CN113388666B - 一种d-a-d型fret dna纳米机器及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及miRNA检测技术领域，具体涉及一种D‑A‑D型FRET DNA纳米机器及其制备方法和应用，使用四条退火后的发夹DNA依次修饰DNA四面体，得到D‑A‑D型FRET DNA纳米机器，四条发夹DNA分别为HMg、H1‑FAM、H2‑TAMRA和H3‑FAM。本发明基于HMg剪切与催化发夹放大，构建了D‑A‑D型FRET DNA纳米机器，该纳米机器可实现对miRNA的高灵敏检测和原位荧光成像，增强了荧光FRET效率，提高了检测灵敏度，解决了发夹DNA细胞膜穿透性和生物稳定性差的技术问题。
Description
技术领域
本发明涉及miRNA检测技术领域，具体涉及一种D-A-D型FRET DNA纳米机器及其制备方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤的早期发现对癌症的预防与治疗具有极其重要的意义，但由于早期癌症患者体内肿瘤标志物浓度较低或肿瘤细胞的数量较少，常规方法难以准确检测，寻找代表性的肿瘤标志物、探求高灵敏度的检测手段以及构建新的循环放大探针对构建诊治一体化平台就有了重要意义。
miRNA是一类单链，小的非编码RNA，在多种细胞过程中发挥重要作用，如细胞增殖、肿瘤发生、胚胎发育。研究表明，miRNA的表达失调与各种人类疾病有关，尤其是癌症，与多种miRNA过表达都有关系。因此，miRNA可作为癌症早期诊断的重要标志物。荧光分析法可实现对早期癌细胞中低浓度miRNA的分析，并以灵敏度高、选择性好、操作简单等优点受到分析工作者的青睐，广泛应用于生化分析、药物检测等领域。
发夹DNA常作为荧光探针应用于细胞内检测，但因其较差的细胞膜穿透性和生物稳定性，应用常常受限。基于此，有必要提供一种细胞膜穿透性和生物稳定性更好的纳米机器，以实现更加高效的活细胞成像。
发明内容
针对发夹DNA细胞膜穿透性和生物稳定性差的技术问题，本发明提供一种D-A-D型FRET DNA纳米机器及其制备方法和应用，本发明基于HMg剪切与催化发夹（CHA）放大，构建了D-A-D型FRET DNA纳米机器，该纳米机器可实现对miRNA的高灵敏检测和原位荧光成像。
第一方面，本发明提供一种D-A-D型FRET DNA纳米机器的制备方法，使用四条退火后的发夹DNA依次修饰DNA四面体，得到D-A-D型FRET DNA纳米机器，四条发夹DNA分别为HMg（Mg2+DNAzyme）、H1-FAM、H2-TAMRA和H3-FAM，HMg的序列如SEQ ID No.5所示，H1-FAM的序列如SEQ ID No.6所示，H2-TAMRA的序列如SEQ ID No.7所示，H3-FAM的序列如SEQ ID No.8所示。
进一步的，包括如下步骤：
（1）分别用Tris-HCl缓冲溶液稀释四条发夹DNA并进行退火处理；
（2）然后退火后的四条发夹DNA依次与DNA四面体比例混合并于37℃下反应，四条发夹DNA与DNA四面体的摩尔比为1：1：1：1：1。
进一步的，步骤（1）具体为：
使用Tris-HCl缓冲溶液将四条发夹DNA分别稀释为1μM的分散液，将四种分散液分别置于95℃下加热5min后自然冷却到室温，完成退火处理。
进一步的，Tris-HCl缓冲溶液的浓度为20mM，pH值为7.4。
进一步的，DNA四面体按照如下方法制得：
将四条寡核苷酸长链依次加入到TM缓冲溶液中得到均匀混合物，加热后立即冷却，得到DNA四面体，四条寡核苷酸长链分别为TDNa、TDNb、TDNc、TDNd，TDNa的序列如SEQ IDNo.1所示，TDNb的序列如SEQ ID No.2所示，TDNc的序列如SEQ ID No.3所示，TDNd的序列如SEQ ID No.4所示。
进一步的，混合物的加热温度为95℃、加热时间为5min；冷却温度为4℃、冷却时间为30min。
进一步的，DNA四面体中TDNa、TDNb、TDNc、TDNd的浓度均为1µM。
进一步的，TM缓冲溶液中Tris-HCl的浓度为20mM，MgCl2的浓度为50mM，TM缓冲溶液的pH值为8.0。
第二方面，本发明提供一种采用上述制备方法制得的D-A-D型FRET DNA纳米机器。
第三方面，本发明提供一种上述D-A-D型FRET DNA纳米机器在细胞内miRNA检测和/或成像中的应用。
有益效果
本发明采用DNAzyme剪切和CHA（催化发夹）双重DNA循环放大，以DNA四面体为核心，通过其四个顶点进行特异性修饰，使其携带具有识别与剪切功能的发夹DNAzyme和能够发生无酶催化的Y型CHA的三个发夹，一方面将DNAzyme、CHA和FRET（荧光共振能量转移）相结合，构建了一种新型D-A-D（供体-受体-供体）FRET模式，提高了FRET效率和检测灵敏度；另一方面，发夹修饰的四面体，可以通过胞吞进入细胞，胞膜穿透性和生物稳定性好，进而能在细胞内完成识别、剪切和CHA过程，从而构建了以DNA四面体和Y结构为节点的交联网络结构，为实现生物成像提供了新的策略。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为TDNH纳米机器的组装及细胞成像原理图；
图2为不同条件下HMg-FAM的荧光发射光谱；
图3为HMg的离子选择性测定表征图；
图4为HMg剪切和CHA过程的聚丙烯酰胺电泳图；
图5为不同Y-FRET相遇模式的荧光强度图和FRET柱状图；
图6为TDNH的琼脂糖电泳图；
图7为Y-TDNH的表征图；
图8为miRNA-21（D）的信号图；
图9为TDNH对不同miRNA或碱基错配RNA的选择性表征图；
图10为DNase I降解TDNH的琼脂糖电泳图；
图11为CCK-8细胞毒性实验结果柱状图；
图12为三组纳米机器在HeLa细胞中miRNA-21的荧光成像图；
图13为HMg/H1/H2/H3和TDNH处理的HeLa细胞DAPI荧光成像图；
图14为HEK293、HeLa、HepG2和MCF-7细胞共聚焦成像图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
本发明所使用的DMEM培养液、PBS缓冲溶液（1×0.0067 M）、胰蛋白酶购自通用电气中国医疗有限公司；宫颈癌细胞（Hela）、乳腺癌细胞（MCF-7）、肝癌细胞（HepG2）和人胚肾细胞（HEK293）购自北京银紫晶生物医学技术有限公司；六水合氯化镁购自上海阿拉丁化学试剂公司；CCK-8试剂盒和DAPI购自上海碧云天生物技术有限公司。
本发明所使用的去离子水由电阻为18.2 MΩ/cm的净水系统制得。
本发明所使用的DNA、RNA序列购自上海生工有限公司，具体如下表1所示。
表1 本发明所使用的DNA、RNA序列
| 名称 | 序列（5'-3'） | 描述 | SEQ ID No. |
| TDNa | TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAGATGCGAGGGTCCAATACTCGCGATTCGGCACA | 1 | |
| TDNb | TCAGGGTCTACGGCTTCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGAATCTACTATGGCGGCTCTTC | 2 | |
| TDNc | GCTCACTCTTCCACTTTTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGTTTGTATTGGACCCTCGCAT | 3 | |
| TDNd | TCAATGTCATCGGATACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTA | 4 | |
| HMg | CAAAAAGAGAGCAACATCAGTCCTrAGTCTTTTTTTTTGATCCGAGCCGGACGAAGGGATAAGCTATGTGCCGAATCGCGA | 5 | |
| HMg-FAM | CAAAAAGAGAGCAACATCAGTCCTrAGTCTTTTTTTTTGATCCGAGCCGGACGAAGGGATAAGCTATGTGCCGAATCGCGA | 5’-FAM | 5 |
| H1 | AGCCGTAGACCCTGAGAGCAACATCAGTCCTGTATAGCCCAAGAGAGTAAGGACTGATGTTGCTCTCTTTTTG | 6 | |
| H1-FAM | AGCCGTAGACCCTGAGAGCAACATCAGTCCTGTATAGCCCAAGAGAGTAAGGACTGATGTTGCTCTCTTTTTG | T’-FAM | 6 |
| H2 | AGTGGAAGAGTGAGCGTATAGCCCAAGAGAGCACCTACGCAAAAAGATACTCTCTTGGGCTATACAGGACTGA | 7 | |
| H2-TAMRA | AGTGGAAGAGTGAGCGTATAGCCCAAGAGAGCACCTACGCAAAAAGATACTCTCTTGGGCTATACAGGACTGA | T’-TAMRA | 7 |
| H3 | ATCCGATGACATTGACACCTACGCAAAAAGAGAGCAACATCAGTCCTTATCTTTTTGCGTAGGTGCTCTCTTG | 8 | |
| H3-FAM | ATCCGATGACATTGACACCTACGCAAAAAGAGAGCAACATCAGTCCTTATCTTTTTGCGTAGGTGCTCTCTTG | T’-FAM | 8 |
| H3-TAMRA | ATCCGATGACATTGACACCTACGCAAAAAGAGAGCAACATCAGTCCTTATCTTTTTGCGTAGGTGCTCTCTTG | T’-TAMRA | 8 |
| DNA1 | CAAAAAGAGAGCAACATCAGTCCT | 9 | |
| miRNA-21 | UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA | 10 | |
| miRNA-21(D) | TAGCTTATCAGACTGATGTTGA | 11 | |
| miRNA-21(D)-BHQ1 | TAGCTTATCAGACTGATGTTGA | 3’-BHQ1 | 11 |
| miRNA-16(D) | TAGCAGCACGTAAATATTGGCG | 12 | |
| miRNA-26a(D) | TTCAAGTAATCCAGGATAGGCT | 13 | |
| miRNA-141(D) | TAACACTGTCTGGTAAAGATGG | 14 | |
| one-base mismatch T1 | TAGCTTATCAGACTAATGTTGA | 15 | |
| two-base mismatch T2 | TAGCTTATCAGACTCATCTTGA | 16 | |
| three-base mismatch T3 | TAGCTTTTCAGACTCAAGTTGA | 17 |
实施例1
将TDNa、TDNb、TDNc、TDNd四条寡核苷酸长链加入到TM缓冲溶液（20mM Tris-HCl、50mM MgCl2，pH8.0）中混合均匀，得到混合物，将混合物在95℃下加热5min，然后立即在4°C下冷却30min，最终得到浓度为1µM的DNA四面体（tetrahedral DNA nanostructures，TDNs），4℃下储存、备用。
分别用Tris-HCl缓冲溶液（20mM，pH7.4）稀释HMg、H1-FAM、H2-TAMRA、H3-FAM四条发夹DNA并进行退火处理，退火工艺为：95℃下加热5min后自然冷却到室温，然后将退火后的四条发夹DNA与合成的TDNs按照1:1:1:1:1的比例混合，于37℃水浴条件下反应2h，得到发夹修饰的功能化的DNA四面体（tetrahedral DNA nanostructures assembling DNAhairpins，TDNH），即D-A-D型FRET DNA纳米机器，该TDNH可用于检测细胞中的miRNA-21。
以100μL浓度为0.1μM的miRNA-21（D）作为引发剂孵育TDNH，孵育温度为37℃，孵育时间为4h，得到Y-TDNH。
TDNH检测细胞中miRNA-21的原理如下：
如图1A所示，本发明设计了一个能够特异识别miRNA21发夹HMg，在miRNA-21和Mg2+同时存在下，miRNA-21先识别HMg引发发夹构型变化，然后在Mg2+作用下进行特定位点的剪切。由于碱基互补减少，发生自剪切的HMg会和miRNA-21发生自动分离，同时产生短链DNA1，miRNA21会再次与发夹HMg结合构成循环1（cycle1），提高miRNA21相对浓度，提高检测的灵敏度；与此同时短链DNA1又可作为引发链，基于立足点介导理论，在无酶催化下参与发夹H1-FAM、H2-TAMRA、H3-FAM的CHA反应。首先，DNA1打开发夹H1，与此同时H1的裸露端会打开发夹H2，H2会打开H3，之后H3的裸露端会置换下与H1碱基互补配对的DNA1，进而DNA1会打开更多的H1、H2、H3，构成循环2（cycle2）。从而形成稳定的H1-H2-H3 Y型DNA结构，同时三个荧光基团会在Y型结构的中心相遇，拉近荧光团之间的距离，发生D-A-D Y型荧光共振能量转移，通过比值信号进一步提高检测的灵敏度。
基于以上的设计思路，以TDNs为载体，分别在其四个顶点延长端碱基互补配对原则分别引入发夹HMg、H1、H2和H3。如图1B所示，TDNH可以通过细胞胞吞作用进入细胞，当遇到细胞中的miRNA-21和Mg2+时，同样会引起构象改变发生剪切作用，释放DNA1的会打开第一个TDNH上的H1，进而打开相邻第二个TDNH上的H2和第三个TDNH上的H3。三个TDNH会以形成的Y结构为连接点，呈发射状向四面延伸，形成稳定的Y状网络结构（Y-TDNH）。此外，TDNH的三维结构使得TDNH介导的催化发夹（CHA）反应可以向不同的方向延伸，有利于从周围环境中抓取自由反应物TDNH。更重要的是，一旦一个TDNH顶点的发夹参与CHA反应，其他三个顶点发夹必然会被带入DNA网络结构中，不论其发生剪切作用还是CHA，都导致反应物的局部浓度大大增加，进一步增加碰撞机会、多个反应方向和增加局部反应物浓度的协同作用，必然大大加快了反应速率，有助于miRNA-21的荧光检测与细胞内原位细胞成像。从DNA纳米机器TDNH的构建到Y-TDNH网络的形成，为实现快速、准确的癌症诊断提供了重要方法策略。
测试例1 体外荧光和电泳实验
体外实验中使用与miRNA-21相同序列的miRNA-21（D）序列进行实验。
首先，验证自剪切发夹HMg与miRNA-21的特异性识别和DNAzyme对Mg2+的依赖性。利用荧光标记技术在HMg的5’端和miRNA-21（D）的3’端分别标记FAM和BHQ1荧光团，使用Tris-HCl缓冲溶液（20mM，pH7.4）分别配制浓度为100nM的HMg溶液和miRNA-21（D）-BHQ1溶液，37℃下加热2h。分别检测HMg-FAM+miRNA-21（D）-BHQ1、HMg-FAM+miRNA-21（D）-BHQ1+Mg2+及HMg-FAM情况下的荧光发射图谱。
结果如图2所示，曲线a、b、c分别代表HMg-FAM+miRNA-21（D）-BHQ1、HMg-FAM+miRNA-21（D）-BHQ1+Mg2+及HMg-FAM情况下的荧光发射图谱，当HMg-FAM与miRNA-21（D）-BHQ1两者结合时，引起HMg的构象发生变化，使FAM与BHQ1荧光团靠近，发生荧光猝灭；存在Mg2+时，Mg2+会引发发夹特定位置的剪切实现荧光的恢复。
其次，为了评价DNAzyme对Mg2+具有良好的选择性，以HMg-FAM和DNA21-BHQ1识别猝灭为反应底物，添加浓度均为25mM的不同金属离子代替，用F-4600荧光分光光度计测定样品的荧光强度（Ex/Em=488/520nm）。如图3所示，只有Mg2+存在时，DNAzyme才具有强的剪切功能。
为了验证退火后的四个发夹的稳定性与DNAzyme剪切和CHA放大的发生，进行12%聚丙烯酰胺电泳。使用Tris-HCl缓冲溶液（20mM，pH7.4）分别配制浓度为1μM的HMg溶液、H1溶液、H2溶液和、H3溶液和miRNA-21（D）溶液，37℃下加热2h。然后将上述所得样品及样品miRNA-21（D）+HMG、样品miRNA-21（D）+HMg+H1+H2+H3、样品miRNA-21（D）+HMg+Mg2+和样品miRNA-21（D）+HMg+H1+H2+H3+Mg2+在135V的PAGE凝胶电泳仪上运行1.5h，使用IR-980A生物电泳图像分析系统进行成像分析。
图4中1-5条带依次为miRNA-21（D）、HMg、H1、H2和H3，可以看出退火后的发夹DNA有单独清晰的印记；通过比较条带6、8，在无Mg2+的条件下，HMg与miRNA-21（D）会发生结合，电泳迁移率升高，与HMg条带相比位置上移，相反在Mg2+存在条件下，HMg与miRNA-21（D）发生剪切作用，HMg链会变短，电泳迁移率加快，条带印记下移，同时剪切掉下来的DNA1链与miRNA-21（D）部分结合出现新的印记；通过比较条带7和9，将miRNA-21（D）与HMg、H1、H2和H3混合发生剪切和引发CHA，形成Y结构电泳迁移率降低，条带上移。
测试例1的结果表明，DNAzyme和CHA的联用是可行的。
测试例2 荧光转换效率实验
为了探究不同荧光标记下荧光转换效率，将剪切链DNA1（DNA1，50nM）作为引发链加入到已经退火的不同荧光标记的H1、H2、H3溶液中（100nM，100μL），室温反应2h，DNA1催化发夹形成Y结构，使荧光基团在Y的中间相遇并发生FRET，共设定五种相遇模式，分别为双供体D-D（DNA1+H1-FAM+H2-FAM+H3）、单供体D（DNA1+H1-FAM+H2+H3）、供体-受体D-A（DNA1+H1-FAM+H2-TAMRA+H3）、单供体-双受体D-A-A（DNA1+H1-FAM+H2-TAMRA+H3-TAMRA）和供体-受体-供体D-A-D（DNA1+H1-FAM+H2-TAMRA+H3-FAM），然后对样品进行荧光检测，并对520nm处的荧光进行归一化处理，比较FRTE效率。结果如图5A、5B所示，曲线a-e分别表示D-D、D、D-A、D-A-A、D-A-D单比较FAM荧光强度的变化，D-A-D模式中FAM的荧光强度降低最大，被猝灭的效果最好；同时与D-A（FA/FD=0.58）、D-A-A（FA/FD=0.69）比较，D-A-D（FA/FD=1.25）具有更高的FRET效率。
测试例3 TDNH与Y-TDNH的表征
由于TDNH分子量较大，选择能够区分生物大分子的琼脂糖电泳来表征Y-TDNH的组装和反应过程。室温下，使用1%琼脂糖凝胶电泳（80V，30min）表征实施例1的TDNs、TDNH及Y-TDNH，形成凝胶前用溴化乙锭(EB)对凝胶进行染色，并用凝胶成像系统进行成像分析。如图6条带1-4所示，通过简单地退火，随着四面体锥四条单链DNA链数量逐条增加，电泳迁移速度明显降低且都为清晰的单一条带，表明TDNs的成功制备；在形成TDNs的基础上，逐渐添加退火后的DNA发夹（HMg、H1、H2、H3）得到发夹修饰的功能化的TDNH，如图6条带5-8所示，随着发夹的加入，TDNH电泳迁移率进一步变慢，表明四个发夹分别通过碱基互补成功地配对连接到TDNs的四个顶点上；如图6条带9所示，在miRNA-21（D）存在下，在电泳的上端出现了新的明亮条带，表明网络Y-TDNH的形成。
为了进一步直观观察Y-TDNH的网络结构和荧光共振能量转移情况，在引发剂存在的情况下，通过透射电子显微镜（TEM）和共聚焦显微镜成像观察Y-TDNH。如图7A、图7B所示，Y-TDNH的TEM照片可以清晰发现Y-TDNH的网络结构。图7C、7D分别为TDNH、Y-TDNH的共聚焦成像图。由图7C可以看出，TDNH本身的FAM荧光存在，但TAMRA的荧光几乎没有；由图7D可以看出，当miRNA-21（D）存在时，所形成的Y-TDNH能够发生荧光共振能量转移。
测试例4 TDNH的体外FRET检测
将100nM TDNH和不同浓度的miRNA-21（D）在37℃孵育4h，混合液体积为100μL。然后用488nm激发FAM的荧光，通过荧光共振能量转移进一步激发TAMRA的荧光，用荧光分光光度计收集500-650nm范围内FAM和TAMRA的荧光发射光谱，并对FAM在520nm的荧光进行归一化处理。实验重复三次。
如图8A所示，曲线a-l分别为0 pM、5.0pM、10pM、50pM、0.1 nM、0.5 nM、1.0 nM、5.0nM、10 nM、20 nM、50 nM、80 nM浓度的miRNA-21所对应的荧光信号曲线，当miRNA-21（D）浓度增加时，TDNH的TAMRA在585nm处的受体与供体荧光发射比（FA/FD）信号逐渐增加；如图8B所示，当miRNA-21（D）浓度大于5nM时，FRET信号比增加速率变慢，且逐渐趋向于平台；如图8C所示，对miRNA-21（D）的浓度（0.005-5nM）取对数，得到miRNA-21的浓度对数与FA/FD的线性方程，y=0.226lgC+0.725，检测限为0.74pM。
为了评估TDNH对miRNA-21的选择性，以浓度100nM的不同目标RNA（或其他靶DNA）代替miRNA-21（D）孵育TDNH，孵育温度为37℃，孵育时间为4h，利用归一化法比较FRET强度。实验重复三次。如图9所示，三种碱基错配与空白相比，存在一定的FRET信号增加，但与miRNA-21（D）相比，信号强度仍存在较大差距；而其他miRNA的信号与空白信号基本相同，因此实施例1的TDNH具有良好的选择性。
测试例4 TDNH的生物稳定性和细胞膜穿透性
分别将浓度为1μM的发夹H1、TDNH、Y-DNA和Y-TDNH溶液与0.5U/mL DNase I溶液等体积混合，在室温25℃下孵育不同时间，之后通过1%琼脂糖电泳比较不同DNA的抗水解能力。
如图10所示，在0.5U/mL DNase I条件下，通过1%琼脂糖电泳发现TDNH和Y-TDNH在6h内仍能清晰地观察到明亮的电泳条带，能够稳定存在，而单独的发夹已经不能存在。可以得出，TDNs能够保护发夹，避免发夹降解。
为进一步探究TDNH在活细胞原位成像中的应用、评估TDNH的生物相容性，选择HeLa细胞和HEK293细胞为研究模型，在TDNH存在时进行CCK-8检测。HeLa细胞和HEK293细胞（1×104cells）通过胰蛋白酶消化接种在96孔板中，培养12h得到数量合适密度的细胞。PBS清洗两次后，一部分细胞用含不同浓度TDNH的新鲜培养液培养24h，另一部分用相同浓度的TDNH培养不同时间，然后PBS清洗，用含有10µL CCK-8的DMEM培养液（100µL）继续孵育细胞3h，最后用细胞增殖-毒性检测采用酶标仪测定每孔460nm处的吸光度，计算细胞活力。
如图11所示，TDNH具有低的细胞毒性和良好的生物相容性，可以应用于细胞原位成像分析。
测试例5 TDNH在活细胞中的荧光成像
按照实施例1方法制备D-A型纳米机器和D-A-A型纳米机器，D-A型纳米机器是在TDNs上接上退火后的HMg、H1-FAM、H2-TAMRA和无修饰的H3；D-A-A型纳米机器是在TDNs上接上退火后的HMg、H1-FAM、H2-TAMRA和H3-TAMRA。
使用D-A、D-A-A、D-A-D对HeLa细胞内miRNA-21原位成像，具体方法为将HeLa细胞通过胰蛋白酶消化传代接种于96孔板内，培养12h。当细胞达到适当数量，分别用含有三组TDNH（100nM）的DMEM培养液（200μL）在37℃、5%CO2条件下孵育细胞4h，通过共聚焦激光扫描显微镜进行细胞成像。荧光成像使用488nm激光，激发FAM通过FRET进一步激发TAMRA的荧光，分别收集490-550nm和550-600nm范围内FAM和TAMRA的荧光发射光谱。如图12所示，D-A-D型荧光探针在HeLa细胞中表现出强烈的TAMRA荧光信号，而在D-A和D-A-A型中表现出相对微弱的信号。
以有无TDNs为变量，评估TDNs的携带能力。如图13所示，DAPI染色结果表明，单纯的发夹探针细胞摄取率低，严重影响荧光成像效果，而TDNH的细胞摄取率高，不需要额外的转染试剂帮助就可以迅速内化到活细胞中，同时又可以作为网络节点在HeLa细胞的细胞质中延伸实现网络结构，进一步提高荧光成像效果，细胞内的荧光强度显著高于无TDNs的HMg/H1/H2/H3体系。。
将细胞（MCF-7、HeLa、HepG2和HEK293）通过胰蛋白酶消化传代接种于96孔板内，培养12h。当细胞达到适当数量，分别用含有TDNH（100nM）的DMEM培养液（200μL）在37℃、5%CO2条件下孵育4h，通过共聚焦激光扫描显微镜进行细胞成像。结果如图14所示，在MCF-7、HePG2、HeLa细胞中miRNA-21的FRET信号显著，而在HEK293细胞中检测到微弱的FRET信号。通过FRET信号强度可以得出，miRNA-21在四种细胞中相对含量的由高到低依次为MCF-7、HepG2、HeLa和HEK93。
综上所述，将四种发夹自组装在TDNs的四个顶点上，一方面HMg发夹通过对miRNA-21的特异性识别，发生剪切放大反应，释放的短链进一步引发CHA放大；另一方面利用TDNs的空间结构，实现各个TDNH在空间范围的连接，增加了局部浓度，更有利于实现Mg2+DNAzyme发夹识别与剪切和D-A-D型FRET信号转变。通过剪切和CHA过程，能够实现了双循环放大，更重要的是，与传统的单供体单受体相比，D-A-D模式的FRET效率更高，能够进一步提高检测的灵敏度。由于DNA的可编程、特殊功能性以及良好的生物相容性，TDNH可以实现对肿瘤细胞内的特定miRNA、蛋白质等分子的检测与原位成像，为癌症相关标志物的检测提供新的策略。
尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛科技大学
<120> 一种D-A-D型FRET DNA纳米机器及其制备方法和应用
<130> 2021
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
tatcaccagg cagttgacag tgtagcaagc tgtaatagat gcgagggtcc aatactcgcg 60
attcggcaca 70
<210> 2
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
tcagggtcta cggcttcaac tgcctggtga taaaacgaca ctacgtggga atctactatg 60
gcggctcttc 70
<210> 3
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
gctcactctt ccacttttca gacttaggaa tgtgcttccc acgtagtgtc gtttgtattg 60
gaccctcgca t 71
<210> 4
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
tcaatgtcat cggatacatt cctaagtctg aaacattaca gcttgctaca cgagaagagc 60
cgccatagta 70
<210> 5
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
caaaaagaga gcaacatcag tcctragtct ttttttttga tccgagccgg acgaagggat 60
aagctatgtg ccgaatcgcg a 81
<210> 6
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
agccgtagac cctgagagca acatcagtcc tgtatagccc aagagagtaa ggactgatgt 60
tgctctcttt ttg 73
<210> 7
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
agtggaagag tgagcgtata gcccaagaga gcacctacgc aaaaagatac tctcttgggc 60
tatacaggac tga 73
<210> 8
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
atccgatgac attgacacct acgcaaaaag agagcaacat cagtccttat ctttttgcgt 60
aggtgctctc ttg 73
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
caaaaagaga gcaacatcag tcct 24
<210> 10
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 10
uagcuuauca gacugauguu ga 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
tagcttatca gactgatgtt ga 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
tagcagcacg taaatattgg cg 22
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
ttcaagtaat ccaggatagg ct 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 14
taacactgtc tggtaaagat gg 22
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 15
tagcttatca gactaatgtt ga 22
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 16
tagcttatca gactcatctt ga 22
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 17
tagcttttca gactcaagtt ga 22
Claims (2)
1.一种D-A-D型FRET DNA纳米机器的制备方法，其特征在于，使用四条退火后的发夹DNA依次修饰DNA四面体，得到D-A-D型FRET DNA纳米机器，四条发夹DNA分别为HMg、H1-FAM、H2-TAMRA和H3-FAM，HMg的序列如SEQ ID No.5所示，H1-FAM的序列如SEQ ID No.6所示，H2-TAMRA的序列如SEQ ID No.7所示，H3-FAM的序列如SEQ ID No.8所示；
包括如下步骤：
（1）使用浓度为20mM，pH值为7.4的Tris-HCl缓冲溶液将四条发夹DNA分别稀释为1μM的分散液，将四种分散液分别置于95℃下加热5min后自然冷却到室温，完成退火处理；
（2）然后退火后的四条发夹DNA依次与DNA四面体比例混合并于37℃下反应，四条发夹DNA与DNA四面体的摩尔比为1：1：1：1：1，DNA四面体中TDNa、TDNb、TDNc、TDNd的浓度均为1µM；
DNA四面体按照如下方法制得：
将四条寡核苷酸长链依次加入到TM缓冲溶液中得到均匀混合物，加热后立即冷却，混合物的加热温度为95℃、加热时间为5min；冷却温度为4℃、冷却时间为30min，得到DNA四面体，四条寡核苷酸长链分别为TDNa、TDNb、TDNc、TDNd，TDNa的序列如SEQ ID No.1所示，TDNb的序列如SEQ ID No.2所示，TDNc的序列如SEQ ID No.3所示，TDNd的序列如SEQ ID No.4所示，TM缓冲溶液中Tris-HCl的浓度为20mM，MgCl2的浓度为50mM，TM缓冲溶液的pH值为8.0。
2.一种采用如权利要求1所述的制备方法制得的D-A-D型FRET DNA纳米机器。
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| 基于三维DNA分子机器信号放大比率型拉曼光谱检测细胞内miRNA;毕成等;《青岛科技大学学报(自然科学版)》;20201231;第41卷(第4期);第20-26页 * |
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