CN107488661A - 一种核酸纳米结构及其制备方法和应用 - Google Patents

一种核酸纳米结构及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107488661A
CN107488661A CN201710859574.8A CN201710859574A CN107488661A CN 107488661 A CN107488661 A CN 107488661A CN 201710859574 A CN201710859574 A CN 201710859574A CN 107488661 A CN107488661 A CN 107488661A
Authority
CN
China
Prior art keywords
golden
chain
nucleic acid
nano structure
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201710859574.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107488661B (zh
Inventor
丁宝全
湛鹏飞
李娜
王振刚
蒋乔
王婷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Center for Nanosccience and Technology China
Original Assignee
National Center for Nanosccience and Technology China
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Center for Nanosccience and Technology China filed Critical National Center for Nanosccience and Technology China
Priority to CN201710859574.8A priority Critical patent/CN107488661B/zh
Publication of CN107488661A publication Critical patent/CN107488661A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107488661B publication Critical patent/CN107488661B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B22—CASTING; POWDER METALLURGY
    • B22F—WORKING METALLIC POWDER; MANUFACTURE OF ARTICLES FROM METALLIC POWDER; MAKING METALLIC POWDER; APPARATUS OR DEVICES SPECIALLY ADAPTED FOR METALLIC POWDER
    • B22F1/00—Metallic powder; Treatment of metallic powder, e.g. to facilitate working or to improve properties
    • B22F1/05—Metallic powder characterised by the size or surface area of the particles
    • B22F1/054—Nanosized particles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B22—CASTING; POWDER METALLURGY
    • B22F—WORKING METALLIC POWDER; MANUFACTURE OF ARTICLES FROM METALLIC POWDER; MAKING METALLIC POWDER; APPARATUS OR DEVICES SPECIALLY ADAPTED FOR METALLIC POWDER
    • B22F1/00—Metallic powder; Treatment of metallic powder, e.g. to facilitate working or to improve properties
    • B22F1/05—Metallic powder characterised by the size or surface area of the particles
    • B22F1/054—Nanosized particles
    • B22F1/0553—Complex form nanoparticles, e.g. prism, pyramid, octahedron
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B22—CASTING; POWDER METALLURGY
    • B22F—WORKING METALLIC POWDER; MANUFACTURE OF ARTICLES FROM METALLIC POWDER; MAKING METALLIC POWDER; APPARATUS OR DEVICES SPECIALLY ADAPTED FOR METALLIC POWDER
    • B22F9/00—Making metallic powder or suspensions thereof
    • B22F9/16—Making metallic powder or suspensions thereof using chemical processes
    • B22F9/18—Making metallic powder or suspensions thereof using chemical processes with reduction of metal compounds
    • B22F9/24—Making metallic powder or suspensions thereof using chemical processes with reduction of metal compounds starting from liquid metal compounds, e.g. solutions
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y40/00—Manufacture or treatment of nanostructures
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/65—Raman scattering
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/65—Raman scattering
    • G01N2021/653—Coherent methods [CARS]
    • G01N2021/656—Raman microprobe

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种核酸纳米结构及其制备方法和应用，所述核酸纳米结构为通过DNA折纸技术构建的六个三角形DNA折纸结构组装形成的六边形DNA纳米结构，具体是通过脚手架链与订书钉链和捕获链进行杂交，再通过连接链分别与六个三角形DNA折纸结构的脚手架链杂交而自组装形成的六边形DNA纳米结构。所述核酸纳米结构稳定性好，可以锚定两个80nm的金三棱柱，制备得到的金蝴蝶结结构可以产生强烈的电磁场，实现了单分子拉曼检测。

Description

一种核酸纳米结构及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于DNA纳米技术领域，涉及一种核酸纳米结构及其制备方法和应用。
背景技术
在光照作用下，贵金属纳米结构表面的电子吸收光子能量，发生局域表面等离子共振(localized surface plasmon resonance,LSPR)，产生一种强烈的电磁场。LSPR光谱峰值处的波长和场强取决于贵金属纳米结构的形状、尺寸、几何排列和理化性质。研究表明，结构合理的贵金属纳米材料之间可以产生强烈的电磁场，这一性质在光学领域具有巨大的应用潜力，目前已应用于光学镊子、单分子荧光检测、表面增强拉曼散射和非线性光学等方面。
在众多的金属纳米结构中，金蝴蝶结结构尤为特殊，其由两个金棱柱以棱角对棱角的方式排列在一起，棱柱间的距离通常在10nm以下，这种特殊的排列方式导致在棱柱间的局限空间内可以产生强烈的电磁场增强，有利于实现单分子拉曼检测。
目前，利用金蝴蝶结结构实现单分子拉曼检测主要存在以下挑战：首先，金棱柱之间的距离需要10nm，制备金蝴蝶结结构的电子束曝光法(electron beam lithography,EBL)过程繁琐，成本较高，很难实现小于10nm的分辨率，并且制备的结构光学性质较差；其次，由于拉曼探针分子具有较小的散射面积，拉曼信号需要通过电磁场进行增强，然而目前缺乏一种有效的方法将拉曼探针分子固定在电磁场内；最后，缺乏一种有效的方法将分子固定在电磁场内而不受其他拉曼探针分子的影响。
近年来，DNA折纸技术利用其形状的可编程性和结构位点的可寻址修饰性，为金蝴蝶结结构的组装提供了一种简单有效的方法，分辨率可达2nm。但是，该方法也存在明显的缺陷，受到环状噬菌体单链长度和固定的碱基序列的影响，DNA折纸结构的尺寸、功能和复杂程度受到了明显的限制，组装的贵金属纳米结构稳定性较差，产生的电磁场强度较弱。
发明内容
针对现有技术存在的缺陷，本发明提供一种核酸纳米结构及其制备方法和应用，本发明利用传统的三角形折纸结构组装一个边长为120nm的六边形核酸纳米结构，并利用该六边形核酸纳米结构锚定两个80nm的金三棱柱，在两金三棱柱之间精确固定一个拉曼探针分子，以实现单分子拉曼检测。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种核酸纳米结构，所述核酸纳米结构为通过DNA折纸技术构建的六个三角形DNA折纸结构组装形成的六边形DNA纳米结构，具体是通过脚手架链与订书钉链和捕获链进行杂交，再通过连接链分别与六个三角形DNA折纸结构的脚手架链杂交而自组装形成的六边形DNA纳米结构。
所述核酸纳米结构为六边形DNA纳米结构，其结构的稳定性与空间的可寻址修饰性增加了组装的等离子体纳米结构的复杂性，组装的等离子体纳米结构尺寸更大、数量更多、形状更多样，缩小了贵金属纳米结构之间的距离，使得贵金属纳米结构间的距离小于10nm，在贵金属纳米结构间的局限空间内产生了强烈的电磁场增强，有利于实现单分子拉曼检测。
优选地，所述核酸纳米结构的边长为100-150nm，例如可以是100nm、110nm、130nm、140nm或150nm，优选为120nm。
本发明中，核酸纳米结构的各边长长度相等，制备的正六边形DNA纳米结构稳定性好，可以作为载体锚定尺寸大、数量多、形状多样的贵金属纳米结构。
优选地，所述脚手架链与所述订书钉链、所述脚手架链与所述捕获链、所述脚手架链与所述连接链通过碱基互补配对原则进行杂交。
优选地，所述脚手架链为M13噬菌体基因组DNA。
优选地，所述订书钉链为人工合成的寡核苷酸序列。
优选地，所述捕获链为人工合成的寡核苷酸序列。
优选地，所述连接链包含二硫键和/或限制性内切酶的特异性识别位点。
第二方面，本发明提供了一种制备如第一方面所述核酸纳米结构的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将所述脚手架链溶液与所述订书钉链、捕获链和连接链的混合溶液按照摩尔比为1:(1-20)混合均匀；
(2)以85-98℃为起始温度退火至15-30℃，采用离心柱离心去除过量的订书钉链和捕获链；
(3)将纯化后的六种三角形DNA折纸结构等量混合后，以40-50℃为起始温度退火至20-30℃，进行梯度PCR循环，制得所述核酸纳米结构。
优选地，步骤(1)所述脚手架链溶液与所述订书钉链、捕获链和连接链的混合溶液的摩尔比为1:(1-10)，例如可以是1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10，优选为1:2。
优选地，步骤(2)所述退火的起始温度为90-98℃，例如可以是90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃或98℃，优选为95℃。
优选地，步骤(2)所述退火的终点温度为15-25℃，例如可以是15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃，优选为20℃。
优选地，步骤(2)所述退火的持续时间为5-20h，例如可以是5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h或20h，优选为8-15h，最优为10h。
优选地，步骤(3)所述退火的起始温度为43-48℃，例如可以是43℃、44℃、45℃、46℃、47℃或48℃，优选为45℃。
优选地，步骤(3)所述退火的终点温度为22-28℃，例如可以是22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃或28℃，优选为25℃。
优选地，步骤(3)所述循环的次数为2-10次，例如可以是2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次，优选为4-9次，最优为8次。
优选地，步骤(3)所述退火的持续时间为20-30h，例如可以是20h、21h、22h、23h、24h、25h、26h、27h、28h、29h或30h，优选为22-25h，最优为24h。
第三方面，本发明提供了一种如第一方面所述核酸纳米结构用于组装贵金属纳米结构。
第四方面，本发明提供了一种金蝴蝶结结构，所述金蝴蝶结结构包括贵金属纳米结构和如第一方面所述的核酸纳米结构，所述贵金属纳米结构表面修饰有寡核苷酸序列，所述贵金属纳米结构与所述核酸纳米结构通过寡核苷酸序列进行组装。
所述金蝴蝶结结构克服了现有技术的缺陷，光学性质稳定，在两金三棱柱之间精确固定了一个拉曼探针分子，实现了单分子拉曼检测。
优选地，所述贵金属纳米结构为表面酸性修饰有巯基化DNA序列的金棱柱，所述巯基化DNA序列与所述捕获链互补。
优选地，所述金棱柱包括金三棱柱、金四棱柱、金五棱柱或金六棱柱中的任意一种或至少两种的组合，优选为金三棱柱。
优选地，所述金三棱柱的长度为50-100nm，例如可以是50nm、60nm、70nm、80nm、90nm或100nm，优选为80nm。
优选地，所述的金三棱柱的尖端宽度为1-6nm，例如可以是1nm、2nm、3nm、4nm、5nm或6nm，优选为2nm。
本发明采用金的多棱柱作为贵金属纳米结构，以六边形DNA纳米结构作为连接载体，突破了传统DNA折纸结构对贵金属纳米结构的形状、取向和数量的限制，本发明的金蝴蝶结结构由非均质、棱镜取向多样的两个金三棱柱组装形成，实现了多个基于尖端的集体等离子体激元的单分子拉曼散射。
本发明中，由于金三棱柱具有大约2nm的尖端，当利用六边形纳米结构作为载体构建金蝴蝶结纳米结构时，两个金三棱柱的尖端与尖端相对，此时由于局域表面等离激元，会产生非常强烈的电磁场。相比于金纳米球和金纳米棒二聚体，金蝴蝶结纳米结构的电磁场会高出约103，所以利用这种高强度的电磁场能检测到金纳米球和金纳米棒检测不到的拉曼染料分子且能实现单分子的拉曼增强。
第五方面，本发明提供了一种制备如第四方面所述金蝴蝶结结构的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1’)制备核酸纳米结构；
(2’)制备金三棱柱；
(3’)将步骤(1’)制备的核酸纳米结构与步骤(2’)制备的金三棱柱按照摩尔比为1:(10-30)混合均匀后，进行退火，循环5-8次；
(4’)将步骤(3’)得到的退火产物进行电泳去除过量的金三棱柱，得到纯化的金蝴蝶结结构。
优选地，步骤(1’)所述的核酸纳米结构采用如第二方面所述的方法进行制备。
优选地，步骤(2’)所述金三棱柱的制备方法包括如下步骤：利用晶种诱导生长法，采用十六烷基三甲基氯化铵为表面活性剂，抗坏血酸为还原剂，使用巯基化DNA序列替代十六烷基三甲基氯化铵，制备得到表面修饰有巯基化DNA序列的金三棱柱。
优选地，步骤(3’)所述核酸纳米结构与所述金三棱柱的摩尔比为1:20。
优选地，步骤(3’)所述退火的起始温度为40-50℃，例如可以是40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃或50℃，优选为45℃。
优选地，步骤(3’)所述退火的终点温度为20-30℃，例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃，优选为25℃。
优选地，步骤(3’)循环的次数为7次。
优选地，步骤(4’)所述电泳包括如下步骤：将退火产物加入1％琼脂糖凝胶中，以15V/cm电压电泳1小时后，切下目的条带，4℃下从凝胶中提取金蝴蝶结结构。
第六方面，本发明提供了一种如第四方面所述金蝴蝶结结构用于单分子拉曼检测。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明通过DNA折纸技术，将脚手架链与订书钉链和捕获链通过碱基互补配对原则杂交，再通过连接链与脚手架链杂交完成自组装，形成六边形核酸纳米结构，该六边形核酸纳米结构稳定性好、寻址修饰性强，锚定的贵金属纳米材料尺寸更大、数量更多、形状更多样；
(2)本发明的六边形核酸纳米结构缩小了贵金属纳米结构之间的距离，使得贵金属纳米结构间的距离小于10nm，在贵金属纳米结构间的局限空间内产生了强烈的电磁场增强，电磁场增强达103，；
(3)本发明的核酸纳米结构和金三棱柱组装形成的金蝴蝶结结构光学性质稳定，克服了现有技术无法有效固定拉曼探针分子的缺陷，在两金三棱柱之间精确固定了一个拉曼探针分子，实现了单分子拉曼检测，拉曼增强因子达1010；
(4)本发明制备金蝴蝶结结构的方法只需将核酸纳米结构和金三棱柱在适宜的温度和时间下进行退火即可实现自组装，方法简便，成本较低，可重复性强。
附图说明
图1是六边形核酸纳米结构的原子力显微镜图；
图2是金蝴蝶结结构的透射电镜图；
图3为单分子拉曼光谱测量示意图；
图4是金蝴蝶结结构的单分子拉曼光谱图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
本发明所用的器材和材料：
器材：梯度PCR仪(Eppendorf，德国)，5810R台式高速离心机(Eppendorf，德国)，紫外可见分光光度计(Shimadzu，日本)，水平凝胶电泳及凝胶成像系统(君意东方，北京)，透射电子显微镜(Tecnei，日本)，原子力显微镜(布鲁克，美国)，扫描电子显微镜(S-4800，Shimadzu，日本)，暗场显微镜(Zeiss，德国)，光谱仪(Princeton，美国)。
原料：本发明合成金三棱柱所用的氯金酸(HAuCl4·4H2O)、硼氢化钠(NaBH4)、碘化钠(NaI)、十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)、抗坏血酸(L-AA)，修饰金三棱柱的三(2-羧乙基)膦(Tris(2-carboxyethyl)phosphine，TCEP)，琼脂糖凝胶电泳过程中所用的琼脂糖和溴化乙锭(Ethidium Bromide，EB)，均购自Sigma-Aldrich公司。
试剂：实验中所用的缓冲溶液有TBE缓冲溶液(pH＝8.0)和TAE/Mg缓冲溶液(pH＝8.0)。其中，1×TAE/Mg缓冲溶液(pH＝8.0)的组分为：4×10-2mol/LTris碱，2×10-2mol/L乙酸，2.0×10-3mol/L EDTA和1.25×10-2mol/L乙酸镁；1×TBE缓冲溶液(pH＝8.0)的组成为：8.9×10-2mol/L Tris碱，8.9×10-2mol/L硼酸和2.0×10-3mol/L EDTA。上述缓冲液配置试剂均为分析纯，购自Sigma-Aldrich公司。
实施例1金三棱柱的合成
金三棱柱的合成采用晶种诱导生长法，表面活性剂为十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)，还原剂为抗坏血酸，具体方法如下：
(1)晶种的合成
取4.7mL浓度为100mM的CTAC，25μL浓度为50mM的HAuCl4至20mL圆底烧瓶中，搅拌均匀后迅速加入300μL浓度为10mM的预冷NaBH4溶液，快速搅拌约2min，溶液逐渐由无色变为棕红色，停止搅拌，将烧瓶移至30℃水浴中静置2小时，备用。
(2)金三棱柱的生长
首先，配置生长液A和生长液B：
生长液A：取1.6mL浓度为100mM的CTAT，8mL超纯水至20mL圆底烧瓶中，混合均匀后加入50μL浓度为50mM的HAuCl4，混合均匀，加入15μL浓度为10mM的NaI溶液，待用；
生长液B：取40mL浓度为50mM的CTAT，500μL浓度为50mM的HAuCl4至50mL圆底烧瓶，混合均匀后加入300μL浓度为10mM的NaI溶液，待用；
其次，将合成的种子溶液用100mM的CTAC稀释10倍后待用；
最后，在生长液A和生长液B中分别加入40μL浓度为100mM的抗坏血酸溶液，摇匀后溶液迅速变为无色；向生长液A中加入600μL稀释后种子溶液，手动摇匀2s溶液变为紫红色；将该混合溶液加入到生长液B中，手动摇匀2s溶液变成蓝色。
(3)金三棱柱的浓缩
将合成的金三棱柱溶液转移至15mL离心管内，在6000rpm下超速离心5分钟，除去上清液后，在离心管内加入10mL去离子水重悬金三棱柱，再次以5000rpm的速度离心5分钟，除去上清液，留底部约500μL浓缩液。通过紫外可见分光光度计测定制备的金三棱柱的浓度。
实施例2金三棱柱的修饰
用浓度为200mM的TCEP分别处理硫醇化的寡核苷酸和硫醇化的PEG-400六小时，将寡核苷酸和PEG-400中的二硫键还原成一硫醇；使用尺寸排阻柱(G-25，GE Healthcare)纯化寡核苷酸，除去TCEP；将纯化后的DNA和PEG分别按摩尔比为10000:1和1000:1加入到含有0.01％(w/v)SDS的OD值为1的金纳米三棱柱溶液中；将混合溶液在30℃下孵育6小时后，缓慢加入浓度为5M的NaCl溶液，使NaCl的终浓度为500mM；将得到的金三棱柱-DNA混合物在8000rpm下离心10分钟，加入1mL含有200mM NaCl的0.5×TBE缓冲液重悬，重复离心三次以除去过量的硫醇化DNA。
实施例3核酸纳米结构的合成
首先，制备六种常规的折纸结构：
将M13主链和相应的订书钉链、捕获链和连接链以1:10的比例混合，利用梯度PCR仪进行退火。反应体系为：75μL超纯水、10μL10×TAE/Mg缓溶液、5μL M13主链、10μL订书钉链和捕获链的混合液；退火程序为：(1)从95℃到70℃，每5℃为一个梯度，每个梯度停留5分钟；(2)从70℃到50℃，每2℃为一个梯度，每个温度梯度停留10分钟；(3)从50℃到20℃，每1℃为一个梯度，每个梯度停留15分钟，整个退火过程共约10个小时。
执行完设定的退火程序后，将三角形折纸结构用100kDa离心柱(MWCO)离心去除过量的捕获链和订书钉链。具体步骤为：将100μL样品加入到300μL1×TAE/Mg缓冲液中，在4700转/分下离心3min，剩余溶液的体积约为100μL，重复离心三遍。
其次，将纯化的六种带有连接链的常规三角形折纸结构等量混合，放入PCR仪中进行退火组装。退火程序为：从45℃到25℃，每1℃为一个梯度，每个梯度停留8分钟，循环8次，持续约24小时。
实施例4核酸纳米结构与金三棱柱的组装与纯化
将六边形核酸纳米结构与DNA功能化的金三棱柱以1:20摩尔比混合，进行退火组装：从45℃至25℃，每1℃为一个梯度，每个梯度停留7分钟，循环8次，持续约24小时，得到金蝴蝶结结构。
将退火产物使用1.0％溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶进行电泳，其中运行缓冲液为含有12mM MgCl2的1×TBE，上样缓冲液为50％甘油，电压为15V/cm，电泳时间1小时。切割目标条带，在4℃下用Freeze-Squeeze柱(Bio-Rad)从凝胶中提取金蝴蝶结结构。
实施例5金蝴蝶结结构的表征
制备得到的六边形核酸纳米结构和金蝴蝶结结构使用透射电子显微镜(TEM)和原子力显微镜(AFM)进行表征。
TEM样品的制备：首先将碳涂覆的铜网(300目，Ted Pella)在等离子清洗机中通过氧负离子进行亲水化处理，然后将10μL样品溶液置于碳涂覆的网格上沉积10分钟，使用滤纸吸去过量的样品，加一滴水去除沉积的盐，使用滤纸吸去过量的水，将铜网放置于干燥器中
AFM样品的制备：将20μL样品沉积到新剥离的云母片(Ted Pella，Inc)上，吸附20分钟，在样品顶部加入10μL 1×TAE/Mg2+缓冲液，并在具有SNL尖端(Veeco Probes，Inc)的Pico-Plus AFM(Molecular Imaging，BrukerTechnologies)上以流体敲击模式进行样品成像。
如图1所示，通过本发明的方法得到了尺寸统一的六角形的核酸纳米结构，核酸纳米结构的产率较高。
如图2所示，黑色的是两根金三棱柱，以棱角对棱角的方式排列在一起，棱柱间的距离小于10nm，核酸纳米结构和金三棱柱形成良好，呈现蝴蝶结形状。
实施例6金三棱柱与Au-Bowtie结构在硅片表面上的固定
在进行拉曼光谱检测和SEM表征前，需要对硅片和ITO玻璃片进行氨基化处理：将标记的硅片和ITO玻璃片分别用丙酮、乙醇和水清洗三遍并超声10min，之后置于食人鱼洗液(浓硫酸与双氧水体积比3:1)中进行亲水化处理，超声30min并用超纯水清洗三遍后，将硅片和ITO玻璃片置于含有10％硅烷化试剂的乙醇溶液中，震荡过夜，用超纯水清洗三遍，待用。
样品的制备：将20μL样品滴加到氨基化的硅片或者ITO玻璃上，氨基和金进行配位反应20分钟，用移液器吸去多余样品，再滴入20μL超纯水，然后吸走，最后将硅片在异丙醇溶液中快速抽离，用轻微氮气将硅片朝同一方向吹干。
实施例7核酸纳米结构-拉曼探针分子-金三棱柱复合结构的单分子拉曼检测
将单个Cy3分子固定在两个金三棱柱的棱角之间，形成金蝴蝶结结构，由此Cy3拉曼探针分子可以准确的置于金三棱柱场强中，将复合结构固定在已做标记的导电ITO玻璃上，进行单分子拉曼检测，其检测示意图如图3所示。
金蝴蝶结结构与拉曼探针分子的单分子拉曼光谱测量在NT-MDT(俄罗斯)拉曼测试系统下进行，测试时使用100倍物镜(空气镜)和633nm激光，测量积分时间为50s/次，激光功率为216μW，获得的光谱已扣除背景。
图4所示为单个金蝴蝶结结构的单分子拉曼光谱图，可以看到金蝴蝶结结构在金三棱柱的LSPR峰值处有明显的信号，产生的电磁场增强达103，拉曼增强因子达1010。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种核酸纳米结构，其特征在于，所述核酸纳米结构为通过DNA折纸技术构建的六个三角形DNA折纸结构组装形成的六边形DNA纳米结构，具体是通过脚手架链与订书钉链和捕获链进行杂交，再通过连接链分别与六个三角形DNA折纸结构的脚手架链杂交而自组装形成的六边形DNA纳米结构。
2.根据权利要求1所述的核酸纳米结构，其特征在于，所述核酸纳米结构的边长为100-150nm，优选为120nm；
优选地，所述脚手架链与所述订书钉链、所述脚手架链与所述捕获链、所述脚手架链与所述连接链通过碱基互补配对原则进行杂交；
优选地，所述脚手架链为M13噬菌体基因组DNA；
优选地，所述订书钉链为人工合成的寡核苷酸序列；
优选地，所述捕获链为人工合成的寡核苷酸序列；
优选地，所述连接链包含二硫键和/或限制性内切酶的特异性识别位点。
3.一种制备如权利要求1或2所述核酸纳米结构的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将所述脚手架链溶液与所述订书钉链、捕获链和连接链的混合溶液按照摩尔比为1:(1-20)混合均匀；
(2)以85-98℃为起始温度退火至15-30℃，采用离心柱离心去除过量的订书钉链和捕获链；
(3)将纯化后的六种三角形DNA折纸结构等量混合后，以40-50℃为起始温度退火至20-30℃，进行梯度PCR循环，制得所述核酸纳米结构。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述脚手架链溶液与所述订书钉链、捕获链和连接链的混合溶液的摩尔比为1:(1-10)，优选为1:2；
优选地，步骤(2)所述退火的起始温度为90-98℃，优选为95℃；
优选地，步骤(2)所述退火的终点温度为15-25℃，优选为20℃；
优选地，步骤(2)所述退火的持续时间为5-20h，优选为8-15h，最优为10h；
优选地，步骤(3)所述退火的起始温度为43-48℃，优选为45℃；
优选地，步骤(3)所述退火的终点温度为22-28℃，优选为25℃；
优选地，步骤(3)所述循环的次数为2-10次，优选为4-9次，最优为8次；
优选地，步骤(3)所述退火的持续时间为20-30h，优选为22-25h，最优为24h。
5.一种如权利要求1或2所述核酸纳米结构用于组装贵金属纳米结构。
6.一种金蝴蝶结结构，其特征在于，所述金蝴蝶结结构包括贵金属纳米结构和如权利要求1或2所述的核酸纳米结构，所述贵金属纳米结构表面修饰有寡核苷酸序列，所述贵金属纳米结构与所述核酸纳米结构通过寡核苷酸序列进行组装。
7.根据权利要求6所述的金蝴蝶结结构，其特征在于，所述贵金属纳米结构为表面酸性修饰有巯基化DNA序列的金棱柱，所述巯基化DNA序列与所述捕获链互补；
优选地，所述金棱柱包括金三棱柱、金四棱柱、金五棱柱或金六棱柱中的任意一种或至少两种的组合，优选为金三棱柱；
优选地，所述金三棱柱的长度为50-100nm，优选为80nm；
优选地，所述金三棱柱的尖端宽度为1-6nm，优选为2nm。
8.一种制备如权利要求6或7所述金蝴蝶结结构的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1’)制备核酸纳米结构；
(2’)制备金三棱柱；
(3’)将步骤(1’)制备的核酸纳米结构与步骤(2’)制备的金三棱柱按照摩尔比为1:(10-30)混合均匀后，进行退火，循环5-8次；
(4’)将步骤(3’)得到的退火产物进行电泳去除过量的金三棱柱，得到纯化的金蝴蝶结结构。
9.根据权利要求8任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1’)所述的核酸纳米结构采用如权利要求3-5中任一项所述的方法进行制备；
优选地，步骤(2’)所述金三棱柱的制备方法包括如下步骤：利用晶种诱导生长法，采用十六烷基三甲基氯化铵为表面活性剂，抗坏血酸为还原剂，使用巯基化DNA序列替代十六烷基三甲基氯化铵，制备得到表面修饰有巯基化DNA序列的金三棱柱；
优选地，步骤(3’)所述核酸纳米结构与所述金三棱柱的摩尔比为1:20；
优选地，步骤(3’)所述退火的起始温度为40-50℃，优选为45℃；
优选地，步骤(3’)所述退火的终点温度为20-30℃，优选为25℃；
优选地，步骤(3’)循环的次数为7次；
优选地，步骤(4’)所述电泳包括如下步骤：将退火产物加入1％琼脂糖凝胶中，以15V/cm电压电泳1小时后，切下目的条带，4℃下从凝胶中提取金蝴蝶结结构。
10.一种如权利要求5或6所述金蝴蝶结结构用于单分子拉曼检测。
CN201710859574.8A 2017-09-21 2017-09-21 一种核酸纳米结构及其制备方法和应用 Active CN107488661B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710859574.8A CN107488661B (zh) 2017-09-21 2017-09-21 一种核酸纳米结构及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710859574.8A CN107488661B (zh) 2017-09-21 2017-09-21 一种核酸纳米结构及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107488661A true CN107488661A (zh) 2017-12-19
CN107488661B CN107488661B (zh) 2020-12-15

Family

ID=60652776

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710859574.8A Active CN107488661B (zh) 2017-09-21 2017-09-21 一种核酸纳米结构及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107488661B (zh)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108310391A (zh) * 2018-04-23 2018-07-24 国家纳米科学中心 一种核酸蛋白纳米复合物及其制备方法和应用
CN108899269A (zh) * 2018-07-10 2018-11-27 重庆京东方显示照明有限公司 一种ito基片的亲水处理方法
CN110057806A (zh) * 2019-04-25 2019-07-26 南京邮电大学 基于表面增强拉曼效应的dna折纸模板组装纳米金立方形成二聚体结构的方法
CN110551725A (zh) * 2018-06-04 2019-12-10 国家纳米科学中心 一种抗凝血的dna纳米复合结构及其制备方法和应用
CN111302349A (zh) * 2020-02-28 2020-06-19 国家纳米科学中心 一种图案化二氧化硅纳米结构的合成方法及其应用
CN112143727A (zh) * 2020-09-03 2020-12-29 华中科技大学 Dna折纸结构、其闭合和释放方法及作为药物载送系统应用
CN114177312A (zh) * 2021-12-14 2022-03-15 国家纳米科学中心 一种核酸纳米药物载体及其制备方法和应用
CN115011593A (zh) * 2022-06-13 2022-09-06 国家纳米科学中心 一种高阶核酸结构及其制备方法和应用
US11513076B2 (en) 2016-06-15 2022-11-29 Ludwig-Maximilians-Universität München Single molecule detection or quantification using DNA nanotechnology

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104324375A (zh) * 2014-08-26 2015-02-04 国家纳米科学中心 一种用于活体光声成像的核酸纳米结构载体-贵金属光敏造影剂复合物及其制备方法和应用
CN106893722A (zh) * 2017-02-20 2017-06-27 国家纳米科学中心 一种刺激响应型核酸纳米结构载体手性贵金属纳米复合物及其制备方法和应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104324375A (zh) * 2014-08-26 2015-02-04 国家纳米科学中心 一种用于活体光声成像的核酸纳米结构载体-贵金属光敏造影剂复合物及其制备方法和应用
CN106893722A (zh) * 2017-02-20 2017-06-27 国家纳米科学中心 一种刺激响应型核酸纳米结构载体手性贵金属纳米复合物及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANTTI-PEKKA ESKELINEN: ""Self-Assembled Silver Nanoparticles in a Bow-Tie Antenna Configuration"", 《NANO SMALL MICRO》 *
PAUL W. K. ROTHEMUND: ""Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns"", 《NATRUE》 *
杨志林 等: ""金纳米粒子光学性质中的尺寸和形状效应"", 《光散射学报》 *
田仙花 等: ""银纳米三棱柱二聚体的光学性质研究"", 《光散射学报》 *

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11513076B2 (en) 2016-06-15 2022-11-29 Ludwig-Maximilians-Universität München Single molecule detection or quantification using DNA nanotechnology
CN108310391B (zh) * 2018-04-23 2020-03-27 国家纳米科学中心 一种核酸蛋白纳米复合物及其制备方法和应用
CN108310391A (zh) * 2018-04-23 2018-07-24 国家纳米科学中心 一种核酸蛋白纳米复合物及其制备方法和应用
CN110551725A (zh) * 2018-06-04 2019-12-10 国家纳米科学中心 一种抗凝血的dna纳米复合结构及其制备方法和应用
CN110551725B (zh) * 2018-06-04 2021-06-08 国家纳米科学中心 一种抗凝血的dna纳米复合结构及其制备方法和应用
CN108899269A (zh) * 2018-07-10 2018-11-27 重庆京东方显示照明有限公司 一种ito基片的亲水处理方法
CN110057806A (zh) * 2019-04-25 2019-07-26 南京邮电大学 基于表面增强拉曼效应的dna折纸模板组装纳米金立方形成二聚体结构的方法
CN110057806B (zh) * 2019-04-25 2022-03-04 南京邮电大学 基于表面增强拉曼效应的dna折纸模板组装纳米金立方形成二聚体结构的方法
CN111302349A (zh) * 2020-02-28 2020-06-19 国家纳米科学中心 一种图案化二氧化硅纳米结构的合成方法及其应用
CN112143727A (zh) * 2020-09-03 2020-12-29 华中科技大学 Dna折纸结构、其闭合和释放方法及作为药物载送系统应用
CN114177312A (zh) * 2021-12-14 2022-03-15 国家纳米科学中心 一种核酸纳米药物载体及其制备方法和应用
CN114177312B (zh) * 2021-12-14 2024-02-13 国家纳米科学中心 一种核酸纳米药物载体及其制备方法和应用
CN115011593A (zh) * 2022-06-13 2022-09-06 国家纳米科学中心 一种高阶核酸结构及其制备方法和应用
CN115011593B (zh) * 2022-06-13 2024-03-12 国家纳米科学中心 一种高阶核酸结构及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN107488661B (zh) 2020-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107488661A (zh) 一种核酸纳米结构及其制备方法和应用
Zhang et al. Preparation of high-quality biocompatible carbon dots by extraction, with new thoughts on the luminescence mechanisms
Liu et al. Development of nitrogen and sulfur-doped carbon dots for cellular imaging
KR101467667B1 (ko) 헤드부 및 바디부로 이루어진 나노스노우맨 형태의 나노입자, 이의 제조방법 및 이를 이용한 검출 방법
Yuan et al. A fluorescence switch sensor used for D-Penicillamine sensing and logic gate based on the fluorescence recovery of carbon dots
CN106893722B (zh) 一种刺激响应型核酸纳米结构载体手性贵金属纳米复合物及其制备方法和应用
Pienpinijtham et al. Micrometer-sized gold nanoplates: starch-mediated photochemical reduction synthesis and possibility of application to tip-enhanced Raman scattering (TERS)
US10209194B2 (en) Raman scattering nanoprobes
Hauwiller et al. Tracking the effects of ligands on oxidative etching of gold nanorods in graphene liquid cell electron microscopy
Fujita et al. Tip-enhanced Raman scattering microscopy: Recent advance in tip production
Li et al. A reversible fluorescent chemosensor for selective and sequential detection of copper ion and sulfide
CN106770049A (zh) 基于DNA折纸模板和纳米金棒构建Dolmen结构的方法
Fakhouri et al. Sub-100 nanometer silver doped gold–cysteine supramolecular assemblies with enhanced nonlinear optical properties
CN108085370A (zh) 一种单颗粒生物探针的构建方法及其用途
Hu et al. Combining gold nanoparticle antennas with single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET) to study DNA hairpin dynamics
Rai et al. Biocompatible gellucire® inspired bimetallic nanohybrids for augmented fluorescence emission based on graphene oxide interfacial plasmonic architectures
Nafie Recent advances in linear and nonlinear Raman spectroscopy. Part VII
CN104788542A (zh) 一种寡肽及其保护的荧光金纳米簇、其制备方法和应用
Zhu et al. Highly photostable and biocompatible graphene oxides with amino acid functionalities
Li et al. A highly active SERS sensing substrate: core–satellite assembly of gold nanorods/nanoplates
Olejnik et al. Spectroscopic studies of plasmon coupling between photosynthetic complexes and metallic quantum dots
Wang et al. An effective surface-enhanced Raman scattering template based on gold nanoparticle/silicon nanowire arrays
CN109490579A (zh) 研究磁场对dna二维折纸结构稳定性影响的方法
Boiko et al. Vibrational spectra of DNA in the confined interglobular volume of photonic crystal
Yang et al. Self-assembled monolayer of NAD at silver surface: a Raman mapping study

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant