CN115121803A - 一种基于dna框架结构的多聚纳米团簇的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于DNA框架结构的多聚纳米团簇的合成方法，所述的多聚纳米团簇包括DNA四面体和纳米银团簇，所述纳米银团簇聚集DNA四面体的顶点，合成所述DNA四面体的四条链的序列如SEQ ID NO.:1、SEQ IDNO.:2、SEQ ID NO.:3或SEQ ID NO.:4所示；所述合成方法包括如下步骤：1)将DNA四面体合成所需的四条链在缓冲液中，通过退火反应以经碱基互补配对合成DNA四面体；2)将反应后的DNA四面体反应液使用HPLC纯化，以获得高纯度DNA四面体；3)纯化后的DNA四面体与硝酸银混合静置后，加入硼氢化钠反应至结束。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及生物材料，特别涉及一种基于DNA框架结构的多聚纳米团簇及其合成方法。
背景技术
配体稳定的金属团簇由几个到数十个金属原子组成，随着能级接近费米波长时，产生与分子能级相似的行为，具有尺寸依赖性的荧光发射。与一般的有机染料荧光标记相比，金属团簇具有更好的荧光量子产率、更大的斯托克斯位移、更强的抗光漂白能力以及优良的生物相容性。
DNA具有成本低、编码性强、生物相容性好等优势，是纳米团簇合成的优选配体。DNA稳定的纳米银团簇广泛用于探针开发、逻辑门设计和细胞标记。但是，纳米团簇在实际样本检测中仍然存在不稳定性的问题。
有序的氨基酸骨架结构稳定蛋白发射不同的荧光。受到如此的结构启发，我们选择三维DNA纳米结构作为框架结构探索团簇稳定的新方法。
DNA四面体一般由四条或者六条DNA通过碱基互补配对而成，六条边形成了刚性双螺旋结构，每条边的切口处作为修饰位点。本发明利用DNA四面体的框架稳定性和切口可修饰性，设计团簇合成区域与切口处，建立一种提高纳米团簇稳定性的新方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于DNA框架结构的多聚纳米团簇的合成方法以及相应的基于DNA框架结构的多聚纳米团簇
本发明一方面涉及的一种基于DNA框架结构的多聚纳米团簇的合成方法，所述的多聚纳米团簇包括DNA四面体和纳米银团簇，所述纳米银团簇聚集DNA四面体的顶点，合成所述DNA四面体的四条链的序列如SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:2、SEQ ID NO.:3或SEQ IDNO.:4所示；
所述合成方法包括如下步骤：
1)将DNA四面体合成所需的四条链在缓冲液中，通过退火反应以经碱基互补配对合成DNA四面体；
2)将反应后的DNA四面体反应液使用HPLC纯化，以获得高纯度DNA四面体；
3)纯化后的DNA四面体与硝酸银混合静置后，加入硼氢化钠反应至结束。
优选地，所述的缓冲液为MOPS溶液，优选地，MOPS溶液包括15mM Mg(NO3)2和20mMMOPS，以避免氯离子对团簇合成的干扰；
优选地，步骤1)中所述的四条链的用量的摩尔比例为1:1:1:1；
优选地，所述退火反应条件为95℃加热5min，迅速退火到4℃，保持30min。
步骤2)中所述的HPLC纯化方法使用尺寸排除色谱法；
优选地，HPLC纯化的流动相缓冲液包含25mM Tris和450mM NaNO3，以避免氯离子对团簇合成过程中的干扰；
优选地，所述流动相缓冲液的pH为7.0-7.2。
进一步地，HPLC的收集液经过离心后超滤；优选地，使用超滤管离心；优选地，所述超滤管规格为30kDa，离心条件为6000rpm，离心15min；优选地，使用MOPS缓冲液置换流动相缓冲液，以减少Tris对团簇合成的干扰，优选地，所述MPOS缓冲液包含15mM Mg(NO3)2和20mMMOPS。
进一步地，步骤3)中DNA四面体、硝酸银和硼氢化钠摩尔比为1:24:24；
优选地，所述DNA四面体、硝酸银和硼氢化钠的加入顺序为DNA、硝酸银和硼氢化钠；
优选地，所述DNA四面体和硝酸银加入后静置20min；
优选地，所述的硼氢化钠溶液需要新鲜配置；所述硼氢化钠加入后，混匀后，静置1小时，获得DNA四面体稳定的纳米银团簇。
本发明另一方面涉及基于DNA框架结构的多聚纳米团簇，包括DNA四面体和纳米银团簇，其中，纳米银团簇聚集DNA四面体的顶点，合成所述DNA四面体的四条链的序列如SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。
所述DNA四面体在顶点处具有切口，以作为团簇合成区域。
本发明利用DNA四面体作为框架结构，纳米银团簇精确设计在四个顶点的缺口处，通过四面体序列合理设计和纯化方法优化，最优条件下合成DNA四面体-纳米银团簇，与常规双链作为框架相比，DNA四面体-纳米银团簇具有更高的稳定性，有潜力用于生物检测、探针设计、细胞成像或活体成像、基因载体和药物递送中的用途。
关于国家资助研究的说明：
本发明技术是在国家自然科学基金No.:21804089，21804091，21804088，21904086支持和资助下完成。
附图说明
图1为聚丙烯酰胺凝胶电泳验证在切口处含有团簇合成区域的四面体合成。其中，A、B、C、D分别表示为本申请具体实施例中的DNA四面体的A链、B链、C链、D链；AB、ABC、ABD、ACD、BCD、ABCD分别为四条链的组合，其中ABCD表示本申请的DNA四面体。
图2为聚丙烯酰胺凝胶电泳验证纯化后的DNA四面体纯度。
图3为DNA四面体的纳米银团簇的2D荧光等高线拟合图。
图4为DNA四面体稳定的纳米银团簇的TEM照片。
图5为时间依赖的双链和四面体稳定的纳米银团簇的荧光变化。
具体实施方式
下述实施例中使用的主要仪器及试剂：
用于DNA四面体合成的仪器为：PCR仪S100TM(Bio-Rad公司)。
用于DNA四面体纯化的仪器为安捷伦1260(Agilent公司)；HPLC纯化四面体的柱子类型：Phenomenex Yarra TM 3μm SEC-4000，300*7.8mm。
用于浓缩纯化收集液的超滤装置为：30kDa超滤管(Millipore公司)。
用于DNA四面体合成效果验证的仪器为：蛋白电泳设备(Bio-Rad公司)和凝胶成像系统(GE公司)。
用于DNA四面体定量的仪器为：UV-vis分光光度计cary100(Agilent公司)。
用于DNA四面体-纳米银团簇荧光特性测定的仪器为：荧光分光光度计FluoroMax-4(Horiba公司)和多功能酶标仪(Synergy H1)。
用于DNA四面体-纳米银团簇表征测定的仪器为：场发射透射显微镜TALOS F200X(赛默飞公司，美国)。
实施例1DNA四面体的制备
DNA四面体合成所需的四条链合成于生工生物工程(上海)股份有限公司。
链1序列A：SEQ ID NO.1：
CCCTTAATCCCCACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTACCCTAACTCCCC
链2序列B：SEQ ID NO.2：
CCCTTAATCCCCTATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAGATGCGAGGGTCCAATACCCCTAACTCCCC
链3序列C：SEQ ID NO.3：
CCCTTAATCCCCTCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGAATCTACTATGGCGGCTCTTCCCCTAACTCCCC
链4序列D：SEQ ID NO.4：
CCCTTAATCCCCTTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGTTTGTATTGGACCCTCGCATCCCTAACTCCCC
前述的四条链等量地加入到MOPS缓冲液(20mM MOPS，15mM Mg(NO3)2，pH 7.0)，每条链的终浓度为1μM。获得的混合液放入PCR仪，95℃加热5min，迅速退火到4℃，保持30min。
使用流动相缓冲液(25mM Tris,450mM NaNO3,pH 7.0-7.2)，流速1.0mL/min，吸收波长为260nm，平衡柱子1-2小时，以500μL DNA复合物作为进样量，运行过程中，会出现两个锋，先出的峰为DNA无序缠绕形成的聚集体，后出的峰为均一分散的DNA四面体。在第二个峰出现时，开始收集流出液体。
获得的收集液使用0.5mL 30kDa超滤管浓缩，6000rpm离心15min。最后一次浓缩离心时，使用MOPS缓冲液(20mM MOPS，15mM Mg(NO3)2，pH 7.0)置换流动相缓冲液。浓缩后的液体，取1微升加入到59微升的MOPS缓冲液(20mM MOPS，15mM Mg(NO3)2，pH 7.0)中，获得的60微升稀释液放入分光光度计，进行测定DNA浓度。
如图1所示，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，与一条链、两条链(AB)、三条链(ABC、ABD、ACD、BCD)形成的结构相比，由于DNA四面体框架结构的形成，DNA四面体(ABCD)的样品在PAGE中具有更慢迁移速度，验证了DNA四面体的成功合成。
如图2所示，纯化后的DNA四面体在PAGE胶仅仅显示单一条带，证明了高纯度DNA四面体框架结构的制备。
实施例2DNA四面体稳定的纳米团簇合成
将获得的5微升高纯度DNA四面体(浓度为20μM)加入在MOPS缓冲液(20mM MOPS，15mM Mg(NO3)2，pH 7.0)中，总反应体积为200微升，加入2.4微升硝酸银(浓度1mM)到以上的溶液，震荡混合5s，避光静置20min。
配制1mM NaBH4，加入2.4微升到以上的混合液，震荡混合5s，避光反应1小时。所得到的DNA四面体银纳米团簇的TEM照片如图4所示。
取100微升加入到比色皿，使用荧光分光光度计，发射光谱扫描范围为425-780nm，步长为5nm，发射光谱扫描范围为475-780nm，步长为2nm，获得DNA四面体-纳米银团簇的2D荧光光谱。
如图3所示，DNA四面体-纳米银团簇产生了相对纯的2D光谱，最强的荧光值出现在550nm激发和616nm发射峰处。
实施例3.DNA四面体稳定的纳米银团簇的稳定性
取100微升合成的DNA四面体-纳米银团簇加入到384微孔板中，激发和发射峰分别设置为为550和616nm，时间间隔为30s，使用酶标仪完成时间依赖的荧光变化。
如图5所示，时间依赖的荧光变化动力学显示了四价四面体合成的团簇比双链合成的团簇拥有更慢的荧光下降速度。通过计算所得，四价四面体团簇和双链团簇的半衰期分别为177min和56min。此处双链团簇的合成序列为：
序列E：SEQ ID NO.5：：
CCCTTAATCCCCCCAGGCAGTTGAGCGAACATT
序列F：SEQ ID NO.6：：
CGCCATAGTAGCGTATCACCCTAACTCCCC
序列G：SEQ ID NO.7：
AATGTTCGCTCAACTGCCTGGTGATACGCTACTATGGCG。
以上描述仅为本申请的较佳实施方式以及对所运用技术原理的说明。本领域技术人员应当理解，本申请中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离本申请构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本申请中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。
序列表
<110> 上海交通大学医学院附属仁济医院
<120> 一种基于DNA框架结构的多聚纳米团簇的合成方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cccttaatcc ccacattcct aagtctgaaa cattacagct tgctacacga gaagagccgc 60
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<211> 79
<212> DNA
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cccttaatcc cctcaactgc ctggtgataa aacgacacta cgtgggaatc tactatggcg 60
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<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cccttaatcc ccttcagact taggaatgtg cttcccacgt agtgtcgttt gtattggacc 60
ctcgcatccc taactcccc 79
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<212> DNA
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgccatagta gcgtatcacc ctaactcccc 30
<210> 7
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aatgttcgct caactgcctg gtgatacgct actatggcg 39
Claims (8)
1.一种基于DNA框架结构的多聚纳米团簇的合成方法，所述的多聚纳米团簇包括DNA四面体和纳米银团簇，所述纳米银团簇聚集DNA四面体的顶点，合成所述DNA四面体的四条链的序列如SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:2、SEQ ID NO.:3或SEQ ID NO.:4所示；
所述合成方法包括如下步骤：
1)将DNA四面体合成所需的四条链在缓冲液中，通过退火反应以经碱基互补配对合成DNA四面体；
2)将反应后的DNA四面体反应液使用HPLC纯化，以获得高纯度DNA四面体；
3)纯化后的DNA四面体与硝酸银混合静置后，加入硼氢化钠反应至结束。
2.如权利要求1所述的基于DNA框架结构的多聚纳米团簇的合成方法，步骤1)中所述的缓冲液为MOPS溶液，优选地，MOPS溶液包括15mM Mg(NO3)2和20mM MOPS，以避免氯离子对团簇合成的干扰；
优选地，步骤1)中所述的四条链的用量的摩尔比例为1:1:1:1；
优选地，所述退火反应条件为95℃加热5min，迅速退火到4℃，保持30min。
3.如权利要求1所述的基于DNA框架结构的多聚纳米团簇的合成方法，步骤2)中所述的HPLC纯化方法使用尺寸排除色谱法；
优选地，HPLC纯化的流动相缓冲液包含25mM Tris和450mM NaNO3，以避免氯离子对团簇合成过程中的干扰；
优选地，所述流动相缓冲液的pH为7.0-7.2。
4.如权利要求3所述的基于DNA框架结构的多聚纳米团簇的合成方法，其特征在于，HPLC的收集液经过离心后超滤；优选地，使用超滤管离心；优选地，所述超滤管规格为30kDa，离心条件为6000rpm，离心15min；优选地，使用MOPS缓冲液置换流动相缓冲液，以减少Tris对团簇合成的干扰，优选地，所述MPOS缓冲液包含15mM Mg(NO3)2和20mM MOPS。
5.如权利要求1所述的基于DNA框架结构的多聚纳米团簇的合成方法，步骤3)中DNA四面体、硝酸银和硼氢化钠摩尔比为1:24:24；
优选地，所述DNA四面体、硝酸银和硼氢化钠的加入顺序为DNA、硝酸银和硼氢化钠；
优选地，所述DNA四面体和硝酸银加入后静置20min；
优选地，所述的硼氢化钠溶液需要新鲜配置；所述硼氢化钠加入后，混匀后，静置1小时，获得DNA四面体稳定的纳米银团簇。
6.基于DNA框架结构的多聚纳米团簇，包括DNA四面体和纳米银团簇，其特征在于，纳米银团簇聚集DNA四面体的顶点，合成所述DNA四面体的四条链的序列如SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。
7.如权利要求5所述的DNA框架结构的多聚纳米团簇，其特征在于，所述DNA四面体在顶点处具有切口，以作为团簇合成区域。
8.如权利要求6-7所述基于DNA框架结构的多聚纳米团簇，在生物检测、探针设计、细胞成像或活体成像、基因载体和药物递送中的用途。
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