KR20200008823A

KR20200008823A - 면역관문억제제가 표면에 결합된 광열 나노입자 및 면역조절제를 포함하는 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20200008823A
Application number: KR1020180082962A
Authority: KR
Inventors: 오유경; 심가용; 르비엣쿠옥
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2018-07-17
Filing date: 2018-07-17
Publication date: 2020-01-29
Also published as: KR102135840B1

Abstract

본 발명은 면역관문억제제(immune checkpoint inhibitor)가 표면에 결합된 광열 나노입자 및 면역조절제(adjuvant)를 유효성분으로 포함하는 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 종양세포에 특이적으로 축적되고 근적외선 조사에 의한 광열치료에 현저한 효과를 보이며 수지상 세포의 분화를 촉진하고, 광열치료 후에도 사멸된 종양세포, 면역관문억제제 및 면역조절제가 내인성 백신(endogenous vaccine)으로 작용하여 원발성 종양 뿐만 아니라 전이성 종양에 대한 치료 효과를 가진다.

Description

면역관문억제제가 표면에 결합된 광열 나노입자 및 면역조절제를 포함하는 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for treatment of cancers or inhibition of metastasis comprising photothermal nanoparticle conjugated immune checkpoint inhibitor and adjuvant}

본 발명은 면역관문억제제가 표면에 결합된 폴리도파민 나노입자 및 면역조절제를 포함하는 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다.

암은 현대사회에서 사망률 1위를 차지하는 주요 질병으로, 대표적 암 치료법에는 외과적 수술요법, 생물요법, 방사선요법, 항암물질 투여에 의한 화학요법 등이 있다. 최근에는 기존의 암 치료법과 다르게 면역 체계를 이용하여 암을 치료하려는 면역치료요법이 각광받고 있다.

면역항암요법은 암 자체를 직접적으로 공격하는 기존 항암제와는 달리 인공면역 단백질을 체내에 주입하여 면역체계를 자극함으로써 면역세포가 선택적으로 암세포만을 공격하도록 유도하는 방법으로, 크게 수동면역치료와 능동면역치료로 나눌 수 있다. 수동면역치료에는 면역관문억제제(immune checkpoint inhibitor), 면역세포치료제(immune cell therapy), 치료용 항체(therapeutic antibody) 등이 있으며, 그 중 면역관문억제제는 T 세포 억제에 관여하는 면역관문단백질(immune checkpoint protein)의 활성화를 차단하여 T 세포를 활성화시켜 암세포를 공격하는 약제로, CTLA-4, PD-1, PD-L1 억제제 등이 있다. 2016년 PD-L1의 항체의약(Atezolizumab)이 항암치료 목적으로 FDA의 승인을 받았으나, 면역관문억제제의 단독 치료요법으로는 제한적인 치료 효과를 보인다는 한계점이 있다. 또한, 능동면역치료에는 암치료 백신(vaccine), 면역조절제(immune-modulating agents) 등이 있으며, 그 중 암치료 백신은 암세포 또는 암세포 유래 물질(substance)로부터 제조하고, 이를 인체에 주입하여 인체의 자연방어 시스템을 작동하게 하는 약제이다. 그러나, 암치료 백신은 생산 과정이 복잡하고 다양한 종류의 암에 적용하기에 힘들뿐더러 개인 맞춤형 치료요법이기 때문에 환자에게 재정적 비용 부담을 준다는 문제가 있다.

한편, 광열치료요법(photothermal therapy)은 금, 은, 멜라닌 또는 그래핀과 같은 탄소 나노입자와 같은 광 감응성 물질을 투여한 이후에 질환 부위에 근적외선 레이저를 조사함으로써 발생하는 열에너지를 치료에 응용하는 방법이다(한국등록특허 제10-1773037호, 한국등록특허 제10-1374926호). 특히 종양 분야에서 광열치료는 비침습적 치료 방법으로서 주목받고 있다. 광열치료 기반의 항암치료요법은 광 반응성 물질을 종양세포에 주입한 후 외부에서 근적외선을 조사하여 발생하는 열에 의해 종양세포의 사멸을 유도하게 된다.

본 발명의 목적은 광열치료요법 및 면역항암요법을 동시에 제공하는 암 치료 또는 암 전이용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 면역관문억제제(immune checkpoint inhibitor)가 표면에 결합된 광열 나노입자 및 면역조절제(adjuvant)를 유효성분으로 포함하는 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 면역관문억제제인 PD-L1 항체(αPDL1)가 표면에 결합되고 내부에 면역조절제인 이미퀴모드(im)가 봉입된 폴리도파민 나노입자(PDN)는 종양세포에 특이적으로 축적되고 근적외선 조사에 의한 광열치료에 현저한 효과를 나타내었다. 아울러, 수지상 세포의 분화를 촉진하고, 광열치료 후에도 사멸된 종양세포, 면역관문억제제 및 면역조절제가 내인성 백신(endogenous vaccine)으로 작용하여 원발성 종양 뿐만 아니라 전이성 종양에 대한 치료 효과를 나타내므로, 암 치료 또는 암 전이 억제 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 폴리도파민 나노입자(이하 PDN) 표면에 PD-L1 항체(이하 αPDL1)가 결합되고 내부에 이미퀴모드(이하 im)가 봉입된 입자(이하, αPDL1-imPDN)의 작용기전을 도시적으로 나타낸 것이다. 원발성 종양(primary tumor)을 가진 마우스 동물모델에 αPDL1-imPDN을 전신투여하면 종양 세포로 나노입자가 축적되고 근적외선 조사에 의해 사멸된 종양들은 세포에 결합되어 있는 αPDL1-imPDN과 함께 미성숙 수지상 세포(immature dendritic cell, 이하 iDC)를 성숙 수지상세포(mature dendritic cell, 이하 mDC)로 분화시키며 이를 통해 활성화된 살상 T세포(Cytotoxic T lymphocytes)는 전이성 종양(distant tumor)의 성장을 억제한다.
도 2는 폴리도파민 나노입자(PDN), 내부에 이미퀴모드가 봉입된 폴리도파민 나노입자(이하 imPDN) 및 표면에 PD-L1 항체가 결합되고 내부에 이미퀴모드가 봉입된 폴리도파민 나노입자(이하 αPDL1-imPDN)의 모식도이다.
도 3은 PDN, imPDN 및 αPDL1-imPDN를 투과전자현미경(TEM)으로 촬영한 사진이다(스케일 바=200 nm).
도 4는 PDN, imPDN 및 αPDL1-imPDN의 크기 분포를 동적광산란법(dynamic light scattering)으로 측정한 결과이다.
도 5는 PDN, imPDN 및 αPDL1-imPDN의 제타 전위를 측정한 결과이다.
도 6은 근적외선 조사 시간에 따른 농도별 αPDL1-imPDN의 온도를 측정한 결과이다.
도 7은 이미퀴모드(IMQ), 표면에 PD-L1 항체가 결합된 폴리도파민 나노입자(이하 αPDL1-PDN) 및 αPDL1-imPDN의 흡광 스펙트럼 결과이다.
도 8은 이미퀴모드(IMG) 및 αPDL1-imPDN의 HPLC 크로마토그램 결과이다.
도 9는 pH 조건에 따른 αPDL1-imPDN의 이미퀴모드 용출도를 나타낸 것이다.
도 10은 CT-26 암세포 표면에서의 PD-L1 발현을 유세포 분석법으로 확인한 결과이다.
도 11은 imPDN 및 αPDL1-imPDN의 암세포에 대한 결합능을 유세포 분석법으로 측정한 결과이다.
도 12는 PDN, imPDN, αPDL1-PDN 및 αPDL1-imPDN의 암세포에 대한 결합능을 형광현미경으로 측정한 결과이다.
도 13은 PDN, imPDN, αPDL1-PDN 및 αPDL1-imPDN의 암세포에 대한 결합능을 투과전자현미경으로 측정한 결과이다.
도 14는 PDN, imPDN, αPDL1-PDN 또는 αPDL1-imPDN가 처리된 iDC에서 mDC 표지인자인 CD40, CD80 및 CD86의 발현을 측정한 결과이다.
도 15는 PDN, imPDN, αPDL1-PDN 또는 αPDL1-imPDN가 처리된 iDC에서 사이토카인 TNF-α의 분비량을 측정한 결과이다.
도 16은 PDN, imPDN, αPDL1-PDN 또는 αPDL1-imPDN가 처리된 iDC에서 사이토카인 IL-6의 분비량을 측정한 결과이다.
도 17은 PDN, imPDN, αPDL1-PDN 또는 αPDL1-imPDN를 처리한 암세포에서 근적외선 조사 시간에 따른 암세포의 온도를 측정한 결과이다.
도 18은 PDN, imPDN, αPDL1-PDN 또는 αPDL1-imPDN를 처리한 암세포에 근적외선 조사 후, 암세포의 생존률을 측정한 결과이다.
도 19는 PDN, imPDN, αPDL1-PDN 또는 αPDL1-imPDN를 처리한 암세포에 근적외선 조사 후, iDC와 공배양하여 iDC에서 mDC 표지인자인 CD40, CD80 및 CD86의 발현을 측정한 결과이다.
도 20은 PDN, imPDN, αPDL1-PDN 또는 αPDL1-imPDN를 처리한 암세포에 근적외선 조사 후, iDC와 공배양하여 iDC의 사이토카인 TNF-α의 분비량을 측정한 결과이다.
도 21은 PDN, imPDN, αPDL1-PDN 또는 αPDL1-imPDN를 처리한 암세포에 근적외선 조사 후, iDC와 공배양하여 iDC의 사이토카인 IL-6의 분비량을 측정한 결과이다.
도 22는 CT-26 세포주 및 CT-26 종양 조직의 세포 표면에서의 PD-L1 발현을 유세포 분석법으로 확인한 결과이다.
도 23은 PDN, imPDN, αPDL1-PDN 또는 αPDL1-imPDN를 종양 동물모델에 전신투여한 후, 각 입자의 암세포에 대한 결합능을 투과전자현미경으로 측정한 결과이다.
도 24는 종양이 유도된 동물모델의 광열치료 일정을 나타낸 것이다.
도 25는 종양 동물모델에 PDN, imPDN, αPDL1-PDN 또는 αPDL1-imPDN를 전신투여하고 근적외선을 조사한 후의 열화상 사진이다.
도 26은 종양 동물모델에 PDN, imPDN, αPDL1-PDN 또는 αPDL1-imPDN를 전신투여하고 근적외선을 조사한 후의 온도를 측정한 결과이다.
도 27은 종양 동물모델에 CT-26 세포를 재접종하여 전이성 종양을 유도시킨 동물모델의 광열치료 일정을 나타낸 것이다.
도 28은 종양 동물모델에 PDN, imPDN, αPDL1-PDN 또는 αPDL1-imPDN를 전신투여하고 근적외선을 조사한 후, 원발성 종양의 부피를 측정한 결과이다.
도 29는 종양 동물모델에 PDN, imPDN, αPDL1-PDN 또는 αPDL1-imPDN를 전신투여하고 근적외선을 조사한 후, 전이성 종양의 부피를 측정한 결과이다.
도 30은 종양 동물모델에 PDN, imPDN, αPDL1-PDN 또는 αPDL1-imPDN를 전신투여하고 근적외선을 조사한 후, 100일 동안 동물모델의 생존율을 측정한 결과이다.
도 31은 종양 동물모델에 PDN, αPDL1 또는 αPDL1-imPDN를 전신투여하고 근적외선을 조사한 후, 전이성 종양에 침윤한 CD8⁺ T 세포의 수를 측정한 결과이다.
도 32는 종양 동물모델에 αPDL1-imPDN를 전신투여하고 근적외선을 조사한 후, 100일 이상 생존한 마우스에서 분리한 T 세포의 종양세포 살상 효과를 형광현미경으로 측정한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 면역관문억제제(immune checkpoint inhibitor)가 표면에 결합된 광열 나노입자 및 면역조절제(adjuvant)를 유효성분으로 포함하는 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 광열 나노입자는 폴리도파민 나노입자, 금 나노입자, 그래핀 나노시트 또는 멜라닌 나노입자일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 상기 광열 나노입자는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인 도파민의 자기중합(self-polymerization)에 의해 생성되는 폴리도파민 나노입자일 수 있다. 상기 폴리도파민 나노입자는 그 크기가 10 내지 500 nm일 수 있으나, 50 내지 200 nm인 것이 보다 바람직하다.

[화학식 1]

또한, 상기 광열 나노입자는 근적외선 영역의 빛을 흡수하여 발열하는 것일 수 있다.

상기 면역관문억제제는 상기 광열 나노입자의 표면에 공유결합으로 결합된 것일 수 있다. 본 명세서에서 면역관문억제제는 T 세포 억제에 관여하는 면역관문단백질(immune checkpoint protein)의 활성화를 차단하여, T 세포를 활성화시켜 암세포를 공격하는 물질을 말한다. 상기 면역관문억제제는 암세포 표면에 발현된 단백질과 결합하는 것일 수 있으며, 구체적으로 PD-L1 억제제 또는 CD47 억제제일 수 있다. 더 구체적으로 상기 PD-L1 억제제 또는 CD47 억제제는 PD-L1 단백질 또는 CD47 단백질과 상보적으로 결합하는 화합물, 펩타이드, 펩타이드 미메틱스, 기질유사체, 앱타머 또는 항체일 수 있고, 보다 구체적으로 항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 광열 나노입자의 표면에는 암세포 표면에 발현된 단백질과 결합할 수 있는 화합물, 펩타이드, 펩타이드 미메틱스, 기질유사체, 앱타머 또는 항체가 더 결합될 수 있으며, 구체적으로 암세포 표면에 발현된 단백질과 결합할 수 있는 항체일 수 있다. 상기 항체는 HER2 항체, EGFR 항체 또는 Ganglioside GD2 항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 면역조절제는 광열 나노입자 내에 봉입된 것일 수 있다. 또한, 상기 면역조절제는 상기 광열 나노입자 내에 봉입되고 pH의 조건에 따라 방출되는 것일 수 있다. 구체적으로, 면역조절제는 이미퀴모드(imiquimod), 레지퀴모드(resiquimod), 가디퀴모드(gardiquimod) 또는 모노포스포릴 지질 A(monophosphoryl lipid A)일 수 있고, 더 구체적으로는 이미퀴모드일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있다. 구체적으로 상기 고형암은 뇌종양, 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프종, 핍지교종, 두개내인종, 상의세포종, 뇌간종양, 두경부 종양, 후두암, 구인두암, 비강암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 구강암, 흉부종양, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 남성유방암, 복부종양, 위암, 간암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 대장암, 항문암, 방광암, 신장암, 남성생식기종양, 음경암, 전립선암, 여성생식기종양, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 자궁육종, 질암, 여성외부생식기암, 여성요도암 또는 피부암 등일 수 있고, 상기 혈액암은 백혈병, 악성림프종, 다발성골수종 또는 재생불량성 빈혈 등일 수 있다.

상기 조성물은 내인성 백신(endogenous vaccine)으로 작용할 수 있다. 도 1은 본 발명의 αPDL1-imPDN의 작용기전을 도시적으로 나타낸 것으로, 원발성 종양(primary tumor)을 가진 마우스 동물모델에 αPDL1-imPDN을 전신투여하면 종양 세포로 나노입자가 축적되고 근적외선 조사에 의해 사멸된 종양들은 세포 결합되어 있는 αPDL1-imPDN과 함께 미성숙 수지상 세포(iDC)를 성숙 수지상세포(mDC)로 분화시키며 이를 통해 활성화된 살상 T세포(Cytotoxic T lymphocytes)는 전이성 종양(distant tumor)의 성장을 억제할 수 있다.

따라서, 상기 조성물은 수지상 세포의 분화를 촉진할 수 있다. 아울러 상기 조성물은 T 세포의 활성을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 광열 나노입자인 폴리도파민 나노입자(PDN), PDN 내부에 면역조절제인 이미퀴모드(im)을 봉입시킨 imPDN, PDN 표면에 PD-L1 항체를 결합시킨 αPDL1-PDN, 및 PDN 내부에 이미퀴모드를 봉입시키고 표면에 PD-L1 항체를 결합시킨 αPDL1-imPDN를 제조하였다(실시예 1 및 도 2 참조).

또한, 본 발명자들은 PDN, imPDN 및 αPDL1-imPDN의 형태, 크기 및 제타 전위를 측정한 결과, 각 입자간의 물리화학적 특성은 유의적인 차이가 없음을 확인하였다(도 3 내지 도 5 참조).

또한, 본 발명자들은 αPDL1-imPDN에 근적외선을 조사하여 광열 효과를 확인하였다(도 6 참조).

또한, 본 발명자들은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 PDN 내부에 이미퀴모드가 봉입되고, pH 조건에 따라 이미퀴모드의 방출이 조절됨을 확인하였다(도 7 내지 도 9 참조).

또한, 본 발명자들은 CT-26 암세포 표면에 PD-L1이 과발현됨을 확인하였으며, αPDL1이 결합된 입자의 암세포에 대한 결합능이 우수함을 확인하였다(도 10 내지 도 13 참조).

또한, 본 발명자들은 PDN, imPDN, αPDL1-PDN 또는 αPDL1-imPDN를 iDC에 처리한 결과, 이미퀴모드가 봉입된 입자의 iDC의 분화를 촉진시키는 효과가 우수함을 확인하였다(도 14 내지 도 16 참조).

또한, 본 발명자들은 PDN, imPDN, αPDL1-PDN 또는 αPDL1-imPDN를 CT-26에 처리하였을 때, αPDL1이 결합된 입자가 암세포에 특이적으로 축적되어 암세포에 대한 우수한 광열치료 효과를 나타냄을 확인하였다(도 17 및 도 18 참조).

또한, 본 발명자들은 imPDN 또는 αPDL1-imPDN로 광열치료하여 사멸된 암세포와 iDC를 공배양한 결과, αPDL1-imPDN로 광열치료된 암세포는 iDC의 분화를 촉진시키는 효과가 우수함을 확인하였다(도 19 내지 도 21 참조).

또한, 본 발명자들은 종양 동물모델에 PDN, imPDN, αPDL1-PDN 또는 αPDL1-imPDN를 전신 투여한 결과, αPDL1이 결합된 입자의 암세포에 대한 결합능이 우수함을 확인하였다(도 22 및 도 23 참조).

또한, 본 발명자들은 종양 동물모델을 제작하고, 동물모델에 PDN, imPDN, αPDL1-PDN 또는 αPDL1-imPDN를 전신투여하고 근적외선을 조사한 결과, αPDL1이 결합된 입자가 암세포에 특이적으로 축적되어 암세포에 대한 우수한 광열치료 효과를 나타내고 종양의 성장을 억제하며, 그 중에서도 αPDL1-imPDN가 전이성 종양의 성장을 보다 효과적으로 억제함을 확인하였다(도 24 내지 도 30 참조).

또한, 본 발명자들은 종양 동물모델에 PDN, αPDL1 또는 αPDL1-imPDN를 전신투여하고 근적외선을 조사한 후 CD8⁺ T 세포의 수를 측정한 결과, αPDL1-imPDN이 처리된 종양 동물모델에서 얻은 전이성 종양에 침윤한 T 세포의 수가 가장 많았으며, αPDL1-imPDN로 광열치료받아 생존한 마우스로부터 분리한 T 세포는 종양 살상 효과가 뛰어남을 확인하였다(도 30 및 도 31 참조).

따라서, 본 발명의 조성물은 종양세포에 특이적으로 축적되고 근적외선 조사에 의해 광열치료에 현저한 효과를 보이며 수지상 세포의 분화를 촉진하고, 광열치료 후에도 사멸된 종양세포, 면역관문억제제 및 면역조절제가 내인성 백신(endogenous vaccine)으로 작용하여 원발성 종양 뿐만 아니라 전이성 종양에 대한 치료 효과를 가짐을 확인함으로써, 본 발명의 면역관문억제제가 표면에 결합된 광열 나노입자 및 면역조절제는 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물에 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 전체 중량에 대하여 유효성분을 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 상기 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제, 주사제제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 복강내, 직장내, 피하, 정맥, 근육내 또는 흉부내 주사 방식을 포함할 수 있다.

상기 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 이는 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 환자의 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간, 동시에 사용되는 약물 등에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 조성물에 포함되는 유효성분의 양은 0.0001 내지 1,000 ㎎/㎏, 구체적으로 0.001 내지 500 ㎎/㎏일 수 있다. 상기 투여는 하루에 1회 수회일 수 있다.

본 발명의 조성물은 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 병용 투여시, 투여는 순차적 또는 동시일 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

< 실시예 1> αPDL1 - imPDN의 제조

면역조절제인 이미퀴모드(imiquimod, 이하 im)가 봉입되고 표면에 면역관문억제제인 PD-L1 항체(이하 αPDL1)가 공유결합된 폴리도파민 나노입자(이하 PDN)를 제조하였다.

<1-1> PDN의 제조

알칼리 용액에서의 도파민의 자기중합을 통해 PDN을 합성하였다.

구체적으로, 도파민 하이드로클로라이드 50 ㎎(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 삼중 증류수(TDW) 25 ㎖에 용해시킨 뒤, 1N 수산화 나트륨 용액을 도파민 하이드로클로라이드 용액에 서서히 적하하여 pH 10으로 적정시키고 50℃에서 12시간 동안 자기 교반하였다. 반응액을 13500×g에서 20분 동안 원심 분리하여 검정색 펠렛의 PDN을 수집하고 상층액이 투명해질 때까지 10 mM Tris 완충액(pH 8.5)으로 펠렛을 세척하였다. 최종 세척 후, PDN을 Tris 완충액(pH 8.5)에 재현탁시켜 4℃에서 보관하였다.

<1-2> imPDN의 제조

실시예 1-1에서 제조한 PDN에 초음파 처리를 통해 이미퀴모드(im)를 봉입시켰다.

구체적으로, DMSO에 녹인 10 mg/㎖의 im(Sigma-Aldrich) 0.5 ㎖를 pH 10으로 조정된 도파민 하이드로클로라이드 용액에 첨가하고, 이를 30분 동안 초음파 처리하였다. 이어서, 반응물을 12시간 동안 격렬하게 교반하였다. 침전된 이미퀴모드는 상대적으로 저속인 200×g로 원심분리하여 제거한 뒤, 이미퀴모드가 봉입된 PDN(imPDN)이 포함된 상층액을 20분 동안 13500×g에서 원심분리하하여 imPDN을 수집하고, 이를 10 mM Tris 완충액(pH 8.5)으로 세척하였다. 최종 세척 후, imPDN을 Tris 완충액(pH 8.5)에 재현탁시켜서 4℃에서 보관하였다.

<1-3> αPDL1 - PDN의 제조

실시예 1-1에서 제조한 PDN의 표면에 PD-L1 항체(αPDL1)를 공유결합시켰다.

구체적으로, 10 mM Tris 완충액(pH 8.5)에 용해된 실시예 1의 PDN 용액(2 mg/㎖) 1 ㎖와 5 mg/㎖의 αPDL1(클론 10F.9G2, Bio X Cell, West Lebanon, NH, USA) 40 ㎕를 섞어준 후 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 결합되지 않은 αPDL1를 원심분리에 의해 제거한 뒤, 수득한 αPDL1-PDN을 TDW로 3회 세척하였다. PDN 표면에 수식된 항체는 상층액에 존재하는 유리 항체의 양을 빼서 계산하였다. 유리 항체의 양은 Rat IgG ELISA(Invitrogen, Carlsbad, CA, US)을 사용하여 정량화하였다. αPDL1가 결합된 PDN(αPDL1-PDN)를 TDW에 재현탁시켜 보관하였다.

<1-4> αPDL1 - imPDN의 제조

실시예 1-2에서 제조한 imPDN의 표면에 PD-L1 항체(αPDL1)를 공유결합시키고자 하였다.

실시예 1-3에서 사용한 PDN 대신 imPDN을 사용한 점을 제외하고는 실시예 1-3과 동일한 방법으로 αPDL1-imPDN를 제조하였다.

< 실험예 1> PDN , imPDN 및 αPDL1 - imPDN의 물리화학적 특성 평가

실시예 1-1, 1-2 및 1-4에서 각각 제조한 PDN, imPDN 및 αPDL1-imPDN의 물리화학적 특성으로 입자의 형태, 크기, 제타 전위 및 광열 효과를 평가하였다.

<1-1> 입자의 형태, 크기 및 제타전위 측정

실시예 1-1, 1-2 및 1-4에서 각각 제조한 PDN, imPDN 및 αPDL1-imPDN의 형태를 투과전자현미경(TEM, JEOL, Tokyo, Japan)으로 확인하였으며, 동적 광산란법(ELS8000 instrument,Photal, Osaka, Japan)을 이용하여 입자의 크기 및 제타 전위를 측정하였다.

그 결과, PDN, imPDN 및 αPDL1-imPDN 간의 크기 및 제타 전위는 유사한 값을 나타내어, im의 봉입이나 αPDL1의 결합이 입자의 크기 또는 제타 전위에 큰 영향을 미치지 않음을 확인하였다 (도 3 내지 도 5).

<1-2> 입자의 광열 효과

실시예 1-4에서 제조한 αPDL1-imPDN의 광열 효과를 측정하였다.

구체적으로, 20, 40, 80, 160 또는 320 ㎍/㎖ 농도인 αPDL1-imPDN에 808 nm의 근적외선 레이저를 1.5 W의 세기로 5분 동안 조사하고, 1분 마다 입자의 온도를 측정하였다.

그 결과, 근적외선 레이저 조사 시간이 길수록 또는 αPDL1-imPDN의 농도가 높을수록 αPDL1-imPDN의 광열 효과가 증가하였다(도 6).

< 실험예 2> αPDL1 - imPDN의 이미퀴모드 봉입 여부 확인

실시예 1-4에서 제조한 αPDL1-imPDN의 봉입 여부를 흡광 스펙트럼, HPLC 및 이미퀴모드의 용출도를 측정하여 확인하였다.

<2-1> αPDL1 - imPDN의 흡광 스펙트럼 측정

실시예 1-3 및 1-4에서 각각 제조한 αPDL1-PDN 및 αPDL1-imPDN의 흡광 스펙트럼을 UV/Vis 분광광도계(UV-3100, Shimadzu Corp, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다.

그 결과, αPDL1-imPDN에서 이미퀴모드의 특이적인 파장 227, 245, 318nm에서 흡광 피크(peak)가 나타났다(도 7).

<2-2> αPDL1 - imPDN의 HPLC 분석

이미퀴모드와 실시예 1-4에서 제조한 αPDL1-imPDN를 HPLC로 분석하여 αPDL1-imPDN 내 이미퀴모드 함량을 확인하였다.

구체적으로, 1 ㎖의 아세토니트릴(acetoinitrile)과 1 ㎖의 25 mM 아세테이트 완충용액(acetate buffer, pH 4.0)의 혼합용액에 αPDL1-imPDN을 분산시키고 10분간 음파처리(sonication)한 후, 200 nm 직경의 필터로 걸러주었다. 여과액을 컬럼에 로딩하고, 이동상으로 아세토니트릴과 25 mM 아세테이트 완충용액(pH 4.0)을 1:1(v/v)로 혼합한 용매에 0.5%가 되도록 trithyl amine을 첨가한 용액을 사용하였다.

그 결과, αPDL1-imPDN에 봉입된 이미퀴모드의 함량은 6.4±1.1%이었다(도 8).

<2-3> αPDL1 - imPDN의 im 용출도 측정

실시예 1-4에서 제조한 αPDL1-imPDN로부터 용출되는 im의 용출도를 pH 조건에 따라 측정하였다.

구체적으로, αPDL1-imPDN를 pH 7.4의 인산완충용액 또는 pH 5의 아세테이트 완충용액에 분산시키고, 이를 투석 튜브(컷오프 분자량 1000)에 넣어 투석을 진행하며 1시간마다 각각의 새로운 완충용액으로 교체한 후 시간별로 수득한 완충용액 내의 이미퀴모드 농도를 HPLC로 측정하였다.

그 결과, pH 7 조건에서는 거의 용출되지 않던 이미퀴모드가 pH 5 조건에서는 이틀 동안 76.5±1.1% 가 용출되었다(도 9).

< 실험예 3> 암세포에 대한 결합능 평가

실시예 1에서 제조한 PDN, imPDN, αPDL1-PDN 및 αPDL1-imPDN의 암세포에 대한 결합능을 형광현미경 및 투과전자현미경을 이용하여 평가하였다.

<3-1> 암세포 표면에 발현하는 PD-L1 확인

암세포에 대한 각 입자의 결합능을 확인하기 이전에, 대장암세포주에서의 PD-L1 발현을 유세포 분석법으로 확인하였다.

구체적으로, Murine colon carcinoma CT-26 세포(American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA)를 10% 소태아혈청(fetal bovine serum), 100 units/㎖ 페니실린 및 100 mg/㎖ 스트렙토마이신이 보충된 RPMI 배지에서 배양하고, CT-26 세포를 수집하여 4℃에서 30분 동안 3% FBS가 함유된 차가운 PBS로 블로킹(blocking)하였다. 다음으로, 세포를 4℃에서 10 ㎍/㎖로 희석한 Anti-mouse PD-L1 항체 또는 Isotype IgG 항체(Biolegend)로 세척하고 항온 배양하였다. 배양 후, 세포를 Alexa Fluor 647로 표지된 anti-mouse IgG 항체와 함께 4℃에서 1시간 동안 배양한 후, 유세포 분석법으로 형광의 세기를 측정하였다.

그 결과, isotype IgG 항체보다 PD-L1 항체에 대한 형광의 세기가 더 큰 것으로 나타나, 대장암 세포 표면에 PD-L1이 과발현되었음 확인하였다(도 10).

<3-2> 형광 현미경을 이용한 암세포에 대한 결합능 평가

실시예 1-2 및 1-4에서 제조한 imPDN 및 αPDL1-imPDN의 암세포에 대한 결합능을 확인하기 위해, imPDN 또는 αPDL1-imPDN로 처리된 대장암 세포를 형광 표지된 항체로 염색하여 형광 현미경으로 관찰하고, 형광의 세기를 유세포 분석법으로 측정하였다.

구체적으로, CT-26 세포를 10% 소태아혈청(fetal bovine serum), 100 units/㎖ 페니실린 및 100 mg/㎖ 스트렙토마이신이 보충된 RPMI 배지에서 웰 당 0.5x10⁵ 세포의 밀도로 배양하였다. 다음날 실시예 1에서 제조한 PDN, imPDN, αPDL1-PDN 또는 αPDL1-imPDN을 0.5 mg/㎖ 농도가 되도록 각 웰에 처리하고, 4시간 후 각 세포를 차가운 인산염 완충 용액(PBS)으로 세척하고 Alexa Fluor®488-Goat-anti Rat IgG 항체(Biolegend, San Diego, CA, USA)와 함께 1시간 더 배양하였다. 배양된 세포를 PBS로 세척하고, 4% 파라포름 알데히드로 15분간 고정한 후 4',6-디아미디노-2-페닐인돌디하이드로클로라이드(DAPI, Sigma-Aldrich)로 염색하였다. 세포의 형광은 형광현미경으로 관찰하였고 형광의 세기는 유세포 분석법으로 측정하였다.

imPDN 및 αPDL1-imPDN의 유세포 분석법 결과, αPDL1-imPDN는 무처리군(Untreated) 및 imPDN보다 형광 세기가 강한 것으로 나타났으며, PDN, imPDN, αPDL1-PDN 또는 αPDL1-imPDN을 처리한 세포를 형광현미경으로 관찰한 결과, αPDL1를 결합된 입자를 처리한 세포에서만 형광이 나타나, 입자 표면에 αPDL1을 결합시킴으로써 암세포에 대한 결합능을 부여할 수 있음을 보여준다(도 11 및 도 12).

<3-3> 투과전자현미경을 이용한 암세포에 대한 결합능 평가

실시예 1에서 제조한 PDN, imPDN, αPDL1-PDN 및 αPDL1-imPDN의 암세포에 대한 결합능을 확인하기 위해, 각 입자로 처리된 대장암 세포를 투과전자현미경(TEM)으로 관찰하였다.

구체적으로, CT-26 세포를 100 mm 배양 접시에 70%정도 면적에 달하도록 세포를 배양한 다음, PDN, imPDN, αPDL1-PDN 또는 αPDL1-imPDN을 0.5 mg/㎖ 농도가 되도록 각 배양 접시에 처리하였다. 6시간 후 각 세포를 수집하여 Karnovsky 용액으로 2시간 동안 고정한 다음, 차가운 0.05M 나트륨 카코딜레이트(sodium carcodylate) 완충액으로 3번 세척하고, 펠렛을 4℃에서 2시간 동안 1% 오스뮴 테트록시드(osmium tetroxide)로 사후 고정시켰다. 고정시킨 펠렛을 차가운 TDW로 3회 세척한 후, 4℃에서 밤새 0.5% 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)로 염색하고, 에탄올(30%, 50%, 70%, 80%, 90% 및 100% 3회)에서 탈수시켰다. 탈수된 세포 펠렛에 50:50 프로필렌 옥사이드(propylene oxide)/스퍼(Spurr) 수지를 2시간 동안 침투시킨 후, 100% 스퍼 수지로 교체하여 이를 70℃ 오븐에서 24시간 동안 고체화시켰다. 펠렛은 극미세단면 (60nm)으로 절단하여 TEM으로 관찰하였다.

투과전자현미경 관찰 결과, PDN, imPDN보다 αPDL1가 결합된 αPDL1-PDN 또는 αPDL1-imPDN의 암세포에 대한 결합능이 더 우수하였다(도 13).

< 실험예 4> 면역조절능력 평가

실시예 1에서 제조한 PDN, imPDN, αPDL1-PDN 및 αPDL1-imPDN의 면역조절능력을 평가하기 위해, 각 입자를 처리한 미성숙 수지상 세포(immature dendritic cell, iDC)에서 성숙 수지상 세포(mature dendritic cell, mDC)의 표지 인자, TNF-α 및 IL-6를 측정하였다.

<4-1> mDC 표지인자의 발현 측정

실시예 1에서 제조한 PDN, imPDN, αPDL1-PDN 또는 αPDL1-imPDN의 iDC에서 mDC로 분화를 촉진시키는 능력을 확인하기 위해, 각 입자로 처리된 수지상 세포에서 mDC 표지인자인 CD40, CD80 및 CD86을 측정하였다.

구체적으로, 골수 유래 수지상 세포(BMDC)를 balb/c (6주령, 오리엔트바이오, 성남시, 대한민국)의 대퇴골 및 경골로부터 분리하였다. 먼저, 근육 조직을 제거한 후, RPMI 배지로 채워진 31G 인슐린 주사기를 사용하여 골수를 플러싱했다. 적혈구를 용해시키기 위해 9 ㎖의 TDW와 10× PBS 1 ㎖를 즉시 첨가한 후, 이를 250×g에서 8분간 원심분리하여 단핵구 펠렛을 수집하였다. 수집한 단핵 세포를 10% FBS, 100 units/㎖ 페니실린, 100 mg/㎖ 스트렙토마이신, 20 ng/㎖ 재조합 마우스 GM-CSF(Genscript, New Jersey, USA), 20 ng/㎖ 재조합 마우스 IL-4(Genscript, New Jersey, USA) 및 50 μM β-메르캅토에탄올(Sigma-Aldrich)이 보충된 배지에서 7일간 배양하고 3일마다 배지를 교체하였다. 7일 후 실시예 1에서 각각 제조한 PDN, imPDN, αPDL1-PDN 또는 αPDL1-imPDN를 80 ㎍/㎖의 PDN 또는 5 ㎍/㎖의 im(이미퀴모드) 농도로 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 배양한 세포를 차가운 PBS로 세척한 후 수집하고, 형광 표지된 항체로 염색하여 CD40, CD80 및 CD86의 발현을 분석하였다. 형광의 세기는 유세포 분석법으로 측정하고, 형광 세기의 중간값(median)을 산출하였다.

그 결과, PDN 또는 αPDL1-PDN보다 im이 봉입된 imPDN 또는 αPDL1-imPDN를 처리한 수지상 세포에서 CD40, CD80 및 CD86의 발현이 높은 것으로 나타나, im(이미퀴모드)는 수지상 세포의 분화를 촉진시킴을 확인하였다(도 14).

<4-2> TNF -α 및 IL-6의 분비량 측정

실시예 1에서 제조한 PDN, imPDN, αPDL1-PDN 또는 αPDL1-imPDN의 iDC에서 mDC로 분화를 촉진시키는 능력을 확인하기 위해, 각 입자로 처리된 수지상 세포에서 TNF-α 및 IL-6의 분비량을 측정하였다.

구체적으로, 실험예 4-1와 동일한 방법으로 배양한 골수 유래 수지상 세포의 배지를 수집한 뒤, TNF-α 및 IL-6의 분비량을 ELISA로 측정하였다.

그 결과, PDN 또는 αPDL1-PDN보다 im이 봉입된 imPDN 또는 αPDL1-imPDN를 처리한 수지상 세포의 TNF-α 및 IL-6의 분비량이 높은 것으로 나타나, im(이미퀴모드)는 수지상 세포의 분화를 촉진시킴을 확인하였다(도 15 및 도 16).

< 실험예 5> 광열치료 효과 평가

실시예 1에서 제조한 PDN, imPDN, αPDL1-PDN 및 αPDL1-imPDN의 광열치료 효과를 평가하기 위해, 각 입자를 처리한 암세포에 근적외선을 조사하여 시간에 따른 온도 변화 및 조사 후 암세포의 생존력을 측정하였다.

<5-1> 근적외선 조사 시간에 따른 암세포의 온도 변화 측정

실시예 1에서 제조한 PDN, imPDN, αPDL1-PDN 또는 αPDL1-imPDN를 CT-26 세포에 처리하고 근적외선을 조사하여, 조사 시간에 따른 CT-26 세포의 온도 변화를 관찰하였다.

구체적으로, TDW에 분산시킨 PDN, imPDN, αPDL1-PDN 또는 αPDL1-imPDN를 CT-26 세포에 처리하고 근적외선 laser beam 장치(BWT Beijing LTD, Beijing, China)를 이용하여 808 nm에서 1.5 W의 출력파워로 조사하였다. 시료의 온도변화를 열화상카메라(FLIR T420, FLIR system Inc., Danderyd, Sweden)로 측정 및 촬영하였다.

그 결과, PDN 또는 imPDN보다 αPDL1-PDN 또는 αPDL1-imPDN를 처리한 CT-26 세포에서 온도가 더 높았으며, 근적외선 1분 이상 조사 시 온도가 50℃ 이상으로 상승되는 것으로 나타나, αPDL1가 결합된 입자가 암세포에 특이적으로 축적되어 암세포의 온도를 높임을 확인하였다(도 17).

<5-2> 근적외선 조사 후 암세포의 생존력 측정

실시예 1에서 제조한 PDN, imPDN, αPDL1-PDN 또는 αPDL1-imPDN를 CT-26 세포에 처리하고 근적외선을 조사한 후, CT-26 세포의 생존력을 MTT 어세이로 측정하였다.

구체적으로, CT-26 세포에 PDN, imPDN, αPDL1-PDN 또는 αPDL1-imPDN를 처리한 후, 배지의 10% 만큼의 MTT(3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma-aldrich) 시약을 첨가하고 2시간 동안 세포를 배양하였다. 그런 다음, 배지와 MTT 시약을 제거하고 DMSO를 첨가하여 포르마잔(formazan)을 용해시키고 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, PDN 또는 imPDN보다 αPDL1-PDN 또는 αPDL1-imPDN를 처리한 암세포에서 세포 사멸 효과가 더 클 뿐만 아니라 거의 대부분의 암세포를 사멸시키는 것으로 나타났다. αPDL1가 결합된 입자가 암세포에 특이적으로 축적되어 암세포에 대한 광열치료 효과를 높임을 확인하였다(도 18).

< 실험예 6> 광열치료 후 면역조절능력 평가

실시예 1에서 제조한 imPDN 또는 αPDL1-imPDN로 사멸된 암세포의 면역조절능력을 평가하기 위해, 광열치료된 암세포와 iDC를 공배양하여 mDC의 표지 인자, TNF-α 및 IL-6를 측정하였다.

<6-1> mDC 표지인자의 발현 측정

실시예 1에서 각각 제조한 imPDN 또는 αPDL1-imPDN의 광열치료 후 iDC에서 mDC로 분화를 촉진시키는 능력을 확인하기 위해, 근적외선 조사된 암세포와 iDC를 공배양하여 mDC 표지인자인 CD40, CD80 및 CD86을 측정하였다.

구체적으로, CT-26 세포를 웰 당 10⁵ 세포의 밀도로 12웰 플레이트에 접종하고 다음날 실시예 1에서 제조한 imPDN 또는 αPDL1-imPDN를 0.5 mg/㎖의 농도로 처리하였다. 이를 4시간 동안 배양한 후, 각 세포를 PBS로 3회 세척하고 500×g에서 3분간 원심분리하여 세포 펠렛을 얻었다. 각 펠렛에 808nm 근적외선 레이저를 5분간 조사하였다. 조사 후, CT-26 세포를 BMDC와 함께 48시간 동안 공동 배양한 후, 형광 표지 항체로 염색하여 CD40, CD80 및 CD86의 발현을 분석하였다. 형광의 세기는 유세포 분석법으로 측정하고, 형광 세기의 중간값(median)을 산출하였다.

그 결과, imPDN 보다 αPDL1-imPDN로 처리하였을 때 CD40, CD80 및 CD86의 발현이 높게 나타나, αPDL1-imPDN는 광열치료 후에 수지상 세포의 분화를 촉진시키는 데 효과적임을 확인하였다(도 19).

<6-2> TNF -α 및 IL-6의 분비량 측정

실시예 1에서 제조한 imPDN 또는 αPDL1-imPDN의 광열치료 후 iDC에서 mDC로 분화를 촉진시키는 능력을 확인하기 위해, 근적외선 조사된 암세포와 iDC를 공배양하고 공배양한 배지 내 TNF-α 및 IL-6의 분비량을 측정하였다.

구체적으로, 실험예 6-1와 동일한 방법으로 배양한 골수 유래 수지상 세포의 배지를 수집한 뒤, TNF-α 및 IL-6의 분비량을 ELISA로 측정하였다.

그 결과, imPDN 보다 αPDL1-imPDN로 처리하였을 때 TNF-α 및 IL-6의 분비량이 높은 것으로 나타나, αPDL1-imPDN는 광열치료 후에 수지상 세포의 분화를 촉진시키는 데 효과적임을 확인하였다(도 20 및 도 21).

< 실험예 7> 종양 동물모델에서의 광열치료 효과 평가

실시예 1에서 제조한 PDN, imPDN, αPDL1-PDN 및 αPDL1-imPDN의 종양 동물모델에서의 광열치료 효과를 평가하기 위해, 각 입자의 암세포에 대한 결합능을 투과전자현미경으로 관찰하고, 각 입자를 투여한 동물모델에 근적외선을 조사하여 암세포의 온도를 측정하였다.

<7-1> 암세포 표면에 발현하는 PD-L1 확인

각 입자의 암세포에 대한 결합능을 확인하기 이전에, CT-26 세포주에서의 PD-L1 발현과 CT-26 종양 조직의 세포에서의 PD-L1 발현을 유세포 분석법으로 확인하였다.

구체적으로, 대장암세포주 CT-26 세포주의 PD-L1 발현은 실험예 3-1과 동일한 방법으로 실험하였다. CT-26 종양 조직은 CT-26 세포주에 의해 형성된 종양 조직으로, CT-26 종양 조직에서의 PD-L1 발현을 확인하기 위해, 먼저 6주령의 Balb/c 마우스의 오른쪽 측면에 10⁶개의 CT-26 세포를 피하 주사하고, 종양이 150-180 mm³의 부피로 성장하였을 때 종양 조직을 분리하였다. 분리한 종양 조직을 1 mg/㎖ 콜라게나제를 함유하는 RPMI 배지에서 37℃에서 2시간 동안 자성 교반하여 단일세포로 분해하였다. 분해된 종양 세포를 원심 분리에 의해 수집하고 차가운 PBS로 세척하였다. 멸균된 40 ㎛ 스트레이너로 세포를 여과하여 얻은 단일 종양 세포를 실험예 4-1에 기술된 동일한 방법으로 염색하고, 유세포 분석법으로 형광의 세기를 측정하였다.

그 결과, CT-26 세포주보다 CT-26 종양 조직의 세포에서 PD-L1이 더 높은 수준의 발현율을 보였으며, 이는 종양환경에서 분비되는 싸이토카인 등에 의해 PD-L1의 발현이 증가하였기 때문이다(도 22).

<7-2> 투과전자현미경을 이용한 암세포에 대한 결합능 평가

실시예 1에서 제조한 PDN, imPDN, αPDL1-PDN 및 αPDL1-imPDN의 암세포에 대한 결합능을 확인하기 위해, 각 입자를 종양 동물모델에 주사하고 종양조직을 적출하여 이를 투과전자현미경(TEM)으로 관찰하였다.

투과전자현미경 관찰 결과, 동물모델에서도 PDN 또는 imPDN보다 αPDL1가 결합된 αPDL1-PDN 또는 αPDL1-imPDN가 암세포에 특이적으로 결합함을 확인하였다(도 23).

<7-3> 근적외선 조사에 따른 종양 동물모델의 온도 측정

실시예 1에서 제조한 PDN, imPDN, αPDL1-PDN 또는 αPDL1-imPDN를 종양 동물모델에 주사하고 근적외선을 조사하여, 종양 동물모델의 온도를 측정하였다.

구체적으로, Balb/c 마우스(6주령)에 10⁶개의 CT-26 세포를 오른쪽 옆구리에 피하 주사한 뒤, 도 24의 광열치료 일정에 따라, 종양 성장 7일째에 마우스를 무작위 배정하여 PDN, imPDN, αPDL1-PDN 또는 αPDL1-imPDN를 마우스당 PDN 2 mg 및 마우스 당 im(이미퀴모드) 24 ㎍의 용량으로 정맥 내 투여하였다. 다음 날, 마우스를 마취시키고 마우스 홀더에 위치시킨 다음, 종양 부위에 808 nm 근적외선 레이저를 1.5 W의 출력으로 10분간 조사하였다.

그 결과, PDN 또는 imPDN보다 αPDL1-PDN 또는 αPDL1-imPDN를 투여한 동물모델에서 온도가 더 높게 나타나, 동물모델에서도 αPDL1가 결합된 입자가 암세포에 특이적으로 축적되어 광열치료 효과를 높임을 확인하였다(도 25 및 도 26).

< 실험예 8> 종양 동물모델에서의 종양치료 효과 평가

실시예 1에서 제조한 PDN, imPDN, αPDL1-PDN 및 αPDL1-imPDN의 동물모델에서의 광열치료 효과를 평가하기 위해, 각 입자를 투여한 종양 동물모델에 근적외선을 조사하여 암세포의 부피 및 마우스의 생존율을 측정하였다.

<8-1> 종양의 부피 측정

종양 동물모델에 PDN, imPDN, αPDL1-PDN 또는 αPDL1-imPDN를 투여하고 근적외선을 조사한 후, 시간에 따라 종양의 부피를 측정하였다.

구체적으로, 실험예 7-3과 동일한 방법으로 CT-26 세포를 접종한 모델에 CT-26 세포를 접종한 지 14일째에 10⁵개의 CT-26 세포를 다시 한번 주입하여 전이성 종양을 유도하였다(도 27). 일부 군에서는 CT-26 세포를 다시 주입한 지 3일 후부터 αPDL1를 마우스당 100 ㎍로 3일마다 복강 투여하였다. 원발성 종양과 전이성 종양 크기는 캘리퍼로 측정하였으며, 종양의 부피는 방정식 a×b²×0.5(여기서 a는 가장 큰 직경, b는 가장 작은 직경이다)에 따라 계산하였다.

그 결과, αPDL1-PDN 또는 αPDL1-imPDN를 투여하고 근적외선을 조사한 동물모델에서 원발성 종양의 성장이 현저히 억제되었으며(도 28), 그 중에서도 αPDL1-imPDN가 전이성 종양의 성장을 보다 효과적으로 억제함을 확인하였다(도 29).

<8-2> 생존율 측정

종양 동물모델에 PDN, imPDN, αPDL1-PDN 또는 αPDL1-imPDN를 투여하고 근적외선을 조사한 후, 시간에 따라 마우스의 생존율을 측정하였다. 각 조건 당 마우스는 총 6마리였으며, 100일 동안 관찰하여 생존율을 산출하였다.

그 결과, αPDL1-PDN 또는 αPDL1-imPDN를 투여하고 근적외선을 조사한 마우스에서 생존율이 높게 유지되었으며, 그 중에서도 αPDL1-imPDN를 투여한 마우스는 100일 동안 100%의 생존율을 나타냈다(도 30).

< 실험예 9> 종양 동물모델에서의 면역조절능력 평가

실시예 1에서 제조한 PDN, imPDN, αPDL1-PDN 및 αPDL1-imPDN의 종양 동물모델에서의 면역조절능력을 평가하기 위해, 종양 동물모델에서 CD8+ T 세포의 수를 측정하고, T 세포의 종양 살상 효과를 측정하였다.

<9-1> CD8+ T 세포수 측정

종양에 침윤하는 CD8+ T 세포의 수를 측정하기 위해, 도 27에 나타낸 광열치료 일정에 따라, 종양 동물모델에 PDN, αPDL1 또는 αPDL1-imPDN을 각각 투여하고 CT-26 두번째 접종 이후 7일째에 마우스로부터 전이성 종양을 적출하였다. 적출한 종양을 포르말린에 고정시키고 파라핀에 포매한 후, 파라핀 포매 조직을 재수화하여 Tris-EDTA 완충액(pH 9.0)을 처리하였다. 조직에 anti-mouse CD8α 항체(Biorad, Hercules, CA, USA)에 대한 1차 항체를 1:100으로 희석하여 처리하고, HRP anti-rat secondary antibody(GBI lab, Bothell, WA, USA)를 처리한 후 3,3'-diaminobenzidine(DAB) 염색을 시행하였다. 조직은 메이어(Mayer)의 헤마톡실린으로 대조염색하였다.

그 결과, αPDL1-imPDN이 처리된 종양 동물모델에서 얻은 전이성 종양에 침윤한 CD8⁺ T세포수가 현저하게 높음을 확인하였다(도 31).

<9-2> 생체외 T 세포 의 종양 살상 효과

αPDL1-imPDN를 투여하고 광열치료를 실시하여 100일 이상 생존한 마우스로부터 분리한 T 세포를 종양세포와 공배양하여, T 세포의 종양 살상 효과를 측정하였다.

구체적으로, 종양이 완전히 사라진 마우스로부터 비장 세포를 분리한 후 나일론컬럼을 사용하여 T 세포를 수득하였다. 수득한 T 세포를 실온에서 5분간 2 mM CFSE(carboxyfluorescein succinimidyl ester, Biolegend)로 표지하고, CT-26 세포를 CellTracker™ Red CMTPX Dye(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 표지한 후, T 세포와 CT-26 세포를 100:1의 비율로 공배양하였다. 2일 후, 형광 현미경(Leica DM IL)으로 세포의 형광을 촬영하였다.

그 결과, αPDL1-imPDN를 처리한 마우스로부터 분리한 T 세포는 무처리 마우스로부터 분리한 T 세포보다 종양 살상 효과가 뛰어남을 확인하였다(도 32).

Claims

면역관문억제제(immune checkpoint inhibitor)가 표면에 결합된 광열 나노입자 및 면역조절제(adjuvant)를 유효성분으로 포함하는 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 광열 나노입자는 근적외선 영역의 빛을 흡수하여 발열하는, 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 광열 나노입자는 폴리도파민 나노입자, 금 나노입자, 그래핀 나노시트 또는 멜라닌 나노입자인, 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 면역조절제는 상기 광열 나노입자 내에 봉입된 것인, 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 면역조절제는 이미퀴모드, 레지퀴모드, 가디퀴모드 또는 모노포스포릴 지질 A인, 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 면역관문억제제는 암세포 표면에 발현된 단백질과 결합하는, 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 면역관문억제제는 PD-L1 항체 또는 CD47 항체인, 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 광열 나노입자는 암세포 표면에 발현된 단백질과 결합할 수 있는 항체가 더 결합된 것인, 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물.
제8항에 있어서, 상기 항체는 HER2 항체, EGFR 항체 또는 Ganglioside GD2 항체인, 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 암은 고형암 또는 혈액암인, 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 내인성 백신(endogenous vaccine)으로 작용하는, 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 수지상 세포의 분화를 촉진하는, 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 T 세포의 활성을 증가시키는, 암 치료 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물.