CH710157A2

CH710157A2 - Zusammensetzung zum Erhöhen der Proliferation von Hautpapillenzellen und die pharmazeutische Kombination und das Herstellungsverfahren davon.

Info

Publication number: CH710157A2
Application number: CH01485/15A
Authority: CH
Inventors: Tsai Cheng-Hsien; Sieber Martin
Original assignee: Bionet Copr
Priority date: 2014-10-14
Filing date: 2015-10-14
Publication date: 2016-04-15
Also published as: JP2016079177A; TW201613621A; CN105505851A; CH710157B1; KR20160043922A

Abstract

Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung zur Vergrösserung der Proliferation von Hautpapillenzellen bereit. Die Zusammensetzung wird erhalten basierend auf dem Kultivieren von Zellen, für eine bestimmte Anzahl an Tagen, auf einem serumfreien Medium, um Zytokine zu erhalten. Die gewonnenen Zellen werden beschädigt unter Verwendung von multiplen Gefrier-Auftau-Zyklen, um eine grössere Menge an Polypeptidmischungen zu erhalten, welche weiter konzentriert und entsalzt werden, um eine Zusammensetzung mit spezifischen Molekulargewichten zu erhalten, wobei die Zusammensetzung eine, die Proliferation von Hautpapillenzellen, mit einer erhöhten Rate von ungefähr 5% bis 50%, vergrössernde Wirkung besitzt.

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. Gebiet der Erfindung

[0001] Die vorliegende Erfindung betrifft ein Herstellungsverfahren einer Zusammensetzung zur Vergrösserung der Proliferation von Hautpapillenzellen und insbesondere ein Herstellungsverfahren, um eine Zusammensetzung zu erhalten, die bestimmte Bestandteile aus der Gewebekultur von fibroblastartigen Zellen eines Nabelschnurgewebes enthält. Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Zusammensetzung zur Vergrösserung der Proliferation von Hautpapillenzellen, wobei die Zusammensetzung eine die Proliferation von Hautpapillenzellen vergrössernde Wirkung besitzt. Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Kombination, die eine wirksame Menge der zuvor genannten Zusammensetzung beinhaltet, um die, die Proliferation von Hautpapillenzellen vergrössernde, Wirkung zu erreichen.

2. Beschreibung verwandter Technik

[0002] In Betracht der konventionellen Technologien werden die Wachstumsfaktoren, wie Stern Cell Factor (SCF, Stammzellfaktor), Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF, vaskulär-endothelialer Wachstumsfaktor), Epidermal Growth Factor (EGF, epidermaler Wachstumsfaktor) und Insulin-like Growth Factor (IGF, insulinähnlicher Wachstumsfaktor), durch ein Verfahren, wie das Kultivieren von Epithelzellen und mesenchymalen Stammzellen, gewonnen. Die konventionellen Verfahren benötigen graduell abnehmende Temperaturen für das übliche Einfrieren, welches zeitaufwändig ist. Des Weiteren können die in einem nachgehenden Kultivierungsprozess in den Medien enthaltenen Salze Reizung von Haut und Haar auslösen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

[0003] Ohne die Vorteile der Verwendung des Gefrier-Auftau-Zyklus-Verfahrens und dem gleichzeitigen Konzentrieren und Entsalzen zu nutzen, ist die Produktionsausbeute niedrig und der Prozess ist mühsam und zeitaufwändig, wenn die konventionellen Technologien verwendet werden. Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin ein Herstellungsverfahren für eine Zusammensetzung zum Vergrössern der Proliferation von Hautpapillenzellen bereit zu stellen, wobei das Verfahren einen Prozess, der Flüssigstickstoff-Gefrier-Auftau-Zyklen verwendet, um Zellen zu beschädigen mit dem Zweck Zelllysat zu sammeln, resultierend in einer gesteigerten Ausbeute einer Polypeptidmischung (oder eines Proteincocktails), einschliesst. Ein Konzentrations- und Entsalzungsprozess wird verwendet, um eine Zusammensetzung mit einem spezifischen Molekulargewicht zu erhalten.

[0004] Um die zuvor genannte Aufgabe zu erfüllen, stellt die vorliegende Erfindung ein Herstellungsverfahren für eine Zusammensetzung zum Vergrössern der Proliferation von Hautpapillenzellen bereit, wobei das Verfahren umfasst: Bereitstellen eines Schweine-Nabelschnur-Gewebes; Waschen des Schweine-Nabelschnur-Gewebes mit einer Waschlösung, um Blutzellen und Körperflüssigkeit von dem Schweine-Nabel schnür -Gewebe zu entfernen; Isolieren von Zellen aus dem Schweine-Nabelschnur-Gewebe zum Sub-Kultivieren, um Zytokine zu erhalten; Unterziehen der Zellen und der Zytokine mindestens zweier Gefrier-Auftau-Zyklen, um eine Polypeptidmischung zu erhalten; Konzentrieren und Entsalzen der Polypeptidmischung, um die Zusammensetzung zu erhalten, wobei das Molekulargewicht der Zusammensetzung grösser als 3000 Da (Dalton) ist.

[0005] Gemäss der vorliegenden Erfindung bezieht sich «die Waschlösung» auf eine isotonische Lösung des Schweine-Nabelschnur-Gewebes. Bevorzugt ist die Waschlösung eine 90% Natriumchlorid-Lösung oder phosphatgepufferte Salzlösung (PBS).

[0006] Gemäss der vorliegenden Erfindung bezieht sich «Zellen Isolieren» auf das Schneiden der Schweine-Nabelschnur in kleine Stücke als Nabelschnurfragmente und das Platzieren von 4 bis 6 Nabelschnurfragmenten in eine Kulturschale, welche 10 ml Wachstumsmedium (mit α-MEM und 10% fetalem Kälberserum (FBS)) enthält. Die Kulturschale wird dann in einem Behälter mit konstanter Temperatur platziert, um für 10 Tage unter der Zugabe von 3 ml Kulturmedium zweimal pro Woche zu kultivieren, um Zellen zu erhalten, und danach werden die Nabelschnürfragmente entfernt, wobei sich der Behälter mit konstanter Temperatur auf einen CO2-Inkubator (mit 5% CO2) bezieht.

[0007] Gemäss der vorliegenden Erfindung bezieht sich «Sub-Kultivieren» auf das Reduzieren von Zelldichte, um das Zellwachstum aufrechtzuerhalten, wozu Zellen bei der höchsten Dichte des Zellwachstums gesammelt und die Zellen anschliessend verdünnt werden, um eine neue Kulturschale zu beimpfen. Das Verdünnungsverhältnis ist abhängig von den Zellarten.

[0008] Gemäss der vorliegenden Erfindung beziehen sich «Gefrier-Auftau-Zyklen» auf das Platzieren der Zellen und der Zytokine in flüssigen Stickstoff zum Einfrieren, und das anschliessende Platzieren der Zellen bei Raumtemperatur zum Auftauen, in sich widerholenden Zyklen, um die Wirkung des Beschädigens der Zellmembran zu erreichen. Wie in den Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dargestellt, wird ein kryogenes Fläschchen mit den Zellen direkt in flüssigen Stickstoff eingetaucht, anschliessend wird das kryogene Fläschchen mit den Zellen aus dem flüssigen Stickstoff entfernt und, um aufzutauen in ein 37 °C warmes Wasserbad platziert. Die zuvor genannten Schritte werden über mindestens 2 Zyklen wiederholt. Die beschädigten Zellen werden für 15 bis 20 Minuten bei 1000 G zentrifugiert.

[0009] Gemäss der vorliegenden Erfindung bezieht sich «Konzentrieren und Entsalzen» auf das Platzieren der Polypeptidmischung in ein Filtriergerät und das anschliessende Aussetzen des Filtriergeräts einer Zentrifugation, um Überstand zu entfernen, das Konzentrieren der Polypeptidmischung und das Entfernen der Salze zu erreichen. Wie in den Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dargestellt, wird die Polypeptidmischung in einem Ultra-Filtriergerät oder in eine Zentrifugationsapparatur platziert, um die Konzentration der Polypeptidmischung zu erhöhen und Verunreinigungen (z.B. Salze und der Gleichen) zu entfernen. Anschliessend wird eine Zusammensetzung erhalten, die ein Molekulargewicht von grösser 3000 Da (Dalton) hat.

[0010] Bevorzugt beinhaltet die Zusammensetzung einen oder mehrere Bestandteile ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Angiogenin, Platelet-derived Growth Factor (PDGF, Wachstumsfaktor aus den Blutplättchen stammend), Fibroblast Growth Factor 7 (FGF7, Fibroblastenwachstumsfaktor 7) und einer Kombination davon.

[0011] Im Schritt des Isolierens von Zellen aus dem Schweine-Nabelschnur-Gewebe zum Sub-Kultivieren, um Zytokine zu erhalten, ist es bevorzugt die isolierten Zellen auf einem serumfreien Medium für 3 bis 18 Tage zu kultivieren, um die Zytokine zu erhalten.

[0012] Im Schritt des Isolierens von Zellen aus dem Schweine-Nabelschnur-Gewebe zum Sub-Kultivieren, um Zytokine zu erhalten, ist es bevorzugt die isolierten Zellen auf einem serumfreien Medium für 6 Tage zu kultivieren, um die Zytokine zu erhalten.

[0013] Gemäss der vorliegenden Erfindung bezieht sich «Schweine-Nabelschnur-Gewebe» auf das Nabelschnurgewebe, welches aus einem spezifisch pathogenfreien (SPF) Schwein gewonnen wird.

[0014] Die vorliegende Erfindung stellt weiter eine aus dem zuvor genannten Herstellungsverfahren gewonnene Zusammensetzung bereit, wobei die Zusammensetzung eine die Proliferation von Hautpapillenzellen vergrössernde Wirkung besitzt.

[0015] Gemäss der vorliegenden Erfindung bezieht sich «Vergrössern der Proliferation von Hautpapillenzellen» auf die Darstellung in den Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, wonach die Wirkung der Zusammensetzung zu einer erhöhten Wachstumsrate der Hautpapillenzellen um 5% bis 50%, verglichen mit dem Beginn des Versuchs oder der Kontrollgruppe, führt.

[0016] Die vorliegende Erfindung stellt weiter eine pharmazeutische Kombination bereit, welche eine wirksame Menge an. der zuvor genannten Zusammensetzung und ein pharmazeutisch akzeptiertes Lösemittel und/oder einen Träger daraus enthält.

[0017] Bevorzugt ist die zuvor genannte wirksame Menge der Zusammensetzung in einem Bereich von 0.05 ng/ml bis 20 ng/ml.

[0018] Gemäss der vorliegenden Erfindung beziehen sich «pharmazeutisch akzeptierte Lösemittel und/oder Träger» auf jegliches Lösemittel, welches zur oralen Gabe oder zur äusserlichen Anwendung bei Mensch oder Tier verwendet werden kann, wie zum Beispiel Alkohol-Wasser Co-Lösemittel, Wasser und physiologische Salzlösung. Bevorzugt ist das pharmazeutisch akzeptierte Lösemittel und/oder der Träger Wasser oder physiologische Salzlösung. Die Menge des zugegebenen Lösemittels basiert auf dem Erhalt der Wirkung der Menge an Zusammensetzung.

[0019] Das Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung basiert auf dem Kultivieren von Zellen für eine bestimmte Anzahl an Tagen in einem serumfreien Medium, um Zytokine zu erhalten. Die Zellen werden durch wiederholtes Verwenden von Gefrier-Auftau-Zyklen beschädigt, um eine grössere Menge Polypeptidmischungen zu erhalten, welche weiter konzentriert und entsalzt werden, um eine Zusammensetzung mit einem spezifischen Molekulargewicht zu erhalten, wobei die Zusammensetzung eine die Proliferation von Hautpapillenzellen vergrössernde Wirkung besitzt, mit einer erhöhten Wachstumsrate von Hautpapillenzellen um 5% bis 50% verglichen mit dem Beginn des Versuchs.

KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN

[0020] <tb>Fig. 1A<SEP>zeigt Bilder des Übergangs zwischen Stirn und Haaransatz einer Testperson am Tag 0 des Versuchs, durch Anwenden der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung die Proliferation von Hautpapillenzellen zu vergrössern. <tb>Fig. 1B<SEP>zeigt Bilder des Übergangs zwischen Stirn und Haaransatz einer Testperson nach ungefähr 2 Monaten (d.h. am sechzigsten Tag) des Versuchs, durch Anwenden der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung die Proliferation von Hautpapillenzellen zu vergrössern.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

[0021] Die folgenden spezifischen Beispiele werden verwendet, um die vorliegende Erfindung zu veranschaulichen. Ein Fachmann kann sich ohne weiteres die weiteren Vorteile und Wirkungen der vorliegenden Erfindung denken. Die vorliegende Erfindung kann auch für andere spezifische Fälle, die für die Anwendung zugelassen werden, angepasst werden. Die Details der Anweisungen können auch auf unterschiedlichen Blickwinkeln und Verwendungen basiert werden, mit verschiedenen Modifikationen und Änderungen, die nicht vom Geist der vorliegenden Erfindung abweichen.

BEISPIEL

Herstellungsbeispiel 1: Isolieren von Zellen aus Schweine-Nabelschnur

[0022] Eine Schweine-Nabelschnur wurde bezogen. Die Schweine-Nabelschnür wurde für 20 bis 30 Sekunden mit 75% Ethanol gewaschen und wurde anschliessend mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen. Dann wurde die Schweine-Nabelschnur in 3 bis 4 gleichgrosse Stücke gewürfelt und in eine sterilisierte Kulturschale platziert. Die Nabelschnur wurde mittels eines Skalpells oder einer Pinzette entlang der Nabelvene geöffnet. Zwei Pinzetten wurden verwendet, um die Nabelschnur zu ziehen und zu öffnen. Die Arterien wurden vorsichtig von der Nabelschnur entfernt ohne Blut auf die Wharton-Sulze (d.h. ein gallertartiges Verbindungsgewebe innerhalb der Nabelschnur) zu spritzen. In der Zwischenzeit wurden auch die Venen entfernt. Der Wharton-Sulze-Block wurde vom Schnur-Amnion entfernt und in einer frischen Kulturschale platziert, welche α-MEM enthielt, um es feucht zu halten. Anschliessend wurde die Schweine-Nabelschnür in kleine Stücke in Form von Nabelschnurfragmenten durch Verwenden von chirurgischen Scheren gewürfelt, und 4 bis 6 Nabelschnurfragmente wurden in eine Kulturschale platziert, welche 10 ml Wachstumsmedium (mit α-MEM und 10% fetalem Kälberserum (FBS)) enthielt. Die Kulturschale wurde dann in einen CO2-Inkubator (mit 5% CO2) platziert, wobei zweimal pro Woche 3 ml Kulturmedium zugegeben wurde. Anschliessend wurden die Nabelschnurfragmente nach 10 Tagen entfernt, und die Schale wurde mit PBS gewaschen und wieder mit frischen Medien gefüllt. Die Zellen wurden bis zum Erreichen von 80% bis 90% Konfluenz wachsen gelassen und dann für die Zellproliferation sub-kultiviert.

Herstellungsbeispiel 2: Sub-Kultivieren von Zellen

[0023] Ein Vakuum wurde verwendet um die Medien zu entfernen. Die Zellen in der Schale wurden mit 5 ml PBS gewaschen. Das PBS wurde dann entfernt. Anschliessend wurden 3 ml einer 0.25% Trypsin-EDTA-Lösung zu jeder Kulturschale zugegeben. Die Kulturschalen wurden bei 37 °C für 5 Minuten inkubiert. Die isolierten Zellen wurden in einem 15-ml-Zentrifugationsröhrchen gesammelt, um für 5 Minuten bei 400 G zentrifugiert zu werden, und dann wurde der Überstand entfernt. Anschliessend wurde 2 ml Medium zum Röhrchen zugegeben und die Zellen wurden mittels einer Pipette resuspendiert. 10 µl Zellsuspension wurden entnommen und mit 10 µl Trypanblau gemischt, um die Zellanzahl mittels eines automatischen Zellzählers zu zählen.

Herstellungsbeispiel 3: Herstellung von Zytokinen

[0024] Um Zytokine zu erhalten, wurden die im Herstellungsbeispiel 2 hergestellten Zellen in Kulturschalen eingeimpft, um die Zellen bis zu einer Dichte von 3 x 105 bis 7x 105 Zellen pro Schale wachsen zu lassen. Die Zellen wurden bei 37 °C in einem CO2-Inkubator unter Wechseln der Medien (zweimal pro Woche, d.h. ungefähr alle 3-4 Tage) kultiviert, bis das Zellwachstum 90% Konfluenz erreicht hatte.

[0025] Wenn das Zellwachstum 90% Konfluenz erreicht hat, wurden die Zellen zweimal mit 5 ml PBS gewaschen. Dann wurde 8 ml serumfreies Medium zu jeder Kulturschale zuggegeben. Die Schalen wurden bei 37 °C in einem CO2-Inkubator für 6 Tage inkubiert, um Zytokine zu erhalten.

Herstellungsbeispiel 4: Sammeln von Polypeptidmischungen

[0026] Manche Zytokine wurden in die Kulturmedien freigesetzt und andere blieben in den Zellen. Die Kulturmedien wurden gesammelt. Die adhärenten Zellen wurden mit 3 ml 0.2% Trypsin-EDTA-Lösung bei 37 °C für 5 Minuten behandelt, und dann für die Zentrifugation bei 40 G für 5 Minuten gesammelt. Der Überstand wurde entfernt. Die durch Zentrifugation präzipitierten Zellen wurden einmal mit 10 ml PBS gewaschen. Die Zellen wurden erneut zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen, und wurden dann in 3 ml PBS resuspendiert. Die Zellsuspensionen wurden in kryogene Röhrchen überführt. Die kryogenen Röhrchen mit den Zellen wurden direkt in flüssigen Stickstoff eingetaucht und dann in einem Wasserbad bei 37 °C aufgetaut. Der zuvor genannte Gefrier-Auftau-Zyklus wurde zweimal wiederholt, um die Zellen zu zerstören. Die aufgebrochenen Zellen wurden bei 1000 G für 15–20 Minuten zentrifugiert. Die gesammelten Überstände und Zelllysate wurden gemischt, um die Mischungen aus Polypeptid, welches für die Gesamtausbeute berücksichtigt wurde, zu erhalten. Die Konzentrationen der Überstände oder der Polypeptid beinhaltenden Mischungen wurden mittels ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) gemessen.

Herstellungsbeispiel 5: Messen der Konzentration der Polypeptidmischung und Entsalzen

[0027] Es war erforderlich die Polypeptidmischungen zu konzentrieren, um das Polypeptid in bestimmten Konzentrationen zu erhalten. Um die konzentrierten Polypeptidmischungen zu erhalten, wurden die erhaltenen Überstände und Zelllysate aus Herstellungsbeispiel 4 in ein Ultra-Filtriergerät (Modelnummer: Amicon Stir Cell) oder eine Zentrifugationsapparatur (Amicon Filter Centrifugation Device) platziert, um die Volumina der Polypeptidmischungen zu verringern und deren Konzentrationen zu vergrössern. Die konzentrierte Polypeptidmischung wurde in ein Sammelröhrchen überführt. 2 ml konzentrierte Mischung wurde entnommen, um die Konzentration der Polypeptidmischung zu bestimmen.

Herstellungsbeispiel 6: Gefriertrocknung von Polypeptidmischungen

[0028] 50 ml der aus Herstellungsbeispiel 5 erhaltenen konzentrierten Polypeptidmischungen wurden in eine Reissverschlusstasche bei –80 °C über Nacht (12 bis 16 Stunden) platziert. Um das gefriergetrocknete Pulver der Polypeptidmischung zu erhalten, wurde die Tasche mit der konzentrierten Polypeptidmischung zur Gefriertrocknung der Polypeptidmischungen für 4–5 Tage in den Gefriertrockner platziert. Das lyophilisierte Polypeptidmischungspulver wurde mit sterilisiertem Wasser resuspendiert, um die Polypeptidmischung zu erhalten. Die Polypeptidlösung wurde durch einen 0.22 pm Filter filtriert, um eine Zusammensetzung, die 55 ng/ml Angiogenin, 6 ng/ml Platelet-derived Growth Factor {PDGF, Wachstumsfaktor aus den Blutplättchen stammend) und 4 ng/ml Fibroblast Growth Factor 7 (FGF7, Fibroblastenwachstumsfaktor 7) enthält, zu erhalten, die bei –80 °C gelagert wurde.

Ausführungsform 1: Haarwachstumsversuch

[0029] Eine fliegende Nadel (flying needle) wurde verwendet, um eine minimalinvasive Wunde (deren Tiefe bei ungefähr 0.2 mm bis 2.5 mm lag) in einem gewünschten Anwendungsbereich einer Testperson zu erzeugen. Die aus Herstellungsbeispiel 6 erhaltene Zusammensetzung wurde in dem gewünschten Anwendungsbereich aufgebracht. Je 1 ml wurde bei jeder Anwendung, 7 Anwendungen lang, aufgetragen. Die Anwendungshäufigkeit lag bei einmal pro Woche’ bis alle 2 Wochen. Die Ergebnisse der Anwendung, der aus Herstellungsbeispiel 6 erhaltenen Zusammensetzung auf den Übergang zwischen Stirn und Haaransatz einer Testperson, sind in FIG. 1A dargestellt. Wie in FIG. 1B dargestellt, wuchs das neue Haar wegen der Vergrösserung der Proliferation von Hautpapillenzellen nachdem die erfindungsgemässe Zusammensetzung für ungefähr 2 Monate angewandt wurde, da Hautpapillenzellen Follikel bilden können und eine der kritischen Zellen für das Haarwachstum sind. Auch ist das neu gewachsene Haar dicker.

Claims

1. Ein Herstellungsverfahren für eine Zusammensetzung zum Vergrössern der Proliferation von einer Hautpapillenzelle, die Schritte umfassend: Bereitstellen eines Schweine-Nabelschnur-Gewebes; Waschen des Schweine-Nabelschnur-Gewebes mit einer Waschlösung, um Blutzellen und Körperflüssigkeit von dem Schweine-Nabelschnur-Gewebe zu entfernen; Isolieren von Zellen aus dem Schweine-Nabelschnur-Gewebe zum Sub-Kultivieren, um Zytokine zu erhalten; Unterziehen der Zellen und der Zytokine mindestens zweier Gefrier-Auftau-Zyklen, um eine Polypeptidmischung zu erhalten; und Konzentrieren und Entsalzen der Polypeptidmischung, um die Zusammensetzung zu erhalten.

2. Das Herstellungsverfahren nach Anspruch 1, wobei das Molekulargewicht der Zusammensetzung grösser als 3000 Da (Dalton) ist.

3. Das Herstellungsverfahren nach Anspruch 1, wobei im Schritt des Konzentrierens und Entsalzens der Polypeptidmischung, um eine Zusammensetzung zu erhalten, die erhaltene Zusammensetzung einen oder mehrere Bestandteile, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Angiogenin, Platelet-derived Growth Factor (PDGF, Wachstumsfaktor aus den Blutplättchen stammend), Fibroblast Growth Factor 7 (FGF7, Fibroblastenwachstumsfaktor 7) und einer Kombination davon, umfasst.

4. Das Herstellungsverfahren nach Anspruch 1, wobei im Schritt des Isolierens von Zellen aus dem Schweine-Nabelschnur- Gewebe zum Sub-Kultivieren, um Zytokine zu erhalten, die isolierten Zellen in ein serumfreies Medium platziert werden, um sie für 3–18 Tage zu kultivieren, um Zytokine zu erhalten.

5. Das Herstellungsverfahren nach Anspruch 1, wobei im Schritt des Isolierens von Zellen aus dem Schweine-Nabelschnur-Gewebe zum Sub-Kultivieren, um Zytokine zu erhalten, die isolierten Zellen in ein serumfreies Medium platziert werden, um sie für 6 Tage zu kultivieren, um Zytokine zu erhalten.

6. Das Herstellungsverfahren nach Anspruch 1, wobei das Schweine-Nabelschnur-Gewebe aus einem spezifisch pathogenfreien (SPF) Schwein gewonnen wird.

7. Eine Zusammensetzung gewonnen aus einem der Herstellungsverfahren der Ansprüche 1–6, wobei die Zusammensetzung eine die Proliferation von Hautpapillenzellen vergrössernde Wirkung besitzt.

8. Die Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei die Zusammensetzung die Proliferation von Hautpapillenzellen, mit einer erhöhten Wachstumsrate der Hautpapillenzellen um 5% bis 50%, vergrössert.

9. Eine pharmazeutische Kombination zum Vergrössern der Proliferation von Hautpapillenzellen, umfassend eine wirksame Menge der Zusammensetzung nach Anspruch 7 oder 8 und ein pharmazeutisch akzeptiertes Lösemittel und/oder ein Träger daraus.

10. Die pharmazeutische Kombination nach Anspruch 9, wobei die wirksame Menge der Zusammensetzung in einem Bereich von 0.05 ng/ml bis 20 ng/ml liegt.