CN112957526A - 基于丝素蛋白的取向性生物墨水及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于丝素蛋白的取向性生物墨水及其制备方法和应用。本发明利用具有电、磁响应性的纳米纤维的电、磁响应性在电场或磁场作用下形成纤维取向结构,制备出适用于多种类型的3D打印机的取向性生物墨水,可构建纳米‑微米‑宏观的多级高取向度仿生结构。
Description
技术领域
本发明涉及仿生材料技术领域,尤其涉及一种基于丝素蛋白的取向性生物墨水及其制备方法和应用。
背景技术
如今,生物医学领域越来越多得采用仿生的方法构建人体组织、器官结构以进行功能或病理学等研究。仿生方法是利用合适的生物材料模仿生物体特征(结构、构造等),构建仿生支架,实现体内外的生物活性和相应功能运作。
动物组织的力学和生物学特性不仅取决于其化学成分,还取决于结构分子和生物因子的特定空间排列,即取向。人体中各组织、器官的物质分布是不均匀、不连续、各向异性的,即使是同一生物组织,不同的部位也有不同的宏观以及微纳米结构,所以在结构上往往有内外层次之分,以及表现出层状分布的组织结构。在这些不同层次的结构中,其力学性能,如弹性、粘性、密度、热胀系数以及内应力的大小均不相同。正是由于不同生物组织有着不同的力学特性,有着不同的层次结构和组织,所以才使得力学作用(信息)有不同的传递方式。许多各向异性组织和器官,例如软骨是由含Ⅰ型胶原(COLⅠ)纤维的氨基葡聚糖基基质组成,其取向特定,与软骨表面平行,在较深层垂直;肌腱平行排列、心肌倾斜排列、皮肤交织网格排列、角膜是正交晶格结构、骨骼是同心编织排列的。因此,对于人体中各向异性组织,构建同组织相似的结构层次是体外组织模型构建、大规模细胞培养和分化以及组织再生的关键。
现有研究实现有序取向的方法有利用纳米纤维固有结构取向和剪切应力诱导,施加外场诱导纳米膜或分子链在随后的复杂聚合或凝胶过程前临时取向,或利用超声波诱导细胞取向等。
传统仿生支架的构建方法有相分离法、纤维编织法、气体发泡法和溶剂浇铸/粒子沥滤法,但存在支架结构及性能难以精确控制的问题。新兴仿生支架的构建技术有溶液静电纺丝技术和生物3D打印技术。其中溶液静电纺丝技术虽然可以制备模仿ECM(细胞外基质)环境的组织工程支架,但其在技术上存在溶剂处理困难和射流稳定直线段短以及制备的支架存在孔径过小和机械强度低等问题。
同其它制备方法相比,生物3D打印的最大优势在于其能够模拟不同组织和器官的复杂结构,在微观取向的同时,构建三维立体宏观结构,更好地满足不同组织的个性化需求,同时支架可以具有一定的机械强度,更能满足仿生组织的功能性要求。
目前WonJin Kim和GeunHyung Kim以及A.Schwab等人利用胶原蛋白原纤维形成和剪切应力诱导取向的方式制备生物墨水,打印出细胞取向对齐排列的组织支架。打印中的剪切应力使胶原纤维在3D打印结构中形成取向,并对细胞的行为产生直接影响。制备的生物墨水有良好的可打印性,能够诱导、调控细胞的粘附、取向和分化。该技术的一个不足是剪切诱导微米级纤维的排列,限制了纤维取向对细胞取向的诱导能力,因为细胞感知的是纳米级材料在微米级别上的取向性。另一个不足是复合材料中的胶原纤维,以及微观结构的排列如何影响细胞排列都缺少量化分析。
而吴耀彬等人也发明了一种直写成型3D打印生物墨水,利用纤维素纳米纤维水凝胶剪切变稀的特性和甲基丙烯酸酯聚合物可光固化的特点,制备出具有生物相容性高,力学性能强,无毒可降解的3D打印生物墨水。利用纤维素纳米纤维固有的结构取向性引导粘附在由其构成的生物墨水支架上的细胞分化生长,形成有固定延伸方向和致密排列的仿生组织环境。但是该生物墨水存在着与仿生组织不同的取向结构,无法实现个性化的模拟、可调控的不足,并且仅依靠剪切力取向无法获得较高的取向度,难以构建高取向度的仿生组织。
上述两种剪切力诱导纤维取向方法仅仅适合于挤出式3D打印机,而挤出式3D打印机由于其尺寸精密度非常低,无法构建具有高精密度的复杂仿生结构。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明的目的是提供一种基于丝素蛋白的取向性生物墨水及其制备方法和应用。
本发明利用具有电、磁响应性的纳米纤维的电、磁响应性在电场或磁场作用下形成纤维取向结构,制备出不仅仅可以适用于挤出式3D打印机,还可以适用于光交联3D打印机的取向性生物墨水,在挤出式3D打印过程中和微流控技术的共同作用下可构建高取向度生物墨水。进一步地实现同ECM相似的纳米-微米-宏观的多级高取向度仿生结构的构建,能够更好地调控细胞行为。
为实现上述技术目的,本发明采用如下技术方案:
一方面,本发明提供了一种基于丝素蛋白的取向性生物墨水,其包括电场响应性丝素蛋白纳米纤维或磁场响应性丝素蛋白纳米纤维以及溶剂;电场响应性丝素蛋白纳米纤维或磁场响应性丝素蛋白纳米纤维经电场或磁场作用沿同一方向取向分布;电场响应性丝素蛋白纳米纤维包括β-折叠含量为20%以上,表面电荷为-20mV~-75mV的丝素蛋白纳米纤维;磁场响应性丝素蛋白纳米纤维包括丝素蛋白纤维以及分布于所述丝素蛋白纤维内部和/或表面的磁性纳米颗粒。
丝素蛋白在结构和性能方面可调节性强,可满足多种的组织需求,是组织工程和再生医学研究的重要材料。丝素蛋白具有优异的生物相容性、低/无免疫原性、可调控的机械性质、硬度和降解性能,已被美国食品药品监督管理局(US FDA)批准为可用于人体内的生物医用材料。因此,本发明的生物墨水其生物安全性较高。
进一步地,取向性生物墨水中,电场响应性丝素蛋白纳米纤维或磁场响应性丝素蛋白纳米纤维的质量分数为0.1%~7%。
进一步地,电场响应性丝素蛋白纳米纤维的直径为1-500nm,长度1μm以上。
进一步地,磁场响应性丝素蛋白纳米纤维中,磁性纳米颗粒以及丝素蛋白的质量比为1:20~50;磁性纳米颗粒的粒径为10~30nm。
进一步地,磁性纳米颗粒包括有超顺磁性Fe3O4的磁性纳米颗粒、NiFe2O4磁性纳米颗粒和SrFe12O19磁性纳米颗粒中的一种或几种。
进一步地,基于丝素蛋白的取向性生物墨水中还包括增稠剂、PEG、可降解颗粒物、温敏物质、辣根过氧化物酶、光敏剂和细胞中的一种或几种。
优选地,基于丝素蛋白的取向性生物墨水中,增稠剂的质量分数为5~10%,辣根过氧化物酶的浓度为10~30u/mL,光敏剂的质量分数为0.1~0.4%,细胞的浓度为2.5×105~1.5×106cell/mL。
进一步地,增稠剂包括膨润土、纤维素、琼脂糖和明胶中的一种或几种。膨润土具有高溶胀比和强的吸湿性,可吸附8~15倍于自身体积的水量,体积膨胀可达数倍至30倍;在水介质中能分散成胶凝状和悬浮状,溶液具有一定的黏滞性、触变性和润滑性,主要原因是在水中膨润土矿物晶层间距加大,水分子进入了晶层引起膨胀,另外还有膨润土矿物的阳离子交换作用的原因,加入膨润土可以增加溶液的粘度而不影响溶胶的性质。
本发明中,基于丝素蛋白的取向性生物墨水的制备方法包括以下步骤:
(1)制备丝素蛋白溶液;
(2)制备电场响应性丝素蛋白纳米纤维或磁场响应性丝素蛋白纳米纤维;
(3)利用电场或磁场效应诱导丝素蛋白纳米纤维发生取向,得到基于丝素蛋白的取向性生物墨水。
其中,步骤(1)中,丝素蛋白的浓度为5~6%。作为一种实施方式,丝素蛋白溶液的制备方法包括以下步骤:
将蚕丝加入碳酸钠的水溶液中脱胶,脱胶后用纯水搓洗至无滑腻感,干燥后得到脱胶蚕丝。然后将脱胶蚕丝浸入溴化锂溶液中溶解,透析后得到丝素蛋白溶液。
步骤(2)中,电场响应性丝素蛋白纳米纤维的制备方法可采用以下方法:
a)利用步骤(1)制备的丝素蛋白溶液浓缩组装后,稀释、孵育再组装过程制备直径几纳米,长度1-2μm,β-折叠含量为20%以上的丝素蛋白纳米纤维。
b)利用步骤(1)制备的丝素蛋白溶液作为纺丝液通过静电纺丝法制备纳米纤维膜,预处理,使其形成β-折叠含量为35%的丝素蛋白,与此同时赋予纳米纤维强负电性,再经剪碎、超声分散得到纳米纤维分散液。
c)利用低浓度溴化锂和甲酸体系对脱胶蚕丝中丝素蛋白破坏度的调控可以获得直径几纳米,长度1-2μm丝蛋白纳米纤维,预处理,使其形成β-折叠含量为35%的丝素蛋白,与此同时赋予纳米纤维强负电性。
上述电场响应性丝素蛋白纳米纤维具有高β-折叠含量,且具有电响应性。预处理过程中,丝素蛋白二级结构由无规结构逐渐向β-折叠结构转变,纳米纤维表面电荷绝对值也随丝素蛋白材料中β-折叠含量增加而增加。通过调节纳米纤维中丝素蛋白二级结构(β-折叠含量)即可调节纤维表面电荷密度,进而影响纳米纤维在电场中的响应性。常规低β-折叠含量丝素蛋白纳米纤维的表面电荷为-20mV,几乎对电场无响应,而高β-折叠含量丝素蛋白纳米纤维表面电荷为-70mV时,其随电场运动明显。
步骤(2)中,磁场响应性丝素蛋白纳米纤维的制备方法包括以下步骤:
将步骤(1)制备的丝素蛋白溶液与铁源混合,利用化学共沉淀法,经柠檬酸钠或醋酸钠还原制得超顺磁性丝素/Fe3O4复合纳米颗粒。将这些颗粒加入浓度为10~30%的丝素蛋白溶液中混合,超声分散均匀后,通过静电纺丝原位生成得到纤维内部含有超顺磁性Fe3O4的磁性纳米纤维膜,再经过乙醇后处理,以稳定丝素蛋白中的二级结构,超声剪碎后即可获得磁场响应性丝素蛋白纳米纤维。
磁性纳米颗粒为超顺磁纳米粒子,其没有矫顽力,对外磁场的磁感应几乎可以达到瞬间磁化和退磁。此外,超顺磁纳米粒子没有剩磁,可避免由于剩磁作用发生团聚,在溶液、纤维膜中都有均匀的分散和分布。超顺磁性丝素/Fe3O4复合纳米颗粒具有磁响应性,因此利用其制备的磁场响应性丝素蛋白纳米纤维也具有磁响应性,即在外加磁场的作用下沿着磁场取向排列;在无磁场作用时,能够保持取向排布。
优选地,超顺磁性丝素/Fe3O4复合纳米颗粒的直径小于等于20nm。
步骤(3)中,利用电场效应诱导丝素蛋白纳米纤维发生取向的方法包括以下步骤:
方法一:将电场响应性丝素蛋白纳米纤维加入到丝素蛋白溶液的基质中,再加入HRP(辣根过氧化物酶)与PBS缓冲溶液调节pH为7.4,并加入增稠剂,混合均匀后,形成具有一定粘度的溶胶,外加交流电场,输出电压5V,频率100Hz。在电场作用的同时对溶胶进行搅拌,电场响应性丝素蛋白纳米纤维在电场力牵引下沿同一方向均匀取向排列分布,制得取向生物墨水。电极材料可采用医用不锈钢,其连接有控制电压输出的装置,可以在不改变电压的情况下,有效降低溶液中的电流,保证溶胶不被电解,防止装载细胞后因为过热细胞死亡。在电场作用的同时对溶胶进行搅拌,可防止不同部位纳米纤维受到的作用力不同。
方法二:将电场响应性丝素蛋白纳米纤维加入到丝素蛋白溶液的基质中,再加入HRP(辣根过氧化物酶)与PBS缓冲溶液调节pH为7.4,并加入增稠剂,混合均匀后,形成具有一定粘度的溶胶。然后将溶胶注入注射器中,将注射器放置于10V环形电场中,环形电场在距离注射器头端和尾端3cm的范围内沿注射器方向往复运动,保证注射器内的电场响应性丝素蛋白纳米纤维都能受到电场力牵引运动,逐渐形成沿电场线方向的有序取向,制得取向生物墨水。
进一步地,使用上述生物墨水通过3D打印机打印成形后,要将得到的3D打印产品在H2O2(浓度0.01~1wt%)水溶液中浸泡3~30min,因丝素蛋白含有酪氨酸,其可通过HRP、H2O2的共同作用,酶交联形成网状结构,固定纳米纤维取向结构。
进一步地,丝素蛋白交联方式可以是可控的物理交联和化学交联。物理交联包括不同浓度PEG诱导凝胶,条件是在成凝胶时间可控,成凝胶前可以实现电场、磁场诱导下的纳米纤维取向诱导。化学交联包括核黄素-紫外诱导凝胶和光敏丝素蛋白-紫外诱导凝胶。
步骤(3)中,利用磁场效应诱导丝素蛋白纳米纤维发生取向的方法包括以下步骤:
方法一:将磁场响应性丝素蛋白纳米纤维加入到丝素蛋白溶液的基质中,再加入HRP(辣根过氧化物酶)与PBS缓冲溶液调节pH为7.4,并加入增稠剂,混合均匀后,形成具有一定粘度的溶胶。外加磁场采用永磁铁平行放置的装置,当两者之间的距离较小,中间的区域磁场近似均匀。将溶胶放置在两块磁铁中间区域静置5~30分钟,使超顺磁复合纳米颗粒在磁场作用下呈均一取向排列,得到丝素蛋白取向生物墨水。
优选地,永磁铁可以采用钕铁硼磁铁或铁钴镍磁铁。
方法二:制作直径为6cm,长20cm,单位长度线圈匝数为1000的通电螺线管,通入16A的直流,轴线磁场强度约为0.02T,竖直放置套在装有溶胶的烧杯外,由于有限长通电螺线管内部的轴向磁场近似是匀强磁场,但两端磁感应强度会略微减弱,因此将烧杯垫高使烧杯中的溶胶位于螺线管中部,同时在磁场作用过程中进行均匀搅拌,避免径向磁感应强度的影响,使纳米纤维受到相同的磁场力作用,沿磁场线方向取向排列,处理20min后可以得到取向生物墨水。
进一步地,当基于丝素蛋白的取向性生物墨水用于挤出式3D打印机时,墨水中不添加光敏剂而添加HRP。当基于丝素蛋白的取向性生物墨水用于光交联3D打印机时,墨水中添加有光敏剂或光敏丝素蛋白而不添加HRP。
光敏丝素蛋白制备方法如下:将脱胶蚕丝用LiBr溶解后,加入甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)溶液反应得到光敏丝素蛋白,对应引发剂为LAP,光源为强度3.5mJ/cm2的紫外光,引发剂添加比例1:25~75。
挤出式式3D打印模式下,如果采用自持性墨水,选用聚乙二醇作为诱导剂,无需添加增稠剂,但其诱导成凝胶时间必须可控,在凝胶形成前完成取向诱导。
光交联3D打印模式下,可添加增稠剂、也可不添加增稠剂。
进一步地,光敏剂优选为核黄素。
优选地,取向性生物墨水用于光交联3D打印机时,利用电场效应诱导丝素蛋白纳米纤维发生取向时,将HRP与PBS缓冲溶液替换为光敏剂与PBS缓冲溶液。
优选地,取向性生物墨水用于光交联3D打印机时,利用磁场效应诱导丝素蛋白纳米纤维发生取向时,将电场响应性丝素蛋白纳米纤维加入到光敏丝素蛋白溶液的基质中,再加入引发剂。
由光交联3D打印机时打印成型后,在紫外光照射下将纳米纤维固定,形成纳米-微米尺度的3D仿生结构。
进一步地,当基于丝素蛋白的取向性生物墨水中包括细胞时,其制备方法与上述步骤相同,不同之处在于,在利用电场或磁场效应诱导丝素蛋白纳米纤维发生取向过程中,将丝素蛋白溶液的基质替换为含有细胞和丝素蛋白溶液的基质,诱导后以形成装载细胞的取向生物墨水。细胞可选择人骨髓间充质干细胞(hMSCs)或其他离体的生物细胞。
在挤出式3D打印过程中:
将装载细胞的取向生物墨水通过微流控管道(长注射针头或塑料管)转移到挤出式3D打印机的打印料仓内,在此过程中,纳米纤维受到微流控处理,取向度进一步提高。
设置料仓和打印喷头的温度、打印喷头移动速度和挤出压力,根据构建好的CAD仿生数字模型进行3D打印,得到3D结构支架。
将打印得到的支架进行交联,而后放于37℃细胞培养箱中培养,每隔2~3天更换培养基,培养一段时间后即可观察到细胞显著增殖并有明显沿取向方向的生长。
在光交联3D打印过程中:
将装载细胞的取向生物墨水光交联形成3D结构支架。而后放于37℃细胞培养箱中培养,每隔2~3天更换培养基,培养一段时间后即可观察到细胞显著增殖并有明显沿取向方向的生长。
设置激光波长、打印喷头移动速度,根据构建好的CAD仿生数字模型进行3D打印,得到3D结构支架。
另一方面,本发明还要求保护上述基于丝素蛋白的取向性生物墨水在3D打印中的应用。
进一步地,3D打印方式为挤出式3D打印或光交联3D打印。
进一步地,3D打印的产品为仿生组织或仿生器官,包括骨、皮肤、角膜等有取向的组织或器官。
本发明开发的基于丝素蛋白的取向性生物墨水为电场或磁场诱导取向生物墨水,可结合3D打印技术,实现纳米→微米→宏观尺度上多尺度结构的构筑,打印出具有良好生物相容性、物质通透性和机械性能的高取向仿生组织或仿生器官。本发明的生物墨水可用于研究组织结构中取向对细胞行为的调控机理。在微米尺度上,细胞可感应3D支架的孔隙结构、机械性能和取向等因素。在宏观尺度上,结构特征能够决定外部刺激(如边界效应和机械性能)对内部细胞行为的调控。细胞可以通过介质感知宏观结构特征,调整细胞行为,进而进行组织重塑、ECM重组和形状重构等。因此,本发明可解决不同组织、不同有序结构的个性化仿生,扩展3D打印技术在仿生材料领域的应用。
借由上述方案,本发明至少具有以下优点:
1、本发明的基于丝素蛋白的取向性生物墨水包括具有场效应的丝素蛋白纳米纤维,其在经电场或磁场诱导发生取向,适用于各种机理的3D打印机,包括挤出式和光交联式打印机。
2、本发明的基于丝素蛋白的取向性生物墨水使用的丝素蛋白是天然高分子材料,无毒、低细胞粘附、微弱或无抗原性,来源广泛,获得了食品药品监管局批准,可用作生物材料,可制备稳定的丝素蛋白纳米纤维。
3、本发明的取向性生物墨水可应用于3D打印领域,在挤出式3D打印体系中,丝素蛋白纳米纤维具有场效应,可使用电、磁场诱导使其获得预先取向,微纳米基元可以有序排列,再结合微流控技术处理,取向度进一步提高,实现更高取向性的有序组装,适合用于打印有固定取向性的横纹肌肌肉组织和致密排列的网状皮肤组织等仿生材料;在光交联3D打印体系中,可构建精密度高、结构复杂的3D仿生结构,同时在纳米-微米尺度上具有取向结构。
4、本发明的基于丝素蛋白的取向性生物墨水制备方法具有个性化仿生效果,可针对不同组织结构使用不同诱导方式。
5、本发明的基于丝素蛋白的取向性生物墨水3D打印得到的生物仿生结构无毒可降解,具有良好的可打印性、生物相容性、物质通透性和机械性能,适合生物细胞在其中粘附、增殖和分化,且具有稳定的有序取向结构,是体内组织再生和功能重建的理想材料。
上述说明仅是本发明技术方案的概述,为了能够更清楚了解本发明的技术手段,并可依照说明书的内容予以实施,以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
图1是本发明具有电场响应性的取向性生物墨水的制备路线示意图;
图2是本发明具有磁场响应性的取向性生物墨水的制备路线示意图。
具体实施方式
下面结合实施例,对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中,自持性墨水是指制备的墨水粘度合适可以直接进行打印,非自持性墨水是指墨水本身粘度太低,需要增稠剂增加粘度以满足打印要求。
实施例1
一种基于丝素蛋白的取向性生物墨水的制备方法及应用,步骤如下:
S1,制备丝素蛋白溶液
(1)蚕丝脱胶:称取25.44g Na2CO3溶解于12L即将沸腾的去离子水中,待其溶解后,将30g蚕丝放入其中煮沸30min,取出后,用去离子水对脱胶后得到的丝素蛋白纤维多次搓洗至无滑腻感,放入通风橱中过夜干燥。
(2)丝素蛋白溶解:称取84.92g纯度为95%的溴化锂配置100mL溶液,放于磁力搅拌器上快速搅拌溶解,然后使用抽滤机抽滤2~3次后,将脱胶蚕丝浸入,用锡箔纸进行封口,放入60℃烘箱内溶解4h,每隔一小时震荡一次。全部溶解后,放入透析袋(截留分子量为3500Da)中,在去离子水中透析36h,期间换5次水,从而去除溶液中的Na+,Br-,CO3 2-,Li+,最后将透析好的丝素蛋白溶液存放于4℃冰箱中备用。得到丝素蛋白溶液,浓度在5~6wt%。其中,丝素蛋白溶液的浓度测定步骤如下:
采用称重法对得到的丝素蛋白溶液的浓度进行测定。取一个洁净干燥的称量船,称重并记录质量为W0(g)。向其中加入1mL左右制得的丝素蛋白溶液后称重并记录质量为W1(g)。将该盛有丝素蛋白溶液的称量船放入60℃烘箱中烘干至恒重,称重并记录质量记为W2(g)。
最后根据如下公式计算即可获得该丝素蛋白溶液的浓度。
S2,制备丝素蛋白纳米纤维
将S1中制得的5~6wt%丝素蛋白溶液浇筑于聚乙烯培养皿中,浇筑量为0.25mL/cm2,在20~25℃,相对湿度55%~60%环境下,干燥至恒重。将所得丝素膜按浴比1/20(w/v)加入到去离子水中,37℃孵育1小时后离心,转速:3500rpm、时间:10分钟,其质量溶出率为25%~35%。将所得上清液稀释至0.5wt%,37℃孵育2~24小时,即可得不同直径(直径为100~500nm)的丝素蛋白纳米纤维溶液。
S3,制备电响应性纳米纤维
将S2中的纳米纤维溶液冻干,经水蒸气处理(室温~90℃,12~24小时)、甲醇/乙醇蒸汽处理或甲醇/乙醇溶液浸泡处理,可以提高纳米纤维中β-折叠的含量,提高表面电荷,从而获得电响应性。所制备的电响应性纳米纤维的β-折叠含量为45%以上,表面电荷为-40~-75mV。
S4,电场诱导取向生物墨水
将S3中制得的电响应性纤维加入到10mL 6wt%丝素蛋白溶液中,再加入100μL酶活性为1u/μL的HRP,添加PBS缓冲溶液调节pH为7.4,再加入0.5~1g皂土作为增稠剂,混合均匀后,形成具有一定粘度的溶胶(粘度为100~200Pas)。以装有溶胶的烧杯为基础,采用交流电场,输出电压为5V,频率为100Hz,使用医用不锈钢作为电极材料,两个电极之间的距离为3cm,在电场作用的同时对溶胶进行搅拌,作用10min后,丝素蛋白纳米纤维沿同一方向均匀取向排列分布,制得取向生物墨水,可上机用于打印。
步骤S4中,非自持性3D打印墨水的增稠剂不仅可选用皂土,还可选用纤维素、明胶、海藻酸盐和葡聚糖等。
S5,应用生物墨水3D打印仿生骨组织
使用含胎牛血清(10%v/v)的α-MEM培养基培养人骨髓间充质干细胞(hMSCs),在温度为37℃、浓度为5%CO2的饱和湿度培养箱中培养,每三天换一次培养液,当细胞的生长密度达到80%-90%时,用胰蛋白酶将细胞从培养皿上消化下来,取10mL细胞悬浮液,在1000rpm下离心5分钟,重悬细胞,将重悬细胞的培养基替换成丝素蛋白溶液(5~6%w/v)。将步骤S3中制得的电响应性纤维加入到10mL上述含细胞的丝素蛋白溶液中,再加入100μL酶活性为1u/μL的HRP,添加PBS缓冲溶液调节pH为7.4,再加入0.5~1g皂土作为增稠剂,混合均匀后,形成具有一定粘度的溶胶(粘度为100~200Pas)。以装有溶胶的烧杯为基础,采用交流电场,输出电压为5V,频率为100Hz,使用医用不锈钢作为电极材料,两个电极之间的距离为3cm,在电场作用的同时对溶胶进行搅拌,作用10min后,丝素蛋白纳米纤维沿同一方向均匀取向排列分布,制得取向装有细胞的取向生物墨水。
将上述得到的装有细胞的取向生物墨水通过微流控管道(长注射针头)转移到INKREDIBLE挤出式3D打印机5mL的打印料仓内,选用15G打印针头(内径为1.36mm),设置料仓和打印喷头的温度(37℃)、打印喷头移动速度(8mm/s)、打印喷头挤出压力(0.02MPa);通过计算机辅助设计(SolidWork或CAD)设计3D组织模型,或采用开源3D模型,经Repetier或CellinkHeartWare软件完成一系列数字切片进行3D打印,得到内部高取向性的骨结构支架;将打印得到的支架在H2O2(0.1wt%)水溶液中浸泡30min进行交联,交联后用37℃的α-MEM培养液冲洗3次,而后再放于α-MEM培养基中于37℃,5%CO2的细胞培养箱中培养,每三天更换一次培养液,一周后细胞已经显著增殖,且沿纳米纤维生长形成明显稳定的取向。
实施例2
一种基于丝素蛋白的取向性生物墨水的制备方法,其制备过程与实施例1相同,不同的是省略实施例1的步骤S1的步骤(2)。将S1中步骤(1)得到的脱胶丝蛋白纤维以1:50的浴比溶解于8.0M溴化锂和98%甲酸混合溶液中,60℃烘箱中密封溶解4小时后,装入透析袋,在4℃冰箱中去离子水透析72小时,透析后的丝蛋白溶液在4℃条件下,以9,000rpm转速离20min,离心两次后即可获低β折叠含量(20~30%),表面电荷为-10~-30mV丝蛋白纳米纤维溶液。然后采用实施例1中S2-S5的方法可制备取向生物墨水、打印3D仿生结构和研究结构与细胞作用机理,并应用。
实施例3
一种基于丝素蛋白的取向性生物墨水的制备方法,其制备过程与实施例1相同,不同的是在步骤S2中,将步骤S1中制得的5wt%丝素蛋白溶液倒入广口烧杯中,在60℃烘箱中快速浓缩24小时后;在25℃烘箱中缓慢浓缩3-5天,得到浓度为20wt%的丝素蛋白浓缩液;用超纯水将丝素蛋白浓缩液稀释到0.5、1.0、2.0wt%,磁力搅拌混合均匀后密封放置在60℃下培育24h,即可获得高晶纳米纤维溶液。且得到的高晶纳米纤维经浓缩、孵育后,二级结构中β-折叠的含量增加至45%以上,表面负电荷转移到纤维表面,电荷密度增加,Zeta电位达到-70mV,随电场运动明显,无需实施例1的步骤S3额外进行赋电性修饰。采用实施例1中步骤S3-S5的方法可制备取向生物墨水、打印3D仿生结构和研究结构与细胞作用机理,并应用。
实施例4
一种基于丝素蛋白的取向性生物墨水的制备方法,其制备过程与实施例1相同,不同的是S2中将实施例3中浓度为10~30wt%的丝素蛋白浓缩液作为纺丝液,设定纺丝电压为24kV,推注速度为0.6mL/小时,电场极距为20cm,启动推注泵装置,可在接收装置上获得直径约300~400nm的纳米纤维膜,剪碎,超声分散后即可获得纳米纤维溶液。采用实施例1中S3-S5的方法可制备取向生物墨水、打印3D仿生结构和研究结构与细胞作用机理,并应用。
实施例5
一种基于丝素蛋白的取向性生物墨水的制备方法,其制备过程与实施例1相同,不同的是S4中制备的溶胶被注入到10mL注射器中,将注射器放置于10V环形电场中,环形电场在距离注射器头端和尾端3cm的范围内沿注射器方向往复运动,保证注射器内的电响应性纳米纤维都能受到电场力牵引运动,10min后,纳米纤维逐渐形成沿电场线方向的有序取向,制得取向生物墨水。
实施例6
一种基于丝素蛋白的取向性生物墨水的制备方法及应用,在非挤出式打印模式(光交联)下进行步骤如下:
S1,制备SilMA光敏丝素蛋白
(1)按实施例1步骤S1中(1)的方法对蚕丝进行脱胶。
(2)丝素蛋白溶解:称取84.92g纯度为95%的溴化锂配置100mL溶液,放于磁力搅拌器上快速搅拌溶解,然后使用抽滤机抽滤2~3次后,将脱胶蚕丝浸入,用锡箔纸进行封口,放入60℃烘箱内溶解1h,将424mM的甲基丙烯缩水甘油酯(GMA)单体加入到SF/LiBr混合液中,以300rpm的速度在60℃下反应3h,使之产生高产率反应。过滤后,使用分子量为12~14kDa的透析袋透析4天,每4h更换去离子水,然后置于-80℃冰箱中过夜,冷冻干燥后制得SilMA光敏丝素蛋白
S2,制备丝素蛋白纳米纤维
按实施例1步骤S2制备。
S3,制备电响应性纳米纤维
按实施例1步骤S3制备。
S4,电场诱导取向生物墨水
将S1中制备的SilMA光敏丝素蛋白以10~30w/v%的比例溶于5mL去离子水中,置于37℃的水浴锅中搅拌至完全溶解。在避光条件下,加入S3中制备的电响应性纳米纤维与0.4w/v%的光引发剂(LAP)继续搅拌,混合均匀。在4℃下将混合溶液静置至成胶后,以装有溶胶的烧杯为基础,采用交流电场,输出电压为5V,频率为100Hz,使用医用不锈钢作为电极材料,两个电极之间的距离为3cm,在电场作用的同时对溶胶进行搅拌,作用10min后,丝素蛋白纳米纤维沿同一方向均匀取向排列分布,制得取向生物墨水,可上机用于打印。
S5,应用生物墨水3D打印仿生骨组织
使用含胎牛血清(10%v/v)的α-MEM培养基培养人骨髓间充质干细胞(hMSCs),在温度为37℃、浓度为5%CO2的饱和湿度培养箱中培养,每三天换一次培养液,当细胞的生长密度达到80%-90%时,用胰蛋白酶将细胞从培养皿上消化下来,取10mL细胞悬浮液,在1000rpm下离心5分钟,重悬细胞,将重悬细胞的培养基替换成S4中的SilMA溶液。按步骤S4制得装有细胞的取向生物墨水。在4℃的环境进行3D打印。
将上述得到的装有细胞的取向生物墨水通过微流控管道(长注射针头)转移到INKREDIBLE挤出式3D打印机5mL的打印料仓内,选用15G打印针头(内径为1.36mm),设置料仓和打印喷头的温度(37℃)、打印喷头移动速度(8mm/s)、打印喷头挤出压力(0.02MPa);通过计算机辅助设计(SolidWork或CAD)设计3D组织模型,或采用开源3D模型,经Repetier或CellinkHeartWare软件完成一系列数字切片进行3D打印,得到内部高取向性的骨结构支架;在打印过程中,打开打印头处的紫外LED灯,强度为1.5mJ/cm2。在支架打印完成后,然后置于4℃再置于强度为3.5mJ/cm2强度的紫外光下交联5分钟,而后再放于α-MEM培养基中于37℃,5%CO2的细胞培养箱中培养,每三天更换一次培养液,一周后细胞已经显著增殖,且沿纳米纤维生长形成明显稳定的取向。
实施例7
一种基于丝素蛋白的取向性生物墨水的制备方法,步骤如下:
S1,制备丝素蛋白溶液
按实施例1步骤S1制备7.5wt%的丝蛋白溶液。
S2,制备丝素蛋白纳米纤维
按实施例4步骤S2制备。
S3,制备磁响应性纳米纤维
(1)制备超顺磁性的丝素/Fe3O4复合纳米颗粒:将5mmol FeCl3·6H2O(1.35g)迅速加入到60mL乙二醇溶液中,搅拌至形成均一混合液后,加入43.87mmol CH3COONa·3H2O(5.97g),继续搅拌至其完全溶解,然后加入7mL S1中制得的7.5wt%的丝蛋白溶液和3mL去离子水,搅拌至形成均一的液体,最后将此混合液转移到100mL拥有聚四氟乙烯内胆的不锈钢水热反应釜中,于160℃反应12小时,反应结束后自然冷却到室温。产物分别用乙醇和超纯水在8000rpm/min的转速下离心洗涤3次后,可获得直径为20nm具有超顺磁性的丝素/Fe3O4复合纳米颗粒。
(2)在S2中的静电纺丝液中加入上述的复合纳米颗粒,配成浓度为0.3wt%的混合溶液,超声使其分散均匀,然后转入直径为0.45mm、体积规格为2mL的注射器中待用。准备静电纺丝装置,连接推动器和高压设备,调节静电纺丝参数,选用电压24kV、推动速度1.2mL/小时,接受距离12cm进行静电纺丝,将在接收装置上获得的纳米纤维膜,用75%的乙醇溶液进行后处理4小时后自然晾干,剪碎,超声分散后即可获得磁响应丝素纳米纤维。
S4,磁场诱导取向生物墨水
取S3中磁响应纳米纤维按照实施例1步骤S4的方法形成溶胶装入10mL烧杯中,在附近无其他磁性物体的水平桌面上放置聚四氟乙烯板,将两块钕铁硼磁铁竖直放在板上,间距5cm,保持相互平行无角度正相对,磁场强度为0.02T,将烧杯放置在两块磁铁中间区域的聚四氟乙烯板上静置20分钟,使超顺磁复合纳米颗粒在磁场作用下呈同向均一线性排列。20分钟后可以得到丝素蛋白取向生物墨水。
S5,应用生物墨水3D打印仿生皮肤肌肉组织
在DMEM培养基加入10%胎牛血清、100U/mL链霉素/青霉素用于培养人真皮成纤维细胞(hFBs),3天后消化离心并调整一下细胞的浓度使其达到25×104cell/mL,然后滴加200μL的细胞悬液于丝素蛋白溶液(7.5%w/v)中,再装入步骤S3获得的磁响应丝素纳米纤维混合均匀后再与PEG混合摇匀,按照步骤S4的方法诱导成装有细胞的取向生物墨水后,通过微流控管道(长注射针头)转移到INKREDIBLE挤出式3D打印机5mL的打印料仓内,选用18G打印针头(内径为0.84mm),设置料仓和打印喷头的温度(37°)、打印喷头移动速度(8mm/s)、打印喷头挤出压力(0.16MPa);按照实施例1中步骤S5的方法进行3D打印,打印出的结构达到更高的取向性,将其用DMEM培养基于37℃,5%CO2的细胞培养箱中培养30min后,再将人肾小管上皮细胞株(hKCs)按同样方法打印在真皮培养物上,以获得组织完整、功能完备的人造皮肤,培养26天后即终末分化得到在形态学和生物学上与人体皮肤组织相似的仿生皮肤,其内部有明显稳定的取向结构。
实施例8
一种基于丝素蛋白的取向性生物墨水的制备方法,其制备过程与实施例7相同,不同的是,步骤S4中,将装有溶胶的10mL烧杯放入自制竖直放置的直径为6cm,长20cm,单位长度线圈匝数为1000的通电螺线管中,用玻璃片将烧杯垫高使烧杯中的溶胶位于螺线管中部,通入16A的直流电流,轴线磁场强度约为0.02T,同时在磁场作用过程中用玻璃棒进行充分均匀搅拌,避免径向磁感应强度的影响,使纳米纤维受到相同的磁场力作用,沿磁场线方向取向排列,处理20min后可以得到取向生物墨水。
实施例9
检验生物墨水的取向度和hMSCs与hFBs细胞在打印支架中的增殖和取向生长情况
S1,采用实施例1和实施例7的方法制备丝素蛋白取向生物墨水并进行3D打印,以未经过步骤S4的生物墨水及其打印得到的支架为对照。
S2,对生物墨水的取向度进行检验。
为了定量分析生物墨水的取向程度,用鬼笔环肽与Alexa Fluor 488染料偶联,将吸收进丝素蛋白生物墨水的附着有绿色染料的鬼笔环肽作为观察其取向的间接物理指标。取向因子f计算方程如下:
f=(90°-φ0)/90°;
其中φ0为半高宽(FWHM),根据扫描电镜图像,利用ImageJ软件评估计算。
将Alexa Fluor 488染料在PBS溶液中以1:100稀释后与鬼笔环肽偶联,将丝素蛋白生物墨水在其中避光孵育1~2h后,用扫描电镜(SEM)进行观察,再根据SEM图片,利用ImageJ软件计算半高宽(FWHM),计算得出取向因子f。使用ImageJ软件测量每个细胞的细胞核取向角来定量分析细胞核的取向排列。细胞核直接与细胞骨架相连,当细胞受外界环境影响而发生形变时,会引起细胞核的相应形变。细胞取向角通常是指细胞核的取向角,即丝素蛋白凝胶取向排列方向(取向方向)与细胞核长轴之间的夹角。每组样品至少统计200个细胞以计算细胞核的取向角,记录取向角的大致分布范围。生物墨水的取向度如下表所示。
表1生物墨水的取向度
无电场诱导 | 有电场诱导 | 无磁场诱导 | 有磁场诱导 | |
取向因子f | 0.36 | 0.81 | 0.030 | 0.84 |
S3,对打印后的结构中hMSCs与hFBs细胞的增殖情况进行检验
使用CCK-8试剂盒来测定支架中细胞增殖情况:分别取第三代hMSCs与hFBs细胞计数,以2×104个/孔的密度接种于24孔板中,每孔加入200μL培养基中进行培养,隔天换液。在培养后的1天、3天和7天运用CCK-8细胞增殖试剂盒对不同支架中细胞增殖情况进行检测。检测前,吸取培养孔板中培养基,加入含10%体积CCK-8试剂的培养基,重新将24孔板置于培养箱中孵育培养2小时后取出培养板,从每孔培养液中吸取100μL溶液加入96孔板中,用酶标仪检测在450nm处的吸光度值。每个浓度梯度设置5个复孔取平均值,根据OD值大小即可反应细胞数目的多少。培养1、3、7天后的OD值如下表所示:
表2 OD值大小
培养1天后 | 培养3天后 | 培养7天后 | |
hMSCs(无电场) | 0.866±0.041 | 1.588±0.064 | 2.102±0.089 |
hMSCs(有电场) | 0.940±0.016 | 1.625±0.114 | 2.187±0.121 |
hFBs(无磁场) | 0.532±0.033 | 1.429±0.057 | 2.078±0.076 |
hFBs(有磁场) | 0.614±0.046 | 1.535±0.089 | 2.144±0.103 |
S4,对打印后的结构中hMSCs与hFBs细胞的取向生长情况进行检验
用ImageJ软件测量每个细胞的细胞核取向角。每组样品至少统计200个细胞以计算细胞核的取向角。
打印培养7天后,两种细胞的细胞核取向角如下表所示,丝素蛋白纳米纤维的取向结构对细胞核的取向有显著影响,经过取向处理的细胞核取向角在0°~40°范围内的细胞占了80%以上,而未经电、磁场诱导的细胞细胞核没有优势取向,其取向角在0°~90°之间呈随机分布。
表3细胞的取向生长情况
以上仅是本发明的优选实施方式,并不用于限制本发明,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以做出若干改进和变型,这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于丝素蛋白的取向性生物墨水,其特征在于:包括电场响应性丝素蛋白纳米纤维或磁场响应性丝素蛋白纳米纤维以及溶剂;所述电场响应性丝素蛋白纳米纤维或磁场响应性丝素蛋白纳米纤维经电场或磁场作用沿同一方向取向分布;所述电场响应性丝素蛋白纳米纤维包括β-折叠含量为20%以上,表面电荷为-20mV~-75mV的丝素蛋白纳米纤维;所述磁场响应性丝素蛋白纳米纤维包括丝素蛋白纤维以及分布于所述丝素蛋白纤维内部和/或表面的磁性纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的基于丝素蛋白的取向性生物墨水,其特征在于:取向性生物墨水中,所述电场响应性丝素蛋白纳米纤维或磁场响应性丝素蛋白纳米纤维的质量分数为0.1%~7%。
3.根据权利要求1所述的基于丝素蛋白的取向性生物墨水,其特征在于:所述电场响应性丝素蛋白纳米纤维的直径为1~500nm,长度1μm以上。
4.根据权利要求1所述的基于丝素蛋白的取向性生物墨水,其特征在于:所述磁场响应性丝素蛋白纳米纤维中,磁性纳米颗粒以及丝素蛋白的质量比为1:20~50;所述磁性纳米颗粒的粒径为10~30nm。
5.根据权利要求1所述的基于丝素蛋白的取向性生物墨水,其特征在于:所述磁性纳米颗粒包括有超顺磁性Fe3O4的磁性纳米颗粒、NiFe2O4磁性纳米颗粒和SrFe12O19磁性纳米颗粒中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的基于丝素蛋白的取向性生物墨水,其特征在于:还包括增稠剂、辣根过氧化物酶、光敏剂和细胞中的一种或几种。
7.根据权利要求6所述的基于丝素蛋白的取向性生物墨水,其特征在于:所述括增稠剂包括膨润土、纤维素、琼脂糖和明胶中的一种或几种。
8.权利要求1-7中任一项所述的基于丝素蛋白的取向性生物墨水在3D打印中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于:3D打印方式为挤出式3D打印或光交联3D打印。
10.根据权利要求8所述的应用,其特征在于:3D打印的产品为仿生组织或仿生器官。
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GR01 | Patent grant | ||
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