CN109477096B - Dna折纸单元分步组装法 - Google Patents
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Abstract
一种将核酸折纸单元分步组装核酸纳米结构的方法，包括如下步骤：1）根据预构成的核酸纳米结构制备用于如下步骤2)和步骤3）中的第1步目标核酸折纸单元组至第m步目标核酸折纸单元组，m为大于等于2的整数；2）将步骤1）得到的每步目标核酸折纸单元组按照顺序分步连接固定在连接有连接链的固定相上，得到连接有连接链的核酸纳米结构；3）向步骤2）得到的连接有连接链的核酸纳米结构中添加与所述连接链完全互补的分离链进行分离反应，得到核酸纳米结构。本方法实现了更多结构单体的成功组装，显示出了这一新方法的高自组装效率。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及DNA纳米技术领域的核酸结构及其合成方法，尤其涉及DNA折纸单元分步组装法。
背景技术
上世纪八十年代，Seeman首次提出利用DNA碱基互补配对的原则可将DNA组装成复杂的空间结构，开创了利用DNA作为纳米级构筑材料而非遗传信息载体的新领域，并将其命名为DNA纳米技术。随后，研究人员通过构造不同基元模块，如DX(double-crossover)、TX(triple-crossover)模块、十字模块和对称模块，并用模块组装得到各式各样的图形结构(二维阵列，方形网格等)，但模块法组装是借助于小结构单元的碱基互补配对连接成较大的图形结构，其尺寸和形状难以精确控制。
2006年，Rothemund提出了一个全新的名词：“DNA折纸术”(DNA origami)，将一条基因组DNA长链(M13mp18)与数百条短链DNA混合，通过在特定位置的碱基互补配对进行折叠连接，得到了三角形、五角星、笑脸等宛如折纸作品一般令人惊叹的复杂二维结构，比通过模块DNA自组装方法得到的结构更为精密，堪称DNA纳米技术一次里程碑式的突破。
为了实现更大可控结构的形成，研究者将DNA结构单体组装起来。传统的方法是一步反应法(one-pot)，将设计、形成好的结构单体一同加入反应体系，一步得到目的结构。然而，一步法意味着要求每一块结构单体连接处的特异性，否则会出现错配等情况，不能得到设计结构。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种将核酸折纸单元分步组装核酸纳米结构的方法。
本发明提供一种将核酸折纸单元分步组装核酸纳米结构的方法，包括如下步骤：
1)根据预构成的核酸纳米结构制备用于如下步骤2)和步骤3)中的第1步目标核酸折纸单元组至第m步目标核酸折纸单元组，m为大于等于2的整数；
每步目标核酸折纸单元组由1个或多个目标核酸折纸单元组成；
所述每步目标核酸折纸单元组中的每个目标核酸折纸单元的两端均带有粘性末端，且所述每步目标核酸折纸单元组中的每个目标核酸折纸单元的粘性末端均不互补；
所述每步目标核酸折纸单元组中的每个目标核酸折纸单元一端的粘性末端与下一步目标核酸折纸单元组中的对应的目标核酸折纸单元对应端的粘性末端互补；另一端的粘性末端与上一步目标核酸折纸单元组中的对应的目标核酸折纸单元对应端的粘性末端互补；
2)将步骤1)得到的每步目标核酸折纸单元组分步连接固定在连接有连接链的固定相上，得到连接有连接链的核酸纳米结构；
所述分步连接固定包括如下步骤：
A、将所述第一步目标核酸折纸单元组加入含有连接有连接链的固定相的体系中，连接固定反应，得到含有第1连接产物体系；
所述含有连接有连接链的固定相的体系由连接有连接链的固定相和自组装反应缓冲液组成；
B、将第2步目标核酸折纸单元组加入含有第1连接产物体系中，连接固定反应，得到含有第2连接产物体系；
依次类推；
C、将所述第m步连接的目标核酸折纸单元组加入含有第m-1连接产物体系中，连接固定反应，得到含有第m连接产物，即为含有连接有连接链的核酸纳米结构体系；
所述第1步目标核酸折纸单元组中的一个目标折纸单元的另一端粘性末端与所述连接链互补；
3)向步骤2)得到的连接有连接链的核酸纳米结构中添加与所述连接链完全互补的分离链进行分离反应，得到核酸纳米结构。
上述方法中，
所述步骤2)中，所述连接有连接链的固定相为固定有连接链的磁珠、固定有连接链的硅面、固定有连接链的玻璃面或其他固定有连接链的固定面；
所述连接链为13-80nt的单链核酸分子，且其5’端6-50nt的碱基与所述第1个目标核酸折纸单元的另一端粘性末端互补；所述连接链3’端标记生物素。
上述方法中，
步骤2)中，所述固定有连接链的磁珠为将所述连接链与标记链霉素的磁珠在自组装缓冲液中进行亲和反应，得到含有连接有连接链的固定相的体系；
步骤3)中，所述向步骤2)得到的连接有连接链的核酸纳米结构中添加与所述连接链完全互补的分离链进行分离反应为：将所述分离链添加到所述含有连接有连接链的核酸纳米结构体系，进行分离反应。
上述方法中，
所述标记链霉素的磁珠浓度为10mg/mL，所述磁珠的加入量为10-500uL；
或所述连接链在所述亲和反应所在体系中的浓度为10nM-100uM或5uM；
或所述亲和反应所在体系由连接链、标记链霉素和自组装缓冲液组成；
或每个所述目标核酸折纸单元结构在其连接固定所在体系中的浓度为1-1000nM或10nM；
或所述连接链和与其互补连接的目标核酸折纸单元的物质的量比为5:1-1000：1或500:1；
或所述分离链在分离反应所在的体系中的浓度为10nM-100uM或5uM。
上述方法中，
每一次分步连接固定前都包括如下步骤：去除上一步分步连接固定反应体系中的游离目标核酸折纸单元；
或所述粘性末端的大小为6-50nt。
上述方法中，
所述制备目标核酸折纸单元的方法包括如下步骤：
(1)根据每个目标核酸折纸单元的长链核酸分子设计合成其对应的多个短链，且将位于所述目标核酸折纸单元两端的多个短链延伸出所述粘性末端，得到带有粘性末端短链，将其余不带有粘性末端的短链命名为补充短链；
每个目标核酸折纸单元的长链核酸分子相同，
每个目标核酸折纸单元的补充短链相同；
每个目标核酸折纸单元的带有粘性末端短链的不同；
(2)再将步骤(1)得到的每个所述目标核酸折纸单元的长链核酸分子、对应的多个补充短链和对应的多个带有粘性末端短链进行自组装反应，得到每个所述目标核酸折纸单元。
上述方法中，
步骤(1)中，所述设计合成采用的软件为caDNAno；
步骤(2)中，所述自组装反应在自组装反应体系中进行，
每个所述补充短链和每个所述带有粘性末端短链在自组装反应体系中浓度均为每个所述长链核酸分子的2-10倍；
或，每个所述长链核酸分子在自组装反应体系中浓度为1-1000nM；
或每个所述补充短链和每个所述带有粘性末端短链在所述自组装反应体系中浓度均为2-2000nM。
上述方法中，
所述每步的连接固定或所述自组装反应的条件均为先高温解链5min以上，再降温循环，所述高温的温度为大于等于85℃，所述降温循环的每个循环至少在1min以上；每个循环温度改变量在1℃以下；温度应降至25℃以下再停止。
上述方法中，
所述核酸纳米结构的形状为包括字母、数字、其他规则或不规则的图案；
或所述核酸纳米结构为二维有限结构或三维有限结构。
上述方法中，
所述核酸为DNA、RNA、核酸-RNA杂化体或其他人造类核酸结构；
或所述核酸为DNA，所述DNA分子具有化学修饰；
或所述化学修饰为将纳米颗粒、多肽或者蛋白质特异结合核苷酸；
或所述纳米颗粒包括链酶亲和素、金颗粒或荧光基团；
或所述化学修饰为其他荧光信号或图案。
上述方法中，
所述核酸纳米结构为12步核酸纳米结构；
所述12步核酸纳米结构由28个目标核酸折纸单元分12步顺次连接得到；
第1步目标核酸折纸单元组为第1个目标折纸单元；
第2步目标核酸折纸单元组为第2个和第3个目标折纸单元；
第3步目标核酸折纸单元组为第4-6个目标折纸单元；
第4步目标核酸折纸单元组为第7个和第8个目标折纸单元；
第5步目标核酸折纸单元组为第9-11个目标折纸单元；
第6步目标核酸折纸单元组为第12个和第13个目标折纸单元；
第7步目标核酸折纸单元组为第14-16个目标折纸单元；
第8步目标核酸折纸单元组为第17个和第18个目标折纸单元；
第9步目标核酸折纸单元组为第19-21个目标折纸单元；
第10步目标核酸折纸单元组为第22个和第23个目标折纸单元；
第11步目标核酸折纸单元组为第24-26个目标折纸单元；
第12步目标核酸折纸单元组为第27个和第28个目标折纸单元；
所述28个目标核酸折纸单元的长链核酸分子的核苷酸序列均为序列1，
每个目标核酸折纸单元的对应补充短链均为192条，这192条补充短链的核苷酸序列分别均为序列2-序列193；
第1个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列194-序列217；
第2个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列218-序列241；
第3个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列242-序列265；
第4个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列194-序列199、序列218-序列223和序列266-序列277；
第5个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列278-序列301；
第6个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列200，序列204-序列205，序列242-序列247和序列302-序列316；
第7个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列260-序列265和序列317-序列334；
第8个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列335-序列358；
第9个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列200，序列204-序列205，序列302-序列304，序列212-序列223和序列284-序列289；
第10个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列236-序列241和序列359-序列376；
第11个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列200，序列204-序列205，序列242-序列247，序列302-序列304和序列377-序列388；
第12个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列224-序列235，序列248-序列253和序列389-序列394；
第13个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列206-211，序列254-265，序列395-400；
第14个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列194-序列199，序列218-序列223和序列266-序列277；
第15个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列278-序列301；
第16个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列200，序列204-序列205，序列242-序列247和序列302-序列316；
第17个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列260-序列265和序列317-序列334；
第18个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列335-序列358；
第19个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列194-序列199，序列212-序列223和序列284-序列289；
第20个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列236-序列241和序列359-序列376；
第21个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列200，序列204-序列205，序列242-序列247，序列302-序列304和序列377-序列388；
第22个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列224-序列235，序列248-序列253和序列389-序列394；
第23个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列206-序列211，序列254-序列265和序列395-序列400；
第24个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列194-序列199，序列218-序列223和序列266-序列277；
第25个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列278-序列301；
第26个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列200，序列204-序列205，序列242-序列247和序列302-序列316；
第27个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列194-序列199，序列200，序列204-序列205，序列302-序列304和序列317-序列328；
第28个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列194-序列199，序列200，序列204-序列205，序列302-序列304，序列335-序列340和序列347-序列352。
上述方法中，
所述核酸纳米结构为等腰三角形核酸纳米结构；
所述等腰三角形核酸纳米结构由21个目标核酸折纸单元分6步顺次连接得到；
第1步目标核酸折纸单元组为第1个目标折纸单元；
第2步目标核酸折纸单元组为第2个和第3个目标折纸单元；
第3步目标核酸折纸单元组为第4-6个目标折纸单元；
第4步目标核酸折纸单元组为第7-10个目标折纸单元；
第5步目标核酸折纸单元组为第11-15个目标折纸单元；
第6步目标核酸折纸单元组为第16-21个目标折纸单元；
21个目标核酸折纸单元的长链核酸分子的核苷酸序列均为序列1，
每个目标核酸折纸单元的对应补充短链均为192条，这192条补充短链的核苷酸序列分别均为序列2-序列193；
第1个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列194-205、序列212-217和序列401-406；
第2个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列218-229和序列407-418；
第3个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列230-235和序列242-259；
第4个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列194-199,序列272-277，序列359-364和序列419-424；
第5个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列206-211，序列266-271，序列278-283和序列323-328；
第6个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列200，序列204-205，序列302-310，序列335-340和序列347-352；
第7个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列218-223，序列260-265，序列329-334和序列389-394；
第8个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列236-241，序列317-332,序列341-346和序列353-358；
第9个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列224-229,序列290-301和序列413-418；
第10个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列242-247，序列230-235，序列254-259和序列311-316；
第11个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列194-199,序列212-217,序列284-289和序列401-406；
第12个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列317-322,序列365-376和序列389-394；
第13个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列236-241，序列290-295，序列377-382和序列419-424；
第14个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列266-271，序列278-283，序列296-301和序列311-316；
第15个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列200，序列204-205，序列212-217，序列302-304，序列305-310和序列383-388；
第16个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列194-199，序列218-233，序列200，序列204-205,序列302-304和序列407-412；
第17个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列194-199，序列200，序列204-205,序列248-253，序列272-277和序列302-304；
第18个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列194-199，序列200，序列204-205,序列302-304，序列323-328和序列359-364；
第19个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列194-199，序列200，序列204-211，序列302-304和序列347-352；
第20个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列194-199，序列200，序列204-205,序列302-304，序列335-340和序列395-400；
第21个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列194-199，序列200，序列204-205,序列242-253和序列302-304。
上述方法中，
所述核酸纳米结构为三维核酸纳米结构；
所述三维核酸纳米结构由6个目标核酸折纸单元分3步顺次连接得到；
第1步目标核酸折纸单元组为第1个目标折纸单元；
第2步目标核酸折纸单元组为第2-5个目标折纸单元；
第3步目标核酸折纸单元组为第6个目标折纸单元；
所述6个目标核酸折纸单元的长链核酸分子的核苷酸序列均为序列1，
第1个目标核酸折纸单元-第6个目标核酸折纸单元的对应短链由核心补充短链、上面补充短链、下面补充短链、上面带有粘性末端短链和下面带有粘性末端短链组成；
每个目标核酸折纸单元的核心补充短链相同，均为182条，这182条补充短链的核苷酸序列分别均为序列427-序列608；
第1个目标核酸折纸单元的15条与连接单链链接的上面带有粘性末端短链核苷酸序列分别为序列609-623；
第1个目标核酸折纸单元的41条上面和下面的补充短链的核苷酸序列分别为序列624-664；
第1个目标核酸折纸单元的16条下面的带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列665-680；
第2个目标核酸折纸单元的32条上面补充短链的核苷酸序列分别为序列624-629，序列631-633，序列635-644和序列681-693；
第2个目标核酸折纸单元的4条上面带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列694-697；
第2个目标核酸折纸单元的32条下面补充短链的核苷酸序列分别为序列645-664和序列698-709；
第2个目标核酸折纸单元的4条下面带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列710-713；
第3个目标核酸折纸单元的32条上面补充短链的核苷酸序列分别为序列624-644，序列681-688，序列691和序列714-715；
第3个目标核酸折纸单元的4条上面带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列716-719；
第3个目标核酸折纸单元的32条下面补充短链的核苷酸序列分别为序列645-664，序列698-705和序列720-723；
第3个目标核酸折纸单元的4条下面带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列724-727；
第4个目标核酸折纸单元的32条上面补充短链的核苷酸序列分别为序列624-625，序列627-628，序列630-644，序列683-693和序列714-715；
第4个目标核酸折纸单元的4条上面带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列728-731；
第4个目标核酸折纸单元的32条下面补充短链的核苷酸序列分别为序列645-664，序列698-701，序列706-709和序列720-723；
第4个目标核酸折纸单元的4条下面带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列732-735；
第5个目标核酸折纸单元的32条上面补充短链的核苷酸序列分别为序列624-629，序列630-644，序列681-682，序列685，序列688-693和序列714-715；
第5个目标核酸折纸单元的4条上面带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列736-739；
第5个目标核酸折纸单元的32条下面补充短链的核苷酸序列分别为序列645-664，序列702-713；
第5个目标核酸折纸单元的4条下面带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列740-743；
第6个目标核酸折纸单元的20条上面补充短链的核苷酸序列分别为序列624-625，序列627-628，序列631-633，序列635-644，序列685，序列688和序列691；
第6个目标核酸折纸单元的16条上面带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列744-759；
第6个目标核酸折纸单元的36条下面补充短链的核苷酸序列分别为序列645-664，序列698-709和序列720-723。
上述m为大于等于2的整数。
含有连接有连接链的固定相的体系由连接有连接链的固定相和自组装反应缓冲液组成，连接有连接链的固定相的浓度为10mg/mL；
每个目标DNA折纸单元的带有粘性末端短链的不同(粘性末端不同)；
或所述自组装反应的条件为85℃持续4min；然后进行120个降温循环，每个循环为-0.5℃/cycle,1min；到达25℃，进行7个降温循环，每个循环为-3℃/cycle,1min。
本发明的实验证明，本发明利用DNA折纸技术获得的结构单体，通过分步加入结构单体，每一步反应中，反应体系里只有设计好的结构单体；合成微米级别可控大小、形状、复杂度的有限二维和三维核酸结构。使用磁珠分步固定折纸单元的好处在于：1.生物素和链霉亲和素的作用比较成熟，这种带链霉亲和素的磁珠也已经商品化。2.利用磁珠的磁性，在清洗操作时可以使用磁铁将磁珠和结构沉降吸附在PCR管底，最大程度上减少了清洗操作中DNA结构的损失。通过分步组装的设计，可以实现结构单体的循环使用，由于每一步的折纸单元会被洗去，因而不要求所有连接处的粘性末端都是不同的，不要求全部的单体都是特异性的。这使得需要设计的不同结构单体数量减少，实现结构形成工作量的简化。这就显著降低了粘性末端的耗费和设计工作的难度，降低了形成结构的成本。此外，本方法实现了超过30块DNA折纸结构单体的组装。与传统的一锅法相比，本方法实现了更多结构单体的成功组装，显示出了这一新方法的高自组装效率。因此，本方法成功实现了更简便地组装更大规模的DNA结构。
附图说明
图1为DNA折纸单元的分步组装流程图示。
图2为步数极限探究结构设计。
图3为步数极限探究12步结构结果AFM图像。
图4为单步加入折纸单元块数上限设计。
图5为六步等腰三角形结构AFM图像。
图6为使用分步组装法组装三维梭形结构。
图7为使用分步组装法组装三维梭形结构TEM图像。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、DNA折纸单元分步组装法
一、本方法的核心思想
将DNA纳米结构固定在某种固相平面上，并分步加入DNA折纸单元。在图1中，展示了分步组装法的示意图，每个折纸单元有两个粘性末端，这两个粘性末端分别位于其两侧的折纸单元的对应粘性末端互补，每个折纸单元按照其在DNA纳米结构的顺序依次编号并且分步加入。
采用带有链霉亲和素的磁珠(商品为Dynabeads M-270)作为固相平面，将3’端带有生物素的连接单链通过生物素和链霉亲和素的相互作用连接到磁珠上，再通过连接单链的5’端的13bp(TATGATTGAGAGATT)的碱基与第一个DNA折纸单元的一个粘性末端互补实现第一个DNA折纸单元固定；再通过第二个DNA折纸单元的一个粘性末端与第一个DNA折纸单元的另一个粘性末端互补实现第二个DNA折纸单元固定；依次类推，将所有的DNA折纸单元依次按顺序固定。每次固定后都用洗液洗涤未固定的折纸单元。
每次加入折纸单元后，进行设定好的降温程序，使得这一步的单元连接到完整结构上；接下来，进行清洗工作，使固定有折纸单元的固相平面与上一步游离未固定的折纸单元分离；然后加入新一步的折纸单元，重复上述步骤，使得设计好的整体结构一步一步的形成；比如要形成一个等腰三角形的结构，可以第一步加入一个折纸单元，第二步两个，以此类推。
二、DNA折纸单元分步组装法的建立
1、构成DNA纳米结构的折纸单元及组成折纸单元的长链和短链的设计
DNA纳米结构由多个个目标折纸单元经过多步连接自组装得到；
每步目标核酸折纸单元组由1个或多个目标核酸折纸单元组成；
所述每个目标核酸折纸单元的两端均带有粘性末端；
所述每步目标核酸折纸单元组中的每个目标核酸折纸单元的两端均带有粘性末端，且所述每步目标核酸折纸单元组中的每个目标核酸折纸单元的粘性末端均不互补；
所述每步目标核酸折纸单元组中的每个目标核酸折纸单元一端的粘性末端与下一步目标核酸折纸单元组中的对应的目标核酸折纸单元对应端的粘性末端互补；
所述每步目标核酸折纸单元组中的每个目标核酸折纸单元另一端的粘性末端与上一步目标核酸折纸单元组中的对应的目标核酸折纸单元对应端的粘性末端互补；
制备目标DNA折纸单元的方法包括如下步骤：
(1)根据每个目标DNA折纸单元的长链DNA分子设计合成其对应的多个短链，且将位于所述目标DNA折纸单元两端的多个短链延伸出所述粘性末端，得到带有粘性末端短链，将其余不带有粘性末端的短链命名为补充短链；
每个目标DNA折纸单元的长链DNA分子相同，
每个目标DNA折纸单元的补充短链相同；
每个目标DNA折纸单元的带有粘性末端短链的不同；
(2)再将步骤(1)得到的每个所述目标DNA折纸单元的长链DNA分子、对应的多个补充短链和对应的多个带有粘性末端短链进行自组装反应，得到每个所述目标DNA折纸单元。
2、目标DNA折纸单元的制备
将上述1设计合成的每个目标DNA折纸单元的长链DNA分子、对应的多个补充短链、对应的多个带有粘性末端短链和自组装反应缓冲液混匀，得到自组装反应体系，自组装反应，得到每个目标DNA折纸单元；
3、DNA纳米结构的获得
将步骤2得到的每个目标DNA折纸单元的按照连接顺序分步加入含有固定有连接链的磁珠的反应体系中，分步进行连接反应，再加入与连接链完全互补的分离链分离反应，得到DNA纳米结构。
每一步连接后均进行洗涤反应。
上述含有固定有连接链的磁珠的反应体系中，
固定有连接链的磁珠上的连接链与第1个目标DNA折纸单元的另一端粘性末端互补；所述连接链3’端标记生物素。
固定有连接链的磁珠为将连接链与标记链霉素的磁珠在自组装缓冲液中进行亲和反应，得到含有连接有连接链的磁珠的体系。
上述分步加入具体包括如下步骤：
A、将第一步目标核酸折纸单元组加入含有连接有连接链的固定相的体系中，连接固定反应，得到含有第1连接产物体系；
所述含有连接有连接链的固定相的体系由连接有连接链的固定相和自组装反应缓冲液组成；
B、将第2步目标核酸折纸单元组加入含有第1连接产物体系中，连接固定反应，得到含有第2连接产物体系；
依次类推；
C、将所述第m步连接的目标核酸折纸单元组加入含有第m-1连接产物体系中，连接固定反应，得到含有第m连接产物，即为含有连接有连接链的核酸纳米结构体系；
m为大于等于2的整数。
每一步加入目标DNA折纸单元前还包括如下步骤：将上一步得到的反应体系中的上一步加入的目标DNA折纸单元洗涤去除。
实施例2、步数极限探究结构设计与12步结构成果
一、折纸单元分步组装法步数极限探究结构设计
1、制备步数极限探究结构所需的多个补充短链和多个带有粘性末端短链
如图2所示，根据步数极限探究结构设置28个形状为长方形的目标DNA折纸单元，用caDNAno软件根据每个目标DNA折纸单元的长链DNA分子序列设计多个补充短链和多个带有粘性末端短链；多个带有粘性末端短链为将每个目标DNA折纸单元的边缘的多个补充短链碱基延伸出粘性末端，得到多个带有粘性末端短链；
完成对12步结构的实验，所需28个目标DNA折纸单元的序列如下：
28个目标DNA折纸单元的长链DNA分子的核苷酸序列均为序列1，每个目标DNA折纸单元的对应补充短链均为192条，这192条补充短链的核苷酸序列分别均为序列2-序列193；
第1个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列194-序列217；
第2个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列218-序列241；
第3个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列242-序列265；
第4个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列194-序列199，序列218-序列223和序列266-序列277；
第5个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列278-序列301；
第6个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列200，序列204-205，序列242-247和序列302-316)；
第7个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列260-265和序列317-334)；
第8个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列335-序列358；
第9个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列200，序列204-序列205，序列302-序列304，序列212-序列223和序列284-序列289；
第10个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列236-序列241和序列359-序列376；
第11个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列(200，204-205，242-247，302-304，377-388)；
第12个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列(224-235，248-253，389-394)；
第13个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列(206-211，254-265，395-400)；
第14个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列(194-199，218-223，266-277)；
第15个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列(278-301)；
第16个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列(200，204-205，242-247，302-316)；
第17个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列(260-265，317-334)；
第18个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列(335-358)；
第19个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列(194-199，212-223，284-289)；
第20个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列(236-241，359-376)；
第21个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列(200，204-205，242-247，302-304，377-388)；
第22个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列(，224-235，248-253，389-394)；
第23个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列(206-211，254-265，395-400)；
第24个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列(194-199，218-223，266-277)；
第25个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列(278-301)；
第26个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列(200，204-205，242-247和302-316)；
第27个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列(194-199，200，204-205，302-304和317-328)；
第28个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列(194-199，200，204-205，302-304，335-340和347-352)。
2、目标DNA折纸单元的制备
1)自组装得到目标DNA折纸单元
将上述1得到的每个目标DNA折纸单元对应的长链DNA分子、192条补充短链、24条带有粘性末端短链和自组装反应缓冲液混匀，得到自组装反应体系，将自组装反应体系在降温程序下退火，得到每个目标DNA折纸单元，共得到28种目标DNA折纸单元。
自组装反应缓冲液由1X TE缓冲液(Tris 10mM,EDTA·Na2 2mM,pH 7.9)和12.5mMMgCl2混匀得到。
上述长链DNA分子在反应体系中的浓度为10nM；
上述每条补充短链在反应体系中的浓度为50nM；
上述每条带有粘性末端短链在反应体系中的浓度为50nM。
降温程序为：85℃持续4min；然后进行120个降温循环，每个循环为-0.5℃/cycle,1min；到达25℃，进行7个降温循环，每个循环为-3℃/cycle,1min。
2)目标DNA折纸单元的纯化
首先，将上述各个目标DNA折纸单元吸入柱材(密理博UFC5100BK)中，然后使用12000rcf在4℃离心10分钟；之后向柱材中加入500μl自组装反应缓冲液清洗柱材，然后使用12000rcf离心10分钟；该步骤重复三次之后，将吸附柱倒置于一个新的离心管之中，然后使用1000rcf离心2分钟，收集离心后的残留液，得到纯化后的目标DNA折纸单元。
3、目标DNA折纸单元分步连接得到12步DNA纳米结构
1)含有固定有连接链的磁珠的反应体系的制备
含有固定有连接链的磁珠的反应体系由固定有连接链的磁珠和自组装反应缓冲液组成，固定有连接链磁珠的浓度为10mg/mL；
固定有连接链磁珠上的连接链5’端TATGATTGAGAGATTnt的碱基与第一个目标DNA折纸单元不连接下一个目标DNA折纸单元的另一端AATCTCTCAATCATAnt的粘性末端互补；
连接链的核苷酸序列为序列ATAGATTTATGATTGAGAGATT。
连接链3’端标记生物素；
固定有连接链的磁珠通过如下方法制备：将连接链与标记链霉素的磁珠在1xTE，12.5Mm MgCl2缓冲液中反应(室温震荡反应30min)，连接链在体系中的浓度5uM，标记链霉素的磁珠加入时的浓度为10mg/mL，磁珠的加入量为10-500uL，通过生物素链霉素亲和作用连接得到含有固定有连接链的磁珠的反应体系。
2)分步连接
下述反应在PCR管中进行，分12步顺次连接得到；
第1步目标核酸折纸单元组为第1个目标折纸单元；
第2步目标核酸折纸单元组为第2个和第3个目标折纸单元；
第3步目标核酸折纸单元组为第4-6个目标折纸单元；
第4步目标核酸折纸单元组为第7个和第8个目标折纸单元；
第5步目标核酸折纸单元组为第9-11个目标折纸单元；
第6步目标核酸折纸单元组为第12个和第13个目标折纸单元；
第7步目标核酸折纸单元组为第14-16个目标折纸单元；
第8步目标核酸折纸单元组为第17个和第18个目标折纸单元；
第9步目标核酸折纸单元组为第19-21个目标折纸单元；
第10步目标核酸折纸单元组为第22个和第23个目标折纸单元；
第11步目标核酸折纸单元组为第24-26个目标折纸单元；
第12步目标核酸折纸单元组为第27个和第28个目标折纸单元。
(1)第一步
连接：
按照预期DNA纳米结构连接顺序，将上述2纯化得到第一步目标DNA折纸单元加入含有固定有连接链的磁珠的反应体系中，且加入的终浓度为10nM，将反应体系置于热循环仪中，进行降温程序以连接结构单体，得到第1步反应体系；
洗脱：
上述程序结束后，将含有第1步反应体系的PCR管置于磁铁上，使磁珠沉降，去除上清液，再加入200uL自组装反应缓冲液，充分悬浮磁珠，重复三次，进行洗脱，得到含有第1连接产物体系(去除游离的DNA折纸)。
(2)第二步
连接：
将第2步目标DNA折纸单元组加入上述(1)得到的含有第1连接产物体系中，且加入的终浓度为10nM，将反应体系置于热循环仪中，进行降温程序以连接结构单体，得到第2步反应体系；
洗脱：
上述程序结束后，将第2步反应体系的PCR管置于磁铁上，使磁珠沉降，去除上清液，再加入200uL自组装反应缓冲液，充分悬浮磁珠，重复三次，进行洗脱，得到含有第2连接产物体系。
(3)第3步-第11步
按照上述顺次加入；
(4)第12步
将最后一步目标DNA折纸单元加入含有第11连接产物体系的反应体系中，且加入的终浓度为10nM，将反应体系置于热循环仪中，进行降温程序以连接结构单体，得到第12步反应体系；
洗脱：
上述程序结束后，将含有第12步反应体系的PCR管置于磁铁上，使磁珠沉降，去除上清液，再加入200uL自组装反应缓冲液，充分悬浮磁珠，重复三次，进行洗脱，得到含有第12连接产物体系。
3)收集步数极限探究DNA纳米结构
收集含有第12连接产物体系，加入分离链(AATCTCTCAATCATAAATCTAT，浓度为5uM)，室温振荡30min；振荡后将PCR管置于磁铁上，吸取上清液，得到步数极限探究DNA纳米结构。
上述每步降温程序为：50℃持续20min；然后进行75个降温循环，每个循环为-0.2℃/cycle,5min。
二、检测
1、原子力共振显微镜成像
将上述一得到的DNA纳米结构采用原子力共振显微镜成像检测，成像时所用的成像基底是云母片，通过使用特质胶带来将云母片的表面平滑化，以减少在原子力共振显微镜成像时所产生的噪音。成像时所用的缓冲液为自组装反应缓冲液。成像作用探针与显微镜都是由Bruker公司生产的。
结果如图3所示，可以看出，得到12步DNA纳米结构。
实施例3、使用折纸单元分步组装法组装等腰三角形DNA纳米结构
一、折纸单元分步组装法组装等腰三角形DNA纳米结构
1、构成等腰三角形DNA纳米结构的折纸单元及组成折纸单元的长链和短链的设计
为探究分步组装法加入单体数极限，设计结构等腰三角形DNA纳米结构如图4所示，制备该结构所需的多个补充短链和多个带有粘性末端短链与实施例2的一的1的方法相同。
如图4所示，先根据预构成等腰三角形DNA纳米结构设置顺次连接的21个形状为长方形的目标DNA折纸单元(编号为1-21)，再用caDNAno软件根据每个目标DNA折纸单元设计合成每个目标DNA折纸单元的长链DNA分子、对应的多个补充短链和对应的多个带有粘性末端短链。
用caDNAno软件根据每个目标DNA折纸单元的长链DNA分子序列设计多个补充短链和多个带有粘性末端短链；多个带有粘性末端短链为将每个目标DNA折纸单元的边缘的多个补充短链碱基延伸出粘性末端，得到多个带有粘性末端短链；
21个目标DNA折纸单元的长链DNA分子的核苷酸序列均为序列1，
每个目标DNA折纸单元的对应补充短链均为192条，这192条补充短链的核苷酸序列分别均为序列2-序列193；
第1个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列(194-205，212-217，401-406)
第2个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列(218-229，407-418)
第3个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列(230-235，242-259)
第4个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列(194-199,272-277，359-364，419-424)
第5个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列(206-211，266-271，278-283，323-328)
第6个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列(200，204-205，302-310，335-340，347-352)
第7个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列(218-223，260-265，329-334，389-394)
第8个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列(236-241，317-332,341-346，353-358)
第9个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列(224-229,290-301，413-418)
第10个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列(242-247，230-235，254-259，311-316)
第11个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列(194-199,212-217,284-289，401-406)
第12个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列(317-322,365-376，389-394)
第13个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列(236-241，290-295，377-382，419-424)
第14个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列(266-271，278-283，296-301，311-316)
第15个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列(200，204-205，212-217，302-304，305-310，383-388)
第16个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列(194-199，218-233，200，204-205,302-304，407-412)
第17个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列(194-199，200，204-205,248-253，272-277，302-304)
第18个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列(194-199，200，204-205,302-304，323-328，359-364)
第19个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列(194-199，200，204-211，302-304，347-352)
第20个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列(194-199，200，204-205,302-304，335-340，395-400)
第21个目标DNA折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列(194-199，200，204-205,242-253，302-304)。
2、目标DNA折纸单元的制备
1)自组装得到目标DNA折纸单元
将上述1得到的每个目标DNA折纸单元对应的长链DNA分子、192条补充短链、24条带有粘性末端短链和自组装反应缓冲液混匀，得到自组装反应体系，将自组装反应体系在降温程序下退火，得到每个目标DNA折纸单元，共得到21种目标DNA折纸单元。
自组装反应缓冲液由1X TE缓冲液(Tris 10mM,EDTA·Na2 2mM,pH 7.9)和12.5mMMgCl2混匀得到。
上述长链DNA分子在反应体系中的浓度为10nM；
上述每条补充短链在反应体系中的浓度为50nM；
上述每条带有粘性末端短链在反应体系中的浓度为50nM。
降温程序为：85℃持续4min；然后进行120个降温循环，每个循环为-0.5℃/cycle,1min；到达25℃，进行7个降温循环，每个循环为-3℃/cycle,1min。
2)目标DNA折纸单元的纯化
首先，将上述各个目标DNA折纸单元吸入柱材中，然后使用12000rcf在4℃离心10分钟；之后向柱材中加入500μl自组装反应缓冲液清洗柱材，然后使用12000rcf离心10分钟；该步骤重复三次之后，将吸附柱倒置于一个新的离心管之中，然后使用1000rcf离心2分钟，收集离心后的残留液，得到纯化后的目标DNA折纸单元。
3、目标DNA折纸单元分步连接得到等腰三角形DNA纳米结构
1)含有固定有连接链的磁珠的反应体系的制备
与实施例1相同，得到含有固定有连接链的磁珠的反应体系。
2)分步连接
下述反应在PCR管中进行。分6步顺次连接得到：
分6步顺次连接得到；
第1步目标核酸折纸单元组为第1个目标折纸单元；
第2步目标核酸折纸单元组为第2个和第3个目标折纸单元；
第3步目标核酸折纸单元组为第4-6个目标折纸单元；
第4步目标核酸折纸单元组为第7-10个目标折纸单元；
第5步目标核酸折纸单元组为第11-15个目标折纸单元；
第6步目标核酸折纸单元组为第16-21个目标折纸单元；
(1)第一步
连接：
按照预期等腰三角形纳米结构连接顺序，将上述2纯化得到第一步目标DNA折纸单元加入含有固定有连接链的磁珠的反应体系中，且加入的终浓度为10nM，将反应体系置于热循环仪中，进行降温程序以连接结构单体，得到第1步反应体系；
洗脱：
上述程序结束后，将第1步反应体系的PCR管置于磁铁上，使磁珠沉降，去除上清液，再加入200uL自组装反应缓冲液，充分悬浮磁珠，重复三次，进行洗脱，得到含有第1连接产物体系(去除游离的DNA折纸)。
(2)第二步
连接：
将第2和第3个目标DNA折纸单元加入上述(1)得到的含有第1连接产物体系中，且加入的终浓度为10nM，将反应体系置于热循环仪中，进行降温程序以连接结构单体，得到第2步反应体系；
洗脱：
上述程序结束后，将第2步反应体系的PCR管置于磁铁上，使磁珠沉降，去除上清液，再加入200uL自组装反应缓冲液，充分悬浮磁珠，重复三次，进行洗脱，得到含有第2连接产物体系。
(3)按照上述顺次加入；
(4)第6步
将最后一步目标DNA折纸单元组加入含有第5连接产物体系中，且加入的终浓度为10nM，将反应体系置于热循环仪中，进行降温程序以连接结构单体，得到第6步反应体系；
洗脱：
上述程序结束后，将第6步反应体系的PCR管置于磁铁上，使磁珠沉降，去除上清液，再加入200uL自组装反应缓冲液，充分悬浮磁珠，重复三次，进行洗脱，得到含有第6连接产物体系。
3)收集步数极限探究DNA纳米结构
收集含有第6连接产物体系，加入分离链(AATCTCTCAATCATAAATCTAT)，室温振荡30min；振荡后将PCR管置于磁铁上，吸取上清液，得到6步等腰三角形DNA纳米结构。
上述每步降温程序为：50℃持续20min；然后进行75个降温循环，每个循环为-0.2℃/cycle,5min。
二、检测
1、原子力共振显微镜成像
将上述一得到的6步等腰三角形DNA纳米结构采用原子力共振显微镜成像检测，成像时所用的成像基底是云母片，通过使用特质胶带来将云母片的表面平滑化，以减少在原子力共振显微镜成像时所产生的噪音。成像时所用的缓冲液为自组装反应缓冲液。成像作用探针与显微镜都是由Bruker公司生产的。
结果如图5所示，可以看出，得到6步等腰三角形反应结构。
实施例5、使用分步组装法组装三维DNA纳米结构
一、折纸单元分步组装法组装三维DNA纳米结构
1、构成三维DNA纳米结构的折纸单元及组成折纸单元的长链和短链的设计
设计结构三维DNA纳米结构如图6所示，制备该结构所需的多个补充短链和多个带有粘性末端短链与实施例2的一的1的方法相同。
如图6所示，先根据预构成三维DNA纳米结构设置顺次连接的6个形状为长方形的目标DNA折纸单元(编号为1-6)，再用caDNAno软件根据每个目标DNA折纸单元设计合成每个目标DNA折纸单元的长链DNA分子、对应的多个补充短链和对应的多个带有粘性末端短链；多个带有粘性末端短链为将每个目标DNA折纸单元的边缘的多个补充短链碱基延伸出粘性末端，得到多个带有粘性末端短链。
将每个目标DNA折纸单元的补充短链分为核心补充短链部分(每一块共用)，上面的补充短链和下面的补充短链，其中上面和下面的补充短链中会部分带有粘性末端，核心、上面和下面的三部分一起构成目标DNA折纸单元的补充短链部分。
所述三维核酸纳米结构由6个目标核酸折纸单元顺次连接得到；
所述6个目标核酸折纸单元的长链核酸分子的核苷酸序列均为序列1，
第1个目标核酸折纸单元-第6个目标核酸折纸单元的对应短链由核心补充短链、上面补充短链、下面补充短链、上面带有粘性末端短链和下面带有粘性末端短链组成；
每个目标核酸折纸单元的核心补充短链相同，均为182条，这182条补充短链的核苷酸序列分别均为序列427-序列608；
第1个目标核酸折纸单元的15条与连接单链链接的上面带有粘性末端短链核苷酸序列分别为序列609-623；
第1个目标核酸折纸单元的41条上面和下面的补充短链的核苷酸序列分别为序列624-664；
第1个目标核酸折纸单元的16条下面的带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列665-680；
第2个目标核酸折纸单元的32条上面补充短链的核苷酸序列分别为序列624-629，序列631-633，序列635-644和序列681-693；
第2个目标核酸折纸单元的4条上面带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列694-697；
第2个目标核酸折纸单元的32条下面补充短链的核苷酸序列分别为序列645-664和序列698-709；
第2个目标核酸折纸单元的4条下面带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列710-713；
第3个目标核酸折纸单元的32条上面补充短链的核苷酸序列分别为序列624-644，序列681-688，序列691和序列714-715；
第3个目标核酸折纸单元的4条上面带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列716-719；
第3个目标核酸折纸单元的32条下面补充短链的核苷酸序列分别为序列645-664，序列698-705和序列720-723；
第3个目标核酸折纸单元的4条下面带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列724-727；
第4个目标核酸折纸单元的32条上面补充短链的核苷酸序列分别为序列624-625，序列627-628，序列630-644，序列683-693和序列714-715；
第4个目标核酸折纸单元的4条上面带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列728-731；
第4个目标核酸折纸单元的32条下面补充短链的核苷酸序列分别为序列645-664，序列698-701，序列706-709和序列720-723；
第4个目标核酸折纸单元的4条下面带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列732-735；
第5个目标核酸折纸单元的32条上面补充短链的核苷酸序列分别为序列624-629，序列630-644，序列681-682，序列685，序列688-693和序列714-715；
第5个目标核酸折纸单元的4条上面带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列736-739；
第5个目标核酸折纸单元的32条下面补充短链的核苷酸序列分别为序列645-664，序列702-713；
第5个目标核酸折纸单元的4条下面带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列740-743；
第6个目标核酸折纸单元的20条上面补充短链的核苷酸序列分别为序列624-625，序列627-628，序列631-633，序列635-644，序列685，序列688和序列691；
第6个目标核酸折纸单元的16条上面带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列744-759；
第6个目标核酸折纸单元的36条下面补充短链的核苷酸序列分别为序列645-664，序列698-709和序列720-723。
2、目标DNA折纸单元的制备
1)自组装得到目标DNA折纸单元
将上述1得到的每个目标DNA折纸单元对应的长链DNA分子、246、242或227条补充短链、8或12或27条带有粘性末端短链和自组装反应缓冲液混匀，得到自组装反应体系，将自组装反应体系在恒温程序下退火，得到每个目标DNA折纸单元，共得到6种目标DNA折纸单元。
自组装反应缓冲液由1X TE缓冲液和12.5mM MgCl2混匀得到。
上述长链DNA分子在反应体系中的浓度为10nM；
上述每条补充短链在反应体系中的浓度为50nM；
上述每条带有粘性末端短链在反应体系中的浓度为50nM。
恒温程序为：85℃持续15min；然后52℃持续10h。
2)目标DNA折纸单元的纯化
将上述各个目标DNA折纸单元分别按照体积比1:1加入PEG(液体)，充分震荡混匀后，使用16000rcf在25℃离心25分钟；之后弃掉上清液，加入缓冲液(Tris 10mM,EDTA·Na22mM,pH 7.9，12.5mM)溶解沉淀，即得到纯化后的目标DNA折纸单元。
3、目标DNA折纸单元分步连接得到三维DNA纳米结构
1)含有固定有连接链的磁珠的反应体系的制备
与实施例1相同，得到含有固定有连接链的磁珠的反应体系。
2)分步连接
下述反应在PCR管中进行，分3步顺次连接得到；
第1步目标核酸折纸单元组为第1个目标折纸单元；
第2步目标核酸折纸单元组为第2-5个目标折纸单元；
第3步目标核酸折纸单元组为第6个目标折纸单元；
(1)第一步
连接：
按照预期三维DNA纳米结构连接顺序，将上述2纯化得到第一步目标DNA折纸单元加入含有固定有连接链的磁珠的反应体系中，且加入的终浓度为10nM，将反应体系置于热循环仪中，进行降温程序以连接结构单体，得到第1步反应体系；
洗脱：
上述程序结束后，将第1步反应体系的PCR管置于磁铁上，使磁珠沉降，去除上清液，再加入200uL自组装反应缓冲液，充分悬浮磁珠，重复三次，进行洗脱，得到含有第1连接产物体系(去除游离的DNA折纸)。
(2)第二步
连接：
将第2步目标DNA折纸单元组加入上述(1)得到的含有第1连接产物体系中，且加入的终浓度为10nM，将反应体系置于热循环仪中，进行降温程序以连接结构单体，得到第2步反应体系；
洗脱：
上述程序结束后，将第2步反应体系的PCR管置于磁铁上，使磁珠沉降，去除上清液，再加入200uL自组装反应缓冲液，充分悬浮磁珠，重复三次，进行洗脱，得到含有第2连接产物体系。
(3)第1步
将第三步目标DNA折纸单元组加入含有第5连接产物体系中，且加入的终浓度为10nM，将反应体系置于热循环仪中，进行降温程序以连接结构单体，得到第3步反应体系；
洗脱：
上述程序结束后，将第3步反应体系的PCR管置于磁铁上，使磁珠沉降，去除上清液，再加入200uL自组装反应缓冲液，充分悬浮磁珠，重复三次，进行洗脱，得到含有第3连接产物体系。
3)三维DNA纳米结构
收集含有第3连接产物体系，加入分离链(AATCTCTCAATCATAAATCTAT)，室温振荡30min；振荡后将PCR管置于磁铁上，吸取上清液，得到三维DNA纳米结构。
上述每步降温程序为：50℃持续140min；然后进行8个降温循环，每个循环为-1℃/cycle,60min；到达42℃，42℃持续60min,再进行7个降温循环，每个循环为-1℃/cycle,60min；到达35℃，35℃持续60min，再进行95个降温循环，每个循环为-0.2℃/cycle,5min。
二、检测
1、电子显微镜成像
将上述一得到的三维DNA纳米结构在TEM成像仪器下检测，将6ul待测样品(1-5nM)滴加到辉光放电处理过的TEM栅格上静置4分钟，随后使用2％甲酸双氧铀水溶液染色30秒，在80kV下操作FEI Tecnai G2F20TWIN场发射透射电子显微镜进行成像。
结果如图7所示，可以看出，得到三维反应结构。
序列表
<110>清华大学
<120> DNA折纸单元分步组装法
<160>759
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7249
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
aatgctacta ctattagtag aattgatgcc accttttcag ctcgcgcccc aaatgaaaatatagctaaac aggttattga ccatttgcga aatgtatcta atggtcaaac taaatctact cgttcgcagaattgggaatc aactgttata tggaatgaaa cttccagaca ccgtacttta gttgcatatt taaaacatgttgagctacag cattatattc agcaattaag ctctaagcca tccgcaaaaa tgacctctta tcaaaaggagcaattaaagg tactctctaa tcctgacctg ttggagtttg cttccggtct ggttcgcttt gaagctcgaattaaaacgcg atatttgaag tctttcgggc ttcctcttaa tctttttgat gcaatccgct ttgcttctgactataatagt cagggtaaag acctgatttt tgatttatgg tcattctcgt tttctgaact gtttaaagcatttgaggggg attcaatgaa tatttatgac gattccgcag tattggacgc tatccagtct aaacattttactattacccc ctctggcaaa acttcttttg caaaagcctc tcgctatttt ggtttttatc gtcgtctggtaaacgagggt tatgatagtg ttgctcttac tatgcctcgt aattcctttt ggcgttatgt atctgcattagttgaatgtg gtattcctaa atctcaactg atgaatcttt ctacctgtaa taatgttgtt ccgttagttcgttttattaa cgtagatttt tcttcccaac gtcctgactg gtataatgag ccagttctta aaatcgcataaggtaattca caatgattaa agttgaaatt aaaccatctc aagcccaatt tactactcgt tctggtgtttctcgtcaggg caagccttat 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aatatttaga gatctacaaa ggctatttta 30
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tttttaaatt gggcttgaga acaccagaac gagtagtttt 40
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<213> Artificial sequence
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ttttaaaata gcgagaggct gacgacgata aaaacctttt 40
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<213> Artificial sequence
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ttttaccgga agcaaactcc cttcaaagcg aaccagtttt 40
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ttttaaaggt ggcatcaatt ttggggcgcg agctgatttt 40
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<213> Artificial sequence
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aatctctcaa tcatattatc aatatgatat tcaagacagt caaatcacct ttt 53
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aatctctcaa tcatatttaa ccaataggaa cgcaaatcag ctcatttttt ttt 53
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<213> Artificial sequence
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aatctctcaa tcatattcca ttcaggctgc gcaggcaaag cgccattcgt ttt 53
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ttttaagcat aaagtgtaaa acaacatacg agccggtttt 40
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tttttggtgg ttccgaaatc cgaaaatcct gtttgatttt 40
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<213> Artificial sequence
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cagctgtgct ccctcaagag aaggatttta agaggctgag actattactg aacc 54
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gaatctcgtg cagccgccgc cagcattcca gaaccaccac cagttggtga ggtt 54
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gacttcttag ccaccattac cattagcgca aaatcaccag taggctctaa cctg 54
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cagctttctg catgattaag actccttacc caaaagaact ggctgcagaa ggat 54
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cttgtgttac gatagcagcc tttacagaac gtcaaaaatg aaatacaaca ctga 54
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attggacgaa aaatcattac cgcgccctta ttttcatcgt aggagttctt tgtg 54
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aagtcgtgct agcattttcg agccagttgt aatttaggca gaggagtaag agtg 54
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<213> Artificial sequence
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atcgtagttc gctgatgcaa atccaattaa ctatatgtaa atgaaacacg tcgt 54
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attggtggat ttgaaacaaa catcaaggag caaaagaaga tgactttgct tcgt 54
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cactgattgg tattatcaga tgatggctat catcatattc ctgaaacctg aggt 54
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gtctggttac gtatcaaacc ctcaatcctt gctgaacctc aaaggtgttg gtcc 54
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ctgaaggagc tcacacgacc agtaatatgg cagattcacc agtacagtat tgac 54
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ttttcctcaa gagaaggatt ttaagaggct gagacttttt 40
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ttttagccgc cgccagcatt ccagaaccac caccagtttt 40
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<211> 40
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<213> Artificial sequence
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ttttcaccat taccattagc gcaaaatcac cagtagtttt 40
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<211> 40
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ttttatgatt aagactcctt acccaaaaga actggctttt 40
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ttttatagca gcctttacag aacgtcaaaa atgaaatttt 40
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ttttaatcat taccgcgccc ttattttcat cgtaggtttt 40
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ttccacgttc aaaaggtggc atcaattttg gggcgcgagc tgactgtgca gagc 54
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ataaggacac gtaaccaata ggaacgcaaa tcagctcatt ttttttccta gttt 54
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gcaagatgct gccattcagg ctgcgcaggc aaagcgccat tcgttaacgt atcc 54
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<213> Artificial sequence
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aggacttatc caagcataaa gtgtaaaaca acatacgagc cgggttgagc tacg 54
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agcagcacgt gtggtggttc cgaaatccga aaatcctgtt tgagtacgtc ctca 54
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cctatcgtcg ttaaattggg cttgagaaca ccagaacgag tagacctata catg 54
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gcacgagatt cctgatgcaa atccaattaa ctatatgtaa atgaacctca ccaa 54
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ttttctgatg caaatccaat taactatatg taaatgtttt 40
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tttttgaaac aaacatcaag gagcaaaaga agatgatttt 40
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tttttatcaa accctcaatc cttgctgaac ctcaaatttt 40
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ttttcacacg accagtaata tggcagattc accagttttt 40
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accaatcagt gatgattaag actccttacc caaaagaact ggcacctcag gttt 54
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cgtaaccaga catagcagcc tttacagaac gtcaaaaatg aaaggaccaa cacc 54
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agctccttca gaatcattac cgcgccctta ttttcatcgt agggtcaata ctgt 54
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<211> 54
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<213> Artificial sequence
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<211> 54
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<213> Artificial sequence
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<211> 54
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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tataagctag ctaaattggg cttgagaaca ccagaacgag taggactgag gatc 54
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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tgttctcagg aaaaatagcg agaggctgac gacgataaaa accaatcctc gtgt 54
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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agactttacg tcacacgacc agtaatatgg cagattcacc agtgctcttg tctc 54
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cagcatcttg ctaaattggg cttgagaaca ccagaacgag tagggatacg ttaa 54
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gctagcttat accattcagg ctgcgcaggc aaagcgccat tcggatcctc agtc 54
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taagtcttac ccaccattac cattagcgca aaatcaccag tagaacaaat ctta 54
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tgactcacct tatgattaag actccttacc caaaagaact ggccatcagg taaa 54
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cctcctatat gctgatgcaa atccaattaa ctatatgtaa atgggttcac ctca 54
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tctcgttact ttgaaacaaa catcaaggag caaaagaaga tgattcactc taaa 54
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ctctgagtcc tattatcaga tgatggctat catcatattc ctgctctggt aagt 54
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<211> 54
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tttttaacca ataggaacgc aaatcagctc attttttttt 40
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<211> 40
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<213> Artificial sequence
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ttttccattc aggctgcgca ggcaaagcgc cattcgtttt 40
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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gagctttgca gagttagcgt aacgatccac agacagccct catggtgctc gtct 54
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<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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tcaagctgat ccacgcataa ccgatatgac aacaaccatc gccaagattc tgac 54
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<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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gaaggttcaa taacggagat ttgtatcgcg cgaaacaaag tacgagaaag gtaa 54
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<213> Artificial sequence
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tcgtggtcac ataaattggg cttgagaaca ccagaacgag taggacgtga tgac 54
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<213> Artificial sequence
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aatttataag taaaatagcg agaggctgac gacgataaaa accctaccta aacg 54
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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gagcatagag taccggaagc aaactccctt caaagcgaac cagaagaagc taag 54
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<213> Artificial sequence
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tcgttgtaag ccctcaagag aaggatttta agaggctgag actagcaggt ccac 54
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<213> Artificial sequence
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ctttagtgag gagccgccgc cagcattcca gaaccaccac caggctacat ttat 54
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<213> Artificial sequence
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tagtaccatt gcaccattac cattagcgca aaatcaccag tagcctccac atag 54
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cgacgttgca tatgattaag actccttacc caaaagaact ggctaccact atcg 54
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aacattcact aatagcagcc tttacagaac gtcaaaaatg aaaacgtcga gtgt 54
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tctgtacgag caatcattac cgcgccctta ttttcatcgt aggctcctcc ttta 54
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taaatgcttg tcctcaagag aaggatttta agaggctgag actacagaag acac 54
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acacttcgat cagccgccgc cagcattcca gaaccaccac cagctcattg gttg 54
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ctgctaggac gcaccattac cattagcgca aaatcaccag tagaccaacc tctc 54
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<213> Artificial sequence
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accaatacga catgattaag actccttacc caaaagaact ggcttctaaa ctaa 54
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acgtaaagtc taatcattac cgcgccctta ttttcatcgt agggagacaa gagc 54
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ggtcctgaca ggcattttcg agccagttgt aatttaggca gagtaatgct atcg 54
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<213> Artificial sequence
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ctcagctacc tctgatgcaa atccaattaa ctatatgtaa atggcacacg taat 54
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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ggtaagactt atgaaacaaa catcaaggag caaaagaaga tgataagatt tgtt 54
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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aaggtgagtc aattatcaga tgatggctat catcatattc ctgtttacct gatg 54
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<213> Artificial sequence
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cgacgtagca atatcaaacc ctcaatcctt gctgaacctc aaaattccta ttca 54
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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actctgctga ccacacgacc agtaatatgg cagattcacc agtcctgtcc acac 54
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accatttcta aaaaggtggc atcaattttg gggcgcgagc tgatcataga cagg 54
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agctctcacg tatcaatatg atattcaaga cagtcaaatc accccacgat ttcc 54
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<212> DNA
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cttcagcaag ctaaccaata ggaacgcaaa tcagctcatt tttcatgcag gaat 54
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<212> DNA
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gagtttcatt cccattcagg ctgcgcaggc aaagcgccat tcgctggatg acct 54
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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ggaagtaaag gaagcataaa gtgtaaaaca acatacgagc cgggctattg agag 54
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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ccagtacaat atggtggttc cgaaatccga aaatcctgtt tgaagacgtg caaa 54
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<212> DNA
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tttaccaatt tagttagcgt aacgatccac agacagccct catagagagt ggat 54
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aggagaccat ccacgcataa ccgatatgac aacaaccatc gcccttgctc gaga 54
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ctcttgataa taacggagat ttgtatcgcg cgaaacaaag tacggtatca tatg 54
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ggtgcagtca caaaatagcg agaggctgac gacgataaaa acctatttct gtat 54
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taccacacga caccggaagc aaactccctt caaagcgaac cagcatgact gact 54
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<213> Artificial sequence
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tagtgaatgt ttatcaaacc ctcaatcctt gctgaacctc aaaacactcg acgt 54
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ctgctttagg aatcaatatg atattcaaga cagtcaaatc acctgaccag caaa 54
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gataaccatc ataaccaata ggaacgcaaa tcagctcatt ttttccagaa tatc 54
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tctaggagca gatagcagcc tttacagaac gtcaaaaatg aaaaccttga ttgt 54
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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gatggtctcc tatcaatatg atattcaaga cagtcaaatc acctctcgag caag 54
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actcatttcc tccattcagg ctgcgcaggc aaagcgccat tcgaagatat agct 54
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<213> Artificial sequence
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gtgactgcac caagcataaa gtgtaaaaca acatacgagc cggatacaga aata 54
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gtcgtgtggt atggtggttc cgaaatccga aaatcctgtt tgaagtcagt catg 54
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tcctaaagca gcacgcataa ccgatatgac aacaaccatc gcctttgctg gtca 54
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gttatctcat tattatcaga tgatggctat catcatattc ctgtgtagaa acac 54
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gtttatatga gctgatgcaa atccaattaa ctatatgtaa atggacgtat ttag 54
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caggagtata ttgaaacaaa catcaaggag caaaagaaga tgaagtcctt gaaa 54
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tacacacctt cattatcaga tgatggctat catcatattc ctggatgaac atgt 54
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acgtatacag ttatcaaacc ctcaatcctt gctgaacctc aaagacctga ccta 54
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cctatgtaca acctcaagag aaggatttta agaggctgag acttccacag cacc 54
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gtacgaccta aagccgccgc cagcattcca gaaccaccac caggctcaaa ccat 54
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acctattgca tcaccattac cattagcgca aaatcaccag tagccaagga tggt 54
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<212> DNA
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tcaatctcac catgattaag actccttacc caaaagaact ggcattgagt gtcc 54
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<211> 54
<212> DNA
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aagtttcttg tatagcagcc tttacagaac gtcaaaaatg aaaaaaggat cagt 54
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<211> 54
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gattccaatc taatcattac cgcgccctta ttttcatcgt aggttctcac ttct 54
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<211> 54
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ttgtacatag ggcattttcg agccagttgt aatttaggca gagggtgctg tgga 54
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ttaggtcgta cctgatgcaa atccaattaa ctatatgtaa atgatggttt gagc 54
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<213> Artificial sequence
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atgcaatagg ttgaaacaaa catcaaggag caaaagaaga tgaaccatcc ttgg 54
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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ggtgagattg aattatcaga tgatggctat catcatattc ctgggacact caat 54
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<213> Artificial sequence
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acaagaaact ttatcaaacc ctcaatcctt gctgaacctc aaaactgatc cttt 54
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<213> Artificial sequence
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agattggaat ccacacgacc agtaatatgg cagattcacc agtagaagtg agaa 54
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tttatgctgc acacgcataa ccgatatgac aacaaccatc gccacacctg aatc 54
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gctaaccaag gaacggagat ttgtatcgcg cgaaacaaag tacgctctct tcca 54
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gaagctcata gtaaattggg cttgagaaca ccagaacgag tagcttatgt atta 54
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ttcttacact aaaaatagcg agaggctgac gacgataaaa accattacct ctgt 54
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attacaccat caaaggtggc atcaattttg gggcgcgagc tgagcaagga agaa 54
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ccttggttag ctaaccaata ggaacgcaaa tcagctcatt ttttggaaga gagc 54
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taaaaaccaa aattgaatat aatgct 26
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catatttaac aacatcataa ttactagaaa aagcctgtt 39
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ctgattatca gatgatggca attcatgaac gttattaat 39
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agcgtcatac atgtgaaaca tgaaagtatt aagaggctg 39
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atattttaaa tgcacaaagg ctatcaggtc attgcctga 39
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agcgagaggc tttcatagta agagca 26
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agcgtaacga tctaaaacga actaac 26
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acagttaatg cccaatcaaa aatcag 26
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gctgagagcc agcactaata gattag 26
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gagaatgacc ata 13
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aatttacgag catcaccctc agagcc 26
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gaaccgcctc cctccttatt agcgtt 26
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gagtgaataa cctgtattct aagaac 26
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gagttaaagg ccgcgaaggc accaac 26
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gacaaagaac gcgctccggc ttaggt 26
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cttttgcggg atccaatcaa tagaaa 26
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gtttattttg tcagtcaccc tcagca 26
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agcaaatgaa aaaccaagtt acaaaa 26
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gcaacagtgc caccttttca ccagtg 26
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ggacattctg gcctaatttt ccctta 26
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actgtagcgc gttaccatcg atagca 26
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ttagaaccct catctgctca ttcagt 26
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aaaatccctt ataaaagcgt aagaat 26
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aagaaccgga tatagcttga taccga 26
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tgcttctgta aatttgaatt accttt 26
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aataaacacc ggagccaaca tgtaatttag gcagaggca 39
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<211> 26
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aataatcggc tgtctacctt tttaac 26
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tcggtttatc agccgacttg agccat 26
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ccggaacgag gcgtcggaac gagggt 26
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<400> 651
tttcggaagc ataagacggg caattt 26
<210> 652
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 652
ttacaaacaa ttcacaattc cacacaacat acgagcttt 39
<210> 653
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 653
tttatggaaa gcgcagtctc tgaatttttt cgagccagt 39
<210> 654
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 654
tttcaccgga acctaaagcc agattt 26
<210> 655
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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tttctgcgga atcgtcataa atattcagac tcctcaaga 39
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<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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ttttgagatt taggcgtcca atattt 26
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tttgagccag caataatcaa aatttt 26
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ttttgccctg acgattcatc agtttt 26
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<211> 26
<212> DNA
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tttcgctgag aagaatggtt tgattt 26
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<211> 26
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<213> Artificial sequence
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tttactccaa cgtcgaaagg agcttt 26
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<213> Artificial sequence
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tttaataccg accgtgtgat aaataacgcc agaatcctg 39
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<213> Artificial sequence
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tttgggcgct agggcgctgg caagtg 26
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<213> Artificial sequence
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tttcagctga ttgaagaacg tggttt 26
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<211> 26
<212> DNA
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tttgcaaaag aagtagatta agattt 26
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<213> Artificial sequence
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aacaggtcag gattagaccg gaagcaaact ccgacctacc aagca 45
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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ggtcaataac ctgtttgata catttcgcaa atctcatagt ggatt 45
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<213> Artificial sequence
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aactacaacg cctgtatttc gtcaccagta cagtgcaaat gtaac 45
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<211> 45
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<213> Artificial sequence
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cggggttttg ctcagtgaag gattaggatt agtataaatg caaca 45
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<213> Artificial sequence
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gtaccgacaa aaggtaaata agagaatata aagtcgtaga cga 43
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<211> 43
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<213> Artificial sequence
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caagcaagcc gtttttccgc actcatcgag aatccagatt tgt 43
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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tcagtgaggc caccgaagaa gtgtttttat aaacctgttt gtggt 45
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<211> 45
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<213> Artificial sequence
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ttacattggc agattcgtct gaaatggatt atcacagtgc tgtca 45
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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agagcctaat ttgccataac gagcgtcttt ccattcgttc ctgtg 45
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 674
agtattaaca ccgcctcaga ggtgaggcgg tcctcagtgt aagct 45
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<211> 43
<212> DNA
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tgagttaagc ccaatagata acccacaaga atggtccaat gag 43
<210> 676
<211> 45
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<213> Artificial sequence
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ttagaagtat tagacttaat acatttgagg atgagtaagt ggttt 45
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 677
gcaaggataa aaatttaagc ctttatttca acgacacttg tcatg 45
<210> 678
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 678
ggagccttta attgtaaaaa aaggctccaa aatgctagat agaca 45
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 679
agagaatcga tgaacggagt ctggagcaaa caggttaaat ctctg 45
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 680
gctttgagga ctaaagagca acggctacag agcagttgga gtcta 45
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 681
tttcgatata ttcggtcgca tcgcccacgc ataacttt 38
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<213> Artificial sequence
<400> 682
tttcaatatg atattcaaca cagtcaaatc accatttt 38
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<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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tttgaaccgc caccctcaga gtaccgccac cctcattt 38
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<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 684
ttttaaatat gcaactaaag tagctcaaca tgtttttt 38
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<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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tttcagacga cgagtcttta ccctgactat tt 32
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<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 686
tttctaaaca actttcaact ctgtatggga ttttgttt 38
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<211> 38
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<213> Artificial sequence
<400> 687
tttaaagaat tagcaaaata tcatacaggc aaggcttt 38
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<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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ttttgctgat gcagttatac aaattcttat tt 32
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<211> 38
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<213> Artificial sequence
<400> 689
tttaataata tcccatccta gtcctgaaca agaaattt 38
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<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 690
tttatcggcc ttgctggtat agaagaactc aaactttt 38
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<213> Artificial sequence
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tttgcactaa atctatggtt gctttgacgt tt 32
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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tttaacctcc cgacttgcgg cgaggcgttt tagcgttt 38
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<213> Artificial sequence
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tttatttttg aatggctata cgtggcacag acaatttt 38
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 694
aaagttacca gaaggaaatc gtctacgac 29
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<211> 29
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<213> Artificial sequence
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tttgcggaac aaagaaacac aaatctgga 29
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<213> Artificial sequence
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agaataacat aaaaacagca gcctttacag agaccacaaa caggt 45
<210> 697
<211> 45
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<213> Artificial sequence
<400> 697
cagttggcaa atcaactcaa tcaatatctg gttgacagca ctgtg 45
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<213> Artificial sequence
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tttggtcaat aacctgtttg atacatttcg caaatttt 38
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<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 699
tttcggggtt ttgctcagtg aaggattagg attagttt 38
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<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 700
tttaactaca acgcctgtat ttcgtcacca gtacattt 38
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<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 701
tttaacaggt caggattaga ccggaagcaa actccttt 38
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<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 702
tttggagcct ttaattgtaa aaaaaggctc caaaattt 38
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<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 703
tttgctttga ggactaaaga gcaacggcta cagagttt 38
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 704
tttgcaagga taaaaattta agcctttatt tcaacttt 38
<210> 705
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 705
tttagagaat cgatgaacgg agtctggagc aaacattt 38
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<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 706
tttgtaccga caaaaggtaa ataagagaat ataaattt 38
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<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 707
tttcaagcaa gccgtttttc cgcactcatc gagaattt 38
<210> 708
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 708
tttttacatt ggcagattcg tctgaaatgg attatttt 38
<210> 709
<211> 38
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<213> Artificial sequence
<400> 709
ttttcagtga ggccaccgaa gaagtgtttt tataattt 38
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 710
agagcctaat ttgccataac gagcgtcttt ccaatcgatc tgtca 45
<210> 711
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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agtattaaca ccgcctcaga ggtgaggcgg tcaccataga ctgtg 45
<210> 712
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 712
tgagttaagc ccaatagata acccacaaga atcttagtta caa 43
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 713
ttagaagtat tagacttaat acatttgagg attagttgag tataa 45
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<211> 38
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<213> Artificial sequence
<400> 714
tttcagttgg caaatcaact caatcaatat ctggtttt 38
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<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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tttagaataa cataaaaaca gcagccttta cagagttt 38
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<211> 45
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<213> Artificial sequence
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aacctcccga cttgcggcga ggcgttttag cgtgcttggt aggtc 45
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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atttttgaat ggctatacgt ggcacagaca ataatccact atgag 45
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 718
atcggccttg ctggtataga agaactcaaa ctgttacatt tgcac 45
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 719
aataatatcc catcctagtc ctgaacaaga aatgttgcat ttata 45
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<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 720
tttagagcct aatttgccat aacgagcgtc tttccttt 38
<210> 721
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 721
ttttgagtta agcccaatag ataacccaca agaatttt 38
<210> 722
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 722
tttttagaag tattagactt aatacatttg aggatttt 38
<210> 723
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 723
tttagtatta acaccgcctc agaggtgagg cggtcttt 38
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<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 724
gtaccgacaa aaggtaaata agagaatata aatgtacgtt cat 43
<210> 725
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 725
caagcaagcc gtttttccgc actcatcgag aagcttcgta ggt 43
<210> 726
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 726
tcagtgaggc caccgaagaa gtgtttttat aaaaagcact acgtg 45
<210> 727
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 727
ttacattggc agattcgtct gaaatggatt attcgtttag tatat 45
<210> 728
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 728
aagcaaatat ttaaatcaca ggaacgaat 29
<210> 729
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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caatatgata ttcaacacag tcaaatcacc atagcttaca ctgag 45
<210> 730
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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ggcaaaagaa tacactaact cattggacc 29
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 731
cgatatattc ggtcgcatcg cccacgcata acaaaccact tactc 45
<210> 732
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 732
gcaaggataa aaatttaagc ctttatttca acgctttgca attcg 45
<210> 733
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 733
ggagccttta attgtaaaaa aaggctccaa aatcttgaca aatgg 45
<210> 734
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 734
agagaatcga tgaacggagt ctggagcaaa cagattagac aacat 45
<210> 735
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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gctttgagga ctaaagagca acggctacag aggtcacaca cgtaa 45
<210> 736
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 736
aaagaattag caaaatatca tacaggcaag gccatgacaa gtgtc 45
<210> 737
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 737
taaatatgca actaaagtag ctcaacatgt tttgtctatc tagca 45
<210> 738
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 738
ctaaacaact ttcaactctg tatgggattt tgcagagatt taacc 45
<210> 739
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 739
gaaccgccac cctcagagta ccgccaccct catagactcc aactg 45
<210> 740
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 740
aacaggtcag gattagaccg gaagcaaact cccgtctcgt atcta 45
<210> 741
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 741
ggtcaataac ctgtttgata catttcgcaa attttgcttc ctagc 45
<210> 742
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 742
aactacaacg cctgtatttc gtcaccagta cagtatgtag gaatc 45
<210> 743
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 743
cggggttttg ctcagtgaag gattaggatt agtatccaca attta 45
<210> 744
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 744
aagcaaatat ttaaattgac agatcgatt 29
<210> 745
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 745
caatatgata ttcaacacag tcaaatcacc atcacagtct atggt 45
<210> 746
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 746
ggcaaaagaa tacactaatt gtaactaag 29
<210> 747
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 747
cgatatattc ggtcgcatcg cccacgcata acttatactc aacta 45
<210> 748
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 748
aaagaattag caaaatatca tacaggcaag gccgaattgc aaagc 45
<210> 749
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 749
taaatatgca actaaagtag ctcaacatgt ttccatttgt caaga 45
<210> 750
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 750
ctaaacaact ttcaactctg tatgggattt tgatgttgtc taatc 45
<210> 751
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 751
gaaccgccac cctcagagta ccgccaccct cattacgtgt gtgac 45
<210> 752
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 752
aacctcccga cttgcggcga ggcgttttag cgtagatacg agacg 45
<210> 753
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 753
atttttgaat ggctatacgt ggcacagaca atgctaggaa gcaaa 45
<210> 754
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 754
atcggccttg ctggtataga agaactcaaa ctgattccta catac 45
<210> 755
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 755
aataatatcc catcctagtc ctgaacaaga aataaattgt ggata 45
<210> 756
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 756
aaagttacca gaaggaaaat gaacgtaca 29
<210> 757
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 757
tttgcggaac aaagaaacac ctacgaagc 29
<210> 758
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 758
agaataacat aaaaacagca gcctttacag agcacgtagt gcttt 45
<210> 759
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 759
cagttggcaa atcaactcaa tcaatatctg gtatatacta aacga 45
Claims (17)
1.一种将核酸折纸单元分步组装核酸纳米结构的方法，包括如下步骤：
1)根据预构成的核酸纳米结构制备用于如下步骤2)和步骤3)中的第1步目标核酸折纸单元组至第m步目标核酸折纸单元组，m为大于等于2的整数；
每步目标核酸折纸单元组由1个或多个目标核酸折纸单元组成；
所述每步目标核酸折纸单元组中的每个目标核酸折纸单元的两端均带有粘性末端，且所述每步目标核酸折纸单元组中的每个目标核酸折纸单元的粘性末端均不互补；
所述每步目标核酸折纸单元组中的每个目标核酸折纸单元一端的粘性末端与下一步目标核酸折纸单元组中的对应的目标核酸折纸单元对应端的粘性末端互补；另一端的粘性末端与上一步目标核酸折纸单元组中的对应的目标核酸折纸单元对应端的粘性末端互补；
2)将步骤1)得到的每步目标核酸折纸单元组分步连接固定在连接有连接链的固定相上，得到连接有连接链的核酸纳米结构；
所述分步连接固定包括如下步骤：
A、将所述第一步目标核酸折纸单元组加入含有连接有连接链的固定相的体系中，连接固定反应，得到含有第1连接产物体系；
所述含有连接有连接链的固定相的体系由连接有连接链的固定相和自组装反应缓冲液组成；
B、将第2步目标核酸折纸单元组加入含有第1连接产物体系中，连接固定反应，得到含有第2连接产物体系；
依次类推；
C、将所述第m步连接的目标核酸折纸单元组加入含有第m-1连接产物体系中，连接固定反应，得到含有第m连接产物，即为含有连接有连接链的核酸纳米结构体系；
所述第1步目标核酸折纸单元组中的一个目标折纸单元的另一端粘性末端与所述连接链互补；
3)向步骤2)得到的连接有连接链的核酸纳米结构中添加与所述连接链完全互补的分离链进行分离反应，得到核酸纳米结构。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述步骤2)中，所述连接有连接链的固定相为固定有连接链的磁珠、固定有连接链的硅面、固定有连接链的玻璃面或其他固定有连接链的固定面；
所述连接链为13-80nt的单链核酸分子，且其5’端6-50nt的碱基与所述第1个目标核酸折纸单元的另一端粘性末端互补；所述连接链3’端标记生物素。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
步骤2)中，所述固定有连接链的磁珠为将所述连接链与标记链霉素的磁珠在自组装缓冲液中进行亲和反应，得到含有连接有连接链的固定相的体系；
步骤3)中，所述向步骤2)得到的连接有连接链的核酸纳米结构中添加与所述连接链完全互补的分离链进行分离反应为：将所述分离链添加到所述含有连接有连接链的核酸纳米结构体系，进行分离反应。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述标记链霉素的磁珠浓度为10mg/mL，所述磁珠的加入量为10-500uL；
或所述连接链在所述亲和反应所在体系中的浓度为10nM-100uM；
或所述亲和反应所在体系由连接链、标记链霉素和自组装缓冲液组成；
或每个所述目标核酸折纸单元结构在其连接固定所在体系中的浓度为1-1000nM；
或所述连接链和与其互补连接的目标核酸折纸单元的物质的量比为5:1-1000：1；
或所述分离链在分离反应所在的体系中的浓度为10nM-100uM。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
所述连接链在所述亲和反应所在体系中的浓度为5uM；
或每个所述目标核酸折纸单元结构在其连接固定所在体系中的浓度为10nM；
或所述连接链和与其互补连接的目标核酸折纸单元的物质的量比为500:1；
或所述分离链在分离反应所在的体系中的浓度为5uM。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
每一次分步连接固定前都包括如下步骤：去除上一步分步连接固定反应体系中的游离目标核酸折纸单元；
或所述粘性末端的大小为6-50nt。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述制备目标核酸折纸单元的方法包括如下步骤：
(1)根据每个目标核酸折纸单元的长链核酸分子设计合成其对应的多个短链，且将位于所述目标核酸折纸单元两端的多个短链延伸出所述粘性末端，得到带有粘性末端短链，将其余不带有粘性末端的短链命名为补充短链；
每个目标核酸折纸单元的长链核酸分子相同，
每个目标核酸折纸单元的补充短链相同；
每个目标核酸折纸单元的带有粘性末端短链的不同；
(2)再将步骤(1)得到的每个所述目标核酸折纸单元的长链核酸分子、对应的多个补充短链和对应的多个带有粘性末端短链进行自组装反应，得到每个所述目标核酸折纸单元。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：
步骤(1)中，所述设计合成采用的软件为caDNAno；
步骤(2)中，所述自组装反应在自组装反应体系中进行，
每个所述补充短链和每个所述带有粘性末端短链在自组装反应体系中浓度均为每个所述长链核酸分子的2-10倍；
或，每个所述长链核酸分子在自组装反应体系中浓度为1-1000nM；
或每个所述补充短链和每个所述带有粘性末端短链在所述自组装反应体系中浓度均为2-2000nM。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述每步的连接固定或所述自组装反应的条件均为先高温解链5min以上，再降温循环，所述高温的温度为大于等于85℃，所述降温循环的每个循环至少在1min以上；每个循环温度改变量在1℃以下；温度应降至25℃以下再停止。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述核酸纳米结构的形状为包括字母、数字、其他规则或不规则的图案；
或所述核酸纳米结构为二维有限结构或三维有限结构。
11.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述核酸为DNA、RNA、核酸-RNA杂化体或其他人造类核酸结构。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：
所述核酸为DNA，所述DNA分子具有化学修饰。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：
所述化学修饰为将纳米颗粒、多肽或者蛋白质特异结合核苷酸。
14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：
所述纳米颗粒包括链酶亲和素、金颗粒或荧光基团。
15.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述核酸纳米结构为12步核酸纳米结构；
所述12步核酸纳米结构由28个目标核酸折纸单元分12步顺次连接得到；
第1步目标核酸折纸单元组为第1个目标折纸单元；
第2步目标核酸折纸单元组为第2个和第3个目标折纸单元；
第3步目标核酸折纸单元组为第4-6个目标折纸单元；
第4步目标核酸折纸单元组为第7个和第8个目标折纸单元；
第5步目标核酸折纸单元组为第9-11个目标折纸单元；
第6步目标核酸折纸单元组为第12个和第13个目标折纸单元；
第7步目标核酸折纸单元组为第14-16个目标折纸单元；
第8步目标核酸折纸单元组为第17个和第18个目标折纸单元；
第9步目标核酸折纸单元组为第19-21个目标折纸单元；
第10步目标核酸折纸单元组为第22个和第23个目标折纸单元；
第11步目标核酸折纸单元组为第24-26个目标折纸单元；
第12步目标核酸折纸单元组为第27个和第28个目标折纸单元；
所述28个目标核酸折纸单元的长链核酸分子的核苷酸序列均为序列1，
每个目标核酸折纸单元的对应补充短链均为192条，这192条补充短链的核苷酸序列分别均为序列2-序列193；
第1个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列194-序列217；
第2个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列218-序列241；
第3个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列242-序列265；
第4个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列194-序列199、序列218-序列223和序列266-序列277；
第5个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列278-序列301；
第6个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列200，序列204-序列205，序列242-序列247和序列302-序列316；
第7个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列260-序列265和序列317-序列334；
第8个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列335-序列358；
第9个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列200，序列204-序列205，序列302-序列304，序列212-序列223和序列284-序列289；
第10个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列236-序列241和序列359-序列376；
第11个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列200，序列204-序列205，序列242-序列247，序列302-序列304和序列377-序列388；
第12个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列224-序列235，序列248-序列253和序列389-序列394；
第13个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列206-211，序列254-265，序列395-400；
第14个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列194-序列199，序列218-序列223和序列266-序列277；
第15个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列278-序列301；
第16个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列200，序列204-序列205，序列242-序列247和序列302-序列316；
第17个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列260-序列265和序列317-序列334；
第18个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列335-序列358；
第19个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列194-序列199，序列212-序列223和序列284-序列289；
第20个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列236-序列241和序列359-序列376；
第21个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列200，序列204-序列205，序列242-序列247，序列302-序列304和序列377-序列388；
第22个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列224-序列235，序列248-序列253和序列389-序列394；
第23个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列206-序列211，序列254-序列265和序列395-序列400；
第24个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列194-序列199，序列218-序列223和序列266-序列277；
第25个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列278-序列301；
第26个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列200，序列204-序列205，序列242-序列247和序列302-序列316；
第27个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列194-序列199，序列200，序列204-序列205，序列302-序列304和序列317-序列328；
第28个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列194-序列199，序列200，序列204-序列205，序列302-序列304，序列335-序列340和序列347-序列352。
16.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述核酸纳米结构为等腰三角形核酸纳米结构；
所述等腰三角形核酸纳米结构由21个目标核酸折纸单元分6步顺次连接得到；
第1步目标核酸折纸单元组为第1个目标折纸单元；
第2步目标核酸折纸单元组为第2个和第3个目标折纸单元；
第3步目标核酸折纸单元组为第4-6个目标折纸单元；
第4步目标核酸折纸单元组为第7-10个目标折纸单元；
第5步目标核酸折纸单元组为第11-15个目标折纸单元；
第6步目标核酸折纸单元组为第16-21个目标折纸单元；
21个目标核酸折纸单元的长链核酸分子的核苷酸序列均为序列1，
每个目标核酸折纸单元的对应补充短链均为192条，这192条补充短链的核苷酸序列分别均为序列2-序列193；
第1个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列194-205、序列212-217和序列401-406；
第2个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列218-229和序列407-418；
第3个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列230-235和序列242-259；
第4个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列194-199,序列272-277，序列359-364和序列419-424；
第5个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列206-211，序列266-271，序列278-283和序列323-328；
第6个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列200，序列204-205，序列302-310，序列335-340和序列347-352；
第7个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列218-223，序列260-265，序列329-334和序列389-394；
第8个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列236-241，序列317-322,序列341-346和序列353-358；
第9个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列224-229,序列290-301和序列413-418；
第10个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列242-247，序列230-235，序列254-259和序列311-316；
第11个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列194-199,序列212-217,序列284-289和序列401-406；
第12个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列317-322,序列365-376和序列389-394；
第13个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列236-241，序列290-295，序列377-382和序列419-424；
第14个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列266-271，序列278-283，序列296-301和序列311-316；
第15个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列200，序列204-205，序列212-217，序列302-304，序列305-310和序列383-388；
第16个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列194-199，序列218-233，序列200，序列204-205,序列302-304和序列407-412；
第17个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列194-199，序列200，序列204-205,序列248-253，序列272-277和序列302-304；
第18个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列194-199，序列200，序列204-205,序列302-304，序列323-328和序列359-364；
第19个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列194-199，序列200，序列204-211，序列302-304和序列347-352；
第20个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列194-199，序列200，序列204-205,序列302-304，序列335-340和序列395-400；
第21个目标核酸折纸单元的24条带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列194-199，序列200，序列204-205,序列242-253和序列302-304。
17.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述核酸纳米结构为三维核酸纳米结构；
所述三维核酸纳米结构由6个目标核酸折纸单元分3步顺次连接得到；
第1步目标核酸折纸单元组为第1个目标折纸单元；
第2步目标核酸折纸单元组为第2-5个目标折纸单元；
第3步目标核酸折纸单元组为第6个目标折纸单元；
所述6个目标核酸折纸单元的长链核酸分子的核苷酸序列均为序列1，
第1个目标核酸折纸单元-第6个目标核酸折纸单元的对应短链由核心补充短链、上面补充短链、下面补充短链、上面带有粘性末端短链和下面带有粘性末端短链组成；
每个目标核酸折纸单元的核心补充短链相同，均为182条，这182条补充短链的核苷酸序列分别均为序列427-序列608；
第1个目标核酸折纸单元的15条与连接单链链接的上面带有粘性末端短链核苷酸序列分别为序列609-623；
第1个目标核酸折纸单元的41条上面和下面的补充短链的核苷酸序列分别为序列624-664；
第1个目标核酸折纸单元的16条下面的带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列665-680；
第2个目标核酸折纸单元的32条上面补充短链的核苷酸序列分别为序列624-629，序列631-633，序列635-644和序列681-693；
第2个目标核酸折纸单元的4条上面带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列694-697；
第2个目标核酸折纸单元的32条下面补充短链的核苷酸序列分别为序列645-664和序列698-709；
第2个目标核酸折纸单元的4条下面带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列710-713；
第3个目标核酸折纸单元的32条上面补充短链的核苷酸序列分别为序列624-644，序列681-688，序列691和序列714-715；
第3个目标核酸折纸单元的4条上面带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列716-719；
第3个目标核酸折纸单元的32条下面补充短链的核苷酸序列分别为序列645-664，序列698-705和序列720-723；
第3个目标核酸折纸单元的4条下面带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列724-727；
第4个目标核酸折纸单元的32条上面补充短链的核苷酸序列分别为序列624-625，序列627-628，序列630-644，序列683-693和序列714-715；
第4个目标核酸折纸单元的4条上面带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列728-731；
第4个目标核酸折纸单元的32条下面补充短链的核苷酸序列分别为序列645-664，序列698-701，序列706-709和序列720-723；
第4个目标核酸折纸单元的4条下面带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列732-735；
第5个目标核酸折纸单元的32条上面补充短链的核苷酸序列分别为序列624-629，序列630-644，序列681-682，序列685，序列688-693和序列714-715；
第5个目标核酸折纸单元的4条上面带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列736-739；
第5个目标核酸折纸单元的32条下面补充短链的核苷酸序列分别为序列645-664，序列702-713；
第5个目标核酸折纸单元的4条下面带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列740-743；
第6个目标核酸折纸单元的20条上面补充短链的核苷酸序列分别为序列624-625，序列627-628，序列631-633，序列635-644，序列685，序列688和序列691；
第6个目标核酸折纸单元的16条上面带有粘性末端短链的核苷酸序列分别为序列744-759；
第6个目标核酸折纸单元的36条下面补充短链的核苷酸序列分别为序列645-664，序列698-709和序列720-723。
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Also Published As
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