CN114042029A - 含人多能干细胞及华通氏胶来源间充质干细胞分泌物冻干粉复合制剂、护肤品及制备方法 - Google Patents

含人多能干细胞及华通氏胶来源间充质干细胞分泌物冻干粉复合制剂、护肤品及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及含人多能干细胞及华通氏胶来源间充质干细胞分泌物冻干粉复合制剂、护肤品及制备方法,属于护肤品技术领域，冻干粉复合制剂的制备方法包括以下步骤：人多能干细胞或脐带华通氏胶来源的间充质干细胞培养并收集上清；将上清装入透析袋，进行浓缩，收集浓缩液；向浓缩液中加入人血白蛋白，混匀；冻干。冻干粉再与溶媒混合形成精华液及其他类型的护肤品。这些类型的护肤品包括间充质干细胞上清浓缩液、人血白蛋白、抗氧化成分、保湿成分，可以作为护肤品，对皮肤具有保护作用，达到更好抗紫外、延缓皮肤及胸腺衰老、提高免疫功能的效果，特别是在抗紫外及延缓皮肤、胸腺衰老方面，为抗紫外、延缓衰老、提升免疫功能的护肤品开拓了新的领域。

Description

含人多能干细胞及华通氏胶来源间充质干细胞分泌物冻干粉 复合制剂、护肤品及制备方法
技术领域
本发明涉及含人多能干细胞及华通氏胶来源间充质干细胞分泌物冻干粉复合制剂、护肤品及制备方法,属于护肤品技术领域。
背景技术
长期暴露于阳光下，紫外线辐射会造成晒伤、免疫抑制、癌症和光老化等。过度暴露在阳光下会导致严重的晒伤和免疫抑制，皮肤癌和光老化则是由于反复暴露造成的累积损伤所致。光老化皮肤表现为皱纹、松弛、色素不均、棕色斑点和皮革外观。
皮肤由表皮、真皮和皮下组织构成。皮肤具有屏障功能，一是抵御环境中的机械、生物、物理和化学侵袭；二是防止机体的水、营养物质、电解质和其他物质的丧失。表皮由角质形成细胞、朗格汉斯细胞、黑素细胞、巨噬细胞和淋巴细胞组成。表皮可吸收大部分的紫外线。真皮位于表皮下面，为表皮提供机械支撑。真皮中的细胞外基质主要由胶原组成，胶原纤维决定皮肤的强度和弹性。紫外线照射引起的皮肤损伤，主要组织学改变为胶原纤维的紊乱和弹性蛋白异常物质积聚。
紫外线分为长波紫外线(UVA)、中波紫外线(UVB)和短波紫外线(UVC)，不同波段紫外线生物学作用有差别。UVB是化学反应中最活跃的部分，大气层能阻断大部分UVB，到达地球表面的紫外线UVB占比小于10％，但生物学损伤却非常严重。因此本发明采用UVB为辐射光源进行实验比对。
护肤品是以涂抹等方式散布于人体表面部位，以达到护肤、美容等目的的日用化学工业品。护肤品分为普通用途和特殊用途，特殊用途包括美白、防晒等。健康的皮肤是由皮肤健康的功能和结构决定。延缓衰老的速度，保持皮肤美观，必须保护皮肤。具有保湿、美白、抗衰、防晒等功效性护肤品开发具有美好前景。
人多能干细胞或脐带华通氏胶来源间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。它在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。人多能干细胞诱导分化MSCs及脐带华通氏胶分离培养的 MSCs，具有来源不受伦理限制，能大规模标准化制备，且细胞含量、增殖能力优于骨髓MSCs，免疫原性比骨髓MSCs低，并且具有取材方便，无伦理学争议等优点，因此越来越受到研究工作者们的关注。
有研究表明，胚胎干细胞、脂肪来源外泌体有抗衰老作用，皮肤注射MSCs 上清有抗衰作用。由于要分泌外泌体，或是注射使用，来源复杂，使用不变。探索一种来源简便，使用方便的含MSCs分泌物的抗紫外、延缓衰老、提高免疫功能制剂迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的在于开发一种来源简便、使用方便的人多能干细胞或脐带华通氏胶来源MSCs分泌物冻干粉复合制剂，具有抗紫外、延缓皮肤及胸腺衰老、提高免疫功能的效果，为抗紫外、延缓衰老、提升免疫功能的护肤品提供一种新的思路配方。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：含人多能干细胞及华通氏胶来源间充质干细胞分泌物冻干粉复合制剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤(A1)人多能干细胞或脐带华通氏胶来源的间充质干细胞培养并收集上清；
步骤(A2)将上清装入透析袋，进行浓缩，收集浓缩液；
步骤(A3)向浓缩液中加入人血白蛋白，混匀；
步骤(A4)冻干。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述步骤(A1)中，人多能干细胞或脐带华通氏胶来源的间充质干细胞在37℃、5％(v/v％)CO2的培养箱中培养并传代，将上清移入无菌细胞培养瓶中，收集的上清放于4℃。在传代时，P2代细胞经过两次细胞传代(传代比例为1:10)后，待细胞长到95％融合，采用降低培养基添加物浓度的方式，饥饿细胞，促进外泌体的产生。
进一步，所述步骤(A2)中，在生物安全柜中，将上清装入2000分子量透析袋，两端用封口夹夹住，在容器(比如烧杯)中装入PEG8000，再将装有上清的透析袋放入容器中，然后在4℃条件下进行浓缩，浓缩为原体积的1/45，收集浓缩液。
进一步，所述步骤(A3)中，人血白蛋白的加入量为浓缩液体积的5％。
进一步，所述步骤(A4)中，将加入人血白蛋白后的浓缩液分装入冻干瓶，每瓶3mL-5mL体积，放入-80℃冰箱存放，在一个月内将样品冻干。具体使用冻干机将样品冻干，在-69.5℃，1Pa真空度，时长72h完成冻干。
本发明还涉及一种含人多能干细胞及华通氏胶来源间充质干细胞分泌物冻干粉复合制剂，由所述含人多能干细胞及华通氏胶来源间充质干细胞分泌物冻干粉复合制剂的制备方法制备而成。
本发明解决上述技术问题的另一技术方案如下：一种溶媒的制备方法，包括以下步骤：步骤(B1)分别称取A相、B相、C相物质，分相混合，分别加热到60℃-80℃处理30分钟，搅拌均匀备用；其中以溶媒总质量的百分数计，A相包括EDTA 0.03-0.09％、水43-49％、胶原蛋白粉1.2-1.7％、羊毛脂1.5-2.5％，B相包括透明质酸0.1-0.5％、丁二醇22-28％、3-O-乙基抗坏血酸1.5-2.5％，C相包括水8-12％、烟酰胺1-5％、VB51-4％、奥婷美1-4％；步骤(B2)各相温度降至40℃，依次将B相、C相加入A相，搅拌均匀出料分装。
上述方案中，分相混合可使各相溶解均匀，不能直接全部混合在一起。
本发明还涉及一种溶媒，由所述溶媒的制备方法制备而成。
本发明解决上述技术问题的另一技术方案如下：一种护肤品的制备方法，将所述的含人多能干细胞及华通氏胶来源间充质干细胞分泌物冻干粉复合制剂加入到所述的溶媒中，所述含人多能干细胞及华通氏胶来源间充质干细胞分泌物冻干粉复合制剂的质量为所述护肤品总质量的10％-40％。
本发明还涉及的护肤品，由所述护肤品的制备方法制备而成。
本发明的含人多能干细胞及华通氏胶来源间充质干细胞分泌物冻干粉复合制剂也可单独使用，不加基质液(溶媒)没有抗紫外线及增强免疫功能效果，只有损伤修复，延缓皮肤衰老效果。
本发明的有益效果是：本发明使用间充质干细胞分泌物浓缩冻干形成冻干粉，形成一种高效抗紫外、皮肤抗衰、提高免疫功效制剂，且便于储存和使用。冻干粉再与溶媒混合形成精华液及其他类型的护肤品。这些类型的护肤品包括间充质干细胞上清浓缩液、人血白蛋白、抗氧化成分、保湿成分，可以作为护肤品，对皮肤具有保护作用，达到更好抗紫外、延缓皮肤衰老、延缓胸腺衰老、提高免疫功能的效果，为抗紫外、延缓衰老、提升免疫功能的护肤品开拓了新的领域。
附图说明
图1为本发明含人多能干细胞及华通氏胶来源间充质干细胞分泌物冻干粉复合制剂成品图；
图2为本发明含人多能干细胞及华通氏胶来源间充质干细胞分泌物冻干粉复合制剂的动物实验中各实验例皮肤外观；
图3为本发明含人多能干细胞及华通氏胶来源间充质干细胞分泌物冻干粉复合制剂的动物实验中各实验例冰冻切片染色结果；
图4为本发明含人多能干细胞及华通氏胶来源间充质干细胞分泌物冻干粉复合制剂的动物实验中各实验例He染色结果；
图5为本发明含人多能干细胞及华通氏胶来源间充质干细胞分泌物冻干粉复合制剂的动物实验中各实验例Masson染色结果；
图6为本发明含人多能干细胞及华通氏胶来源间充质干细胞分泌物冻干粉复合制剂的人体实验结果；图6A为制剂涂抹前，图6B为制剂涂抹后，图 6C为制剂涂抹一周后。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1：MSCs上清的收集、浓缩与冻干
1实验材料
临床级MSCs培养基：安徽中盛溯源公司ncMission；二甲基亚砜(DMSO)，天津市瑞金特化学品有限公司；胰蛋白酶，biosharp公司；磷酸盐缓冲液， gibco公司；PEG8000；2000分子量透析袋；人血白蛋白，octapharma；低温冻干机，LGJ-10C。
2实验步骤
人多能干细胞或脐带华通氏胶来源的间充质干细胞(人多能干细胞来源于血液有核细胞诱导分化细胞，可以大规模培养；而华通氏胶来源于脐带) 培养上清收集放于4℃，培养方法为：人多能干细胞诱导分化成为间充质干细胞，形成拟胚体后，加入A83和SB431542小分子和中胚层诱导因子BMP4，进行6天的诱导培养，然后把拟胚体进行贴壁培养，使用间充质干细胞培养基。待间充质样细胞爬出后，进行传代培养，此时细胞记为P0代；脐带华通氏胶来源的间充质干细胞P0代获取方法是：1、取脐带，首先用含双抗的 PBS或者加双抗的生理盐水清洗脐带表面；用镊子尽量将脐带里面的血清洗干净；2、脐带剖开，去除两根动脉、一根静脉，用镊子撕取华通氏胶，3、将华通氏胶放入离心管内用剪刀剪碎至1mm3左右，转入培养瓶，均匀铺开，贴壁培养。待细胞从华通氏胶中爬出进行传代培养，此时细胞记为P0代。
P0代的间充质干细胞经过两次传代扩增后，建立P2代细胞的工作库， P2代细胞经过两次细胞传代(传代比例为1:10)后，待细胞长到95％融合，采用降低培养基添加物浓度的方式，饥饿细胞，促进外泌体的产生；将上清移入无菌细胞培养瓶中进行培养，收集的上清放于4℃，培养条件为：37℃、 5％(v/v％)CO2的培养箱。
在生物安全柜中，将上清装入2000分子量透析袋，两端用封口夹夹住，在容器(比如烧杯)中装入PEG8000，再将装有上清的透析袋放入容器中，然后在4℃条件下进行浓缩，浓缩为原体积的1/45，收集浓缩液。
在浓缩液中加入人血白蛋白，其比重为5％(即人血白蛋白的加入量为浓缩液质量的5％)。
混匀并分装入冻干瓶，每瓶3mL-5mL体积，放入-80℃冰箱，一个月内进行冻干。
3冻干粉成品如图1所示。
实施例2：溶媒配制
1实验材料
1.1溶媒及含量(以溶媒总质量的百分数计)：
A相：
EDTA 0.03-0.09％；水43-49％；胶原蛋白粉1.2-1.7％；羊毛脂1.5-2.5％。
B相：
透明质酸0.1-0.5％；丁二醇22-28％；3-O-乙基抗坏血酸1.5-2.5％。
C相：
水8-12％；烟酰胺1-5％；VB51-4％；奥婷美1-4％。
材料为护肤品级别，购自成都欧泊商贸。
1.2仪器设备
万分之一天平，Precisa XS 125A-SCS；纯水仪，型号UPH-II-10T。
2.实验方法
2.1溶媒配制
分别称取A相、B相、C相物质，分相混合，加热到60℃-80℃处理30 分钟，搅拌均匀备用。
各相温度降至40℃，依次将B相、C相加入A相，搅拌均匀出料分装。
实施例3：人多能干细胞或脐带华通氏胶来源的间充质干细胞分泌物冻干粉复合制剂的动物实验及应用
1.实验材料
1.1实验动物：昆明种小鼠，雌性，8周龄，体重18-22g，共40只，购自成都达硕生物科技有限公司。
1.2实验器材：飞利浦TL20W/01窄谱UVB灯管(311nm)，纳米电动微针仪器WZY-13SXA，2mL含EDTA抗凝管，Leica CM3050S冰冻切片机。
2.实验方法
2.1实验分组
按不同的涂抹试剂，分为四组，分别为阴性对照组(不涂抹、不照射紫外线)、UVB组(不涂抹、照射紫外线)、溶媒组(涂抹溶媒、照射紫外线)、上清组(涂抹人多能干细胞或脐带华通氏胶来源的间充质干细胞分泌物冻干粉+溶媒、照射紫外线)。
2.2动物分组及给药方法
上清组的制剂配方为人多能干细胞或脐带华通氏胶来源的间充质干细胞分泌物冻干粉加溶媒(其中冻干粉质量：总质量＝0.1-0.4)，人体实验的护肤品配方与动物实验上清组的配方相同。
将40只昆明鼠分为4组，每组10只昆明鼠，使用剃毛刀去除小鼠背部毛发，如小鼠背部长出毛，立即用剃毛刀去除。紫外功率UVB 220μW/cm2，溶媒组涂抹溶媒的量为200μL/只、上清组涂抹冻干粉+溶媒的总量为200μ L/只。实验持续七周，UVB总剂量20.46J/cm2。
第一周UVB照射前5天，每天20min。后2天不做任何处理(后面几周同理，也是后2天不做任何处理)；
第二周UVB照射前5天，每天30min；溶媒组和上清组照射前涂抹，第 1天用微针涂抹，第2、3、4和5天用200μL的枪头轻轻涂抹均匀。
第三周UVB照射前5天，每天40min；溶媒组和上清组照射前涂抹，第 1天用微针涂抹，第2、3、4和5天用200μL的枪头轻轻涂抹均匀。
第四周UVB照射前5天，每天40min；溶媒组和上清组照射前涂抹，第 1天用微针涂抹，第2、3、4和5天用200μL的枪头轻轻涂抹均匀。
第五周UVB照射前5天，每天60min，溶媒组和上清组照射前涂抹，第 1天用微针涂抹，第3天和第5天用200μL的枪头轻轻涂抹均匀。
第六周UVB照射前5天，每天60min，溶媒组和上清组照射前涂抹，第 1天用微针涂抹，第3天和第5天用200μL的枪头轻轻涂抹均匀。
第七周UVB照射前5天，每天60min，溶媒组和上清组照射前涂抹，第 1天用微针涂抹，第3天和第5天用200μL的枪头轻轻涂抹均匀。
上述实验进行过程中，微针涂抹深度0.25mm，使用挡位为1档。
2.3检测指标及方法
2.3.1皮肤外观评价
观察皮肤色泽，粗糙度。
2.3.2腹股沟取血
用剪刀剪开腹股沟皮肤，用镊子使腹股沟血管暴露，取血，收集于2mL 含EDTA抗凝管，做血常规检测WBC(白细胞计数)，GPR(粒细胞百分比)， LPR(淋巴细胞百分比)。
2.3.3体重及脏器系数的测定
脱颈椎处死小鼠，称取各小鼠的体重。剪取背部皮肤，剪开腹腔，分离小鼠心、肝、脾、肺、肾及胸腺，分别称重，按下式计算各内脏系数。
心脏系数＝[心脏重量(mg)/体重(g)]×100％
肝脏系数＝[肝脏重量(mg)/体重(g)]×100％
脾脏系数＝[脾脏重量(mg)/体重(g)]×100％
肺系数＝[肺重量(mg)/体重(g)]×100％
肾系数＝[肾重量(mg)/体重(g)]×100％
胸腺系数＝[胸腺重量(mg)/体重(g)]×100％
2.3.4冰冻切片β半乳糖苷酶染色
使用OTC包埋皮肤组织，冰冻切片皮肤厚度为8μm，皮肤晾干，染色，按β半乳糖苷酶染色试剂盒说明染色，再进行伊红复染，甘油封片。
2.3.5病理学染色
将皮肤和胸腺用4％(质量百分数)多聚甲醛固定24h，石蜡包埋，脱蜡水化，脱水、透明和封片。皮肤进行HE染色和Masson染色。
2.4统计方法
本实施例的动物实验数据使用GraphPad Prism 5.0中的非参数检验 Kruskal-Wallis test验证显著性差异。数据以平均值±标准差表示，P≤ 0.05认为具有统计学意义。
3.实验结果
3.1皮肤外观评价
如图2所示，经UVB辐射，阴性对照组小鼠皮肤有光泽。UVB组小鼠皮肤暗沉无光泽，粗糙。溶媒组和上清组皮肤变亮，粗糙度改善。
3.2血常规检测统计值
如表1所示，阴性对照组、UVB组、溶媒组和上清组的WBC、GPR和LPR 均在正常值范围，没有不良反应。说明溶媒和上清对小鼠的血项无影响，护肤品安全。
表1血常规检测统计
Figure BDA0003300368620000101
3.3体重及脏器系数
如表2所示，溶媒组和上清组的小鼠体重、心、脾、肺、肾、胸腺较UVB 组无显著性差异，UVB组较阴性对照组胸腺系数减少，胸腺萎缩，人和动物的胸腺都会随着年龄的增长发生退化萎缩且越来越明显，UVB辐射导致胸腺老化。溶媒组和上清组较UVB组胸腺指数增加，说明溶媒和上清有增加胸腺作用趋势，具有胸腺抗衰作用。这是从胸腺系数看到的结果，后面将从组织病理学评价胸腺老化原因。
表2小鼠体重及脏器系数
Figure BDA0003300368620000102
3.4冰冻切片染色
细胞或组织衰老时衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence-associatedβ -galactosidase；SA-β-Gal)活性水平上调，使用β-半乳糖苷酶染色试剂盒染色，衰老细胞或组织在显微镜下观察呈现蓝色。如图3所示，图3中的衰老细胞用黑色箭头标出，经UVB辐射，UVB组表达β半乳糖苷酶增加，蓝色明显，溶媒组和上清组蓝色减少。说明溶媒组和上清组皮肤表达β半乳糖苷酶减少，有一定抗衰作用。
3.5HE染色
如图4所示，UVB组小鼠皮肤异常，表皮层变薄，毛孔长至表皮，真皮层皮肤松弛，溶媒组和上清组较UVB组，表皮变厚，真皮层结构紧密，上清组真皮变厚越加明显。阴性对照组毛孔长在真皮部位。UVB组毛孔长至表皮层，毛孔生长位置异常，溶媒组和上清组毛孔生长异常现象有所改善。
3.6Masson染色
如图5所示，阴性对照组小鼠真皮部位胶原蛋白排列紧密，UVB组小鼠真皮部位胶原蛋白减少，排列稀疏，真皮层结构疏松。溶媒组较UVB组胶原蛋白增多，排列紧密。上清组较UVB组胶原蛋白表达增加，排列紧密。上清组较溶媒组胶原蛋白表达增加更为明显。
实施例4：人多能干细胞或脐带华通氏胶来源的间充质干细胞分泌物冻干粉复合制剂的人体实验应用
1实验步骤
人体实验的制剂配方与动物实验上清组的配方相同。制剂使用体积为 1mL，微针涂抹深度0.25mm，使用挡位为1档，涂抹面积为57cm2。
2实验结果
如图6A所示，制剂涂抹前的皮肤，上下部分皮肤松弛，皱纹明显，色泽暗沉。图6B下半部分用黑框框住的部分为护肤品微针涂抹部分，涂抹后，皮肤光泽，皱纹减少。图6C为一周后的拍照记录，可见微针涂抹后的皮肤光亮富有弹性，皱纹明显减少。
4.实验结论
上清对UVB辐射后的皮肤抗紫外和润肤保护作用，具体作用如下：皮肤变亮；表皮变厚；真皮层胶原蛋白表达增加；真皮层毛孔异常生长情况改善；皮肤衰老相关β半乳糖苷酶表达下调；促进胸腺生长，保护胸腺，具有胸腺抗衰作用。减少人体皮肤皱纹，增加皮肤弹性及提高皮肤光泽度。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.含人多能干细胞及华通氏胶来源间充质干细胞分泌物冻干粉复合制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(A1)人多能干细胞或脐带华通氏胶来源的间充质干细胞培养并收集上清；
步骤(A2)将上清装入透析袋，进行浓缩，收集浓缩液；
步骤(A3)向浓缩液中加入人血白蛋白，混匀；
步骤(A4)冻干。
2.根据权利要求1所述含人多能干细胞及华通氏胶来源间充质干细胞分泌物冻干粉复合制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(A1)中，人多能干细胞或脐带华通氏胶来源的间充质干细胞在37℃、5％CO2的培养箱中培养并传代，将上清移入无菌细胞培养瓶中，收集的上清放于4℃。
3.根据权利要求1所述含人多能干细胞及华通氏胶来源间充质干细胞分泌物冻干粉复合制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(A2)中，在生物安全柜中，将上清装入2000分子量透析袋，两端用封口夹夹住，在容器中装入PEG8000，再将装有上清的透析袋放入容器中，然后在4℃条件下进行浓缩，浓缩为原体积的1/45，收集浓缩液。
4.根据权利要求1所述含人多能干细胞及华通氏胶来源间充质干细胞分泌物冻干粉复合制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(A3)中，人血白蛋白的加入量为浓缩液体积的5％。
5.根据权利要求1所述含人多能干细胞及华通氏胶来源间充质干细胞分泌物冻干粉复合制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(A4)中，将加入人血白蛋白后的浓缩液分装入冻干瓶，每瓶3mL-5mL体积，放入-80℃冰箱存放，在一个月内将样品冻干。
6.一种含人多能干细胞及华通氏胶来源间充质干细胞分泌物冻干粉复合制剂，其特征在于，由如权利要求1至5任一项所述含人多能干细胞及华通氏胶来源间充质干细胞分泌物冻干粉复合制剂的制备方法制备而成。
7.一种溶媒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(B1)分别称取A相、B相、C相物质，分相混合，分别加热到60℃-80℃处理30分钟，搅拌均匀备用；其中以溶媒总质量的百分数计，A相包括EDTA0.03-0.09％、水43-49％、胶原蛋白粉1.2-1.7％、羊毛脂1.5-2.5％，B相包括透明质酸0.1-0.5％、丁二醇22-28％、3-O-乙基抗坏血酸1.5-2.5％，C相包括水8-12％、烟酰胺1-5％、VB51-4％、奥婷美1-4％；步骤(B2)各相温度降至40℃，依次将B相、C相加入A相，搅拌均匀出料分装。
8.一种溶媒，其特征在于，由如权利要求7所述溶媒的制备方法制备而成。
9.一种护肤品的制备方法，其特征在于，将如权利要求6所述的含人多能干细胞及华通氏胶来源间充质干细胞分泌物冻干粉复合制剂加入到如权利要求8所述的溶媒中；其中，所述含人多能干细胞及华通氏胶来源间充质干细胞分泌物冻干粉复合制剂的质量为所述护肤品总质量的10％-40％。
10.一种护肤品，其特征在于，由如权利要求9所述护肤品的制备方法制备而成。
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