CN115710581A - 一种提高酶利用率的蛋白质囊泡聚集体的构建方法 - Google Patents
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Abstract
一种提高酶利用率的蛋白质囊泡聚集体的构建方法，包括：通过在蛋白质囊泡构筑基元中引入葡聚糖，完成蛋白质囊泡的糖基功能化；采用经典的溶胶‑凝胶法制备介孔二氧化硅纳米粒子，通过硅烷偶联剂与4‑甲酰基苯硼酸顺序进行氨基与苯硼酸基团修饰，得到苯硼酸化介孔二氧化硅纳米粒子；基于利用苯硼酸与多糖的生物正交反应，使得苯硼酸接枝的介孔二氧化硅纳米粒子充当连接剂从而形成蛋白质囊泡聚集体；通过这种结构阻碍负载酶的蛋白质囊泡通过小孔径毛细管，使其留在重力流空柱中并进行多次酶催化反应。本发明酶催化反应高效专一，灵活可控，并且采用蛋白质膜包覆的方式负载酶，在极大保证酶的可逆催化活性前提下，酶的利用率提升高达3倍。
Description
技术领域
本发明属于细胞模型应用技术领域，具体涉及一种提高酶利用率的蛋白质囊泡聚集体的构建方法。
背景技术
近年来，基于合成生物学的研究方法，关于生物体结构与功能的仿生组装构筑受到了广泛关注，从构筑基元自发组装到微区室的产生，再到高阶层级结构的形成，其逐步发展的过程与地球早期生命的形成历程相近。仿生组装的研究过程不仅有助于从化学自组装的角度揭示生物体的奥秘，加深人类对自然与生命的理解，进一步去改造利用，以便架起材料科学和生命科学之间的桥梁，也将为仿生材料的设计提供理论基础。细胞作为地球上生物体最小的结构和功能单元，成为了仿生组装体的研究基础。到目前为止，各种类型的可以模拟活细胞基本特征的功能性微区室结构已经被开发出来，然而以此为基础展现仿生材料特性的研究还相对较少。
集体行为是一种独特的社会互动行为，是自然界和社会情境中广泛存在的一种现象。其基本特征是自组织性，表现为大量无组织的个体在同一事件的促进影响下共同行动，并且这种无领导的自组织行为具有物理和生物系统整合的能力。在微观和宏观世界中都存在这种智能的特征，如微生物群体感应细胞聚集组成高级结构的生物组织、鱼群抵抗天敌等。与零散的个体相比，这种由群体聚集所产生的新特性展现出巨大的优势。因此以单一微区室仿生细胞为基础，通过构筑多区室聚集体模型，可进一步开发仿生细胞的新性能，并且为仿生细胞领域的研究提供新的思路。
发明内容
本发明为仿生细胞领域作为仿生材料提供思路，实现对生命的模拟为目的，提供一种基于苯硼酸和多糖的生物正交反应构筑蛋白质囊泡聚集体的方法，在保持天然酶可逆催化活性的基础上，使酶利用率提升高达3倍。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种提高酶利用率的蛋白质囊泡聚集体的构建方法，所述方法为：
步骤一：蛋白质囊泡的糖基功能化
(1)制备葡聚糖-聚合物基元：将氨基化葡聚糖与聚异丙基丙烯酰胺按照1：1的质量比混合，在pH为6～8的磷酸缓冲溶液中孵育过夜，透析后冻干使用；
(2)制备功能蛋白-聚合物基元：将氨基化功能蛋白与聚异丙基丙烯酰胺按照1：1的质量比混合，在pH为6～8的磷酸缓冲溶液中孵育过夜，透析后冻干使用；所述功能蛋白为牛血清白蛋白、淀粉酶、葡萄糖氧化酶或过氧化氢酶中的一种；
(3)糖基功能化蛋白质囊泡制备：将以上两种基元分别配置为5～10mg/mL的水溶液后混合，加入异辛醇油相，剧烈震荡后，转移到水相中备用；
步骤二：苯硼酸化介孔二氧化硅纳米粒子合成
(1)介孔二氧化硅纳米粒子合成：十六烷基三甲基溴化铵充分溶解于超纯水中，随后加入正硅酸乙酯，在60～90℃的碱性条件下搅拌水解，得到白色粉末；十六烷基三甲基溴化铵与正硅酸乙酯的质量比为0.4：100；
(2)介孔二氧化硅纳米粒子修饰氨基：取介孔二氧化硅纳米粒子悬浮于甲苯中，加入氨丙基三乙氧基硅烷，惰性条件下回流过夜，洗涤后真空干燥；
(3)介孔二氧化硅纳米粒子修饰苯硼酸：氨基化介孔二氧化硅纳米粒子与4-甲酰基苯硼酸超声分散在无水甲苯中，浓度为0.01gmL-1，加入几滴冰醋酸，在50～80℃加热条件下回流过夜；
步骤三：蛋白质囊泡聚集体制备
将步骤一得到的糖基功能化蛋白质囊泡与步骤二得到的苯硼酸化介孔二氧化硅纳米粒子混合于pH为6～8的磷酸缓冲溶液中，室温下轻微震荡10～30min，除去上层溶液，得到蛋白质囊泡聚集体。
进一步地，在步骤一(3)制备囊泡的过程中加入适量酶，所述方法还包括步骤四：将步骤三蛋白质囊泡的聚集体的制备过程，转移到重力流空柱(底部孔径为50～300μm)中操作，在底部形成蛋白质囊泡聚集体，加入底物发生酶促反应，将反应物从底部放出，重新加入底物继续反应，重复该操作。
进一步地，步骤一(3)中，糖基功能化蛋白质囊泡的制备具体为：用移液枪吸取构建基元溶液到离心管内(不同基元的比例相同，也可按需求搭配比例)，然后加入磷酸缓冲液，控制pH为6～8，混合均匀后加入异辛醇油相并剧烈震荡30～120s得到乳液囊泡，另外如有转移水相的要求，在制备前加入0.5～2.5mg(终浓度为0.02～0.1mg/μL)交联剂，交联反应过夜后，用不同浓度的乙醇梯度透析转移到水相中。
进一步地，步骤一(3)中，两种构建基元的比例为1：1～5，水油比例1：20～40。
进一步地，步骤二(1)中，所用碱性的调控是在250mL体系中加入2M氢氧化钠3～5mL。
进一步地，步骤二(2)中，所述介孔二氧化硅纳米粒子、甲苯和氨丙基三乙氧基硅烷的比例为1g：50～200mL：1～3mL。
进一步地，步骤二(3)中，所述氨基化介孔二氧化硅纳米粒子与4-甲酰基苯硼酸的质量比为2：1～5。
进一步地，步骤三中，蛋白质囊泡在溶液中的浓度为0.1～2.0mg/mL。
进一步地，步骤三中，苯硼酸化介孔二氧化硅纳米粒子在溶液中的浓度为2～7mg/mL。
进一步地，步骤四中，重力流空柱中蛋白质囊泡聚集体的组装时间为10～30min，酶促反应时间为5～30min。
与现有技术相比，本发明的蛋白质囊泡聚集体具有以下有益效果：
(1)以蛋白质囊泡为基础的体系的独特优势在于使用各种功能蛋白作为构建基元，它的柔性膜可以通过简单的设计展现各种功能。由于自然界中存在数以百万计的具有明确的一级序列以及各种各样的三维结构和功能的蛋白质，所以其作为构建基元的使用，为后续不同功能的应用提供广阔的空间；
(2)蛋白质囊泡外部具有柔性膜结构与内部的中空结构，可为内部装载的物质提供稳定的保障；
(3)基于苯硼酸和多糖的生物正交反应构筑蛋白质囊泡聚集体的方法，这种非共价键的方法，为聚集体的形成与解聚带来了可逆的效果；
(4)这种整体非共价键的构建方式，保证了内部负载的酶的活性，并且这种蛋白质囊泡聚集体模型具备了提升酶利用率的新功能。
附图说明
图1为葡聚糖羧基化核磁共振氢谱图；
图2为糖基化蛋白质囊泡显微镜照片及尺寸统计图；
图3为干燥状态下糖基化蛋白质囊泡扫描电子显微镜照片；
图4为水相中糖基化蛋白质囊泡柔性测试图；
图5为苯硼酸化介孔二氧化硅纳米粒子扫描电子显微镜照片。
图6为蛋白质囊泡聚集体共聚焦显微镜照片。
图7为多次酶催化反应示意图；
图8为蛋白质囊泡聚集体酶利用率提升测试图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修正或等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神范围，均应涵盖再本发明的保护范围之中。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本领域技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
本发明通过在蛋白质囊泡构筑基元中引入葡聚糖(70kDa)，完成蛋白质囊泡的糖基功能化；采用经典的溶胶-凝胶法制备介孔二氧化硅纳米粒子，通过硅烷偶联剂与4-甲酰基苯硼酸顺序进行氨基与苯硼酸基团修饰，得到苯硼酸化介孔二氧化硅纳米粒子；基于利用苯硼酸与多糖的生物正交反应，使得苯硼酸接枝的介孔二氧化硅纳米粒子充当连接剂从而形成蛋白质囊泡聚集体；通过这种“手牵手”结构阻碍负载酶的蛋白质囊泡通过小孔径毛细管，使其留在重力流空柱中并进行多次酶催化反应。本发明的构建方法绿色污染，酶催化反应高效专一，灵活可控，并且采用蛋白质膜包覆的方式负载酶，在极大保证酶的可逆催化活性前提下，酶的利用率提升高达3倍。
本发明的方法适用于多种不同的蛋白质形成蛋白质囊泡以及蛋白质囊泡聚集体，例如：淀粉酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶等；并且在不同蛋白质引入的情况下，也会引入不同的效果，例如过氧化氢酶的引入，膜上相同酶的增加，使得底物转化率提高5～10％；又或者引入葡萄糖氧化酶，通过酶级联反应，增加底物的选择空间(葡萄糖)而最终产物不变。总之，不同功能蛋白质的引入，会让该蛋白质囊泡聚集体的功能增加，发挥更多优势。
实施例1：
一、蛋白质囊泡的糖基功能化
(1)制备葡聚糖-聚合物基元：葡聚糖经过羧基化和氨基化，通过图1葡聚糖羧基化核磁共振氢谱，可证明羧基修饰过程的成功，随后氨基化葡聚糖10mg溶于10mL超纯水中，缓慢滴加到聚异丙基丙烯酰胺溶液中(10mL，1mgmL-1)，室温反应过夜，溶液在超纯水中透析(透析袋截留分子量为10000)，透析液过滤后冷冻干燥得到白色固体，并在-20℃保存。
(2)制备牛血清白蛋白-聚合物基元：氨基化牛血清白蛋白10mg溶于10mL超纯水中，缓慢滴加到聚异丙基丙烯酰胺溶液(10mL，1mgmL-1)中，室温反应过夜，溶液在超纯水中透析(透析袋截留分子量为35000)，透析液过滤后冷冻干燥得到白色固体，并在-20℃保存。
(3)糖基功能化蛋白质囊泡制备：配置构建基元溶液均为10mgmL-1，用移液枪吸取构建基元溶液共20μL于1.5mL离心管内，然后加入8μL磷酸缓冲液(pH8.0，50mM)，混合均匀后加入400μL异辛醇并剧烈震荡30s得到乳液囊泡(图2)，并且通过扫描电子显微镜可观察到其干燥后的膜结构。另外如有转移水相的要求，在制备前加入0.5mg交联剂(NHS-PEG16-NHS)，交联反应过夜后，分别用75％、50％、25％浓度的乙醇梯度透析转移到水相中，在图4光学显微镜下可观察其在微吸管下的吞吐过程，表明其膜的柔性。
二、苯硼酸化介孔二氧化硅纳米粒子合成
(1)介孔二氧化硅纳米粒子合成：首先称取十六烷基三甲基溴化铵(1.0g)充分溶解于240mL超纯水中，随后加入3.5mL氢氧化钠溶液(NaOH，2M)，将体系升温到80℃并加入5mL正硅酸乙酯，保持80℃恒温持续充分搅拌2h，减压过滤除去溶液得到白色固体，随后利用减压过滤用大量超纯水和甲醇洗涤，真空干燥过夜并得到白色粉末。为了去除CTAB模板，称取上一步得到的产物1.0g悬浮于100mL甲醇中，超声使其彻底，加热条件下加入6mL浓HCl回流6h，用大量水和甲醇减压过滤洗涤，真空干燥过夜并得到白色粉末。
(2)介孔二氧化硅纳米粒子修饰氨基：本方法主要是利用含氨基的硅烷偶联剂在纳米粒子表面的羟基水解的过程，其中需要保证无水无氧的环境将1.0g介孔二氧化硅纳米粒子悬浮于100mL无水甲苯中，加入2.4mL氨丙基三乙氧基硅烷，惰性气体保护下加热回流12h，用大量水和甲醇减压过滤洗涤，真空干燥过夜。
(3)介孔二氧化硅纳米粒子修饰苯硼酸：本方法利用4-甲酰基苯硼酸上的醛基和氨基化介孔二氧化硅纳米粒子修饰的氨基进行反应，将苯硼酸基团大量修饰到纳米粒子表面以及介孔孔道里，首先将100mg氨基化介孔二氧化硅纳米粒子和100mg4-甲酰基苯硼酸用超声波清洗器彻底分散在100mL无水甲苯中，加入几滴(约20～50μL)冰醋酸，将悬浮液在70℃加热条件下回流过夜，用大量水和甲醇减压过滤洗涤，真空干燥过夜并得到白色粉末，最后产品可通过扫描电子显微镜观察形貌(图5)。
三、蛋白质囊泡聚集体制备
糖基化蛋白质囊泡在转移水相后，浓度浓缩到0.4mgmL-1，取50μL蛋白质囊泡，再加入40μL磷酸缓冲溶液(pH＝7.4，100mM)和10μL苯硼酸化介孔二氧化硅纳米粒子(5mgmL-1)，中性的溶液环境以保证苯硼酸和糖基的超分子相互作用，轻微震荡30min形成蛋白质囊泡聚集体(图6)。
四、酶利用率模型构筑及效果测试
将蛋白质囊泡(内部负载酶5～10μg)的聚集体的制备过程，转移到重力流空柱(底部孔径为200μm)中操作，如图7所示，在底部形成蛋白质囊泡聚集体，加入底物发生酶促反应，将反应物从底部放出，重新加入底物继续反应，重复该操作，该反应分别进行5～30min，经历5个循环，通过图8可以看出酶的利用率提升了2～3倍。例如，在反应时间为5min中时，其经历的5个循环后，底物的转化率由29％提升到了97％，酶的利用率提升了约3倍。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.一种提高酶利用率的蛋白质囊泡聚集体的构建方法，其特征在于：所述方法为：
步骤一：蛋白质囊泡的糖基功能化
(1)制备葡聚糖-聚合物基元：将氨基化葡聚糖与聚异丙基丙烯酰胺按照1：1的质量比混合，在pH为6～8的磷酸缓冲溶液中孵育过夜，透析后冻干使用；
(2)制备功能蛋白-聚合物基元：将氨基化功能蛋白与聚异丙基丙烯酰胺按照1：1的质量比混合，在pH为6～8的磷酸缓冲溶液中孵育过夜，透析后冻干使用；所述功能蛋白为牛血清白蛋白、淀粉酶、葡萄糖氧化酶或过氧化氢酶中的一种；
(3)糖基功能化蛋白质囊泡制备：将以上两种基元分别配置为5～10mg/mL的水溶液后混合，加入异辛醇油相，剧烈震荡后，转移到水相中备用；
步骤二：苯硼酸化介孔二氧化硅纳米粒子合成
(1)介孔二氧化硅纳米粒子合成：十六烷基三甲基溴化铵充分溶解于超纯水中，随后加入正硅酸乙酯，在60～90℃的碱性条件下搅拌水解，得到白色粉末；十六烷基三甲基溴化铵与正硅酸乙酯的质量比为0.4：100；
(2)介孔二氧化硅纳米粒子修饰氨基：取介孔二氧化硅纳米粒子悬浮于甲苯中，加入氨丙基三乙氧基硅烷，惰性条件下回流过夜，洗涤后真空干燥；
(3)介孔二氧化硅纳米粒子修饰苯硼酸：氨基化介孔二氧化硅纳米粒子与4-甲酰基苯硼酸超声分散在无水甲苯中，浓度为0.01g mL-1，加入几滴冰醋酸，在50～80℃加热条件下回流过夜；
步骤三：蛋白质囊泡聚集体制备
将步骤一得到的糖基功能化蛋白质囊泡与步骤二得到的苯硼酸化介孔二氧化硅纳米粒子混合于pH为6～8的磷酸缓冲溶液中，室温下轻微震荡10～30min，除去上层溶液，得到蛋白质囊泡聚集体。
2.根据权利要求1所述的一种提高酶利用率的蛋白质囊泡聚集体的构建方法，其特征在于：在步骤一(3)制备囊泡的过程中加入适量酶，所述方法还包括步骤四：将步骤三蛋白质囊泡的聚集体的制备过程，转移到重力流空柱(底部孔径为50～300μm)中操作，在底部形成蛋白质囊泡聚集体，加入底物发生酶促反应，将反应物从底部放出，重新加入底物继续反应，重复该操作。
3.根据权利要求1或2所述的一种提高酶利用率的蛋白质囊泡聚集体的构建方法，其特征在于：步骤一(3)中，糖基功能化蛋白质囊泡的制备具体为：用移液枪吸取构建基元溶液到离心管内(不同基元的比例相同，也可按需求搭配比例)，然后加入磷酸缓冲液，控制pH为6～8，混合均匀后加入异辛醇油相并剧烈震荡30～120s得到乳液囊泡，另外如有转移水相的要求，在制备前加入0.5～2.5mg(终浓度为0.02～0.1mg/μL)交联剂，交联反应过夜后，用不同浓度的乙醇梯度透析转移到水相中。
4.根据权利要求3所述的一种提高酶利用率的蛋白质囊泡聚集体的构建方法，其特征在于：步骤一(3)中，两种构建基元的比例为1：1～5，水油比例1：20～40。
5.根据权利要求1所述的一种提高酶利用率的蛋白质囊泡聚集体的构建方法，其特征在于：步骤二(1)中，所用碱性的调控是在250mL体系中加入2M氢氧化钠3～5mL。
6.根据权利要求1所述的一种提高酶利用率的蛋白质囊泡聚集体的构建方法，其特征在于：步骤二(2)中，所述介孔二氧化硅纳米粒子、甲苯和氨丙基三乙氧基硅烷的比例为1g：50～200mL：1～3mL。
7.根据权利要求1所述的一种提高酶利用率的蛋白质囊泡聚集体的构建方法，其特征在于：步骤二(3)中，所述氨基化介孔二氧化硅纳米粒子与4-甲酰基苯硼酸的质量比为2：1～5。
8.根据权利要求1所述的一种提高酶利用率的蛋白质囊泡聚集体的构建方法，其特征在于：步骤三中，蛋白质囊泡在溶液中的浓度为0.1～2.0mg/mL。
9.根据权利要求1所述的一种提高酶利用率的蛋白质囊泡聚集体的构建方法，其特征在于：步骤三中，苯硼酸化介孔二氧化硅纳米粒子在溶液中的浓度为2～7mg/mL。
10.根据权利要求2所述的一种提高酶利用率的蛋白质囊泡聚集体的构建方法，其特征在于：步骤四中，重力流空柱中蛋白质囊泡聚集体的组装时间为10～30min，酶促反应时间为5～30min。
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- 2022-11-16 CN CN202211436499.1A patent/CN115710581A/zh active Pending
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