CN111019941B - 一种dna纳米材料及其制备方法和应用 - Google Patents

一种dna纳米材料及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111019941B
CN111019941B CN202010068347.5A CN202010068347A CN111019941B CN 111019941 B CN111019941 B CN 111019941B CN 202010068347 A CN202010068347 A CN 202010068347A CN 111019941 B CN111019941 B CN 111019941B
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
nano
nucleotide sequence
follows
concentration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010068347.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111019941A (zh
Inventor
吴再生
陈畅
张书馨
李应福
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fuzhou University
Original Assignee
Fuzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fuzhou University filed Critical Fuzhou University
Priority to CN202010068347.5A priority Critical patent/CN111019941B/zh
Publication of CN111019941A publication Critical patent/CN111019941A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111019941B publication Critical patent/CN111019941B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y40/00—Manufacture or treatment of nanostructures
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Composite Materials (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种DNA纳米材料及其制备方法和应用，属于纳米材料技术领域。本发明在DNA折纸理论基础上设计了DNA纳米条纹带，该纳米条纹带由特殊结构的环模板经滚环反应扩增得到的滚环扩增反应产物自组装形成DNA纳米晶格，在DNA纳米晶格上修饰靶向核仁素的AS1411适配体形成DNA纳米材料DNA纳米条晶格带‑AS1411复合物；进一步将DNA纳米条晶格带‑AS1411复合物与纳米金球结合形成DNA纳米材料纳米金‑DNA纳米晶格带复合物。制备所得DNA纳米材料作为靶向药物载体在肿瘤诊疗中的广泛应用价值。

Description

一种DNA纳米材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于纳米材料技术领域，具体涉及一种DNA纳米材料及其制备方法和应用。
背景技术
众所周知，在当今人类生命健康正面临着癌症等多种重大疑难疾病的威胁，传统意义上的抗癌药物存在着极大的潜在威胁。为了改善传统药物的性能，弥补传统抗癌药物的缺陷，发展适宜的药物递送载体成为当今生物技术与医药领域研究者的关注热点。
传统的药物输送载体如脂质体，高分子聚合物等特异性低，存在较大的非靶细胞毒性；无机纳米粒子则细胞摄取率低，胞内稳定性差；近年来，运用DNA组装而成纳米材料作为药物运送载体可以降低细胞组织毒性，降低药物输送途径的难题，并有望实现协同运输，然而，目前的DNA纳米结构仍然有结构设计复杂，载药量低等诸多缺陷。
基于自组装DNA纳米技术的DNA纳米结构在纳米载体领域表现出了巨大的前景。DNA折纸术是近年来飞速发展，被广泛应用于纳米材料组装的全新DNA自组装的策略，是DNA纳米技术和DNA自组装领域的跨越式的进展。与传统的DNA自组装技术不同的是，DNA折纸术利用一根长的DNA单链（称为手脚架链）与一系列短的DNA单链（称为订书钉链）间的碱基互补配对，使长的DNA单链发生折叠弯曲，最终形成特定结构。该技术能够精准构造出高度复杂的纳米图案和结构，在DNA纳米材料构建领域中具有广泛的潜在应用。为简化DNA折纸术以RCA(rolling circle amplification）产物的长的DNA单链做为手脚架链。
本发明在DNA折纸理论基础上设计了DNA纳米条纹带，该纳米条纹带由特殊结构的环模板经滚环反应扩增得到的RCA(rolling circle amplification）产物自组装形成，将纳米条纹带与纳米金球结合，成功构建出一种能高效载入抗癌药物阿霉素，且能通过AS1411适配体精确靶向MCF-7细胞的纳米级药物输送载体Au-R2A-DOX。
发明内容
本发明的目的在于提供一种DNA纳米材料及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种介导合成的DNA纳米材料的环状模板的制备方法：将浓度为10 µM的成环链pL1 和pL2各 1µL，浓度为10 µM的封口模板T1和 T2各1µL，2 µL T4 DNA连接酶缓冲液加入到13 µL ddH2O中，充分混合后，将所得溶液在90℃退火5分钟，然后冷却至室温；随后，加入1 µL 350 U / µL T4 DNA连接酶，并在16℃下孵育16小时，然后在65°C下加热10分钟使连接酶变性，制得环状模板。
上述成环链pL1 的核苷酸序列为：PL1：5’-AAACGCATGCAAAAAGATCTATAAA TAGCGAAAACTAGAAAAAAAGCATGCGAACCATAT-3’；成环链pL2的核苷酸序列为：PL2：5’-AAAACTTAGGAAAAATTCTAGTAAATAGCGAAAATAGATCAAAAACCTAAGTAAA CATAT-3’；封口模板T1的核苷酸序列为：T1 ：5’-GATCTTTTTGCATGCGTTTATATGTTTACT-3’；封口模板T2的核苷酸序列为：T2：5’-AGAATTTTTCCTAAGTTTTATATGGTTCGC-3’。
上述环状模板的核苷酸序列为：5’-AAACGCATGCAAAAAGATCTATAAATAGCGAAAACTAGAAAAAAAGCATGCGAACCATATAAAACTTAGGAAAAATTCTAGTAAATAGCGAAAATAGATCAAAAACCTAAGTAAACATAT-3’
一种环状模板介导合成的DNA纳米材料DNA纳米条晶格带-AS1411复合物（RDL2-AS1411）的制备方法：将2μL浓度为15μM的滚环扩增（RCA）产物组成单元，2μL浓度为10μM的SS1，2μL浓度为10μM的SS1-AS1411核酸适配体，2μL浓度为10μM的SS2和2μL含125mM Mg2+的10×TAE缓冲液依次添加到12μLddH2O中并充分混合，然后将所得混合溶液在90℃下加热5分钟，然后冷却至室温制得DNA纳米材料RDL2-AS1411；
所述滚环扩增（RCA）产物的制备方法为：环状模板20ul，添加4 µL的10x phi29缓冲液，1 µL 10 mM的dNTP和0.5 µL10 U /μL的phi29聚合酶，添加ddH2O至总体积40μL，30℃温育30分钟；接着65℃下加热10分钟使phi29聚合酶失活；最后用苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）萃取RCA产物，用乙醇沉淀并溶于1xTE缓冲液中；
制备所得滚环扩增（RCA）产物的核苷酸序列为：5’-ATATGTTTACTTAGGTTTTTGATCTATTTTCGCTATTTACTAGAATTTTTCCTAAGTTTTATATGGTTCGCATGCTTTTTTTCTAGTTTTCGCTATTTATAGATCTTTTTGCATGCGTTT-3’。
一种环状模板介导合成的纳米金-DNA纳米晶格带复合物（Au-R2A）DNA纳米材料的制备方法，包括以下步骤：
（1）纳米金接引物（Au-Primer）：100ul浓度为10uM的修饰了巯基的引物序列与500uL纳米金均匀混合反应，得到纳米金接引物Au-Primer；
（2）纳米金滚环产物（Au-RP）：将步骤（1）修饰了滚环引物的纳米金接引物与环状模板按摩尔比为1:100混合，然后取20ul混合物添加4µL的10x phi29缓冲液，1 µL浓度为10mM的dNTP和0.5 µL10 U /μL的phi29聚合酶，添加ddH2O至40μL，30℃温育30分钟，接着65℃下加热10分钟使phi29聚合酶失活，得到的纳米金滚环产物Au-RP；
（3）纳米金-DNA纳米晶格带复合物（Au-R2A）：120uL步骤（2）制备所得纳米金滚环产物Au-RP与20uL 浓度为10µM SS1-AS1411，20uL 浓度为10µM的SS2混合，90℃退火5min后缓慢降至室温得到纳米金-DNA纳米晶格带复合物（Au-R2A）纳米材料。
上述制备方法中所述SS1-AS1411核酸适配体的核苷酸序列为：5’-TAGCGTAGCGTAGCGTTTTTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’。；所述SS2的核苷酸序列为：5’-TATACTATACTATAC-3’。
上述制备方法中所述修饰了巯基的引物序列，其核苷酸序列为：5’-SH-AAAAAAAAAACCCCCCCCCCGATCTTTTTGCATGCGTTTATATGTTTACT-3’；
上述方法制备所得的纳米材料DNA纳米条晶格带-AS1411（RDL2-AS1411）及纳米金-DNA纳米晶格带复合物（Au-R2A）作为靶向药物载体的应用。
一种DNA 靶向药物的制备方法：40uL合成的DNA纳米材料DNA纳米条晶格带-AS1411（RDL2-AS1411）或纳米金-DNA纳米晶格带复合物（Au-R2A）加入到160uL浓度为2mM的阿霉素( Doxorubicin)溶液中，37℃孵育24小时离心得到DNA 靶向药物RDL2-AS1411-DOX，Au-R2A-DOX。
上述一种DNA 靶向药物在肿瘤诊疗中的应用。
本发明的优点在于：
本发明提供了一种DNA纳米材料及其制备方法和应用。本发明DNA折纸理论基础上，以环状模板经过滚环扩增（RCA）反应后生成滚环扩增产物的组成单元；滚环扩增产物的组成单元能自组装折叠形成DNA纳米晶格，两条短侧边链SS1 和SS2与DNA纳米晶格外侧的未参与碱基互补配对的单链DNA互补配对形成DNA纳米晶格带RDL2，（如图1所示）。DNA纳米晶格带RDL2携带能够靶向核仁素的AS1411适配体，形成纳米材料RDL2-AS1411。进一步的先将修饰了巯基的引物修饰在Au上，然后与环状模板经过滚环扩增（RCA）反应直接在纳米金的表面形成滚环扩增产物的组成单元，之后经自组装折叠，并增两条短侧边链SS1 和SS2，以及能够靶向核仁素的AS1411适配体形成纳米材料Au-R2A。纳米材料RDL2-AS1411和Au-R2A作为纳米级药物运输载体能够携带药物靶向运输，在医药领域具有广泛的应用价值。
附图说明
图1DNA纳米材料RDL2的结构示意图。
图2DNA纳米材料负载阿霉素结果图。
图3DNA靶向药物递送药物的细胞成像图。图中第一行是细胞核染料hoechst通道图（405nm）；第二行是DOX通道图（488nm）；第三行是第一，二行的叠加overlay。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。
实施例1
一种介导合成的DNA纳米材料的环状模板的制备方法：将浓度为10 µM的成环链pL1 和pL2各 1µL，浓度为10 µM的封口模板T1和 T2各1µL，2 µL T4 DNA连接酶缓冲液加入到13 µL ddH2O中，充分混合后，将所得溶液在90℃退火5分钟，然后冷却至室温；随后，加入1 µL 350 U / µL T4 DNA连接酶，并在16℃下孵育16小时，然后在65°C下加热10分钟使连接酶变性，制得环状模板。
上述成环链pL1 的核苷酸序列为：PL1：5’-AAACGCATGCAAAAAGATCTATAAATAGCGAAAACTAGAAAAAAAGCATGCGAACCATAT-3’；成环链PL2的核苷酸序列为：PL2：5’-AAAACTTAGGAAAAATTCTAGTAAATAGCGAAAATAGATCAAAAACCTAAGTAAA CATAT-3’；封口模板T1的核苷酸序列为：T1 ：5’-GATCTTTTTGCATGCGTTTATATGTTTACT-3’；封口模板T2的核苷酸序列为：T2：5’-AGAATTTTTCCTAAGTTTTATATGGTTCGC-3’。
上述环状模板的核苷酸序列为：5’-AAACGCATGCAAAAAGATCTATAAATAGCGAAAACTAGAAAAAAAGCATGCGAACCATATAAAACTTAGGAAAAATTCTAGTAAATAGCGAAAATAGATCAAAAACCTAAGTAAACATAT-3’。
实施例2
一种环状模板介导合成的DNA纳米条晶格带-AS1411复合物（RDL2-AS1411）DNA纳米材料的制备方法：将2μL浓度为15μM的滚环扩增（RCA）产物，2μL浓度为10μM的SS1，2μL浓度为10μM的SS1-AS1411核酸适配体，2μL浓度为10μM的SS2和2μL含125mM Mg2+的10×TAE缓冲液依次添加到12μLddH2O中并充分混合，然后将所得混合溶液在90℃下加热5分钟，然后冷却至室温制得DNA纳米材料RDL2-AS1411。
上述滚环扩增（RCA）产物的制备方法为：实施例1制备的环状模板20ul，添加4 µL的10x phi29缓冲液，1 µL 10 mM的dNTP和0.5 µL10 U /μL的phi29聚合酶，添加ddH2O至总体积40μL，30℃温育30分钟；接着65℃下加热10分钟使phi29聚合酶失活；最后用苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）萃取RCA产物，用乙醇沉淀并溶于1xTE缓冲液中。
制备所得滚环扩增（RCA）产物的核苷酸序列为：5’-ATATGTTTACTTAGGTTTTTGATCTATTTTCGCTATTTACTAGAATTTTTCCTAAGTTTTATATGGTTCGCATGCTTTTTTTCTAGTTTTCGCTATTTATAGATCTTTTTGCATGCGTTT-3’。
上述制备方法中所述SS1-AS1411核酸适配体的核苷酸序列为：5’-TAGCGTAGCGTAGCGTTTTTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’。；所述SS2的核苷酸序列为：5’-TATACTATACTATAC-3’。
实施例3
一种环状模板介导合成的纳米金-DNA纳米晶格带复合物（Au-R2A）DNA纳米材料的制备方法，包括以下步骤：
（1）纳米金接引物（Au-Primer）：100ul浓度为10uM的修饰了巯基的引物序列与500uL纳米金均匀混合反应，得到纳米金接引物Au-Primer；
（2）纳米金滚环产物（Au-RP）：将步骤（1）修饰了滚环引物的纳米金接引物与实施例1制备的环状模板按摩尔比为1:100混合，然后取20ul混合物添加4µL的10x phi29缓冲液，1 µL浓度为10 mM的dNTP和0.5 µL10 U /μL的phi29聚合酶，添加ddH2O至40μL，30℃温育30分钟，接着65℃下加热10分钟使phi29聚合酶失活，得到的纳米金滚环产物Au-RP；
（3）纳米金-DNA纳米晶格带复合物（Au-R2A）：120uL步骤（2）制备所得纳米金滚环产物Au-RP与20uL 浓度为10µM SS1-AS1411，20uL 浓度为10µM的SS2混合，90℃退火5min后缓慢降至室温得到纳米金-DNA纳米晶格带复合物（Au-R2A）纳米材料。
上述步骤（1）中所述修饰了巯基的引物序列，其核苷酸序列为：5’-SH-AAAAAAAAAACCCCCCCCCCGATCTTTTTGCATGCGTTTATATGTTTACT-3’。
上述步骤（3）中，所述所述SS1-AS1411核酸适配体的核苷酸序列为：5’-TAGCGTAGCGTAGCGTTTTTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’。
实施例4 药物负载实验
将160 µL阿霉素（DOX）溶液（2 mM）分别在40 µL实施例2制备的DNA纳米条晶格带-AS1411（RDL2-AS1411）纳米材料和实施例3制备的纳米金-DNA纳米晶格带复合物（Au-R2A）纳米材料中37 ℃孵育24小时，之后将样品在25°C下离心5分钟（6,000 g），并将深红色沉淀溶于200 µL PBS中，制备DNA 靶向药物RDL2-AS1411-DOX和Au-R2A-DOX（图2）。
同时，为验证靶向药物的靶向性，设置对照实验：
对照纳米材料为：未修饰AS1411适配体的DNA纳米条晶格带RDL2和纳米金-DNA纳米晶格带复合物Au-RDL2。
DNA纳米条晶格带RDL2的制备方法为：将实施例2DNA纳米条晶格带-AS1411（RDL2-AS1411）纳米材料的制备方法中的SS1-AS1411核酸适配体替换为SS1短核苷酸链，SS1的核苷酸序列为：5’-TAGCGTAGCGTAGCG-3’；其余步骤同实施例2。
纳米金-DNA纳米晶格带复合物Au-RDL2的制备方法为：将实施例3 DNA纳米条晶格带-AS1411（RDL2-AS1411）纳米材料的制备方法中的SS1-AS1411核酸适配体替换为SS1短核苷酸链，SS1的核苷酸序列为：5’-TAGCGTAGCGTAGCG-3’；其余步骤同实施例3。
未修饰AS1411适配体的DNA纳米条晶格带RDL2和纳米金-DNA纳米晶格带复合物Au-RDL2负载药物：将160 µL阿霉素（DOX）溶液（2 mM）分别在40 µL未修饰AS1411适配体的DNA纳米条晶格带RDL2和纳米金-DNA纳米晶格带复合物Au-RDL2材料中37 ℃孵育24小时，之后将样品在25°C下离心5分钟（6,000 g），并将深红色沉淀溶于200 µL PBS中，制备DNA靶向药物RDL2-DOX和Au-RDL2-DOX。
实施例5 细胞内原位检测
MCF-7细胞先在24孔板内爬片（培养基成分为10%（v/v）胎牛血清（FBS），100U/mL青霉素（penicillin），100μg/mL链霉素（streptomycin），在37℃，5%的CO2环境下培养），培养24小时后加入实施例4制备的药物（DOX浓度为40µM）（RDL2-AS1411-DOX、RDL2-DOX、Au-R2A-DOX、Au-RDL2-DOX），然后在无胎牛血清与双抗(100U/mL青霉素,100μg/mL链霉素）的DMEM培养基中37℃，5%的CO2环境下培养2小时，之后除去培养基，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定15分钟用PBS清洗3次，Hochest荧光染料染核10分钟，PBS清洗3次，封片后拍摄共聚焦。结果见图3。从图3可以看出，Au-R2A-DOX组在MCF-7细胞中观测到大量红色DOX荧光，RDL2-AS1411-DOX组的荧光亮度次之，RDL2-DOX和Au-RDL2-DOX组荧光亮度很低。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 一种DNA纳米材料及其制备方法和应用
<130> 10
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 60
<212> DNA
<213> PL1
<400> 1
aaacgcatgc aaaaagatct ataaatagcg aaaactagaa aaaaagcatg cgaaccatat 60
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> PL2
<400> 2
aaaacttagg aaaaattcta gtaaatagcg aaaatagatc aaaaacctaa gtaaacatat 60
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> T1
<400> 3
gatctttttg catgcgttta tatgtttact 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> T2
<400> 4
agaatttttc ctaagtttta tatggttcgc 30
<210> 5
<211> 120
<212> DNA
<213> 环状模板
<400> 5
aaacgcatgc aaaaagatct ataaatagcg aaaactagaa aaaaagcatg cgaaccatat 60
aaaacttagg aaaaattcta gtaaatagcg aaaatagatc aaaaacctaa gtaaacatat 120
<210> 6
<211> 120
<212> DNA
<213> 滚环扩增产物
<400> 6
atatgtttac ttaggttttt gatctatttt cgctatttac tagaattttt cctaagtttt 60
atatggttcg catgcttttt ttctagtttt cgctatttat agatcttttt gcatgcgttt 120
<210> 7
<211> 52
<212> DNA
<213> 修饰了巯基的引物序列
<400> 7
shaaaaaaaa aacccccccc ccgatctttt tgcatgcgtt tatatgttta ct 52
<210> 8
<211> 47
<212> DNA
<213> SS1-AS1411核酸适配体
<400> 8
tagcgtagcg tagcgttttt tggtggtggt ggttgtggtg gtggtgg 47
<210> 9
<211> 15
<212> DNA
<213> SS2
<400> 9
tatactatac tatac 15
<210> 10
<211> 15
<212> DNA
<213> SS1
<400> 10
tagcgtagcg tagcg 15

Claims (6)

1.一种环状模板介导合成DNA纳米条晶格带-AS1411复合物RDL2-AS1411 DNA纳米材料的方法，其特征在于：将2μL浓度为15μM的滚环扩增产物，2μL浓度为10μM的SS1，2μL浓度为10μM的SS1-AS1411核酸适配体，2μL浓度为10μM的SS2和2μL含125mM Mg2+的10×TAE缓冲液依次添加到12μL ddH2O中并充分混合，然后将所得混合溶液在90℃下加热5分钟，然后冷却至室温制得DNA纳米材料RDL2-AS1411；
所述滚环扩增产物的制备方法为：环状模板20ul，添加4 µL的10x phi29缓冲液，1µL10mM的dNTP和0.5µL 10U/μL的phi29聚合酶，添加ddH2O至总体积40μL，30℃温育30分钟；接着65℃下加热10分钟使phi29聚合酶失活；最后用体积比为25：24：1的苯酚/氯仿/异戊醇萃取滚环扩增产物，用乙醇沉淀并溶于1xTE缓冲液中；
所述滚环扩增产物的核苷酸序列为：5’-ATATGTTTACTTAGGTTTTTGATCTATTTTCGCTATTTACTAGAATTTTTCCTAAGTTTTATATGGTTCGCATGCTTTTTTTCTAGTTTTCGCTATTTATAGATCTTTTTGCATGCGTTT-3’；
所述SS1-AS1411核酸适配体的核苷酸序列为：5’-TAGCGTAGCGTAGCGttttttGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’，所述SS2的核苷酸序列为：5¢-TATACTATACTATAC-3¢；所述SS1的核苷酸序列为：5’-TAGCGTAGCGTAGCG-3’；
所述环状模板的核苷酸序列为：5’-AAACGCATGCAAAAAGATCTATAAATAGCGAAAACTAGAAAAAAAGCATGCGAACCATATAAAACTTAGGAAAAATTCTAGTAAATAGCGAAAATAGATCAAAAACCTAAGTAAACATAT-3’；
所述环状模板的制备方法为：将浓度为10µM的成环链pL1和pL2各1µL，浓度为10µM的封口模板T1和 T2各1µL，2µL T4 DNA连接酶缓冲液加入到13µL ddH2O中，充分混合后，将所得溶液在90℃退火5分钟，然后冷却至室温；随后，加入1µL 350U/µL T4 DNA连接酶，并在16℃下孵育16小时，然后在65℃下加热10分钟使连接酶变性，制得环状模板；所述成环链pL1 的核苷酸序列为：pL1：5’-aaaCGCATGCaaaaaGATCTATaaaTAGCGaaaACTAGAAaaaaaGCATGCGaacCATAT-3’；成环链pL2的核苷酸序列为：pL2：5’-aaaACTTAGGaaaaaTTCTAGTaaaTAGCGaaaATAGATCaaaaaCCTAAGTaaaCATAT-3’；封口模板T1的核苷酸序列为：T1 ：5’-GATCtttttGCATGCGtttATATGtttACT-3’；封口模板T2的核苷酸序列为：T2：5’-AGAAtttttCCTAAGTtttATATGgttCGC-3’ 。
2.一种环状模板介导合成纳米金-DNA纳米晶格带复合物Au-R2A DNA纳米材料的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）纳米金接引物Au-Primer的制备：100ul浓度为10uM的修饰了巯基的引物序列与500uL纳米金均匀混合，得到纳米金接引物Au-Primer；
（2）纳米金滚环产物Au-RP的制备：将步骤（1）修饰了滚环引物的纳米金接引物与环状模板按摩尔比为1：100混合，然后取20ul混合物添加4µL的10x phi29缓冲液，1µL浓度为10mM的dNTP和0.5µL 10U/μL的phi29聚合酶，添加ddH2O至40μL，30℃温育30分钟，接着65℃下加热10分钟使phi29聚合酶失活，得到的纳米金滚环产物Au-RP；
（3）纳米金DNA纳米条带复合物Au-R2A的制备：120uL步骤（2）制备所得纳米金滚环产物Au-RP与20uL浓度为10µM SS1-AS1411，20uL浓度为10µM的SS2混合，90℃退火5min后缓慢降至室温得到纳米金-DNA纳米晶格带复合物Au-R2A纳米材料；
步骤（1）中所述修饰了巯基的引物序列，其核苷酸序列为：5’-SH-AAAAAAAAAACCCCCCCCCCGATCTTTTTGCATGCGTTTATATGTTTACT-3’；
步骤（2）中所述环状模板的核苷酸序列为：5’-AAACGCATGCAAAAAGATCTATAAATAGCGAAAACTAGAAAAAAAGCATGCGAACCATATAAAACTTAGGAAAAATTCTAGTAAATAGCGAAAATAGATCAAAAACCTAAGTAAACATAT-3’；
所述环状模板的制备方法为：将浓度为10µM的成环链pL1和pL2各1µL，浓度为10µM的封口模板T1和T2各1µL，2µL T4 DNA连接酶缓冲液加入到13µL ddH2O中，充分混合后，将所得溶液在90℃退火5分钟，然后冷却至室温；随后，加入1µL 350U/µL T4 DNA连接酶，并在16℃下孵育16小时，然后在65℃下加热10分钟使连接酶变性，制得环状模板；所述成环链pL1的核苷酸序列为：pL1：5’-aaaCGCATGCaaaaaGATCTATaaaTAGCGaaaACTAGAAaaaaaGCATGCGaacCATAT-3’；成环链pL2的核苷酸序列为：pL2：5’-aaaACTTAGGaaaaaTTCTAGTaaaTAGCGaaaATAGATCaaaaaCCTAAGTaaaCATAT-3’；封口模板T1的核苷酸序列为：T1 ：5’-GATCtttttGCATGCGtttATATGtttACT-3’；封口模板T2的核苷酸序列为：T2：5’-AGAAtttttCCTAAGTtttATATGgttCGC-3’；
步骤（3）中所述SS1-AS1411核酸适配体的核苷酸序列为：5’-TAGCGTAGCGTAGCGttttttGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’’ ，所述SS2的核苷酸序列为：5¢-TATACTATACTATAC-3¢。
3.如权利要求1所述方法制备所得的DNA纳米条晶格带-AS1411复合物RDL2-AS1411DNA纳米材料在制备靶向药物载体中的应用。
4.如权利要求2所述方法制备所得的纳米金-DNA纳米晶格带复合物Au-R2A DNA纳米材料在制备靶向药物载体中的应用。
5.一种DNA靶向药物的制备方法，其特征在于：40uL权利要求1制备所得DNA纳米条晶格带-AS1411复合物RDL2-AS1411 DNA纳米材料，或权利要求2制备所得纳米金-DNA纳米晶格带复合物Au-R2A DNA纳米材料加入到160uL浓度为2mM的阿霉素溶液中，37℃孵育24小时离心得到DNA 靶向药物RDL2-AS1411-DOX或Au-R2A-DOX。
6.一种如权利要求5所述方法制备的DNA靶向药物。
CN202010068347.5A 2020-01-21 2020-01-21 一种dna纳米材料及其制备方法和应用 Active CN111019941B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010068347.5A CN111019941B (zh) 2020-01-21 2020-01-21 一种dna纳米材料及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010068347.5A CN111019941B (zh) 2020-01-21 2020-01-21 一种dna纳米材料及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111019941A CN111019941A (zh) 2020-04-17
CN111019941B true CN111019941B (zh) 2023-09-08

Family

ID=70203041

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010068347.5A Active CN111019941B (zh) 2020-01-21 2020-01-21 一种dna纳米材料及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111019941B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK3472351T3 (da) 2016-06-15 2020-11-09 Univ Muenchen Ludwig Maximilians Enkeltmolekylepåvisning eller -kvantificering ved hjælp af DNA-nanoteknologi
CN113201532B (zh) * 2021-04-30 2023-10-20 南京邮电大学 Dna折纸框架脂质体及其制备方法
CN114053425B (zh) * 2021-11-11 2023-03-24 福州大学 一种具有癌细胞及线粒体双靶向性的核酸纳米器件

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102586450A (zh) * 2012-03-06 2012-07-18 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 基于滚环扩增比色检测靶核酸或蛋白的方法
CN104388563A (zh) * 2014-11-19 2015-03-04 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 纳米粒子表面用dna四面体为支架并引滚环扩增反应的方法
CN109675049A (zh) * 2019-02-11 2019-04-26 青岛大学 一种pH诱导的药物缓释DNA纳米结构及其制备方法与应用
CN110551725A (zh) * 2018-06-04 2019-12-10 国家纳米科学中心 一种抗凝血的dna纳米复合结构及其制备方法和应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101896615B1 (ko) * 2016-10-13 2018-09-07 한국과학기술연구원 핵산 물질의 팩킹방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102586450A (zh) * 2012-03-06 2012-07-18 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 基于滚环扩增比色检测靶核酸或蛋白的方法
CN104388563A (zh) * 2014-11-19 2015-03-04 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 纳米粒子表面用dna四面体为支架并引滚环扩增反应的方法
CN110551725A (zh) * 2018-06-04 2019-12-10 国家纳米科学中心 一种抗凝血的dna纳米复合结构及其制备方法和应用
CN109675049A (zh) * 2019-02-11 2019-04-26 青岛大学 一种pH诱导的药物缓释DNA纳米结构及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DNA origami/gold nanorod hybrid nanostructures for the circumvention of drug resistance;Linlin Song等;Nanoscale;第9卷(第23期);第7750-7754页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111019941A (zh) 2020-04-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111019941B (zh) 一种dna纳米材料及其制备方法和应用
Mahmoudpour et al. Aptamer functionalized nanomaterials for biomedical applications: Recent advances and new horizons
Liu et al. Organic–inorganic nanoflowers: from design strategy to biomedical applications
Maity et al. Use of the confined spaces of apo-ferritin and virus capsids as nanoreactors for catalytic reactions
Lim et al. Carbon quantum dots and their applications
KR101866968B1 (ko) 핵산 나노구조체의 대량생산방법 및 이의 약물전달체로서의 활용
Yang et al. DNA-templated quantum dots and their applications in biosensors, bioimaging, and therapy
CN110478322B (zh) 一种核酸药物复合物及其制备方法和应用
Li et al. Aptamer-tagged green-and yellow-emitting fluorescent silver nanoclusters for specific tumor cell imaging
CN106620725B (zh) 一种集光学和光声于一体的双模态分子影像探针及其制备方法和应用
He et al. Recent progress in live cell mRNA/microRNA imaging probes based on smart and versatile nanomaterials
Dhamodharan et al. Carbon nanodots: Synthesis, mechanisms for bio-electrical applications
Minami et al. Nanoarchitectonics for fullerene biology
Xu et al. Construction of rolling circle amplification-based DNA nanostructures for biomedical applications
CN101806795A (zh) 一种肿瘤靶向性的功能化量子点及其制备方法
Li et al. Construction of rolling circle amplification products-based pure nucleic acid nanostructures for biomedical applications
Yang et al. Metal/covalent-organic framework-based biosensors for nucleic acid detection
Kong et al. DNA nanostructure-based fluorescent probes for cellular sensing
Sun et al. Integration of Manganese Dioxide‐Based Nanomaterials for Biomedical Applications
CN112941072B (zh) 一种核酸自组装结构及其制备方法和应用
Lv et al. Hybridization chain reaction-based DNA nanomaterials for biosensing, bioimaging and therapeutics
CN111166728B (zh) 一种肿瘤靶向的复合纳米药物载体、药物及制备方法和应用
CN116983283A (zh) 一种负载核酸及示踪剂工程化细胞外囊泡的制备方法
Zhang et al. Biomineralized zeolitic imidazolate framework-8 nanoparticles enable polymerase/endonuclease synergetic amplification reaction in living cells for sensitive microRNA imaging
Wang et al. Nano-fluorophores prepared by polymerization-induced self-assembly and its application in cell imaging

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant