CN114557908A - 一种具有皮肤屏障修复功效的纤连弹性蛋白组合物冻干微芯及其制备方法 - Google Patents

一种具有皮肤屏障修复功效的纤连弹性蛋白组合物冻干微芯及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有皮肤屏障修复功效的纤连弹性蛋白组合物冻干微芯及其制备方法，所述冻干微芯包括以下重量百分比的原料：纤连蛋白10‑15ppm，血小板衍生生长因子10‑15ppm，金属硫蛋白Ⅳ型10‑15ppm，弹性蛋白10‑15ppm，丝聚蛋白20‑40ppm，冻干保护液，余量为水；其为生物功效性产品，具有促细胞增殖活性和促细胞迁移活性，在乳酸刺痛实验中显示具有舒缓刺痛的功效，且制备时不添加防腐剂、人工化学成分，对皮肤无刺激。

Description

一种具有皮肤屏障修复功效的纤连弹性蛋白组合物冻干微芯 及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有皮肤屏障修复功效的纤连弹性蛋白组合物冻干微芯及其制备方法。
背景技术
敏感性皮肤是一种皮肤高度敏感的状态，在这种状态下皮肤极易受到外界因素影响，出现皮肤瘙痒、紧绷、烧灼、刺痛等不适。研究显示，全球范围内的敏感肌肤正在日益增加，敏感性皮肤在亚洲女性中发生率为40％～55％，其中我国女性的发生率在36.1％。敏感性皮肤作为现代社会人群中发生率极高的皮肤问题，已经严重影响着人们的学习、工作和生活。市场上宣称具有敏感肌修复效果的护肤类产品琳琅满目，不乏一些功效差，甚至对皮肤有害的产品。
随着基因工程技术的不断发展，生物功效性护肤品也逐渐获得人们的青睐。该技术制备的功效性蛋白护肤品无论从生物学活性、皮肤亲和性、生物相容性等等均显著优于传统的化妆品。此外生物护肤品以生物活性蛋白为核心，注重产品有效成分对生物活性的保持，不添加防腐剂，不添加人工化学成分，对皮肤无刺激，能快速修复皮肤屏障，对皮肤修护功效优于传统化妆品，但是在敏感肌修复方面尚无类似产品。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种具有皮肤屏障修复功效的纤连弹性蛋白组合物冻干微芯及其制备方法，所述冻干微芯为生物功效性产品，具有促细胞增殖活性和促细胞迁移活性，在乳酸刺痛实验中显示具有舒缓刺痛的功效，且制备时不添加防腐剂、人工化学成分，对皮肤无刺激。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种具有皮肤屏障修复功效的纤连弹性蛋白组合物冻干微芯，所述冻干微芯包括以下重量百分比的原料：纤连蛋白10-15ppm，血小板衍生生长因子10-15ppm，金属硫蛋白Ⅳ型10-15ppm，弹性蛋白10-15ppm，丝聚蛋白20-40ppm，冻干保护液，余量为水。
所述冻干保护液的重量百分比为10-15％。
所述冻干保护液中各原料的重量比如下：甘露醇：甘氨酸：海藻糖＝4-8：4-8：1.
所述冻干微芯优选为包括以下重量百分比的原料：纤连蛋白15ppm，血小板衍生生长因子15ppm，金属硫蛋白Ⅳ型15ppm，弹性蛋白15ppm，丝聚蛋白20ppm，甘露醇6％，甘氨酸6％，海藻糖1％，余量为水。
所述冻干微芯优选为包括以下重量百分比的原料：纤连蛋白10ppm，血小板衍生生长因子10ppm，金属硫蛋白Ⅳ型10ppm，弹性蛋白10ppm，丝聚蛋白40ppm，甘露醇6％，甘氨酸6％，海藻糖1％，余量为水。
本发明还提供了所述具有皮肤屏障修复功效的纤连弹性蛋白组合物冻干微芯的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将配方量的各原料混合得到混合液；
(2)利用高精度流体分装系统，将混合溶液逐滴滴入存于杜瓦瓶的液氮中冷冻成微芯；
(3)将微芯取出装入西林瓶中，进行冷冻干燥。
步骤(2)中，每滴混合溶液的体积为5-60μL，优选为5-15μL，更优选为10μL。
步骤(3)中，每个西林瓶中装入2-20粒冷冻后的微芯。
所述冷冻干燥具体为：35～45Kpa的真空度下-35-45℃预冻170-190min，并在同样的条件下冻结220～260min，随后在5～15Pa的真空度下进行一期升华干燥及二期升华干燥。
所述一期升华干燥的程序设计为：-34～-38℃保持55～65min，-31～-33℃保持150～200min，-28～-30℃保持400～450min，-20～-27℃保持220～260min，-10～-18℃保持220～260min，-5～-5℃保持100～140min；所述二期升华干燥的程序设计为：20～25℃保持280-320min，28～-30℃保持280-320min。
本发明提供的具有皮肤屏障修复功效的纤连弹性蛋白组合物冻干微芯的使用方法为：将适量纯化水加入到含有冻干微芯的西林瓶中，混合待微芯完全溶解后，即可使用。
本发明提供的具有皮肤屏障修复功效的纤连弹性蛋白组合物冻干微芯的配方中，纤连蛋白(FN)广泛参与细胞迁移、黏附、增殖、止血及组织修复等过程，调动单核吞噬细胞系统清除损伤组织处有害物质，具有生长因子作用；血小板衍生生长因子(PDGF)能促进皮肤细胞的生长与更新，提升皮肤组织的生理活性与新陈代谢水平，增强皮肤细胞的免疫力与自我修复能力，修复由于日光、严寒、化学物质与机械磨损伤害造成的红血丝与敏感肌肤；金属硫蛋白是富含半胱氨酸的金属结合蛋白，其巯基能强烈螯合有毒金属，并将之排出体外，从而实现解毒功能，金属硫蛋白可清除自由基实现抗衰老、抗氧化及细胞凋亡；弹性纤维可提高皮肤的延展性和回弹性，使皮肤具有良好的柔韧性和弹性；丝聚蛋白可与皮肤内的相关蛋白共同组成角质包膜而成为皮肤屏障的重要组成部分，可防止皮肤水分丢失、提升皮肤的免疫屏障。
本发明提供的具有皮肤屏障修复功效的纤连弹性蛋白组合物冻干微芯为生物功效性产品，易吸收，对皮肤无任何副作用，具有促细胞增殖活性和促细胞迁移活性，在乳酸刺痛实验中显示具有舒缓刺痛的功效，且制备时不添加防腐剂、人工化学成分，对皮肤无刺激，能修复敏感肌。其制备形式相较于普通的冻干粉，更有效的降低了冻干过程对于重组蛋白的活性损失。
具体实施方式
本发明所涉及的纤连蛋白的制备方法如下：
(1)通过GenBank查询获得纤连蛋白(FN)基因，将FN基因序列插入到pMD19-TSimple Vector中，其5’端接NotⅠ酶切位点(GCGGCCGC)，3’端接XbaⅠ酶切位点(TCTAGA)，由此得到质粒pMD19-T-FN；
(2)用内切酶Not I和内切酶Xba I分别对质粒pYES2/CT-MFα及质粒pMD19-T-FN进行双酶切，酶切反应体系为：
双酶切体系 体积(μL)
QuickCut Not I 2.0
QuickCut Xba I 2.0
10xQuickCut Green Buffer 5
pYES2/CT-MFa或FN片段 15
ddH<sub>2</sub>O 26
Total Volume 50
在37℃金属浴酶切反应3h，酶切产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测，并分别切胶回收FN基因片段和pYES2/CT-MFα载体，然后用T4 DNA连接酶进行连接，连接反应体系为：
连接体系 体积(μL)
FN基因片段 5
pYES2/CT-MFα 3
T4 DNA连接酶 1
10×ligase buffer 1
Total Volume 10
反应条件为16℃、14h，将重组质粒转化至大肠杆菌(DH5ɑ)，在含氨苄青霉素的LB平板培养基上挑取阳性克隆，经菌液PCR及双酶切鉴定，选取阳性克隆pYES2/CT-MFα-FN；
(3)将10μL pYES2/CT-MFα-FN质粒加到80μl酿酒酵母INVScl感受态细胞中，吹吸使其混合均匀，然后转移到预冷的电击杯中，冰浴5min，擦干电击杯外壁；将Bio-Rad电转化仪调至真菌档，PIC选项，电击杯置于Bio-Rad电转化仪上电击，迅速向电击杯中加入500μl预冷的1M山梨醇溶液，混合均匀，涂SC-U板；30℃恒温倒置培养，直至长出单克隆。在SC-U选择培养基(含氨苄)生长的为含有pYES2/CT-MFα-FN的酿酒酵母转化子，菌液PCR筛选出INVSc1/pYES2/CT-MFα-FN阳性克隆子。
(4)挑取INVSc1/pYES2/CT-MFα-FN单菌落接种于20ml SC-U选择培养基，经30℃、220rpm震荡培养过夜，测定其OD600nm吸光值，计算好相应体积的菌液转接至于100ml SC-U诱导培养基中，使得初始OD600nm达到0.4；然后在4℃、1500g离心5min，收集菌体，用1～2ml的SC-U诱导培养基悬浮菌体，重新接种100ml的SC-U诱导培养基中，置于30℃震荡培养96h，4℃、15000g离心5min，收集菌体和上清，诱导表达的上清液经离心并通过0.22μm滤膜过滤，收集过滤液。
(5)取离心并经0.22μm滤膜过滤后的过滤液，使用GE Healthcare公司C helatingSepharose TM Fast Flow镍离子螯合亲和层析填料自行装柱，用3个柱体积的纯化水清洗Ni2+螯合亲和层析柱，再用PBS平衡2-3个柱体积；在线检测电导率值及280nm波长吸收值，待两者都稳定后开始上样，设置样品经过泵过层析柱的流速5-6ml/min；再用PBS过层析柱，洗去未与层析柱结合的杂蛋白，直到OD280nm稳定，再以含500mM咪唑PBS缓冲液过层析柱，洗脱并收集洗脱峰对应的蛋白，即得到经过金属离子亲和层析后的重组人FN蛋白原液。
(6)将金属离子亲和层析纯化后收集的蛋白原液置换到Binding BufferⅡ中后，上样通过用Binding BufferⅡ平衡好的DEAE阴离子交换层析柱，收集FN融合蛋白峰；再用Elution BufferⅡ(50mM三羟甲基氨基甲烷，1M NaCl，pH8.5)洗脱，洗去杂蛋白并收集洗脱峰对应的蛋白。即可制备得到酸性成纤维细胞生长因子的蛋白原液，此原液直接作为冻干微芯的原料进行使用。
按照上述纤连蛋白制备方法在同样的制备步骤下分别制备出血小板衍生生长因子、血小板衍生生长因子、金属硫蛋白Ⅳ型、弹性蛋白、丝聚蛋白的蛋白原液，各原液直接作为冻干微芯的原料进行使用。
各个原料的基因序列参考的基因库编号如下所示：
纤连蛋白：AJ320527.1；
血小板衍生生长因子：U41745.1；
金属硫蛋白Ⅳ型：NM_032935.3；
弹性蛋白：M36860.1；
丝聚蛋白：M24355.1。
下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
一种具有皮肤屏障修复功效的纤连弹性蛋白组合物冻干微芯，其是由下述重量百分比的原料制得：纤连蛋白15ppm，血小板衍生生长因子15ppm，金属硫蛋白Ⅳ型15ppm，弹性蛋白15ppm，丝聚蛋白20ppm，甘露醇6％，甘氨酸6％，海藻糖1％，余量为水。
所述冻干微芯的制备方法，包括以下步骤：
(1)将配方量的各原料混合得到混合液；
(2)利用高精度流体分装系统，将混合溶液按照10μl每滴逐滴滴入存于杜瓦瓶的液氮中冷冻成微芯；
(3)将微芯取出装入西林瓶中，每个西林瓶中装入10粒冷冻后的微芯，进行冷冻干燥，冷冻干燥的程序控制如表1所示。
表1冻干程序参数表
Figure BDA0003559164810000071
Figure BDA0003559164810000081
实施例2
一种具有皮肤屏障修复功效的纤连弹性蛋白组合物冻干微芯，其是由下述重量百分比的原料制得：纤连蛋白10ppm，血小板衍生生长因子10ppm，金属硫蛋白Ⅳ型10ppm，弹性蛋白10ppm，丝聚蛋白40ppm，甘露醇6％，甘氨酸6％，海藻糖1％，余量为水。
所述冻干微芯的制备方法同实施例1。
对比例1
本对比例与实施例1相比，区别仅在于，在配方中，将丝聚蛋白替换为等量的纤连蛋白，除此之外的方法步骤均相同。
对比例2
本对比例与实施例相比，区别仅在于，在制备过程中省去了其中的步骤(2)，即将100μL步骤(1)中的混合液装入西林瓶中后进行冷冻干燥，冷冻干燥的程序控制同实施例。
对比例3
一种具有皮肤屏障修复功效的纤连弹性蛋白组合物混合液，其原料组成为：纤连蛋白15ppm，血小板衍生生长因子15ppm，金属硫蛋白Ⅳ型15ppm，弹性蛋白15ppm，丝聚蛋白20ppm，甘露醇6％，甘氨酸6％，海藻糖1％，余量为水。
测试例
一、乳酸刺痛实验
测试人数：共50人，男女各半，年龄22-50岁。
随机分成5组，每组5名男性、5名女性。以面部作为受试部位，受试部位在试验前15天内不能使用任何产品(化妆品或外用药品或内服保健品)。试验前，受试者清洗面部并在清洗后2h进入温度22±1℃，湿度50±5％的恒温恒湿房间内静坐30min，并保持放松状态，进行颜面部乳酸刺激功效评估测试：
试验中按随机表进行半边脸测试，一侧为实施例产品，另一侧为对比例产品.实施例产品使用方法为将适量纯化水加入到含有冻干微芯的西林瓶中，混合待微芯完全溶解后，即可使用。
在受试者鼻唇沟部位进行试验，将10％乳酸溶液50ul滴在直径为0.8cm的单层滤纸上，分别在0.5min、2.5min、5min和8min询问受试者刺痛感，按4分法进行评分(0分为没有刺痛，1分为轻度刺痛，2分为中度刺痛，3分为重度刺痛)，若受试者在试验内任意时间达到3分即终止实验。取下滤纸并用碱液或者碱性肥皂缓解症状。按要求每天早晚2次进行产品涂抹，连续试用14天，并要求试验的第7天(D7)及第14天(D14)进行回访。
测试结果如表1所示。
表1
Figure BDA0003559164810000091
由表1结果可知：实施例1、实施例2、对比例1都有防皮肤刺激的作用，即敏感肌修复作用。其中以实施例2效果较好，实施例1次之，对比例1效果低于实施例1和实施例2。表明丝聚蛋白的加入显著提升了微芯的降低乳酸刺激的效果，且效果大小与丝聚蛋白的含量存在剂量效应。综上，本发明所涉及的冻干微芯具有较好的修复作用，具有降低乳酸刺激的效果。
二、促细胞迁移速率实验
实验原理：本法系依据当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。在细胞迁移过程中在开始和试验结束时定期捕获图像，通过比较图像以确定细胞迁移速率。
试验材料
细胞株：MDBK细胞；
其他材料与设备：新生牛血清和DMEM培养基；
96孔细胞培养板；200μl、1ml无菌枪头；青霉素-链霉素溶液；
200μl、1ml移液器，直尺等。
二氧化碳培养箱、超净工作台、冰箱等。
试验方法
①先用marker笔在6孔板背后，用直尺对齐，均匀得划横线，大约每隔0.5～1cm一道，横穿过孔。
②向6孔板孔中加入浓度为5×104个/ml的MDBK细胞悬液2ml。
③第二天观察到6孔板内细胞均长满单层，用枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕，每孔内划2道。
④用PBS洗细胞3次，洗掉划下的悬浮细胞。
⑤将实施例1、实施例2、对比例1和对比例2中加入适量且等量的纯化水，至蛋白含量与对比例3相同。根据分组往孔中加入1.8ml的无血清培养液，之后加入200μl的供试品，细胞对照孔加入等量的PBS。12孔板中供试品孔与细胞对照孔如下表所示。
⑥放入37度5％CO2培养箱，培养。0时拍照，记录每孔内拍照位置。后续观察时对固定位置进行观察、拍照。
通过对比不同时间同一划痕处细胞迁移数，算出细胞迁移速率，得出结论。
表2促细胞迁移速率结果汇总表
样品配方 实施例1 实施例2 对比例1 对比例2 对比例3
促细胞迁移速率 48％ 47％ 45％ 35％ 50％
本次实验结果表明本发明提供的冻干微芯具有促细胞迁移活性。数据表明，对比例3迁移活性最高，实施例1和实施例2迁移活性略低于对比例3，对比例1和对比例2迁移活性均低于实施例1和实施例2。结果表明，冻干过程会导致配方原液的活性略微降低，但冻干微芯的活性显著优于普通冻干粉。综上，本发明所涉及的冻干微芯具有促细胞迁移的效果。
三、促细胞增殖活性检验
试剂配制
完全培养液 量取小牛血清100ml，加培养液定容至1000ml。
维持培养液 量取小牛血清4ml，加培养液定容至1000ml。
消化液：称取乙二胺四乙酸二钠0.2g、氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.152g、磷酸二氢钾0.2g、胰蛋白酶2.5g，加纯化水溶解并定容至1000ml，过滤除菌。
噻唑蓝(MTT)溶液：称取MTT粉末0.10g，加PBS 20ml使溶解，经0.22μm滤膜过滤除菌。4℃避光保存。
PBS：称取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加纯化水溶解并定容至1000ml，经121℃15分钟灭菌。
细胞株：小鼠皮肤成纤维细胞(BALB/c 3T3细胞)。
试验操作
供试品制备：将实施例1、实施例2、对比例1和对比例2中加入适量且等量的纯化水，至蛋白含量与对比例3相同。取100μl供试品于900μl完全培养液中进行10倍稀释。取1000倍稀释液在96孔细胞培养板中，从1︰2开始依次做2倍递增梯度稀释(具体操作步骤为首先于96孔细胞培养板中加入100μl完全培养液，取50μl 10倍稀释的供试品溶液加入96孔板中第1列，吹打稀释。充分稀释后于第1列孔中抽取50μl于第2列孔，吹打稀释。充分稀释后于第2列孔中抽取50μl于第3列孔，吹打稀释。重复上述操作，直至第10列)，共做10个稀释度(1～10孔)，每个稀释度同时设置一个复孔。
测定方法
①BALB/c 3T3细胞株用完全培养液于37℃、5％二氧化碳培养，控制细胞浓度为每1ml含3.0×104-5.0×104个细胞，传代后24～36小时用于生物学活性测定。
②弃去培养瓶中的培养液，消化和收集细胞用完全培养液配成每1ml含5.0×104～8.0×104个细胞的细胞悬液，接种于96孔板中，接种过程中不停摇匀，保持每孔接种数相同，每孔100μl,于37℃、5％二氧化碳条件下培养。
③24小时后换成维持培养液。置37℃、5％二氧化碳培养24小时。
④制备的细胞培养板弃去维持液，加入标准品溶液和供试品溶液，每孔100μl。置37℃、5％二氧化碳培养24～48小时。
⑤MTT比色法：每孔加入MTT溶液20μl,于37℃、5％二氧化碳培养5小时。以上操作在无菌条件下进行。弃去培养板中的液体后，向每孔中加入DMSO100μl,混匀后在酶标仪上，以630nm为参比波长，570nm为试验波长测定吸光度，记录测定结果。
数据处理
将各个样品及标准品的OD值数据进行四参数拟合。
结果计算
试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。
供试品工作效价计算公式：U＝预稀释倍数*2C(C为四参数方程中C值)
表3促细胞增殖活性结果汇总表
样品配方 实施例1 对比例1 对比例2 对比例3
工作效价(U/ml) 1210 1152 952 1515
本次实验结果表明本发明提供的冻干微芯具有促细胞增长活性。数据表明，对比实施例1工作效价最高，实施例1工作效价略低于对比实施例1，对比例1和对比例2工作效价均低于实施例1。结果表明，冻干过程会导致配方原液的活性略微降低，但是冻干微芯的活性显著优于普通冻干粉。综上，本发明所涉及的组合物具有促细胞增殖的效果。
综上所述，该冻干微芯具有促细胞增殖活性和促细胞迁移活性，且在乳酸刺痛实验中显示具有舒缓刺痛的功效。并且，该配方中丝聚蛋白的加入提升了上述效果。乳酸刺痛实验结果表明，该配方中丝聚蛋白的加入提升了舒缓效果，且舒缓效果与丝聚蛋白存在剂量效应。另外，冻干微芯的制备形式相较于普通的冻干粉，更有效的降低了冻干过程对于重组蛋白的活性损失。
上述参照实施例对一种具有皮肤屏障修复功效的纤连弹性蛋白组合物冻干微芯及其制备方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种具有皮肤屏障修复功效的纤连弹性蛋白组合物冻干微芯，其特征在于，所述冻干微芯包括以下重量百分比的原料：纤连蛋白10-15ppm，血小板衍生生长因子10-15ppm，金属硫蛋白Ⅳ型10-15ppm，弹性蛋白10-15ppm，丝聚蛋白20-40ppm，冻干保护液，余量为水。
2.根据权利要求1所述的具有皮肤屏障修复功效的纤连弹性蛋白组合物冻干微芯，其特征在于，所述冻干保护液的重量百分比为10-15％。
3.根据权利要求1所述的具有皮肤屏障修复功效的纤连弹性蛋白组合物冻干微芯，其特征在于，所述冻干保护液中各原料的重量比如下：甘露醇：甘氨酸：海藻糖＝4-8：4-8：1。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的具有皮肤屏障修复功效的纤连弹性蛋白组合物冻干微芯，其特征在于，所述冻干微芯包括以下重量百分比的原料：纤连蛋白15ppm，血小板衍生生长因子15ppm，金属硫蛋白Ⅳ型15ppm，弹性蛋白15ppm，丝聚蛋白20ppm，甘露醇6％，甘氨酸6％，海藻糖1％，余量为水。
5.根据权利要求1-3任意一项所述的具有皮肤屏障修复功效的纤连弹性蛋白组合物冻干微芯，其特征在于，所述冻干微芯包括以下重量百分比的原料：纤连蛋白10ppm，血小板衍生生长因子10ppm，金属硫蛋白Ⅳ型10ppm，弹性蛋白10ppm，丝聚蛋白40ppm，甘露醇6％，甘氨酸6％，海藻糖1％，余量为水。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的具有皮肤屏障修复功效的纤连弹性蛋白组合物冻干微芯的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将配方量的各原料混合得到混合液；
(2)利用高精度流体分装系统，将混合溶液逐滴滴入存于杜瓦瓶的液氮中冷冻成微芯；
(3)将微芯取出装入西林瓶中，进行冷冻干燥。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，每滴混合溶液的体积为5-60μL。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，每个西林瓶中装入2-20粒冷冻后的微芯。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥具体为：35～45Kpa的真空度下-35-45℃预冻170-190min，并在同样的条件下冻结220～260min，随后在5～15Pa的真空度下进行一期升华干燥及二期升华干燥。
10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述一期升华干燥的程序设计为-34～-38℃保持55～65min，-31～-33℃保持150～200min，-28～-30℃保持400～450min，-20～-27℃保持220～260min，-10～-18℃保持220～260min，-5～-5℃保持100～140min；所述二期升华干燥的程序设计为20～25℃保持280-320min，28～-30℃保持280-320min。
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