CN106591227A - 一种乳酸菌多肽复合物、其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种乳酸菌多肽复合物、其制备方法和应用。所述制备方法包括以下步骤：A、取乳酸菌菌体破碎，释放内容物，并在3500‑5000rpm的转速下离心10‑15分钟，离心后取上清液Ⅰ；B、在步骤A得到的上清液Ⅰ中加入复合蛋白酶进行酶解，在35‑45℃的温度下酶解8‑15小时，酶解后将体系加热至90‑100℃并保持5‑10分钟，取上清液Ⅱ；C、分离回收步骤B得到的上清液Ⅱ中相对分子质量为100‑1000的物质，并冷冻干燥，即可得到乳酸菌多肽复合物。利用所述制备方法得到的乳酸菌多肽复合物，能够应用于干细胞培养体系，并能够提高间充质干细胞的增殖效率，有重要的科学价值和社会经济效益。

Description

一种乳酸菌多肽复合物、其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种乳酸菌多肽复合物、其制备方法和应用。
背景技术
间充质干细胞维持着人体各组织中的新陈代谢。一方面它们不断地分裂增殖分化成为功能性细胞，替换掉衰老的功能性细胞，实现了组织的自我更新；另一方面，在组织受到损伤时，干细胞又及时通过增殖分化，修复损伤。但是随着年龄的增长和刺激因素的积累，体内间充质干细胞渐渐出现衰老，数量也有所减少。通过体外培养的间充质干细胞，能够在需要的时候回输到人体，发挥修复和抗衰老的作用。
间充质干细胞在培养过程中，能够实现一定量的扩增。但是由于对间充质干细胞生长条件目前还没有完全阐述清楚，导致培养条件仍有缺陷。比如，在干细胞的扩增过程当中，干细胞往往出现衰老迹象，干性消失，功能受损，而生长速度也会减缓。
因此改善间充质干细胞的培养系统，促进间充质干细胞的增殖和干性维持，对促进干细胞生物学研究和再生医学研究有重要意义。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种乳酸菌多肽复合物、其制备方法和应用。利用所述制备方法得到的乳酸菌多肽复合物，能够应用于干细胞培养体系，并能够提高间充质干细胞的增殖效率，有重要的科学价值和社会经济效益。
本发明所采用的技术方案为：一种乳酸菌多肽复合物的制备方法，包括以下步骤：
A、取乳酸菌菌体破碎，释放内容物，并在3500-5000rpm的转速下离心10-15分钟，离心后取上清液Ⅰ；
B、在步骤A得到的上清液Ⅰ中加入复合蛋白酶进行酶解，在35-45℃的温度下酶解8-15小时，酶解后将体系加热至90-100℃并保持5-10分钟，取上清液Ⅱ；
C、分离回收步骤B得到的上清液Ⅱ中相对分子质量为100-1000的物质，并冷冻干燥，即可得到乳酸菌多肽复合物。
所述乳酸菌多肽复合物的形态为冻干粉，便于保存和使用。
为保证使乳酸菌菌体充分破碎，优选的技术方案是，步骤A中，取乳酸菌菌体加入质量分数为2％的NaCl溶液重悬成质量分数为25-35％的混合物，加热至90-110℃，保持5-15分钟，然后在35-45MPa的压强下均质破碎。
为了得到相对分子质量为100-1000的物质，本发明采取以下三种方案中的一种：
步骤C中，使用凝胶层析柱分离回收步骤B得到的上清液Ⅱ中相对分子质量为100-1000的物质。
或者，步骤C中，使用截留分子量为100-1000的透析袋对步骤B得到的上清液Ⅱ进行分离回收。
再或者，步骤C中，使用100-1000分子量的醋酸纤维素膜对步骤B得到的上清液Ⅱ进行超滤浓缩。
以上三种方案均有操作简便，效果可靠的优点。
根据本发明的一个实施例，冷冻干燥时的压强为5-13Pa，在-20℃下保持60-84小时。
本发明还提供了一种乳酸菌多肽复合物，所述乳酸菌多肽复合物由上述制备方法制备而成。
本发明还公开了所述乳酸菌多肽复合物在培养间充质干细胞中的应用。
所述乳酸菌多肽复合物能够作为添加剂添加至间充质干细胞培养基中，能够提高间充质干细胞的增殖效率。一般来说，所述乳酸菌多肽复合物在间充质干细胞培养基中的添加量为0.1-5％。
所述间充质干细胞来取自皮肤、脂肪、毛囊、骨髓、脐血、脐带、胎盘或牙龈。
本发明提供了一种乳酸菌多肽复合物、其制备方法和应用。利用所述制备方法得到的乳酸菌多肽复合物，能够应用于干细胞培养体系，并能够提高间充质干细胞的增殖效率，有重要的科学价值和社会经济效益。
附图说明
图1为应用本发明制备的乳酸菌多肽复合物培养细胞后细胞的增殖情况结果图；
图2为干细胞干性基因的表达图。
具体实施方式
下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1
一种乳酸菌多肽复合物的制备方法，包括以下步骤：
A、取乳酸菌菌体加入质量分数为2％的NaCl溶液重悬成质量分数为25％的混合物，加热至110℃，保持5分钟，然后在45MPa的压强下均质破碎，释放内容物，并在3500rpm的转速下离心15分钟，离心后取上清液Ⅰ；
B、在步骤A得到的上清液Ⅰ中加入复合蛋白酶进行酶解，在35℃的温度下酶解15小时，酶解后将体系加热至90℃并保持10分钟，取上清液Ⅱ；
C、使用凝胶层析柱分离回收步骤B得到的上清液Ⅱ中相对分子质量为100-1000的物质，并冷冻干燥，即可得到乳酸菌多肽复合物，冷冻干燥时的压强为5Pa，在-20℃下保持60小时。
实施例2
一种乳酸菌多肽复合物的制备方法，包括以下步骤：
A、取乳酸菌菌体加入质量分数为2％的NaCl溶液重悬成质量分数为35％的混合物，加热至90℃，保持15分钟，然后在35MPa的压强下均质破碎，释放内容物，并在5000rpm的转速下离心10分钟，离心后取上清液Ⅰ；
B、在步骤A得到的上清液Ⅰ中加入复合蛋白酶进行酶解，在45℃的温度下酶解8小时，酶解后将体系加热至100℃并保持5分钟，取上清液Ⅱ；
C、使用截留分子量为100-1000的透析袋对步骤B得到的上清液Ⅱ进行分离回收，并冷冻干燥，即可得到乳酸菌多肽复合物，冷冻干燥时的压强为8Pa，在-20℃下保持84小时。
实施例3
一种乳酸菌多肽复合物的制备方法，包括以下步骤：
A、取乳酸菌菌体加入质量分数为2％的NaCl溶液重悬成质量分数为30％的混合物，加热至100℃，保持10分钟，然后在40MPa的压强下均质破碎，释放内容物，并在4200rpm的转速下离心12分钟，离心后取上清液Ⅰ；
B、在步骤A得到的上清液Ⅰ中加入复合蛋白酶进行酶解，在40℃的温度下酶解11小时，酶解后将体系加热至95℃并保持7分钟，取上清液Ⅱ；
C、使用100-1000分子量的醋酸纤维素膜对步骤B得到的上清液Ⅱ进行超滤浓缩，并冷冻干燥，即可得到乳酸菌多肽复合物，冷冻干燥时的压强为13Pa，在-20℃下保持72小时。
实施例4
本实施例为所述乳酸菌多肽复合物的应用。
将实施例3制得的乳酸菌多肽复合物按体积比1：100与细胞培养液(DMEM，10％FBS，10ng/mL bFGF)混合，制得干细胞培养基。
利用所述干细胞培养基对脐血间充质干细胞进行培养，作为实验组；并用所述细胞培养液作为对照组。隔天换液，当细胞达到90％融合时，胰酶消化后，进行传代。每次传代时计数，并作记录。
实验组(含乳酸菌多肽复合物的干细胞培养基)和对照组的细胞增殖情况如图1所示，从图中能够看出，添加乳酸菌多肽复合物后，细胞增殖速度有显著提高。
为分析干细胞干性，从第九代细胞中分离提取蛋白质，采用Western blot检测干细胞干性基因的表达，结果如图2所示，从图中能够看出，添加乳酸菌多肽复合物后，干细胞干性基因Oct4表达量明显高于对照组。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种乳酸菌多肽复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、取乳酸菌菌体破碎，释放内容物，并在3500-5000rpm的转速下离心10-15分钟，离心后取上清液Ⅰ；
B、在步骤A得到的上清液Ⅰ中加入复合蛋白酶进行酶解，在35-45℃的温度下酶解8-15小时，酶解后将体系加热至90-100℃并保持5-10分钟，取上清液Ⅱ；
C、分离回收步骤B得到的上清液Ⅱ中相对分子质量为100-1000的物质，并冷冻干燥，即可得到乳酸菌多肽复合物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤A中，取乳酸菌菌体加入质量分数为2％的NaCl溶液重悬成质量分数为25-35％的混合物，加热至90-110℃，保持5-15分钟，然后在35-45MPa的压强下均质破碎。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤C中，使用凝胶层析柱分离回收步骤B得到的上清液Ⅱ中相对分子质量为100-1000的物质。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤C中，使用截留分子量为100-1000的透析袋对步骤B得到的上清液Ⅱ进行分离回收。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤C中，使用100-1000分子量的醋酸纤维素膜对步骤B得到的上清液Ⅱ进行超滤浓缩。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，冷冻干燥时的压强为5-13Pa，在-20℃下保持60-84小时。
7.一种乳酸菌多肽复合物，其特征在于，由权利要求1-6任一所述的制备方法制备而成。
8.权利要求7所述的乳酸菌多肽复合物在培养间充质干细胞中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述乳酸菌多肽复合物在间充质干细胞培养基中的添加量为0.1-5％。
10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞来取自皮肤、脂肪、毛囊、骨髓、脐血、脐带、胎盘或牙龈。
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