CN110551725A

CN110551725A - 一种抗凝血的dna纳米复合结构及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110551725A
Application number: CN201810995000.8A
Authority: CN
Inventors: 丁宝全; 赵帅; 蒋乔; 刘少利
Original assignee: National Center for Nanosccience and Technology China
Current assignee: National Center for Nanosccience and Technology China
Priority date: 2018-06-04
Filing date: 2018-08-29
Publication date: 2019-12-10
Anticipated expiration: 2038-08-29
Also published as: CN110551725B

Abstract

本发明提供了一种抗凝血的DNA纳米复合结构及其制备方法和应用，所述DNA纳米复合结构包括DNA纳米结构和抗凝血酶核酸适配体，所述DNA纳米结构由DNA模板链、辅助折叠DNA链和捕获DNA链组装而成，所述抗凝血酶核酸适配体通过捕获DNA链结合在DNA纳米结构表面；本发明首先自组装得到DNA纳米结构，并通过位点设计将两种抗凝血酶适配体短DNA链组装到长方形DNA结构表面，精准控制适配体的相对位置，协同起效，优化组装和制备方法，最终得到DNA纳米复合结构，能有效抑制凝血酶活性，并能够利用与核酸适配体互补DNA短链使其快速解毒，具有广阔的应用前景和市场价值。

Description

一种抗凝血的DNA纳米复合结构及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及纳米药物技术领域，尤其涉及一种抗凝血的DNA纳米复合结构及其制备方法和应用。

背景技术

凝血酶通过识别多种超分子底物发挥凝血的功能，是生物体凝血系统的一种关键酶。在不需要其它众多凝血因子参与的情况下，凝血酶能够快速而高效的诱导血栓的形成。凝血酶可识别可溶性纤维蛋白原，使之转变为不可溶解的纤维蛋白，还可诱导血小板活化，使之在纤维蛋白凝胶网的作用下形成血小板血栓。凝血酶发挥功能时需要识别特定底物，其表面具有两个特异性识别位点，分别是纤维蛋白原识别位点(Fibrinogen-recognitionexosite)和肝素识别位点(Heparin-binding exosites)。

抗凝血酶核酸适配体是一类核酸序列，其二级结构为G四联体(G-quadruplex)，能够特异性识别凝血酶的外识别位点(exosites)。这些适配体序列由指数富集的配基系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by ExponentiaL Enrichment，SELEX)筛选得到，其中TBA15和HD22最为著名。L.C.Bock,J.J.Toole及其同事于1992年利用SELEX技术得到第一条抗凝血酶核酸适配体TBA15，这条单链DNA序列(5'-GGTTGGTGTGGTTGG-3')形成的二级结构能够特异性识别前述纤维蛋白原识别位点(the fibrinogen-recognitionexosite)，通过抑制纤维蛋白原活化和血小板聚集从而抑制凝血酶活力。Gilead Sciences公司在1997年发现第二条抗凝血酶核酸适配体HD22(5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3')，通过识别肝素结合位点(heparin-bindingexosites)，通过抑制V/VIII因子活化从而抑制凝血酶活力。这两种抗凝血酶核酸适配体都具有较高的亲和性和良好的特异性，已在各种基于核酸适配体的诊断和治疗中发挥作用，已有临床试验研究。同时，不同于其他抗凝剂，核酸适配体药物为核酸本质，可利用互补序列对其进行快速解毒，从而减少或避免其出血风险。然而，虽然已有许多优势，核酸适配体在实际应用中仍然存在诸多的问题，如核酸序列在体液内稳定性较差、很容易被降解、被肾脏代谢清除，限制其进一步应用。

在纳米医学领域中，DNA纳米技术展现了广泛的应用潜能。其中DNA折纸技术(DNAorigami)作为一种全新的DNA自组装策略引起研究者广泛的关注。在DNA折纸技术中，通过将一条DNA长单链(模板链，Scaffold strand)与一系列预先设计的DNA短单链(辅助折叠链，Helper strands)共同退火自组装，可构造出多种多样复杂可控的纳米图案或结构(Nature,2006,440,297-302)。DNA纳米材料具有结构精确可控、易于化学修饰、生物可降解等特点，是一种很有潜力的纳米载体材料，在药物靶向运输、可控释放、多种药物协同运输治疗、智能药物体系构建等方面有非常广阔的应用前景。

为了提升核酸适配体在活体内的稳定性和长循环，目前已有对于适配体序列进行化学修饰后进行应用的报道。然而，虽然序列修饰使得适配体的热稳定性得到提升，但却不可避免的影响其抗凝活力。利用纳米颗粒修饰核酸适配体，则可提升核酸适配体的稳定性，已被用于靶向配体的筛选或检测探针研究，但结合其核酸适配体生物功能，应用于医学实践的报道则非常稀少。

CN107219208A公开了一种基于硅纳米微球与核酸适配体的双荧光探针及其制备方法和应用。该探针的制备过程是，先在硅纳米微球表面修饰与不同靶标分析物的核酸适配体碱基序列互补的两种DNA单链，并在两种核酸适配体链的5’端修饰两种不同的荧光基团，然后将两者混合孵育，基于碱基互补配对的原理，得到双荧光探针。当该探针与靶标分析物共存时，靶标分析物会与核酸适配体竞争结合，从而使核酸适配体与其互补链解链并从探针上脱离下来。将溶液高速离心后，收集上清液并测定荧光强度值，根据两个最大波长处的荧光强度值计算得到各靶标分析物的浓度。CN104614358A涉及一种基于纳米粒子信号探针的拉曼放大检测凝血酶的方法，结合DNA滚环复制和核-壳结构的纳米粒子拉曼信号探针来实现双重信号放大，在磁珠表面结合把氨基修饰的DNA，凝血酶适体与其杂交形成双链DNA探针，在凝血酶存在下，与固定在磁珠表面的双链DNA探针结合，释放其中的一条链，留在磁珠上的探针作为引物发生滚环复制反应，生成长链DNA，与所制备的核-壳结构纳米探针上的DNA杂交，捕获拉曼信号探针，通过检测拉曼信号实现凝血酶的检测。现有技术中也有学者利用金纳米棒装载核酸适配体或胶束自组装形成纳米化的抗凝剂的尝试，但无法精确控制两种适配体的空间位置或者仅适用一种适配体进行组装，适配体DNA载量有限，活体应用具有潜在毒性，有学者通过在DNA纳米结构表面伸出数个带有核酸适配体序列的Loop结构，用于引导控制凝血酶在纳米结构表面组装，但未考虑其抗凝血功能与解毒。因此，上述现有技术的制备工艺复杂，抗凝血功能不显著，存在诸多缺陷，有待进一步优化和提升。

因此，构建一种能长期有效稳定、能够快速解毒的抑制凝血酶活力的纳米级抗凝剂，并用于抗凝治疗具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种抗凝血的DNA纳米复合结构及其制备方法和应用，所述纳米复合结构通过位点设计将凝血酶核酸适配体杂交组装到纳米结构表面，适配体的种类、位点分布和密度均可调整，能有效稳定抑制凝血酶的活性，并可快速解毒，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种抗凝血的DNA纳米复合结构，所述DNA纳米复合结构包括DNA纳米结构和抗凝血酶核酸适配体；

其中，所述DNA纳米结构由DNA模板链、辅助折叠DNA链和捕获DNA链自组装而成；

所述抗凝血酶核酸适配体通过捕获DNA链杂交结合在DNA纳米结构表面，所述结合能被与核酸适配体互补的解毒序列竞争破坏，逆转DNA纳米复合结构的抗凝血功能。

本发明中，发明人在长期的科研实践过程中，深入研究现有技术中关于凝血治疗的优缺点，为提升抗凝血酶核酸适配体在活体内的稳定性和长循环，创造性地提供一种由DNA模板、辅助折叠DNA链和捕获DNA链组装而成的纳米结构，巧妙地通过设计捕获DNA链来整合抗凝血酶核酸适配体，通过DNA杂交，实现抗凝血酶核酸适配体在DNA自组装纳米结构表面的精确定位，并通过调整适配体在DNA纳米结构上分布的种类、位点数量、分布密度和相对距离，形成核酸适配体阵列，有效结合凝血酶功能位点，抑制凝血酶活性，达到抗凝的作用；同时，与捕获DNA链杂交核酸适配体的设计，能够利用与核酸适配体相互补的链将其从纳米结构表面竞争结合，通过破坏核酸适配体单链，可逆响应快速解毒，该设计并能够可逆响应快速解毒，有望提供一种高效安全的新型抗凝药剂用于多种血栓疾病治疗与预防。

所述解毒序列为所述抗凝血适配体的互补序列，用于所述抗凝血DNA纳米结构的快速逆转解毒；为实现所述可逆的抗凝血功能，即去除DNA纳米复合结构的抗凝血功能，使用DNA解毒序列与杂交了核酸适配体的DNA纳米复合结构共孵育，将核酸适配体竞争下来，破坏其单链特定结构域；所述DNA解毒链将与竞争脱落的核酸适配体形成双链结构，破坏其与凝血酶特异识别结合的结构域，从而逆转整个DNA纳米复合结构的抗凝能力。

所述结合的位点具有可寻址性，能够预先设计；所述可寻址性，是指整个DNA纳米结构由全部已知序列DNA组装而成，任意表面或内部位点可以确定，并且用于放置适配体等功能基团；同时，也可通过设计控制两种适配体之间的距离；这是DNA折纸结构与金球等其他的结构最大的不同：其他结构中，适配体上载在表面是随机分布的，是不确定位置的；而DNA折纸结构是完全预先设计其组装位点的。

优选地，所述DNA模板包括M13mp18噬菌体基因组环状单链DNA、Lamda DNA、经过基因改造过的M13噬菌体基因组DNA或非对称PCR扩增产物中的任意一种或至少两种的组合，优选为M13mp18噬菌体基因组环状单链DNA。

优选地，所述M13mp18噬菌体基因组环状单链DNA的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

所述SEQ ID NO.1如下：

AATGCTACTACTATTAGTAGAATTGATGCCACCTTTTCAGCTCGCGCCCCAAATGAAAATATAGCTAAAC AGGTTATTGA CCATTTGCGA AATGTATCTAATGGTCAAAC TAAATCTACTCGTTCGCAGA ATTGGGAATCAACTGTTATATGGAATGAAA CTTCCAGACA CCGTACTTTAGTTGCATATT TAAAACATGTTGAGCTACAGCATTATATTC AGCAATTAAG CTCTAAGCCATCCGCAAAAATGACCTCTTATCAAAAGGAGCAATTAAAGGTACTCTCTAATCCTGACCTGTTGGAGTTTGCTTCCGGTCT GGTTCGCTTT GAAGCTCGAATTAAAACGCGATATTTGAAGTCTTTCGGGC TTCCTCTTAA TCTTTTTGAT GCAATCCGCTTTGCTTCTGACTATAATAGTCAGGGTAAAG ACCTGATTTT TGATTTATGG TCATTCTCGTTTTCTGAACTGTTTAAAGCATTTGAGGGGG ATTCAATGAA TATTTATGAC GATTCCGCAGTATTGGACGC TATCCAGTCTAAACATTTTACTATTACCCCCTCTGGCAAAACTTCTTTTGCAAAAGCCTCTCGCTATTTTGGTTTTTATCGTCGTCTGGT AAACGAGGGT TATGATAGTG TTGCTCTTAC TATGCCTCGTAATTCCTTTTGGCGTTATGTATCTGCATTA GTTGAATGTG GTATTCCTAA ATCTCAACTGATGAATCTTTCTACCTGTAA TAATGTTGTTCCGTTAGTTC GTTTTATTAA CGTAGATTTTTCTTCCCAACGTCCTGACTG GTATAATGAG CCAGTTCTTA 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AATTCACCTTTAATGAATAATTTCCGTCAATATTTACCTTCCCTCCCTCAATCGGTTGAATGTCGCCCTTTTGTCTTTGGCGCTGGTAAA CCATATGAAT TTTCTATTGA TTGTGACAAAATAAACTTATTCCGTGGTGTCTTTGCGTTT CTTTTATATG TTGCCACCTT TATGTATGTATTTTCTACGTTTGCTAACATACTGCGTAAT AAGGAGTCTT AATCATGCCA GTTCTTTTGGGTATTCCGTTATTATTGCGTTTCCTCGGTT TCCTTCTGGT AACTTTGTTC GGCTATCTGCTTACTTTTCTTAAAAAGGGCTTCGGTAAGATAGCTATTGCTATTTCATTGTTTCTTGCTCTTATTATTGGGCTTAACTCAATTCTTGTGGGTTATCTCTCTGATATTAGCGCTCAATTACCCTCTGACTTTGTTCAGGGTGTTCAGTTAATTCTCCCGTCTAATGCGCTTCCCTGTTTTT ATGTTATTCTCTCTGTAAAGGCTGCTATTT TCATTTTTGACGTTAAACAAAAAATCGTTTCTTATTTGGATTGGGATAAATAATATGGCTGTTTATTTTGTAACTGGCAAATTAGGCTCTGGAAAGACGCTCGTTAGCGTTGGTAAGATTCAGGATAAAA TTGTAGCTGGGTGCAAAATA GCAACTAATCTTGATTTAAGGCTTCAAAACCTCCCGCAAGTCGGGAGGTTCGCTAAAACGCCTCGCGTTCTTAGAATACC GGATAAGCCT TCTATATCTGATTTGCTTGC TATTGGGCGCGGTAATGATTCCTACGATGA AAATAAAAAC GGCTTGCTTGTTCTCGATGAGTGCGGTACT TGGTTTAATACCCGTTCTTG GAATGATAAG GAAAGACAGCCGATTATTGATTGGTTTCTA CATGCTCGTAAATTAGGATG GGATATTATT TTTCTTGTTCAGGACTTATC TATTGTTGAT 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CTCCTTCTGG TGGTTTCTTTGTTCCGCAAA ATGATAATGTTACTCAAACTTTTAAAATTA ATAACGTTCGGGCAAAGGAT TTAATACGAG TTGTCGAATT GTTTGTAAAGTCTAATACTTCTAAATCCTCAAATGTATTATCTATTGACGGCTCTAATCTATTAGTTGTTAGTGCTCCTAAAGATATTTTAGATAACCTTCCTCAATTCCTTTCAACTGTTGATTTGCCAACTGACCAGATATTGATTGAGGGTTTGATATTTGAGGTTCAGCAAGGTGATGCTTTAGATTTTTCATTTGCTGCTGGCTCTCAGCGTGGCACTGTTGCAG GCGGTGTTAATACTGACCGCCTCACCTCTGTTTTATCTTCTGCTGGTGGT TCGTTCGGTA TTTTTAATGGCGATGTTTTAGGGCTATCAGTTCGCGCATT AAAGACTAAT AGCCATTCAA AAATATTGTCTGTGCCACGTATTCTTACGCTTTCAGGTCAGAAGGGTTCTATCTCTGTTGGCCAGAATGTCCCTTTTATTACTGGTCGTGTGACTGGTGAATCTGCCAAT GTAAATAATC CATTTCAGACGATTGAGCGTCAAAATGTAG GTATTTCCAT GAGCGTTTTTCCTGTTGCAATGGCTGGCGG TAATATTGTTCTGGATATTA CCAGCAAGGC CGATAGTTTGAGTTCTTCTACTCAGGCAAG TGATGTTATTACTAATCAAAGAAGTATTGCTACAACGGTT AATTTGCGTG ATGGACAGAC TCTTTTACTCGGTGGCCTCACTGATTATAAAAACACTTCTCAGGATTCTGGCGTACCGTTCCTGTCTAAAATCCCTTTAATCGGCCTCCT GTTTAGCTCC CGCTCTGATT CTAACGAGGAAAGCACGTTATACGTGCTCG TCAAAGCAACCATAGTACGC GCCCTGTAGCGGCGCATTAA GCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGC GCCCTAGCGC CCGCTCCTTTCGCTTTCTTC CCTTCCTTTCTCGCCACGTT CGCCGGCTTTCCCCGTCAAG CTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTA GTGGGCCATC GCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCC ACGTTCTTTA ATAGTGGACT CTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGC TATTCTTTTG ATTTATAAGGGATTTTGCCG ATTTCGGAACCACCATCAAACAGGATTTTC GCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGC GCGTTGGCCG ATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATG TGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGT TGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTC ACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACG AATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACG TCGTGACTGG GAAAACCCTG GCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTT CGCCAGCTGG CGTAATAGCG AAGAGGCCCGCACCGATCGC CCTTCCCAACAGTTGCGCAG CCTGAATGGCGAATGGCGCTTTGCCTGGTTTCCGGCACCAGAAGCGGTGCCGGAAAGCTGGCTGGAGTGCGATCTTCCTGAGGCCGATAC TGTCGTCGTC CCCTCAAACTGGCAGATGCACGGTTACGATGCGCCCATCTACACCAACGTGACCTATCCCATTACGGTCAATCCGCCGTTTGTTCCCACG GAGAATCCGACGGGTTGTTACTCGCTCACATTTAATGTTGATGAAAGCTG GCTACAGGAAGGCCAGACGC GAATTATTTTTGATGGCGTT CCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAAC AAAAATTTAATGCGAATTTT AACAAAATAT TAACGTTTACAATTTAAATATTTGCTTATACAATCTTCCTGTTTTTGGGG CTTTTCTGAT TATCAACCGGGGTACATATGATTGACATGCTAGTTTTACGATTACCGTTCATCGATTCTCTTGTTTGCTCCAGACTCTCAGGCAATGACC TGATAGCCTTTGTAGATCTC TCAAAAATAGCTACCCTCTCCGGCATTAAT TTATCAGCTA GAACGGTTGA ATATCATATTGATGGTGATTTGACTGTCTCCGGCCTTTCT CACCCTTTTG AATCTTTACC TACACATTACTCAGGCATTGCATTTAAAATATATGAGGGT TCTAAAAATT TTTATCCTTG CGTTGAAATA AAGGCTTCTCCCGCAAAAGTATTACAGGGTCATAATGTTTTTGGTACAACCGATTTAGCTTTATGCTCTGAGGCTTTATTGCTTAATTTTGCTAATTCTT TGCCTTGCCT GTATGATTTA TTGGATGTT.

优选地，所述DNA纳米复合结构的形状包括三角形片层、长方形片层、管状、盒状或球形中的任意一种，优选为三角形片层和/或长方形片层。

其中，所述DNA纳米复合结构的形状均可根据实际需要调整得到，本发明以长方形片层为例。

两种核酸适配体在长方形DNA折纸结构上的分布示意图如图1(A)所示，修饰了核酸适配体的长方形DNA折纸对于凝血酶的捕获示意图如图1(B)所示。

优选地，所述三角形片层为等边三角形，所述三角形片层的边长为80-100nm，例如可以是80nm、85nm、90nm、95nm或100nm。

优选地，所述长方形片层的边长为(50-70)nm×(80-100)nm，例如可以是50nm×80nm、60nm×90nm、70nm×100nm、60nm×100nm或70nm×80nm。

所述辅助折叠DNA链根据文章“Paul W.K.Rothemund，Folding DNA to createnanoscale shapes and patterns.Nature,2006,440,297-302”进行设计，其中包括设计得到的辅助折叠链，而本领域技术人员可以根据需要挑选辅助折叠链，上述捕获链的设计可以根据需要进行增多、减少或者其他位点的变更，整个DNA折纸纳米结构的平面均可进行设计。

所述辅助折叠链举例如下：

SEQ ID NO.2:GCCAGCTGCCTGCAGGTCGACTCTGCAAGGCG.

SEQ ID NO.3:ATTAAGTTCGCATCGTAACCGTGCGAGTAACA.

SEQ ID NO.4:ACCCGTCGTCATATGTACCCCGGTAAAGGCTA.

SEQ ID NO.5:TCAGGTCACTTTTGCGGGAGAAGCAGAATTAG.

SEQ ID NO.6:CAAAATTAAAGTACGGTGTCTGGAAGAGGTCA.

SEQ ID NO.7:TTTTTGCGCAGAAAACGAGAATGAATGTTTAG.

SEQ ID NO.8:ACTGGATAACGGAACAACATTATTACCTTATG.

SEQ ID NO.9:CGATTTTAGAGGACAG ATGAACGGCGCGACCT.

SEQ ID NO.10:GCTCCATGAGAGGCTT TGAGGACTAGGGAGTT.

优选地，所述抗凝血酶核酸适配体的个数为2-3个，优选为2个。

所述抗凝血酶适配体通过与特定的捕获DNA序列进行双链杂交，自组装至DNA纳米结构表面，形成凝血酶结合位点。

优选地，所述抗凝血酶核酸适配体包括TTT-TBA15和TAT-HD22。

优选地，所述TTT-TBA15的核苷酸序列为SEQ ID NO.11，具体如下：

5’-TTTTTTTTTTTTTTTACGCGGTTGGTGTGGTTGG-3’

所述TAT-HD22的核苷酸序列为SEQ ID NO.12，具体如下：

5’-TATTATTATTATTATTTTTAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3’

本发明体系中用了两种适配体协同起效，通过精准控制两个适配体的相对位置，可以同时抑制凝血酶两个活性位点，优于单独一种适配体的结构；通过调整适配体在DNA纳米结构上分布的种类、位点数量、分布密度和相对距离，可使两种适配体共同作用，有效结合凝血酶功能位点，抑制凝血酶活性，达到抗凝的作用；这种优良抗凝的作用首先来自核酸适配体与凝血酶分子特异性结合，而通过DNA模板精准控制两个适配体的相对位置，实现同时抑制凝血酶两个活性位点，进一步增强其抗凝作用；这种抗凝作用是基于具有特定二级结构的核酸适配体与蛋白质相互作用而实现的，因此利用与核酸适配体效应序列互补的DNA序列可迅速有效的破坏核酸适配体的功能结构，通过其与DNA自组装纳米抗凝药物表面适配体杂交而快速解毒。

优选地，所述捕获DNA链包括捕获DNA链I和捕获DNA链II；

优选地，所述捕获DNA链I由在辅助折叠链的5’端加上与适配体TTT-TBA15的序列互补杂交的捕获序列I形成，所述捕获序列I的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，具体如下：AAAAAAAAAAAAAAA.

优选地，所述捕获DNA链II由在辅助折叠链的5’端加上与适配体TTT-TBA15的序列互补杂交的捕获序列II形成，所述捕获序列II的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，具体如下：ATAATAATAATAATA.

例如：捕获DNA链I：5’-AAAAAAAAAAAAAAA-辅助折叠链n-3’；捕获DNA链II：5’-ATAATAATAATAATA-辅助折叠链m-3’，即编号是n或者m的辅助折叠链经过修饰，在其5’端伸出捕获序列，用于杂交适配体TBA或HD22.

一组捕获DNA链I举例如下:

SEQ ID NO.15:

AAAAAAAAAAAAAAA GCCAGCTGCCTGCAGGTCGACTCTGCAAGGCG.

SEQ ID NO.16:

AAAAAAAAAAAAAAA ATTAAGTTCGCATCGTAACCGTGCGAGTAACA.

SEQ ID NO.17:

AAAAAAAAAAAAAAA ACCCGTCGTCATATGTACCCCGGTAAAGGCTA.

SEQ ID NO.18:

AAAAAAAAAAAAAAA TCAGGTCACTTTTGCGGGAGAAGCAGAATTAG.

SEQ ID NO.19:

AAAAAAAAAAAAAAA CAAAATTAAAGTACGGTGTCTGGAAGAGGTCA.

SEQ ID NO.20:

AAAAAAAAAAAAAAA TTTTTGCGCAGAAAACGAGAATGAATGTTTAG.

SEQ ID NO.21:

AAAAAAAAAAAAAAA ACTGGATAACGGAACAACATTATTACCTTATG.

SEQ ID NO.22:

AAAAAAAAAAAAAAACGATTTTAGAGGACAG ATGAACGGCGCGACCT.

SEQ ID NO.23:

AAAAAAAAAAAAAAAGCTCCATGAGAGGCTT TGAGGACTAGGGAGTT.

一组捕获DNA链II举例如下:

SEQ ID NO.24:ATAATAATAATAATACCCGGGTACTTTCCAGTCGGGAAACGGGCAAC.

SEQ ID NO.25:

ATAATAATAATAATA GTTTGAGGGAAAGGGGGATGTGCTAGAGGATC.

SEQ ID NO.26:

ATAATAATAATAATA AGAAAAGCAACATTAAATGTGAGCATCTGCCA.

SEQ ID NO.27:

ATAATAATAATAATA CAACGCAATTTTTGAGAGATCTACTGATAATC.

SEQ ID NO.28:

ATAATAATAATAATA TCCATATACATACAGGCAAGGCAACTTTATTT.

SEQ ID NO.29:

ATAATAATAATAATA CAAAAATCATTGCTCCTTTTGATAAGTTTCAT.

SEQ ID NO.30:

ATAATAATAATAATA AAAGATTCAGGGGGTAATAGTAAACCATAAAT.

SEQ ID NO.31:

ATAATAATAATAATA CCAGGCGCTTAATCATTGTGAATTACAGGTAG.

SEQ ID NO.32:

ATAATAATAATAATA TTTCATGAAAATTGTGTCGAAATCTGTACAGA.

根据上述设计，可控制得到每个DNA纳米颗粒表面具有捕获位点，其捕获位点的伸出的DNA序列可与抗凝血酶核酸适配体延伸序列互补，通过DNA退火杂交，将两种抗凝血酶适配体组装至DNA纳米颗粒表面。

第二方面，本发明提供一种制备如第一方面所述的DNA纳米复合结构的方法，包括如下步骤：

(1)将DNA模板、辅助折叠链和捕获DNA链按比例混合于缓冲溶液中进行退火，得到DNA折纸结构；

(2)将步骤(1)得到的产物离心后与抗凝血酶核酸适配体混合并退火；

(3)将步骤(2)得到的产物离心后得到所述的DNA纳米复合结构。

本发明利用DNA折纸技术，以长单链DNA作为模板链，在过量辅助折叠DNA短单链的协助下，利用碱基互补原则，自组装得到DNA纳米结构；并通过位点设计和序列杂交，将两种抗凝血酶适配体DNA短链组装到长方形DNA结构表面，得到纳米化的抗凝血酶适配体阵列，两种DNA适配体的在长方形DNA纳米结构上分布的位点完全可预先设计；以DNA纳米结构作为一种纳米化容器，通过其表面伸出捕获DNA链与核酸适配体延伸序列互补杂交，可有效装载抗凝核酸适配体，通过调整适配体在DNA纳米结构上分布的种类、位点数量、分布密度和相对距离，获得不同的适配体阵列，并通过这些设计来调控DNA纳米抗凝药物对于凝血酶的抑制能力；这种DNA纳米抗凝药物通过适配体的纳米化设计及位点调控，这种自组装DNA纳米药物能够有效提升抗凝血酶的活力、稳定性，实现长效抗凝，从而开发一种纳米化、可寻址、安全高效、具有较高医用价值的抗凝剂，能够有效抑制凝血酶活性，延长活化部分凝血活酶时间、凝血酶时间，并能够利用与核酸适配体效应序列互补的DNA短链使其快速解毒，有望用于多种血栓疾病治疗与预防。

优选地，步骤(1)所述退火的条件为：起点温度为95-65℃，终点温度为25-4℃，整个退火过程为2-24h，优选为7-9h；

优选地，所述起点温度为95-65℃，例如可以是95℃、93℃、91℃、90℃、87℃、85℃、83℃、81℃、80℃、77℃、75℃、73℃、71℃、69℃、67℃或65℃。

优选地，所述终点温度为25-4℃，例如可以是25℃、24℃、23℃、21℃、20℃、19℃、17℃、15℃、13℃、11℃、7℃、5℃或4℃。

优选地，所述退火过程的温度为2-24h，例如可以是2h、4h、6h、7h、8h、9h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h或24h。

优选地，步骤(1)所述退火的条件为从95℃到65℃，每5℃为一个梯度，每个梯度停留时间为5min；从65℃到25℃，每1℃为一个梯度，每个温度梯度停留时间为10min；整个退火过程为7-9h。

优选地，步骤(1)所述DNA模板、辅助折叠DNA链和捕获DNA链的摩尔量比为1:(5-20):(5-20)，例如可以是1:5:5、1:7:7、1:10:10、1:15:15，1:20:20、1:12:12或1:15:15，优选为1:(7-15):(7-15)，进一步优选为1:10:10。

优选地，步骤(1)所述缓冲液为1×TAE/Mg²⁺缓冲溶液。

优选地，步骤(2)所述退火的条件为：起点温度37-45℃，终点温度25-16℃，每5℃为一个梯度，每个梯度停留时间为5-8min；进行2-10个循环。

优选地，所述起点温度为37-45℃，例如可以是37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃或45℃。

优选地，所述终点温度为25-16℃，例如可以是25℃、24℃、23℃、22℃、21℃、20℃、19℃、18℃、17℃或16℃。

优选地，所述停留时间为5-8min，例如可以是5min、6min、7min或8min。

优选地，所述循环的个数为2-10个，例如可以是2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个。

优选地，步骤(2)所述退火的条件为：从42℃到25℃，每5℃为一个梯度，每个梯度停留时间为5min；进行6个循环。

优选地，步骤(2)所述DNA折纸结构、核酸适配体TTT-TBA15和核酸适配体TAT-HD22的摩尔量比为1:(2-15):(2-15)，例如可以是1:2:2、1:4:4、1:5:5、1:6:6、1:7:7或1:15:15，优选为1:(4-7):(4-7)。

优选地，所述离心的步骤为：将得到的退火产物与1×TAE/Mg²⁺缓冲溶液混合并加入100kDa的离心柱，进行离心。

本发明中，发明人通过大量复杂的实验摸索，优化反应条件，探究退火温度和反应时间对纳米结构的影响，各步骤各条件协同增效，最终成功制备得到性能优良的DNA纳米复合结构。

作为优选技术方案，一种制备如第一方面所述的DNA纳米复合结构的方法，具体包括如下步骤：

(1)将DNA模板、辅助折叠链和捕获DNA链按摩尔量比为1:(5-20):(5-20)的比例混合于1×TAE/Mg²⁺缓冲溶液中进行退火，退火的条件为：从95℃到65℃，每5℃为一个梯度，每个梯度停留时间为5min；从65℃到25℃，每1℃为一个梯度，每个温度梯度停留时间为10min；整个退火过程为7-9h，得到DNA折纸结构；

(2)将步骤(1)得到的产物与1×TAE/Mg²⁺缓冲溶液混合并加入100kDa的离心柱，进行离心，然后与抗凝血酶核酸适配体按摩尔量比为1:(2-15):(2-15)的比例混合并退火，退火的条件为：从42℃到25℃，每5℃为一个梯度，每个梯度停留时间为5min；进行六个循环；(3)将步骤(2)退火完成的产物与1×TAE/Mg²⁺缓冲溶液混合并按1:1加入沉淀缓冲液(15％PEG8000(w/v),5mM Tris,1mM EDTA,and 505mM NaCl)，16000g离心25min，得到第一方面所述的DNA纳米复合结构。

第三方面，本发明提供一种DNA解毒链，所述DNA解毒链为所述抗凝血适配体的互补序列，DNA解毒链的核苷酸序列如SEQ ID NO.33-34。

所述DNA解毒链用于第一方面所述抗凝血DNA纳米结构的快速逆转解毒。

为实现所述可逆的抗凝血功能，即去除DNA纳米复合结构的抗凝血功能，使用DNA解毒链与杂交了核酸适配体的DNA纳米复合结构共孵育，将核酸适配体竞争下来，破坏其单链特定结构域；所述DNA解毒链将与竞争脱落的核酸适配体形成双链结构，破坏其与凝血酶特异识别结合的结构域，从而逆转整个DNA纳米复合结构的抗凝能力。

SEQ ID NO.33具体如下：

5’-CCAACCACACCAACCGCGTAAAAAAAAAAAAAAA-3’；

SEQ ID NO.34具体如下：

5’-AGTCACCCCAACCTGCCCTACCACGGACTAAAAATAATAATAATAATA-3’.

本发明具有抗凝作用的DNA纳米复合结构，其对于凝血酶活性的抑制能力能够通过加入DNA解毒链而进行逆转，加入的DNA解毒链核酸序列与前述两种核酸适配体互补；解毒就是用互补序列去抑制掉适配体的功能，这个完全依赖于DNA互补杂交，响应快，特异性好，生物安全性好，常见的抗凝方法很难做到这一点。

第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的DNA纳米复合结构用于制备抗凝剂的用途，所述抗凝的效应并不限于单一血栓疾病，其抗凝类型具有广谱性，用于多种血栓疾病治疗与预防，例如静脉血栓、动脉栓塞、动脉粥样硬化等心血管疾病。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的DNA纳米复合结构通过采用DNA折纸技术将模板、捕获DNA链和辅助折叠链自组装形成，所有的辅助折叠链均为预先设计，因此整个结构是完全可寻址的，能够实现核酸适配体这种目标分子的定位组装；通过位点设计实现核酸适配体的种类、位点数量、分布密度和相对距离的精密控制，使得每个凝血酶捕获位置均具有两个不同的核酸适配体分别与其两个结合位点识别，两种核酸适配体得以协同起效，更加有效的抑制凝血酶活性，且能够利用与适配体互补的解毒序列进行逆转解毒；DNA纳米结构具有尺寸可控、易于修饰、生物相容性好、稳定性高等优点，固定化核酸适配体后可有效提升适配体稳定性并实现活体内长循环，具有良好的药物开发潜力。

附图说明

图1为本发明提供的长方形DNA纳米复合结构的抗凝剂设计图，图1(A)为两种核酸适配体在长方形DNA折纸结构上的分布示意图，图1(B)为修饰了核酸适配体的长方形DNA折纸对于凝血酶的捕获示意图；

图2为本发明提供的长方形DNA纳米复合结构图，比例尺为100nm；

图3为DNA纳米复合结构作为抗凝剂捕获凝血酶后的原子力显微镜形貌观察图，比例尺为100nm；

图4为本发明提供的DNA纳米抗凝剂对于纤维蛋白原形成纤维蛋白反应试剂的抑制及解毒效果图；

图5(A)为本发明提供的DNA纳米抗凝剂与游离核酸适配体经尾静脉注射在小鼠体内后0.25h的活体成像图；

图5(B)为本发明提供的DNA纳米抗凝剂与游离核酸适配体经尾静脉注射在小鼠体内后1h的活体成像图；

图5(C)为本发明提供的DNA纳米抗凝剂与游离核酸适配体经尾静脉注射在小鼠体内后2h的活体成像图；

图5(D)为本发明提供的DNA纳米抗凝剂与游离核酸适配体经尾静脉注射在小鼠体内后4h的活体成像图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。下述实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

技术方案简述如下：

本发明利用DNA折纸技术，将模板链(M13mp18基因组DNA)与预先设计的辅助折叠链及捕获链混合，通过退火杂交获得长方形DNA折纸纳米结构，在预先设计的位置伸出捕获DNA链

(捕获DNA链I：5’-AAAAAAAAAAAAAAA-辅助折叠链n-3’；捕获DNA链II：5’-ATAATAATAATAATA-辅助折叠链m-3’.)，即编号是n或者m的辅助折叠链经过修饰，在其5’端伸出捕获序列，用于杂交适配体TBA或HD22.

将具有延伸链的两种核酸适配体TTT-TBA15(SEQ ID NO.11

5’-TTTTTTTTTTTTTTTACGCGGTTGGTGTGGTTGG-3’)和

TAT-HD22(SEQ ID NO.12

5’-TATTATTATTATTATTTTTAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3’)与上述带有捕获DNA链的长方形DNA纳米结构互补杂交，使得两种核酸适配体在DNA纳米结构表面固定，形成核酸适配体阵列，其种类、位点数量、分布密度和相对距离可通过捕获DNA链的设计从而进行调整；利用原子力显微镜观测上述负载核酸适配体阵列的DNA纳米结构的形貌和并评价其吸附捕获凝血酶的能力；抽取小鼠及人静脉血，利用该纳米化的DNA抗凝剂与血液样本共孵育，检测纳米抗凝剂对于凝血酶活力的抑制情况，评价纳米药物新剂型的抗凝作用。

加入的特定解毒核酸序列与DNA折纸结构上前述两种核酸适配体分别互补，这种新型纳米抗凝剂对于凝血酶活性的抑制能力能够被逆转。

解毒序列I的核苷酸序列为SEQ ID NO.33：

5‘-CCAACCACACCAACCGCGTAAAAAAAAAAAAAAA-3’，

解毒序列II的核苷酸序列为SEQ ID NO.34：5‘-AGTCACCCCAACCTGCCCTACCACGGACTAAAAATAATAATAATAATA-3’.

本发明所用仪器和材料如下：

器材：Mastercycler Pro梯度PCR仪(Eppendorf，德国)，5810R小型高速离心机(Eppendorf，德国)，UV-2450紫外-可见分光光度计(岛津，日本)，全波长酶标仪(TECAN，瑞士)，全自动血凝分析仪(Sysmex5100)，小动物活体荧光成像系统(Spectrum BL)。原料：短链核苷酸序列(核酸适配体，辅助折叠链等)购自生工生物工程(上海)有限公司，M13mp18基因组DNA购自New England Biolabs公司。

试剂：实验中所用的缓冲溶液有TAE/Mg²⁺缓冲溶液(pH 8.0)和PBS缓冲溶液(pH7.4)；其中，1×TAE/Mg²⁺缓冲溶液(pH 8.0)的组分为：4×10^-2moL L^-1Tris，2×10^-2moL L^-1乙酸，2.0×10^-3moL L^-1EDTA和1.25×10^-2moL L^-1醋酸镁；1×PBS缓冲溶液(pH 7.4)的组成为：136.9×10^-3moL L^-1(8.00g L-1)NaCl，2.68×10^-3moL L-1(0.20g L^-1)KCl，9.75×10^- ³moL L^-1(1.56g L-1)Na₂HPO₄·H₂O和1.47×10^-3moL L^-1(0.20g L^-1)KH₂PO₄；这些缓冲溶液所用的试剂均为分析纯，购自Sigma-Aldrich公司。

实施例1带有捕获位点的DNA折纸纳米结构的制备及纯化

首先将模板链和辅助折叠序列、捕获DNA链按照1:10:10的比例进行混合，与核酸适配体TBA杂交的捕获链共设计18条(图1-A深色实线)，与核酸适配体HD22杂交的捕获链共设计18条(图1-A浅色虚线)，共形成18对结合凝血酶的位点(图1-B)；

所述捕获DNA链举例如下：

捕获DNA链I

SEQ ID NO.15:

AAAAAAAAAAAAAAA GCCAGCTGCCTGCAGGTCGACTCTGCAAGGCG.

SEQ ID NO.16:

AAAAAAAAAAAAAAA ATTAAGTTCGCATCGTAACCGTGCGAGTAACA.

SEQ ID NO.17:

AAAAAAAAAAAAAAA ACCCGTCGTCATATGTACCCCGGTAAAGGCTA.

SEQ ID NO.18:

AAAAAAAAAAAAAAA TCAGGTCACTTTTGCGGGAGAAGCAGAATTAG.

SEQ ID NO.19:

AAAAAAAAAAAAAAA CAAAATTAAAGTACGGTGTCTGGAAGAGGTCA.

SEQ ID NO.20:

AAAAAAAAAAAAAAA TTTTTGCGCAGAAAACGAGAATGAATGTTTAG.

SEQ ID NO.21:

AAAAAAAAAAAAAAA ACTGGATAACGGAACAACATTATTACCTTATG.

SEQ ID NO.22:

AAAAAAAAAAAAAAA CGATTTTAGAGGACAG ATGAACGGCGCGACCT.

SEQ ID NO.23:

AAAAAAAAAAAAAAA GCTCCATGAGAGGCTT TGAGGACTAGGGAGTT.

一组捕获DNA链II举例如下:

SEQ ID NO.24:

ATAATAATAATAATACCCGGGTACTTTCCAGTCGGGAAACGGGCAAC.

SEQ ID NO.25:

ATAATAATAATAATA GTTTGAGGGAAAGGGGGATGTGCTAGAGGATC.

SEQ ID NO.26:

ATAATAATAATAATA AGAAAAGCAACATTAAATGTGAGCATCTGCCA.

SEQ ID NO.27:

ATAATAATAATAATA CAACGCAATTTTTGAGAGATCTACTGATAATC.

SEQ ID NO.28:

ATAATAATAATAATA TCCATATACATACAGGCAAGGCAACTTTATTT.

SEQ ID NO.29:

ATAATAATAATAATA CAAAAATCATTGCTCCTTTTGATAAGTTTCAT.

SEQ ID NO.30:

ATAATAATAATAATA AAAGATTCAGGGGGTAATAGTAAACCATAAAT.

SEQ ID NO.31:

ATAATAATAATAATA CCAGGCGCTTAATCATTGTGAATTACAGGTAG.

SEQ ID NO.32:

ATAATAATAATAATA TTTCATGAAAATTGTGTCGAAATCTGTACAGA.

上述捕获链的设计可以根据需要进行增多、减少或者其他位点的变更，整个DNA折纸纳米结构的平面均可进行设计。

在1×TAE/Mg²⁺缓冲溶液(pH 8.0)条件下进行退火；退火条件为：从95℃到65℃，每5℃为一个梯度，每个梯度停留时间为5min；从65℃到25℃，每1℃为一个梯度，每个温度梯度停留时间为10min；整个退火过程约为8h；退火完成后，将DNA折纸结构样品加入离心柱(100kDa)，加入1×TAE/Mg²⁺缓冲溶液(pH 8.0)离心除去过量短链DNA。

实施例2组装核酸适配体的DNA纳米阵列的制备及纯化

依照实施例1所设计和制备的的DNA折纸结构与核酸适配体进行混合(位点：核酸适配体TBA：核酸适配体HD22＝1:5:5)，在1×TAE/Mg²⁺缓冲溶液(pH8.0)条件下进行退火；退火条件：从42℃到25℃，每5℃为一个梯度，每个梯度停留时间为5min；进行六个循环；退火完成后，将载有核酸适配体的DNA折纸结构样品按体积1:1加入沉淀缓冲液(含有15％PEG8000(w/v),5mM Tris,1mM EDTA,and 505mM NaCl)。离心16000g，25min，即得到DNA纳米抗凝剂。

实施例3负载核酸适配体的DNA纳米阵列的对凝血酶的捕获

依照实施例2所构建的载有核酸适配体的DNA纳米结构与凝血酶进行混合，核酸适配体TBA:核酸适配体HD22:凝血酶＝1:1:5，室温放置30min；利用原子力显微镜评价负载核酸适配体的DNA结构和捕获凝血酶能力，结果如图2和图3所示；

由图2和图3可知，杂交两种适配体后，DNA纳米结构尺寸和高度没有非常明显的改变，仍为90×60nm的长方形片层，与凝血酶共孵育后，则可见长方形片层一侧高度明显增加，即凝血酶被带有适配体的结构捕获，捕获位置与预先设计的适配体位置相符合。

实施例4DNA纳米抗凝剂对于人血浆中凝血酶活力的抑制作用评价

利用北京积水潭医院检验科获得的健康捐赠者血浆及全自动血凝分析仪(Sysmex5100)对依照实施例2得到的DNA纳米抗凝剂进行评价；取新鲜人血浆(135μL)加入DNA纳米抗凝剂(15μL，使DNA纳米抗凝剂终浓度分别为0.0028、0.0139、0.056μM，即核酸适配体终浓度分别为0.1、0.5、2μM)；利用凝血酶仪评价凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血酶时间(aPTT)，以低分子量肝素作为对照(终浓度分别为0.1、0.5、2U/mL)，结果如表1所示；

表1

根据表1数据可知，带有两种核酸适配体的DNA折纸纳米结构能够有效延长凝血酶原时间和活化部分凝血酶时间，与肝素组效果类似，表明凝血酶的活力受到该纳米结构的有效抑制。

实施例5解毒剂对DNA纳米抗凝剂的解毒作用的评价

使用依照实施例2得到的纳米抗凝剂进行解毒的评价：将90μL DNA纳米抗凝剂与凝血酶的混合溶液(核酸适配体TBA:核酸适配体HD22:凝血酶＝25:25:1)平衡到25℃，加入5μL解毒剂(TTT-TBA15和TAT-HD22互补DNA序列)，放置10min，加入5μL凝血酶底物纤维蛋白原(纤维蛋白原的终浓度为0.5mg/ml)，起始催化反应；利用荧光光谱仪和凝血酶底物纤维蛋白原对解毒剂解毒效果进行评价，通过观测650的散射光强变化评价凝血活性及解毒剂效果，结果如图4所示；

由图4可知，当仅有凝血酶与底物相互作用时，纤维蛋白原迅速转变为纤维蛋白，散射光强度迅速提升；当体系中加入纳米抗凝剂时，凝血酶活力受到抑制，散射光强度增幅明显减缓；当混合物中具有解毒剂时(解毒剂与抗凝剂比例为1:1或2:1)，与仅血浆组类似，纤维蛋白原迅速转变为纤维蛋白，散射光强度迅速提升，显示其对于凝血酶活力的抑制快速解除。

实施例6DNA纳米抗凝剂的长循环作用的评价

使用Cy5.5荧光标记的DNA适配体进行杂交，组装制备荧光标记的纳米抗凝剂。将荧光标记的纳米抗凝剂(纳米抗凝剂18nM，含两种核酸适配体各648nM)和游离的DNA适配体混合液(等量游离核酸适配体各648nM)对健康小鼠进行尾静脉注射，利用小动物活体荧光成像系统(Spectrum BL)在注射后0.25h，1h，2h，4h分别进行小动物活体成像，观测DNA纳米抗凝剂及游离核酸适配体在活体内的分布，结果如图5(A)-图5(D)所示；

由图5(A)-图5(D)可知，游离核酸适配体经由肾脏很快被代谢；而DNA纳米抗凝剂则有效的延长了其在活体内存留时间。

综上所述，本发明提供的由DNA模板链、辅助折叠DNA链和捕获DNA链组装而成的纳米结构，巧妙地通过设计捕获DNA链来整合抗凝血酶核酸适配体，通过DNA杂交，实现抗凝血酶核酸适配体在DNA自组装纳米结构表面的精确定位，并通过调整适配体在DNA纳米结构上分布的种类、位点数量、分布密度和相对距离，形成核酸适配体阵列，有效结合凝血酶功能位点，抑制凝血酶活性，达到抗凝的作用并能够可逆响应快速解毒，有望提供一种高效安全的新型抗凝药剂用于多种血栓疾病治疗与预防，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 国家纳米科学中心

<120> 一种抗凝血的DNA纳米复合结构及其制备方法和应用

<130> 2018年

<160> 34

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 7249

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

aatgctacta ctattagtag aattgatgcc accttttcag ctcgcgcccc aaatgaaaat 60

atagctaaac aggttattga ccatttgcga aatgtatcta atggtcaaac taaatctact 120

cgttcgcaga attgggaatc aactgttata tggaatgaaa cttccagaca ccgtacttta 180

gttgcatatt taaaacatgt tgagctacag cattatattc agcaattaag ctctaagcca 240

tccgcaaaaa tgacctctta tcaaaaggag caattaaagg tactctctaa tcctgacctg 300

ttggagtttg cttccggtct ggttcgcttt gaagctcgaa ttaaaacgcg atatttgaag 360

tctttcgggc ttcctcttaa tctttttgat gcaatccgct ttgcttctga ctataatagt 420

cagggtaaag acctgatttt tgatttatgg tcattctcgt tttctgaact gtttaaagca 480

tttgaggggg attcaatgaa tatttatgac gattccgcag tattggacgc tatccagtct 540

aaacatttta ctattacccc ctctggcaaa acttcttttg caaaagcctc tcgctatttt 600

ggtttttatc gtcgtctggt aaacgagggt tatgatagtg ttgctcttac tatgcctcgt 660

aattcctttt ggcgttatgt atctgcatta gttgaatgtg gtattcctaa atctcaactg 720

atgaatcttt ctacctgtaa taatgttgtt ccgttagttc gttttattaa cgtagatttt 780

tcttcccaac gtcctgactg gtataatgag ccagttctta aaatcgcata aggtaattca 840

caatgattaa agttgaaatt aaaccatctc aagcccaatt tactactcgt tctggtgttt 900

ctcgtcaggg caagccttat tcactgaatg agcagctttg ttacgttgat ttgggtaatg 960

aatatccggt tcttgtcaag attactcttg atgaaggtca gccagcctat gcgcctggtc 1020

tgtacaccgt tcatctgtcc tctttcaaag ttggtcagtt cggttccctt atgattgacc 1080

gtctgcgcct cgttccggct aagtaacatg gagcaggtcg cggatttcga cacaatttat 1140

caggcgatga tacaaatctc cgttgtactt tgtttcgcgc ttggtataat cgctgggggt 1200

caaagatgag tgttttagtg tattcttttg cctctttcgt tttaggttgg tgccttcgta 1260

gtggcattac gtattttacc cgtttaatgg aaacttcctc atgaaaaagt ctttagtcct 1320

caaagcctct gtagccgttg ctaccctcgt tccgatgctg tctttcgctg ctgagggtga 1380

cgatcccgca aaagcggcct ttaactccct gcaagcctca gcgaccgaat atatcggtta 1440

tgcgtgggcg atggttgttg tcattgtcgg cgcaactatc ggtatcaagc tgtttaagaa 1500

attcacctcg aaagcaagct gataaaccga tacaattaaa ggctcctttt ggagcctttt 1560

ttttggagat tttcaacgtg aaaaaattat tattcgcaat tcctttagtt gttcctttct 1620

attctcactc cgctgaaact gttgaaagtt gtttagcaaa atcccataca gaaaattcat 1680

ttactaacgt ctggaaagac gacaaaactt tagatcgtta cgctaactat gagggctgtc 1740

tgtggaatgc tacaggcgtt gtagtttgta ctggtgacga aactcagtgt tacggtacat 1800

gggttcctat tgggcttgct atccctgaaa atgagggtgg tggctctgag ggtggcggtt 1860

ctgagggtgg cggttctgag ggtggcggta ctaaacctcc tgagtacggt gatacaccta 1920

ttccgggcta tacttatatc aaccctctcg acggcactta tccgcctggt actgagcaaa 1980

accccgctaa tcctaatcct tctcttgagg agtctcagcc tcttaatact ttcatgtttc 2040

agaataatag gttccgaaat aggcaggggg cattaactgt ttatacgggc actgttactc 2100

aaggcactga ccccgttaaa acttattacc agtacactcc tgtatcatca aaagccatgt 2160

atgacgctta ctggaacggt aaattcagag actgcgcttt ccattctggc tttaatgagg 2220

atttatttgt ttgtgaatat caaggccaat cgtctgacct gcctcaacct cctgtcaatg 2280

ctggcggcgg ctctggtggt ggttctggtg gcggctctga gggtggtggc tctgagggtg 2340

gcggttctga gggtggcggc tctgagggag gcggttccgg tggtggctct ggttccggtg 2400

attttgatta tgaaaagatg gcaaacgcta ataagggggc tatgaccgaa aatgccgatg 2460

aaaacgcgct acagtctgac gctaaaggca aacttgattc tgtcgctact gattacggtg 2520

ctgctatcga tggtttcatt ggtgacgttt ccggccttgc taatggtaat ggtgctactg 2580

gtgattttgc tggctctaat tcccaaatgg ctcaagtcgg tgacggtgat aattcacctt 2640

taatgaataa tttccgtcaa tatttacctt ccctccctca atcggttgaa tgtcgccctt 2700

ttgtctttgg cgctggtaaa ccatatgaat tttctattga ttgtgacaaa ataaacttat 2760

tccgtggtgt ctttgcgttt cttttatatg ttgccacctt tatgtatgta ttttctacgt 2820

ttgctaacat actgcgtaat aaggagtctt aatcatgcca gttcttttgg gtattccgtt 2880

attattgcgt ttcctcggtt tccttctggt aactttgttc ggctatctgc ttacttttct 2940

taaaaagggc ttcggtaaga tagctattgc tatttcattg tttcttgctc ttattattgg 3000

gcttaactca attcttgtgg gttatctctc tgatattagc gctcaattac cctctgactt 3060

tgttcagggt gttcagttaa ttctcccgtc taatgcgctt ccctgttttt atgttattct 3120

ctctgtaaag gctgctattt tcatttttga cgttaaacaa aaaatcgttt cttatttgga 3180

ttgggataaa taatatggct gtttattttg taactggcaa attaggctct ggaaagacgc 3240

tcgttagcgt tggtaagatt caggataaaa ttgtagctgg gtgcaaaata gcaactaatc 3300

ttgatttaag gcttcaaaac ctcccgcaag tcgggaggtt cgctaaaacg cctcgcgttc 3360

ttagaatacc ggataagcct tctatatctg atttgcttgc tattgggcgc ggtaatgatt 3420

cctacgatga aaataaaaac ggcttgcttg ttctcgatga gtgcggtact tggtttaata 3480

cccgttcttg gaatgataag gaaagacagc cgattattga ttggtttcta catgctcgta 3540

aattaggatg ggatattatt tttcttgttc aggacttatc tattgttgat aaacaggcgc 3600

gttctgcatt agctgaacat gttgtttatt gtcgtcgtct ggacagaatt actttacctt 3660

ttgtcggtac tttatattct cttattactg gctcgaaaat gcctctgcct aaattacatg 3720

ttggcgttgt taaatatggc gattctcaat taagccctac tgttgagcgt tggctttata 3780

ctggtaagaa tttgtataac gcatatgata ctaaacaggc tttttctagt aattatgatt 3840

ccggtgttta ttcttattta acgccttatt tatcacacgg tcggtatttc aaaccattaa 3900

atttaggtca gaagatgaaa ttaactaaaa tatatttgaa aaagttttct cgcgttcttt 3960

gtcttgcgat tggatttgca tcagcattta catatagtta tataacccaa cctaagccgg 4020

aggttaaaaa ggtagtctct cagacctatg attttgataa attcactatt gactcttctc 4080

agcgtcttaa tctaagctat cgctatgttt tcaaggattc taagggaaaa ttaattaata 4140

gcgacgattt acagaagcaa ggttattcac tcacatatat tgatttatgt actgtttcca 4200

ttaaaaaagg taattcaaat gaaattgtta aatgtaatta attttgtttt cttgatgttt 4260

gtttcatcat cttcttttgc tcaggtaatt gaaatgaata attcgcctct gcgcgatttt 4320

gtaacttggt attcaaagca atcaggcgaa tccgttattg tttctcccga tgtaaaaggt 4380

actgttactg tatattcatc tgacgttaaa cctgaaaatc tacgcaattt ctttatttct 4440

gttttacgtg caaataattt tgatatggta ggttctaacc cttccattat tcagaagtat 4500

aatccaaaca atcaggatta tattgatgaa ttgccatcat ctgataatca ggaatatgat 4560

gataattccg ctccttctgg tggtttcttt gttccgcaaa atgataatgt tactcaaact 4620

tttaaaatta ataacgttcg ggcaaaggat ttaatacgag ttgtcgaatt gtttgtaaag 4680

tctaatactt ctaaatcctc aaatgtatta tctattgacg gctctaatct attagttgtt 4740

agtgctccta aagatatttt agataacctt cctcaattcc tttcaactgt tgatttgcca 4800

actgaccaga tattgattga gggtttgata tttgaggttc agcaaggtga tgctttagat 4860

ttttcatttg ctgctggctc tcagcgtggc actgttgcag gcggtgttaa tactgaccgc 4920

ctcacctctg ttttatcttc tgctggtggt tcgttcggta tttttaatgg cgatgtttta 4980

gggctatcag ttcgcgcatt aaagactaat agccattcaa aaatattgtc tgtgccacgt 5040

attcttacgc tttcaggtca gaagggttct atctctgttg gccagaatgt cccttttatt 5100

actggtcgtg tgactggtga atctgccaat gtaaataatc catttcagac gattgagcgt 5160

caaaatgtag gtatttccat gagcgttttt cctgttgcaa tggctggcgg taatattgtt 5220

ctggatatta ccagcaaggc cgatagtttg agttcttcta ctcaggcaag tgatgttatt 5280

actaatcaaa gaagtattgc tacaacggtt aatttgcgtg atggacagac tcttttactc 5340

ggtggcctca ctgattataa aaacacttct caggattctg gcgtaccgtt cctgtctaaa 5400

atccctttaa tcggcctcct gtttagctcc cgctctgatt ctaacgagga aagcacgtta 5460

tacgtgctcg tcaaagcaac catagtacgc gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg 5520

tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt 5580

cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg 5640

ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga 5700

tttgggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc gccctttgac 5760

gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc 5820

tatctcgggc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggaac caccatcaaa 5880

caggattttc gcctgctggg gcaaaccagc gtggaccgct tgctgcaact ctctcagggc 5940

caggcggtga agggcaatca gctgttgccc gtctcactgg tgaaaagaaa aaccaccctg 6000

gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 6060

cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 6120

cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat 6180

tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg aattcgagct 6240

cggtacccgg ggatcctcta gagtcgacct gcaggcatgc aagcttggca ctggccgtcg 6300

ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac 6360

atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac 6420

agttgcgcag cctgaatggc gaatggcgct ttgcctggtt tccggcacca gaagcggtgc 6480

cggaaagctg gctggagtgc gatcttcctg aggccgatac tgtcgtcgtc ccctcaaact 6540

ggcagatgca cggttacgat gcgcccatct acaccaacgt gacctatccc attacggtca 6600

atccgccgtt tgttcccacg gagaatccga cgggttgtta ctcgctcaca tttaatgttg 6660

atgaaagctg gctacaggaa ggccagacgc gaattatttt tgatggcgtt cctattggtt 6720

aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa tgcgaatttt aacaaaatat taacgtttac 6780

aatttaaata tttgcttata caatcttcct gtttttgggg cttttctgat tatcaaccgg 6840

ggtacatatg attgacatgc tagttttacg attaccgttc atcgattctc ttgtttgctc 6900

cagactctca ggcaatgacc tgatagcctt tgtagatctc tcaaaaatag ctaccctctc 6960

cggcattaat ttatcagcta gaacggttga atatcatatt gatggtgatt tgactgtctc 7020

cggcctttct cacccttttg aatctttacc tacacattac tcaggcattg catttaaaat 7080

atatgagggt tctaaaaatt tttatccttg cgttgaaata aaggcttctc ccgcaaaagt 7140

attacagggt cataatgttt ttggtacaac cgatttagct ttatgctctg aggctttatt 7200

gcttaatttt gctaattctt tgccttgcct gtatgattta ttggatgtt 7249

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gccagctgcc tgcaggtcga ctctgcaagg cg 32

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

attaagttcg catcgtaacc gtgcgagtaa ca 32

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

acccgtcgtc atatgtaccc cggtaaaggc ta 32

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

tcaggtcact tttgcgggag aagcagaatt ag 32

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

caaaattaaa gtacggtgtc tggaagaggt ca 32

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

tttttgcgca gaaaacgaga atgaatgttt ag 32

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

actggataac ggaacaacat tattacctta tg 32

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

cgattttaga ggacagatga acggcgcgac ct 32

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

gctccatgag aggctttgag gactagggag tt 32

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

tttttttttt tttttacgcg gttggtgtgg ttgg 34

<210> 12

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

tattattatt attattttta gtccgtggta gggcaggttg gggtgact 48

<210> 13

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

aaaaaaaaaa aaaaa 15

<210> 14

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

ataataataa taata 15

<210> 15

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

aaaaaaaaaa aaaaagccag ctgcctgcag gtcgactctg caaggcg 47

<210> 16

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

aaaaaaaaaa aaaaaattaa gttcgcatcg taaccgtgcg agtaaca 47

<210> 17

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

aaaaaaaaaa aaaaaacccg tcgtcatatg taccccggta aaggcta 47

<210> 18

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

aaaaaaaaaa aaaaatcagg tcacttttgc gggagaagca gaattag 47

<210> 19

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

aaaaaaaaaa aaaaacaaaa ttaaagtacg gtgtctggaa gaggtca 47

<210> 20

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

aaaaaaaaaa aaaaattttt gcgcagaaaa cgagaatgaa tgtttag 47

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<211> 47

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 21

aaaaaaaaaa aaaaaactgg ataacggaac aacattatta ccttatg 47

<210> 22

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 22

aaaaaaaaaa aaaaacgatt ttagaggaca gatgaacggc gcgacct 47

<210> 23

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 23

aaaaaaaaaa aaaaagctcc atgagaggct ttgaggacta gggagtt 47

<210> 24

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 24

ataataataa taatacccgg gtactttcca gtcgggaaac gggcaac 47

<210> 25

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 25

ataataataa taatagtttg agggaaaggg ggatgtgcta gaggatc 47

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<211> 47

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 26

ataataataa taataagaaa agcaacatta aatgtgagca tctgcca 47

<210> 27

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 27

ataataataa taatacaacg caatttttga gagatctact gataatc 47

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<211> 47

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 28

ataataataa taatatccat atacatacag gcaaggcaac tttattt 47

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<211> 47

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 29

ataataataa taatacaaaa atcattgctc cttttgataa gtttcat 47

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 30

ataataataa taataaaaga ttcagggggt aatagtaaac cataaat 47

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<212> DNA

<213> 人工合成

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ataataataa taataccagg cgcttaatca ttgtgaatta caggtag 47

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 32

ataataataa taatatttca tgaaaattgt gtcgaaatct gtacaga 47

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<212> DNA

<213> 人工合成

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ccaaccacac caaccgcgta aaaaaaaaaa aaaa 34

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 34

agtcacccca acctgcccta ccacggacta aaaataataa taataata 48

Claims

1.一种抗凝血的DNA纳米复合结构，其特征在于，所述DNA纳米复合结构包括DNA纳米结构和抗凝血酶核酸适配体；

所述抗凝血酶核酸适配体通过与捕获DNA链杂交结合在DNA纳米结构的表面，所述结合能被与核酸适配体互补的解毒序列竞争破坏，逆转DNA纳米复合结构的抗凝血功能。

2.根据权利要求1所述的DNA纳米复合结构，其特征在于，所述DNA模板链包括M13mp18噬菌体基因组环状单链DNA、Lamda DNA、经过基因改造过的M13噬菌体基因组DNA或非对称PCR扩增产物中的任意一种或至少两种的组合，优选为M13mp18噬菌体基因组环状单链DNA；

3.根据权利要求1或2所述的DNA纳米复合结构，其特征在于，所述DNA纳米复合结构的形状包括长方形片层、三角形片层、管状、盒状或球形中的任意一种，优选为三角形片层和/或长方形片层；

优选地，所述三角形片层为等边三角形，其边长为80-100nm；

优选地，所述长方形片层的边长为(50-70)nm×(80-100)nm。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的DNA纳米复合结构，其特征在于，所述抗凝血适配体的个数为2-3个，优选为2个；

优选地，所述抗凝血酶核酸适配体包括TTT-TBA15和TAT-HD22；

优选地，所述TTT-TBA15的核苷酸序列为SEQ ID NO.11，所述TAT-HD22的核苷酸序列为SEQ ID NO.12。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的DNA纳米复合结构，其特征在于，所述捕获DNA链包括捕获DNA链I和捕获DNA链II；

优选地，所述捕获DNA链I由在辅助折叠链的5’端加上与适配体TTT-TBA15的序列部分互补杂交的捕获序列I形成，所述捕获序列I的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；

优选地，所述捕获DNA链II由在辅助折叠链的5’端加上与适配体TAT-HD22的序列部分互补杂交的捕获序列II形成，所述捕获序列II的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

6.一种制备如权利要求1-5中任一项所述的DNA纳米复合结构的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(3)将步骤(2)得到的产物离心后得到所述DNA纳米复合结构。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述退火的条件为：起点温度为95℃-65℃，终点温度为25℃-4℃，；整个退火过程为2-24h，优选为7-9h；

优选地，步骤(1)所述DNA模板、辅助折叠DNA链和捕获DNA链的摩尔量比为1:(5-20):(5-20)，优选为1:(7-15):(7-15)；

优选地，步骤(1)所述缓冲液为1×TAE/Mg²⁺缓冲溶液；

优选地，步骤(2)所述退火的条件为：起点温度37-45℃，终点温度25-16℃，每5℃为一个梯度，每个梯度停留时间为5-8min；进行2-10个循环；

优选地，步骤(2)所述DNA折纸结构、核酸适配体TTT-TBA15和核酸适配体TAT-HD22的摩尔量比为1:(2-15):(2-15)；

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)将DNA模板、辅助折叠序列和捕获DNA链按摩尔量比为1:(5-20):(5-20)的比例混合于1×TAE/Mg²⁺缓冲溶液中进行退火，退火的条件为：从95℃到65℃，每5℃为一个梯度，每个梯度停留时间为5min；从65℃到25℃，每1℃为一个梯度，每个温度梯度停留时间为10min；整个退火过程为7-9h，得到DNA折纸结构；

(2)将步骤(1)得到的产物与1×TAE/Mg²⁺缓冲溶液混合并加入100kDa的离心柱，进行离心，然后与抗凝血酶核酸适配体按摩尔量比为1:(2-15):(2-15)的比例混合并退火，退火的条件为：从42℃到25℃，每5℃为一个梯度，每个梯度停留时间为5min；进行六个循环；

(3)将步骤(2)得到的产物与1×TAE/Mg²⁺缓冲溶液混合并加入100kDa的离心柱，进行离心，得到所述的DNA纳米复合结构。

9.一种DNA解毒链，其特征在于，所述DNA解毒链为抗凝血适配体的互补序列，所述DNA解毒链的核苷酸序列如SEQ ID NO.33-34所示。

10.一种如权利要求1-5中任一项所述的DNA纳米复合结构用于制备抗凝剂的用途。