KR20140083459A - 보습효과를 가지는 피부 외용제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 감초 추출물 및 금은화 추출물 중 선택된 하나 이상의 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 보습 효능을 가지는 피부외용제 조성물에 관한 것으로서, 인체 피부세포에서 필라그린(filaggrin), 아크아포린-3 (aquaporin-3) 또는 인볼루크린(involucrin)의 발현을 증가시키는 효과를 가지며, 부작용에 대한 우려없이 안전하고 효과적으로 바를 수 있는 기능성 화장품 또는 의약품으로 이용될 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

Description

보습효과를 가지는 피부 외용제 조성물{Skin external composition having remarkable moisturizing effect}

본 발명은 감초 추출물 및 금은화 추출물 중에서 선택된 하나 이상의 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 보습 효능을 가지는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

피부는 외부의 환경과 항상 접하고 있는 기관으로 주로 외부의 물리적 손상 및 화학물질로부터 인체를 보호하고, 세균, 곰팡이, 바이러스 등이 피부로 침범하는 것을 방지하며, 수분 손실을 막는 보호장벽 역할을 한다. 피부의 구조를 보면 표피, 진피, 피하지방의 3개 층으로 구성되고 표피는 3개 층 중 가장 얇은 층으로 피부의 보습 및 보호를 담당하는 중요한 기능을 한다. 특히 표피의 각질층에 존재하는 수분에 의하여 피부가 탄력 있고 부드럽게 되는데, 각질층의 탄력성이 유지되려면 10% 이상의 수분함유가 필수적인 것으로 알려져 있다(OK, Jacobi, About the mechanism of moisture regulation in the horny layer of skin, Proc. Sci. Sec. Toilet Goods Assoc. 31, 22 (1959)).

피부의 수화작용(skin hydration)은 표피에서 진피로의 삼투압에 의한 수분이동과 증발작용에 의한 표피의 수분손실의 평형에 의해서 결정된다. 임상적으로 건성피부는 피부 표면이 건조하고 탄력이 떨어지며, 각질탈리(scaling)가 일어나기 쉽고 거칠다. 또, 가려운 증상이 나타나기도 하고 경우에 따라서는 건조증, 갈라짐 등의 증상이 동반되기도 한다. 표피의 보습수준은 각질세포간 지질, 각질층결합단백질(corneodesmosom), 천연보습인자(natural moisturizing factor: NMF)에 크게 의존한다.

필라그린(filaggrin)은 표피단백질의 일종으로, 피부가 수분과 보습성분을 유지하는 기능을 수행할 뿐 아니라 외부로부터 세균과 독소가 침투하지 못하도록 억제하는데 필수적인 단백질이다. 먼저 필라그린의 전구체인 프로필라그린 (profilaggrin)형태로 분비된 다음 필라그린 단량체(monomer)로 분해되고, 이는 각질층 내에서 케라틴 중간미세섬유를 응집하여 불용성인 케라틴 기질을 형성한다. 이 기질을 뼈대로 하여 각질세포의 세포막 바로 아래에 각화세포피(cornified cell envelope)가 형성된다. 그리고 필라그린은 더 분해되어 친수성 아미노산인 NMF로 분해된다. NMF는 강력한 보습제로서 각질층의 수분공급에 중요한 역할을 하고 각질층의 pH를 낮추어 항균효과를 갖게 한다(Sara J. Brown and W.H. Irwin McLean, One Remarkable Molecule: Filaggrin, J. Invest. Dermatiol., 132, 751 (2012)).

아쿠아포린(aquaporins)은 물 분자만을 선택적으로 통과시키며 모든 세포막에 존재하는 막관통단백질(major intrinsic protein family)로 피부의 수분 흡수를 증가시키는 기작을 통한 보습제로서 연구가 선행된 바 있다. 일반적으로 사람의 경우 1초당 30억 개의 물 분자가 아쿠아포린 단백질을 통해 피부를 통과한다. 포유동물에서는 13가지 종류가 알려져 있고 이들 중 아쿠아포린-3 (aquaporin-3)은 피부의 각질형성세포에서 발현하며 아쿠아포린-3을 통한 물과 글리세롤 흡수와 이동은 세포의 수분 손실을 방지해 피부 탄력을 증가시킨다.

인볼루크린(involucrin)은 인체의 편평상피세포에서 합성되는 일종의 세포질 단백으로 정상 표피에서는 상부 유극층과 과립층에서부터 나타나기 시작하고 합성된 후에는 세포막 가까이에 위치하여 트랜스글루타미다제(trasnglutamidase)에 의해 막단백질에 결합되어 지지체 역할을 하는 각화세포피(cornified cell envelope)의 주요한 구조 구성단백질이다(Eleonora Candi et al., Pro. Natl. Acad. Sci., USA March 95, 2067 (1998); Steiner PM, et al., J. Biol. Chem., Jan 17, 272(3) 2021 (1997)).

현재 의약품이나 화장품에 함유되어 있는 보습제로서는 대개 알콜류, 수용성 고분자 및 유기산염 등이 이용되고 있다(Imokawa G, Abe A, Jin K, Higaki, et al., A decreased level of cermides in straum corneum of atopic dermatitis; an etologic factor in atopic dry skin, J. Invest. Dermatol., 996, 523 (1991)). 그러나 이들 보습용 소재들은 여러 문제점을 가지고 있다. 예로, 수용성 다가 알콜류인 글리세롤, 솔비톨 등은 뛰어난 보습력에 반해 끈적임 등이 있어 사용감이 좋지 않고, 유기산인 젖산 나트륨(Na-lactate) 또는 요소 등은 전해성이 강해 유화안정성을 해치는 등의 문제점을 가지고 있다. 따라서 효능뿐만 아니라 사용감이나 제형 안정화 등에 대한 요구가 여전히 존재한다.

최근에 보습기능성 소재와 관련된 연구는 친환경을 지향하는 추세와 맞물려 생약을 포함한 식물성 원료를 이용하여 여러 가지 형태의 소재 개발연구가 많은 관심을 끌고 있다. 국내 등록특허 제10-0508379호에서는 주목열매로부터 추출한 폴리사카라이드를 함유하는 피부 보습기능성 화장료 조성물을 개시한 바 있고, 국내 공개특허 제1992-0010271호에서는 유산발효원액을 함유하는 피부 보습기능성 화장료 조성물, 등록특허 제10-1125878호에서는 스위트 복합체를 함유하는 피부 보습기능성 화장료 조성물, 등록특허 제10-0193105호에서는 옥죽, 백합 등 생약재 추출액을 함유하는 피부보습제를 개시한 바 있다. 이 밖에도 등록특허 제10-0787312호에서는 쟈스민, 아르니카, 야로우 추출물을 함유한 보습기능성 화장료 조성물을 개시한 바 있으나 본 발명에서 사용한 감초 추출물 또는 금은화 추출물은 상기문헌 어디에서도 개시되거나 암시된 바 없다.

따라서, 본 발명의 목적은 표피의 수분 유지와 관련된 단백질인 필라그린, 아쿠아포린-3 또는 인볼루크린의 발현을 증가시킴으로써 피부 장벽기능의 강화와 천연보습인자 생성을 증가시키고 그 결과 보습, 아토피 개선 등의 효과가 탁월한 피부 외용제 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 상기 목적은 감초 추출물 및 금은화 추출물 중에서 선택된 하나 이상의 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물을 제공함으로써 달성한다.

본 발명에서 보습제 원료로서 사용한 감초(Glycyrrhiza glabra Linne)는 콩과의 여러해살이 초본으로, 한국, 중국, 일본 등지에서 한약의 재료로 널리 이용하고 있는 약용식물이다. 감초는 보비익기(補脾益氣), 윤폐지해(潤肺止咳), 완급지통(緩急止痛)하는 효능이 있어 비위허약, 심허동계(心虛動悸), 맥결대(脈結代), 장조(臟躁), 해천(咳喘), 인후종통(咽喉腫痛), 식물이나 약물 및 농약중독, 완와약성, 조화백약(造化百藥)에 이용되고 있다. 약리작용으로는 진경(鎭痙)작용, 진해(鎭咳)작용, 항염증작용, 항궤양작용, 항알레르기작용, 중추억제작용, 부신피질호르몬작용, 성호르몬작용, 해독작용, 간장해개선작용, 항바이러스작용, interferon 유도작용 등이 밝혀져 있다(전국한의과대학 본초학, 영림사, 서울, 787 (2004); 서부일, 최호영, 임상한방본초학, 영림사, 서울, 787 (2004); 생약학연구회, 현대생약학, 학창사, 서울, 274 (1992)).

또, 금은화(Lonicera japonica Flos)는 인동과의 식물인 인동(Lonicera japonica Thunb .)의 꽃봉오리로 은화, 쌍화, 인동화라고도 한다(전통의학연구소, 동양의학대사전, 성보사, 서울, 309 (2000)). 이 약은 청열해독(淸熱解毒), 양산풍열(凉散風熱)하는 대표적인 약물로 옹종정창(癰腫賽瘡), 후비(喉痺), 단독(丹毒), 열독혈리(熱血毒痢), 풍열감모(風熱感冒), 온병발열(溫病發熱) 등을 치료하는 효과 있어(전국한의과대학 공동표재편찬위원회, 본초학, 영림사, 서울, 242 (2005)), 임상적으로 많은 감염성 질환, 외이도염, 화농증, 중이염과 같은 질환에 효과가 있으며, 바이러스성 결막염, 인플루엔자, 폐렴 등의 염증에 사용되고 있다(Dan Bensky, Andrew Gamble, Chinese herbal medicine, Materia Medica, Eastland Press, Incorporated, 85 (1986); Hyang KC, The Pharmacology of Chinese herbs (2nd Ed.), CRC, 260, 388 (1998)).

본 발명에 따르면, 감초 및 금은화는 각질형성세포에서 필라그린과 아쿠아포린-3의 발현을 증가시킨다. 또한 감초는 인볼루크린 발현도 증가시키는 것을 확인하였다.

본 발명의 구체적인 예에서, 상기 추출물은 물, 에탄올, 메탄올과 같은 친수성 유기용매 또는 이들의 혼합 용매에 의해 추출된 것일 수 있으며, 바람직하게는 80% 에탄올로 추출된 추출물이다. 상기 추출물에 의해 수득되는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 수득되는 건조물 또는 추출액의 조정제물 또는 정제물이다.

본 발명의 조성물은 감초 추출물 및 금은화 추출물 중에서 선택된 하나 이상의 추출물을 그 유효량으로 포함하는 약제학적 조성물 형태로 제조할 수 있으며, 하나 또는 그 이상의 무독성, 약제학적으로 허용 가능한 담체, 보조제 또는 희석액 또는 다른 활성성분을 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체와 부형제를 이용하여 공지의 방법으로 피부 외용제의 형태로 제제화될 수 있다

본 발명에 의한 조성물은 오일 또는 수성매질에서 용액, 현탁액 또는 유화액의 형태가 되거나 사용하기 전에 무균, 발열물질이 제거된 물로 녹여 사용하는 건조분말의 형태가 되어 피부 외용제의 제형으로 제형화될 수 있다.

이 밖에도 본 발명의 조성물은 유화액의 형태로 되어 화장액, 크림 등으로 제형화될 수 있다.

본 발명에 따른 감초 추출물 및 금은화 추출물 중에서 선택된 하나 이상의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 외용제 조성물은 피부세포에서 필라그린, 아쿠아포린-3 또는 인볼루크린 발현을 증가시키는 효과를 갖는다. 본 발명에 따른 피부외용제 조성물은 또한 부작용에 대한 우려 없이 안전하고 효과적으로 바를 수 있는 기능성 화장품 또는 의약품으로 이용될 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 감초 추출물을 HaCaT 각질형성세포에 처리했을 때 세포독성 효과의 유무를 나타내는 그래프이다.
도 2는 금은화 추출물을 HaCaT 각질형성세포에 처리했을 때 세포독성 효과의 유무를 나타내는 그래프이다.
도 3은 감초 추출물 또는 금은화 추출물을 HaCaT 각질형성세포에 처리했을 때 필라그린의 발현을 나타내는 밴드이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것에 불과하며, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 의도되지 않는다.

실시예 1. 감초 추출물 및 금은화 추출물의 제조

본 발명에 따른 추출물은 물, 친수성 유기용매 또는 이들의 혼합용매에 의해 추출하여 제조할 수 있다. 가장 바람직하기로는 80% 에탄올로 추출된 추출물이다.

감초 및 금은화의 중량을 각각 측정하고, 그 중량의 10배의 80% 에탄올을 첨가하고 하루 냉침 추출을 3회 반복하여 그 추출액을 회수하였다. 회수된 추출액을 감압 농축하여 추출물을 제조하였다. 상기 추출물을 DMSO (dimethyl sulfoxide)에 100 mg/mL로 용해시켜 스톡 용액을 제조하여 사용하였다.

상기 [표 1]에 나타난 바와 같이, 본 발명의 실시예 1에 따른 감초 추출물 및 금은화 추출물의 수율은 각각 13.8% 그리고 29.6%로 확인되었다.

실시예 2. 감초 및 금은화 추출물의 세포독성 실험

세포독성 테스트는 Moseman의 방법(Moseman T. J., Immuno. Methods, 65, 55 (1983)) 및 Skaper 등의 방법(Skaper SD, et al., Cell Culture, 2, 17 (1990))을 이용한 MTT(3-4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) 측정법을 이용하여 수행하였다.

인간의 각질형성세포 HaCaT는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank; Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. HaCaT는 10% (V/V) FBS, 페니실린 100 U/mL 및 스트렙토마이신 100 g/mL의 항생제를 포함하는 DMEM 배지를 사용하여 실험실에서 37℃, 5% CO₂ 공급조건을 갖춘 동물세포 배양기에서 배양하였다.

실시예 1에서 수득한 감초 추출물 및 금은화 추출물을 DMSO에 용해시켜 0-100 g/mL로 배양액에 첨가하고, 상기 배양액에서 세포를 24시간 동안 배양하였다. MTT 용액(5 mg/mL)을 처리하여 4시간 더 배양 시킨 다음, 생성된 청색 결정인 포르마잔의 양을 ELISA 판독기를 이용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포에 대한 독성은 각각의 대조구의 평균 흡광도 값에 대한 백분율로 나타냈다.

HaCaT 각질세포에서 감초 추출물 및 금은화추출물의 세포독성을 조사하기 위하여 0-100 g/mL 농도의 감초 추출물 및 금은화 추출물을 처리하였을 때, 대조구인 DMSO만을 처리한 것과 비교하여 세포증식의 변화 정도를 계산하여 세포독성을 조사하였다. 실시예 2의 결과를 도 1과 도 2에 나타내었다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 감초 추출물을 HaCaT 각질형성세포에 처리 했을 때 세포독성 효과의 유무를 보여준다. 감초 추출물 20 g/mL에서 세포 생존율이 88% 이상인 것으로 측정되었다. 따라서 감초 추출물 20 g/mL 이하에서는 세포 독성이 없는 것으로 확인하였다.

도 2는 본 발명의 실시예에 따른 금은화 추출물을 HaCaT 각질형성세포에 처리 하였을 때 세포독성 효과의 유무를 보여준다. 금은화 추출물 50 g/mL에서도 세포 생존율이 77% 이상인 것으로 측정되어 상기 금은화 추출물은 50 g/mL 이하 농도에서는 세포 독성이 없는 것으로 확인하였다.

실시예 3. 감초 및 금은화 추출물의 필라그린 합성 촉진효과 실험

감초 추출물 및 금은화 추출물이 피부 장벽기능과 보습에 중요한 역할을 하는 필라그린의 합성을 증가시키는 효과를 확인하기 위하여 다음과 같이 HaCaT각질세포에 감초 추출물 및 금은화 추출물을 처리한 후 역전사중합연쇄반응(RT-PCR)을 통해 확인하였다.

먼저, 인간의 각질형성세포 HaCaT를 접종하여 24시간 후, 실시예 1의 감초 추출물 및 금은화 추출물을 첨가하여 DMEM 배지, 37℃, 5% CO₂에서 배양하였다. 24시간 배양 후 세포를 회수한 후 RNA를 추출하여 역전사 효소(reverse transcriptase)와 cDNA (complementary DNA)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 스탠다드로 GAPDH를 사용하였다. 아가로즈 겔의 전기영동을 통하여 발현되는 밴드는 이미지 분석(BioRad, Universal Hood , USA )을 통해 측정하였다.

도 3은 본 발명의 실시예 1에 따른 감초 추출물 및 금은화 추출물을 HaCaT 각질세포에 처리 하였을 때 피부 장벽기능과 보습에 중요한 역할을 하는 필라그린의 발현이 대조군에 비해 증가하는 것을 보여주었다.

실시예 4. 감초 및 금은화 추출물의 아쿠아포린 -3 및 인볼루크린 합성 촉진효과 실험

감초 및 금은화 추출물을 피부세포의 장벽 및 보습기능에 중요한 역할을 하는 인볼루크린과 물 이동에 중요한 역할을 하는 아쿠아포린-3의 합성을 증가시키는 효과를 확인하기 위하여 다음과 같이 세포에 감초 추출물 및 금은화 추출물을 각각 처리한 후 웨스턴 블럿팅(western blotting)을 통해 확인하였다.

먼저, 인간의 각질형성세포 HaCaT를 접종하여 24시간 후, 제조예 1의 감초 추출물, 금은화 추출물 그리고 양성대조군으로 EGF(epidermal growth factor)를 각각 첨가하여 DMEM 배지, 37℃, 5% CO₂에서 배양하였다. 24시간 배양 후 세포를 회수한 후 파쇄하여 단백질만을 추출하여 -40℃에 보관하였다. 추출된 단백질은 BCA saasy를 통해 단백질을 정량하였다. 각각의 시료의 단백질량 30 g로 희석한 후 12% SDS-겔에서 전기영동한 후 PVDF membrane으로 옮겼다. 1차 항체(rabbit anti-aquaporins-3 antibody)와 반응 시킨 후 남은 항체를 세척하여 제거하고 2차 항체(rabbit HRP-coupled anti-IgG antibody)와 반응시켰다. 남은 항체를 제거한 후 항체와 반응하여 발색 반응을 일으키는 시약(peroxidase substrate and chromogen solution)을 첨가하였다. 발색된 밴드는 이미지 분석(BioRad, Universal Hood , USA )을 통해 측정하고 수치화 하였다. 실험결과는 하기 [표 2]와 [표 3]에 나타내었다.

[표 2]에 나타난 바와 같이, 본 발명의 실시예 1에 따른 감초 추출물 및 금은화 추출물을 HaCaT 각질세포에 처리 했을 때 물 이동에 중요한 역할을 하는 아쿠아포린-3의 발현이 대조군에 비해 24%, 29% 각각 증가시켜주는 것을 확인할 수 있다.

[표 3]에 나타난 바와 같이, 본 발명의 실시예 1에 따른 감초 추출물을 HaCaT 각질세포에 처리 했을 때 피부 장벽기능과 보습에 중요한 역할을 하는 인볼루크린의 발현이 대조군에 비해 37% 증가시켜주는 것을 확인할 수 있다.

이상의 실험결과를 통하여 본 발명에서 선택한 한약재 추출물은 피부장벽기능과 보습에 뛰어난 효과를 확인할 수 있었으며 이와 같은 효과는 본 실험결과에서 표로 나타내지는 않았으며 각 추출물 부피비 1:1의 혼합물의 경우에도 대동소이한 효과를 나타내었다.

Claims (5)

1. 인체 피부세포에 있어서 필라그린, 아쿠아포린-3 또는 인볼루크린의 생합성 촉진용 감초 추출물.
2. 인체 피부세포에 있어서 필라그린 또는 아쿠아포린-3의 생합성 촉진용 금은화 추출물.
3. 감초 추출물 및 금은화 추출물 중에서 선택된 하나 이상의 추출물을 유효성분으로 함유하는 인체 피부 보습기능성 피부외용제 조성물.
4. 감초 추출물 및 금은화 추출물 중에서 선택된 하나 이상의 추출물을 유효성분으로 함유하는 인체 피부장벽강화 기능성 피부외용제 조성물.
5. 제1항 내지 제4항에 있어서, 상기 추출물은 물, 친수성 유기용매 또는 이들의 혼합용매에 의해 추출된 것이 특징인 인체 피부외용제 조성물.
   
   
   
   

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