CN114404662B - 一种可控il-4缓释聚乳酸多孔微球载体材料及其制备方法和应用 - Google Patents

一种可控il-4缓释聚乳酸多孔微球载体材料及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可控IL‑4缓释聚乳酸多孔微球载体材料及其制备方法和应用。本发明通过微流控技术构建PLLA多孔微球，然后在微球表面引入氨基，在负载IL‑4的脂质体表面引入活性酯，通过共价酰胺键接枝，成功构建IL‑4/Ls/PLLA微球。本发明针对现有技术缺陷，以含脂质体的聚乳酸材料为IL‑4的释放载体，仅使用化学键接枝，使材料具有主动调控免疫反应的活性，进而实现材料结构与活性组分协同促成骨功效的生物支架；设计方法简单易行，需要的设备简单。可获得平均孔径约为11.4±5.0μm，粒径为369.0±64.4μm，IL‑4缓释浓度和长效性满足临床使用，因此具有很强的产业化前景。

Description

一种可控IL-4缓释聚乳酸多孔微球载体材料及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及一种可控IL-4缓释聚乳酸多孔微球载体材料及其制备方法和应用，属于医用材料技术领域。
背景技术
种植体周围炎征是导致种植体松动失败的主要原因，发病率在28-56％。种植体周围炎治疗的最终目标是终止炎症的进展和使暴露的植体表面再次发生骨结合。目前，常用的手术方式是骨移植术或引导骨再生技术(GBR技术)，这两种术式能有效地填补骨缺损，增加种植体周围新生骨量和再次骨结合率，从而阻止种植体周围炎对骨组织的继续损害使种植体的稳固性得到提高。然而，GBR技术需要用到大量的骨粉和骨膜，有研究认为，单纯使用骨粉治疗种植体周围炎时，种植体周围骨整合效果欠佳，并且骨粉骨膜的市场价格昂贵，因此，研发新型支架材料并结合自身机体促进骨组织再生对临床种植体周围炎导致的骨缺损具有重要意义。
骨组织工程技术是骨缺损治疗的最有效方式，它提供了一种供细胞黏附和保持其功能的支架。然而，当支架植入体内时，支架、细胞与宿主间的免疫排斥极大阻碍了临床应用转化。当材料植入体内时，其“表面的特异结构”及其”释放的活性组分”分别为激活生物学响应和成骨提供了相关的物理和化学信号，进而引发一系列的特异性生物学响应。作为骨替代品的生物材料一直被认为是可以触发宿主免疫反应的异物。传统的设计原则一直旨在通过制造惰性生物材料来最大限度地减少免疫反应。然而，随着骨免疫学及骨免疫微环境的提出，越来越多的研究证实了免疫反应在骨再生作用中的重要地位。它激发了生物材料从“免疫逃避”到“重新编程”的转变。骨免疫调节策略旨在使生物材料能够调节局部免疫环境，使其免于促炎，从而有利于愈合和再生。因此，材料自身物理结构及具有主动调节免疫的分子分别为激活巨噬细胞重编程和成骨提供了“物理信号”和“分子信号”。通过将“物理信号”与“分子信号”结合，有望设计并制备出具有主动调控免疫反应，进而实现材料结构与活性组分协同促成骨功效的生物支架。
因此，基于生物支架联合主动免疫调节功能是材料发展的新方向。巨噬细胞对骨愈合有实质性和长期性的贡献，是免疫调节骨再生的重要治疗靶标。不同功能的巨噬细胞对成骨作用有不同的影响。较早出现的巨噬细胞为促炎型的M1巨噬细胞，可以分泌炎性细胞因子进而抑制骨形成。而在较晚时间出现的巨噬细胞主要为抗炎型的M2巨噬细胞，通过分泌成骨细胞因子促进血管生成和诱导骨形成。巨噬细胞可以实现细胞由促炎型到抗炎型功能表型的转变。巨噬细胞在M1和M2之间转化，使其变得高度敏感并适应其环境。但目前研究中发挥作用的因子不能长期有效的释放，生物利用度差，持续作用时间短，阻碍了M2型巨噬细胞的应用。因此，构建可维持长期稳定释放巨噬细胞M2诱导因子的载体是首要解决的问题。
白细胞介素4(IL-4)是M2型巨噬细胞的经典诱导剂。将IL-4负载到支架材料上极化巨噬细胞为M2型，可以抑制炎症反应，促进成骨分化。同时，IL-4对募集到支架周围的成骨细胞具有促成骨作。但IL-4作为细胞因子，半衰期短，直接负载到材料支架上无法保持活性，需要合适的载体对其包裹。脂质体因制作方法简单，含有与细胞膜相似的磷脂双分子层，一直作为药物缓释的载体。脂质体可以保护药物、提高药效、使药物具有靶向性。因此，使用脂质体作为IL-4载体，可达到长效缓释的目的，在成骨免疫微环境中提供了“分子信号”。IL-4与巨噬细胞表面IL-4Rα/γ受体结合，激活下游信号通路，使M1型巨噬细胞极化为M2型。但直接将包裹了IL-4的脂质体注射到骨缺损处，不能在骨缺损中起到支撑空间和承重的作用，并且不能长期滞留。因此，亟需一种生物支架可以提供一种可能的脂质体的应用方法在长期免疫重编程中发挥作用。用于修复口腔骨缺损的组织工程支架材料包括水凝胶、生物陶瓷和金属材料等，但水凝胶不能承受生物压力，生物陶瓷脆性较大，金属缺乏生物降解性。因此，仍然缺乏合适的载体将发挥作用的蛋白进行缓释并作用到局部损伤部位。口腔骨缺损存在腔隙狭小及不规则等特点，需要一种可注射、具有一定机械强度的生物支架并能通过化学键实现稳定负载，进而实现免疫微环境中巨噬细胞M1到M2的材料。聚乳酸PLLA因较强的机械性能和降解性能被广泛使用。支架几何形状在启动骨形成方面起着关键作用，这个过程被称为骨形成的几何诱导。传统的实心微球不能为细胞增殖提供足够的内部空间，细胞大多粘附在微球表面，在注射过程中，微球之间的压力和摩擦会诱导细胞的凋亡。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：如何制备出能够主动调控免疫反应，实现材料结构与活性组分协同促成骨功效的生物支架。
为了解决上述技术问题，本发明提供了可控IL-4缓释聚乳酸多孔微球载体材料，为一种负载有IL-4的聚乳酸多孔微球，所述的IL-4是由负载有IL-4的脂质体进行NHS-酯表面修饰后与胺化的聚乳酸多孔微球通过化学接枝生成酰胺键进行负载的。
优选地，所述聚乳酸多孔微球是以聚乳酸和聚乙烯醇为原料通过微流控技术制备而成，所述的聚乳酸为左旋聚乳酸PLLA、右旋聚乳酸PLDA和外消旋聚乳酸PDLLA中的至少一种。
优选地，所述脂质体包括卵磷脂、三油精和胆固醇，所述NHS-酯的表面修饰所采用的NHS-酯为DSPE-PEG-NHS，其中，PEG的分子量为2000～5000。
优选地，所述卵磷脂、三油精和胆固醇的质量比为7:2:1。
本发明还提供了上述的可控IL-4缓释聚乳酸多孔微球载体材料的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：采用微流控技术将含聚乳酸和聚乙烯醇的乳液制备成聚乳酸微液滴，该聚乳酸微液滴依次经过固化、破乳、洗涤、干燥后制得聚乳酸多孔微球；
步骤2：将步骤1制备所得的聚乳酸多孔微球与含六亚甲基二胺的溶液通过氨解反应进行胺基化，得到胺化的聚乳酸多孔微球；
步骤3：将IL-4水溶液和含脂质体的溶液搅拌下乳化，得到负载有IL-4的脂质体乳液，随后，加入含有DSPE-PEG-NHS的葡萄糖溶液搅拌乳化，再依次经过溶剂分离和纯化步骤得到NHS-酯修饰的IL-4脂质体。
步骤4：将胺化的聚乳酸多孔微球与NHS-酯修饰的IL-4脂质体在PBS缓冲液中搅拌反应，即得可控IL-4缓释聚乳酸多孔微球载体材料。
优选地，所述步骤1中含聚乳酸和聚乙烯醇的乳液是由聚乳酸的二氯甲烷溶液和聚乙烯醇的水溶液通过超声振动乳化后制得；所述微流控技术为采用具有同轴双通道的微流控装置进行制备，具体过程包括：以聚乙烯醇水溶液为连续相，通入同轴双通道的外通道，含聚乳酸和聚乙烯醇的乳液为分散相，通入同轴双通道的内通道，所述连续相与流动相的流速比设为20:1。
优选地，所述同轴双通道的内通道尺寸为：内径0.41mm，外径0.71mm，外通道尺寸为：内径1.04mm，外径1.50mm。
优选地，所述聚乳酸的二氯甲烷溶液中聚乳酸的浓度为1.5～2.5wt％，所述聚乙烯醇的水溶液中聚乙烯醇的浓度为0.8～1.2wt％；所述聚乳酸的二氯甲烷溶液与聚乙烯醇的水溶液的体积比为1：1。
优选地，所述步骤1中固化的条件为：在冰水凝固浴中搅拌过夜；所述破乳的条件为：在40～50℃的温水中搅拌2～4h；所述洗涤的条件为：采用ddH2O洗涤多次；所述干燥的条件为：冷冻干燥。
优选地，所述步骤2中含六亚甲基二胺的溶液为六亚甲基二胺的异丙醇溶液，所述氨解反应的条件为：温度36～38℃，时间20～40min；所述氨解反应后还包括将氨解反应所得混合物依次进行离心、洗涤和干燥的步骤。
优选地，所述步骤3中IL-4水溶液的浓度为15～25μg/mL；所述含脂质体的溶液为含有卵磷脂、三油精和胆固醇的氯仿溶液，所述卵磷脂、三油精和胆固醇的质量比为7:2:1，所述卵磷脂、三油精和胆固醇的浓度总和为1～1.5mg/mL；所述IL-4水溶液与含脂质体的溶液的体积比为0.5～1.5：2。
优选地，所述步骤3中的葡萄糖溶液含有40～60μg/mL的DSPE-PEG-NHS和3～5wt％的葡萄糖；所述含有DSPE-PEG-NHS的葡萄糖溶液与负载有IL-4的脂质体乳液的质量比为1～1.5:1。
优选地，所述步骤3中的纯化为：采用SephadexG-50柱分离纯化。
优选地，所述步骤4中胺化的聚乳酸多孔微球的浓度为8～12mg/mL；所述NHS-酯修饰的IL-4脂质体的浓度为0.8～1.2mg/mL；所述PBS缓冲液的pH值为8.0；所述搅拌反应的温度为室温，时间为3～5h。
优选地，所述步骤4中反应的终止是通过淬灭步骤，所述淬灭步骤为：加入赖氨酸阻断未反应的NHS-酯基团进行淬灭。
本发明还提供了上述的可控IL-4缓释聚乳酸多孔微球载体材料作为骨缺损修复生物支架的应用。
本发明的技术原理：
本发明基于微流控技术制备可控IL-4缓释聚乳酸多孔微球载体材料，微流控技术利用同轴环管微通道制备单分散的PLLA液滴，通过控制液滴在凝固浴中的固化时间，即可得到整体多孔、均质的微球。细胞可在微球内形成三维培养，多孔3D球体为成骨细胞的增殖分化提供“物理信号”。同时，多孔结构能够较好的模仿人骨层级结构，材料微环境中的内源性蛋白及生长因子会被募集到材料表面形成蛋白环，该蛋白环动员了细胞与微球之间发生交互作用并分泌功能因子。因此，能够实现材料“双元”特征。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1.本发明通过微流控技术制备PLLA多孔微球，然后在微球表面引入氨基，在负载IL-4的脂质体表面引入活性酯，通过共价酰胺键接枝，成功构建IL-4/Ls/PLLA微球；
2.本发明针对现有技术缺陷，以含脂质体的聚乳酸材料为IL-4的释放载体，仅使用化学键接枝，使材料具有主动调控免疫反应的活性，进而实现材料结构与活性组分协同促成骨功效的生物支架；设计方法简单易行，需要的设备简单，可获得平均孔径约为11.4±5.0μm，粒径为369.0±64.4μm，IL-4缓释浓度和长效性满足临床使用，因此具有很强的产业化前景。
附图说明
图1为实施例中可控IL-4缓释聚乳酸多孔微球载体材料的制备流程图；
图2为实施例中制备聚乳酸多孔微球的微流控装置示意图；
图3为本发明制备所得的IL-4/Ls/PLLA微球在不同放大倍数下的扫描电镜图像；
图4为本发明制备所得的IL-4/Ls/PLLA微球的作用原理图；
图5为本发明制备所得的IL-4/Ls/PLLA微球的生物相容性试验结果；其中，a为小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1与IL-4/Ls/PLLA微球共培养的DAPI染色结果；b为共培养第3天的细胞增殖检测结果；c为活死细胞染色试剂盒检测共培养第3天和第5天的细胞染色结果；d为活死细胞染色的定量统计结果；e为共培养第5天的细胞增殖检测结果；f为免疫荧光染色检测M1巨噬细胞极化为M2型的结果；＊表示经过统计学分析，两组间具有显著性差异，P＜0.05；＊＊表示经过统计学分析，两组间具有显著性差异，P＜0.01；
图6为成骨诱导分化实验流程(a)、免疫荧光染色检测成骨细胞(b)以及成骨诱导分化1天后(c)、3天后(d)、5天后(e)的成骨细胞定量统计结果；其中，ns表示经过统计学分析，两组间无显著性差异；＊表示经过统计学分析，两组间具有显著性差异，P＜0.05；＊＊表示经过统计学分析，两组间具有显著性差异，P＜0.01。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
实施例
本实施例提供了一种可控IL-4缓释聚乳酸多孔微球载体材料的制备方法，工艺流程如图1所示，包括如下步骤：
1.采用微流控技术制备可注射多孔PLLA微球：
将左旋聚乳酸(PLLA)粉末溶解在二氯甲烷中，得到2wt.％的溶液。然后将得到的2wt.％PLLA溶液与1wt.％聚乙烯醇(PVA)水溶液以体积比1:1的比例通过超声振动(300W，5min)混合以实现均匀乳液。此处用于制备PLLA微球的微流控装置(如图2所示)包括具有双通道的同轴针，其尺寸为0.41mm(内径，id)×0.71mm(外径，od)和1.04mm(id)×1.50mm(外径，od)，PVC管连接到微流控装置通道的末端用以收集微液滴。将上述PLLA/PVA乳液作为分散相，通过注射器注入内通道中。1wt.％PVA溶液用作连续相，通过注射器注入同轴针的外通道中，外/内相流速设定为20:1，分散相在连续相的高速剪切作用下，形成W/O/W双乳相微液滴。将微液滴收集在含有4℃冰水的500mL烧杯中并轻轻搅拌过夜。然后将其置于45℃的温水中再搅拌3小时，在此期间用ddH2O洗涤3次，然后冷冻干燥后储存。
2.PLLA微球的表面胺化：
为了获得微球表面的活性基团进行进一步修饰，采用经典的氨解反应引入氨基。首先，将PLLA微球重新悬浮在异丙醇(60mg/mL)溶解的六亚甲基二胺中，并在37℃下搅拌30分钟。然后，将反应混合物以12000rpm离心10分钟并用PBS缓冲液(pH 8.0)洗涤3次。最后，冻干后得到表面胺化的PLLA微球。
3.负载IL-4的脂质体(IL-4/Ls)的制备：
具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS-酯)表面改性的脂质体用作将IL-4固定到微球表面的介质，脂质体表面的NHS酯将与PLLA微球的氨基结合，将IL-4固定，即构建稳定且可释放IL-4的载体。通过双乳液法(W/O/W)制备NHS-酯表面修饰的IL-4包封脂质体(IL-4/Ls)。简而言之，将1mL IL-4水溶液(20μg/mL)加入2mL含有卵磷脂、三油精和胆固醇(卵磷脂：三油精：胆固醇的质量比＝7:2:1，总浓度1.2mg/mL)的氯仿溶液中)并在室温下高速搅拌下乳化，得到W/O乳液。随后，将4mL含有二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-活性酯DSPE-PEG-NHS(PEG分子量5000，50μg/mL)的4wt.％葡萄糖溶液快速加入W/O乳液中，并在室温下继续高速乳化30分钟。最后，通过旋转蒸发去除W/O/W乳液中的氯仿。未负载的IL-4通过SephadexG-50柱分离。
4.负载IL-4/Ls的微球(IL-4/Ls/PLLA)的制备：
负载IL-4的脂质体与PLLA微球的结合是通过它们的NHS-酯和氨基之间的化学反应实现的。将胺化的PLLA微球(10mg/mL)与IL-4/Ls(1mg/mL)在PBS缓冲液(pH 8.0)中搅拌4小时。之后，将混合物在4000rpm下离心，收集上清液，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定未加载的IL-4的量，从而计算最终加载的IL-4(1.6±0.2ng/mL)。将沉淀的微球浸入40mM赖氨酸中以阻断未反应的NHS-酯基团被阻断，封闭未反应的活性酯。最后用PBS(pH 7.4)洗涤微球3次，冻干备用。
上述制备得的IL-4/Ls/PLLA微球在不同倍数放大倍数下的扫描电镜图像如图3所示，由图3可知，该微球具有多孔结构，经测定其平均孔径约为11.4±5.0μm，粒径为369.0±64.4μm。本发明制备的IL-4/Ls/PLLA微球在使用时，脂质体作为IL-4载体，可达到长效缓释的目的，在成骨免疫微环境中提供了“分子信号”。IL-4与巨噬细胞表面IL-4Rα/γ受体结合，激活下游信号通路，使M1型巨噬细胞极化为M2型。其作用原理如图4所示。
上述制备得的IL-4/Ls/PLLA微球的生物性能测试：
(1)细胞相容性试验：
生物相容性是生物材料应用的首要前提。PLLA完全由聚合的L-乳酸组成，不会引发动物源性生物材料特有的感染和免疫反应。为了评估PLLA微球的生物相容性，将小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1与IL-4/Ls/PLLA微球共培养，经DAPI染色，可以观察到细胞均匀的黏附在支架上，从微球表面逐步向内部迁移，这为细胞增殖提供了更多空间，如图5a所示。同时，检测了第3天和第5天的细胞增殖情况，分别如图5b、5e所示。使用活死细胞染色试剂盒，同样观察第3天和第5天的细胞染色情况，绿色代表活细胞(亮色荧光)，红色代表死细胞(暗色荧光，图中以圈示出)，证明PLLA具有良好的生物相容性，如图5c、5d所示。为了证明M1巨噬细胞可以在IL-4/Ls/PLLA成功极化为M2型，进行了免疫荧光染色，分别使用不同颜色的荧光标记M1(绿，图中显示为较亮的荧光)和M2(红，图中显示为较暗的荧光)的表面蛋白INOS及Arg-1，如图5f所示，以上结果表明，本发明制备的IL-4/Ls/PLLA微球具有主动调控免疫反应的活性，从而能够促进成骨细胞的增殖和分化。
(2)成骨诱导分化试验：
为了进一步在体外检测直接培养体系结合微球对成骨的影响，使用成骨诱导培养基进行成骨诱导分化。由于先前的研究已经证明IL-4对成骨分化没有直接影响，因此试验中分析了不同亚型的巨噬细胞对骨修复的影响，实验流程如图6a所示。通过免疫荧光染色检测成骨诱导1天后、3天后、5天后的成骨细胞以及成骨细胞的定量统计结果如图6b-e所示。以上结果表明IL-4/Ls/PLLA微球上的M2型巨噬细胞对MC3T3-E1的成骨作用有明显的增强，而PLLA微球及M1巨噬细胞在早期成骨分化中具有一定的作用，但晚期成骨能力减弱。
上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (12)

1.一种可控IL-4缓释聚乳酸多孔微球载体材料，其特征在于，为一种负载有IL-4的聚乳酸多孔微球，所述的IL-4是由负载有IL-4的脂质体进行NHS-酯表面修饰后与胺化的聚乳酸多孔微球通过化学接枝生成酰胺键进行负载的。
2.如权利要求1所述的可控IL-4缓释聚乳酸多孔微球载体材料，其特征在于，所述聚乳酸多孔微球是以聚乳酸和聚乙烯醇为原料通过微流控技术制备而成，所述的聚乳酸为左旋聚乳酸PLLA、右旋聚乳酸PLDA和外消旋聚乳酸PDLLA中的至少一种。
3.如权利要求1所述的可控IL-4缓释聚乳酸多孔微球载体材料，其特征在于，所述脂质体由卵磷脂、三油精和胆固醇组成，所述NHS-酯的表面修饰所采用的NHS-酯为DSPE-PEG-NHS，其中，PEG的分子量为2000～5000。
4.权利要求1～3中任意一项所述的可控IL-4缓释聚乳酸多孔微球载体材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：采用微流控技术将含聚乳酸和聚乙烯醇的乳液制备成聚乳酸微液滴，该聚乳酸微液滴依次经过固化、破乳、洗涤、干燥后制得聚乳酸多孔微球；
步骤2：将步骤1制备所得的聚乳酸多孔微球与含六亚甲基二胺的溶液通过氨解反应进行胺基化，得到胺化的聚乳酸多孔微球；
步骤3：将IL-4水溶液和含脂质体的溶液搅拌下乳化，得到负载有IL-4的脂质体乳液，随后，加入含有DSPE-PEG-NHS的葡萄糖溶液搅拌乳化，再依次经过溶剂分离和纯化步骤得到NHS-酯修饰的IL-4脂质体；
步骤4：将胺化的聚乳酸多孔微球与NHS-酯修饰的IL-4脂质体在PBS缓冲液中搅拌反应，即得可控IL-4缓释聚乳酸多孔微球载体材料。
5.如权利要求4所述的可控IL-4缓释聚乳酸多孔微球载体材料的制备方法，其特征在于，所述步骤1中含聚乳酸和聚乙烯醇的乳液是由聚乳酸的二氯甲烷溶液和聚乙烯醇的水溶液通过超声振动乳化后制得；所述制备聚乳酸微液滴采用具有同轴双通道的微流控装置进行制备，具体过程包括：以聚乙烯醇水溶液为连续相，通入同轴双通道的外通道，含聚乳酸和聚乙烯醇的乳液为分散相，通入同轴双通道的内通道，所述连续相与流动相的流速比设为20:1。
6.如权利要求4所述的可控IL-4缓释聚乳酸多孔微球载体材料的制备方法，其特征在于，所述步骤1中固化的条件为：在冰水凝固浴中搅拌过夜；所述破乳的条件为：在40～50℃的温水中搅拌2～4h；所述洗涤的条件为：采用ddH2O洗涤多次；所述干燥的条件为：冷冻干燥。
7.如权利要求4所述的可控IL-4缓释聚乳酸多孔微球载体材料的制备方法，其特征在于，所述步骤2中含六亚甲基二胺的溶液为六亚甲基二胺的异丙醇溶液，所述氨解反应的条件为：温度36～38℃，时间20～40min；所述氨解反应后还包括将氨解反应所得混合物依次进行离心、洗涤和干燥的步骤。
8.如权利要求4所述的可控IL-4缓释聚乳酸多孔微球载体材料的制备方法，其特征在于，所述步骤3中IL-4水溶液的浓度为15～25μg/mL；所述含脂质体的溶液为含有卵磷脂、三油精和胆固醇的氯仿溶液，所述卵磷脂、三油精和胆固醇的质量比为7:2:1，所述卵磷脂、三油精和胆固醇的浓度总和为1～1.5mg/mL；所述IL-4水溶液与含脂质体的溶液的体积比为0.5～1.5：2。
9.如权利要求8所述的可控IL-4缓释聚乳酸多孔微球载体材料的制备方法，其特征在于，所述步骤3中的葡萄糖溶液含有40～60μg/mL的DSPE-PEG-NHS和3～5wt％的葡萄糖；所述含有DSPE-PEG-NHS的葡萄糖溶液与负载有IL-4的脂质体乳液的质量比为1～1.5:1。
10.如权利要求4所述的可控IL-4缓释聚乳酸多孔微球载体材料的制备方法，其特征在于，所述步骤4中胺化的聚乳酸多孔微球的浓度为8～12mg/mL；所述NHS-酯修饰的IL-4脂质体的浓度为0.8～1.2mg/mL；所述PBS缓冲液的pH值为8.0；所述搅拌反应的温度为室温，时间为3～5h。
11.如权利要求4所述的可控IL-4缓释聚乳酸多孔微球载体材料的制备方法，其特征在于，所述步骤4中反应的终止是通过淬灭步骤，所述淬灭步骤为：加入赖氨酸阻断未反应的NHS-酯基团进行淬灭。
12.权利要求1～3中任意一项所述的可控IL-4缓释聚乳酸多孔微球载体材料作为骨缺损修复生物支架的应用。
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