CN1857720A - 人细胞纤连蛋白冻干粉制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种人细胞纤连蛋白冻干粉制剂，其含有作为活性成分的人细胞纤连蛋白和/或片断与可药用的辅料制成。本发明还涉及制备这种人细胞纤连蛋白冻干粉制剂的方法。本发明的人细胞纤连蛋白冻干粉制剂为其理论和应用的研究提供了一种稳定性好、能长期保存、使用方便的新剂型。本发明的人细胞纤连蛋白冻干粉制剂不仅可以作为人细胞纤连蛋白的原料进行存贮、运输以及进一步制备成外用或口服制剂应用于临床；而且可以直接作为注射剂使用，用于治疗各种纤连蛋白缺失症等疾病。
Description
技术领域
本发明涉及药物制剂领域，具体而言，本发明涉及一种人细胞纤连蛋白的冻干粉制剂。更具体地说，本发明涉及一种人细胞纤连蛋白和/或其片断为活性成分，与可药用辅料配制成的冻干粉制剂。本发明还涉及制备这种人细胞纤连蛋白冻干粉制剂的方法。
背景技术
人细胞纤连蛋白(Human Cellular Fibronectin)是人体细胞外基质的主要成分之一，为高分子量糖蛋白，由二聚体或多聚体组成，主要为微纤维和无定型的结构，广泛分布于细胞表面、基膜、疏松结缔组织和血管平滑肌周围。人细胞纤连蛋白具有粘附能力，维持细胞的正常结构及生理，维护胞壁的完整性、通透性及组织修复有重要作用，并参与细胞运动，对细胞有趋化性，促进细胞分裂，因此，在胚胎生长发育、肿瘤的发生和转移以及创伤的修复等病理生理过程中具有重要作用。
通过细胞工程技术，进行人工细胞培养，经过提取、纯化可以制备人细胞纤连蛋白。在这一制备过程中通常获得人细胞纤连蛋白的浓缩液，进一步开展理论研究和应用研究。
人细胞纤连蛋白作为一种活性蛋白在常温下是不稳定的，特别是在含水的介质中更容易变性或降解，使其生物活性丧失。在目前的研究中，将人细胞纤连蛋白制成浓缩液，放在4℃低温环境中，其活性只能保持2周左右。因此，人细胞纤连蛋白水溶液不能长期保存，更无法制成水溶液剂供临床使用。然而，在许多场合人细胞纤连蛋白只有在溶液状态下才适合于研究和应用，特别是临床应用，更需要以水溶液的剂型给药。为此，我们将浓缩液进一步制成冻干粉剂，并以冻干粉剂型在低温下长期保存，临用之前再配制成水溶液。这样就能在维持其生物活性的同时，延长人细胞纤连蛋白的保存期。通过研究，我们达到了这一目标，制备出可以长期保存的冻干粉剂。
发明目的
本发明的目的是提供了一种人细胞纤连蛋白冻干粉制剂；
本发明的另一目的是提供了一种制备人细胞纤连蛋白冻干粉制剂的方法；
本发明的另一目的是提供了一种人细胞纤连蛋白冻干粉制剂，不仅可以作为人细胞纤连蛋白的原料进行存贮、运输以及进一步制备成外用或口服制剂的应用；而且可以直接作为注射剂使用。
发明内容
本发明人进行了大量的研究，筛选出人细胞纤连蛋白冻干粉制剂的配方和制备工艺，不仅满足了稳定性好、能长期贮藏、使用方便，并显示出良好的生物活性。由此，完成了本发明。
本发明的人细胞纤连蛋白的冻干粉制剂，含有作为活性成分的人细胞纤连蛋白和/或片断与可药用辅料制成，其中，人细胞纤连蛋白和/或片断在冻干粉制剂中的重量百分比可以是0.1～50％，优选0.5～30％，更优选1～15％，其在制剂中的含量范围是0.1～10mg，优选0.2～2mg；可药用辅料可以是选自氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、枸橼酸、枸橼酸钠、三羟甲基氨基甲烷、磷酸、盐酸或氢氧化钠中的一种或多种，可药用辅料在冻干粉制剂中的含量可以是制剂重量的50～99.9％，优选70～99.5％，更优选85～99％。
本发明的人细胞纤连蛋白冻干粉制剂可以通过下列步骤制备：
a.配制辅料溶液：用注射用水溶解占制剂重量50～99.9％的可药用辅料配制成辅料溶液。
b.配制药物溶液：取占制剂重量的0.1～50％的人细胞纤连蛋白和/或片断，用上述辅料溶液定容到一定的体积。
c.除菌：将药物溶液用除菌滤器过滤除菌。
d.灌装：将除菌的药物溶液无菌灌装到西林瓶中一定的体积。
e.冻干：在低温真空下进行冷冻干燥，抽真空，加塞，扎盖，即得人细胞纤连蛋白冻干粉制剂。
本发明的人细胞纤连蛋白冻干粉制剂的制备方法，其配制辅料溶液所用的可药用辅料可以选自氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、枸橼酸、枸橼酸钠、三羟甲基氨基甲烷、磷酸、盐酸或氢氧化钠中的一种或多种。
本发明的人细胞纤连蛋白冻干粉制剂的制备方法，其制成的冻干粉制剂再溶解后的水溶液具有的pH值范围是6～8，并且具有注射剂适宜的渗透压。
本发明的人细胞纤连蛋白冻干粉制剂为其理论和应用的研究提供了一种稳定性好、能长期保存、使用方便的新剂型。本发明的人细胞纤连蛋白冻干粉制剂不仅可以作为人细胞纤连蛋白的原料进行存贮、运输以及进一步制备成外用或口服制剂应用于临床；而且可以直接作为注射剂使用，用于治疗各种纤连蛋白缺失症，如弥漫性血管内凝(DIC)，大手术后，严重创伤，烧伤或伴重症感染，休克等疾病。
具体实施方式
以制备每瓶含量为1mg的人细胞纤连蛋白冻干粉制剂为例，说明本发明的具体过程和步骤。制备人细胞纤连蛋白冻干粉制剂使用的物料在冻干粉制剂中的重量范围是：
人细胞纤连蛋白 1.0mg
氯化钠 2.0～10.0mg
磷酸二氢钾 2.0～10.0mg
氢氧化钠 适量
配制辅料溶液：取注射用水适量，溶解2～10g的磷酸二氢钾，再用0.1mol/L的氢氧化钠调pH值至6～8，加入并溶解2～10g的氯化钠，用注射用水稀释到一定体积，使磷酸盐的含量为0.05M，氯化钠的含量为0.1M。
配制药物溶液：取含量为1000mg的人细胞纤连蛋白和/或片断的浓缩液，用上述辅料溶液稀释至1000ml，制成1mg/ml的药物溶液。
除菌：将配制的药物溶液以无菌操作法进行微孔滤膜滤器除菌，使用0.22μm微孔滤膜，在压力0.1Mpa以下正压滤过。滤前应先进行起泡点试验，滤后取样进行半成品质量检查，应符合规定。
灌装：在洁净度100级环境中，将合格的除菌药液罐装于清洗干净并灭菌的西林瓶中，每瓶装量1ml，灌装1000支，半加胶塞。
冻干：将灌装的西林瓶放在冻干箱内，在-40℃以下预冻2小时，然后升温至瓶内制品变全白，同时保持一定的真空度，直至冻干结束，最后真空全加塞，轧盖，包装，即得到每瓶含量为1mg的人细胞纤连蛋白冻干粉制剂。
以下实施实例进一步说明本发明。但是，应当理解本发明不以任何方式限于这些实例。
实施例1
人细胞纤连蛋白 0.1～10.0mg
氯化钠 2.0～10.0mg
磷酸二氢钾 2.0～10.0mg
氢氧化钠 适量
实施例2
人细胞纤连蛋白 0.1～10.0mg
氯化钠 2.0～10.0mg
氯化钾 0.1～1.0mg
磷酸氢二钠 1.0～10.0mg
磷酸二氢钾 0.1～1.0mg
实施例3
人细胞纤连蛋白 0.1～10.0mg
氯化钠 2.0～10.0mg
磷酸氢二钠 1.0～10.0mg
磷酸 适量
实施例4
人细胞纤连蛋白 0.1～10.0mg
氯化钠 2.0～10.0mg
三羟甲基氨基甲烷 1.0～10.0mg
盐酸 适量
实施例5
人细胞纤连蛋白 0.1～10.0mg
氯化钠 2.0～10.0mg
磷酸氢二钠 1.0～10.0mg
磷酸二氢钠 1.0～10.0mg
实施例6
人细胞纤连蛋白 0.1～10.0mg
氯化钠 2.0～10.0mg
磷酸氢二钾 1.0～10.0mg
磷酸二氢钾 1.0～10.0mg
通过以下实验说明本发明的有益效果。
实验1人细胞纤连蛋白冻干粉制剂和水溶液剂的稳定性实验
实验目的：比较人细胞纤连蛋白冻干粉制剂和水溶液剂在不同温度下的稳定性。
实验方法：取适量人细胞纤连蛋白提取的浓缩液，用含有0.1mol/L NaCL的pH7.5的0.05mol/L磷酸缓冲液定量稀释制成人细胞纤连蛋白含量为200μg/ml溶液。取上述溶液分装小血清瓶中，每瓶1ml，作为溶液剂样品供使用；另取上述溶液分装小血清瓶中，每瓶1ml，经冷冻干燥制成冻干粉，作为冻干粉制剂样品供使用。分别将人细胞纤连蛋白溶液剂样品和冻干粉制剂样品放在4℃、-20℃环境中，定期测定含量，结果如下表：
表 人细胞纤连蛋白冻干粉制剂和水溶液剂在低温保存中的含量变化(μg/ml)
| 实验温度 | 在4℃环境中 | 在-20℃环境中 | ||
| 实验样品 | 冻干粉剂 | 水溶液剂 | 冻干粉剂 | 水溶液剂 |
| 保存前 | 200 | 200 | 200 | 200 |
| 保存15天 | 205 | 182 | 208 | 201 |
| 保存1个月 | 199 | 0 | 191 | 194 |
| 保存3个月 | 196 | 0 | 198 | 168 |
| 保存6个月 | 189 | - | 195 | 0 |
| 保存12个月 | 177 | - | 202 | 0 |
| 保存18个月 | 169 | - | 202 | - |
| 保存24个月 | 162 | - | 198 | - |
实验结果表明，人细胞纤连蛋白水溶液剂在4℃环境中保存1个月，在-20℃环境中保存6个月已测不出含量；而冻干粉剂在4℃环境中保存24个月含量降低19％，在-20℃环境中保存24个月含量稳定。可以看出本发明的人细胞纤连蛋白冻干粉制剂可以在-20℃环境中保存2年，完全满足人细胞纤连蛋白产品的存贮及应用的要求。
实验2溶血性试验
实验目的：通过溶血和红细胞凝聚反应，判断本发明的人细胞纤连蛋白冻干粉制剂作为注射剂使用时，是否引起免疫性溶血或非免疫性溶血反应，为临床应用提供安全性依据。
实验方法：采用体外试管法评价。
配制红细胞悬液：取新鲜兔血15ml，放入含有玻璃珠的三角瓶中振摇10分钟，除去纤维蛋白原，使成脱纤血液。加入0.9％氯化钠溶液100ml，摇匀，1500r/min离心15分钟，除去上清液，沉淀的红细胞再用0.9％氯化钠溶液按上述方法洗涤2～3次，至上清液不显红色为止。将所得的红细胞用0.9％氯化钠溶液配成2％的混悬液，供试验用。
配制供试品溶液：取含量为2mg的人细胞纤连蛋白冻干粉制剂，用注射用水2ml溶解，制成浓度为1mg/ml的溶液，该浓度为临床使用浓度，作为供试品溶液。
试验方法：取试管7支，编号，按下表加入各种溶液。第6管不加供试品，作为空白对照；第7管不加供试品并用蒸馏水代替生理盐水，作为完全溶血的对照。试管加好后，轻轻摇匀，置37℃的水浴中保温1h后，观察结果并判断。
表 人细胞纤连蛋白冻干粉制剂的溶血试验
| 试管号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| 供试品溶液(ml)生理盐水(ml)红细胞悬液(ml) | 0.12.42.5 | 0.22.32.5 | 0.32.22.5 | 0.42.12.5 | 0.52.02.5 | 2.52.5 | 蒸馏水2.52.5 |
| 观察结果 | 不溶血 | 不溶血 | 不溶血 | 不溶血 | 不溶血 | 不溶血 | 全溶血 |
表中观察结果判断为全溶血，表现为溶液红色、澄明，试管底部无红细胞残留。判断为不溶血，表现为溶液上层无色、澄明，红细胞全部下沉，镜检红细胞不粘集。
溶血试验结果表明人细胞纤连蛋白冻干粉制剂适宜作为静脉注射使用。
实验3刺激性试验
实验目的：通过刺激性试验，判断本发明的人细胞纤连蛋白冻干粉制剂作为注射剂使用时，动物的给药部位是否引起红肿、充血、渗出、变性或坏死等局部反应，为临床应用提供安全性依据。
实验方法：选用家兔股四头肌单次注射给药，并采用同体左右侧自身对比法进行试验。
选取成年健康家兔2只，分别于左侧后肢的股四头肌处注射人细胞纤连蛋白冻干粉制剂1mg(由冻干粉制剂1支，含量为1mg，用1ml注射用水溶解)；左侧后肢的股四头肌处注射生理盐水1ml作为对照，进针以30～45度为宜。注射后48h，观察家兔反应，并放血处死动物，解剖取出股四头肌，纵向切开，观察注射部位肌肉组织的反应。
实验结果，试验组和对照组动物注射部位的肌肉均未出现红肿、充血、渗出、变性或坏死等局部反应，表明人细胞纤连蛋白冻干粉制剂作为注射剂使用时无刺激性。
实验4热源检查
依照中国药典2005年版的热源检查法进行检查，结果表明人细胞纤连蛋白冻干粉制剂所含热源的限度符合规定。
实验5异常毒性检查
依照中国药典2005年版的异常毒性检查法进行检查，结果表明人细胞纤连蛋白冻干粉制剂的异常毒性检查符合规定。
实验6人细胞纤连蛋白冻干粉制剂的外用剂制备
配制外用剂的基质溶液：取注射用水配制pH 6～8、磷酸盐含量为0.05mol/L、氯化钠含量为0.1mol/L的溶液，灭菌，分装血清瓶中备用。
使用时将外用剂的基质溶液2ml注入含量为1mg的人细胞纤连蛋白冻干粉制剂小瓶中，轻轻振摇使溶解，即得到浓度为0.5mg/ml的溶液剂。依据临床需要将上述溶液的一定量喷雾或滴涂到使用部位。该溶液可一次性用完，也可在低温下冷藏一个月内使用。
Claims (8)
1.一种人细胞纤连蛋白的冻干粉制剂，其含有作为活性成分的人细胞纤连蛋白和/或片断与可药用辅料制成，其中，人细胞纤连蛋白和/或片断在冻干粉制剂中的重量百分比可以是0.1～50％，其在制剂中的含量范围是0.1～10mg；可药用辅料可以是选自氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、枸橼酸、枸橼酸钠、三羟甲基氨基甲烷、磷酸、盐酸或氢氧化钠中的一种或多种，可药用辅料在冻干粉制剂中的含量可以是制剂重量的50～99.9％。
2.根据权利要求1的人细胞纤连蛋白冻干粉制剂，其中，人细胞纤连蛋白和/或片断在冻干粉制剂中的重量百分比可以是0.5～30％，可药用辅料在冻干粉制剂中的含量可以是制剂重量的70～99.5％。
3.根据权利要求2的人细胞纤连蛋白冻干粉制剂，其中，人细胞纤连蛋白和/或片断在冻干粉制剂中的重量百分比可以是1～15％，可药用辅料在冻干粉制剂中的含量可以是制剂重量的85～99％。
4.根据权利要求1～3之一的人细胞纤连蛋白冻干粉制剂，其中，人细胞纤连蛋白和/或片断在冻干粉制剂中的含量范围是0.2～2mg。
5.一种制备权力要求1～4之一的人细胞纤连蛋白冻干粉制剂的方法，包括下列步骤：
a.配制辅料溶液：用注射用水溶解占制剂重量50～99.9％的可药用辅料配制成辅料溶液。
b.配制药物溶液：取占制剂重量的0.1～50％的人细胞纤连蛋白和/或片断，用上述辅料溶液定容到一定的体积。
c.除菌：将药物溶液用除菌滤器过滤除菌。
d.灌装：将除菌的药物溶液无菌灌装到西林瓶中一定的体积。
e.冻干：在低温真空下进行冷冻干燥，抽真空，加塞，扎盖，即得人细胞纤连蛋白冻干粉制剂。
6.根据权利要求5的方法，其中，配制辅料溶液所用的可药用辅料可以选自氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、枸橼酸、枸橼酸钠、三羟甲基氨基甲烷、磷酸、盐酸或氢氧化钠中的一种或多种。
7.根据权利要求5和6的方法，其中，人细胞纤连蛋白冻干粉制剂再溶解后的水溶液具有的pH值范围是6～8。
8.根据权利要求5～7的方法，其中，人细胞纤连蛋白冻干粉制剂再溶解后的水溶液具有注射剂适宜的渗透压。
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| CN 200610017527 CN1857720A (zh) | 2006-03-16 | 2006-03-16 | 人细胞纤连蛋白冻干粉制剂及其制备方法 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110393793A (zh) * | 2019-08-28 | 2019-11-01 | 方晓东 | 透皮纤连蛋白冻干粉的制备方法及由该方法制备的透皮纤连蛋白冻干粉 |
| CN114557908A (zh) * | 2022-03-22 | 2022-05-31 | 芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司 | 一种具有皮肤屏障修复功效的纤连弹性蛋白组合物冻干微芯及其制备方法 |
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2006
- 2006-03-16 CN CN 200610017527 patent/CN1857720A/zh active Pending
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