CN113730361A - 黏膜适用的类无针注射效果的外泌体制剂及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种黏膜适用的类无针注射效果的外泌体制剂及制备方法。本发明将间充质干细胞与乳酸菌共培养,收集上清,通过超滤浓缩技术根据分子量依次分离间充质干细胞分泌的细胞因子和外泌体,其中细胞因子经脂质体包封,覆被S层蛋白,然后与外泌体按比例混合,制成冻干粉,进而制备成干粉喷雾剂,该干粉喷雾剂具有类似无针注射的透皮吸收效果,通过阴道黏膜给药,不易流失,可以极大的降低损耗。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种黏膜适用的类无针注射效果的外泌体制剂及制备方法。
背景技术
随着生物大分子药物的发展,如何安全有效的进行药物递送逐渐成为研究热点。口服途径摄入生物大分子,会经消化道分解失效;有针注射则会引发显著组织损伤,且痛感明显,患者顺应性低,不利于药物的日常使用。因此,生物大分子无针注射技术得到广泛关注,该技术在进行药物递送时不借助针头,利用机械装置产生的瞬间高压将药物以液体针的形式瞬间穿过患者的表皮细胞,使药物像水花一样均匀分布在皮下,注射时无明显刺痛,且吸收面积增加。
从不借助针头、使药物均匀分布在皮下这些方面来说,广义的无针注射理应包含透皮给药途径。透皮给药使用方便,用药次数少,避免胃肠道刺激和肝首过效应,且药物毒副作用低。但是,由于黏膜等屏障的存在,生物大分子类药物成分很难直接通过,所以想达到无针注射效果,其关键在于寻找合适的方法来提高药物的透过量。
阴道是由黏膜、肌层和外膜组成的肌性管道,表面存在许多褶皱,提供扩张性,支撑和增加阴道壁的表面积。阴道壁上血管丰富,血流通过会阴静脉丛流向会阴静脉,最终进入下腔静脉,密集的血管网络使阴道能够成为药物传输的有效途径。阴道黏膜给药起效迅速,不仅可直达病灶部位,发挥局部治疗效果,在阴道炎、宫颈炎等疾病的治疗和避孕等方面具有显著优势,还可避免肝脏首过效应,发挥全身治疗作用。但阴道内环境在正常情况下存在多种细菌以一定的比例生长,比如主要菌种之一的乳酸菌,负责维持阴道的酸性环境,保持pH处于4-4.5,防止致病菌在阴道内繁殖;且阴道可分泌黏液自我清洁,黏液的分泌会导致药物流失,减少药物与阴道黏膜的接触时间,降低预期疗效。加上阴道黏膜具有屏障作用,降低了药物的渗透率。因此,增加药物制剂的黏附性、提高药物制剂的渗透效果是阴道黏膜给药制剂研究的重点与难点。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种黏膜适用的类无针注射效果的外泌体制剂及制备方法。
本发明的目的是提供一种黏膜适用的类无针注射效果的外泌体制剂的制备方法,包括以下步骤:
步骤1,干细胞与乳酸菌共培养
以海藻酸钠溶液、CaCl2溶液和乳酸菌为原料,制备乳酸菌-海藻酸钠凝胶球;
将间充质干细胞以4-7×104个/mL的密度接种于培养容器中,然后置于37℃,5%CO2,饱和湿度培养箱中培养1d;
将乳酸菌-海藻酸钠凝胶球以10-30个/mL的比例加入上述含间充质干细胞的培养容器中,37℃,5%CO2,饱和湿度培养箱中共培养1-3d,分别收集上清液和共培养所得乳酸菌-海藻酸钠凝胶球;
步骤2,分离外泌体与细胞因子
步骤1收集的上清液离心去除死细胞,再过滤去除细胞碎片及其它较大粒径的颗粒,最后通过超滤浓缩工艺根据分子量依次分离间充质干细胞分泌的外泌体和细胞因子;
步骤3,制备S层蛋白包被的细胞因子脂质体
将步骤2分离得到的细胞因子复配药物,所得混合溶液注入搅拌状态下的液体磷脂中,然后进行均质处理,得到细胞因子脂质体溶液;
用柠檬酸钠处理步骤1共培养所得乳酸菌-海藻酸钠凝胶球,释放乳酸菌,扩大培养后收集的菌体经氯化锂处理,收集乳酸菌表面的S层蛋白,制得S层蛋白浓缩液;将S层蛋白浓缩液稀释后与细胞因子脂质体溶液混合均匀,混合液于低温静置,得到S层蛋白包被的细胞因子脂质体;
步骤4,制备外泌体-脂质体冻干粉
将步骤2所得外泌体和步骤3所得S层蛋白包被的细胞因子脂质体混合均匀,添加冻干保护剂,得冻干粉原液,冷冻干燥后制成冻干粉。
优选的,上述黏膜适用的类无针注射效果的外泌体制剂,配制质量浓度3-5%的海藻酸钠溶液和质量浓度2-4%的CaCl2溶液,分别灭菌,将乳酸菌加入已灭菌的海藻酸钠溶液中,混合均匀,然后吸取混合液,均匀滴至CaCl2溶液中,液滴表面钙化成球,置于4℃交联4-12h后,用无菌水清洗小球,得到乳酸菌-海藻酸钠凝胶球。
优选的,上述黏膜适用的类无针注射效果的外泌体制剂,所述间充质干细胞为P3-P6代的脐带间充质干细胞。
优选的,上述黏膜适用的类无针注射效果的外泌体制剂,步骤2具体为:
将步骤1收集的上清液于300g、4℃下离心5min去除死细胞,再用0.22μm滤器过滤去除细胞碎片及其它较大粒径的颗粒;所得滤液用截留分子量300K的超滤膜分离外泌体;超滤膜过滤所得滤液(含分子量<300kd的成分)用截留分子量3-50kd的超滤膜分离细胞因子。
优选的,上述黏膜适用的类无针注射效果的外泌体制剂,步骤3中,细胞因子脂质体溶液的具体制备方法如下:将细胞因子复配药物,所得混合溶液注入搅拌状态下的液体磷脂中,注入速度1-4%V/min,液体磷脂搅拌速度800-1000rpm/min,磷脂最终质量浓度0.05-0.5%,完成后继续搅拌5-10min,然后进行均质处理,得到细胞因子脂质体溶液。
优选的,上述黏膜适用的类无针注射效果的外泌体制剂,步骤3中,S层蛋白浓缩液的具体制备方法如下:将所述乳酸菌-海藻酸钠凝胶球用55mmol/L的柠檬酸钠溶液裂解,离心收集乳酸菌,接种至液体培养基中,无氧环境培养1-3d,将菌液在3000rpm转速下离心15min,收集菌体并用PBS缓冲液清洗;向每1g湿重的菌体沉淀中加入15ml的5M氯化锂溶液,常温振荡30min;15000rpm下离心10min后收集上清,置于透析袋中透析,然后浓缩,得到S层蛋白浓缩液;
将S层蛋白浓缩液配置成0.01-0.1mg/mL的溶液,与等体积细胞因子脂质体溶液混合均匀,使S层蛋白与磷脂的质量比为1:5,混合液于4℃放置24h,得到S层蛋白包被的细胞因子脂质体。
优选的,上述黏膜适用的类无针注射效果的外泌体制剂,还包括步骤5,制备黏膜适用的干粉喷雾剂:
得到的冻干粉中添加黏附材料,混合均匀,制备成干粉剂,装入按压式干粉喷雾瓶,即得用于阴道黏膜给药的干粉喷雾剂。
优选的,上述黏膜适用的类无针注射效果的外泌体制剂,所述冻干保护剂为甘露醇和海藻糖;所述黏附材料为壳聚糖和海藻酸钠。
优选的,上述黏膜适用的类无针注射效果的外泌体制剂,冻干粉原液中,总蛋白浓度0.3-1mg/mL,其中外泌体蛋白与脂质体蛋白的质量比为1:10-50,所述冻干保护剂占冻干粉原液质量的10%;所述黏附材料中,壳聚糖和海藻酸钠分别占干粉剂质量的5-20%和1-10%。
本发明还提供了一种由上述黏膜适用的类无针注射效果的外泌体制剂。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
1.在本发明中,干细胞与乳酸菌共培养情况下,乳酸菌可分泌多种成分调节干细胞,促进干细胞针对乳酸菌产生分泌物,因此收集共培养上清,分离所得的细胞因子和外泌体对以乳酸菌为主要菌种之一的阴道黏膜环境有更好的针对性和适应性。
2.在本发明中,从共培养所得上清中分离得到的外泌体和细胞因子可起到黏膜修复效果,最终制备的干粉喷雾剂作为基础剂型,可在此基础上进一步为细胞因子复配多种小分子及多肽药物,然后进行脂质体包封,通过多肽和小分子药物的多种组合,在黏膜修复的基础上极大的丰富干粉喷雾剂的治疗方向,可涉及杀菌,消炎,避孕,抗病毒,调节月经,抑制肿瘤等。
3.因为黏膜的屏障作用和蛋白酶的存在,直接涂抹细胞因子存在吸收率低和失活的缺点,而本发明用脂质体包封细胞因子会起到一定保护作用,同时因其双层膜结构类似细胞膜结构,可增加透皮效果,另外,共培养所得乳酸菌用于提取S层蛋白,包裹脂质体使其作为一个稳定的膜系统存在,极大的增加了其在阴道环境里的稳定性和对黏膜表皮细胞的黏附作用。
4.在本发明中,将所得外泌体和脂质体制成冻干粉,能使细胞因子在常温储存时保持活性,然后添加壳聚糖、海藻酸钠等生物黏附材料,制备成干粉剂,因阴道黏膜存在黏液,该干粉喷雾可以吸收黏液水分迅速溶胀,在黏膜上长时间紧密黏附,延长药物在阴道黏膜的滞留时间,进一步增强透皮吸收能力,达到接近无针注射的效果。干粉颗粒内含的脂质体和外泌体随着干粉溶解,逐渐释放,起到长效缓释作用,减少给药次数,提高患者用药顺应性。
5.因为阴道结构相对封闭,本发明使用的干粉喷雾剂既可以达到类似无针注射的效果,还可以极大的降低浪费,减少气溶胶空气污染,也不像液体制剂那样容易流出。
6.壳聚糖本身具有广谱抗菌的药理活性,本发明用作黏附材料时,可在阴道感染的治疗中起到辅助作用。制剂长期或反复使用的安全性好。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的乳酸菌-海藻酸钠凝胶球;
图2为本发明实施例1所用脐带间充质干细胞;
图3为本发明实施例1制备的S层蛋白包被的细胞因子脂质体粒径检测图;
图4为本发明实施例1制备的干粉剂的类无针注射效果。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施,下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
在本发明的描述中,如未特殊说明,所用试剂均为市售,所用方法均为本领域常规技术。
下述实施例中,干细胞的制备方法如下:
采集新鲜人脐带组织,用体积分数75%酒精快速清洗消毒,转移到超净工作台中无菌操作,用含体积分数2%双抗的生理盐水冲洗5次,去除脐静脉、脐动脉,用有齿镊撕下华通氏胶,剪碎成1mm3大小,将组织块移入细胞培养瓶中,加少量基础培养液,轻轻混匀,让组织块平铺在培养瓶底面,放入37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱进行培养,组织块黏附于瓶底,过夜后增加至正常液量,之后每3d换液,间充质干细胞慢慢从组织块中爬出,待细胞长满90%时,得到第0代脐带间充质干细胞。用0.25g/100mL胰蛋白酶消化,按1:2比例传代培养。
所述双抗为市售的青霉素和链霉素的混合液,青霉素的含量为10000U/ml,链霉素的含量为10mg/ml。
所述基础培养液为α-MEM培养基中添加中体积分数10%的胎牛血清而得。
实施例1
一种黏膜适用的类无针注射效果的外泌体制剂,按照以下步骤制备:
步骤1,干细胞与乳酸菌共培养
1)制备乳酸菌-海藻酸钠凝胶球
配制质量浓度5%的海藻酸钠溶液和质量浓度4%的CaCl2溶液。两种溶液分别于121℃高温高压灭菌20min,然后放入无菌操作台中冷却至室温。
称取适量乳酸菌,放入已灭菌的烧杯中,与海藻酸钠溶液混合均匀,乳酸菌湿重终浓度1%(w/w),用注射器或移液器吸取混合液,均匀滴至CaCl2溶液中,液滴表面钙化成球,直径1-3mm,参见图1。在4℃冰箱中交联4h后,用无菌水清洗小球去除交联剂,得到乳酸菌-海藻酸钠凝胶球,放置在无菌容器中,4℃冰箱内保存。
2)干细胞接种
用上述基础培养液将P5代脐带间充质干细胞以5×104个/mL的密度接种于培养容器中,然后置于37℃,5%CO2,饱和湿度培养箱中培养1d,倒置显微镜下观察,细胞生长状态良好,脐带间充质干细胞形态参见图2。
3)将乳酸菌-海藻酸钠凝胶球以10个/mL的比例加入2)中贴壁培养1d的脐带间充质干细胞的培养容器中,37℃,5%CO2,饱和湿度培养箱中共培养2d,分别收集上清液和共培养所得乳酸菌-海藻酸钠凝胶球,备用。
步骤2,分离外泌体与细胞因子
步骤1的3)收集的上清液于300g、4℃下离心5min去除死细胞,再用0.22μm滤器过滤去除细胞碎片及其它较大粒径的颗粒,最后通过超滤浓缩工艺根据分子量依次分离干细胞分泌的外泌体和细胞因子。
超滤浓缩工艺具体为用截留分子量300kd的超滤膜分离外泌体成分(分子量>300kd),作为外泌体溶液,备用;剩余溶液(含分子量<300kd的成分)用截留分子量3-50kd的超滤膜分离出分子量3-50kd细胞因子,作为细胞因子溶液,备用。
用BCA法分别测定外泌体溶液和细胞因子溶液的蛋白浓度,外泌体溶液中蛋白浓度0.26mg/mL,细胞因子溶液中蛋白浓度0.72mg/mL,-20℃冰箱保存备用。
其中,外泌体为双层膜结构包裹的囊泡,其中含蛋白质、DNA、mRNA等多种细胞内的活性物质;细胞因子均为蛋白质大分子。
步骤3,制备S层蛋白包被的细胞因子脂质体
(1)将步骤2分离得到的细胞因子复配荧光指示剂罗丹明B,将细胞因子溶液与罗丹明B按照100:2的质量比例混合,所得混合溶液缓慢注入搅拌状态下的液体磷脂中,注入速度3%V/min(即,每分钟注入相当于终体积3%的混合溶液),液体磷脂搅拌速度800rpm/min,磷脂最终质量浓度0.5%,完成后继续搅拌5min,然后进行均质处理,得到细胞因子脂质体溶液,该溶液中细胞因子脂质体的粒径范围为50-500nm。涉及荧光指示剂的操作步骤均需避光。
本步骤制备了双层膜结构包裹细胞因子形成的微囊形态的细胞因子脂质体,双层膜结构类似细胞膜结构,可通过相似相溶原理大大增加其包裹的细胞因子等成分的透皮吸收能力,还可将荧光指示剂替换为具有治疗效果的多肽及小分子药物,尤其是具有妇科疾病治疗效果的药物,以增加脂质体内容物的多样性和疾病治疗方向。
(2)收集步骤1的3)中共培养所得乳酸菌-海藻酸钠凝胶球,用55mmol/L的柠檬酸钠溶液裂解,释放出菌种,接种至液体培养基中,无氧环境培养2d,将菌液在3000rpm转速下离心15min,收集菌体并用PBS缓冲液清洗2次。向每1g湿重的菌体沉淀中加入15ml的5M氯化锂溶液,常温振荡30min;15000rpm下离心10min后收集上清,置于截留分子量为14KD的透析袋中透析,收集袋内溶液,然后浓缩,得到S层蛋白浓缩液。BCA法测定提取的S层蛋白浓缩液的浓度,-20℃冰箱保存备用。
将S层蛋白浓缩液配置成0.01mg/mL的溶液,与等体积细胞因子脂质体溶液混合均匀,使S层蛋白与磷脂的质量比为1:5,混合液于4℃放置24h,得到S层蛋白包被的细胞因子脂质体。用Zetasizer nano ZS90纳米粒度仪检测S层蛋白包被后的脂质体的电位为-12.1mV,平均粒径为323.6nm,S层蛋白包被的细胞因子脂质体的粒径范围参见图3。
本步骤提取乳酸菌的S层蛋白,包裹细胞因子脂质体后,增加脂质体的稳定性和细胞黏附作用,进一步增强透皮吸收能力,达到类似无针注射的效果。
步骤4,制备外泌体-脂质体冻干粉
步骤2所得外泌体和步骤3所得S层蛋白包被的细胞因子脂质体混合均匀,总蛋白浓度0.6mg/mL,其中外泌体中蛋白质量:脂质体中蛋白质量=1:14,然后添加甘露醇和海藻糖作为冻干保护剂,混合均匀后得到冻干粉原液,无菌条件下,对冻干粉原液进行除菌过滤,冷冻干燥,得到冻干粉常温贮存备用。所加甘露醇、海藻糖占冻干粉原液的质量比分别为8%、2%,冻干保护剂占冻干粉原液的质量比合计10%。
步骤5,制备黏膜适用的干粉喷雾剂
将步骤4得到的冻干粉中添加水溶性壳聚糖、海藻酸钠,混合均匀,制备成干粉剂,水溶性壳聚糖、海藻酸钠分别占干粉剂的质量百分比为20%、10%;干粉剂装入按压式干粉喷雾瓶,即得用于阴道黏膜给药的干粉喷雾剂。
用雌性小型猪(体重26kg左右)进行动物实验,给药2g,作用6h后处死,解剖取得完整阴道组织,纵向切开,肉眼观察无充血、水肿等异常表现,然后用OTC包埋剂-20℃条件下做组织包埋,立即用于制作冰冻切片,厚度10-15μm。共聚焦显微镜下拍照,可见包埋在脂质体内部的荧光指示剂罗丹明B穿透黏膜到达组织深处,结果见图4,整个实验过程注意避光。
实施例2
一种黏膜适用的类无针注射效果的外泌体制剂的制备方法,包括以下步骤:
步骤1,干细胞与乳酸菌共培养
1)制备乳酸菌-海藻酸钠凝胶球
配制质量浓度3%的海藻酸钠溶液和质量浓度2%的CaCl2溶液。两种溶液分别于121℃高温高压灭菌20min,然后放入无菌操作台中冷却至室温。
步骤1的其余操作参见实施例1,其中将交联时间改为12h。
2)干细胞接种
用上述基础培养液将P3代脐带间充质干细胞以4×104个/mL的密度接种于培养容器中;或者,用上述基础培养液将P6代脐带间充质干细胞以7×104个/mL的密度接种于培养容器中;然后置于37℃,5%CO2,饱和湿度培养箱中培养1d。
3)将乳酸菌-海藻酸钠凝胶球以30个/mL的比例加入2)中贴壁培养1d的脐带间充质干细胞的培养容器中,37℃,5%CO2,饱和湿度培养箱中共培养3d,分别收集上清液和共培养所得乳酸菌-海藻酸钠凝胶球,备用。
步骤2,分离外泌体与细胞因子
参见实施例1的步骤2的操作。
步骤3,制备S层蛋白包被的细胞因子脂质体
(1)将步骤2分离得到的细胞因子复配荧光指示剂罗丹明B,将细胞因子溶液与罗丹明B按照100:2的质量比例混合,所得混合溶液缓慢注入搅拌状态下的液体磷脂中,注入速度1%V/min或者4%V/min(即,每分钟注入相当于终体积1%或者4%的混合溶液),液体磷脂搅拌速度1000rpm/min,磷脂最终质量浓度0.05%,完成后继续搅拌10min,然后进行均质处理,得到细胞因子脂质体,粒径范围为50-500nm。涉及荧光指示剂的操作步骤均需避光。
(2)参见实施例1的步骤(2),区别在于将S层蛋白浓缩液配置成0.1mg/mL的溶液。用Zetasizer nano ZS90纳米粒度仪检测S层蛋白包被后的脂质体的电位为-12mV左右,平均粒径为320nm左右。
步骤4,制备外泌体-脂质体冻干粉
步骤2所得外泌体和步骤3所得S层蛋白包被的细胞因子脂质体混合均匀;总蛋白浓度0.3mg/mL,其中外泌体中蛋白质量:脂质体中蛋白质量1:10;或者,总蛋白浓度1mg/mL,其中外泌体中蛋白质量:脂质体中蛋白质量=1:50;然后添加甘露醇和海藻糖作为冻干保护剂,混合均匀后得到冻干粉原液,无菌条件下,对冻干粉原液进行除菌过滤,冷冻干燥,得到冻干粉常温贮存备用。所加甘露醇、海藻糖占冻干粉原液的质量比分别为8%、2%,冻干保护剂占冻干粉原液的质量比合计10%。
步骤5,制备黏膜适用的干粉喷雾剂
将步骤4得到的冻干粉中添加水溶性壳聚糖、海藻酸钠,混合均匀,制备成干粉剂;水溶性壳聚糖、海藻酸钠分别占干粉剂的质量百分比为5%、1%,或者分别占百分比为10%、5%;干粉剂装入按压式干粉喷雾瓶,即得用于阴道黏膜给药的干粉喷雾剂。
需要说明的是,本发明中涉及数值范围时,应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用,由于采用的步骤方法与实施例相同,为了防止赘述,本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例,但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念,则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以,所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然,本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样,倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内,则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.一种黏膜适用的类无针注射效果的外泌体制剂的制备方法,其特征在于,包括:
步骤1,干细胞与乳酸菌共培养
以海藻酸钠溶液、CaCl2溶液和乳酸菌为原料,制备乳酸菌-海藻酸钠凝胶球;将间充质干细胞与乳酸菌-海藻酸钠凝胶球共培养1-3d,分别收集上清液和共培养所得乳酸菌-海藻酸钠凝胶球;
步骤2,分离外泌体与细胞因子
步骤1收集的上清液离心去除死细胞,再过滤去除细胞碎片及其它较大粒径的颗粒,最后通过超滤浓缩工艺根据分子量依次分离间充质干细胞分泌的外泌体和细胞因子;
步骤3,制备S层蛋白包被的细胞因子脂质体
将步骤2分离得到的细胞因子复配药物,所得混合溶液注入搅拌状态下的液体磷脂中,然后进行均质处理,得到细胞因子脂质体溶液;
用柠檬酸钠处理步骤1共培养所得乳酸菌-海藻酸钠凝胶球,释放乳酸菌,扩大培养后收集的乳酸菌经氯化锂处理,收集菌体表面的S层蛋白,制得S层蛋白浓缩液;将S层蛋白浓缩液稀释后与细胞因子脂质体溶液混合均匀,混合液于低温静置,得到S层蛋白包被的细胞因子脂质体;
步骤4,制备外泌体-脂质体冻干粉
将步骤2所得外泌体和步骤3所得S层蛋白包被的细胞因子脂质体混合均匀,添加冻干保护剂,得冻干粉原液,冷冻干燥后制成冻干粉。
2.根据权利要求1所述的黏膜适用的类无针注射效果的外泌体制剂的制备方法,其特征在于,配制质量浓度3-5%的海藻酸钠溶液和质量浓度2-4%的CaCl2溶液,分别灭菌,冷却,将乳酸菌放入已灭菌的海藻酸钠溶液中,混合均匀,接着吸取混合液,均匀滴至CaCl2溶液中,液滴表面钙化成球,4℃交联4-12h后,用无菌水清洗小球,得到乳酸菌-海藻酸钠凝胶球。
3.根据权利要求2所述的黏膜适用的类无针注射效果的外泌体制剂的制备方法,其特征在于,所述间充质干细胞为P3-P6代的脐带间充质干细胞。
4.根据权利要求3所述的黏膜适用的类无针注射效果的外泌体制剂的制备方法,其特征在于,步骤2具体为:
将步骤1收集的上清液于300g、4℃下离心5min去除死细胞,再用0.22μm滤器过滤去除细胞碎片及其它较大粒径的颗粒;所得滤液用截留分子量300K的超滤膜分离外泌体;超滤膜过滤所得滤液用截留分子量3-50kd的超滤膜分离细胞因子。
5.根据权利要求4所述的黏膜适用的类无针注射效果的外泌体制剂的制备方法,其特征在于,步骤3中,细胞因子脂质体溶液的具体制备方法如下:将细胞因子复配药物,所得混合溶液注入搅拌状态下的液体磷脂中,注入速度1-4%V/min,液体磷脂搅拌速度800-1000rpm/min,磷脂最终质量浓度0.05-0.5%,完成后继续搅拌5-10min,然后进行均质处理,得到细胞因子脂质体溶液。
6.根据权利要求4所述的黏膜适用的类无针注射效果的外泌体制剂的制备方法,其特征在于,步骤3中,S层蛋白浓缩液的具体制备方法如下:将所述乳酸菌-海藻酸钠凝胶球用55mmol/L的柠檬酸钠溶液裂解,收集乳酸菌,接种至液体培养基中,无氧环境培养1-3d,将菌液在3000rpm转速下离心15min,收集菌体并用PBS缓冲液清洗;向每1g湿重的菌体沉淀中加入15ml的5M氯化锂溶液,常温振荡30min;15000rpm下离心10min后收集上清,置于透析袋中透析,然后浓缩,得到S层蛋白浓缩液;
将S层蛋白浓缩液配置成0.01-0.1mg/mL的溶液,与等体积细胞因子脂质体溶液混合均匀,使S层蛋白与磷脂的质量比为1:5,混合液于4℃放置24h,得到S层蛋白包被的细胞因子脂质体。
7.根据权利要求1所述的黏膜适用的类无针注射效果的外泌体制剂的制备方法,其特征在于,还包括步骤5,制备黏膜适用的干粉喷雾剂:
得到的冻干粉中添加黏附材料,混合均匀,制备成干粉剂,装入按压式干粉喷雾瓶,即得用于阴道黏膜给药的干粉喷雾剂。
8.根据权利要求7所述的黏膜适用的类无针注射效果的外泌体制剂的制备方法,其特征在于,所述冻干保护剂为甘露醇和海藻糖;所述黏附材料为壳聚糖和海藻酸钠。
9.根据权利要求8所述的黏膜适用的类无针注射效果的外泌体制剂的制备方法,其特征在于,冻干粉原液中,总蛋白浓度0.3-1mg/mL,其中外泌体蛋白质量:脂质体蛋白质量=1:10-50,所述冻干保护剂占冻干粉原液质量的10%;所述黏附材料占干粉剂质量的6-30%。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法制备的黏膜适用的类无针注射效果的外泌体制剂。
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