JP2022043013A - 間葉系幹細胞又はそれに由来する前駆細胞の培養上清の浄化濃縮物、及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】高い有効性と高い安全性を有する培養上清の浄化濃縮物、及びその製造方法を提供すること。【解決手段】間葉系幹細胞又はそれに由来する前駆細胞が分泌するＩＧＦＢＰ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＫＧＦ（ＦＧＦ－７），ＰＤＧＦＲ、ＴＧＦα、及びＴＧＦβの少なくとも一以上を含み、間葉系幹細胞又はそれに由来する前駆細胞による代謝老廃物である乳酸及びアンモニアが除去されている、間葉系幹細胞又はそれに由来する前駆細胞の培養上清の浄化濃縮物。【選択図】なし

Description

本発明は、再生医療に有用である、間葉系幹細胞又はそれに由来する前駆細胞の培養上清の浄化濃縮物に関する。本発明はさらに、上記浄化濃縮物の製造方法に関する。

細胞は、生体中においても培養環境においても、その細胞自身や周囲の細胞が正常な機能を維持するための生理活性物質を放出していることが知られている。特に体性幹細胞・前駆細胞では、その細胞に特異的な生理活性物質（サイトカイン、増殖因子、血管新生因子、エクソソーム、酵素、細胞外マトリックスなど）が放出され、臓器の再生や恒常性維持において重要な役割を果たしている。

幹細胞は、骨髄、脂肪、皮膚など全身の多様な場所に存在している。皮下脂肪組織に存在する幹細胞（脂肪由来間葉系幹細胞Ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｒｏｍａｌ／ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ， ＡＳＣ）は、骨髄由来幹細胞とほぼ同様の性質を有することが報告されている。脂肪由来間葉系幹細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞と比較して、組織あたりの含有量が多いこと、組織から単離、増殖、保存の簡便な方法が確立していること、産生する各種因子（肝細胞増殖因子や血管内皮細胞増殖因子など）の量が多いこと、免疫抑制能が高いこと、並びに採取に際して患者への負担が少ない、採取後の患者の長期的な健康や寿命への影響が小さい、という利点を有している。

従来の幹細胞投与による治療については、細胞自体が生着・分化し機能することよりは、幹細胞が分泌する液性因子の効能の影響が大きいことが注目されている。幹細胞の培養上清は、組織修復や美容などの目的で注射剤、外用剤、化粧品としての使用が始まっている。

特許文献１には、中空糸膜の内表面に間葉系幹細胞を接触させる工程、中空糸膜の内腔および外腔に細胞培養液を灌流し、間葉系幹細胞を培養する工程、及び中空糸膜の内腔に灌流した細胞培養液の回収工程を含む、水晶体の硬化防止剤または治療剤の製造方法が記載されている。

特許文献２には、細胞を含む細胞懸濁液を収容する培養容器と、培養容器から抜き出される細胞懸濁液に対して膜分離処理を施す第１のフィルタ膜を有する第１のフィルタ部と、第１のフィルタ膜によって阻止された成分を培養容器に戻す第１の循環流路と、前記細胞懸濁液の前記第１のフィルタ膜を透過した成分に対して膜分離処理を施す第２のフィルタ膜を有する第２のフィルタ部と、第２のフィルタ膜を透過した成分を培養容器に戻す第２の循環流路と、第２のフィルタ膜によって阻止された成分を回収する回収流路とを含む細胞培養装置が記載されている。

特開２０１９－１７２６０７号公報 国際公開ＷＯ２０１８／１５９８４７号公報

現在、臨床で利用される培養上清は、細胞培養後の上清を培養器から回収し、上清に混入した幹細胞を必要に応じて遠心操作やフィルターにより除去処理を施した原液ないしその希釈液である。このような培養上清は、肝細胞増殖因子（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ， ＨＧＦ）、インスリン様成長因子（Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ， ＩＧＦｓ）、血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ， ＶＥＧＦ）などの生理活性物質の濃度が低く、また細胞が放出した代謝老廃物（乳酸、アンモニアなど）が含まれていることから、有効性を最大限に発揮していない。代謝老廃物を含んだ培養上清を治療にそのまま用いた場合には、組織や細胞に危害を与える可能性もある。本発明は、高い有効性と高い安全性を有する培養上清の浄化濃縮物、及びその製造方法を提供することを解決すべき課題とする。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った。まず、間葉系幹細胞又はそれに由来する前駆細胞の培養上清中に産生される生理活性物質の量は、酸素濃度、環境ストレス、培養時の細胞密度（コンフルエンシー）、培養期間、培地組成、重力、気圧などにより影響されることを見出し、これらの培養条件に着目し、最適な培養プロトコールを確立することにより、高機能な培養上清原液を獲得した。一方、培養上清中に含まれる有害物質については、適切なプロトコールによる浄化工程により除去することができることを確認した。この浄化工程によれば、有害物質の除去とあわせて、有用な生理活性物質の濃縮を実現することができることを実証した。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。

すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞ 間葉系幹細胞又はそれに由来する前駆細胞が分泌するＩＧＦＢＰ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＫＧＦ（ＦＧＦ－７），ＰＤＧＦＲ、ＴＧＦα、及びＴＧＦβの少なくとも一以上を含み、間葉系幹細胞又はそれに由来する前駆細胞による代謝老廃物である乳酸及びアンモニアが除去されている、間葉系幹細胞又はそれに由来する前駆細胞の培養上清の浄化濃縮物。
＜２＞ 再生医療用治療剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、又は抗線維化剤として使用するための、＜１＞に記載の浄化濃縮物。
＜３＞ 間葉系幹細胞又はそれに由来する前駆細胞が分泌するＩＧＦＢＰ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＫＧＦ（ＦＧＦ－７），ＰＤＧＦＲ、ＴＧＦα、及びＴＧＦβの全てを含む、＜１＞又は＜２＞に記載の浄化濃縮物。
＜４＞ 濃縮前の培養上清と比べて、ＩＧＦＢＰ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＫＧＦ（ＦＧＦ－７），ＰＤＧＦＲ、ＴＧＦα、及びＴＧＦβの少なくとも一以上の濃度が１．２倍以上に濃縮されている、＜１＞から＜３＞の何れか一に記載の浄化濃縮物。
＜５＞ 間葉系幹細胞又はそれに由来する前駆細胞が、脂肪由来間葉系幹細胞又は脂肪由来血管内皮前駆細胞である、＜１＞から＜４＞の何れか一に記載の浄化濃縮物。
＜６＞ アンモニア濃度が２０μｇ／ｄＬ以下であり、ＨＧＦ濃度が５００００ｐｇ／ｍＬ以上である、＜１＞から＜５＞の何れか一に記載の浄化濃縮物。
＜７＞ 間葉系幹細胞又はそれに由来する前駆細胞を培養液中において培養することにより培養上清を取得する培養上清取得工程；前記培養上清から有用成分を濃縮する濃縮工程
前記濃縮培養上清から代謝老廃物を除去する浄化工程；
を含む、＜１＞から＜６＞の何れか一に記載の浄化濃縮物の製造方法。
＜８＞ 培養上清取得工程において、増殖期又はコンフルエント期の状態にある間葉系幹細胞又はそれに由来する前駆細胞の培養物から培養上清を取得する、＜７＞に記載の方法。
＜９＞ 浄化工程において除去される代謝老廃物が、乳酸およびアンモニアである、＜７＞又は＜８＞に記載の方法。
＜１０＞ 浄化工程を限外濾過により行う、＜７＞から＜９＞の何れか一に記載の方法。
＜１１＞ 限外濾過を、分画分子量２ｋＤａ～３０ｋＤａの濾過膜を使用して行う、＜１０＞に記載の方法。

本発明の方法によれば、従来の回収法により回収された培養上清と比較して、体外で培養した細胞の増殖能を約２倍に増加させることができる。即ち、本発明によれば、安全であり、かつ高い再生治療効果を持つ、培養上清を供給することができる。本発明の培養上清の浄化濃縮物は、大量生産が可能で、細胞を含まないため、他家由来の細胞からの製品としても利用することができる。

図１は、ＡＳＣ細胞増殖活性への阻害物質の影響（Ｍｅａｎ±ＳＤ，ｎ＝４， ＷＳＴ８ ａｓｓａｙ）を示す。 図２は、限外濾過膜を用いたＣＭからの乳酸排除効果（Ｍｅａｎ±ＳＤ， ｎ＝３）を示す。 図３は、細胞増殖スピードを加速させる酸素培養条件の検討の結果を示す。 図４は、ＡＳＣ播種密度と培養上清に分泌されるＨＧＦ量 （ｎ＝１）を示す。 図５は、ＡＳＣのコンフルエンシーとＨＧＦ量を示す。 図６は、ＣＭ中に分泌された増殖因子の種類を示す。 図７は、実施例５における培養上清回収と培地交換スケジュールを示す。 図８は、酸素濃度、血清（１０％ＦＢＳ）有無によるＨＧＦ産生への影響を測定した結果を示す。 図９は、培養上清、濃縮液、濃縮後廃液中のＨＧＦを測定した結果を示す。 図１０は、培養上清、濃縮液、濃縮後廃液中のアンモニア濃度を測定した結果を示す。 図１１は、培養上清、濃縮液、濃縮後廃液によるｈＡＳＣｓ増殖能への影響（細胞増殖実験）を測定した結果を示す。 図１２は、培養上清、浄化濃縮液によるヒト皮膚線維芽細胞、正常ヒト表皮角化細胞増殖への影響（細胞増殖実験）を測定した結果を示す。 図１３は、培養上清、培養上清浄化濃縮液による血管内皮細胞管腔形成能への影響（内皮細胞管腔形成試験）を測定した結果を示す。 図１４は、２型糖尿病マウスの創傷治癒促進効果を評価した結果を示す。 図１５は、ＡＳＣにおいて血小板溶解液による細胞増殖能、ＨＧＦ産生能への影響を測定した結果を示す。 図１６は、ＡＳＣにおいて各種増殖因子によるＨＧＦ産生能への影響を測定した結果を示す。 図１７は、培養上清、浄化濃縮液による炎症性サイトカイン産生への影響を測定した結果を示す。

以下、本発明の実施形態について具体的に説明する。
［１］間葉系幹細胞又はそれに由来する前駆細胞の培養上清の浄化濃縮物
本発明は、体外で培養した間葉系幹細胞又はそれに由来する前駆細胞の培養上清を、回収、浄化濃縮することにより得られる浄化濃縮物に関する。間葉系幹細胞又はそれに由来する前駆細胞の培養上清には、細胞から分泌される成長因子やサイトカイン、エクソソーム、血管新生因子、酵素などの生理活性物質が含有されており、これらの生理活性物質は、損傷・老化で傷ついた細胞の機能回復や組織・臓器再生に重要な役割を果たし、再生医療として様々な難治性疾患の治療に利用することができる。

具体的には、本発明は、間葉系幹細胞又はそれに由来する前駆細胞が分泌するＩＧＦＢＰ（ＩＧＦＢＰ－１、ＩＧＦＢＰ－２、ＩＧＦＢＰ－３、ＩＧＦＢＰ－４、ＩＧＦＢＰ－６など）、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ－Ａなど）、ＰＤＧＦ（ＰＤＧＦ－ＡＡ、ＰＤＧＦ－ＡＢ、ＰＤＧＦ－ＢＢなど）、ＥＧＦ、ＫＧＦ（ＦＧＦ－７），ＰＤＧＦＲ（ＰＤＧＦＲ－α、ＰＤＧＦＲ－βなど）、ＴＧＦα、及びＴＧＦβの少なくとも一以上を含み、間葉系幹細胞又はそれに由来する前駆細胞による代謝老廃物である乳酸及びアンモニアが除去されている、間葉系幹細胞又はそれに由来する前駆細胞の培養上清の浄化濃縮物に関する。

本発明の浄化濃縮物は、ＩＧＦＢＰ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＫＧＦ（ＦＧＦ－７），ＰＤＧＦＲ、ＴＧＦα、及びＴＧＦβのうちの少なくとも一以上を含めばよいが、好ましくは少なくとも二以上を含み、より好ましくは上記の全てを含む。

本発明の浄化濃縮物においては、濃縮前の培養上清と比べて、ＩＧＦＢＰ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＫＧＦ（ＦＧＦ－７），ＰＤＧＦＲ、ＴＧＦα、及びＴＧＦβのうちの少なくとも一以上（好ましくは少なくとも二以上を含み、より好ましくは上記の全て）の濃度が１．２倍以上に濃縮されていることが好ましく、濃縮の倍率は１．５倍以上、２倍以上、３倍以上、５倍以上、１０倍以上、１５倍以上、２０倍以上、２５倍以上又は３０倍以上でもよい。

本発明の浄化濃縮物においては、アンモニア濃度が２０μｇ／ｄＬ以下であることが好ましく、１５μｇ／ｄＬ以下であることがより好ましく、１０μｇ／ｄＬ以下であることがさらに好ましい。ＨＧＦ濃度は５００００ｐｇ／ｍＬ以上であることが好ましく、５万ｐｇ／ｍＬ以上２５０万ｐｇ／ｍＬ以下であることが好ましい。ＨＧＦ濃度は１０万ｐｇ／ｍＬ以上でもよく、２０万ｐｇ／ｍＬ以上でもよい。

間葉系幹細胞又はそれに由来する前駆細胞としては、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、臍帯血由来幹細胞、又はそれらに由来する前駆細胞などが挙げられる。
脂肪由来幹細胞としては、血管内皮（前駆）細胞などが挙げられる。

脂肪由来幹細胞は、脂肪に由来する多分化能を有する細胞であり、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨芽細胞、筋線維芽細胞、骨細胞、筋肉細胞又は神経鞘細胞などに分化することができる細胞である。脂肪由来幹細胞の割合は、ＣＤ３１陰性で、ＣＤ９０陽性の細胞として確認することが可能である。脂肪由来幹細胞は、さらに、ＣＤ４５陰性、ＣＤ４４陽性、ＣＤ２９陽性、ＣＤ１３陽性として確認することができる。上記のマーカーは、ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）により測定することができる。

血管内皮（前駆）細胞とは、血管の内表面を構成する細胞であり、血液の循環する内腔と接している細胞である。血管内皮（前駆）細胞とは、血管内皮細胞及び血管内皮前駆細胞とを包含する概念である。血管内皮（前駆）細胞は、分裂増殖する能力を保持している。血管内皮（前駆）細胞は、ＣＤ４５陰性かつＣＤ３１陽性を指標として同定することができ、ＣＤ１４６陽性およびＣＤ１４４陽性としても同定することができる。

［２］間葉系幹細胞又はそれに由来する前駆細胞の培養上清の浄化濃縮物の製造方法
本発明は、間葉系幹細胞又はそれに由来する前駆細胞を培養液中において培養することにより培養上清を取得する培養上清取得工程；及び前記培養上清を濃縮する濃縮工程、さらに濃縮した培養上清から代謝老廃物を除去する浄化工程を含む、間葉系幹細胞又はそれに由来する前駆細胞の培養上清の浄化濃縮物の製造方法に関する。

脂肪由来幹細胞又はそれに由来する前駆細胞は、脂肪組織から取得することができる。脂肪組織は、例えばヒト、又はヒト以外の哺乳類又は鳥類などから外科的切除することにより得ることができる。ヒト以外の哺乳類としては、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、サル、フェレット、ウサギ、マウス、ラット、スナネズミ、モルモット、ハムスター等を挙げることができる。鳥類としては、ニワトリ等を挙げることができる。外科的切除の際には、局所麻酔をしてもよい。脂肪組織は、カニューレを腹部、大腿部、臀部、又は全身の皮下脂肪組織に挿管することによって、吸引により得ることもできる。得られる脂肪組織の量は、例えば０．１ｇ～１０００ｇであり、好ましくは１ｇ～５００ｇ、１ｇ～１００ｇ、２ｇ～５０ｇ、又は２ｇ～４０ｇであるが、これらに限定されない。

得られた脂肪組織は、肉眼で、腫瘍性病変や汚染がないことを確認することが好ましい。脂肪組織は、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ－１、及びＴＰＨＡ／ＲＰＲがいずれも陰性であることを確認してもよい。脂肪組織は、マイコプラズマが１２８倍未満（ＰＡ法）、単純ヘルペスが３２０倍未満（ＣＦ法）であることを確認してもよい。

脂肪由来幹細胞の調製方法は、公知の方法で実施でき、特に限定されない。例えば、吸引脂肪組織を静置し、オイル層、脂肪層、水層を分離した後に、オイル層及び水層を除去し、脂肪層のみを回収することができる。得られた脂肪層は、次いで酵素処理に供することができる。あるいは、細片化した脂肪組織をそのまま培養皿などに接着させ、脂肪由来細胞の増殖、接着培養を促すこともできる。

酵素処理に供する前の脂肪組織は、酵素処理の前に室温または３７℃ウォーターバスで５分～１５分間温めておくことが好ましい。

酵素処理は、チューブ中の脂肪層に適量の酵素反応液を加え、恒温振とう機にチューブを固定して、振盪させることによって行うことができる。酵素処理の温度は、酵素反応が進行する限り特に限定されないが、一般的には２５℃～５０℃であり、好ましくは３０～４５℃であり、例えば、３７℃である。振盪は、往復振盪でも旋回振盪でもよい。往復振盪の場合、往復振盪速度は特に限定されないが、一般的には１０ｒｐｍ～３００ｒｐｍであり、好ましくは５０ｒｐｍ～２００ｒｐｍであり、例えば、１２０ｒｐｍである。反応時間は特に限定されないが、一般的には１０分間～３時間であり、好ましくは１５分間から１時間であり、例えば、３０分間である。

酵素としては、少なくともコラゲナーゼを使用することが好ましい。
コラゲナーゼとは、動物組織細胞、炎症細胞、腫瘍細胞又はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ等のバクテリアなどが産生する、又は、遺伝子組換え技術により人工的に産生される組換え蛋白質であり、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型コラーゲンを分解する酵素をいう。さらに、中性プロテアーゼ、サーモリシン、トリプシン、ディスパーゼなどを加えてもよい。

酵素処理液におけるコラゲナーゼの最終濃度は、好ましくは０．０２％～２％であり、より好ましくは０．１％～１％であり、さらに好ましくは０．１％～０．５％であり、さらに好ましくは０．１％～０．４％であり、さらに好ましくは０．１％～０．３％であり、最も好ましくは０．２％である。

酵素処理に使用する酵素処理液は、コラゲナーゼに加えてＤＮａｓｅＩをさらに含むことも好ましい。ＤＮａｓｅＩを使用する場合、酵素処理液におけるＤＮａｓｅＩの濃度は、好ましくは１００～１００００Ｕ／ｍＬであり、より好ましくは２００～５０００Ｕ／ｍＬであり、さらに好ましくは５００～２０００Ｕ／ｍＬである。

酵素処理に使用する酵素処理液はさらにＣａＣｌ_２を含むことが好ましい。酵素処理液におけるＣａＣｌ_２の濃度は、好ましくは０．０１ｍＭ～１０ｍＭであり、より好ましくは０．１ｍＭ～５ｍＭであり、さらに好ましくは１ｍＭ～４ｍＭであり、例えば、３ｍＭである。

酵素処理に使用する酵素処理液は、緩衝液であることが好ましく、ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）であることがより好ましい。

脂肪層と酵素液の混合物を、酵素反応に適した温度（例えば、３０℃から４５℃、好ましくは３５～４０℃）で、遠沈管において回転させることにより反応させることができる。反応後、さらに８００Ｇで遠心することにより、上からオイル層、脂肪層、水層、沈殿層（細胞層）の３層に分離させることができる。オイル層、脂肪層、水層を除去することにより沈殿層（細胞層）のみにすることができる。沈殿層を適当な生理食塩水に懸濁することにより、脂肪由来細胞の懸濁液（間質細胞血管群、Ｓｔｒｏｍａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ｆｒａｃｔｉｏｎ，ＳＶＦ）を得ることができる。

本発明においては、間葉系幹細胞又はそれに由来する前駆細胞を培養液中において培養することにより培養上清を取得する。

培養液（培地）は、間葉系幹細胞又はそれに由来する前駆細胞を培養できる培地であれば特に限定されず、ＥＧＭ－２（Ｌｏｎｚａ）、αＭＥＭ、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地／ハムＦ－１２混合培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）、ＲＰＭＩ１６４０などを挙げることができる。これらの培養液に対しては、通常、血清、各種ビタミン、各種抗生物質、各種ホルモン、各種増殖因子等、通常の細胞培養に適用可能な各種添加剤を添加してもよい。培地としては特に好ましくは、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、又はＥＧＭ－２、ＥＧＭ－２ＭＶ（ともにＬｏｎｚａ）などを使用することができる。

培養は、フラスコ等の培養容器を用いて、５％ＣＯ_２、３７℃で行うことが好ましい。培地交換は、例えば２日おきに行えばよい。酸素濃度は、１－２１％で培養を行うことができる。特に好ましくは、２－６％の酸素濃度で培養する。
培養期間は特に限定されないが、例えば、１日～１４日間の培養を行うことができる。１日～６日間の培養を行った後に、細胞を継代して、例えば、３日～６日間の培養を再度行ってもよい。継代の回数及び培養の回数は特に限定されない。

細胞懸濁液の播種は特に限定されないが、一例としては、５．１×１０^４個の生存有核細胞／ｃｍ^２、培地量は０．２５ｍＬ／ｃｍ^２程度で実施可能である。継代培養が安定して可能になった段階以降においては、一例としては、４０００個の生存有核細胞／ｃｍ^２、培地量は０．２５ｍＬ／ｃｍ^２とすることができる。

培養上清取得工程においては、増殖期又はコンフルエント期の状態にある間葉系幹細胞又はそれに由来する前駆細胞の培養物から培養上清を取得することができる。

培養上清は、当技術分野で公知の方法で調製できる。例えば、得られた培養液を遠心処理し、適当な孔径のフィルター（又はストレイナー）にかけることで、培養上清を得ることができる。ここで遠心処理は、例えば、３００～１２００×ｇで５～２０分間実施することができる。

本発明においては、培養上清の有用含有物質を濃縮する濃縮工程、さらに濃縮した培養上清から代謝老廃物を除去する浄化工程を行う。濃縮工程は、当技術分野で公知の方法で実施できる。例えば、限外濾過、ゲル濾過、透析などが挙げられるが特に限定されない。浄化工程においては、希釈した濃縮培養上清をさらに、同様の濾過工程を用いることによって、代謝老廃物である乳酸およびアンモニアを低減又は除去することができる。このように代謝老廃物を一定濃度以下まで低減することにより、培養上清を無害化することができる。

濃縮および浄化工程は、好ましくは、限外濾過で行うことができる。
限外濾過法による場合には、限外濾過は、分画分子量２ｋＤａ～３０ｋＤａの濾過膜を使用して行うことが好ましい。濾過膜の分画分子量は２ｋＤａ～２０ｋＤａ、２ｋＤａ～１０ｋＤａ、２ｋＤａ～５ｋＤａ、または２ｋＤａ～４ｋＤａでもよい。

培養上清の濃縮倍率は、移植時の液体状態において、好ましくは１～１００倍、より好ましくは２０～５０倍である。濃縮により、さらに大きな治癒促進効果や免疫抑制効果を期待できる。濃縮工程を繰り返すことにより、限界なくさらに濃縮することも可能である。

本発明の特徴は、濃縮と浄化を、それぞれの工程で行う点にある。培養上清をフラスコから回収し、培養上清中に混入した細胞を遠心とフィルター（例えば０．２２μｍ ＰＥＳ滅菌フィルター）により除去して、細胞除去培養上清を得る。細胞を除去した培養上清を限外濾過膜に通して、濃縮することにより、濃縮した細胞を除去した培養上清（実施例ではＣＣＭ－ｐｒｅと記載した）が限外濾過フィルターに回収される（濃縮工程）。次いで、限外濾過フィルターに新鮮な基礎培地を最大積載量まで添加し、再度、限外濾過する（浄化工程）。これにより、濃縮液が、低分子量のものに関しては、基礎培地の成分にほとんど置き換えられる（即ち、アンモニアや乳酸などの低分子の代謝産物が新鮮な基礎培地に置換されて排除される）ため、浄化濃縮細胞除去培養上清を得られる。本発明において、濃縮工程、浄化工程ともに複数回繰り返してもよい。また、培地については、適宜、任意の溶媒（例えばＰＢＳ、リンゲル液、蒸留水など）に置換することも可能である。

上記のようにして得られる培養上清の浄化濃縮物には、細胞は含まれていないが、間葉系幹細胞又はそれに由来する前駆細胞が分泌するＩＧＦＢＰ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＫＧＦ（ＦＧＦ－７），ＰＤＧＦＲ、ＴＧＦα、及びＴＧＦβの少なくとも一以上が含まれ、間葉系幹細胞又はそれに由来する前駆細胞による代謝老廃物である乳酸及びアンモニアは除去されている。

［３］治療又は美容のための組成物
本発明の浄化濃縮物は、生体組織や臓器の損傷、変性、障害や機能不全の治療や美容を目的とした組成物として用いることができる。即ち、本発明の浄化濃縮物は、再生医療用治療剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、又は抗線維化剤などの医薬組成物、または美容組成物として提供することができる。具体的には、血管新生、組織再生、および免疫抑制の効果を得ることができる。このことは、皮膚においては、しわ・しみなどの改善を目的とした美容や若返りの効果、またＥＤや薄毛の治療効果、を期待することができる。この組成物の持つ免疫抑制効果は、アトピー性皮膚炎をはじめとするアレルギー性疾患の治療、関節リウマチをはじめとする様々な自己免疫疾患の治療、あるいは重症新型コロナウィルスにみられるサイトカインストームの治療など、幅広く応用が可能である。

細胞を含まない培養上清の浄化濃縮物を移植することにより、細胞移植に伴う免疫拒絶、ＧＶＨＤのリスクを回避でき、投与時の操作を簡素化することができる。また、培養上清の浄化濃縮物は、保存が可能であり、液体の状態で凍結保存、または凍結乾燥により乾燥粉末品として、劣化することなく長期間保存することができる。また、細胞移植では自家移植が望ましいため、健常部位から侵襲的な手法で採らなくてはならないのに対し、培養上清の浄化濃縮物の移植にはその必要がない。さらに、培養上清の浄化濃縮物の移植においては、大量の投与が可能である。さらに、浄化濃縮した培養上清を２～３種類（例えば、脂肪幹細胞由来と血管内皮細胞由来）混合して使用することも可能である。また、難治性皮膚潰瘍への投与で治癒効果があるという報告があるPRP（多血小板血漿）を混合して使用することも可能である。

本発明の浄化濃縮物、幹細胞と組み合わせて使用することによって、様々な臓器や組織を効率的に再生させ、移植先に生着させることができる。とくに、血管新生、および組織の再生やリモデリングを促すことができる。
本発明の浄化濃縮物は、脂肪組織との組み合わせ、脂肪組織由来の間質血管細胞群（ＳＶＦ）との組み合わせ、脂肪幹細胞や血管内皮（前駆）細胞との組み合わせなどにより、豊胸、乳がん切除後の乳房再建、目元や頬のシワやハリの低下の改善等を目的とした移植を行うことができる。
本発明の浄化濃縮物は、骨芽細胞と組み合わせて使用することによって、骨折の治療、低身長・骨変形・脚長差を改善するための骨延長術等を目的とした移植を行うことができる。
本発明の浄化濃縮物は、軟骨細胞と組み合わせて使用することによって、関節軟骨の退化・変性・変形その他の異常に関連する疾患（例えば、変形性関節症、関節リウマチ、肩関節周囲炎、顎関節症など）の治療を目的とした移植を行うことができる。
本発明の浄化濃縮物は、平滑筋細胞と組み合わせて使用することによって、平滑筋細胞の傷害や異常に起因する疾患（例えば、排尿障害（尿漏れ、頻尿、尿閉など）、平滑筋腫、平滑筋肉腫等）の治療を目的とした移植を行うことができる。

本発明の組成物は、製薬上許容し得る媒体として使用される輸液製剤、注射用蒸留水、又は培養液により希釈したものでもよい。輸液製剤としては特に限定されないが、例えば、生理食塩液、５％ブドウ糖液、リンゲル液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、開始液（１号液）、脱水補給液（２号液）、維持輸液（３号液）、術後回復液（４号液）等を挙げることができる。希釈する際の細胞数は特に限定されないが、例えば、１×１０^３～１×１０^７個／ｍＬとすることができる。

本発明の組成物は、保存安定性、無菌性、等張性、吸収性及び／又は粘性を増加するための種々の添加剤、例えば、乳化剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、湿潤剤、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、増粘剤、ゲル化剤、ｐＨ調整剤等を含んでもよい。増粘剤としては、例えば、ＨＥＳ、デキストラン、メチルセルロース、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の組成物の投与量は、投与形態、投与方法、使用目的、及び患者又は被験者の年齢、体重及び症状等によって適宜決定することができる。
浄化濃縮物の１回あたりの投与量は、特に限定されないが、例えば、原料となる浄化濃縮前培養上清の体積で表現すると、０．０１ｍＬ／ｋｇ体重以上、０．１ｍＬ／ｋｇ体重以上、又は１ｍＬ／ｋｇ体重以上である。また、浄化濃縮物の１回の投与量は、特に限定されないが、例えば、１０ｍＬ／ｋｇ体重以下、又は５ｍＬ／ｋｇ体重以下である。

本発明の組成物の投与方法は、特に限定されないが、例えば、皮下注射、リンパ節内注射、静脈内注射、動脈内注射、腹腔内注射、胸腔内注射又は局所への直接注射でもよいし、又はカテーテルなどにより局所に直接移植することなどが挙げられる。さらに、軟膏や乳液としての外用塗布や、ローションとしてのスプレー塗布、内服として投与も可能である。

本発明の組成物の投与対象は、典型的にはヒトであるが、他の動物であってもよい。他の動物としては、哺乳類又は鳥類などが挙げられる。哺乳類としては、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、サル、フェレット、ウサギ、マウス、ラット、スナネズミ、モルモット、ハムスター等を挙げることができる。鳥類としては、ニワトリ等を挙げることができる。
以下の実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

用意するもの
＃１： ＨＢＳＳ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｃａ＋＋，ｗｉｔｈｏｕｔ Ｍｇ＋＋ （Ｇｉｂｃｏ， ＃１４１７５－０９５）
＃２： コラゲナーゼ粗精製Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ由来 （富士フイルム和光純薬，＃０３２－２２３６４）
＃３： ＤＮａｓｅ１粗精製（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，＃ＬＳ００２１３９）
＃４： 遠沈管（ＣＯＲＮＩＮＧ，＃４３１１２３）
＃５： スイング式卓上遠心機（ＫＵＢＯＴＡ，＃Ｓ７００Ｔ）
＃６： 恒温振盪機（ヤマト科学，＃ＢＴ１００）
＃７： 電子秤
＃８： スポイトシリコンゴム（アズワン，＃６－３５６－０４）
＃９： セルストレイナー （ＣＯＲＮＩＮＧ，１００μｍ；＃３５２３６０，４０μｍ； ＃３５５２３４０）
＃１０： セルカウンター（Ｌｏｇｏｓ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，＃Ｌ３０００１）
＃１１： 塩化カルシウム（富士フイルム和光純薬，＃０３７－２４０３１）
＃１２： シリンジフィルター０．２２μｍ径（ミリポア，＃２ＬＧＶ－３３ＲＳ）
＃１３： セルバンカー１（タカラバイオ，＃ＣＤ０１１）
＃１４： 細胞培養ディッシュ（ＣＯＲＮＩＮＧ，＃３５３０２５）
＃１５： ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２（富士フイルム和光純薬，＃０４８－２９７８５）
＃１６： Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）
＃１７： ペニシリン－ストレプトマイシン（１００ｘ）（富士フイルム和光純薬，＃１６８－２３１９１）
＃１８： ＣＯ_２インキュベーター（Ｐａｎａｓｏｎｉｃ，＃ＭＣＯ－１７０ＡＩＣＵＶＨ－ＰＪ）
＃１９： ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ （Ｇｉｂｃｏ，＃１２６０４－０２１）
＃２０： Ｌ－（＋）－乳酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，＃Ｌ６４０２）
＃２１： １０％アンモニア水（富士フイルム和光純薬，＃０１３－１７５０５）
＃２２： ９６ｗｅｌｌプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＳｐｅｃｔｒａＰｌａｔｅ－９６，＃６００５６５０）
＃２３： Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（Ｄｏｊｉｎｄｏ，＃ＣＫ０４）
＃２４： プレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＡＲＶＯ ＭＸ）
＃２５： 限外濾過膜（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ，Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５ １０ｋＤａ， ＃ＵＦＣ９０１０２４）
＃２６： 乳酸定量キット（Ａｂｂｏｔｔ，ＧＣ４＋）
＃２７： 低酸素ＣＯ_２インキュベーター（ワケンビーテック）
＃２８： Ｈｕｍａｎ ＨＧＦ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ ＃ＤＨＧ００Ｂ）
＃２９： Ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｒｒａｙ（Ｒａｙｂｉｏ， ＃ＡＡＨ－ＧＦ－１）
＃３０： ルミノイメージアナライザー（富士フイルム， ＬＡＳ－３０００ｍｉｎｉ）

※１： １Ｍ塩化カルシウム溶液の調製
塩化カルシウム（＃１１）１１．１ｇをＭｉｌｉＱ水１００ｍＬでメスアップしてオートクレーブ滅菌（１２１℃、 ２０分）した。

※２： １×１０^５ｕｎｉｔｓ／ｍＬ ＤＮａｓｅ１溶液の調製
ＤＮａｓｅ１（＃２）を１×１０^５ｕｎｉｔｓ／ｍＬ濃度となるようにＭｉｌｉＱ水で溶解し、シリンジフィルター（＃１２）で滅菌、滅菌チューブに分注して-３０℃でストックした。

※３： 酵素反応液の調製
Ａ液
０．２％（ｗ／ｖ）コラゲナーゼ（＃２） ０．２６４ｇ
３ｍＭ 塩化カルシウム［１Ｍストック液（※１）］ ０．３９６ｍＬ
ＨＢＳＳ（＃１） ６５．６ｍＬ
シリンジフィルター０．２２μｍ径（＃１２）等のフィルターユニットで濾過滅菌した。
酵素反応液
Ａ液 ６０ｍＬ
１０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ ＤＮａｓｅ１［１×１０^５ｕｎｉｔｓ／ｍＬストック液（※２）］ １．２ ｍＬ
ＨＢＳＳ（＃１） ５８．８ ｍＬ
使用直前に調製した。
なお、脂肪層との反応時には、酵素反応液と脂肪層を等量加えるため、酵素反応液の各濃度は半分での反応となる。

※４： 新鮮培地の調製
ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２（＃１５） ５００ｍＬ
ＦＢＳ（＃１６） ５５ｍＬ
ペニシリン－ストレプトマイシン（＃１７） ５ｍＬ

※５： 新鮮培地 （ＦＢＳ不含）の調製
ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２ （＃１５） ５００ｍＬ
ペニシリン－ストレプトマイシン （＃１７） ５ｍＬ

実施例１：ＳＶＦ調製
吸引脂肪組織を静置し、オイル層、脂肪層、水層を分離した。オイル層、及び水層を除去し、脂肪層のみにした。空の遠沈管（＃４）の重さを秤量した。遠沈管のサイズは、脂肪層５０ｇに対して５００ｍＬ用を用いた。脂肪層を遠沈管に移して秤量し、（遠沈管＋脂肪層）－遠沈管の重量より、脂肪層の重量を算出した。酵素反応液（※３）を脂肪層と等量加えた。恒温振盪機（＃６）に遠沈管を固定して、３７℃、１２０ｒｐｍ、３０分間反応させた。チューブを恒温振盪機から取り出して、遠心機（＃５）で８００Ｇ、１０分遠心した。遠心後は、上からオイル層、脂肪層、水層、沈殿層（細胞層）の３層に分離するので、オイル層、脂肪層、水層をピペットで除去して、沈殿層のみにする。脂肪層５０ｇに対して９０ｍＬのＨＢＳＳ（＃１）になるように、沈殿層にＨＢＳＳを添加し、ピペットで穏やかに懸濁して洗浄した。細胞懸濁液をセルストレイナー１００μｍと４０μｍに通し組織片を除去した。遠心機（＃５）で８００Ｇ、５分遠心した。上清を吸引してＨＢＳＳ（＃１）４５ｍＬで再懸濁し、７００Ｇ、５分間遠心した。上清を吸引してＨＢＳＳ（＃１）で脂肪層５ｇに対し１ｍＬのＨＢＳＳで再懸濁した。有核生細胞数をセルカウンター（＃１０）で計測した。ＳＶＦは、凍結保存液Ｃｅｌｌｂａｎｋｅｒ１（＃１３）に懸濁し極低温で保存する。

実施例２：ＡＳＣの継代培養
間質血管細胞群（ＳＶＦ）は、凍結保存液からの起眠、または新鮮な状態いずれの場合も５．１×１０^４個の生存有核細胞／０．２５ｍＬの培地（※４）／ｃｍ^２で培養フラスコ （＃１４）に播種し、ＣＯ_２インキュベーター（＃１８）（３７℃、５％ＣＯ_２、Ａｉｒ）で培養開始した。翌日、３７℃のＨＢＳＳ（＃１）で３回洗浄し血球や残存組織片を除去し、新鮮培地（※４）を添加した。３日に１回新鮮培地に交換した。７日目に細胞（主にＡＳＣ）回収するために、細胞分散した。３７℃のＨＢＳ（＃１）で洗浄後、３７℃の１×ＴｒｙｐＬＥ ｅｘｐｒｅｓｓ（＃１９）（１ｍＬ ＴｒｙｐＬＥ ｅｘｐｒｅｓｓ／１５ｃｍ^２）添加し、３７℃、５％ＣＯ_２、５分間で細胞分散させた。新鮮培地（※４）で反応停止、遠心分離（３００Ｇ，５分、４℃）で細胞ペレットを得た。有核細胞数をセルカウンター（＃１０）でカウントした。細胞（主にＡＳＣ）は、４０００個の生存有核細胞／０．２５ｍＬの培地（※４）／ｃｍ^２で培養フラスコ（＃１４）に播種し、ＣＯ_２インキュベーター（＃１８）（３７℃、５％ＣＯ_２、Ａｉｒ）で培養開始した。３日に１回新鮮培地に交換し、７日間培養した。

実施例３：ＣＭ中の阻害物質
＜概要＞
ＣＭ中には、組織再生や細胞培養への有効性が期待される細胞由来の生理活性物質が放出されるが、一方で細胞の生存・増殖を阻害する代謝産物も細胞から放出されており、通常ＣＭには、有効成分と阻害物質の両方を含んでいる。代謝産物の代表として新鮮培地に純品試薬の乳酸、またはアンモニアを添加し、ＡＳＣの増殖に対する影響を確認した。

＜手順－１＞
上述の実施例１のＳＶＦ調製、及び実施例２のＡＳＣの継代培養によりＡＳＣをｐａｓｓａｇｅ ｎｕｍｂｅｒ（Ｐ）＝２まで培養し、ＡＳＣの細胞懸濁液を得た。有核生細胞数をセルカウンター（＃１０）で計測した。９６ｗｅｌｌプレート（＃２２）に４０００個、または１０００個ＡＳＣ生存有核細胞数／１００μＬ培地（※４）／ｗｅｌｌで播種した。２枚用意した。ＣＯ_２インキュベーター （＃１８）（３７℃、５％ＣＯ_２、Ａｉｒ）で培養開始した。新鮮培地（※４）、２，１０，５０ｍＭの乳酸（＃２０）を含む新鮮培地（※４）、２，１０，５０ｍＭのアンモニア（＃２１）を含む新鮮培地（※４）を準備し、２２時間後、培地交換した。培養開始から３日後（培地交換から２日後）にｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ（＃２３）により、細胞増殖活性を確認した。プレートリーダー（＃２４）で４５０ ｎｍの吸光度を測定した。測定結果を図１に示す。

新鮮培地培養と比較して、新鮮培地に乳酸、またはアンモニアを添加した培地では、細胞増殖活性阻害が起きた。乳酸では５０ｍＭ 乳酸－新鮮培地で培養阻害が顕著に見られた。アンモニアでは、２ｍＭアンモニア－新鮮培地からＡＳＣの培養阻害が見られ、５０ｍＭアンモニア－新鮮培地で培養阻害が顕著に起きた。コンフルエント期に回収した培養上清（ＣＭ）のアンモニア濃度は、１．４２８Ｍ ＮＨ_４＋（２０００μｇ／ｄＬ）程度であった。したがって、ＣＭに含まれるＡＳＣが分泌するアンモニア濃度は、細胞増殖を阻害するレベルを含んでおり、通常のＣＭでは、生理活性物質（有益）と代謝産物（有害）を同時に含む特性がある。

＜手順－２＞
上述の実施例１のＳＶＦ調製、及び実施例２のＡＳＣの継代培養によりＡＳＣをｐａｓｓａｇｅ ｎｕｍｂｅｒ（Ｐ）＝２まで培養し、ＡＳＣの細胞懸濁液を得た。有核生細胞数をセルカウンター（＃１０）で計測した。細胞培養ディッシュ（＃１４）に４０００個ＡＳＣ生存有核細胞数／０．２ｍＬ培地（※４）／ｃｍ^２で播種した。以下の３条件のＣＭを回収した。

（条件１）６０－７０％コンフルエンシーの状態から新鮮培地（※４）に交換し７２時間培養したＣＭ、
（条件２）９０－１００％コンフルエンシーの状態から新鮮培地（※４）に交換し７２時間培養したＣＭ、
（条件３）９０－１００％コンフルエンシーの状態から新鮮培地 （ＦＢＳ不含）（※５）に交換し７２時間培養したＣＭ。

回収したＣＭを遠沈管に速やかに回収し、スイング式遠心機で８００Ｇ，１０分遠心し、ＣＭ中の細胞とデブリスを沈殿させ、上清を回収した。上清を限外濾過膜（＃２５）で濃縮し、ＣＣＭ－ｐｒｅを得た。限外濾過膜上に濃縮したＣＣＭ－ｐｒｅに、新鮮培地（ＦＢＳ不含）（※５）を積載最大量添加（希釈）し、再度濃縮した。以上により、３培養条件のＣＭそれぞれについて、ＣＭ、新鮮培地への置換濃縮（浄化）されたＣＣＭ、ＣＭを限外濾過した際のフロースルーとなる廃液ｗａｓｔｅ ｏｆ ＣＭを得た。乳酸定量キット （＃２６）で各培地の乳酸定量を実施した。なお、測定キットの性質により、０．３ ｍＭ乳酸以下では、＜０．３０と表示され、低値であるが実測値は測定できない。測定結果を図２に示す。

本発明によれば、限外濾過膜を用いた濃縮、及び新鮮培地への置換濃縮により、有益な生理活性物質を濃縮するのとともに、有害な低分子の代謝産物の排除できることが明らかになった。

＜手順－３＞
上述の実施例１のＳＶＦ調製、及び実施例２のＡＳＣの継代培養によりＡＳＣをｐａｓｓａｇｅ ｎｕｍｂｅｒ（Ｐ）＝２まで培養し、ＡＳＣの細胞懸濁液を得た。有核生細胞数をセルカウンター（＃１０）で計測した。９６ｗｅｌｌプレート（＃２２）に４０００個、または１０００個ＡＳＣ生存有核細胞数／１００μＬ培地（※４）／ｗｅｌｌで播種した。低酸素ＣＯ_２インキュベーター（＃２７）（３７℃、５％ＣＯ_２）２１％または６％または１％Ｏ_２で培養開始した。培養３日目、及び培養６日目でｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ（＃２３）により、細胞増殖活性を確認した。プレートリーダー（＃２４）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。測定結果を図３に示す。

酸素環境は、低酸素（６％，１％）が２１％Ｏ_２よりも増殖効率が良く、特に６％Ｏ_２が良かった。以上の結果から、３７℃、５％ＣＯ_２、６％Ｏ_２の培養条件でＣＭを調製することとした。

実施例４：ＣＭ調製
＜概要＞
有効成分が多く分泌されたＣＭを得るために、生理環境に近似した酸素濃度（６％Ｏ_２）で培養下での、最適な細胞播種密度、培地量、培養期間を検討した。

＜手順－１＞
上述の実施例１のＳＶＦ調製、及び実施例２のＡＳＣの継代培養によりＡＳＣをｐａｓｓａｇｅ ｎｕｍｂｅｒ（Ｐ）＝１まで培養（ただし、培養酸素濃度は６％に変更）し、ＡＳＣの細胞懸濁液を得た。有核生細胞数をセルカウンター（＃１０）で計測した。細胞培養ディッシュ（＃１４）に以下の２条件で細胞を播種した。

（条件１） ２×１０^４個ＡＳＣ生存有核細胞数／０．２ｍＬ培地（※４）／ｃｍ^２（播種翌日にＡＳＣが９０％コンフルエンシーになっている播種密度）、
（条件２） ３．５×１０^４個ＡＳＣ生存有核細胞数／０．２ｍＬ培地（※４）／ｃｍ^２（播種翌日にＡＳＣが１００％コンフルエンシーとなる播種密度）。

翌日、同容量の新鮮培地（※４）に交換し、３日後（培養開始から４日後）に培地を遠沈管に速やかに回収し、スイング式遠心機で８００Ｇ，１０分遠心し、細胞とデブリスを沈殿させ、上清をＣＭとして回収した。ＡＳＣが培養上清に分泌する増殖因子の内、文献上報告があるＨＧＦ量についてＨｕｍａｎ ＨＧＦ ＥＬＩＳＡｋｉｔ（＃２８）で定量した。測定結果を図４に示す。

条件１（２×１０^４個ＡＳＣ生存有核細胞数）（播種翌日にＡＳＣが９０％コンフルエンシーになっている播種密度）と、条件２（３．５×１０^４個ＡＳＣ生存有核細胞数）（播種翌日にＡＳＣが１００％コンフルエンシーとなる播種密度）とでは、ＣＭ中のＨＧＦ量に違いがあった。以上より、ＣＭ調製のためのＡＳＣ播種密度、及び培地量は、６％Ｏ_２環境で条件２（３．５×１０^４個ＡＳＣ生存有核細胞数／０．２ｍＬ培地（※４）／ｃｍ^２とした。

＜手順－２＞
上述の実施例１のＳＶＦ調製、及び実施例２のＡＳＣの継代培養によりＡＳＣをｐａｓｓａｇｅ ｎｕｍｂｅｒ（Ｐ）＝１まで培養し、ＡＳＣの細胞懸濁液を得た。有核生細胞数をセルカウンター（＃１０）で計測した。細胞培養ディッシュ（＃１４）に６％Ｏ_２環境で条件２（３．５×１０^４個 生存有核細胞数／０．２ｍＬ培地（※４）／ｃｍ^２）でＡＳＣを播種した。Ｄａｙ３，６，８，１１に培養上清を回収し、同量の新鮮培地（※４）を添加した。Ｄａｙ １１のみ新鮮培地群（※４）、及び新鮮培地（ＦＢＳ不含）群（※５）で培養した。培養上清は、遠沈管に速やかに回収し、スイング式遠心機で８００Ｇ，１０分遠心し、細胞とデブリスを沈殿させ、上清をＣＭとして回収し、－８０℃で保管した。ＨＧＦ量についてＨｕｍａｎ ＨＧＦ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（＃２８）で定量した。測定結果を図５に示す。

以下４条件、（１）Ｄ３－Ｄ６、（２）Ｄ８－Ｄ１１ ｗｉｔｈ ＦＢＳ、（３）Ｄ８－Ｄ１１ ｗｉｔｈｏｕｔ ＦＢＳ、コントロール新鮮培地（ＦＢＳ不含）（※５）について、Ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｒｒａｙ（＃２９）でＣＭ中の分泌因子の判定量解析を実施した。撮影は、ルミノイメージアナライザー（＃３０）で行なった。測定結果を図６に示す。

抗体アレイに含まれる４１種類の増殖因子は、Ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ，ｂＦＧＦ， ｂ－ＮＧＦ，ＥＧＦ，ＥＧＦＲ，ＦＧＦ－４，ＦＧＦ－６，ＦＧＦ－７，Ｇ－ＣＳＦ，ＧＤＮＦ，ＧＭ－ＣＳＦ，ＨＢ－ＥＧＦ，ＨＧＦ，ＩＧＦＢＰ－１，ＩＧＦＢＰ－２，ＩＧＦＢＰ－３，ＩＧＦＢＰ－４，ＩＧＦＢＰ－６，ＩＧＦ－１，ＩＧＦ－１ｓＲ，ＩＧＦ－２，Ｍ－ＣＳＦ，Ｍ－ＣＳＦ Ｒ，ＮＴ－３，ＮＴ－４，ＰＤＧＦＲａ，ＰＤＧＦＲｂ， ＰＤＧＦ－ＡＡ，ＰＤＧＦ－ＡＢ，ＰＤＧＦ－ＢＢ，ＰＬＧＦ，ＳＣＦ，ＳＣＦ Ｒ，ＴＧＦ ａｌｐｈａ，ＴＧＦ ｂｅｔａ １，ＴＧＦ ｂｅｔａ ２，ＴＧＦ ｂｅｔａ ３， ＶＥＧＦ－Ａ，ＶＥＧＦＲ２，ＶＥＧＦＲ３，ＶＥＧＦ－Ｄである。

播種翌日にＡＳＣが１００％コンフルエンシーとなる播種密度でも、さらにＡＳＣは重畳した。ＨＧＦ量は、培養前半（増殖期）よりも培養後半（分化期）で増大した（図５）。

各条件の培養上清（ＣＭ）について、矢印で示した増殖因子の増大傾向が確認できた（図６）。条件により、量、及び増殖因子の種類が異なるため、必要に応じた条件でＣＭを回収することができる。また、限外濾過膜を用いた浄化濃縮により、これらの増殖因子は、より濃縮される。

抗体アレイとＥＬＩＳＡの測定結果を組み合わせることにより推測される、濃縮液における各サイトカインの濃度の推測値を以下に示す。
培養上清を３０倍濃縮する場合、濃縮液中、
ＶＥＧＦ： ２５０ｎｇ／ｍＬ
ＦＧＦ７（ＫＧＦ） １２０００ｐｇ／ｍＬ
ＰＤＧＦ－ＡＡ： ５０ｎｇ／ｍＬ
ＰＤＧＦＲ－β： １２５ｎｇ／ｍＬ
ＴＧＦβ： １５００ｐｇ／ｍＬ
ＩＧＦＢＰ－６： ２０００ｎｇ／ｍＬ
ＩＧＦＢＰ－４： ３５０ｎｇ／ｍＬ
ＩＧＦＢＰ－３： １７０ｎｇ／ｍＬ
ＩＧＦＢＰ－２： ２７０ｎｇ／ｍＬ
ＩＧＦＢＰ－１： ４０ｎｇ／ｍＬ

実施例５：酸素濃度、血清（１０％ＦＢＳ）有無によるＨＧＦ産生への影響
＜測定方法・キット＞
ＥＬＩＳＡ法、Ｈｕｍａｎ ＨＧＦ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃ＤＨＧ００Ｂ）

＜測定対象サンプル＞
（１）培養上清サンプルの回収
ｈＡＳＣｓを通常播種密度（２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２）でフラスコに播種し、３７℃、５％ＣＯ_２、酸素濃度では、１％Ｏ_２、６％Ｏ_２、２１％Ｏ_２設定したインキュベーターに培養した。培養上清回収と培地交換スケジュールは、図７に示す。Ｄ６（６日目）回収後の培地交換では、血清（１０％ＦＢＳ）ありと血清なし培地に使い分けた。

（２）培養上清サンプルの処理
回収した培養上清では、遠心分離により細胞破片などを除去し、上澄みを－８０℃で保存した。

＜結果＞
測定結果を図８に示す。
血清有無に関わらず、１％Ｏ_２環境培養において、培養上清中ＨＧＦの検出がごく僅か。一方、６％Ｏ_２、２１％Ｏ_２培養条件ともに、血清フリー培地と比較して、１０％ＦＢＳ含む培地での培養では、ＨＧＦ産生量が多いことが確認され、さらに６％Ｏ_２と血清添加する培地培養したＡＳＣは、ＨＧＦをより多く放出された。

生体内環境において、酸素濃度は平均５～７％程度と言われ、大気中の酸素濃度（通常酸素環境）と比較し、低酸素環境である。生体内環境に最も近い６％Ｏ_２ではＡＳＣの生存にはより適切であり、ＨＧＦ産生にもいい条件と考えられた。
培養上清中最大限にＨＧＦ放出するためには、培養容器の接着面がコンフルエントになるようｈＡＳＣｓを大量に播種し、１０％ＦＢＳ添加した培地および６％Ｏ_２条件で継続培養することが好ましいことが推測される。

実施例６：培養上清、濃縮液、濃縮後廃液中ＨＧＦ定量測定
＜測定方法・キット＞
ＥＬＩＳＡ法、Ｈｕｍａｎ ＨＧＦ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃ＤＨＧ００Ｂ）

＜測定対象サンプル＞
培養上清、濃縮液、濃縮後廃液、それぞれ３回分の混合物［正常酸素（２１％Ｏ_２）条件で培養）］

＜方法＞
培養上清中に産生された有用因子（例、ＨＧＦ）では、ｈＡＳＣｓ細胞数と正の相関を有する。回収日の違いによってＨＧＦ濃度も異なることを想定し、回収コース１ヶ月を、Ｄａｙ １－９、Ｄａｙ １０－１８、Ｄａｙ １９－３０、３群に分ける。培養上清、濃縮液、濃縮後廃液、それぞれ３回分の混合物を用いてＨＧＦ定量解析を行った。Ｄａｙ １－９ で回収した培養上清、濃縮液、濃縮後廃液中ＨＧＦ定量解析した結果を図９に示す。

＜結果＞
培養上清中、ｈＡＳＣｓ細胞より分泌されたＨＧＦが確認された。濃縮液にＨＧＦ濃度は、濃縮前の約３０倍であった。濃縮後廃液中ＨＧＦの残存がほとんど認められなかった。

＜考察＞
培養上清の濾過濃縮に伴い、濃縮液に有用因子の増加が想定された。今回、培養上清中最も注目されている増殖因子であるｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ （ＨＧＦ）を対象として分析を行った。全回収コースに濃縮液中ＨＧＦ濃度では、濃縮前培養上清と比較し、２０倍～３０倍高かった。

実施例７：培養上清、濃縮液、濃縮後廃液中アンモニア濃度測定
＜測定方法＞
富士ドライケムＮＸ１０Ｎ（富士フイルムメディカル株式会社）
富士ドライケムスライドＮＨ_３－ＰＩＩ（血漿用）（富士フイルムメディカル株式会社）

＜測定対象サンプル＞
培養上清、濃縮液、濃縮後廃液、それぞれ１０回分（１ヶ月）の混合物。コントロールとして、Ｄ－ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２（１０％ＦＢＳ，１％ＰＳ）を用いる。

＜結果＞
富士ドライケムスライドＮＨ_３－ＰＩＩ（血漿用）におけるアンモニア濃度の定量可能範囲は、１０～５００μｇ／ｄＬである。したがって、上記サンプルを定量範囲内になるよう希釈して測定して、希釈倍数をさらに乗じることによって、正確な測定値を計算することができる。
測定結果を図１０に示す。

＜考察＞
上記測定結果では、培養上清、濃縮液と濃縮後廃液にアンモニア濃度の変化が認められなかったが、質量に換算すると、濃縮液にアンモニアの量では培養上清の約３０分の１になった。濃縮液を希釈し、限外濾過を行う、その回数を増やすことによって、液中のアンモニア濃度を測定限界以下にすることができる。
たとえば、一次濾過後の濃縮液に基礎培地（滅菌した蒸留水や超純水、或いはｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳなど）を添加して希釈（例：３０倍希釈）する。希釈液を撹拌型限外濾過装置で、二次限外濾過を行う（例、３０倍濃縮）。これにより、濃縮液が、低分子量のもの（特に有害物質であるアンモニア、乳酸など）に関しては、基礎培地などの成分にほとんど置き換えられる。なお、増殖因子をはじめとする有効因子では、大分子量であるため、ほとんどが濃縮液に保っている。この濃縮と浄化の工程は、その程度と回数を調節することが可能であるため、最終的な濃縮と浄化の程度は無限である。

実施例８：培養上清、濃縮液、濃縮後廃液によるｈＡＳＣｓ増殖能への影響（細胞増殖実験）
＜測定対象サンプル＞
培養上清、濃縮液、濃縮後廃液の原液では、それぞれ１０回分（１ヶ月）の混合物である。
培養上清原液、濃縮液と段階希釈液、濃縮後廃液と段階希釈液を、以下表１で示したとおりに調製した。コントロール（ｃｏｎｔｒｏｌ）として、１％ＰＳを含有Ｄ－ＭＥＭ／Ｈａｍ′ｓ Ｆ－１２（以下、ＤＭＥＭ－Ｆ１２と省略記載）用いて、ビヒクル（Ｖｅｈｉｃｌｅ）群ではＤＭＥＭ－Ｆ１２／１０％ＦＢＳ／１％ＰＳを使用した。

＜方法＞
細胞増殖能測定するため、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８ （ＣＣＫ－８，株式会社同仁化学研究所、＃ＣＫ０４）を用いた。細胞中の脱水素酵素により産生されるＮＡＤＨは、電子伝達物質である１－Ｍｅｔｈｏｘｙ ＰＭＳを介して、水溶性テトラゾリウム塩（ＷＳＴ－８）を橙色のホルマザンに還元されます。このホルマザン色素の量（極大吸収波長４５０ｎｍ）は生細胞数に比例し、吸光度測定により生細胞数測定が可能である。ｈＡＳＣｓは継代数Ｐ４を使用し、３０００ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）で播種した（ｎ＝４）。培養は、３７℃，５％ＣＯ_２、２１％Ｏ_２で実施した。表１で示したように用意されたサンプルを１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、培養４日目ＣＣＫ－８ ａｓｓａｙを行い、マイクロプレートリーダーで吸光度（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ）を測定した。

＜結果＞
測定結果を図１１に示す。
コントロール（ＤＭＥＭ－Ｆ１２、１％ＰＳ）群と比較し、濃縮液の１００倍希釈液（ＣＣＭ＿１／１００）でも、細胞増殖を有意に増加させた。この増殖促進能は、ビヒクル（ＤＭＥＭ－Ｆ１２／１０％ＦＢＳ／１％ＰＳ）群と有意な差が認められなかったが、濃縮液希釈液（１０倍希釈液ＣＣＭ＿１／１０、３倍希釈液ＣＣＭ＿１／３）と濃縮液原液では顕著に細胞増殖促進させた。ビヒクル群と比較し、濃縮後廃液３倍希釈液（Ｗ／ＣＣＭ＿１／３）添加により、細胞増殖能を有意に抑制させ、濃縮後原液（Ｗ／ＣＣＭ）では細胞増殖能を著しく低下させた。

実施例９：培養上清、浄化濃縮液によるヒト皮膚線維芽細胞、正常ヒト表皮角化細胞増殖への影響（細胞増殖実験）
＜試薬・方法＞
正常ヒト皮膚線維芽細胞（ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ，ＮＨＤＦ）または、正常ヒト表皮角化細胞（ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ，ＮＨＥＫ）を１ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬで９６ウェルプレートに播種した（ｎ＝４）。２４時間後、コントロールないし段階的に希釈された培養上清浄化濃縮液に交換した。

ＮＨＤＦでは、コントロールのＤ－ＭＥＭ／Ｈａｍ’s Ｆ－１２ないし５％ＦＢＳ添加したＤ－ＭＥＭ／Ｈａｍ’s Ｆ－１２を用いて表１に記載のＣＣＭ（濃縮液原液）希釈液を調製した。一方、ＮＨＥＫでは、コントロールのＫＧＭ－Ｇｏｌｄ（Ｌｏｎｚａ，＃１９２０６０）培地を用いて表１に記載のＣＣＭ（濃縮液原液）希釈液を調製した。

細胞増殖能測定するため、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８ （ＣＣＫ－８，株式会社同仁化学研究所、＃ＣＫ０４）を用いた。
培養７２時間後、ＣＣＫ－８ ａｓｓａｙを行い、マイクロプレートリーダーで吸光度（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ）を測定した。

＜結果＞
測定の結果を図１２に示す。
ヒト皮膚線維芽細胞において、５％ＦＢＳの存在にもかかわらず、細胞増殖能はＣＣＭを濃度依存的に増加することが確認された（図１２の左図）。
正常ヒト表皮角化細胞においても、ＣＣＭ添加により細胞増殖を促進することが認められた（図１２の右図）。

実施例１０：培養上清、培養上清浄化濃縮液による血管内皮細胞管腔形成能への影響（内皮細胞管腔形成試験）
＜測定サンプル＞
培養上清（表１に記載のＣＭ）及び培養上清浄化濃縮液（表１に記載のＣＣＭ）を下記表で示すように調製した。

＜方法＞
内皮細胞管腔形成能を評価するため、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ, ＨＵＶＥＣ）を使用した。ＨＵＶＥＣは、対数増殖期に入っているまでにＥＧＭ－２培地（Ｌｏｎｚａ，＃ＣＣ－４１７６）を用いて培養する。管腔形成解析に先たち、ＨＵＶＥＣを１２時間無血清状態にしておく。マトリゲル基底膜マトリックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃３５６２３１）を４℃で一晩かけて解凍し、実験中は常に氷上に置いておく。９６ウェルプレートのウェルに、解凍したマトリゲルを５０μＬずつ入れって、インキュベーターに１時間静置する。ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓを用いて飢餓状態のＨＵＶＥＣを剥がした後、ＨＵＶＥＣをペレット化する。コントロール群及び実験群は上記表の通りで調製し、ＨＵＶＥＣを１×１０^５個／ｍＬの密度で再度浮遊させ、マトリゲルを入っていたウェルに細胞懸濁液を１００μＬずつ入れる（ウェル１つ当たりの細胞数は１×１０^４個）。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２条件下に置き、４～６時間培養した。培養したプレート上の細胞を、位相差顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）にて、４０倍の倍率で撮影した。管腔形成能の程度は、無作為に撮影した５つの顕微鏡画像を用い、形成された管腔の長さを画像解析ソフトであるＩｍａｇｅＪを用いて評価した。

＜結果＞
測定の結果を図１３に示す。
コントロール群と比較して、ＣＭ希釈液添加群は明らかな変化が認められず、濃縮液の希釈液添加群では、管腔形成を促進する作用を示した。

実施例１１：
＜方法＞
８週齢のｄｂ／ｄｂマウス（ＢＫＳ．Ｃｇ－＋Ｌｅｐｒ^ｄｂ／＋Ｌｅｐｒ^ｄｂ／Ｊ）、及びそのコントロールマウス（ＢＫＳ．Ｃｇ－Ｄｏｃｋ７^ｍ＋／Ｄｏｃｋ７^ｍ＋／Ｊ）を実験に使用した。マウスは１匹ずつ別のケージで飼育し個体識別を行った。イソフルラン吸入下にマウス背部をバリカンにて剃毛し、剃毛部に滅菌バイオプシーパンチ（６．０ｍｍ直径、Ｋａｉ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社）にて皮膚全層を剥離して潰瘍を作成した。創収縮を防ぐ目的でドーナツ型のシリコンスプリント（ドーナツ穴直径９ ｍｍ、外径１５ ｍｍ、厚さ１ ｍｍ、共和工業）を６－０ナイロンで固定した。潰瘍作成日を０日目として０日目、３日目、６日目にそれぞれ試料を１匹あたり表１に記載の濃縮液原液ＣＣＭ０．１ｍｌずつを注射器を用いて潰瘍周囲皮下に４方向に分けて均等に注射した。創部はモイスキンパッドでドレッシングしてシリコンスプリントの脱落および創部乾燥を防いだ。ＣＣＭはＡＳＣを培養時の培養上清を浄化濃縮したものを使用した。０日目から２１日目までの創部経過を一眼レフカメラでマクロ撮影し、創面積から創傷治癒促進効果を評価した。マウスは２１日目に５％イソフルラン吸入により安楽死させた。

＜結果＞
評価の結果を図１４に示す。
ＣＣＭを投与することにより、２型糖尿病マウスの創傷治癒遅延が有意に改善されることが明らかとなった。

実施例１２：ＡＳＣにおいて血小板溶解液による細胞増殖能、ＨＧＦ産生能への影響
＜試薬・キット＞
血小板溶解液（ｈｕｍａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｌｙｓａｔｅｓ， ｈＰＬ）
ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ， ＦＢＳ）
ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ，＃１２６０４－０２１）
Ｈｕｍａｎ ＨＧＦ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ＃ＤＨＧ００Ｂ）

＜測定対象サンプル＞
（１） 培養上清サンプルの回収
ｈＡＳＣｓを２．５×１０^４ ｃｅｌｌｓ／ｍＬで１００ｍｍディッシュに播種し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで培養する。２４時間後、培地を１０％ＦＢＳ、５％ｈＰＬそれぞれ添加したＤ－ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２に交換し、７日間培養した。

（２）培養上清サンプルの処理
７日間培養後、各ディッシュの培養上清を回収し、遠心分離により細胞破片などを除去し、上澄みを－８０℃で保存した。培養上清回収後、細胞をＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓによって剥離し、有核細胞数をセルカウンター（Ｌｏｇｏｓ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，＃Ｌ３０００１）でカウントした。

＜結果＞
測定の結果を図１５に示す。
図１５の左図で示すように、１０％ＦＢＳ添加した培地を用いてＡＳＣを培養する場合は、Ｄａｙ０（Ｄ０）播種時と比較して、Ｄ７では２倍ほど細胞数を増えていた。一方、５％ｈＰＬ添加した培地では、細胞数を約８倍増加させたことが確認された。
Ｄ７で回収した培養上清中ＨＧＦ濃度を比較した結果、５％ｈＰＬで培養したｈＡＳＣｓより放出したＨＧＦ量は明らかに多いことも確認された（図１５の右図）。

＜考察＞
ヒト血小板溶解液（ｈｕｍａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｌｙｓａｔｅｓ，ｈＰＬ）では、ＦＢＳよりもｈＡＳＣｓの細胞増殖能およびＨＧＦ産生能を高めさせたことが確認された。

実施例１３：ＡＳＣにおいて各種増殖因子によるＨＧＦ産生能への影響
＜試薬・キット＞
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＦＧＦ ｂａｓｉｃ／ＦＧＦ２ （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ＃２３３－ＧＭＰ）
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＬＲ３ ＩＧＦ－１／ＩＧＦ－１ ＧＭＰ （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ＃８３３５Ｄ－ＧＭＰ）
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＰＤＧＦ－ＢＢ （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ＃ＡＦ２２０）
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＥＧＦ （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ＃２３６－ＥＧ－２００）
Ｈｕｍａｎ ＨＧＦ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ＃ＤＨＧ００Ｂ）

＜測定対象サンプル＞
（１）培養上清サンプルの回収
ｈＡＳＣｓを５×１０^４ ｃｅｌｌｓ／ｍＬで４８ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ_２、２１％Ｏ_２で培養する。２４時間後、培地をｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＩＧＦ（ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＥＧＦ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、 ＰＤＧＦ－ＢＢ（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ＢＢ）をそれぞれ添加したＤ－ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２に交換し、７２時間培養する。ｈＡＳＣｓにおける各種増殖因子の終濃度では、０、２．５、５．０、１０．０、２０．０、５０．０、１００．０ｎｇ／ｍＬであった。

（２）培養上清サンプルの処理
７２時間培養後、各ウェルの培養上清を回収し、遠心分離により細胞破片などを除去し、上澄みを－８０℃で保存した。

＜結果＞
ＨＧＦ産生能の測定結果を図１６に示す。
ｈＡＳＣｓにおいて、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ－ＢＢではＨＧＦ産生に促進する作用を示した。ｂＦＧＦの最適濃度では、２０ｎｇ／ｍＬであり、ＰＤＧＦ－ＢＢでは１００ｎｇ／ｍＬであった。一方、ＩＧＦ、ＥＧＦでは、ＨＧＦ産生に影響が認められなかった。

＜考察＞
ｂＦＧＦ及びＰＤＧＦ－ＢＢ両因子ともにＨＧＦ産生を促進したが、ｂＦＧＦでは比較的低濃度で効果が表す一方で、この効果がｂＦＧＦ終濃度２０ｎｇ／ｍＬまで示した。一方、ＰＤＧＦ－ＢＢでは、濃度依存的にＨＧＦ産生を促進した。
ＰＤＧＦ－ＢＢは、血小板由来増殖因子であり、血小板溶解液（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｌｙｓａｔｅｓ， ＰＬ）には大量に含まれている。ＡＳＣ培養において、ＦＢＳ以外に、ＰＬをサプリメントとしての有用性も考えられる。

実施例１４：幹細胞培養方法および浄化濃縮工程の調整による浄化濃縮液品質への影響
＜試薬・キット＞
血小板溶解液（ｈｕｍａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｌｙｓａｔｅｓ， ｈＰＬ）
Ｈｕｍａｎ ＨＧＦ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃ＤＨＧ００Ｂ）
富士ドライケムＮＸ１０Ｎ（富士フイルムメディカル株式会社）
富士ドライケムスライドＮＨ_３－ＰＩＩ（血漿用）（富士フイルムメディカル株式会社）

＜測定対象サンプル＞
（１）培養上清サンプルの回収
ｈＡＳＣｓを２．５×１０^５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬで１５０ｍｍディッシュに播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養する。培地は、Ｄ－ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２に５％ｈＰＬおよび特定のサプリメントを添加したものを使用した。７日間毎に培養上清回収および培地交換を行った。回収日毎にロット番号を付けた。

（２）培養上清の限外濾過工程
回収された培養上清は、遠心分離により細胞破片などを除去し、上澄みを約３０倍濃縮するよう撹拌型限外濾過装置で一次濾過を行った。その後、一次濾過後得られた「一次濃縮液」をｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）にて３０倍に希釈し、再度限外濾過を行った。よって、（１）で回収されたロット別の培養上清それぞれ３４０ｍＬに対し、二回限外濾過を経て約１０ｍＬ浄化濃縮液を得る。二次濾過後の浄化濃縮液を対象として、ＨＧＦ濃度およびアンモニア濃度を測定する。

＜測定方法＞
ＨＧＦ濃度の測定は、Ｈｕｍａｎ ＨＧＦ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔを用いて測定した。アンモニア濃度の測定は、富士ドライケムＮＸ１０Ｎおよび富士ドライケムスライドＮＨ_３－ＰＩＩ（血漿用）を用いて測定した。

＜測定結果＞
測定結果を表４に示す。

＜考察＞
培養方法（基礎培地に添加するサプリメント）および限外濾過の回数を調節することで、よりＨＧＦ濃度の高く、アンモニア濃度の低い浄化濃縮液を得ることができた。

実施例１５：培養上清、浄化濃縮液による炎症性サイトカイン産生への影響
＜試薬・キット＞
Ｈｕｍａｎ ＩＬ－６ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ＃Ｄ６０５０）
Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＯ５５：Ｂ５ （Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， ＃Ｌ６５２９）
培養上清及び浄化濃縮液を下記表で示すように調製した。

＜測定対象サンプル＞
（１）正常ヒト皮膚線維芽細胞馴化培養液サンプルの回収
正常ヒト皮膚線維芽細胞（ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ，ＮＨＤＦ）を３×１０^５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬで６ウェルプレート（２枚分）に播種し、３７℃、５％ＣＯ_２、２１％Ｏ_２で培養する。２４時間後、培地をＤ－ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２に交換し、６時間無血清状態にしておく。飢餓状態のＮＨＤＦを表５で用意された培地にて培地交換する。２４ｈ時間後、培地をアスピレーターにて除去され、ＮＨＤＦ細胞をＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で２回洗浄する。その後、ＮＨＤＦ細胞をＬｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ（ＬＰＳ）未添加、ないしＬＰＳ終濃度１００ｎｇ／ｍＬ添加したＤ－ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地で６ｈ培養しておく。６ｈ後、各条件でのＮＨＤＦ細胞馴化培養液をそれぞれ回収する。

（２）ＮＨＤＦ細胞馴化培養液サンプルの処理
上記（１）で回収されたＮＨＤＦ細胞馴化培養液を遠心分離により細胞破片などを除去し、上澄みを－８０℃で保存した。

＜測定方法＞
ＮＨＤＦ細胞馴化培養液中炎症性サイトカインＩＬ－６の濃度では、ＥＬＩＳＡ法にて測定した。

＜結果＞
測定結果を図１７に示す。
ＮＨＤＦ細胞において、ＬＰＳ １００ｎｇ／ｍＬ添加では、炎症性サイトカインであるＩＬ－６の分泌を促進したことが示した。また、ＬＰＳの存在にも関わらず、コントロール群と比較し、培養上清原液（ＣＭ）添加群では、ＮＨＤＦ細胞のＩＬ－６分泌能を抑制することを示し、濃縮液原液の１００倍希釈液（CＣＭ＿１／１００）及び濃縮液原液の３０倍希釈液（CＣＭ＿１／３０）添加群では、ＩＬ－６産生を大幅に抑制することが示した。

＜考察＞
ＩＬ－６では、免疫応答や炎症反応の調製において重要な役割を果たすサイトカインであり、ＩＬ－６を過剰に産生すると、さまざまな病態を引き起こすことが知られています。幹細胞培養上清では軽度の抗炎症作用を示したが、培養上清濃縮液では、添加量が少量でも明らかな抗炎症作用を示した。培養上清濃縮液では、抗炎症剤として応用される可能性も示唆された。

Claims (11)

1. 間葉系幹細胞又はそれに由来する前駆細胞が分泌するＩＧＦＢＰ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＫＧＦ（ＦＧＦ－７），ＰＤＧＦＲ、ＴＧＦα、及びＴＧＦβの少なくとも一以上を含み、間葉系幹細胞又はそれに由来する前駆細胞による代謝老廃物である乳酸及びアンモニアが除去されている、間葉系幹細胞又はそれに由来する前駆細胞の培養上清の浄化濃縮物。
2. 再生医療用治療剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、又は抗線維化剤として使用するための、請求項１に記載の浄化濃縮物。
3. 間葉系幹細胞又はそれに由来する前駆細胞が分泌するＩＧＦＢＰ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＫＧＦ（ＦＧＦ－７），ＰＤＧＦＲ、ＴＧＦα、及びＴＧＦβの全てを含む、請求項１又は２に記載の浄化濃縮物。
4. 濃縮前の培養上清と比べて、ＩＧＦＢＰ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＫＧＦ（ＦＧＦ－７），ＰＤＧＦＲ、ＴＧＦα、及びＴＧＦβの少なくとも一以上の濃度が１．２倍以上に濃縮されている、請求項１から３の何れか一項に記載の浄化濃縮物。
5. 間葉系幹細胞又はそれに由来する前駆細胞が、脂肪由来間葉系幹細胞又は脂肪由来血管内皮前駆細胞である、請求項１から４の何れか一項に記載の浄化濃縮物。
6. アンモニア濃度が２０μｇ／ｄＬ以下であり、ＨＧＦ濃度が５００００ｐｇ／ｍＬ以上である、請求項１から５の何れか一項に記載の浄化濃縮物。
7. 間葉系幹細胞又はそれに由来する前駆細胞を培養液中において培養することにより培養上清を取得する培養上清取得工程；前記培養上清から有用成分を濃縮する濃縮工程
   前記濃縮培養上清から代謝老廃物を除去する浄化工程；
   を含む、請求項１から６の何れか一項に記載の浄化濃縮物の製造方法。
8. 培養上清取得工程において、増殖期又はコンフルエント期の状態にある間葉系幹細胞又はそれに由来する前駆細胞の培養物から培養上清を取得する、請求項７に記載の方法。
9. 浄化工程において除去される代謝老廃物が、乳酸およびアンモニアである、請求項７又は８に記載の方法。
10. 浄化工程を限外濾過により行う、請求項７から９の何れか一項に記載の方法。
11. 限外濾過を、分画分子量２ｋＤａ～３０ｋＤａの濾過膜を使用して行う、請求項１０に記載の方法。

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