CN111019941A - 一种dna纳米材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种DNA纳米材料及其制备方法和应用,属于纳米材料技术领域。本发明在DNA折纸理论基础上设计了DNA纳米条纹带,该纳米条纹带由特殊结构的环模板经滚环反应扩增得到的滚环扩增反应产物自组装形成DNA纳米晶格,在DNA纳米晶格上修饰靶向核仁素的AS1411适配体形成DNA纳米材料DNA纳米条晶格带‑AS1411复合物;进一步将DNA纳米条晶格带‑AS1411复合物与纳米金球结合形成DNA纳米材料纳米金‑DNA纳米晶格带复合物。制备所得DNA纳米材料作为靶向药物载体在肿瘤诊疗中的广泛应用价值。
Description
技术领域
本发明属于纳米材料技术领域,具体涉及一种DNA纳米材料及其制备方法和应用。
背景技术
众所周知,在当今人类生命健康正面临着癌症等多种重大疑难疾病的威胁,传统意义上的抗癌药物存在着极大的潜在威胁。为了改善传统药物的性能,弥补传统抗癌药物的缺陷,发展适宜的药物递送载体成为当今生物技术与医药领域研究者的关注热点。
传统的药物输送载体如脂质体,高分子聚合物等特异性低,存在较大的非靶细胞毒性;无机纳米粒子则细胞摄取率低,胞内稳定性差;近年来,运用DNA组装而成纳米材料作为药物运送载体可以降低细胞组织毒性,降低药物输送途径的难题,并有望实现协同运输,然而,目前的DNA纳米结构仍然有结构设计复杂,载药量低等诸多缺陷。
基于自组装DNA纳米技术的DNA纳米结构在纳米载体领域表现出了巨大的前景。DNA折纸术是近年来飞速发展,被广泛应用于纳米材料组装的全新DNA自组装的策略,是DNA纳米技术和DNA自组装领域的跨越式的进展。与传统的DNA自组装技术不同的是,DNA折纸术利用一根长的DNA单链(称为手脚架链)与一系列短的DNA单链(称为订书钉链)间的碱基互补配对,使长的DNA单链发生折叠弯曲,最终形成特定结构。该技术能够精准构造出高度复杂的纳米图案和结构,在DNA纳米材料构建领域中具有广泛的潜在应用。为简化DNA折纸术以RCA(rolling circle amplification)产物的长的DNA单链做为手脚架链。
本发明在DNA折纸理论基础上设计了DNA纳米条纹带,该纳米条纹带由特殊结构的环模板经滚环反应扩增得到的RCA(rolling circle amplification)产物自组装形成,将纳米条纹带与纳米金球结合,成功构建出一种能高效载入抗癌药物阿霉素,且能通过AS1411适配体精确靶向MCF-7细胞的纳米级药物输送载体Au-R2A-DOX。
发明内容
本发明的目的在于提供一种DNA纳米材料及其制备方法和应用。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种介导合成的DNA纳米材料的环状模板的制备方法:将浓度为10 µM的成环链pL1 和pL2各 1µL,浓度为10 µM的封口模板T1和 T2各1µL,2 µL T4 DNA连接酶缓冲液加入到13 µL ddH2O中,充分混合后,将所得溶液在90℃退火5分钟,然后冷却至室温;随后,加入1 µL350 U / µL T4 DNA连接酶,并在16℃下孵育16小时,然后在65°C下加热10分钟使连接酶变性,制得环状模板。
上述成环链pL1 的核苷酸序列为:PL1:5’-AAACGCATGCAAAAAGATCTATAAA TAGCGAAAACTAGAAAAAAAGCATGCGAACCATAT-3’;成环链pL2的核苷酸序列为:PL2:5’-AAAACTTAGGAAAAATTCTAGTAAATAGCGAAAATAGATCAAAAACCTAAGTAAA CATAT-3’;封口模板T1的核苷酸序列为:T1 :5’-GATCTTTTTGCATGCGTTTATATGTTTACT-3’;封口模板T2的核苷酸序列为:T2:5’-AGAATTTTTCCTAAGTTTTATATGGTTCGC-3’。
上述环状模板的核苷酸序列为:5’-AAACGCATGCAAAAAGATCTATAAATAGCGAAAACTAGAAAAAAAGCATGCGAACCATATAAAACTTAGGAAAAATTCTAGTAAATAGCGAAAATAGATCAAAAACCTAAGTAAACATAT-3’
一种环状模板介导合成的DNA纳米材料DNA纳米条晶格带-AS1411复合物(RDL2-AS1411)的制备方法:将2μL浓度为15μM的滚环扩增(RCA)产物组成单元,2μL浓度为10μM的SS1,2μL浓度为10μM的SS1-AS1411核酸适配体,2μL浓度为10μM的SS2和2μL含125mM Mg2+的10×TAE缓冲液依次添加到12μLddH2O中并充分混合,然后将所得混合溶液在90℃下加热5分钟,然后冷却至室温制得DNA纳米材料RDL2-AS1411;
所述滚环扩增(RCA)产物的制备方法为:环状模板20ul,添加4 µL的10x phi29缓冲液,1 µL 10 mM的dNTP和0.5 µL10 U /μL的phi29聚合酶,添加ddH2O至总体积40μL,30℃温育30分钟;接着65℃下加热10分钟使phi29聚合酶失活;最后用苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)萃取RCA产物,用乙醇沉淀并溶于1xTE缓冲液中;
制备所得滚环扩增(RCA)产物的核苷酸序列为:5’-ATATGTTTACTTAGGTTTTTGATCTATTTTCGCTATTTACTAGAATTTTTCCTAAGTTTTATATGGTTCGCATGCTTTTTTTCTAGTTTTCGCTATTTATAGATCTTTTTGCATGCGTTT-3’。
一种环状模板介导合成的纳米金-DNA纳米晶格带复合物(Au-R2A)DNA纳米材料的制备方法,包括以下步骤:
(1)纳米金接引物(Au-Primer):100ul浓度为10uM的修饰了巯基的引物序列与500uL纳米金均匀混合反应,得到纳米金接引物Au-Primer;
(2)纳米金滚环产物(Au-RP):将步骤(1)修饰了滚环引物的纳米金接引物与环状模板按摩尔比为1:100混合,然后取20ul混合物添加4µL的10x phi29缓冲液,1 µL浓度为10 mM的dNTP和0.5 µL10 U /μL的phi29聚合酶,添加ddH2O至40μL,30℃温育30分钟,接着65℃下加热10分钟使phi29聚合酶失活,得到的纳米金滚环产物Au-RP;
(3)纳米金-DNA纳米晶格带复合物(Au-R2A):120uL步骤(2)制备所得纳米金滚环产物Au-RP与20uL 浓度为10µM SS1-AS1411,20uL 浓度为10µM的SS2混合,90℃退火5min后缓慢降至室温得到纳米金-DNA纳米晶格带复合物(Au-R2A)纳米材料。
上述制备方法中所述SS1-AS1411核酸适配体的核苷酸序列为:5’-TAGCGTAGCGTAGCGTTTTTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’。;所述SS2的核苷酸序列为:5’-TATACTATACTATAC-3’。
上述制备方法中所述修饰了巯基的引物序列,其核苷酸序列为:5’-SH-AAAAAAAAAACCCCCCCCCCGATCTTTTTGCATGCGTTTATATGTTTACT-3’;
上述方法制备所得的纳米材料DNA纳米条晶格带-AS1411(RDL2-AS1411)及纳米金-DNA纳米晶格带复合物(Au-R2A)作为靶向药物载体的应用。
一种DNA 靶向药物的制备方法:40uL合成的DNA纳米材料DNA纳米条晶格带-AS1411(RDL2-AS1411)或纳米金-DNA纳米晶格带复合物(Au-R2A)加入到160uL浓度为2mM的阿霉素( Doxorubicin)溶液中,37℃孵育24小时离心得到DNA 靶向药物RDL2-AS1411-DOX,Au-R2A-DOX。
上述一种DNA 靶向药物在肿瘤诊疗中的应用。
本发明的优点在于:
本发明提供了一种DNA纳米材料及其制备方法和应用。本发明DNA折纸理论基础上,以环状模板经过滚环扩增(RCA)反应后生成滚环扩增产物的组成单元;滚环扩增产物的组成单元能自组装折叠形成DNA纳米晶格,两条短侧边链SS1 和SS2与DNA纳米晶格外侧的未参与碱基互补配对的单链DNA互补配对形成DNA纳米晶格带RDL2,(如图1所示)。DNA纳米晶格带RDL2携带能够靶向核仁素的AS1411适配体,形成纳米材料RDL2-AS1411。进一步的先将修饰了巯基的引物修饰在Au上,然后与环状模板经过滚环扩增(RCA)反应直接在纳米金的表面形成滚环扩增产物的组成单元,之后经自组装折叠,并增两条短侧边链SS1 和SS2,以及能够靶向核仁素的AS1411适配体形成纳米材料Au-R2A。纳米材料RDL2-AS1411和Au-R2A作为纳米级药物运输载体能够携带药物靶向运输,在医药领域具有广泛的应用价值。
附图说明
图1DNA纳米材料RDL2的结构示意图。
图2DNA纳米材料负载阿霉素结果图。
图3DNA靶向药物递送药物的细胞成像图。图中第一行是细胞核染料hoechst通道图(405nm);第二行是DOX通道图(488nm);第三行是第一,二行的叠加overlay。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解,下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明,但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已,并不代表本发明所限定的权利保护范围,本发明的权利保护范围以权利要求书为准。
实施例1
一种介导合成的DNA纳米材料的环状模板的制备方法:将浓度为10 µM的成环链pL1 和pL2各 1µL,浓度为10 µM的封口模板T1和 T2各1µL,2 µL T4 DNA连接酶缓冲液加入到13 µL ddH2O中,充分混合后,将所得溶液在90℃退火5分钟,然后冷却至室温;随后,加入1 µL350 U / µL T4 DNA连接酶,并在16℃下孵育16小时,然后在65°C下加热10分钟使连接酶变性,制得环状模板。
上述成环链pL1 的核苷酸序列为:PL1:5’-AAACGCATGCAAAAAGATCTATAAATAGCGAAAACTAGAAAAAAAGCATGCGAACCATAT-3’;成环链PL2的核苷酸序列为:PL2:5’-AAAACTTAGGAAAAATTCTAGTAAATAGCGAAAATAGATCAAAAACCTAAGTAAA CATAT-3’;封口模板T1的核苷酸序列为:T1 :5’-GATCTTTTTGCATGCGTTTATATGTTTACT-3’;封口模板T2的核苷酸序列为:T2:5’-AGAATTTTTCCTAAGTTTTATATGGTTCGC-3’。
上述环状模板的核苷酸序列为:5’-AAACGCATGCAAAAAGATCTATAAATAGCGAAAACTAGAAAAAAAGCATGCGAACCATATAAAACTTAGGAAAAATTCTAGTAAATAGCGAAAATAGATCAAAAACCTAAGTAAACATAT-3’。
实施例2
一种环状模板介导合成的DNA纳米条晶格带-AS1411复合物(RDL2-AS1411)DNA纳米材料的制备方法:将2μL浓度为15μM的滚环扩增(RCA)产物,2μL浓度为10μM的SS1,2μL浓度为10μM的SS1-AS1411核酸适配体,2μL浓度为10μM的SS2和2μL含125mM Mg2+的10×TAE缓冲液依次添加到12μLddH2O中并充分混合,然后将所得混合溶液在90℃下加热5分钟,然后冷却至室温制得DNA纳米材料RDL2-AS1411。
上述滚环扩增(RCA)产物的制备方法为:实施例1制备的环状模板20ul,添加4 µL的10x phi29缓冲液,1 µL 10 mM的dNTP和0.5 µL10 U /μL的phi29聚合酶,添加ddH2O至总体积40μL,30℃温育30分钟;接着65℃下加热10分钟使phi29聚合酶失活;最后用苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)萃取RCA产物,用乙醇沉淀并溶于1xTE缓冲液中。
制备所得滚环扩增(RCA)产物的核苷酸序列为:5’-ATATGTTTACTTAGGTTTTTGATCTATTTTCGCTATTTACTAGAATTTTTCCTAAGTTTTATATGGTTCGCATGCTTTTTTTCTAGTTTTCGCTATTTATAGATCTTTTTGCATGCGTTT-3’。
上述制备方法中所述SS1-AS1411核酸适配体的核苷酸序列为:5’-TAGCGTAGCGTAGCGTTTTTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’。;所述SS2的核苷酸序列为:5’-TATACTATACTATAC-3’。
实施例3
一种环状模板介导合成的纳米金-DNA纳米晶格带复合物(Au-R2A)DNA纳米材料的制备方法,包括以下步骤:
(1)纳米金接引物(Au-Primer):100ul浓度为10uM的修饰了巯基的引物序列与500uL纳米金均匀混合反应,得到纳米金接引物Au-Primer;
(2)纳米金滚环产物(Au-RP):将步骤(1)修饰了滚环引物的纳米金接引物与实施例1制备的环状模板按摩尔比为1:100混合,然后取20ul混合物添加4µL的10x phi29缓冲液,1 µL浓度为10 mM的dNTP和0.5 µL10 U /μL的phi29聚合酶,添加ddH2O至40μL,30℃温育30分钟,接着65℃下加热10分钟使phi29聚合酶失活,得到的纳米金滚环产物Au-RP;
(3)纳米金-DNA纳米晶格带复合物(Au-R2A):120uL步骤(2)制备所得纳米金滚环产物Au-RP与20uL 浓度为10µM SS1-AS1411,20uL 浓度为10µM的SS2混合,90℃退火5min后缓慢降至室温得到纳米金-DNA纳米晶格带复合物(Au-R2A)纳米材料。
上述步骤(1)中所述修饰了巯基的引物序列,其核苷酸序列为:5’-SH-AAAAAAAAAACCCCCCCCCCGATCTTTTTGCATGCGTTTATATGTTTACT-3’。
上述步骤(3)中,所述所述SS1-AS1411核酸适配体的核苷酸序列为:5’-TAGCGTAGCGTAGCGTTTTTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’。
实施例4 药物负载实验
将160 µL阿霉素(DOX)溶液(2 mM)分别在40 µL实施例2制备的DNA纳米条晶格带-AS1411(RDL2-AS1411)纳米材料和实施例3制备的纳米金-DNA纳米晶格带复合物(Au-R2A)纳米材料中37 ℃孵育24小时,之后将样品在25°C下离心5分钟(6,000 g),并将深红色沉淀溶于200 µL PBS中,制备DNA 靶向药物RDL2-AS1411-DOX和Au-R2A-DOX(图2)。
同时,为验证靶向药物的靶向性,设置对照实验:
对照纳米材料为:未修饰AS1411适配体的DNA纳米条晶格带RDL2和纳米金-DNA纳米晶格带复合物Au-RDL2。
DNA纳米条晶格带RDL2的制备方法为:将实施例2DNA纳米条晶格带-AS1411(RDL2-AS1411)纳米材料的制备方法中的SS1-AS1411核酸适配体替换为SS1短核苷酸链,SS1的核苷酸序列为:5’-TAGCGTAGCGTAGCG-3’;其余步骤同实施例2。
纳米金-DNA纳米晶格带复合物Au-RDL2的制备方法为:将实施例3 DNA纳米条晶格带-AS1411(RDL2-AS1411)纳米材料的制备方法中的SS1-AS1411核酸适配体替换为SS1短核苷酸链,SS1的核苷酸序列为:5’-TAGCGTAGCGTAGCG-3’;其余步骤同实施例3。
未修饰AS1411适配体的DNA纳米条晶格带RDL2和纳米金-DNA纳米晶格带复合物Au-RDL2负载药物:将160 µL阿霉素(DOX)溶液(2 mM)分别在40 µL未修饰AS1411适配体的DNA纳米条晶格带RDL2和纳米金-DNA纳米晶格带复合物Au-RDL2材料中37 ℃孵育24小时,之后将样品在25°C下离心5分钟(6,000 g),并将深红色沉淀溶于200 µL PBS中,制备DNA靶向药物RDL2-DOX和Au-RDL2-DOX。
实施例5 细胞内原位检测
MCF-7细胞先在24孔板内爬片(培养基成分为10%(v/v)胎牛血清(FBS),100U/mL青霉素(penicillin),100μg/mL链霉素(streptomycin),在37℃,5%的CO2环境下培养),培养24小时后加入实施例4制备的药物(DOX浓度为40µM)(RDL2-AS1411-DOX、RDL2-DOX、Au-R2A-DOX、Au-RDL2-DOX),然后在无胎牛血清与双抗(100U/mL青霉素,100μg/mL链霉素)的DMEM培养基中37℃,5%的CO2环境下培养2小时,之后除去培养基,PBS清洗3次,4%多聚甲醛固定15分钟用PBS清洗3次,Hochest荧光染料染核10分钟,PBS清洗3次,封片后拍摄共聚焦。结果见图3。从图3可以看出,Au-R2A-DOX组在MCF-7细胞中观测到大量红色DOX荧光,RDL2-AS1411-DOX组的荧光亮度次之,RDL2-DOX和Au-RDL2-DOX组荧光亮度很低。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 一种DNA纳米材料及其制备方法和应用
<130> 10
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<212> DNA
<213> 修饰了巯基的引物序列
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shaaaaaaaa aacccccccc ccgatctttt tgcatgcgtt tatatgttta ct 52
<210> 8
<211> 47
<212> DNA
<213> SS1-AS1411核酸适配体
<400> 8
tagcgtagcg tagcgttttt tggtggtggt ggttgtggtg gtggtgg 47
<210> 9
<211> 15
<212> DNA
<213> SS2
<400> 9
tatactatac tatac 15
<210> 10
<211> 15
<212> DNA
<213> SS1
<400> 10
tagcgtagcg tagcg 15
Claims (10)
1.一种介导合成的DNA纳米材料的环状模板的制备方法,其特征在于:将浓度为10 µM的成环链pL1 和pL2各 1µL,浓度为10 µM的封口模板T1和 T2各1µL,2 µL T4 DNA连接酶缓冲液加入到13 µL ddH2O中,充分混合后,将所得溶液在90℃退火5分钟,然后冷却至室温;随后,加入1 µL 350 U / µL T4 DNA连接酶,并在16℃下孵育16小时,然后在65°C下加热10分钟使连接酶变性,制得环状模板。
2.根据权利要求1所述的一种介导合成的DNA纳米材料的环状模板的制备方法,其特征在于:所述成环链pL1 的核苷酸序列为:PL1:5’-AAACGCATGCAAAAAGATCTATAAATAGCGAAAACTAGAAAAAAAGCATGCGAACCATAT-3’;成环链pL2的核苷酸序列为:PL2:5’-AAAACTTAGGAAAAATTCTAGTAAATAGCGAAAATAGATCAAAAACCTAAGTAAACATAT-3’;封口模板T1的核苷酸序列为:T1 :5’-GATCTTTTTGCATGCGTTTATATGTTTACT-3’;封口模板T2的核苷酸序列为:T2:5’-AGAATTTTTCCTAAGTTTTATATGGTTCGC-3’ 。
3.一种如权利要求1所述方法制备所得环状模板,其特征在于:所制得环状模板的核苷酸序列为:5’-AAACGCATGCAAAAAGATCTATAAATAGCGAAAACTAGAAAAAAAGCATGCGAACCATATAAAACTTAGGAAAAATTCTAGTAAATAGCGAAAATAGATCAAAAACCTAAGTAAACATAT-3’。
4.一种如权利要求3所述的环状模板介导合成DNA纳米条晶格带-AS1411复合物RDL2-AS1411 DNA纳米材料的制备方法,其特征在于:将2μL浓度为15μM的滚环扩增产物,2μL浓度为10μM的SS1,2μL浓度为10μM的SS1-AS1411核酸适配体,2μL浓度为10μM的SS2和2μL含125mM Mg2+的10×TAE缓冲液依次添加到12μLddH2O中并充分混合,然后将所得混合溶液在90℃下加热5分钟,然后冷却至室温制得DNA纳米材料RDL2-AS1411;
所述滚环扩增产物的制备方法为:环状模板20ul,添加4 µL的10x phi29缓冲液,1 µL10 mM的dNTP和0.5 µL10 U/μL的phi29聚合酶,添加ddH2O至总体积40μL,30℃温育30分钟;接着65℃下加热10分钟使phi29聚合酶失活;最后用体积比为25:24:1的苯酚/氯仿/异戊醇萃取滚环扩增产物,用乙醇沉淀并溶于1xTE缓冲液中;
制备所得滚环扩增产物的核苷酸序列为:5’-ATATGTTTACTTAGGTTTTTGATCTATTTTCGCTATTTACTAGAATTTTTCCTAAGTTTTATATGGTTCGCATGCTTTTTTTCTAGTTTTCGCTATTTATAGATCTTTTTGCATGCGTTT-3’。
5.一种如权利要求3所述的环状模板介导合成纳米金-DNA纳米晶格带复合物Au-R2ADNA纳米材料的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)纳米金接引物Au-Primer的制备:100ul浓度为10uM的修饰了巯基的引物序列与500uL纳米金均匀混合,得到纳米金接引物Au-Primer;
(2)纳米金滚环产物Au-RP的制备:将步骤(1)修饰了滚环引物的纳米金接引物与环状模板按摩尔比为1:100混合,然后取20ul混合物添加4µL的10x phi29缓冲液,1 µL浓度为10mM的dNTP和0.5 µL10 U/μL的phi29聚合酶,添加ddH2O至40μL,30℃温育30分钟,接着65℃下加热10分钟使phi29聚合酶失活,得到的纳米金滚环产物Au-RP;
(3)纳米金DNA纳米条带复合物Au-R2A的制备:120uL步骤(2)制备所得纳米金滚环产物Au-RP与20uL 浓度为10µM SS1-AS1411,20uL 浓度为10µM的SS2混合,90℃退火5min后缓慢降至室温得到纳米金-DNA纳米晶格带复合物Au-R2A纳米材料。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于:步骤(1)中所述修饰了巯基的引物序列,其核苷酸序列为:5’-SH-AAAAAAAAAACCCCCCCCCCGATCTTTTTGCATGCGTTTATATGTTTACT-3’。
7.根据权利要求4或5所述的制备方法,其特征在于:所述SS1-AS1411核酸适配体的核苷酸序列为:5’-TAGCGTAGCGTAGCGTTTTTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’,所述SS2的核苷酸序列为:5’-TATACTATACTATAC-3’。
8.如权利要求4或5所述方法制备所得的DNA纳米材料DNA纳米条晶格带-AS1411复合物RDL2-AS1411或纳米金-DNA纳米晶格带复合物Au-R2A作为靶向药物载体的应用。
9.一种DNA 靶向药物的制备方法,其特征在于:40uL权利要求4制备所得DNA纳米材料DNA纳米条晶格带-AS1411复合物RDL2-AS1411,或实施例5制备所得纳米金-DNA纳米晶格带复合物Au-R2A加入到160uL浓度为2mM的阿霉素溶液中,37℃孵育24小时离心得到DNA 靶向药物RDL2-AS1411-DOX或Au-R2A-DOX。
10.如权利要求9所述的一种DNA 靶向药物在肿瘤诊疗中的应用。
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