invention It is possible to increase the amount of storage in Furthermore, CNH used in the present invention has a spherical structure of about 100 nm, and the surface is rich in unevenness, so that it does not agglomerate strongly and is isolated and dispersed in the solution. Accordingly, appropriately surface-modified BN-CNH can realize accumulation in a tumor and enhance the effect of boron neutron capture therapy when administered in vivo.
  • Figure (a) showing the number of boron atoms per carbon atom of BN-CNH synthesized at different temperatures, after immersing BN-CNH in each of phosphate buffered saline and cell culture medium for 3 days
  • Figures (b, c) showing the amount of boron remaining in BN-CNH as a percentage of the amount of boron before immersion, and the amount of boron in BN-CNH in% when the immersion in PBS was extended to 10 days
  • Figure (d) BN-CNH transmission electron micrograph (ad) and BN-CNH electron energy loss spectrum (e), ⁇ in Fig. (E) is inserted BN-CNH electron micrograph The location where the electron energy loss spectrum was measured is shown.
  • the present invention is characterized in that a boron compound is supported on an inner wall and an outer wall of a carbon nanohorn.
  • the method for producing the carbon nanohorn in the present invention is not particularly limited, and any method such as a CVD method, a laser ablation method, or an arc discharge method may be used.
  • the boron compound to be supported on the inner wall and the outer wall of the carbon nanohorn and the method thereof are not particularly limited, and examples thereof include a method in which ammonia borane is used as a raw material and heated together with CNH.
  • BN-CNH can be obtained by changing from ammonia borane to BN by heating, and at that time BN stays in the CNH or on the outer wall.
  • the chemical reaction formula is as follows. NH 3 BH 3 ⁇ BN + 3H 2
  • the BN-CNH of the present invention is chemically added to increase the amount of accumulation in the tumor when administered in blood. Alternatively, it can be physically modified.
  • BN-CNH can be accumulated specifically in cancer cells.
  • the BN-CNH of the present invention is oxidized to introduce a carboxyl group, and then PEG-COOH is added to the carboxyl group of the obtained BN-CNH by an amide bond, so that BN-CNH-PEG- COOH was obtained, and a small amount of N-hydroxysuccinimide (NHS) and EDC was added to the obtained BN-CNH-PEG-COOH to obtain BN-CNH-PEG-NHS, and then triethylamine and EGF were added.
  • BN-CNH-PEG-EGF can be obtained.
  • BN-CNH can be specifically accumulated in cancer cells by physically binding PLPEG-FA to the surface of BN-CNH of the present invention.
  • PLPEG phospholipid PEG
  • FA folic acid
  • the resulting PLPEG-FA is physically converted into carbon nanotubes by van der Waals force.
  • PLPEG-FA can be obtained according to the present invention by a similar method.
  • PEG poly (ethylene glycol) derivatized distearoylphosphatidylethanolamine
  • FA folic acid
  • PEG-FA folic acid
  • BN-CNH was recovered by filtration, and the amount of boron remaining in BN-CNH was measured and estimated by ICP using the method described above.
  • the boron content in BN-CNH is expressed as a percentage of the boron content before immersion, it was as shown in FIGS. 1b and 1c, respectively.
  • BN—CNH heated at 750 ° C. or higher was considered to have a stable structure.
  • BN—CNH heated at 800 ° C. was used for structural evaluation.
  • BN-CNH was added to the cell culture solution (2 mL), dispersed for 5 minutes with an ultrasonic cleaner, and allowed to stand for 0 to 10 days. After standing, BN-CNH was recovered by filtration, and the amount of boron remaining in BN-CNH was measured by ICP by the above method and estimated. The amount of boron in BN—CNH is shown in FIG. 1d as a percentage of the amount of boron before immersion. It was found that the amount of boron in BN-CNH was kept at 75-80% of the amount of boron before immersion even after 10 days immersion.
  • BN-CNH Transmission electron microscope observation (TEM) and electron energy loss spectroscopy (EELS) measurement
  • TEM transmission electron microscope observation
  • EELS electron energy loss spectroscopy
  • DLS Dynamic light scattering measurement
  • the average particle size of BN—CNH shown in b is about 130 nm, which is almost the same as the average particle size of about 120 nm of the original CNH shown in a, and the structure is not greatly changed by the operation of supporting the boron compound on the inner wall and outer wall. It suggests that. Since the average diameter of CNH is known to be about 100 nm by electron microscope observation, it can be seen that BN—CNH dispersed in PBS with PLPEG is dispersed almost alone. This dispersion state was stable for at least several days.
  • BN-CNH surface modification In order to accumulate a high concentration of BN-CNH in the tumor, the BN-CNH surface was coated with polyethylene glycol (PEG) to avoid phagocytosis by macrophages, and folic acid (FA) was added to BN-CNH to add BN- CNH is selectively taken up by cancer cells.
  • PEG polyethylene glycol
  • FA folic acid
  • the obtained liquid was put into a dialysis membrane (MWCO 3500), immersed in 2 L of water, and allowed to stand at room temperature. About 1 day later, 2 L of water was replaced five times to remove unreacted PLPEG molecules. The obtained liquid was freeze-dried to obtain PLPEG-FA powder. The structure of PLPEG-FA was confirmed by 1 H NMR.
  • PLPEG-FA 4 mg
  • BN-CNH 3 mg
  • PBS phosphate buffered saline
  • the lipid group (alkyl chain) of PLPEG-FA was bonded to the surface of BN-CNH with one-delwal force to synthesize BN-CNH / PLPEG-FA that is selectively taken up by cancer cells.
  • BN-CNH / PLPEG (a) and CNH / PLPEG (c) were less uptake into KB cells, but BN-CNH / PLPEG-FA (b) and CNH / PLPEG -FA (d) was taken up in large quantities by KB cells.
  • a cell lysate was prepared with a cell lysis reagent, and the amount of protein and the amount of CNH in this solution were measured.
  • cell debris was removed and separated from CNH by a centrifuge (1800 ⁇ g, 50 minutes).
  • Bradford solution 250 ⁇ L was added to the supernatant cell lysate (10 ⁇ L), and the absorption intensity at a wavelength of 595 nm was measured.
  • the amount of BN-CNH taken up by the cells was estimated by measuring the absorption intensity at a wavelength of 700 nm after applying the cell lysate to chip-type sonication for 10 minutes.
  • the amount of BN-CNH / PLPEG-FA uptake in cancer cells was calculated from the amount of protein and the amount of CNH by the above operation. The result is shown in FIG. As a result, it was found that BN-CNH can be easily taken up by cancer cells by modifying PLPEG-FA, similar to CNH.
  • the BN-CNH of the present invention carries a large amount of boron compound on the inner wall and outer wall, and in particular, the appropriately surface-modified BN-CNH realizes accumulation in a tumor when administered in vivo, and boron Since the effect of neutron capture therapy can be enhanced, it can be used in the pharmaceutical manufacturing industry that provides components useful for boron neutron capture therapy.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Carbon And Carbon Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

　本発明は、従来のホウ素中性子捕捉療法に使われているホウ素製剤のホウ素の腫瘍蓄積量が少ないという欠点を解決して、ホウ素の腫瘍蓄積量が多いホウ素製剤を提供することを目的とするものであり、ホウ素化合物を内包するカーボンナノホーン(ＢＮ－ＣＮＨ)を、ホウ素中性子捕捉療法製剤の有効成分とすることにより、ホウ素化合物を腫瘍細胞へ選択的に送達し、ホウ素の腫瘍蓄積量を上げることを可能にする。該ＢＮ－ＣＮＨは、好ましくは、原料にアンモニアボランを用い、カーボンナノホーンとともに加熱することにより製造される。

Description

ホウ素化合物を内包および外壁に担持するカーボンナノホーン及びその製造方法
　本発明は、ホウ素化合物を内包および外壁に担持するカーボンナノホーン及びその製造方法に関し、特に、ホウ素中性子捕捉療法(ＢＮＣＴ：Boron Neutron Capture Therapy)に用いるホウ素化合物を内包および外壁に担持するカーボンナノホーン及びその製造方法に関するものである。
　ホウ素中性子捕捉療法は、正常組織よりもがん組織に集合しやすいホウ素化合物を、あらかじめ癌細胞内に取り込ませておき、外部からエネルギーの低い熱中性子線を照射すると、ホウ素の原子核が低速の熱中性子を好んで捕捉し、捕捉と同時に核分裂を起こし、α粒子を発生し、このα粒子で近傍のがん細胞を殺傷させる手法である。
　ホウ素中性子捕捉療法では、腫瘍に対して高い親和性と選択性を持ち、かつ正常組織に対する蓄積・損傷を最小限にすることが可能なホウ素製剤が必須であるが、現在使われている、ホウ素フェニルアラニンやオルトデカボランなどでは、化学的安定性が十分でないことや腫瘍への蓄積量を上げることが困難であるなどの問題があり、ホウ素中性子捕捉療法の効果を高めることができない。
　近年、ホウ素中性子捕捉療法用製剤の性能向上を目指して多くの研究が進められるようになり、ポルフィリンやフラーレン(特許文献１参照)、あるいはヘテロポリ酸(特許文献２参照)などの化合物中にホウ素を導入した例、リポソーム中にＢＳＨやＢＰＡを導入したもの(特許文献３および４参照)、カルボランのような無機系ホウ素化合物(特許文献５参照)の利用、ポリマーにＢＰＡ等を含む化合物を反応させたもの(特許文献６参照)などの複合系を利用しようとする試みも行われている。しかし、これらのいずれの手法も、ホウ素の量を飛躍的に向上することは不可能である。
　一方、ＢＮナノチューブを内包したカーボンナノチューブが報告されている(非特許文献１参照)。しかしながら、該非特許文献１には、ホウ素中性子捕捉療法用製剤としての利用については、触れられていない。
　また、カーボンナノチューブでは、直径が細いために内包量を上げることが困難である。また、カーボンナノチューブは、チューブ同士がファンデルワールス力で凝集し、分散させることが困難であるという欠点を有する。
特開２００５－５３９０４号公報 特開２００４－２５６３７０号公報 特開２００６－６３００８号公報 特開２００６－６３００９号公報 特開２００２－３４８３８１号公報 特開２００６－５０２９９３号公報
Nakanishiet al. Scientific Report, Vol.3, Article No.1385, 2013
　前述のとおり、これまでの、ホウ素中性子捕捉療法に使われているホウ素製剤は、腫瘍蓄積量が少ないという欠点を有する。
　本発明は、こうした現状を鑑みてなされたものであって、ホウ素の腫瘍蓄積量が多いホウ素製剤を提供することを目的とするものである。
　本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、中性子捕捉療法用製剤として、ホウ素化合物を内包および外壁に担持するカーボンナノホーンを用いることにより、ホウ素化合物を腫瘍細胞へ選択的に送達し、ホウ素の腫瘍蓄積量を上げることが可能になるという知見を得た。
　本発明はこれらの知見に基づいて完成に至ったものであり、本発明によれば、以下の発明が提供される。
［１］ホウ素化合物が内包及びおよび外壁に担持されていることを特徴とするカーボンナノホーン。
［２］前記ホウ素化合物が、窒化ホウ素であることを特徴とする[１]に記載のカーボンナノホーン。
［３］ホウ素化合物の原料にアンモニアボランを用い、カーボンナノホーンとともに加熱することを特徴とする、ホウ素化合物が内包および外壁に担持されているカーボンナノホーンの製造方法。
［４］７５０℃以上に加熱することを特徴とする[３]に記載の、ホウ素化合物が内包および外壁に担持されているカーボンナノホーンの製造方法。
［５］[１]又は[２]に記載のカーボンナノホーンの表面に、抗体または葉酸を付加させたリン脂質ＰＥＧが物理的に付着して表面修飾されていることを特徴とするカーボンナノホーン複合体。
［６］[１]又は[２]に記載のカーボンナノホーンに導入された官能基に、抗体付加ポリエチレングリコールが化学結合されていることを特徴とするカーボンナノホーン複合体。
［７］[１]又は[２]に記載のカーボンナノホーン或いは[５]又は[６]に記載のカーボンナノホーン複合体を有効成分として含有することを特徴とするホウ素中性子捕捉療法用製剤。
　本発明のホウ素化合物を内包および外壁に担持しているカーボンナノホーン(以下、「ＢＮ－ＣＮＨ」ということもある。)は、カーボンナノホーン(以下、「ＣＮＨ」ということもある。)の直径が２～５ｎｍと大きいために、大量のホウ素化合物を内包しており、ホウ素の腫瘍蓄積量を上げることが可能になる。また、比表面積が３００－４００ｍ２／ｇであるため、外壁にも大量のホウ素化合物を担持できる。特に、原料としてアンモニアボラン(Ｈ３Ｎ－ＢＨ３)を用いた場合、加熱によりアンモニアボランからＢＮへ変化し、その際にＢＮがＣＮＨ内部や外壁にとどまることで、BN－CNHをえることができる。
　また、ＣＮＨは化学的に安定であって、その外壁を修飾することが容易であるので、本発明のＢＮ－ＣＮＨを化学的にあるいは物理的に修飾することにより、血中投与した際の腫瘍での蓄積量を上げることが可能となる。
　さらに、本発明に用いるＣＮＨは、１００ｎｍ程度の球状構造をとっていて、しかも表面は凹凸に富んだ構造をしているため、強く凝集することはなく、溶液中にて孤立分散する。したがって、適切に表面修飾したＢＮ－ＣＮＨは、生体内投与した際に、腫瘍への蓄積を実現させ、ホウ素中性子捕捉療法の効果を高めることができる。
異なる温度で合成したＢＮ－ＣＮＨの炭素原子１個あたりのホウ素原子数を示す図(ａ)、ＢＮ－ＣＮＨを、リン酸緩衝生理食塩水及び細胞培養液のそれぞれに３日間浸したのちに、ＢＮ－ＣＮＨに残ったホウ素の量を浸漬前のホウ素量の％で表した図(ｂ、ｃ)、及びＰＢＳ中への浸漬を１０日間まで延長したときのＢＮ－ＣＮＨのホウ素量を％で表した図(ｄ) ＢＮ－ＣＮＨの透過電子顕微鏡写真(ａ－ｄ)、及びＢＮ－ＣＮＨの電子エネルギー損失スペクトルを示す図(ｅ)であり、図(ｅ)中の○は、ＢＮ－ＣＮＨの電子顕微鏡写真を挿入し電子エネルギー損失スペクトルを測定した場所を示す。 ＢＮ－ＣＮＨのＸＰＳ測定結果を示す図。 ＢＮ－ＣＮＨをリン酸緩衝生理食塩水中に分散させた際の粒径分布を示す図。 ＫＢ細胞にＢＮ－ＣＮＨ／ＰＬＰＥＧ(ａ)、ＢＮ－ＣＮＨ／ＰＬＰＥＧ－ＦＡ(ｂ)、ＣＮＨ／ＰＬＰＥＧ(ｃ)、ＣＮＨ／ＰＬＰＥＧ－ＦＡ(ｄ)を添加し、２４時間培養した後の共焦点レーザー顕微鏡写真(ａ～ｄ)と、タンパク質量で規格化したＣＮＨ取り込み量を示す図(ｅ)。 正常細胞にＢＮ－ＣＮＨ／ＰＬＰＥＧ(ａ)、ＢＮ－ＣＮＨ／ＰＬＰＥＧ－ＦＡ(ｂ)、ＣＮＨ／ＰＬＰＥＧ(ｃ)、ＣＮＨ／ＰＬＰＥＧ－ＦＡ(ｄ)を添加し、２４時間培養した後の共焦点レーザー顕微鏡写真(ａ～ｄ)と、タンパク質量で規格化したＣＮＨ取り込み量を示す図(ｅ)。
　本発明は、カーボンナノホーンにホウ素化合物が内包および外壁に担持されていることを特徴とするものである。
　本発明におけるカーボンナノホーンの製造方法は、特に限定されず、ＣＶＤ法、レーザーアブレーション法、アーク放電法など、いずれの方法であっても構わない。
　本発明において、カーボンナノホーンに内包および外壁に担持させるホウ素化合物及びその方法は、特に限定されないが、たとえば、原料にアンモニアボランを用い、ＣＮＨとともに加熱する方法があげられる。該方法によれば、加熱によりアンモニアボランからＢＮへ変化し、その際にＢＮがＣＮＨ内部や外壁にとどまることで、BN－CNHを得ることができる。
　ちなみに、化学反応式は、以下のとおりである。
　　　ＮＨ3ＢＨ3　→　ＢＮ＋３Ｈ2
　カーボンナノホーンは化学的に安定であって、その外壁を化学修飾することが容易であるので、血中投与した際に腫瘍での蓄積量を上げるために、本発明のＢＮ－ＣＮＨを化学的にあるいは物理的に修飾することができる。
　化学的な修飾の一例として、例えば、本発明のＢＮ－ＣＮＨに、ＰＥＧを介して、がん細胞にその受容体が多数形成されている上皮成長因子(ＥＧＦ：Epidermal Growth Factor)を結合させることで、ＢＮ－ＣＮＨをがん細胞に特異的に集積させることができる。
　具体的には、本発明のＢＮ－ＣＮＨを酸化処理してカルボキシル基を導入した後、得られたＢＮ－ＣＮＨのカルボキシル基にアミド結合によりＰＥＧ－ＣＯＯＨを付加して、ＢＮ－ＣＮＨ-ＰＥＧ－ＣＯＯＨを得、得られたＢＮ－ＣＮＨ－ＰＥＧ－ＣＯＯＨに、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド(ＮＨＳ)とＥＤＣを少量加えて、ＢＮ－ＣＮＨ－ＰＥＧ－ＮＨＳを得た後、トリエチルアミンとＥＧＦを加えて、ＢＮ－ＣＮＨ－ＰＥＧ－ＥＧＦを得ることができる。
　また、物理的な修飾の一例として、例えば、本発明のＢＮ－ＣＮＨの表面に、ＰＬＰＥＧ－ＦＡを物理的に結合させることで、ＢＮ－ＣＮＨをがん細胞に特異的に集積させることができる。
　すなわち、がん細胞には葉酸受容体が多数形成されているため、リン脂質ＰＥＧ(ＰＬＰＥＧ)と葉酸(ＦＡ)を反応さて、得られたＰＬＰＥＧ－ＦＡをカーボンナノチューブにファンデルワールス力により物理的に付着させるとカーボンナノチューブががん細胞に集積しやすくなることが示されており(飯泉陽子、博士学理論文、筑波大学、２０１２年参照)、同様な手法により、ＰＬＰＥＧ－ＦＡを、本発明のＢＮ－ＣＮＨの表面に物理的に結合させると、ＢＮ－ＣＮＨをがん細胞に特異的に集積させることが可能となる。
　以下に、リン脂質ＰＥＧ(ポリ(エチレングリコール)誘導体化ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、以下、「ＰＬＰＥＧ」とする。)、葉酸(ＦＡ)、及びその化合物(ＰＬＰＥＧ－ＦＡ)の分子構造と反応式を示す(前掲論文、図５－９参照)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
　（ＢＮ－ＣＮＨの作製）
　ＣＮＨは乾燥空気中で室温から５００℃まで１℃／ｍｉｎで昇温し、その後放冷して開孔させた。アンモニアボラン１ｍｇと開孔ＣＮＨ１ｍｇをガラス容器にいれて、４×１０-4Ｐａにて２時間真空排気後、ガラス容器の一端を封じ切ってアンプルを得た。
　得られた試料入りアンプルを電気炉に入れ、２４時間かけて所定の温度(５５０℃から８５０℃までの、５０℃毎に異なる温度)まで昇温し、２４時間保った後、放冷させた。この処理により、ＢＮ－ＣＮＨを得た。
　アンプルを開封して、ＢＮ－ＣＮＨを取り出し、エタノールで遊離している余剰なホウ素化合物をフィルターろ過することで洗い流した後、構造評価に用いた。
　（誘導結合プラズマ(ＩＣＰ)発光測定）
　各温度で合成したＢＮ－ＣＮＨを、それぞれ、１％ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム水溶液中に０.０５ｍｇ／ｍＬになるように加え、チップ型ソニケーションで５分間処理し、ＢＮ－ＣＮＨ分散溶液を得た。これをＩＣＰ発光測定することにより、ＢＮ－ＣＮＨ中のホウ素含有量を定量した。その結果を図１ａに示す。
　また、ＢＮ－ＣＮＨ(１ｍｇ)を、リン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)(２ｍＬ)及び細胞培養液(Cell Culture Meddium)(２ｍＬ)にそれぞれ加え、超音波洗浄機を用いて５分間分散させた後、３日間静置させた。３日間静置後、濾過によりＢＮ－ＣＮＨを回収し、ＢＮ－ＣＮＨに残っていたホウ素量を上述の方法でＩＣＰにて測定して見積もった。ＢＮ－ＣＮＨ中のホウ素量は、浸漬前のホウ素量に対する％で示すと、それぞれ図１ｂ、ｃのようになった。
　図１ｂ、ｃに示すとおり、７５０℃以上で加熱処理したＢＮ－ＣＮＨが安定した構造をとると考えられたため、以後は、８００℃で加熱処理したＢＮ－ＣＮＨを構造評価に用いた。
　８００℃で作製したＢＮ－ＣＮＨ(１ｍｇ)を細胞培養液(２ｍＬ)に加え、超音波洗浄機にて５分間分散させた後、０～１０日間静置させた。静置後、濾過によりＢＮ－ＣＮＨを回収し、ＢＮ－ＣＮＨに残っていたホウ素量を上述の方法でＩＣＰにて測定して見積もった。ＢＮ－ＣＮＨ中のホウ素量は、浸漬前のホウ素量に対する％で示すと図１ｄのようになった。ＢＮ－ＣＮＨ中のホウ素量は、１０日間浸漬でも浸漬前のホウ素量の７５－８０％に保たれることが分かった。
　（透過型電子顕微鏡観察(ＴＥＭ)と電子エネルギー損失分光(ＥＥＬＳ)測定）
　得られた前記ＢＮ－ＣＮＨをエタノールに分散させ、ＴＥＭ観察とＥＥＬＳ測定を行った。
　ＴＥＭ測定の結果を、図２ａ－ｄに示す。図２ａ－ｄに示すとおり、ＢＮ－ＣＮＨはＣＮＨ個々の擬円筒状構造とその球状集合体形状を維持していた。さらに高倍率で観察してみると、ＣＮＨの壁に沿って、壁の内側と外側に層状にＢＮが合成されていることがわかった。また、ＣＮＨ内部空間にもＢＮが存在していることを確認した。ＢＮは六方晶ＢＮとして存在していると推知される。図２ｅに示すＥＥＬＳスペクトルには、Ｂ、Ｎ、及びＣによるピークが観察され、Ｂ及びＮのピーク形状は六方晶ＢＮのものと一致した。
　（Ｘ線光電子分光(ＸＰＳ)測定）
　前記のＢＮ－ＣＮＨ(１ｍｇ)とエタノール(５ｍＬ)を混合し、５分間バスソニケーションして得た分散液をＳｉウエハー上に滴下し、乾燥させた後に、ＸＰＳ測定を行った。結果を図３に示す。
　図３に示すとおり、ＢＮ－ＣＮＨは、Ｂ、Ｃ、及びＮに帰属されるピークが観察され、それぞれの強度から、Ｂ(２２％)、Ｃ(５５％)、Ｎ(２２％)であることが分かった(％は原子数％)。酸素のピークも見られたが、これは、基盤に用いたＳｉウエハーの表面のＳｉ酸化物による。
　（動的光散乱測定(ＤＬＳ)）
　前記のＢＮ－ＣＮＨ(１ｍｇ)をＰＬＰＥＧのリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)(５ｍＬ)に加え、バスソニケーションで、５分間ソニケーションしてＢＮ－ＣＮＨを分散させた後に、粒子径をＤＬＳにて測定した。比較のため、同様にして前記の開孔したＣＮＨ(１ｍｇ)を分散させた後に、粒子径をＤＬＳにて測定した。それぞれの結果を、図４のｂ、ａに示す。
　ｂに示すＢＮ－ＣＮＨの平均粒子径は約１３０ｎｍであり、ａに示すもとのＣＮＨの平均粒子径約１２０ｎｍとほぼ一致し、ホウ素化合物を内包および外壁に担持する操作により構造が大きく変わらなかったことを示唆している。電子顕微鏡観察によりＣＮＨの平均直径が約１００ｎｍであることが知られているので、ＰＬＰＥＧでＰＢＳ中に分散したＢＮ－ＣＮＨはほぼ孤立に分散していることが分かる。また、この分散状態は少なくとも数日間は安定であった。
　（ＢＮ－ＣＮＨの表面修飾）
　腫瘍へＢＮ－ＣＮＨを高濃度蓄積させるために、ＢＮ－ＣＮＨ表面をポリエチレングリコール(ＰＥＧ)によりコーティングしてマクロファージによる貪食を避け、さらに、葉酸(ＦＡ)をＢＮ－ＣＮＨに付加して、ＢＮ－ＣＮＨをがん細胞選択的に取り込ませるようにする。
　そのためにまず、ＦＡ(１ｍｇ)をＤＭＳＯ(４ｍＬ)に溶解させ、この溶液に、ＰＬＰＥＧ(２００ｍｇ)、ピリジン(２ｍＬ)、ＥＤＣ(３８ｍｇ)を加え、４時間室温にて撹拌した。ロータリーエバポレーターでピリジンを蒸発させた後に水５０ｍＬを加えた。得られた液を透析膜(ＭＷＣＯ３５００)に入れ、水２Ｌ中に浸したのちに室温にて放置した。約１日後に、水２Ｌを入れ替えるという操作を５回行い、未反応ＰＬＰＥＧ分子を除去した。得られた液を凍結乾燥させ、ＰＬＰＥＧ－ＦＡの粉末を得た。ＰＬＰＥＧ－ＦＡの構造は1Ｈ　ＮＭＲにて確認した。
　得られたＰＬＰＥＧ－ＦＡでＢＮ－ＣＮＨ表面を修飾するため、ＰＬＰＥＧ－ＦＡ(４ｍｇ)と、前記ＢＮ－ＣＮＨ(３ｍｇ)をリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)(２ｍＬ)中にて混合させ、ＰＬＰＥＧ－ＦＡの脂質基(アルキル鎖)をＢＮ－ＣＮＨの表面にワンデルワール力で結合させ、がん細胞選択的に取り込まれるＢＮ－ＣＮＨ／ＰＬＰＥＧ－ＦＡを合成した。
　ＣＮＨをＰＬＰＥＧ－ＦＡを用いてＰＢＳ中に分散させたもの(ＣＮＨ／ＰＬＰＥＧ－ＦＡ)と、［００２８］で得られたＢＮ－ＣＮＨ／ＰＬＰＥＧ－ＦＡのＰＢＳ分散液における粒子サイズをＤＬＳにて測定した。その結果をそれぞれ、図４のｄ、ｃに示す。
　ｄに示すＢＮ－ＣＮＨ／ＰＬＰＥＧ－ＦＡの平均粒子サイズは約１３０ｎｍであり、上記［００２６］と同様、ｃに示すもとのＣＮＨのサイズとほぼ一致し、ＦＡ付加後においても、表面修飾したＣＮＨは単一分散していることがわかる。
　（がん細胞のＢＮ－ＣＮＨ／ＰＬＰＥＧ－ＦＡ選択的取り込み実験）
　ヒト口腔類上皮がん由来の細胞株(ＫＢ細胞)を培養し、そこに、ＰＢＳに分散させたＢＮ－ＣＮＨ／ＰＬＰＥＧ－ＦＡ溶液を、最終濃度１０μｇ／ｍＬになるように添加した。２４時間培養後、細胞に取り込まれなかったＢＮ－ＣＮＨ／ＰＬＰＥＧ－ＦＡをＰＢＳで洗い流したあと、共焦点レーザー顕微鏡にて、細胞を観察した。結果を図５ａ－ｄに示す。
　図５ａ－ｄに示すとおり、ＢＮ－ＣＮＨ／ＰＬＰＥＧ(ａ)とＣＮＨ／ＰＬＰＥＧ(ｃ)は、ＫＢ細胞に取り込まれる量が少なかったが、ＢＮ－ＣＮＨ／ＰＬＰＥＧ―ＦＡ(ｂ)とＣＮＨ／ＰＬＰＥＧ―ＦＡ(ｄ)は、ＫＢ細胞に大量に取り込まれていた。
　また、ＢＮ－ＣＮＨ／ＰＬＰＥＧ－ＦＡのがん細胞による取り込み量を定量的に評価するため、細胞溶解試薬によって、細胞溶解液を作成し、この溶液中のタンパク質量とＣＮＨ量を測定した。タンパク質量は、ブラッドフォード法にて定量するため、遠心分離機(１８００ｘｇ，５０分)によって、細胞片を取り除き、また、ＣＮＨから分離した。上澄みの細胞溶解液(１０μＬ)に、ブラッドフォード液(２５０μＬ)を加えて、５９５ｎｍの波長での吸収強度を測定した。さらに、細胞が取り込んだＢＮ－ＣＮＨ量は、細胞溶解液をチップ型ソニケーションに１０分間かけた後、７００ｎｍの波長での吸収強度を測定することで濃度を見積もった。以上の操作によるタンパク質量とＣＮＨ量から、がん細胞でのＢＮ－ＣＮＨ／ＰＬＰＥＧ－ＦＡ取り込み量を算出した。結果を図５ｅに示す。
　その結果、ＢＮ－ＣＮＨは、ＣＮＨと同様に、ＰＬＰＥＧ－ＦＡを修飾することによって、がん細胞に取り込まれやすくなることがわかった。
　［００３０］と［００３１］に記載と同様の実験を、正常細胞ＦＨｓ１７３Ｗｅを用いて行った。結果を図６ａ－ｅに示す。
　図６ａ－eに示すとおり、ＦＡを付加したことによる細胞取り込み量に差は見られず、ＦＡがない場合と同様取り込み量は少なかった。ＢＮ－ＣＮＨ／ＰＬＰＥＧ(ａ)、ＢＮ－ＣＮＨ／ＰＬＰＥＧ－ＦＡ(ｂ)、ＣＮＨ／ＰＬＰＥＧ(ｃ)、ＣＮＨ/ＰＬＰＥＧ―ＦＡ(ｄ)のいずれの場合も、顕微鏡でみた細胞内取り込み量は少なく、また、これら試料の細胞内取り込み量測定結果にも優位な差は認められなかった(ｅ)。
　上記［００３０］、［００３１］に記載の結果と合わせて考察することにより、ＢＮ－ＣＮＨ／ＰＬＰＥＧ－ＦＡは、がん細胞選択的に取り込まれるといえる。
　本発明のＢＮ－ＣＮＨは、大量のホウ素化合物を内包および外壁に担持しており、特に、適切に表面修飾したＢＮ－ＣＮＨは、生体内投与した際に、腫瘍への蓄積を実現させ、ホウ素中性子捕捉療法の効果を高めることができるので、ホウ素中性子捕捉療法に有用な成分を提供する医薬製造業において利用できる。

Claims (7)

  1. 　ホウ素化合物が内包および外壁に担持されていることを特徴とするカーボンナノホーン。
  2. 　前記ホウ素化合物が、窒化ホウ素であることを特徴とする請求項１に記載のカーボンナノホーン。
  3. 　ホウ素化合物の原料にアンモニアボランを用い、カーボンナノホーンとともに加熱することを特徴とする、ホウ素化合物が内包および外壁に担持されているカーボンナノホーンの製造方法。
  4. 　７５０℃以上に加熱することを特徴とする請求項３に記載の、ホウ素化合物が内包および外壁に担持されているカーボンナノホーンの製造方法。
  5. 　請求項１又は２に記載のカーボンナノホーンの表面に、抗体または葉酸を付加させたリン脂質ＰＥＧが物理的に付着して表面修飾されていることを特徴とするカーボンナノホーン複合体。
  6. 　請求項１又は２に記載のカーボンナノホーンに導入された官能基に、抗体付加ポリエチレングリコールが化学結合されていることを特徴とするカーボンナノホーン複合体。
  7. 　請求項１又は２に記載のカーボンナノホーン或いは請求項５又は６に記載のカーボンナノホーン複合体を有効成分として含有することを特徴とするホウ素中性子捕捉療法用製剤。
PCT/JP2015/061209 2014-04-11 2015-04-10 ホウ素化合物を内包および外壁に担持するカーボンナノホーン及びその製造方法 WO2015156385A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016512786A JP6281991B2 (ja) 2014-04-11 2015-04-10 ホウ素化合物を内包および外壁に担持するカーボンナノホーン及びその製造方法

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014082154 2014-04-11
JP2014-082154 2014-04-11
JP2014-215682 2014-10-22
JP2014215682 2014-10-22
JP2015-011605 2015-01-23
JP2015011605 2015-01-23

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015156385A1 true WO2015156385A1 (ja) 2015-10-15

Family

ID=54287956

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2015/061209 WO2015156385A1 (ja) 2014-04-11 2015-04-10 ホウ素化合物を内包および外壁に担持するカーボンナノホーン及びその製造方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP6281991B2 (ja)
WO (1) WO2015156385A1 (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017162093A1 (zh) * 2016-03-25 2017-09-28 南京中硼联康医疗科技有限公司 硼中子捕获治疗系统及类α-氨基酸三氟化硼化物在制备肿瘤治疗药物中的应用
CN107224580A (zh) * 2016-03-25 2017-10-03 南京中硼联康医疗科技有限公司 类α-氨基酸三氟化硼化物在硼中子俘获治疗中的应用
JP2018145107A (ja) * 2017-03-01 2018-09-20 国立大学法人 岡山大学 細胞内導入機能を有するホウ素を含むデンドリマー
WO2022260136A1 (ja) * 2021-06-11 2022-12-15 国立大学法人京都大学 表面修飾ナノ粒子

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004256370A (ja) * 2003-02-27 2004-09-16 Toshihiro Yamase ホウ素原子含有ヘテロポリ酸及びホウ素化合物
JP2005053904A (ja) * 2003-07-24 2005-03-03 Ideal Star Inc フラーレン類、及び抗癌治療剤
JP2006502993A (ja) * 2002-07-22 2006-01-26 シメイ ファーマスーティカルズ ピーエルシー 新規な抗癌性化合物
JP2013057577A (ja) * 2011-09-08 2013-03-28 Shinshu Univ 放射線を用いる識別方法及びこれに用いる識別材料

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006502993A (ja) * 2002-07-22 2006-01-26 シメイ ファーマスーティカルズ ピーエルシー 新規な抗癌性化合物
JP2004256370A (ja) * 2003-02-27 2004-09-16 Toshihiro Yamase ホウ素原子含有ヘテロポリ酸及びホウ素化合物
JP2005053904A (ja) * 2003-07-24 2005-03-03 Ideal Star Inc フラーレン類、及び抗癌治療剤
JP2013057577A (ja) * 2011-09-08 2013-03-28 Shinshu Univ 放射線を用いる識別方法及びこれに用いる識別材料

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FRANCISCO TORRENS ET AL.: "Solvent features of cluster single-wall C, BC2N and BN nanotubes, cones and horns", MICROELECTRONIC ENGINEERING, vol. 108, August 2013 (2013-08-01), pages 127 - 133, XP028563435 *
M.ZHANG ET AL.: "In Vivo Study of SWNHs with Different Sizes on Biodistribution", FULLERENE- NANOTUBES GENERAL SYMPOSIUM KOEN YOSHISHU, vol. 38 th, 2010, pages 121 *
MAKI NAKAMURA ET AL.: "Single-walled Carbon Nanohorns as Drug Carriers: Adsorption of Prednisolone and Anti-inflammatory Effects on Arthritis", FULLERENE-NANOTUBES GENERAL SYMPOSIUM KOEN YOSHISHU, vol. 1.39th, 2010, pages 81 *
MANABU HARADA ET AL.: "Boron doped Nanohorn Aggregates Produced by means of Arc Discharge", THE FULLERENES, NANOTUBES AND GRAPHENE GENERAL SYMPOSIUM KOEN YOSHISHU, vol. 33, pages 112 *
RYOTA YUGE ET AL.: "Preparation and structural properties of BN-doped carbon nanohorn aggregates", THE FULLERENES, NANOTUBES AND GRAPHENE GENERAL SYMPOSIUM KOEN YOSHISHU, vol. 45 th, pages 89 *
Y.FUKUNAGA ET AL.: "Variable range hopping conduction and percolation networks in the pellets formed from pristine and boron-doped carbon nanohorn particles", APPLIED PHYSICS A, vol. 94, no. 1, January 2009 (2009-01-01), pages 5 - 9, XP019655923, ISSN: 1432-0630 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017162093A1 (zh) * 2016-03-25 2017-09-28 南京中硼联康医疗科技有限公司 硼中子捕获治疗系统及类α-氨基酸三氟化硼化物在制备肿瘤治疗药物中的应用
CN107224580A (zh) * 2016-03-25 2017-10-03 南京中硼联康医疗科技有限公司 类α-氨基酸三氟化硼化物在硼中子俘获治疗中的应用
CN107224580B (zh) * 2016-03-25 2020-10-16 南京中硼联康医疗科技有限公司 类α-氨基酸三氟化硼化物在硼中子俘获治疗中的应用
JP2018145107A (ja) * 2017-03-01 2018-09-20 国立大学法人 岡山大学 細胞内導入機能を有するホウ素を含むデンドリマー
WO2022260136A1 (ja) * 2021-06-11 2022-12-15 国立大学法人京都大学 表面修飾ナノ粒子

Also Published As

Publication number Publication date
JP6281991B2 (ja) 2018-02-21
JPWO2015156385A1 (ja) 2017-04-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chen et al. Stanene‐based nanosheets for β‐elemene delivery and ultrasound‐mediated combination cancer therapy
Qi et al. Inorganic–organic hybrid nanomaterials for photothermal antibacterial therapy
Geng et al. Carbon dot-passivated black phosphorus nanosheet hybrids for synergistic cancer therapy in the NIR-II window
Kadian et al. Recent advancements in synthesis and property control of graphene quantum dots for biomedical and optoelectronic applications
Li et al. Technical synthesis and biomedical applications of graphene quantum dots
Fan et al. Group IV nanoparticles: synthesis, properties, and biological applications
Hu et al. Engineering of a novel pluronic F127/graphene nanohybrid for pH responsive drug delivery
Secret et al. Two-photon excitation of porphyrin-functionalized porous silicon nanoparticles for photodynamic therapy
Akhavan et al. Graphene nanomesh promises extremely efficient in vivo photothermal therapy
Karousis et al. Current progress on the chemical modification of carbon nanotubes
Zhang et al. Facile synthesis of water-soluble, highly fluorescent graphene quantum dots as a robust biological label for stem cells
Chen et al. NIR light controlled release of caged hydrogen sulfide based on upconversion nanoparticles
JP6281991B2 (ja) ホウ素化合物を内包および外壁に担持するカーボンナノホーン及びその製造方法
Zheng et al. Multifunctional graphene quantum dots-conjugated titanate nanoflowers for fluorescence-trackable targeted drug delivery
EP3063091B1 (en) Biocompatible graphene quantum dots for drug delivery and bioimaging applications
Wang et al. Mesoporous carbon nanoshells for high hydrophobic drug loading, multimodal optical imaging, controlled drug release, and synergistic therapy
Liu et al. Synthesis of mesoporous silica/reduced graphene oxide sandwich-like sheets with enlarged and “funneling” mesochannels
Zhao et al. Surface-confined winding assembly of mesoporous nanorods
Zhang et al. Graphene oxide and adenosine triphosphate as a source for functionalized carbon dots with applications in pH-triggered drug delivery and cell imaging
Yallappa et al. Synthesis of a biocompatible nanoporous carbon and its conjugation with florescent dye for cellular imaging and targeted drug delivery to cancer cells
Ren et al. Multifunctional hierarchical mesoporous silica and black phosphorus nanohybrids as chemo-photothermal synergistic agents for enhanced cancer therapy
Ranasinghe et al. Engineered 2D materials for optical bioimaging and path toward therapy and tissue engineering
Sun et al. A Pd corolla–human serum albumin–indocyanine green nanocomposite for photothermal/photodynamic combination therapy of cancer
Zhang et al. Aptamer-mediated nanocomposites of semiconductor quantum dots and graphene oxide as well as their applications in intracellular imaging and targeted drug delivery
Boncel et al. In vitro targeting and selective killing of T47D breast cancer cells by purpurin and 5-fluorouracil anchored to magnetic CNTs: nitrene-based functionalization versus uptake, cytotoxicity, and intracellular fate

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15777374

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016512786

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 15777374

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1