CN115414477B - 一种磁性可注射型颗粒水凝胶、制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及复合材料制备技术领域，具体涉及一种磁性可注射型颗粒水凝胶、制备方法及其应用。通过静电力自组装合成了由明胶纳米颗粒和磁性蒙脱土颗粒组成的磁性颗粒水凝胶，该水凝胶具有优越的粘弹性、自愈合性能，能够智能响应磁场，磁热加速颗粒水凝胶适应手术创口，实现磁热促进药物均匀释放，并具有较好的止血性能，效果优于商用的止血海绵，在小鼠肝癌切除后防复发治疗中有显著的疗效。该水凝胶构成成分均为医用辅料，来源广泛，制备简单，具有转化潜力。

Description

一种磁性可注射型颗粒水凝胶、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及复合材料制备技术领域，具体涉及一种磁性可注射型颗粒水凝胶、制备方法及其应用。
背景技术
肝细胞癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在所有恶性肿瘤中排名第六，死亡率排名第三。手术切除是肝癌的主要治疗方法之一，但是由于微小肿瘤细胞残留和缺乏有效的辅助治疗，肝癌5年内的复发率高达50-70％。全身化疗被广泛用于预防术后患者的肿瘤复发。但是，全身化疗不可避免地导致全身毒性，加剧对人体的损害。局部给药植入已被用来病灶区域原位给药，以减少全身副作用，使治疗更加有效。然而，护理人员面临的另一个挑战是，在肝癌手术切除过程中，术中失血量无法控制，出血不仅导致患者预后不良，而且对原位给药辅助治疗也造成了很大的挑战。早期研发的局部止血植入物，包括海绵和泡沫，负载抗肿瘤药物被广泛报道可以止血并实现局部化疗，但这些植入物适应性差，无法匹配肝癌术后区域的不规则形状，因此导致药物分布不均匀，降低了植入物的疗效。癌症术后治疗的一个有潜力的替代方案是使用具有形状适应性的可注射超分子水凝胶。凭借其卓越的适应性，这种水凝胶实现了覆盖所有残留癌细胞并防止癌症复发。然而，化学交联水凝胶中存在残留官能团、有机交联剂和用于构建高度交联结构的催化剂，其均有潜在的毒性，限制了水凝胶在生物体内的应用，因此水凝胶的生物相容性需要进一步提高。因此，临床迫切需要设计一种具有所需适应性和止血能力的可注射和生物相容性水凝胶，以实现有效的HCC术后辅助治疗。
颗粒水凝胶是一种理想局部给药植入物，与聚合物水凝胶相比，颗粒水凝胶仅由胶体颗粒组成，通过调节胶体颗粒的特性，可以更好地控制颗粒水凝胶物理化学性质。然而，当前颗粒水凝胶缺乏对外界环境的刺激响应性，难以实现对肝癌手术创口的有效止血及治疗。利用非共价键或者动态化学键，可以构建具有显著的剪切变稀性能和对各种刺激的高敏感性的自愈性颗粒水凝胶，有望注射到肿瘤切缘部位，在磁场刺激下杀伤残余肿瘤、填充手术创面并止血，实现均匀有效的局部释放药物。
鉴于上述缺陷，本发明创作者经过长时间的研究和实践终于获得了本发明。
发明内容
本发明的目的在于解决化学交联水凝胶中存在残留官能团、有机交联剂和用于构建高度交联结构的催化剂，其均有潜在的毒性，限制了水凝胶在生物体内的应用的问题，提供了一种磁性可注射型颗粒水凝胶、制备方法及其应用。
为了实现上述目的，本发明公开了一种磁性可注射型颗粒水凝胶的制备方法，具体过程如下：将明胶纳米颗粒和磁性蒙脱土颗粒在碱性条件下(pH≈12)混合，两种颗粒均带负电荷，添加葡萄糖酸-δ-内酯(GDL，酸化剂)粉末并调节pH≤7(小于明胶的等电点)，明胶纳米颗粒由负电荷变为正电荷，磁性蒙脱土依然保持负电荷，两种颗粒间产生静电作用，发生凝胶化后得到磁性可注射型颗粒水凝胶。
所述明胶纳米颗粒的制备方法包括以下步骤：
S11：将明胶溶解于去离子水中得到明胶溶液，再加入丙酮，室温下放置1h沉淀出高分子量明胶，弃去上清液，明胶沉淀溶解在去离子水中并冷冻干燥得到冻干明胶：
S12：将步骤S11中得到的冻干明胶溶解于去离子水中，加入盐酸调节pH至2.5，边搅拌边加入丙酮，然后在室温下再向明胶分散体中加入戊二醛溶液，搅拌过夜，再将盐酸胍水溶液加入至明胶分散体中，搅拌1h后，过滤离心洗涤，得到两性的明胶纳米颗粒。
所述磁性蒙脱土颗粒的制备方法包括以下步骤：
S21：将乙酰丙酮铁和蒙脱土加入三缩四乙二醇中，分散均匀后得到混合溶液；
S22：将步骤S21中得到的混合溶液真空处理，升温后反应，反应结束后冷却至室温，离心、洗涤后得到磁性蒙脱土颗粒。
所述步骤S21中乙酰丙酮铁和蒙脱土的质量比为1:4～2:1。
所述步骤S22中的真空处理时间为2h，反应温度从室温升至300℃，升温速率为3℃/min，升温结束后在300℃反应30min。
所述明胶纳米颗粒和磁性蒙脱土颗粒在pH≈12下涡旋混合。
所述明胶纳米颗粒和磁性蒙脱土颗粒的质量比为1:3～3:1。
所述磁性可注射型颗粒水凝胶中固含量为5～15％w/v。
本发明还公开了一种采用上述制备方法制得的磁性可注射型颗粒水凝胶以及这种磁性可注射型颗粒水凝胶在制备肝癌术后辅助治疗药物中的应用，明胶纳米颗粒通过吸附溶胀的方法载负抗癌药物，用于磁性颗粒水凝胶合成，合成载药的颗粒水凝胶。
本发明公开的一种磁性可注射型颗粒水凝胶的合成机理是两性的明胶纳米颗粒和负电性的磁性蒙脱土，在碱性条件下混合，由于两种颗粒均带有相同的负电荷，使体系混合均匀。向混合体系中添加葡萄糖酸-δ-内酯(GDL，酸化剂)粉末并调节pH≤7，小于明胶的等电点9，明胶纳米颗粒的电荷由负电荷转变为正电荷，磁性蒙脱土一直保持负电荷，两种颗粒产生静电相互作用，体系逐渐凝胶化，形成磁性可注射型颗粒水凝胶。
本发明公开的一种磁性可注射型颗粒水凝胶中，明胶纳米颗粒通过吸附溶胀的方法载负抗癌药物，用于磁性颗粒水凝胶合成，合成载药的颗粒水凝胶。
与现有技术比较本发明的有益效果在于：
1、本发明制备的磁性颗粒水凝胶是构建基元通过静电作用力形成的完全由颗粒组成的三维网络，不涉及复杂的化学交联，合成原料及交联方式都具有良好的生物相容性，非常有利于临床转化；
2、本发明制备的磁性颗粒水凝胶具有良好的注射性能和自愈合性能，以及稳定的磁热性能；
3、本发明制备的磁性颗粒水凝胶在磁热刺激下能够加速适应不规则形状和释放药物；
4、本发明制备的磁性颗粒水凝胶，能够在肝癌手术切除之后，在伤口处实现止血，并结合磁热及药物治疗从而起到肿瘤抑制复发的效果。
附图说明
图1为本发明磁性可注射型颗粒水凝胶的制备原理示意图；
图2为明胶纳米颗粒的扫描电镜照片；
图3为明胶纳米颗粒(a)和载药的明胶纳米颗粒的粒径分布曲线(b)；
图4为蒙脱土的扫描电镜照片；
图5为磁性蒙脱土的扫描电镜照片；
图6为蒙脱土和磁性蒙脱土的粒径分布曲线图；
图7为蒙脱土和磁性蒙脱土的pH＝7时的Zeta电位柱状图；
图8为明胶纳米颗粒和磁性蒙脱土在不同pH值下的Zeta电位柱状图；
图9为不同浓度磁性可注射型颗粒水凝胶的模量与频率变化曲线(a)以及损耗因子柱状图(b)；
图10为不同构建单元比例的磁性可注射型颗粒水凝胶的模量与频率变化曲线(b)以及损耗因子柱状图(a)；
图11为磁性可注射型颗粒水凝胶的扫描电镜照片以及元素分布照片；
图12为不同质量分数的铁含量(0％、5％、10％、15％、20％)的磁性可注射型颗粒水凝胶的应变扫描曲线和对应磁性可注射型颗粒水凝胶的临界应变值散点图。
图13为磁性可注射型颗粒水凝胶与由明胶分子组成的非颗粒水凝胶的注射力曲线以及注射稳定段平均注射力的柱状图；
图14为磁性可注射型颗粒水凝胶的磁热升温曲线及红外热成像图；
图15为磁性可注射型颗粒水凝胶的模量随温度的变化曲线(a)以及水凝胶的在磁热下自适应性行为的数码图片(b)；
图16为磁性可注射型颗粒水凝胶的药物释放曲线；
图17为磁性可注射型颗粒水凝胶的体外凝血数码照片(a)及凝血指数柱状图(b)；
图18为磁性可注射型颗粒水凝胶的大鼠肝脏止血数码照片(a)及不同处理组的肝脏失血量柱状图(b)；
图19为磁性可注射型颗粒水凝胶对肝脏切口实现物理封闭的H&E照片；
图20为磁性可注射型颗粒水凝胶促进纤维蛋白网络的形成的扫描电镜照片；
图21为磁性可注射型颗粒水凝胶用于肝癌术后治疗的手术过程数码照片(a)和其中三试验组小鼠的交变磁场下的红外热成像图片(b)；
图22为磁性可注射型颗粒水凝胶用于肝癌术后治疗后，不同治疗组的肿瘤复发曲线(a)、肿瘤生长曲线(b)、离体肿瘤质量柱状图(c)、治疗后第0天和第14天的小鼠肿瘤数码照片(d)；
图23为磁性可注射型颗粒水凝胶用于肝癌术后辅助治疗，不同治疗组的治疗区域的病理分析数据：H&E和Tunel染色照片(标尺为50μm)。
具体实施方式
以下结合附图，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。
实施例1
1、制备明胶纳米颗粒
通过两步去溶剂法制备球形明胶纳米颗粒。
(1)将50g明胶溶解在1L的50℃的去离子水中。然后，将1L丙酮加入明胶溶液中，将混合物在室温下放置1小时以沉淀出高分子量明胶。之后，弃去上清液，将明胶沉淀溶解在去离子水中并冷冻干燥直至进一步使用。
(2)将3.75g冻干明胶溶解在75mL去离子水中，并通过加入盐酸将溶液的pH值设置为2.5。此后，在1200rpm剧烈搅拌溶液期间，使用注射泵以4mL/min的滴速将225mL丙酮添加到40℃的明胶溶液中。为了稳定明胶纳米颗粒结构，在室温下将495μL戊二醛溶液(25wt％)滴加到明胶分散体中，并在以600rpm搅拌的同时反应过夜。
(3)将300mL 100mM盐酸胍水溶液加入到步骤(2)制备的明胶分散体中，去除未反应的醛基，使明胶纳米颗粒带正电。搅拌1h后，用100μm筛孔的筛子过滤分散液。随后，通过离心洗涤四次，冷冻干燥备用。
(4)将冻干的明胶加入到含有阿霉素的水溶液中，待其充分溶胀2h，明胶吸附小分子药物，得到载药的明胶纳米颗粒。
2、制备磁性蒙脱土
具体的，负载四氧化三铁的蒙脱土(磁性蒙脱土)的合成方法如下：
(1)称取天然的蒙脱土粉末300mg，加入30mL去离子水，破碎悬浊(5min以上)。
(2)将聚苯乙烯磺酸钠(PSS)粉末配置在0.04M的氯化钠溶液中。(0.04M的NaCl可称取0.0936g溶于40mL溶液中)；按照每10mg PSS溶解在1mL上述氯化钠，配置PSS溶液。
(3)然后把蒙脱土悬液，PSS溶液和NaCl溶液按照体积比10:5:1共混，先涡旋震荡2min，超声破碎5min，再静置30min，然后按3000rpm*5min*3次的条件水洗产物，之后冻干备用。
(4)取200mg上述冻干后的蒙脱土和200mg乙酰丙酮铁加入50mL三缩四乙二醇中，将混合物以3℃/min的速率缓慢加热至300℃，在不断搅拌并且通氮气保护下保持回流30分钟，完成反应需要总共2小时。在自然冷却至室温后，用磁铁将样品磁分离并用乙醇洗涤三次并在60℃下真空干燥。即通过原位生长的方式在蒙脱土表面负载上了四氧化三铁，铁元素含量约为15％。
3、制备磁性可注射型颗粒水凝胶
如图1所示，将两种颗粒混合到离心管中并在pH≈12下涡旋混合。此后，通过添加80mM葡萄糖酸-δ-内酯(GDL)粉末并调节pH≤7(低于明胶的等电点)发生凝胶化，合成了固含量为5％w/v的磁性颗粒水凝胶，磁性蒙脱土与明胶纳米颗粒的质量比为1：1。即配置pH≈12、50mg/mL明胶纳米颗粒溶液和pH≈12、50mg/mL磁性蒙脱土溶液；分布取0.5mL上述两种溶液，充分混合均匀，向混合溶液中加入80mM葡萄糖酸-δ-内酯，调节混合溶液pH至6～7，即得到固体含量为5％w/v的磁性可注射型颗粒水凝胶。
图2为冻干明胶纳米颗粒的扫描电镜照片，图3为明胶纳米颗粒和载药的明胶纳米颗粒的水合粒径，表面载药后明胶粒径未发生显著变化。
图4为蒙脱土扫描电镜照片，图5为磁性蒙脱土的扫描电镜照片，表明磁性纳米颗粒成功合成到蒙脱土的表面。
图6为蒙脱土和磁性蒙脱土的粒径分布，可以看出磁性纳米颗粒原位合成在蒙脱土表面并为引起蒙脱土粒径的显著变化。图7为蒙脱土和磁性蒙脱土pH＝7条件下的电位，表面其两种材料的电位没有显著差异。
图8为磁性蒙脱土和明胶纳米颗粒在不同pH值下的电位柱状图，结果表明明胶纳米颗粒电荷在pH>9时带负电荷，在pH<9时带正电荷，磁性蒙脱土在不同pH值下一直为负电荷，颗粒间的静电作用力是颗粒水凝胶形成的理论基础。
实施例2
本实施例与实施例1中区别在于磁性颗粒水凝胶固含量为10％w/v，其他制备条件均相同。即配置pH≈12、100mg/mL明胶纳米颗粒溶液和pH≈12、100mg/mL磁性蒙脱土溶液；分布取0.5mL上述两种溶液，充分混合均匀，向混合溶液中加入80mM葡萄糖酸-δ-内酯，调节混合溶液pH至6～7，即得到固体含量为10％w/v的磁性可注射型颗粒水凝胶。
实施例3
本实施例与实施例1中区别在于磁性颗粒水凝胶固含量为15％w/v，其他制备条件均相同。即配置pH≈12、150mg/mL明胶纳米颗粒溶液和pH≈12、150mg/mL磁性蒙脱土溶液；分布取0.5mL上述两种溶液，充分混合均匀，向混合溶液中加入80mM葡萄糖酸-δ-内酯，调节混合溶液pH至6～7，即得到固体含量为15％w/v的磁性可注射型颗粒水凝胶。
对实施例1～3得到的磁性可注射性颗粒水凝胶进行流变比较，结果如图9所示，根据损耗因子数据，浓度(固含量)为10％w/v的可注射性颗粒水凝胶损耗最小。
实施例4
本实施例与实施例2中区别在于磁性蒙脱土与明胶纳米颗粒的质量比为1：3，其他制备条件均相同。即配置pH≈12、100mg/mL明胶纳米颗粒溶液和pH≈12、100mg/mL磁性蒙脱土溶液；分布取0.75mL明胶纳米颗粒溶液和0.25mL磁性蒙脱土溶液，充分混合均匀，向混合溶液中加入80mM葡萄糖酸-δ-内酯，调节混合溶液pH至6～7，即得到固体含量为10％w/v、磁性蒙脱土与明胶纳米颗粒的质量比为1:3的磁性可注射型颗粒水凝胶。
实施例5
本实施例与实施例2中区别在于磁性蒙脱土与明胶纳米颗粒的质量比为3:1，其他制备条件均相同。即配置pH≈12、100mg/mL明胶纳米颗粒溶液和pH≈12、100mg/mL磁性蒙脱土溶液；分布取0.25mL明胶纳米颗粒溶液和0.75mL磁性蒙脱土溶液，充分混合均匀，向混合溶液中加入80mM葡萄糖酸-δ-内酯，调节混合溶液pH至6～7，即得到固体含量为10％w/v、磁性蒙脱土与明胶纳米颗粒的质量比为3:1的磁性可注射型颗粒水凝胶。
对实施例2、4、5得到的构建单元比例不同的磁性可注射性颗粒水凝胶进行流变比较，结果如图10所示，根据损耗因子数据，当构建单元(磁性蒙脱土与明胶纳米颗粒)比例为1：1时，可注射性颗粒水凝胶损耗最小。
图11为实施例2得到的磁性可注射型颗粒水凝胶的扫描元素分布图片，结果表明磁性蒙脱土在颗粒水凝胶中均匀分布。
实施例6
本实施例与实施例1中的区别在于制备磁性蒙脱土所采用的乙酰丙酮铁和蒙脱土的质量比为1:4，制备的磁性蒙脱土含铁元素的量约为5％，其他制备条件均相同。即配置pH≈12、100mg/mL明胶纳米颗粒溶液和pH≈12、100mg/mL磁性蒙脱土溶液；分布取0.5mL上述两种溶液，充分混合均匀，向混合溶液中加入80mM葡萄糖酸-δ-内酯，调节混合溶液pH至6～7，即得到固体含量为10％w/v的磁性可注射型颗粒水凝胶。
实施例7
本实施例与实施例1中的区别在于制备磁性蒙脱土所采用的乙酰丙酮铁和蒙脱土的质量比为1:2，制备的磁性蒙脱土含铁元素的量约为10％，其他制备条件均相同。即配置pH≈12、100mg/mL明胶纳米颗粒溶液和pH≈12、100mg/mL磁性蒙脱土溶液；分布取0.5mL上述两种溶液，充分混合均匀，向混合溶液中加入80mM葡萄糖酸-δ-内酯，调节混合溶液pH至6～7，即得到固体含量为10％w/v的磁性可注射型颗粒水凝胶。
实施例8
本实施例与实施例1中的区别在于制备磁性蒙脱土所采用的乙酰丙酮铁和蒙脱土的质量比为2:1，制备的磁性蒙脱土含铁元素的量约为20％，其他制备条件均相同。即配置pH≈12、100mg/mL明胶纳米颗粒溶液和pH≈12、100mg/mL磁性蒙脱土溶液；分布取0.5mL上述两种溶液，充分混合均匀，向混合溶液中加入80mM葡萄糖酸-δ-内酯，调节混合溶液pH至6～7，即得到固体含量为10％w/v的磁性可注射型颗粒水凝胶。
实施例9
本实施例与实施例1中的区别在于蒙脱土表面未负载磁性纳米颗粒，蒙脱土含铁元素的量约为0％，其他制备条件均相同。即配置pH≈12、100mg/mL明胶纳米颗粒溶液和pH≈12、100mg/mL蒙脱土溶液；分布取0.5mL上述两种溶液，充分混合均匀，向混合溶液中加入80mM葡萄糖酸-δ-内酯，调节混合溶液pH至6～7，即得到固体含量为10％w/v的可注射型颗粒水凝胶。
对实施例1、6、7、8、9得到的含磁性纳米颗粒比例不同的磁性可注射型颗粒水凝胶进行流变比较，结果如图12所示，根据临界应变值，当磁性蒙脱土中铁含量为15％时，磁性可注射型颗粒水凝胶的临界应变值最大，说明水凝胶的结构最稳定。实施例10
基于实施例2中优选的浓度为10％w/v、磁性蒙脱土和明胶颗粒质量比为1:1的磁性可注射型颗粒水凝胶，制备了浓度为10％w/v，磁性蒙脱土与明胶分子质量比为1:1的传统的非颗粒水凝胶作为对照，比较两种水凝胶在使用26G针头的注射器注射时，注射力的大小，注射速度设置为1mL/min。
图13为两种水凝胶的注射力的曲线及注射力稳定段平均注射力的柱状图，结果表面磁性可注射型颗粒的水凝胶的注射力明显小于由明胶分子组成的传统的非颗粒水凝胶。磁性可注射型颗粒水凝胶更有利于后续的术后肝癌辅助治疗的应用。
实施例11
本实施例与实施例2中区别在于磁性可注射型颗粒水凝胶负载了抗癌药物阿霉素，其他制备条件均相同。即配置pH≈12、100mg/mL明胶纳米颗粒溶液和pH≈12、100mg/mL磁性蒙脱土溶液；其中明胶纳米颗粒通过溶胀吸附抗癌药物阿霉素；分布取0.5mL明胶纳米颗粒溶液(含有1mg阿霉素)和0.5mL磁性蒙脱土溶液，充分混合均匀，向混合溶液中加入80mM葡萄糖酸-δ-内酯，调节混合溶液pH至6～7，即得到固体含量为10％w/v、磁性蒙脱土与明胶纳米颗粒的质量比为1:1的载药的磁性可注射型颗粒水凝胶。
对实施例2得到磁性可注射型颗粒水凝胶(固含量为10％w/v，磁性蒙脱土与明胶纳米颗粒质量比为1:1)以及实施例11中得到的固体含量为10％w/v、磁性蒙脱土与明胶纳米颗粒的质量比为1:1的载药的磁性可注射型颗粒水凝胶的性能表征
1、磁性可注射型颗粒水凝胶磁热性能测试
蒙脱土水凝胶磁热性能测试：分别取磁性可注射型颗粒水凝胶和不含磁性纳米颗粒的颗粒水凝胶各0.5mL置于1.5mL离心管中，将装有不同水凝胶的离心管置于磁线圈中，使用30kA/m的磁场强度，使用热红外成像仪记录不同水凝胶的升温情况。随后准备两个玻璃瓶，向两个玻璃瓶中加入一些锆珠，铺满瓶底，然后分别向两个玻璃瓶中的锆珠表面注射等量的磁性可注射型颗粒水凝胶，将其中一个玻璃瓶置于交变磁场下进行磁热，拍照观察水凝胶的状态，并使用红外热成像仪记录水凝胶的温度。通过吸附溶胀的方法将抗癌药物阿霉素载负到明胶纳米颗粒中，随后合成载药水凝胶。然后将载药水凝胶放到3000kDa的透析袋中，将透析袋置于pH＝7.4的PBS中，每次取液前将其置于交变磁场中磁15min，取多少液体补充多少液体。最后通过紫外分光光度计，测试阿霉素的释放量，比较磁热对水凝胶药物释放的影响。
图14(a)为磁性可注射型颗粒水凝胶的磁热升温曲线，图14(b)为磁性可注射型颗粒水凝胶磁热升温的红外热成像图，说明磁性可注射型颗粒水凝胶具有优异的磁热升温性能。图15(a)为磁性可注射型颗粒水凝胶的模量随温度变化曲线，图15(b)为磁性可注射型颗粒水凝胶磁热条件下在锆珠间的适应性图片，说明磁性可注射型颗粒水凝胶在磁热条件下表现出优异的不规则形状适应性。图16为磁性可注射型颗粒水凝胶的药物释放曲线，说明磁热能够加速磁性可注射型颗粒水凝胶中药物的释放。
2、体外和体内的止血性能评估
体外评价磁性可注射型颗粒水凝胶的止血作用，将50μL血液直接滴入培养皿中，作为对照组。同时，在两个培养皿中分别加入明胶海绵和磁性可注射型颗粒水凝胶，所有样品中加入50μL血液。5分钟后，向培养皿中加入10mL蒸馏水。轻轻摇动每个样品以溶解游离红细胞。首先拍照观察不同处理组的溶血情况，然后通过紫外分光光度计在542nm处测量每个样品的血红蛋白吸光度。此外，在大鼠出血性肝模型和新西兰兔肝肿瘤切除出血模型中研究了磁性可注射型颗粒水凝胶的体内止血能力。每组3只大鼠，使用气体麻醉。然后使用手术刀开腹腔暴露大鼠的肝脏并用手术刀划开肝脏建立肝脏出血模型。立即在出血部位给予磁性可注射型颗粒水凝胶和止血海绵，另一只大鼠不对出血部位进行任何处理。收集不同治疗组的失血量并进行定量分析。
图17为磁性可注射型颗粒水凝胶的体外凝血数据，在未处理组和商业明胶海绵组中观察到明显的溶血现象，但在磁性可注射型颗粒水凝胶组中几乎没有出现溶血。通过紫外分光光度计测出结果，磁性可注射型颗粒水凝胶组中最低的凝血指数(BCI)值，证明了磁性蒙脱土颗粒水凝胶具有潜在止血能力。
图18为磁性可注射型颗粒水凝胶的体内止血数据，将颗粒水凝胶注射到大鼠肝脏伤口处，30s内肝出血明显被抑制，而明胶海绵组和未治疗组在60s后出现明显出血。磁性可注射型颗粒水凝胶组的失血量仅只有0.275±0.040g，明显少于未治疗组的1.221±0.045g。商业明胶海绵组出血量为0.501±0.053g，也显著高于磁性可注射型颗粒水凝胶处理后的伤口，这表明磁性可注射型颗粒水凝胶具有非常优异的止血能力。
图19和图20为磁性可注射型颗粒水凝胶止血机理数据，水凝胶的有效止血能力应归因于两个方面。一个方面是由于良好的自适应性，使用磁性可注射型颗粒水凝胶可以渗入创面间隙，完全封闭病灶，起到物理屏障止血的作用(图19)。受损肝脏的H&E切片的结果显示，磁性可注射型颗粒水凝胶处理后水凝胶的碎片遗留在伤口间隙中，实现了对伤口的物理封闭。另一方面，带负电的磁性蒙脱石表面增强了对血细胞的刺激，提高了磁性可注射型颗粒水凝胶的凝血能力(图20)。经磁性可注射型颗粒水凝胶处理后的全血的扫描电镜可以看出，红细胞周围形成纤维蛋白网络，从而实现凝血。
3、预防肿瘤复发的效果评价
建立HepG2(肝癌细胞)荷瘤小鼠模型，将小鼠随机分为5组(每组5只小鼠)，手术切除肿瘤组织。五组小鼠分别为(1)对照组，进行手术切除后注射PBS并置于交变磁场中；(2)颗粒水凝胶组，手术后仅注射磁性颗粒水凝胶；(3)颗粒水凝胶+交变磁场组，手术后注射磁性颗粒水凝胶并置于交变磁场中；(4)颗粒水凝胶+阿霉素组，手术后注射包载阿霉素的磁性颗粒水凝胶；(5)颗粒水凝胶+阿霉素+交变磁场组，手术后注射包载阿霉素的磁性颗粒水凝胶并置于交变磁场中。随后，将(1)、(3)、(5)组小鼠置于线圈中，磁场强度为H＝30kA/m，频率为f＝312kHz，磁热处理15分钟。通过红外热成像监测肿瘤部位的温度。每2天测量小鼠体重和肿瘤体积以及记录各组小鼠肿瘤复发情况，共14天。14天后，取治疗区域进行病理学分析。
根据公式计算单个肿瘤体积(V)，其中长度(L)为肿瘤的最大直径，宽度(W)为垂直于肿瘤长度的最短直径。
图21为载药的磁性颗粒水凝胶用于肝癌术后治疗过程的数码照片和(1)、(3)、(5)小鼠的磁热治疗的热红外照片，说明磁性颗粒水凝胶在小鼠体内也表现出具有良好的磁热效果。
图22为不同治疗组的小鼠(a)肿瘤复发曲线，(b)肿瘤生长曲线，(c)离体肿瘤质量和(d)各组小鼠治疗后第0天和第14天的数码照片，结果表明磁性可注射型颗粒水凝胶介导的药物及磁热联合治疗能够显著抑制肝癌的术后复发。
图23为第14天时不同治疗组的小鼠治疗位置的病例学分析，结果说明(5)颗粒水凝胶+阿霉素+交变磁场组基本不存在存活的肿瘤细胞，并且肿瘤凋亡因子表达最高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，对本发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种磁性可注射型颗粒水凝胶的制备方法，其特征在于，具体过程如下：将明胶纳米颗粒和磁性蒙脱土颗粒在碱性条件下混合，两种颗粒均带负电荷，添加葡萄糖酸-δ-内酯粉末并调节pH≤7，明胶纳米颗粒由负电荷变为正电荷，磁性蒙脱土依然保持负电荷，两种颗粒间产生静电作用，发生凝胶化后得到磁性可注射型颗粒水凝胶；
所述明胶纳米颗粒的制备方法包括以下步骤：
S11：将明胶溶解于去离子水中得到明胶溶液，再加入丙酮，室温下放置1h沉淀出高分子量明胶，弃去上清液，明胶沉淀溶解在去离子水中并冷冻干燥得到冻干明胶：
S12：将步骤S11中得到的冻干明胶溶解于去离子水中，加入盐酸调节pH至2.5，边搅拌边加入丙酮，然后在室温下再向明胶分散体中加入戊二醛溶液，搅拌过夜，再将盐酸胍水溶液加入至明胶分散体中，搅拌1h后，过滤离心洗涤，得到两性的明胶纳米颗粒；
所述磁性蒙脱土颗粒的制备方法包括以下步骤：
S21：将乙酰丙酮铁和蒙脱土加入三缩四乙二醇中，分散均匀后得到混合溶液；
S22：将步骤S21中得到的混合溶液真空处理，升温后反应，反应结束后冷却至室温，离心、洗涤后得到磁性蒙脱土颗粒；
明胶纳米颗粒通过吸附溶胀的方法负载抗癌药物，用于磁性颗粒水凝胶合成，合成载药的颗粒水凝胶，所述抗癌药物为阿霉素。
2.如权利要求1所述的一种磁性可注射型颗粒水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤S21中乙酰丙酮铁和蒙脱土的质量比为1:4～2:1。
3.如权利要求1所述的一种磁性可注射型颗粒水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤S22中的真空处理时间为2h，反应温度从室温升至300℃，升温速率为3℃/min，升温结束后在300℃反应30min。
4.如权利要求1所述的一种磁性可注射型颗粒水凝胶的制备方法，其特征在于，所述明胶纳米颗粒和磁性蒙脱土颗粒在pH≈12下涡旋混合。
5.如权利要求1所述的一种磁性可注射型颗粒水凝胶的制备方法，其特征在于，所述明胶纳米颗粒和磁性蒙脱土颗粒的质量比为1:3～3:1。
6.如权利要求1所述的一种磁性可注射型颗粒水凝胶的制备方法，其特征在于，所述磁性可注射型颗粒水凝胶中固含量为5～15％w/v。
7.一种采用如权利要求1～6任一项所述的制备方法制得的磁性可注射型颗粒水凝胶。
8.如权利要求7所述的一种磁性可注射型颗粒水凝胶在制备肝癌术后辅助治疗药物中的应用。
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