KR20220074557A

KR20220074557A - Rsvf를 발현하는 엑소좀 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20220074557A
Application number: KR1020200163200A
Authority: KR
Inventors: 김인산; 김기범; 남기훈; 김성현; 양유수
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2020-11-27
Filing date: 2020-11-27
Publication date: 2022-06-03
Also published as: EP4252743A1; WO2022114409A1; CN116744905A

Abstract

본 발명은 호흡기 세포 융합 바이러스 F 단백질(Respiratory syncytial virus F protein, RSVF)을 발현하는 엑소좀 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 호흡기 세포 융합 바이러스 F 단백질을 발현하는 엑소좀은 암세포 특이적으로 막에 융합하여 암세포를 사멸시키며, 종양 특이적으로 축적되어 종양 성장을 억제시키는 바, 암의 예방 또는 치료 용도로 제공할 수 있다.

Description

RSVF를 발현하는 엑소좀 및 이의 용도{Exosomes expressing respiratory syncytial virus F protein and uses thereof}

본 발명은 호흡기 세포 융합 바이러스 F 단백질(Respiratory syncytial virus F protein, RSVF)을 발현하는 엑소좀 및 이의 용도에 관한 것이다.

19 세기 후반, 야생형 인플루엔자 바이러스가 백혈병을 치료하는 데 사용되면서부터 종양 용해성 바이러스(Oncolytic virus; OV) 요법이 시작되었다. 종양 용해성 바이러스 요법은 종양 치료에 있어 놀라운 발전과 성과가 있었다. 특히, 2015 년 T-VEC(Talimogene laherparepvec)는 흑색종 치료에 대해 미국 FDA(Food and Drug Administration)의 승인을 받았다. 이는 종양 용해성 바이러스 요법의 가능성을 보여 주었으며, 다양한 종양 용해 바이러스를 사용한 약 60 건의 임상 실험이 진행 중이다. OV의 가장 큰 특징은 건강한 세포에는 영향을 미치지 않고 악성 세포에는 악영향을 미친다는 것이다.

이와 같이 OV는 다양한 암에 대한 항종양 효과를 나타내어 왔지만, 기원에 따라 항체와 선천 면역 체계를 중화하여 혈액에서 빠르게 제거된다. 이러한 이유로 OV는 전신 치료에 적용하기 어려우며, 흑색종 및 두경부암과 같은 종양 내 주사가 용이한, 제한된 종양에만 적용 가능한 문제점이 있다(비특허문헌 1).

오르토뉴모바이러스속(Orthopneumovirus)에 속하는 호흡기 세포 융합 바이러스(Respiratory syncytial virus, RSV)는 하부 호흡기를 감염시키고 폐렴 및 기관지염을 유발하는 음성 단일가닥 RNA 바이러스이다. RSV는 11 개의 단백질로 구성되며, 이 중 RSV 융합 단백질(RSV fusion protein; RSVF)은 숙주 세포를 감염시키는 데 필수적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 2, 비특허문헌 3). RSVF가 표적 세포와 융합하여 세포 사멸을 초래할 수 있고 전임상 연구에서 상당한 종양 퇴행 효과를 나타냈다는 사실에 근거하여 RSV를 종양 용해 바이러스로 사용하려는 다양한 시도가 있었다. 또한, RSVF의 주요 수용체인 뉴클레오린(nucleolin)은 종양 세포 표면에서 높게 발현되는 것으로 알려져 있어, 종양 표적 약물의 수용체로 널리 사용되어 왔다.

그러나 이러한 시도에도 불구하고, 여전히 RSV를 사용한 OV 요법은 혈액에서 빠르게 제거된다는 점에서 OV 요법의 한계를 극복할 수 없었다.

한편, 효과적인 치료제 전달 담체로서 많은 관심을 받고 있는 엑소좀은 대부분의 세포 유형으로부터 분비되는 나노 크기의 세포 외 소포이며 RNA, 단백질 및 지질과 같은 기원의 다양한 생체 분자를 포함한다. 세포 간 신호 전달에 참여하고 독성 없이 혈액에서 순환 시간이 길다는 것을 고려할 때, 엑소좀은 효과적인 세포 유래의 운반체로 사용될 수 있으며 암 치료에 현저한 영향을 나타낼 수 있다. 또한, 엑소좀은 인지질 이중층을 가지고 있기 때문에 생물학적 활성 막 단백질을 전달하는데 적합한 것으로 알려져 있다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 표면에 RSVF가 발현되는 종양 분해 엑소좀을 제조하고, 제조된 RSVF 발현 엑소좀(RSVF-Exo)이 RSVF의 주요 수용체이자 종양 세포 표면에서 높은 수준으로 발현되는 뉴클레오린 의존적으로 악성 세포와 우선적으로 융합될 수 있고 소포체(endoplasmic reticulum; ER) 스트레스 매개 방식을 통해 면역원성 세포 사멸(immunogenic cell death; ICD)을 추가로 유발할 수 있음을 확인하였다. 또한, RSVF-Exo가 종양과 융합되면 표면에 바이러스 단백질이 발현되고 면역 체계에 의해 쉽게 인식되어 식균 작용을 증가시켰다. 또한, 종양 부위에 축적된 RSVF-Exo를 전신 주사하였을 경우 면역계의 상향 조절을 유도하여 항 종양 효과를 나타내었으며, 면역 체크 포인트 차단 요법과 함께 적용시, RSVF-Exo가 면역 체크 포인트 차단의 효능을 상승적으로 개선시키는 것을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

M.S. Ferguson, N.R. Lemoine, Y. Wang, U.M. Lauer, Systemic Delivery of Oncolytic Viruses: Hopes and Hurdles, Adv. Virol. 2012 (2012) 14. https://doi.org/10.1155/2012/805629. S. Bueno, P. Gonzαlez, R. Pacheco, ··· E.L.-I., undefined 2008, Host immunity during RSV pathogenesis, Elsevier. (n.d.). https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1567576908001057 (accessed November 13, 2019) J.S. McLellan, W.C. Ray, M.E. Peeples, Structure and Function of Respiratory Syncytial Virus Surface Glycoproteins, in: 2013: pp. 83-104. https://doi.org/10.1007/978-3-642-38919-1_4.

본 발명의 하나의 목적은 호흡기 세포 융합 바이러스 F 단백질(Respiratory syncytial virus F protein, RSVF)을 발현하는 엑소좀을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 암의 예방용 백신 조성물을 제공하는 것이다.본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 약학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 호흡기 세포 융합 바이러스 F 단백질을 발현하는 엑소좀을 포함하는 제1조성물; 및 항암제를 유효성분으로 함유하는 제2조성물;을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 i) 호흡기 세포 융합 바이러스 F 단백질(Respiratory syncytial virus F protein, RSVF)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드로 세포를 형질 감염시키는 단계; ii) i) 단계의 세포에 약물을 처리하는 단계; 및 iii) ii) 단계의 세포의 상청액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계;를 포함하는, 호흡기 세포 융합 바이러스 F 단백질을 발현하는 엑소좀의 제조방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 호흡기 세포 융합 바이러스 F 단백질(Respiratory syncytial virus F protein, RSVF)을 발현하는 엑소좀(RSVF-Exo)을 제공한다.

본 발명에서 용어 "호흡기 세포 융합 바이러스(Respiratory syncytial virus, RSV)"는 파라믹소비리다에 패밀리(Paramyxoviridae family)에 속하며, 이의 게놈은 9 개의 구조 단백질(3 개의 당 단백질(glycoprotein)과 6 개의 내부 단백질)과 2 개의 비 구조 단백질을 포함하여 11 개의 단백질을 암호화하는 단일 가닥인, 음성 센스(negative-sense) RNA 분자로 구성된다. RSV는 소아 및 성인에서 감기, 기관지염, 폐렴, 세기관지염을 야기하는 바이러스로 5세 미만의 소아에서 폐렴을 일으키는 가장 흔한 원인으로 알려져 있다. RSV를 구성하는 단백질 중 RSV 비리온(virion) 표면상의 2 개의 주요 당 단백질과, 기도의 섬모 세포를 표적으로 하는 부착 당 단백질(attachment glycoprotein, G) 및 비리온 막이 표적 세포막과 융합되게 하는 융합(fusion, F) 당 단백질은 감염의 초기 단계를 제어한다. RSV는 호흡기 분비물의 흡입, 경구 접촉에 의해서 전염되며, 잠복기는 4-5일이다.

본 발명에서 용어 "호흡기 세포 융합 바이러스 F 단백질(Respiratory syncytial virus F protein, RSVF)"은 RSV 비리온 막이 표적 세포막과 융합되게 하는 융합(fusion, F) 당 단백질로 비리온 막에서 삼량체(trimer)로 존재한다.

F 단백질을 코딩하는 유전자는 균주에 따라 5 내지 6 개의 N-연결된 글리칸(glycan)이 부착된 574 개의 아미노산 불활성 전구체인 F0으로 합성된 제 1 형 일체형 막 단백질을 코딩한다. 3 개의 F0 단량체가 삼량체 내로 조립되고, 삼량체가 골지를 통과함에 따라 단량체는 푸린 유사 숙주 프로테아제(furin-like host protease)에 의해 활성화된다. 프로테아제는 109 개 및 136 개의 아미노산 이후 두 번 절단하여 3 개의 폴리펩티드를 생성한다. N-말단 및 C-말단 절단 생성물은 각각 F2 및 F1 서브 유닛이고, 이들은 2 개의 이황화 결합(disulfide bond)에 의해 서로 공유 연결되어있다. F2 서브 유닛은 2 개의 N-연결 글리 칸을 포함하며, 이보다 더 큰 F1 서브 유닛은 단일 N-연결 부위를 포함한다. 이 F1 글리칸은 단백질이 막 융합을 일으키는 데 필수적인 것으로 알려져 있다(Jason S. McLellan et al., Structure and Function of RSV Surface Glycoproteins, Curr Top Microbiol Immunol. 2013; 372: 83-104.).

본 발명에서 용어 "엑소좀(Exosome)"은 세포 간 신호전달을 하기 위하여, 단백질, DNA, RNA 등을 가지고 세포 밖으로 분비되는 50 - 200 nm 크기의 막구조의 작은 소낭을 의미한다. 엑소좀은 다낭체(Multivesicular bodies, MVBs)라고 불리는 세포 내 특정 구획에서 기원하여 세포 밖으로 방출, 분비되는 것으로, 대부분의 세포 유형으로부터 분비된다. 엑소좀에는 세포 내의 다양한 단백질, DNA, RNA 등이 포함되어 있다. 이러한 엑소좀에 포함되어 세포 밖으로 분비되는 물질들은 세포막과의 융합(fusion) 혹은 내포작용(endocytosis)에 의해 다른 세포 내로 다시 유입되어 세포 간의 통신자로서의 역할을 하기도 한다.

세포 간 신호 전달에 참여하고 독성 없이 혈액에서 순환 시간이 길다는 것을 고려할 때, 엑소좀은 효과적인 세포 운반체로 사용될 수 있다. 엑소좀은 효과적인 치료제 전달 담체로서 많은 관심을 받고 있으며 암 치료에 현저한 영향을 나타낼 수 있다. 또한, 엑소좀은 인지질 이중층을 가지고 있기 때문에 생물학적 활성 막 단백질을 전달하는데 적합한 것으로 알려져 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따라 제조된 엑소좀은 막에서 RSVF를 발현하는 것을 확인하였고(도 1c, 도 2a, 도 2f), 직경이 약 100 nm(도 1b, 도 2b)인 원형인 것을 확인하였다.

상기 엑소좀은 암세포 특이적으로 막에 융합하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따라 제조된 엑소좀이 시험관 내 조건에서 뉴클레오린을 고도로 발현하는 루이스 폐 암종(Lewis lung carcinoma, LLC) 및 CT26.CL25 결장암세포주의 세포막과 융합하는지를 확인한 결과, RSVF가 엑소좀으로부터 LLC 및 CT26.CL25 세포막으로 전달되었고(도 1e, 도 3a), 항-뉴클레오린 항체로의 사전 차단에 의해 막 융합 활성이 감소되었으며(도 1g), 이를 통해 막 융합 활성이 RSVF와 뉴클레오린 사이의 상호 작용에 의존적임을 확인하였다. RSVF-Exo는 농도 및 시간 의존적으로 암세포막과 융합하고, 최대 4시간 까지 암세포막과 결합하였다(도 2c-d 및 도 2f). 반면, HEK293T, BMDM 및 BMDC를 포함하는, 낮은 수준의 뉴클레오린을 발현하는 비-암세포에서는 엑소좀 매개 RSVF 융합이 거의 관찰되지 않았다(도 1e, 도 3a).

또한, 생체 내에서 RSVF-Exo로 처리된 마우스로부터 분리된 골수, 내피 및 섬유아세포 세포가 아닌 종양 세포에서 RSVF가 검출됨을 확인하였다(도 1f, 도 3b).

상기 결과는 RSVF-Exo가 시험관 내 및 생체 내에서 높은 수준의 뉴클레오린을 발현하는 암세포와 우선적으로 융합한다는 것을 나타낸다.

상기 엑소좀은 면역원성 세포 사멸(immunogenic cell death; ICD)을 통해 암세포를 사멸시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

RSVF는 3 개의 소포체(endoplasmic reticulum; ER) 스트레스 센서(이노시톨 요구 효소 1(inositol-requiring enzyme 1; IRE1), 단백질 키나제 R-유사 소포체 키나제(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase; PERK) 및 활성 전사 인자 6(activating transcription factor 6; ATF6))를 활성화함으로써 세포 자멸사를 유도할 수 있는 것으로 알려져 있으며, 연장된 ER 스트레스는 아폽토시스(apoptosis) 및 괴사(necrosis)를 통해 세포 사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다.

즉, 전술한 RSVF를 표면에서 발현하는 본 발명의 RSVF 발현 엑소좀(RSVF-Exo)은 RSVF의 주요 수용체이자 종양 세포 표면에서 높은 수준으로 발현되는 뉴클레오린 의존적으로 악성 세포와 우선적으로 융합될 수 있고, 소포체 스트레스 매개 방식을 통해 ICD를 추가로 유발할 수 있다.

본 발명의 RSVF-Exo에 의해 상기 ICD가 유발되는 이유는 액포형 H+ ATP 가수분해(vacuolar type H+ ATPase) 활성을 가지는 항생제인 바필로마이신 A1(Bafilomycin A1)을 RSVF를 발현하는 세포에 처리시, 파고좀-리소좀(phagosome-lysosome)의 융합을 억제하여 엑소좀 내 비접힘-단백질(unfolded protein) 등의 축적을 일으키고, 이에 따라 상기 세포에서 유래한 RSVF-Exo 내부에 비접힘-단백질이 다량 축적되기 때문인 것으로 예상된다. 상기 비접힘-단백질을 포함하는 RSVF-Exo은 종양 세포에 막 융합하여 비접힘-단백질을 전달하고, 이에 따라 종양세포 내 비접힘-단백질이 증가하여 종양세포의 비접힘-단백질 반응 항상성 조절이 실패함으로써 ER 스트레스가 발생되어 ICD가 유발된다.

즉, 본 발명에 따른 엑소좀은 파고좀-리소좀 융합 억제제 처리에 의해 파고좀-리소좀의 융합이 억제되어 엑소좀 내 비접힘-단백질이 축적된 것일 수 있다.

상기 파고좀-리소좀 융합 억제제에 의한 파고좀-리소좀 융합 억제는 액포형 H+ ATP 가수분해(vacuolar type H+ ATPase) 촉진, 프로테아좀(Proteasome) 기능 억제, 오토파고솜(Autophagosome) 형성 억제, 및 디아세틸라제(Deacetylase) 억제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나로부터 유발되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에서, RSVF-Exo이 ER 스트레스를 유발할 수 있는지를 확인한 결과, ER 스트레스 마커인 ATF4 및 CHOP가 RSVF-Exo 처리 군에서 상향 조절됨을 확인하였다(도 4e).

RSVF-Exo 처리된 LLC 및 CT26.CL25 암세포는 Con-Exo 처리된 대조군과 비교하여 농도 의존적으로 더 낮은 세포 생존력을 나타내었다. 그러나, RSVF-Exo는 HEK293T, BMDM 및 BMDC와 같은 정상적인 세포에서는 세포 사멸을 유도하지 않았다(도 6a, 도 7b).

상기 결과는 RSVF-Exo가 암세포에만 세포 사멸 효과를 나타냄을 있음을 시사한다.

ER 스트레스가 암세포에 대해 면역원성 세포 사멸(immunogenic cell death; ICD)을 유도 하는지 확인한 결과, RSVF-Exo는 세포 표면에서 칼레티쿨린(calreticulin; CRT) 발현을 증가시키고, LLC 및 CT26.CL25 세포로부터 방출되는 HSP70(heat shock protein 70) 및 HMGB1(high mobility group box 1)와 같은 ICD 마커의 양을 증가시켰다(도 6b-c, 도 7d).

또한, RSVF-Exo가 종양과 융합되면 표면에 바이러스 단백질이 발현되고 면역 체계에 의해 쉽게 인식되어 식균 작용을 증가시켰다.

본 발명의 일 구현예에서, RSVF-Exo 처리된 LLC 및 CT26.CL25 암세포는 Con-Exo 처리된 대조군과 비교하여 식작용(Phagocytosis) 발생율이 현저히 높았다(도 7e).

상기 결과는 RSVF-Exo가 암세포 죽음을 유도할 뿐만 아니라 암에 대한 숙주의 면역 시스템을 활성화시킴을 나타낸다.

상기 엑소좀은 종양 특이적으로 축적되어 종양 성장을 억제시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에서, CT26.CL25 종양-보유 마우스를 이용하여 생체 내 RSVF-Exo의 종양 억제 효과를 확인한 결과, RSVF-Exo를 종양 내 처리시 종양 크기에 대해 약 70 % 회복 효과가 확인되었으며(도 8a-b), 체중에 유의한 차이는 없었다(도 9a).

바이러스 항원인 RSVF는 톨-유사 수용체 4(toll-like receptor 4; TLR4)와 상호 작용하고 하류 신호 전달 경로를 활성화시키며, 이는 T 세포 프라이밍(priming)에 필수적인 수지상세포(dendritic cell; DC)의 활성화로 이어지는 것으로 알려져 있는 바, RSVF-Exo가 종양-특이적 면역을 유발할 수 있는지 여부를 조사한 결과, RSVF-Exo 처리된 마우스로부터 분리된 TDLN은 대조군에 비해 종양-특이적 펩티드인 gp70 및 β-갈락토스에 대해 분비되는 IFN-γ의 양이 증가되었으며(도 8c), CD11c + 세포에서 수지상세포 성숙 마커인 CD40 및 CD86의 발현 수준이 RSVF-Exo 처리된 그룹에서 증가되었음을 확인하였다(도 8d).

또한, CT26.CL25 종양-보유 BALB/c 마우스 유래 종양 조직에서 CD8 + T 세포의 침윤을 분석한 결과, RSVF-Exo 처리군의 종양 조직에서 CD8 + T 세포의 수가 증가하였다(도 8e).

상기 결과는 RSVF-Exo가 항 종양 면역 반응을 활성화시킴으로써 생체 내 종양 성장을 억제할 수 있음을 나타낸다.

한편, 종양 용해성 바이러스(Oncolytic virus; OV) 요법은 건강한 세포에는 영향을 미치지 않고 악성 세포에는 악영향을 미치며, 다양한 암에 대한 항종양 효과를 나타내어 왔으나, 기원에 따라 항체와 선천 면역 체계를 중화하여 혈액에서 빠르게 제거된다. 이러한 이유로 OV는 전신 치료에 적용하기 어려우며, 흑색종 및 두경부암과 같은 종양 내 주사가 용이한, 제한된 종양에만 적용 가능한 문제점이 있었다.

그러나, 본 발명의 RSVF-Exo는 전신 주사하였을 경우 면역계의 상향 조절을 유도하여 항 종양 효과를 나타내었다.

본 발명의 일 구현예에서, RSVF-Exo가 정맥 내 주사 시에도 종양 부위에 축적되는지의 여부를 CT26,CL25 종양 누드 마우스 모델에서 확인한 결과, RSVF-Exo는 Con-Exo보다 종양 부위에 더 많이 축적되어 있었으며(도 10a 및 c), Con-Exo에 비해 종양 부위를 표적화하여 폐, 간 및 비장과 같은 주요 기관에서는 Cy5.5-NHS 신호의 양에 유의한 차이가 없었다(도 10b). 상기 결과는 LLC 모델에서도 동일하게 확인되었다(도 11a-c).

RSVF-Exo이 정맥 주사 되었을 때 항 종양 면역을 통해 생체 내에서 종양 성장을 억제할 수 있는지를 확인한 결과, RSVF-Exo 처리된 그룹은 대조군보다 종양 성장을 더 억제하였으며, 그룹 간 체중 차이는 없었다(도 12a, 도 13a). 뿐만 아니라, TDLN에서 수지상세포 성숙 마커인 CD40 및 CD86이 RSVF-Exo 처리된 그룹에서 상향 조절됨을 확인하였다(도 12c).

결과적으로, RSVF-Exo 처리는 TDLN에서 CD8 + T 세포의 빈도와 비장에서 CD8 + T 세포상의 활성화 마커인 CD40 리간드(CD40 ligand; CD40L)를 증가시켰다(도 12d, 도 13b-c).

또한, RSVF-Exo가 CD8 + T 세포 기억을 촉진하는지 여부를 결정하기 위해 CD8 + T 세포에서 CD44의 발현 및 빈도를 평가한 결과, RSVF-Exo가 TDLN에서 항원-경험된 CD44 발현 CD8 + T 세포의 비율을 효과적으로 증가시켰다(도 12c). 또한, 종양 침윤 CD8 + T 세포의 양은 RSVF-Exo에 의해 현저히 증가되었다(도 12d).

상기 결과는 RSVF-Exo가 정맥 내 주사 시에도 종양 부위에 축적되어 항 종양 면역을 통해 생체 내에서 종양 성장을 억제할 뿐만 아니라, CD8 + T 세포의 빈도 및 활성화를 촉진하고 CD8 + T 세포 기억을 촉진함으로써, 종양 침윤 CD8 + T 세포의 양을 현저히 증가시킴을 나타낸다.

본 발명의 다른 양태는 상기 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.

본 발명에서 용어 "암"은 정상적인 조직 세포가 각종 물리적·화학적·생물학적인 암원성 물질의 작용 또는 요인에 의해 형성되는 종양을 의미하는 것으로, 상기 암은 암의 종류에 제한없이 포함되나, 그 예로, 식도암, 위암, 대장암, 직장암, 구강암, 인두암, 후두암, 폐암, 결장암, 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 전립선암, 고환암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 골암, 결합 조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨(Hodgkin) 질환, 림프종 또는 다발성 골수종 혈액암일 수 있고, 구체적으로 결장암 또는 폐암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 암의 "예방(prevention)" 및/또는 "치료(treatment)"의 용도를 갖는다. 예방적 용도에 있어, 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명에 기술된 질환 또는 증상을 가지고 있거나 발병 위험이 있는 것으로 의심되는 개체에 투여될 수 있다. 치료적 용도에 있어, 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명에 기술된 질환을 이미 앓고 있는 환자와 같은 개체에 본 발명에 기술된 질병 또는 증상을 치료하거나 적어도 부분적으로 정지시키기 위해 충분한 양으로 투여된다. 이러한 사용에 효과적인 양은 질환 또는 증상의 심각도 및 경과, 이전의 치료, 개체의 건강 상태와 약물에 대한 반응성 및 의사 또는 수의사의 판단에 따라 달려있을 것이다.

본 발명의 약학적 조성물은 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 조성물에 포함되는 유효성분인 RSVF-Exo의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 중량% 내지 10 중량%로, 바람직하게는 0.001 중량% 내지 1 중량%를 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 개체에 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며 단일 또는 다중 투여될 수 있다.

본 발명의 RSVF-Exo는 면역 체크 포인트 차단 요법과 함께 적용시, 면역 체크 포인트 차단의 효능을 상승적으로 개선시켰다.

본 발명의 일 구현예에서, RSVF-Exo로 유도된, 면역 체크 포인트 차단 요법의 효능을 증가시키는 CD8 + T 세포 면역성을 확인하기 위해 CT26.CL25 종양-보유 BALB/c 마우스에 대해 RSVF-Exo와 항-PD-1 차단의 병용 요법을 수행한 결과, 항-PD-1 항체 단일 요법 그룹 및 Con-Exo 또는 PBS를 투여한 대조군은 종양 억제 효과가 없었으나 이와 대조적으로, RSVF-Exo와 항-PD-1 항체의 병용 요법 그룹은 종양 억제에 상승 효과를 나타내었으며 마우스의 생존율을 향상시켰다(도 8f-i, 도 12e-f).

상기 결과는 RSVF-Exo의 정맥 내 주사를 통한 전신 투여가 종양 용해 바이러스와는 달리, 독성 없이 종양 성장을 억제할 수 있고 면역 체크 포인트 차단의 치료 효과를 향상시킬 수 있음을 나타내었다.

상기 약학적 조성물은 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.

상기 약학적 조성물은 암의 예방 또는 치료를 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고 투여 가능하다. 투여의 방식은 당업계의 통상적인 방법이라면 제한없이 포함한다. 상기 약학적 조성물은 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 경구, 복강, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 일반적으로 0.001 내지 1,000 μg/kg의 농도, 구체적으로는 0.05 내지 1,000 μg/kg의 농도, 보다 구체적으로는 1 내지 100 μg/kg의 농도로 투여되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 양태는 약학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료방법을 제공한다.

여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.

본 발명에서 용어 "개체"는 암이 발생하였거나 발생할 수 있는 가능성이 있는 모든 동물을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물을 암의 의심 개체에 투여함으로써, 개체를 효율적으로 치료할 수 있다. 상기 개체는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 동물, 조류 및 어류 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 암의 의심 개체에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있으며, 상기 약학적으로 유효한 양은 전술한 바와 같다.

적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 일반적으로 0.001 내지 1,000 μg/kg의 농도, 구체적으로는 0.05 내지 1,000 μg/kg의 농도, 보다 구체적으로는 1 내지 100 μg/kg의 농도를 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 상기 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 암의 예방용 백신 조성물을 제공한다.

여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.

본 발명에서 용어 "백신"은 암에 대한 예방 또는 치료를 목적으로 개체에서 세포성 면역 반응을 유도하는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 백신 조성물은 다양한 암세포에 대하여 세포성 면역을 유도할 수 있다.

상기 백신 조성물은 추가적으로 용매, 면역증강제(adjuvant) 및 부형제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 상기 용매로는 생리식염수 또는 증류수를 사용할 수 있으며, 상기 면역증강제로는 프로인트(Freund's) 불완전체 또는 완전체 어쥬번트, 알루미늄 하이드록사이드 겔, 및 식물성 및 광물성 오일 등을 사용할 수 있고, 상기 부형제로는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포타슘 설페이트를 사용할 수 있다. 또한, 백신 제조에 사용되는 공지의 물질을 더 포함할 수 있다.

상기 백신 조성물은 경구형 또는 비경구형 제제로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 비경구형 제제인 주사 액제로 제조하며, 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내, 비강 또는 경막외(eidural) 경로로 투여할 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 호흡기 세포 융합 바이러스 F 단백질을 발현하는 엑소좀을 포함하는 제1조성물; 및 항암제를 유효성분으로 함유하는 제2조성물;을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 키트를 제공한다.

여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.

상기 제1조성물 및 제2조성물의 투여 경로 및 빈도는 각각 독립적인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 항암제는 당업계에 알려진 것이라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들면, 면역 체크 포인트 차단 요법에 사용되는 항암제일 수 있고, 구체적으로 항-PD-1 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 키트는 상기 제1조성물 및 제2조성물을 각각 포함하여 암의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있는 도구를 의미한다. 상기 키트는 그 종류가 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 형태의 키트를 사용할 수 있다.

본 발명의 상기 키트는 상기 제1조성물 및 제2조성물이 각각 개별 용기에 담긴 형태, 또는 하나 이상의 구획으로 나누어진 한 개의 용기 내에 담긴 형태로 포장되어 있을 수 있으며, 상기 제1조성물 및 제2조성물은 각각 1회 투여 용량의 단위 용량 형태로 포장되어 있을 수 있다.

상기 키트 내의 상기 제1조성물 및 제2조성물은 투여 대상 개체의 건강 상태 등에 따라 적절한 시기에 개별적으로 병용 투여될 수 있다. 즉, 상기 제1조성물 및 제2조성물의 투여 경로 및 빈도는 각각 독립적인 것일 수 있다.

본 발명의 상기 키트는 상기 제1조성물 및 제2조성물 각각의 투여량, 투여방법과 투여빈도를 기재한 사용설명서를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 상기 키트를 이용하여 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.

본 발명의 또 하나의 양태는 i) 호흡기 세포 융합 바이러스 F 단백질(Respiratory syncytial virus F protein, RSVF)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드로 세포를 형질 감염시키는 단계; ii) i) 단계의 세포에 약물을 처리하는 단계; 및 iii) ii) 단계의 세포의 상청액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계;를 포함하는, 호흡기 세포 융합 바이러스 F 단백질을 발현하는 엑소좀의 제조방법을 제공하는 것이다.

여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.

상기 i) 단계는 호흡기 RSVF을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드로 세포를 형질 감염시키는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서는 pCMV6-Entry(PS100001) 벡터(origene)에 RSVF(Respiratory syncytial virus fusion protein)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 2)를 포함되도록 플라스미드를 제작하고, 상기 제작된 플라스미드를 리포펙타민 3000(lipofectamine 3000)을 사용하여 인간 배아 신장 293T(Human embryonic kidney 293T, HEK293T) 세포에 형질 감염 시켰으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 ii) 단계는 i) 단계의 세포에 약물을 처리하는 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 세포에 약물을 처리하여 비접힘 단백질이 축적된 엑소좀을 생산하는 세포를 제작할 수 있다.

상기 약물은 파고좀-리소좀 융합 억제제(phagosome-lysosome fusion inhibitor), 프로테아좀(proteasome) 기능 억제제, 및 오토파고좀(Autophagosome) 기능 억제제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 세포가 비접힘 단백질이 축적된 엑소좀을 생산하도록 유도할 수 있는 약물이라면 제한 없이 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 파고좀-리소좀 융합 억제제는 예를 들면, 바필로마이신 A1(bafilomycin A1), 클로로퀸(chloroquine), 하이드록시클로로퀸(hydroxychloroquine), 퀴나크린(quinacrine), 모넨신(Monensin), E64d, 또는 펩스타틴 A(pepstatin A)일 수 있고, 상기 프로테아좀 기능 억제제는 예를 들면, 보르테조밉(bortezomib), 또는 카르필조밉(carfilzomib)일 수 있고, 상기 오토파고좀 기능 억제제는 베르테포르핀(verteporfin), 또는 빈카 알칼로이드(vinca alkaloids)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 ii) 단계는 i) 단계의 세포가 형질전환된 후 24시간 뒤에 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에서는 i) 단계의 세포가 형질전환된 후 24시간 뒤, 디메틸술폭시드(dimethyl sulfoxide; DMSO)에 용해된 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 유래 바필로마이신 A1(bafilomycin A1; BafA1)을 10nM 내지 50nM의 농도로 세포에 처리하였으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 iii) 단계는 ii) 단계의 세포의 상청액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 iii) 단계는 i) 단계의 세포가 형질전환된 후 48시간 뒤, 즉, 바필로마이신 A1 처리 후 48시간 뒤에 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에서는 i) 단계의 세포가 형질전환된 후 48시간 뒤, HEK293T 세포의 상청액을 수확하고 이를 원심분리하고 여과하여 엑소좀을 분리하였으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 방법에 따라 액포형 H+ ATP 가수분해 활성을 가지는 항생제인 바필로마이신 A1을 RSVF를 발현하는 세포에 처리하여 RSVF을 발현하는 엑소좀 제조할 경우, 제조된 RSVF을 발현하는 엑소좀은 전술한 바와 같이 파고좀-리소좀의 융합을 억제하여 비접힘-단백질 등의 축적을 일으키고, 이에 따라 상기 세포에서 유래한 RSVF-Exo 내부에 비접힘-단백질이 다량 축적됨에 따라 ICD가 유발되어 암세포 사멸 및 종양 성장 억제 효과가 발휘될 수 있다.

본 발명에 따른 호흡기 세포 융합 바이러스 F 단백질(Respiratory syncytial virus F protein, RSVF)을 발현하는 엑소좀은 암세포 특이적으로 막에 융합하여 암세포를 사멸시키며, 종양 특이적으로 축적되어 종양 성장을 억제시키는 바, 암의 예방 또는 치료 용도로 제공할 수 있다.

도 1은 뉴클레오린(nucleolin) 의존적인 호흡기 세포 융합 바이러스 F 단백질(Respiratory syncytial virus F protein, RSVF) 발현 엑소좀(RSVF-Exo)의 특성 및 융합활성을 나타낸 도이다. (a) RSVF-Exo에서의 RSVF 발현 및 엑소좀 마커인 TSG101, Alix 및 CD81 검출 결과. (b) RSVF-Exo의 크기 분포 및 cryo-TEM 이미지. (c) RSVF-Exo의 암세포에 대한 융합을 확인한 이미지. (d) 그래프는 LLC, CT26.CL25, HEK293T, BMDC 및 BMDM에서의 뉴클레오린 발현량. (n = 4). (e) LLC, CT26.CL25, HEK293T, BMDC 및 BMDM에 대한 엑소좀 처리 후, 각 세포 표면상의 RSVF의 양(n = 4). (f) CT26.CL25-mCherry 종양 보유 마우스에 종양 세포 접종 후 10 일째 및 11 일째에 RSVF-Exo, Con-Exo 및 PBS를 종양 내 주사한 후, 2시간 이후 분리된 종양 내 CD45 +, CD31 + 및 CD90.2 + 세포에서의 표면상의 RSVF의 상대 평균 형광 강도(mean fluorescence intensity, MFI) (n = 3; *** p <0.001; ANOVA with Turkey's post-hoc test.). (g) CT26.CL25 세포를 뉴클레오린 항체를 사용하여 사전 차단하고 RSVF-Exo로 처리한 후 표면상의 RSVF 발현량(n = 3; *** p <0.001; ANOVA with Student's t-test.). (h) 암세포 표면에 노출된 RSVF가 PAMP 신호로 작용하여 대식세포의 식작용(Phagocytosis)을 증가시킴을 확인한 도.
도 2는 RSVF-Exo의 특성 및 융합활성을 나타낸 도이다. (a) RSVF-Exo에서의 RSVF 발현량. (b) 저온전자현미경(Cryo-TEM)으로 확인한 RSVF-Exo. (c) 엑소좀 처리농도별 LLC, CT26.CL25 세포막상의 RSVF의 상대 MFI. (d) 엑소좀 처리시간별 LLC 세포막상의 RSVF의 상대 MFI. (e) pDisplay 벡터에 포함되어 cytoplasmic도메인이 없는 RSVF를 발현하는 엑소좀(RSVF-Exo(pDisplay) 및 RSVF 전체가 발현된 엑소좀(RSVF-Exo)의 LLC 세포에 대한 융합 정도. (f) 공초점 현미경으로 확인한 시간별 RSVF-Exo의 종양 세포 표면에서의 융합 정도.
도 3은 시험관 내(a) 또는 생체 내(b)에서 RSVF-Exo과 융합한 각 세포 표면상의 RSVF의 양을 분석한 도이다.
도 4는 RSVF-Exo의 소포체(endoplasmic reticulum; ER) 스트레스를 통한 종양 세포의 면역원성 세포 사멸을 나타낸 도이다. (a) 바필로마이신 A1(bafilomycin A1) 처리 여부에 따라 추출한 RSVF-Exo의 유비퀴틴화된 단백질(ubiquitinated protein)의 양. (b) 바필로마이신 A1 처리 여부에 따라 추출한 RSVF-Exo과 LLC 세포를 융합 후, LLC 세포 내의 비접힙-단백질(unfolded protein)인 어그레섬(aggresome)에 대한 FACS 분석. (c) 어그레섬의 CT26.CL25 세포 내부 존재 여부를 확인한 공초점 현미경 분석 결과. (d) 바필로마이신 A1 처리 여부에 따라 추출한 RSVF-Exo의 LLC 세포에 대한 세포 사멸 정도. (e) 바필로마이신 A1을 처리한 후 추출한 대조군 엑소좀(Con-Exo), RSVF-Exo을 LLC 세포에 처리 후 세포 내 ER 스트레스 마커의 웨스턴 블롯 결과.
도 5는 (a) 처리 농도별(10nM, 30nM, 50nM)로 처리한 바필로마이신 A1에 대한 RSVF-Exo의 모세포인 HEK293T 세포 내의 유비퀴틴화된 단백질의 양. (b) 바필로마이신 A1 처리 여부에 따라 추출한 RSVF-Exo과 CT26.CL25 세포를 융합 후, CT26.CL25 세포 내의 비접힙-단백질의 어그레섬에 대한 FACS 분석.
도 6은 RSVF-Exo의 소포체(endoplasmic reticulum; ER) 스트레스를 통한 종양 세포의 면역원성 세포 사멸을 나타낸 도이다. (a) RSVF-Exo 처리된 LLC 및 CT26.CL25 암세포 생존율. (b) 엑소좀 처리한 PI 음성인 CT26.CL25 및 LLC 세포에서의 CRT 발현 상대 MFI. (c) 엑소좀 처리한 CT26.CL25 세포로부터 방출되는 HSP70 및 HMGB1의 발현량.
도 7은 (a) 엑소좀 처리된 암세포의 생존율. (b) 엑소좀 처리한 HEK293T, BMDM, BMDC 세포의 생존율 (c) RSVF-Exo와 LLC세포를 fusion시킨 이후 LLC 세포의 생존률 (d) 엑소좀 처리한 PI음성인 CT26.CL25 및 LLC 세포에서의 CRT 발현 퍼센트. (e) 엑소좀 처리한 음성인 CT26.CL25 및 LLC 세포에서의 식작용 발생율.
도 8은 CT26.CL25 모델 마우스에서 RSVF-Exo의 종양 성장 억제 효과를 나타낸 도이다. (a-e) CT26.CL25 종양 보유 마우스에 종양 접종 후 7 일째 및 8 일째에 하루 간격 총 2 회 100 μg의 RSVF-Exo, Con-Exo 또는 PBS를 종양 내 주사하였다(intratumoral injection; i.t.). (a) 21 일 동안의 평균 종양 성장 곡선(n = 10; *** p <0.001; ANOVA with Turkey's post-hoc test.). (b) 21 일째의 종양 중량(n = 10; ** p <0.01; ANOVA with Turkey's post-hoc test.). (c) 림프절 배수로부터 분리된 단일 세포로부터의 gp70 및 β-갈락토스(β-galactose)에 대한 IFN(Interferon)-γ 분비량(n = 3; * p <0.05, ** p <0.01; ANOVA with Turkey's post-hoc test.). (d) CD40 및 CD86의 상대 MFI(n = 3-4; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; ANOVA with Turkey's post-hoc test.). (e) 형광 현미경 이미지(우)로부터 계수한 종양 침윤성 CD8 + T 세포의 수(n = 3; *** p <0.001; ANOVA with Turkey's post-hoc test.)(좌). (f-i) CT26.CL25 종양-보유 마우스에 종양 접종 후 6~8 일째에 하루 간격 총 3 회 100 μg의 RSVF-Exo, Con-Exo 또는 PBS를 주사하고 11 일, 13 일, 15 일 및 17 일째에 항-PD-1 항체 200 μg를 주사하였다. (f) PD1 항체와 병용 투여 후 종양 크기 측정 결과. (g) PD1 항체와 병용 투여 후 마우스의 생존율. (h) 해당 치료를 하였을 때, 암이 완전히 사라지는 종양 완전 관해 마우스에 대해 같은 암종을 재접종하였을 때, 종양 성장 곡선 (n=2)
도 9는 (a) 엑소좀 처리한 종양 보유 마우스의 체중을 나타낸 도이다. (b) 도 8의 f 실험군의 개체별 종양 성장곡선을 나타낸 도이다.
도 10은 CT26.CL25 종양 보유 마우스에서 RSVF-Exo의 생체 분포를 나타낸 도이다. (a) 시아닌 5.5 NHS 에스테르(Cy5.5-NHS)로 표지한 300 μg의 RSVF-Exo, Con-Exo 또는 PBS를 CT26.CL25를 보유한 BALB/c 누드 마우스에 정맥 내 주사하고, 엑소좀의 생체 분포를 특정 시간(5 분, 2 시간, 4 시간, 8 시간, 18 시간, 24 시간)에서 시각화한 결과. 주황색 점선은 종양 위치. (b-c) 주사 24 시간 후, 마우스 유래 폐, 간, 비장 및 종양에서의 Cy5.5-NHS 신호의 양.
도 11은 LLC 종양 보유 마우스에서 RSVF-Exo의 생체 분포를 나타낸 도이다. (a) 시아닌 5.5 NHS 에스테르(Cy5.5-NHS)로 표지한 300 μg의 RSVF-Exo, Con-Exo 또는 PBS를 LLC를 보유한 BALB/c 누드 마우스에 정맥 내 주사하고, 엑소좀의 생체 분포를 특정 시간(5 분, 2 시간, 4 시간, 8 시간, 18 시간, 24 시간)에서 시각화한 결과. 주황색 점선은 종양 위치. (b-c) 주사 24 시간 후, 마우스 유래 폐, 간, 비장 및 종양에서의 Cy5.5-NHS 신호의 양.
도 12는 전신 투여된 RSVF-Exo의 항 종양 효과를 나타낸다. (a-d) CT26.CL25 종양 보유 마우스에 종양 접종 후 6 일째, 7 일째 및 8 일째에 100 μg의 RSVF-Exo, Con-Exo 또는 PBS를 하루 총 3 회 정맥 내 주사 하였다. (a) 21 일 동안의 평균 종양 성장 곡선(n = 8; ** p <0.01; ANOVA with Turkey's post-hoc test.). (b) 21 일째의 종양 중량(n = 8; * p <0.05, ** p <0.01; ANOVA with Turkey's post-hoc test.). (c) 림프절 배수 유래 CD11C + 수지상세포의 CD40 및 CD86의 상대 MFI와 CD45.2+CD3+CD8+ T 세포의 CD44의 상대 MFI(n = 3; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; ANOVA with Turkey's post-hoc test.) 우측 그래프는 CD44 + CD8 + T 세포의 백분율(n = 5-6; ** p <0.01, *** p <0.001; 터키의 사후 테스트를 통한 ANOVA.) (d) 형광 현미경 이미지 및 형광이미지로부터 계수한 종양 침윤성 CD8 + T 세포의 수, CD8 + CD45.2 + 세포의 백분율(n = 3; ** p <0.01, *** p <0.001; ANOVA with Turkey's post-hoc test.). (e-f) CT26.CL25 종양 보유 마우스에 종양 접종 후 6 일째, 7 일째 및 8 일째에 150 μg의 RSVF-Exo, Con-Exo 또는 PBS를 하루 총 3 회 정맥 내 주사하였다. 종양 접종 후 11 일째부터 항-PD-1 항체 200 ㎍를 2 일마다 총 4 회 복강 내 주사(Intraperitoneal injection; i.p.)하였다. (e) 21 일에 비교된 평균 종양 성장 곡선(n = 8; ** p <0.01; two-tailed unpaired student's t-test.). (f) 면역 체크 포인트 봉쇄와의 병용 요법 후 마우스의 생존율.
도 13은 전신 투여된 RSVF-Exo의 항 종양 효과를 나타낸다. (a) 엑소좀 처리한 종양 보유 마우스의 체중. (b) 엑소좀 처리한 종양 보유 마우스 유래 비장에서 수지상세포의 CD40의 상대 MFI. (c) 비장 및 림프절 배수에서의 CD8 + T 세포의 백분율.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1. 호흡기 세포 융합 바이러스 F 단백질(Respiratory syncytial virus F protein, RSVF) 발현 엑소좀(RSVF-Exo) 제조

인간 배아 신장 293T(Human embryonic kidney 293T, HEK293T) 세포를 10 % 소태아 혈청(fetal bovine serum; FBS) 및 1 % 항생제(Antibiotic-Antimycotic, Gibco)가 첨가된 DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium)에서 37 ℃, 5 % CO₂ 조건으로 배양하였다.

또한, 제한효소 SgfI, MluI가 처리된 pCMV6-Entry(PS100001) 벡터(origene)에 RSVF(Respiratory syncytial virus fusion protein)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 2)를 포함하는 플라스미드를 제작하였다.

HEK293T 세포의 합류(confluency)가 90 %에 도달하면, 1 % 글루타맥스(glutamax) 및 1 % 항생제를 함유하는 DMEM으로 배지를 교환하였다. 2 시간 후, 리포펙타민 3000(lipofectamine 3000, Invitrogen)을 사용하여 RSVF를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드로 HEK293T 세포를 형질 감염시켰다. 24 시간 후, 디메틸술폭시드(dimethyl sulfoxide; DMSO)에 용해된 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 유래 바필로마이신 A1(bafilomycin A1; BafA1)을 농도별로(10nM, 30nM, 50nM) 세포에 처리하였다. HEK293T 세포의 상청액은 엑소좀 분리를 위해 형질 감염 후 48 시간 뒤에 수확되었다. 미세소포(microvesicles) 및 세포 잔해를 제거하기 위해, 상청액을 300g에서 10 분 동안, 2000g에서 10 분 동안 및 10,000g에서 30 분 동안 원심 분리하였다. 상청액을 0.22 μm 세공 필터로 여과하고, 다시 150,000 g에서 3 시간 동안 원심 분리하여 엑소좀 펠렛을 제조하였다. 엑소좀 펠렛을 프로테이나제 억제제 칵테일(proteinase inhibitor cocktail; PIC, Roche)을 포함하는 PBS(phosphate-buffered saline)로 재현탁시키고, 4 ℃에서 보존하여, RSVF-Exo를 제조하였다.

대조군으로, 빈 플라스미드로 형질 감염된 HEK293T 세포가 배양되었던 배지의 상청액을 수확하여 대조군 엑소좀(Con-Exo)을 제조하였다.

실시예 2. RSVF-Exo의 특성 확인

실시예 1에서 제조한 RSVF-Exo 중의 전체 단백질의 양을 비신코니닉산(bicinchoninic acid; BCA) 단백질 분석을 사용하여 측정하였다. 엑소좀을 용해시키기 위해, 동일한 양의 엑소좀 단백질을 RIPA(Radioimmunoprecipitation assay) 완충액에 첨가하고, SDS-PAGE(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis) 완충액과 혼합하였다. 겔 전기 영동 후, 밴드를 니트로셀룰로스(nitrocellulose) 막으로 옮겼다. TBST(Tris Buffered Saline)가 첨가된 트윈-20(tween-20)에 용해된 5 % 탈지유(skim milk)로 실온에서 1시간 동안 사전-차단한 후, 1 차 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 인큐베이션했다. RSVF 발현 검출을 위한 엑소좀 마커 및 FLAG(Sigma-Aldrich, 1:500)를 확인하기 위해 Tsg101(Santa Cruz, 1 : 500), Alix(Santa Cruz, 1 : 500) 및 CD81(Santa Cruz, 1 : 500)을 처리하였다. 막을 HRP-(horseradish peroxidase) 접합된 항-마우스(Sigma-Aldrich, 1 : 3000) 또는 항-토끼(Sigma-Aldrich, 1 : 3000) 2 차 항체와 함께 인큐베이션한 다음, 이미징 시스템(ChemiDoc Imaging System, Bio-Rad)을 이용하여 분석하였다.

RSVF-Exo 막 상에 존재하는 RSVF의 양은 유세포 분석법을 사용하여 분석하였다. 알데하이드(Aldehyde)/설페이트 라텍스 비드(sulfate latex bead)를 엑소좀과 혼합하고, PBS로 희석한 다음, 4 ℃에서 밤새 반응시켰다. 엑소좀과 접합된 라텍스 비드를 1M 글리신(glycine) 완충액을 사용하여 30 분 동안 사전-차단하고 0.5 % 소 혈청 알부민으로 세척하여 PBS에 용해시켰다. 비드를 RSVF 항체(Abcam, 1 : 100)와 함께 4 ℃에서 1 시간 동안 반응시킨 다음, 실온에서 1 시간 동안 Alexa Fluor 488-접합된 2차 항체(Jackson ImmunoResearch, 1 : 200) 처리 하였다. 원심 분리를 통해 비 접합 항체를 제거한 후, 비드를 유세포 분석법(BD Biosciences, Accuri C6)을 통해 분석하였다.

RSVF-Exo의 크기는 Zetasizer(Malvern Panalytical, Nano ZS)로 측정하였다. 1 μg의 RSVF-엑소 좀을 500 μl의 PBS에 희석한 다음, 세미-마이크로 큐벳(semi-micro cuvette, ratiolab)에 넣었다. 엑소좀의 크기 분포는 25 ℃에서 고정 각 173 °로 분석하였다.

또한, RSVF-Exo의 구조는 극저온 투과 전자 현미경(cryo-TEM; Tecnai system)을 통해 확인하였다. RSVF-Exo을 구리 그리드로 덮은 얇은 탄소 필름 상에 놓고 비트로봇(Vitrobot, FEI)에 의해 유리화시켰다. 유리화 샘플은 샘플 이미지가 찍힐 때까지 액체 질소에서 유지되었다.

그 결과, 정제된 RSVF-Exo이 막에서 RSVF를 발현하는 것을 확인하였고(도 2a), 직경이 약 100 nm(도 1b)인 원형(도 2a, 도 2b)인 것을 확인하였다.

실시예 3. RSVF-Exo과 암세포의 막 융합

3-1. in vitro(시험관 내)

악성(Malignant) 세포는 RSVF의 주요 수용체인 뉴클레오린을 높은 수준으로 발현하는 바, RSVF-Exo이 시험관 내 조건에서 암세포의 막과 융합될 수 있는지를 확인하기 위해 루이스 폐 암종(Lewis lung carcinoma, LLC) 및 CT26.CL25 결장암세포주에서 RSVF 단백질의 발현을 분석하였다.

LLC 세포는 10 % 소태아 혈청 및 1 % 항생제(Antibiotic-Antimycotic, Gibco, 15240-062)가 첨가된 DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium)에서 37 ℃, 5 % CO₂ 조건으로 배양하였다. CT26.CL25 결장암세포, 골수 유래 대식세포(Bone marrow derived macrophage, BMDM) 및 골수 유래 수지상세포(bone marrow derived dendritic cell, BMDC)는 10 % FBS 및 1 % 항생제가 첨가된 RPMI 1640 배지(Roswell Park Memorial Institute 1640)에서 37 ℃, 5 % CO₂ 조건으로 배양하였다.

상기 BMDM은 C57BL/6 마우스 유래 골수 세포를 1, 2 및 3 일에 20 ng/ml의 M-CSF(PeproTech, 315-02)로 처리한 다음, 4 일 및 6 일에 20 ng/ml의 M-CSF를 포함하는 신선한 배지로 교환하여 분화시켰다. 또한, 상기 BMDC는 C57BL/6 마우스 유래 골수 세포를 200 ng/ml의 Flt3-리간드(Flt3-Ligand, PeproTech, 250-31L) 및 0.1 % β-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol)로 10일 간 처리하여 분화시켰다.

LLC, CT26.CL25, HEK293T, BMDC 및 BMDM 세포막 상에 존재하는 뉴클레오린의 양을 확인하기 위해, 5 x 10⁵ 개의 각 세포를 0.25 % 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 4 ℃에서 1 시간 동안 고정시켰다. 세포를 3 % BSA(Bovine serum albumin)로 사전-차단하고, 이를 PBS에 4 ℃에서 15 분 동안 용해시킨 후, 4 ℃에서 45 분 동안 뉴클레오린 항체(Abcam, 1 : 200)로 처리하였다. DPBS(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline)로 세척한 후, 샘플을 4 ℃에서 30 분 동안 Alexa Fluor 647-접합된 2차 항체(Jackson Immuno Research, 1 : 400)로 처리하였다. 세포를 DPBS로 세척한 다음, 유세포 분석법을 사용하여 세포 표면 상의 뉴클레오린의 양을 측정하였다.

또한, 3.75 x 10⁵ 개의 LLC 또는 CT26.CL25 결장암세포를 25 μg, 50 μg 또는 100 μg의 RSVF-Exo, Con-Exo 또는 PBS로 각각 처리한 다음 37 ℃ 무혈청 배지에서 5 분 (또는 1시간, 4시간) 동안 배양하였다. 원심 분리를 통해 엑소좀을 제거하고, 안정화를 위해 세포를 37 ℃에서 1 시간 동안 혈청 첨가 배지에서 유지시켰다. 배지를 제거한 후, 세포를 4 ℃에서 15 분 동안 3 % BSA로 사전-차단하고, 4 ℃에서 45 분 동안 RSVF 항체(Abcam, 1 : 200)와 함께 배양하였다. 비 접합 항체를 제거하기 위해 DPBS로 세척한 후, Alexa Fluor 647-접합된 2차 항체(1 : 400)를 샘플에 첨가 한 다음, 4 ℃에서 30 분 동안 유지시켰다. 세포를 DPBS로 세척하고, 유세포 분석법을 통해 세포막 상의 RSVF의 양을 측정하였다.

공초점 현미경 분석을 위해 3.75 x 10⁵ 개의 CT26.CL25 세포에 RSVF-Exo를 50 μg 처리하고 Nunc^TM Lab-Tek^TM(Thermo fisher Scientific)에 시딩(seending)한 다음 37 ℃에서 1 시간, 4 시간 또는 16 시간 동안 배양하였다. 이후, CT26.CL25 세포를 4 % 파라포름알데히드로 고정시키고 3 % BSA 용액으로 사전-차단하였다. 이어서, 각 세포의 원형질 막을 1 % BSA 용액에서 밀 배아 아굴티닌(wheat germ agglutinin; WGA, 5 μg ml-1, Alexa FluorTM-633-결합 염료, ThermoFisher)으로 표지하였다. 각 세포 표면의 RSVF 단백질은 RSVF 항체(Abcam, 1 : 200) 및 Alexa Fluor 488-접합된 2차 항체로 표지되었다.

RSVF가 뉴클레오린 의존적으로 세포와 융합되는지 확인 하기 위해, 3.75 x 10⁵개의 세포를 0.25 % 파라포름알데히드로 4 ℃에서 1 시간 동안 고정시켰다. 파라포름알데히드를 제거한 후, 고정된 세포를 뉴클레오린 항체(Santa Cruz, 1 : 100)로 처리하고 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 비 접합된 뉴클레오린 항체를 원심 분리를 통해 제거하였다. 해당 세포를 25 μg 의 RSVF 엑소좀과 5분간 배양하였다. 원심 분리를 통해 비접합된 RSVF 엑소좀을 제거하였다. 안정화를 위해 세포를 37 ℃에서 1 시간 동안 혈청 무첨가 배지에서 유지시켰다. 배지를 제거한 후, 세포를 4 ℃에서 15 분 동안 3 % BSA로 사전-차단하고, 4 ℃에서 45 분 동안 RSVF 항체(Abcam, 1 : 200)와 함께 배양하였다. 비 접합 항체를 제거하기 위해 DPBS로 세척한 후, Alexa Fluor 647-접합된 2차 항체(1 : 400)를 샘플에 첨가 한 다음, 4 ℃에서 30 분 동안 유지시켰다. 세포를 DPBS로 세척하고, 유세포 분석법을 통해 세포막 상의 RSVF의 양을 측정하였다.

그 결과, RSVF가 엑소좀으로부터 뉴클레오린을 고도로 발현하는 LLC 및 CT26.CL25 세포막으로 전달되었음을 보여 주었다(도 1e, 도 3a).

또한, 항-뉴클레오린 항체로의 사전 차단에 의해 막 융합 활성이 감소되었으며(도 1g), 이를 통해 막 융합 활성이 RSVF와 뉴클레오린 사이의 상호 작용에 의존적임을 알 수 있다.

HEK293T, BMDM 및 BMDC를 포함하는, 낮은 수준의 뉴클레오린을 발현하는 비-암세포에서는 엑소좀 매개 RSVF 융합이 거의 관찰되지 않았다(도 1e, 도 3a). 또한, RSVF-Exo는 농도의존적으로 암세포막과 융합하고, 최대 4시간 까지 암세포막과 결합하였다(도 2c-d).

3-2. in vivo(생체 내)

RSVF-Exo가 생체 내에서 암세포와 결합할 수 있는지 확인하기 위해, 1 x 10⁶ 개의 CT26.CL25-mCherry 세포를 8 주령 수컷 BALB/c 누드 마우스의 왼쪽 옆구리에 접종하였다. 평균 종양 부피가 150 mm³에 도달하면, 종양 접종 후 10 일째 및 11일째에 100 μg의 RSVF-Exo, Con-Exo 또는 PBS를 하루 간격 총 2 회 종양 내 주사 하였다. 마지막 주사 시점으로부터 3 시간 후, 마우스를 희생시키고 종양을 추출하였다. 키트(Dead Cell Removal Kit, Miltenyi Biotec)를 이용하여 아폽토시스된 세포(apoptotic cell)를 제거한 후, CD45, CD31 및 CD90.2 마이크로비드(MicroBead, Miltenyi Biotec)를 사용하여 세포를 분류하였다. 종양, CD45 +, CD31 + 및 CD90.2 + 세포에서의 RSVF의 양을 유세포 분석법을 사용하여 평가하였다.

그 결과, 생체 내에서 RSVF-Exo으로 처리된 마우스로부터 분리된 골수, 내피 및 섬유아세포 세포가 아닌 종양 세포에서 RSVF가 검출되었다(도 1f, 도 3b).

상기 결과는 RSVF-Exo이 시험관 내 및 생체 내에서 높은 수준의 뉴클레오린을 발현하는 암세포와 우선적으로 융합한다는 것을 나타낸다.

실시예 4. RSVF-Exo의 암세포로의 aggresome 전달 확인

실시예 1에서 제조한 RSVF-Exo 내의 유비퀴틴화 된 단백질 양을 측정하기 위해 유세포 분석법을 사용하였다. 알데하이드(Aldehyde)/설페이트 라텍스 비드(sulfate latex bead)를 엑소좀과 혼합하고, PBS로 희석한 다음, 4 ℃에서 밤새 반응시켰다. 엑소좀과 접합된 라텍스 비드를 1M 글리신(glycine) 완충액을 사용하여 30 분 동안 사전-차단하고 0.5 % 소 혈청 알부민으로 세척하여 PBS에 용해시켰다. 해당 엑소좀을 Proteostat^®Aggresome detection kit의 Permeablizing solution을 사용하여 4 ℃에서 30 분 반응시켰다. 이후, DPBS 용액으로 세척한 후 3 % 소 혈청 알부민용액을 사용하여 사전-차단하였다. 이후 Proteostat^®Aggresome detection kit의 aggresome detection reagent 를 사용하여 상온에서 30 분 반응시켰다. 마지막으로 DPBS 용액으로 세척한 엑소좀을 유세포 분석법으로 분석하였다(도 4a).

실시예 1에서 제조한 RSVF-Exo의 내부에 존재하는 aggresome의 암세포로의 축적을 확인하기 위해 유세포 분석법을 사용하였다. 5 x 10⁵ 개의 CT26.CL25, LLC 각 종양세포와 바필로마이신을 처리하고 수득한 RSVF-Exo 100 μg 및 바필로마이신을 처리하지 않고 수득한 RSVF-Exo 140 μg을 1 % 항생제(Antibiotic-Antimycotic, Gibco, 15240-062)가 첨가된 DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium)에서 37 ℃, 2시간동안 반응시켰다. 이후 세포를 3000 rpm, 3분동안 원심분리 후 펠렛을 DPBS 용액으로 세척한 후, 4 % 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 상온에서 7분 동안 고정시켰다. 세포를 3 % BSA(Bovine serum albumin)로 상온에서 15분 간 사전-차단하였다. 이후 Proteostat^®Aggresome detection kit의 aggresome detection reagent를 사용하여 상온에서 30 분 반응시켰다. 마지막으로 DPBS 용액으로 세척 후 유세포 분석법으로 분석하였다(도 4b, 도 5b).

실시예 1에서 제조한 RSVF-Exo의 내부에 존재하는 aggresome의 암세포로의 축적을 확인하기 위해 공초점현미경을 사용하였다. 5 x 10⁵ 개의 CT26.CL25 세포를 Nunc^TM Lab-Tek^TM(Thermo fisher Scientific)에 시딩한 뒤 37 ℃에서 밤새 배양한 후, 다음날 1 % 항생제(Antibiotic-Antimycotic, Gibco, 15240-062)가 첨가된 DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium)로 교체하였다. 이후 바필로마이신을 처리하고 수득한 RSVF-Exo 100 μg 및 바필로마이신을 처리하지 않고 수득한 RSVF-Exo 140 μg을 처리하고 37 ℃, 2시간동안 반응시켰다. DPBS로 세척한 뒤, 4 % 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 상온에서 7분 동안 고정시켰다. 이후 DPBS 용액을 사용하여 세척해준 후, Proteostat^®Aggresome detection kit의 Permeablizing solution을 사용하여 4 ℃에서 30 분 반응시켰다. 이어서 세포를 1 % BSA(Bovine serum albumin)로 상온에서 15분 간 사전-차단하고, DPBS 용액으로 세척한 뒤 Proteostat^®Aggresome detection kit의 aggresome detection reagent를 사용하여 상온에서 30 분 반응시켰다. 이후 공초점 현미경을 통해 암세포 내부에 존재하는 aggresome을 촬영하였다(도 4c).

RSVF-Exo를 추출한 모세포에 축적되어 있는 aggresome의 양은 바필로마이신 A1을 농도별(10nm, 30nm, 50nm)로 처리함에 따라 증가하였다(도 5a).

실시예 5. RSVF-Exo의 암세포 사멸 유도 효과

4 x 10⁵ 개의 CT26.CL25 세포를 6-웰 플레이트에서 밤새 37 ℃로 배양하였다. 배지를 100 μg의 RSVF-Exo, Con-Exo 또는 PBS를 포함하는 무혈청 배지로 교체하고 37 ℃에서 24 시간 동안 유지시켰다. 다음날 RIPA 완충액을 사용하여 세포를 용해시키고 웨스턴 블롯을 통해 ER 스트레스 마커의 양을 분석하였다. CHOP(C/EBP homologus protein, Santa Cruz, 1 : 200), ATF4(activating transcription factor 4, Santa Cruz, 1 : 100), eIF2α(eukaryotic translation initiation factor 2 alpha subunit, CST, 1 : 1000), Phospho-eIF2α (CST, 1 : 1000) 및 GAPDH(Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase, R & D Systems, 1 : 2000) 항체를 막에 처리하고 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 비 접합 항체를 TBST로 세척 한 다음, 샘플을 실온에서 1 시간 동안 HRP-접합된 제 2 항체로 처리하였다.

그 결과, ER 스트레스 마커인 ATF4 및 CHOP가 RSVF-Exo 처리 군에서 상향 조절되었다(도 4e).

RSVF-Exo가 세포 사멸을 유도할 수 있는지 조사하기 위해, 2 x 10⁴ 개의 CT26.CL25 및 LLC 세포를 RSVF-Exo, Con-Exo 또는 PBS로 처리하고, 혈청이 없는 배지에서 24 시간 동안 37 ℃로 배양하였다. 2 x 10⁴ 개의 LLC 세포 혹은 CT26.CL25 세포와 RSVF-Exo 200 μg을 37 ℃에서 5분간 반응 시킨 뒤, 3000 rpm에서 3분간 원심분리를 통해 암세포만 수득하였다. 해당 세포를 96 웰 플레이트에 시딩하고 혈청이 없는 배지에서 24 시간 동안 37 ℃로 배양하였다. 그 후, CCK(Cell Counting Kit)-8을 사용하여 세포의 생존력을 측정하였다. 450nm에서의 흡광도는 마이크로 플레이트 리더(Molecular Devices, SpectraMAX 340)를 사용하여 측정되었다.

그 결과, RSVF-Exo 처리된 LLC 및 CT26.CL25 암세포는 Con-Exo 처리된 대조군과 비교하여 농도 의존적으로 더 낮은 세포 생존력을 나타내었다. 그러나, RSVF-Exo는 HEK293T, BMDM 및 BMDC와 같은 정상적인 세포에서는 세포 사멸을 유도하지 않았다(도 6a, 도 7b).

ER 스트레스가 암세포에 대해 면역원성 세포 사멸(immunogenic cell death; ICD)을 유도하는지 확인하기 위해, CT26.CL25 세포를 엑소좀으로 처리한 후 칼레티쿨린(calreticulin; CRT), HSP70(heat shock protein 70) 및 HMGB1(high mobility group box 1)와 같은 ICD 마커의 양을 분석하였다. RSVF-Exo가 손상 관련 분자 패턴(Damage-associated molecular pattern; DAMP) 신호를 유도할 수 있는지 확인하기 위해, 4 x 10⁵ 개의 CT26.CL25 및 LLC 세포를 6-웰 플레이트에 시딩하고 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그 후, 세포를 RSVF-Exo, Con-Exo 또는 PBS로 처리한 다음 혈청 결핍 배지에서 유지시켰다. 처리 24 시간 후, 칼레티쿨린의 표면 발현을 검출하기 위해 세포를 분리하였다. 상청액을 수집하고 농축하여 HMGB1 및 HSP70을 확인하였다.

구체적으로, CRT 분석을 위해 RSVF-Exo 처리된 5 x 10⁵ 개의 CT26.CL25 세포를 4 ℃에서 5 분 동안 0.25 % 파라포름알데히드를 사용하여 고정한 다음, 3 % BSA로 사전-차단하고, 이를 PBS에서 4 ℃에서 15 분 동안 희석시켰다. 샘플을 4 ℃에서 45 분 동안 칼레티쿨린 항체(Abcam, 1 : 250)로 처리하였다. 비 접합된 항체를 제거한 후, Alexa Fluor 488-접합된 제 2 항체(1 : 200)를 세포로 처리하고 4 ℃에서 30 분 동안 유지시켰다. 샘플을 DPBS를 사용하여 세척하고, 프로피디움 요오다이드(propidium iodide; PI, Sigma-Aldrich, 1 : 200)로 4 ℃에서 15 분 동안 염색하여 세포 생존율을 확인하였다. 세포막상의 칼레티쿨린의 양을 유세포 분석법을 사용하여 분석하였다.

HSP70 및 HMGB1에 대한 웨스턴 블롯 분석을 위해, HSP70 항체(Abcam, 1 : 1000) 및 HMGB1 항체(Abcam, 1 : 1000)를 막에 처리하고 4 ℃에서 밤새 유지시켰다. 샘플을 TBST로 세척하고, HRP-접합된 항-토끼 2 차 항체와 함께 반응시킨 후 분석하였다.

그 결과, RSVF-Exo는 세포 표면에서 CRT 발현을 증가시키고 CT26.CL25 세포로부터 방출되는 HSP70 및 HMGB1을 증가시켰다(도 6b-c, 도 7d).

또한, BMDM을 1mM CellTracker^TM Green CMFDA 염료(Thermo fisher Scientific)로 염색하였다. 암세포를 엑소좀으로 처리하고 6-웰 플레이트에 시딩한 후 37 ℃에서 24 시간 동안 항온 처리하여 면역원성 세포 사멸(immunogenic cell death; ICD)을 유도 하였다. 엑소좀 처리된 암세포를 1 mM의 pHrodo^TM 레드, 숙신이미딜 에스테르(succinimidyl ester, Thermo fisher scientific)로 염색하였다. 식균 작용 분석을 위해, 2 x 10⁵ 개의 BMDM 및 3.75 x 10⁵ 개의 암세포를 37 ℃에서 2 시간 동안 공동 배양하였다. pH10 PBS로 세척한 후, 대식세포에 의한 암세포의 탐식작용(engulfment)을 형광 현미경(Nikon Eclipse Ti, Nikon)으로 시각화하고 ImageJ를 사용하여 정량화하였다.

그 결과, RSVF-Exo 처리된 LLC 및 CT26.CL25 암세포는 Con-Exo 처리된 대조군과 비교하여 식작용(Phagocytosis) 발생율이 현저히 높았다(도 7e).

실시예 6. RSVF-Exo의 종양 퇴행 효과

RSVF-Exo의 항 종양 효과를 조사하기 위해, 두 가지의 CT26.CL25 종양-보유 마우스모델을 이용하여 생체 내 RSVF-Exo의 종양 억제 효과를 확인하였다.

구체적으로, 8 주령 수컷 BALB/c 마우스에 5 x 10⁵ 개의 CT26.CL25 세포를 접종 후 7일째 및 8일째에 하루 간격 총 2 회 100 μg의 RSVF-Exo, Con-Exo 또는 PBS를 종양 내 주사(intratumoral injection; i.t.)하였다.

또한 RSVF-Exo로 유도된, 면역 체크 포인트 차단 요법의 효능을 증가시키는 CD8+ T 세포 면역성을 확인하기 위해 CT26.CL25 종양-보유 BALB/c 마우스에 대해 RSVF-Exo와 항-PD-1 차단의 병용 요법을 수행하였다.

구체적으로, 항-PD-1 항체와의 병용 요법의 경우, CT26.CL25 종양-보유 마우스에 종양 접종 후 6~8 일째에 하루 간격 총 3 회 100 μg의 RSVF-Exo, Con-Exo 또는 PBS를 주사하고 11 일, 13 일, 15 일 및 17 일째에 항-PD-1 항체 200 μg를 주사하였다.

그 결과, RSVF-Exo 처리시 종양 크기에 대해 약 70 % 회복 효과가 확인되었으며(도 8a-b), 체중에 유의한 차이는 없었다(도 9a).

바이러스 항원인 RSVF는 톨-유사 수용체 4(toll-like receptor 4; TLR4)와 상호 작용하고 하류 신호 전달 경로를 활성화시키며, 이는 T 세포 프라이밍(priming)에 필수적인 수지상세포(dendritic cell; DC)의 활성화로 이어지는 것으로 알려져 있는 바, RSVF-Exo가 종양-특이적 면역을 유발할 수 있는지 여부를 조사하였다.

구체적으로, IFN(Interferon)-γ 분석을 위해 CT26.CL25 종양-보유 마우스 유래 종양-배수 림프절(Tumor-draining lymph node; TDLN)을 주사기 플런저(syringe plunger)를 사용하여 단일 세포 현탁액으로 제조하였다. 단일 세포 현탁액에서 적혈구(red blood cell; RBC)를 RBC 용해 완충제(Biolegend)를 사용하여 용해시킨 후, 5 x 10⁵ 개의 TDLN 세포를 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 5 ㎍/ml의 gp70 및 β-갈락토스(β-galactose)를 각각의 웰에 처리하고 37 ℃에서 24 시간 동안 반응시켰다. 세포 상청액 중 IFN-γ의 양을 마우스 IFN-γ 퀀티카인(Quantikine) ELISA 키트(R & D Systems)를 사용하여 측정하였다.

또한, TDLN의 단일 세포 현탁액을 원심 분리하여 펠렛화하였다. TDLN의 단일 세포를 Fc 차단을 위해 정제된 랫트 항-마우스 CD16/CD32 항체(BD Biosciences, 1 : 100)를 포함하는 PBS로 재현탁시켰다. TDLN의 단일 세포 현탁액은 APC 항-마우스 CD11c(Biolegend, 1 : 80), PE 항-마우스 CD40 (Biolegend, 1:40) 및 PE 항-마우스 CD86(Biolegend, 1 : 40)을 사용하는 유세포 분석에 의해 조사되었다.

그 결과, RSVF-Exo 처리된 마우스로부터 분리된 TDLN은 대조군에 비해 종양-특이적 펩티드인 gp70 및 β-갈락토스에 대해 분비되는 IFN-γ의 양이 증가되었다(도 8c).

또한, CD11c + 세포에서 수지상세포 성숙 마커인 CD40 및 CD86의 발현 수준은 RSVF-Exo 처리된 그룹에서 증가되었다(도 8d).

한편, CT26.CL25 종양-보유 BALB/c 마우스 유래 종양 조직에서 CD8 + T 세포의 침윤을 측정하기 위해, 수확된 종양은 종양 해리 키트(Tumor Dissociation Kit, Miltenyi Biotec, 130-096-730) 및 분해 장치(gentle MACS Octo Dissociator with Heaters, Miltenyi Biotec, 130-096-427)를 사용하여 단일 세포 현탁액으로 제조하였다. 단일 세포 현탁액 중의 RBC를 용해시키고, 사멸 세포를 사멸 세포 제거 키트를 통해 제거 하였다. 현탁액을 APC 항-CD3(Biolegend, 1:40), PerCP 항 -CD45.2(Biolegend, 1:80) 및 FITC 항-CD8α(Biolegend, 1:50) 항체로 처리한 후 CD8 + T 세포의 양을 측정하기 위해 유세포 분석하였다. 냉동된 종양 절편을 PBS로 세척하고 CD8α 항체(BD Pharmingen, 1 : 200)로 처리하였다. PBS로 세척한 후, 샘플을 Alexa Fluor 488-접합된 제 2 항체(1 : 400)로 염색하고 면역 형광 분석을 수행하였다. CD8 + T 세포의 수는 공초점 현미경을 이용하여 계수하였다.

그 결과, RSVF-Exo 처리군의 종양 조직에서 CD8 + T 세포의 수가 증가하였다(도 8e).

실시예 7. RSVF-Exo의 종양 부위 축적 효과

RSVF-Exo가 뉴클레오린 의존적으로, 선택적으로 암세포와 융합할 수 있음을 확인한 바, 정맥 주사된 RSVF-Exo가 의도하지 않은 장기가 아닌 종양 부위에만 축적되는 종양-표적화 능력을 갖는지 확인하였다.

구체적으로, RSVF-Exo을 시아닌 5.5 NHS 에스테르(Cy5.5-NHS)로 표지하여 엑소좀의 생체 분포를 측정하였다. 300 μg의 RSVF-Exo 및 Con-Exo를 Cy5.5-NHS 3 μg과 혼합하고 4 ℃에서 밤새 반응시켰다. 비 접합된 Cy5.5-NHS를 제거하기 위해 표지된 엑소좀을 1 시간 동안 원심 분리하고, 엑소좀 펠렛을 PBS로 재현탁시켰다. 표지된 엑소좀을 마우스에 주사하기 전에, 샘플 사이의 형광 강도를 맞추기 위해 Cy5.5-NHS 접합된 엑소좀을 마이크로 플레이트 리더를 통해 분석하였다.

8 주령 수컷 BALB/c 누드 마우스에 5 x 10⁵ 개의 CT26.CL25 또는 1 x 10⁷ 개의 LLC 세포를 좌측 측면에 접종하였다. 평균 종양 부피가 150 mm³에 도달하였을 때 300 μg의 Cy5.5-표지된 엑소좀 또는 PBS를 정맥 내 경로를 통해 종양-보유 마우스에 주사하였다. 엑소좀 주사 후 5 분, 2 시간, 4 시간, 8 시간, 18 시간 및 24 시간에 엑소좀의 생체 분포를 IVIS 스펙트럼(Caliper Life Sciences, IVIS® Lumina Series III)을 통해 시각화하였다. 엑소좀 주사 후 24 시간에 마우스를 희생시키고 폐, 간, 비장 및 종양을 추출하여 생체 외 이미지를 수득하였다.

그 결과, 시각화된 전신 이미지는 RSVF-Exo가 Con-Exo보다 종양 부위에 더 많이 축적되어 있음을 나타내었다(도 10a 및 c). 또한, RSVF-Exo는 Con-Exo에 비해 종양 부위를 표적화하였으며 폐, 간 및 비장과 같은 주요 기관에서는 Cy5.5-NHS 신호의 양에 유의한 차이가 없었다(도 10b).

상기 결과는 LLC 모델에서도 동일하게 확인되었다(도 11a-c).

실시예 8. RSVF-Exo의 정맥 내 주사에 따른 종양 퇴행 효과

RSVF-Exo이 정맥 주사 되었을 때 항 종양 면역을 통해 생체 내에서 종양 성장을 억제할 수 있는지를 분석하였다.

구체적으로, CT26.CL25 종양-보유 BALB/c 마우스에 1 x 10⁶ 개의 CT26.CL25 세포 접종 후 6 일째에 하루 간격 총 3 회 100 μg의 RSVF-Exo, Con-Exo 또는 PBS를 정맥 내 주사하였다.

CT26.CL25 종양-보유 마우스로부터 추출된 비장 및 TDLN을 단일 세포 현탁액으로 제조하였다. 단일 세포 현탁액 중의 RBC를 RBC 용해 완충제를 사용하여 용해시켰다. 원심 분리를 통해 RBC 용해 완충제를 제거한 후, 펠렛을 정제된 쥐 항-마우스 CD16/CD32 항체 (1 : 100)를 포함하는 PBS로 재현탁시켰다. TDLN 및 비장에서 CD8 + T 세포 활성화를 평가하기 위해, TDLN과 비장의 단일 세포 현탁액을 APC 항-CD3 (1:40), PerCP 항-CD45.2 (1:80) 및 FITC 항-CD8α (1:50) 항체로 처리하였다. 또한, PE 항-마우스/인간 CD44 항체 (Biolegend, 1:80)를 TDLN 샘플에 첨가하고, PE 항-마우스 CD154 항체 (Biolegend, 1:80)를 비장 샘플에 처리하였다.

그 결과, RSVF-Exo 처리된 그룹은 대조군보다 종양 성장을 더 억제하였으며, 그룹 간 체중 차이는 없었다(도 12a, 도 13a).

TDLN에서 수지상세포 성숙 마커인 CD40 및 CD86이 RSVF-Exo 처리된 그룹에서 상향 조절되었다(도 12c).

결과적으로, RSVF-Exo 처리는 TDLN에서 CD8 + T 세포의 빈도와 비장에서 CD8 + T 세포상의 활성화 마커인 CD40 리간드(CD40 ligand; CD40L)를 증가시켰다(도 13b-c).

또한, RSVF-Exo가 CD8 + T 세포 기억을 촉진하는지 여부를 결정하기 위해 CD8 + T 세포에서 CD44의 발현 및 빈도를 평가한 결과, RSVF-Exo가 TDLN에서 항원-경험된 CD44 발현 CD8 + T 세포의 비율을 효과적으로 증가시켰다(도 12c). 또한, 종양 침윤 CD8 + T 세포의 양은 RSVF-Exo에 의해 현저히 증가되었다(도 12c).

실시예 9. RSVF-Exo의 병용 투여에 따른 종양 퇴행 효과

RSVF-Exo로 유도된, 면역 체크 포인트 차단 요법의 효능을 증가시키는 CD8 + T 세포 면역성을 확인하기 위해 CT26.CL25 종양-보유 BALB/c 마우스에 대해 RSVF-Exo와 항-PD-1 차단의 병용 요법을 수행하였다.

구체적으로, 8주령 수컷 Balb/c 마우스에 1x10⁶ 개의 CT26.CL25 세포를 접종 후, 7일째, 8일째 및 9일째에 하루 간격 총 3번 100 ug의 RSVF-Exo, Con-Exo 또는 PBS를 주사하였다.

항-PD-1 항체와의 병용 요법의 경우, 상기 CT26.CL25 종양-보유 마우스에 종양 접종 후 6~8 일째에 하루 간격 총 3 회 100 μg의 RSVF-Exo, Con-Exo 또는 PBS를 종양 내 주사하고 11 일, 13 일, 15 일 및 17 일째에 항-PD-1 항체 200 μg를 주사하였다. 또는, 상기 CT26.CL25 종양-보유 마우스에 종양 접종 후 6~8 일째에 하루 간격 총 3 회 150 μg의 RSVF-Exo, Con-Exo 또는 PBS를 정맥 내 주사하고 11 일, 13 일, 15 일 및 17 일째에 항-PD-1 항체 200 μg를 총 4 회 복강 내 주사(Intraperitoneal injection; i.p.)하였다.

그 결과, 항-PD-1 항체 단일 요법 그룹 및 Con-Exo 또는 PBS를 투여한 대조군은 종양 억제 효과가 없었다. 이와 대조적으로, RSVF-Exo와 항-PD-1 항체의 병용 요법 그룹은 종양 억제에 상승 효과를 나타내었으며 마우스의 생존율을 향상시켰다(도 8f-i, 도 12e-f).

상기 실시예의 결과와 같이, RSVF-Exo는 암세포 특이적으로 막에 융합하여 암세포를 사멸시키며, 종양 특이적으로 축적되어 종양 성장을 억제시키는 바, 암의 예방 또는 치료 용도로 제공할 수 있다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Exosomes expressing respiratory syncytial virus F protein and uses thereof <130> KPA200585-KR <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 574 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> RSVF ORF <400> 1 Met Glu Leu Leu Ile His Arg Leu Ser Ala Ile Phe Leu Thr Leu Ala 1 5 10 15 Ile Asn Ala Leu Tyr Leu Thr Ser Ser Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe 20 25 30 Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Arg Gly Tyr Phe Ser Ala Leu 35 40 45 Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile 50 55 60 Lys Glu Thr Lys Cys Asn Gly Thr Asp Thr Lys Val Lys Leu Ile Lys 65 70 75 80 Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu 85 90 95 Met Gln Asn Thr Pro Ala Ala Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Ala Pro 100 105 110 Gln Tyr Met Asn Tyr Thr Ile Asn Thr Thr Lys Asn Leu Asn Val Ser 115 120 125 Ile Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val 130 135 140 Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Ile Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu 145 150 155 160 Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Asn Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys 165 170 175 Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val 180 185 190 Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asn Asn Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn 195 200 205 Gln Gln Ser Cys Arg Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln 210 215 220 Gln Lys Asn Ser Arg Leu Leu Glu Ile Asn Arg Glu Phe Ser Val Asn 225 230 235 240 Ala Gly Val Thr Thr Pro Leu Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu 245 250 255 Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys 260 265 270 Leu Met Ser Ser Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile 275 280 285 Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro 290 295 300 Ile Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro 305 310 315 320 Leu Cys Thr Thr Asn Ile Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg 325 330 335 Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe 340 345 350 Pro Gln Ala Asp Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp 355 360 365 Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Ser Leu Cys Asn Thr 370 375 380 Asp Ile Phe Asn Ser Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr 385 390 395 400 Asp Ile Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys 405 410 415 Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile 420 425 430 Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp 435 440 445 Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Leu Glu Gly 450 455 460 Lys Asn Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Tyr Tyr Asp Pro 465 470 475 480 Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn 485 490 495 Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Arg Ser Asp Glu Leu 500 505 510 Leu His Asn Val Asn Thr Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr 515 520 525 Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Val Leu Leu Ser Leu Ile Ala Ile 530 535 540 Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Lys Asn Thr Pro Val Thr Leu Ser 545 550 555 560 Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Lys 565 570 <210> 2 <211> 1722 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> RSVF ORF <400> 2 atggagctgc ttattcacag gcttagcgct atttttttga ccttggccat taacgccttg 60 tatctgacat cctcacagaa tattacagaa gaattttacc agtcaacctg ctccgcggtt 120 agtagagggt atttctctgc tctccggact ggctggtata catcagtcat cacgattgag 180 ttgtctaata tcaaggagac aaaatgcaat ggcacagaca ccaaagtgaa actcatcaag 240 caggagttgg acaagtacaa aaatgctgtg acggaacttc aactgcttat gcagaataca 300 cccgcggcaa acaatcgagc aaggagggag gctcctcagt acatgaatta tacaattaat 360 acaaccaaga accttaatgt ttcaatctca aaaaaaagaa aaaggagatt tctcgggttc 420 ctgttgggcg tgggctcagc cattgcgagc gggattgctg tgtccaaggt tctccacctg 480 gagggagaag tgaataagat taagaacgcg ctcctgagta ctaacaaggc cgtcgtttct 540 ctcagcaatg gggtgtcagt gctgacgagt aaagttctgg acctgaaaaa ctatatcaac 600 aatcagctgc tgcccatcgt caaccagcag agctgccgca ttagcaacat tgagaccgta 660 atcgagttcc aacagaagaa cagccggctc ctggagatca atcgagagtt ctccgttaat 720 gctggtgtta ctacgcccct tagcacttac atgttgacaa atagcgagct cctctccctg 780 ataaacgaca tgccgattac taacgatcag 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aaggccaaga atacaccggt gactctctct 1680 aaggaccaac tgagtggaat caataacatt gcattctcta ag 1722

Claims

호흡기 세포 융합 바이러스 F 단백질(Respiratory syncytial virus F protein, RSVF)을 발현하는 엑소좀.
제1항에 있어서, 상기 엑소좀은 파고좀-리소좀 융합 억제제(phagosome-lysosome fusion inhibitor) 처리에 의해 파고좀-리소좀의 융합이 억제되어 엑소좀 내 비접힘-단백질(unfolded protein)이 축적된 것인, 엑소좀.
제2항에 있어서, 상기 파고좀-리소좀 융합 억제제에 의한 파고좀-리소좀 융합 억제는 액포형 H+ ATP 가수분해(vacuolar type H+ ATPase) 촉진, 프로테아좀(Proteasome) 기능 억제, 오토파고솜(Autophagosome) 형성 억제, 및 디아세틸라제(Deacetylase) 억제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나로부터 유발되는 것인, 엑소좀.
제1항에 있어서, 상기 엑소좀은 암세포 특이적으로 막에 융합하는 것인, 엑소좀.
제1항에 있어서, 상기 엑소좀은 면역원성 세포 사멸(immunogenic cell death)을 통해 암세포를 사멸시키는 것인, 엑소좀.
제1항에 있어서, 상기 엑소좀은 종양 특이적으로 축적되어 종양 성장을 억제시키는 것인, 엑소좀.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제7항에 있어서, 상기 암은 식도암, 위암, 대장암, 직장암, 구강암, 인두암, 후두암, 폐암, 결장암, 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 전립선암, 고환암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 골암, 결합 조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨(Hodgkin) 질환, 림프종 및 다발성 골수종 혈액암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 약학적 조성물.
제7항의 약학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 암의 예방용 백신 조성물.
호흡기 세포 융합 바이러스 F 단백질을 발현하는 엑소좀을 포함하는 제1조성물; 및 항암제를 유효성분으로 함유하는 제2조성물;을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 키트.
제11항에 있어서, 제1조성물 및 제2조성물의 투여 경로 및 빈도는 각각 독립적인 것인, 키트.
i) 호흡기 세포 융합 바이러스 F 단백질(Respiratory syncytial virus F protein, RSVF)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드로 세포를 형질 감염시키는 단계;
ii) i) 단계의 세포에 약물을 처리하는 단계; 및
iii) ii) 단계의 세포의 상청액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계;를 포함하는, 호흡기 세포 융합 바이러스 F 단백질을 발현하는 엑소좀의 제조방법.
제13항에 있어서, 상기 약물은 파고좀-리소좀 융합 억제제(phagosome-lysosome fusion inhibitor), 프로테아좀(proteasome) 기능 억제제, 및 오토파고좀(Autophagosome) 기능 억제제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 방법.
제14항에 있어서, 상기 파고좀-리소좀 융합 억제제는 바필로마이신 A1(bafilomycin A1), 클로로퀸(chloroquine), 하이드록시클로로퀸(hydroxychloroquine), 퀴나크린(quinacrine), 모넨신(Monensin), E64d, 및 펩스타틴 A(pepstatin A)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 방법.
제14항에 있어서, 상기 프로테아좀 기능 억제제는 보르테조밉(bortezomib) 또는 카르필조밉(carfilzomib) 중 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 방법.
제14항에 있어서, 상기 오토파고좀 기능 억제제는 베르테포르핀(verteporfin) 또는 빈카 알칼로이드(vinca alkaloids) 중 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 방법.