CN103409506A - 一种用于检测alk基因不含重复序列的fish探针、试剂盒及其检测方法 - Google Patents
一种用于检测alk基因不含重复序列的fish探针、试剂盒及其检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术领域，公开了一种用于检测ALK基因不含重复序列的荧光原位杂交探针、试剂盒及其检测方法。以人工构建的基因序列或者大小为30～1000kb的ALK基因为模板，对ALK基因中的非重复序列进行聚合酶连反应，扩增产物为350～800碱基对大小不等的DNA片段，消除ALK基因中的重复序列，从而形成不含重复序列的产物，产物经过荧光标记后获得ALK基因不含重复序列荧光原位杂交探针，用于ALK基因荧光原位杂交检测。本发明获得的ALK基因荧光原位杂交探针可消除重复序列，显著降低ALK基因荧光原位探针的非特异性背景信号，提高荧光原位杂交探针的特异性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于检测ALK基因不含重复序列的FISH探针、试剂盒及其检测方法。
背景技术
受体型酪氨酸激酶间变性淋巴瘤激酶（Anaplastic lymphoma kinase，ALK）最早发现于间变性大细胞淋巴瘤（Anaplastic large cell lymphoma，ALCL）中，由2号及5号染色体易位所形成的融合蛋白质包含了ALK的3’端胞内结构域，以及核磷蛋白（Nucleophosmin，NPM）的5’端的结构域。ALK基因位于染色体2p23位点，正常情况下人ALK基因可转录产生大小6222bp的mRNA，由29个外显子构成，编码1620个氨基酸序列200KDa的I型穿膜蛋白ALK，该蛋白为一种受体酪氨酸激酶（Receptor tyrosine-kinase，RTK），是RTK胰岛素超家族的成员。完整的ALK蛋白具有典型的RTK三部分结构，即胞外区、亲脂性穿膜区和胞浆内酪氨酸激酶。正常情况下ALK只在神经系统中表达。人体中ALK基因表达水平随着脑的发育成熟而下降，成熟脑组织中的量很低，表达存在一定的区域性；其它系统中未发现ALK的表达。ALK的异常表达来源于不同的染色体易位。ALK易位的基因组断裂点多发生在16及17号外显子中间的内含子，而17-26号外显子编码ALK胞内结构域，每个易位产生一种不同的融合蛋白质，由配偶体的5’端和ALK酪氨酸激酶结构域3’端融合得到。大多数情况下，5’端的配偶体具有可以形成同源或异源二聚体的结构域，使得ALK激酶结构域交互磷酸化，相互作用增强并且使多种下游蛋白质磷酸化。失去调控的ALK活性增高，使其功能近似原癌蛋白质，这些融合蛋白质定位在不同的亚细胞区域上，因此可能导致不同的细胞功能改变。
据文献报道，ALK基因断裂、融合等突变可在60%～85%的原发性系统性ALCL和3%～5%的肺癌患者中中呈现。针对ALK基因开发的靶向治疗药物克唑替尼也基于ALK基因的融合和断裂突变，临床使用克唑替尼药物对ALK融合基因患者有效，无ALK融合基因患者产生耐药。
目前，临床上用于检测基因重排、融合等突变类型的金标准是荧光原位杂交技术。荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术。利用特定核酸经荧光素标记后作为探针，与靶DNA进行杂交后，再通过荧光显微镜直接以单个细胞为观察对象进行计数，可以在36小时内实现对待测染色体片段的定性、定量和定位分析。然而荧光原位杂交探针主要使用人工染色体制备，这些人工染色体包括酵母人工染色体（YAC）、细菌人工染色体（BAC）和噬菌体人工染色体（PAC）等，由于在人工染色体中存在很多的重复序列，这些重复序列在整个基因组中不断出现，从而导致制备的荧光原位杂交探针存在很多的重复序列，这些重复序列在探针与非靶DNA杂交后也能产生荧光，从而产生非特异性的荧光信号，大大降低了FISH检测的特异性和灵敏度。因此，本领域迫切需求开发ALK基因的不含重复序列FISH探针试剂盒，用于提高ALK基因的荧光原位杂交实验的特异性和灵敏度。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种用于检测ALK基因不含重复序列的FISH探针、试剂盒及其检测方法。
一种用于检测ALK基因不含重复序列的FISH探针，所述FISH探针DNA是以BAC克隆的ALK基因为模板，由引物组或与引物组具有同一性的核苷酸序列，采用聚合酶链技术进行PCR扩增反应制备得到，所述引物组为（其中1、2、3……78为引物名称，F为上游引物，R为下游引物）：
1F：5'ACTGTTGTTCCACCCAAGATG3'
1R：5'ACCAGGCTGTTCCAAGTATGA3'
2F：5'GGAAGATACACCCAATCC3'
2R：5'AACCTCCTCCACTACCTC3'
3F：5'TGCCAGGTAGTCACATCAT3'
3R：5'AGGCCACATTCCTAAACA3'
4F：5'ACCCTTTGTATTCTTCTTCATCTTG3'
4R：5'GCCTTTTAGTAGTCCTTCCAGTG3'
5F：5'GGGATGGCTGCTGCTCTT3'
5R：5'GATGCTGCCTGGGAAACAA3'
6F：5'GAGTCAAAGAATGCTGGGTA3'
6R：5'CTTCCTTGGAGGATAAACA3'
7F：5'CGATTTCTGTGCCTCTTG3'
7R：5'GCTCTGCTCTGCCTACCT3'
8F：5'GAGGTCATTGTAAGGAGGAT3'
8R：5'AGGTCAGCACATGCCACT3'
9F：5'ATGTAGTCAAGGCAGGTTTC3'
9R：5'CAAGCGTTAAGGGTTAGG3'
10F：5'GCAGGCTGGAAATCTATG3'
10R：5'TCCCACTGGAAGGGTTAT3'
11F：5'CTGGGCAGGCTGCTTATC3'
11R：5'GTGGCACAGAGTTTGTTTCC3'
12F：5'TTCGGGAGAAGGCACAAT3'
12R：5'CAAGGGCAAAGCCAGCAA3'
13F：5'TAATGCTTTGCTGGTCTG3'
13R：5'AGGGCTCTTAAATTGGTC3'
14F：5'TAGGGCTGGAAAGGTGATGG3'
14R：5'TGGCTCTGGCTTGCTGAA3'
15F：5'TGCCTATGTGCCACCCTC3'
15R：5'CAGCCTGTTAGTGCTCCAAG3'
16F：5'GGCAGATGTGGATGCTGTAGA3'
16R：5'TGAGGGGAATTAGGGAGTGG3'
17F：5'AGGAACAAGCCCTGAGAC3'
17R：5'CTTAGACAACCCGACCAC3'
18F：5'CAGCCTAAGTTGTTTGTTCC3'
18R：5'TTCCGATTGCTCTATGTTTCA3'
19F：5'CCAGGGAAATCCTCAGAACA3'
19R：5'ATGGCATCCGCAGCAATC3'
20F：5'ACCGTTCATCACCCATCA3'
20R：5'TTCTATCCCACCCTCTACC3'
21F：5'GACCAAGGGCTACAAGTT3'
21R：5'GGAGGCAAGGAGAATACA3'
22F：5'CTGCTGACTGTATTTTGGTGCT3'
22R：5'GCTAGGGAGTTGGAGGGATTA3'
23F：5'AGGGCTTAGCACCATTCG3'
23R：5'AACTCTGCCTCCCACATC3'
24F：5'GGTTCTGAAGAGGAGGCA3'
24R：5'AGGATAGTGGTGTTGAGGC3'
25F：5'ATAAAGTAGGGATGGAGGC3'
25R：5'ATAGGGAGCTGAGGGAAT3'
26F：5'CGTTGCCAGGAACAAGAAAG3'
26R：5'CCACAAAAGGGGAATAGGGA3'
27F：5'ACTCATCATTAGCCACCCATTT3'
27R：5'GGTCATCCCCAACTTCAACAT3'
28F：5'AGGCTGTGAGTCTGAGGT3'
28R：5'AGCTTTCCCAGTTCTTCC3'
29F：5'ATTCCACCAAGTCACCAT3'
29R：5'AAGACTGCCCAGAAAGAT3'
30F：5'ACTAACAGGCAGGCAGAA3'
30R：5'AACTTGAGATACTTGGAGGG3'
31F：5'GAGTCTCCAACGGTGTTC3'
31R：5'TTACATCCTCCCACAAAA3'
32F：5'TATGCCTGGCTGTGACTC3'
32R：5'TGTGCCCACTACTGACCC3'
33F：5'TTCGGGAGCATTGATTGG3'
33R：5'CGACTTGGGACTTGACACC3'
34F：5'CTGGTAGTCAGGCATTGTGG3'
34R：5'AGTGAAGTGAGCCGTGGG3'
35F：5'CATGCCATGCAATTTACC3'
35R：5'TCACTTCTTCCTCCCTCA3'
36F：5'CCATTTGGCTTTTGCCTTTA3'
36R：5'TTGCTGTTTGTCATTTGTCCC3'
37F：5'ACAACAGGAAGGGCATAGGAG3'
37R：5'CAGGAGCCAAACCGCAAG3'
38F：5'CCATTTGGCTTTTGCCTTTA3'
38R：5'TTGCTGTTTGTCATTTGTCCC3'
39F：5'TTGGCATTGACAGTTGAGG3'
39R：5'TGAAGCTGGAATAAGGAAGAA3'
40F：5'ATTAGGGATACAGATGGGATT3'
40R：5'GGTTAGCAGAGGTGGTCAA3'
41F：5'TACCCTACTCCCAACTATCATC3'
41R：5'CTCAACATAAACTCTGCTTCACTC3'
42F：5'AGAGTAAACCAAAGGGTCAGAAAGC3'
42R：5'CATAGGTCCTAAGTGCCACATAAT3'
43F：5'CATGGTTGTGGCGCTGTATG3'
43R：5'CAGGTTGGCAGAATGTTGAGT3'
44F：5'CTTCCTGTCCGCAATAAATGG3'
44R：5'ACCCTCCCTTTTCTCACCACC3'
45F：5'ATGAAGCAGTTGGCAGAGGAG3'
45R：5'GAAATGGATGTGAGTAGCGTGT3'
46F：5'CCACGGGAAGAGTGGTGAG3'
46R：5'GAGAAGGGAGACTGGGCTGT3'
47F：5'GATTACTGGTGCTGAGTTGGC3'
47R：5'TGGCATTGGAGTGGTAGGAT3'
48F：5'GGGAGTGAGAAGGGCTGTTT3'
48R：5'CGCTTGGTGATTTTGGAATT3'
49F：5'TATTGTATGTGAGGTGAATGGGT3'
49R：5'GAGGGTTTGAGACTGTTTCTTGT3'
50F：5'CTGGGGATATTGTGCTTGTT3'
50R：5'ACTGGAGTCCTGCCTTTGTC3'
51F：5'GGGTAGGCAGGATATGGGTT3'
51R：5'GAAGGGGCTGGACATTTCTC3'
52F：5'CTCTTTTGGCACCCCTCACT3'
52R：5'CCCTGCTTCCTAATCACTTCC3'
53F：5'TTGATTCCCATCTCCTCCTT3'
53R：5'GTACAGTATGTCAGCATTCCAG3'
54F：5'ATTTGCCACTCACTGCTATGTT3'
54R：5'CTGCTTTGTCACCCTTTACG3'
55F：5'CACAGAAAGCAGCACTGAGAC3'
55R：5'TCCCAGGGAGAAAGGAACATAC3'
56F：5'AACCCATGTCACCTCCTTATT3'
56R：5'GGTAGTGTCTGCTGTTACTTTCC3'
57F：5'CTGTATTGATCCAGACAAACTC3'
57R：5'CGGTTGCATTATTACTACATAGCT3'
58F：5'CCCACAACAAATACTCCTGC3'
58R：5'TCAATCAATCCCTCCCCATC3'
59F：5'CTGGGGTATGTTTACAGGTTCAC3'
59R：5'TGCCCAAGCAGGCATTGTTTCT3'
60F：5'AAGATGGGCTCAGTGTTGGAT3'
60R：5'GAGGCTTTGGTTGCTGTTGT3'
61F：5'GAGTTAAGCTCCCCACCAAT3'
61R：5'TTTCTAAGCCCAAGACTTTCAG3'
62F：5'TCATTCTTCTCCTCCTCCCAG3'
62R：5'CCTGACCCACTCCCTACAGC3'
63F：5'GAGCAAGCAGTTGGGGAAAG3'
63R：5'TATGGAGGGTGGATGGGAAG3'
64F：5'CCAGACCAGCCTTCTCCTTC3'
64R：5'CCTGCACAGATAGCTCCACCCT3'
65F：5'TAAGAAAACTGTAAACCAGCAC3'
65R：5'CCCTGAGTCTCCCATCTGTC3'
66F：5'ATGGAACCTGTGGTTTCTGC3'
66R：5'TTGAGTGACCTCGTTGACGG3'
67F：5'CAAGTCATTGGGTCTTTAGTT3'
67R：5'AAAGGTCCCCTTTCTGGAAT3'
68F：5'CTCATAAAGATGCTTTTGGTCAG3'
68R：5'CAATGGAGATAGTAGCGGATG3'
69F：5'GATTGGTGCTGTCTTTAGGGT3'
69R：5'AAGTCTTGGCTTGGGGTATG3'
70F：5'CCTAATGCTTCCCCACTGCT3'
70R：5'TGCCTTGTCCATTCTTGTCTG3'
71F：5'GTAACTCCACTCGCAGCACTAC3'
71R：5'GAATCTGGCAGGTACTTCAGG3'
72F：5'AGGAATGGGGTGCTTCTGTT3'
72R：5'GGGTCAAGGCTGTTCAGTTTC3'
73F：5'CCACTCACCCACTTCCCTCTT3'
73R：5'ACGGATTTCTTCTTCTATCACAT3'
74F：5'GGCAAGACCTCCTCCATCAG3'
74R：5'GGGCTTCCAGTTCTTCACCT3'
75F：5'GGATTCACTTGCCCCTTACAT3'
75R：5'TGATGTTCACAGCATGATGTCC3'
76F：5'CCCTCTGTTATCTGACTTTTCC3'
76R：5'TGCATGTCTAGCCTGGTGTT3'
77F：5'CTTTGGAGTGCTGCTATGGG3'
77R：5'TGAGGGTGCGAACTCGTCTAG3'
78F：5'ATTACGGCTACCAGCAACAG3'
78R：5'GGAAACATCTATGACCCCAAC3'。
上述方案中，在所述78对引物组的5’端均插入通用标签序列：CGCTTTACTGACGCGTTGC，针对通用标签序列可进行PCR产物的二次扩增，从而能够放大PCR产物，降低生产成本，提高探针制备效率。
一种包含上述用于检测ALK基因不含重复序列的FISH探针的试剂盒。
上述试剂盒中，所述FISH探针为荧光原位杂交双色探针，所述FISH双色探针为粉剂，所述FISH双色探针包括ALK红色荧光探针及ALK绿色荧光探针，所述ALK红色荧光探针与ALK绿色荧光探针的质量比为1:4。
上述试剂盒中，所述FISH探针为荧光原位杂交双色探针，所述FISH双色探针为液体试剂，所述FISH双色探针是通过将ALK红色荧光探针及ALK绿色荧光探针溶解在2x柠檬酸钠缓冲液得到，其中ALK红色荧光探针的浓度为5ng/ul（w/v），ALK绿色荧光探针的浓度为20ng/ul（w/v），所述2x柠檬酸钠缓冲液是以氯化钠8.8g，柠檬酸钠4.4g，去离子水400ml配置而成。
上述试剂盒中，还包括4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）复染液。
一种利用上述试剂盒对ALK基因进行检测的方法，具体包括如下步骤：（1）将待检测组织固定在玻片上，对玻片上的待测组织进行预处理；（2）将探针与玻片上的待测组织进行核苷酸序列的变性杂交；（3）杂交后，对玻片进行洗涤；（4）使用复染液对玻片上的杂交区域进行复染；（5）使用荧光显微镜观察玻片的杂交区域。
上述方案中，步骤（1）所述待检测组织的预处理为：（1）将待测石蜡组织切片置于破片上，再将玻片置于65℃下烘烤12～16小时，然后用二甲苯脱蜡，随后将玻片依次置于100%（vt%）、85%（vt%）、70%（vt%）乙醇梯度溶液中各2分钟，再浸入去离子水中3分钟，取出后用吸水纸吸取多余的水分；（3）用酸性亚硫酸钠在50℃下处理组织玻片20～30分钟，90℃下用水处理玻片30分钟，再用2×柠檬酸钠缓冲液漂洗，然后于37℃下将玻片浸泡在蛋白酶K溶液中10～20分钟，随后用2×柠檬酸钠缓冲液漂洗；（4）用甲醛固定玻片，再将玻片置于乙醇梯度溶液中脱水，最后经自然晾干，并加热到56℃，备用。
上述方案中，步骤（2）所述探针与待测组织的核苷酸序列变性杂交为：（1）取探针试剂2ul，2x柠檬酸钠缓冲液7ul，去离子水1ul，混合得到探针混合液，于78℃条件下变性5分钟，再迅速置于45℃条件下，杂交前取出；（2）将经预处理后的玻片浸入到78℃甲酰胺/2×柠檬酸钠缓冲液中变性处理30分钟，再置于-20℃预冷的70%（vt%）、85%（vt%）、100%（vt%）乙醇梯度溶液中进行脱水处理，然后将玻片自然干燥后，置于45℃条件预热；（3）将上述变性后的探针混合液滴于玻片杂交区域，置于45℃条件下杂交12～16小时。
上述方案中，步骤（3）所述玻片洗涤为：移去盖玻片，将玻片置于0.3%（wt%）乙基苯基聚乙二醇/0.4×柠檬酸钠缓冲液中，漂洗2分钟；再将破片置于0.1%（wt%）乙基苯基聚乙二醇/2×柠檬酸钠缓冲液中，漂洗30秒；最后将玻片置于70%（vt%）乙醇中，漂洗3分钟。
现有技术中，因ALK基因FISH探针中含有大量重复序列，使用前，首先需要用Cot-1DNA试剂将样本DNA中的重复序列封闭，该封闭实验不仅耗时，而且所用的试剂价格昂贵；本发明制备的ALK基因FISH探针不含重复序列，在使用时，无需用Cot-1DNA试剂进行封闭实验，操作方便，经济高效，大大缩短了试剂盒的检测时间。
本发明的有益效果：
（1）本发明FISH探针的制备过程，综合了核酸杂交技术、荧光标记技术、荧光显微显像技术，FISH探针作为基因断裂、融合等突变检测的金标准，检测灵敏度高；
（2）本发明制备的不含重复序列FISH探针对ALK核酸分子的杂交识别，具有准确性高，特异性好、及假阳性低的优点；
（3）本发明中探针及试剂盒的生产成本低，便于规模化生产；
（4）本发明所述试剂盒的操作简单、安全，同时减少了Cot-1DNA试剂、罗丹明抗-地高辛抗体等昂贵试剂的使用，经济高效；
（5）与现有技术相比，本发明所述试剂盒的检测方法，无需使用Cot-1DNA对样本基因进行封闭，操作方便，检测速度快，可在12-24小试内完成杂交检测实验。
附图说明
图1是ALK基因使用Repeat Masking数据库分析后得出的重复和非重复序列示意图，其中XXX…XXX代表重复序列。
图2是1-78对引物组PCR产物电泳图，其中模板是BAC克隆的ALK基因DNA，图中，分子量标记物(M)是DNA梯（DNA ladder），1、2、3……78为各自对应引物对所扩增的产物。
图3是不含重复序列ALK探针荧光原位杂交图，其中模板是非小细胞肺癌样本。图中①是ALK红色探针和绿色探针标记DNA片段连接一起；②是ALK红色荧光标记DNA片段；③是ALK绿色荧光探针标记DNA片段。红色和绿色探针标记DNA片段融合者为野生型ALK基因，如图中白色箭头所示；红色或绿色荧光探针标记DNA未连接者为突变型ALK基因，如图中黑色箭头所示，表现为ALK基因断裂形式。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合附图、实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实例。
实施例1
引物组的合成：通过在线分析数据库Repeat Masking（http://www.girinst.org/)对ALK基因进行分析，得到ALK基因的重复与非重复序列（如图1所示），将非重复序列导入引物设计软件Primer5进行引物设计，设计引物扩增产物在350～800bp，并用人工合成的方法合成如下78对引物：
1F：5'ACTGTTGTTCCACCCAAGATG3'
1R：5'ACCAGGCTGTTCCAAGTATGA3'
2F：5'GGAAGATACACCCAATCC3'
2R：5'AACCTCCTCCACTACCTC3'
3F：5'TGCCAGGTAGTCACATCAT3'
3R：5'AGGCCACATTCCTAAACA3'
4F：5'ACCCTTTGTATTCTTCTTCATCTTG3'
4R：5'GCCTTTTAGTAGTCCTTCCAGTG3'
5F：5'GGGATGGCTGCTGCTCTT3'
5R：5'GATGCTGCCTGGGAAACAA3'
6F：5'GAGTCAAAGAATGCTGGGTA3'
6R：5'CTTCCTTGGAGGATAAACA3'
7F：5'CGATTTCTGTGCCTCTTG3'
7R：5'GCTCTGCTCTGCCTACCT3'
8F：5'GAGGTCATTGTAAGGAGGAT3'
8R：5'AGGTCAGCACATGCCACT3'
9F：5'ATGTAGTCAAGGCAGGTTTC3'
9R：5'CAAGCGTTAAGGGTTAGG3'
10F：5'GCAGGCTGGAAATCTATG3'
10R：5'TCCCACTGGAAGGGTTAT3'
11F：5'CTGGGCAGGCTGCTTATC3'
11R：5'GTGGCACAGAGTTTGTTTCC3'
12F：5'TTCGGGAGAAGGCACAAT3'
12R：5'CAAGGGCAAAGCCAGCAA3'
13F：5'TAATGCTTTGCTGGTCTG3'
13R：5'AGGGCTCTTAAATTGGTC3'
14F：5'TAGGGCTGGAAAGGTGATGG3'
14R：5'TGGCTCTGGCTTGCTGAA3'
15F：5'TGCCTATGTGCCACCCTC3'
15R：5'CAGCCTGTTAGTGCTCCAAG3'
16F：5'GGCAGATGTGGATGCTGTAGA3'
16R：5'TGAGGGGAATTAGGGAGTGG3'
17F：5'AGGAACAAGCCCTGAGAC3'
17R：5'CTTAGACAACCCGACCAC3'
18F：5'CAGCCTAAGTTGTTTGTTCC3'
18R：5'TTCCGATTGCTCTATGTTTCA3'
19F：5'CCAGGGAAATCCTCAGAACA3'
19R：5'ATGGCATCCGCAGCAATC3'
20F：5'ACCGTTCATCACCCATCA3'
20R：5'TTCTATCCCACCCTCTACC3'
21F：5'GACCAAGGGCTACAAGTT3'
21R：5'GGAGGCAAGGAGAATACA3'
22F：5'CTGCTGACTGTATTTTGGTGCT3'
22R：5'GCTAGGGAGTTGGAGGGATTA3'
23F：5'AGGGCTTAGCACCATTCG3'
23R：5'AACTCTGCCTCCCACATC3'
24F：5'GGTTCTGAAGAGGAGGCA3'
24R：5'AGGATAGTGGTGTTGAGGC3'
25F：5'ATAAAGTAGGGATGGAGGC3'
25R：5'ATAGGGAGCTGAGGGAAT3'
26F：5'CGTTGCCAGGAACAAGAAAG3'
26R：5'CCACAAAAGGGGAATAGGGA3'
27F：5'ACTCATCATTAGCCACCCATTT3'
27R：5'GGTCATCCCCAACTTCAACAT3'
28F：5'AGGCTGTGAGTCTGAGGT3'
28R：5'AGCTTTCCCAGTTCTTCC3'
29F：5'ATTCCACCAAGTCACCAT3'
29R：5'AAGACTGCCCAGAAAGAT3'
30F：5'ACTAACAGGCAGGCAGAA3'
30R：5'AACTTGAGATACTTGGAGGG3'
31F：5'GAGTCTCCAACGGTGTTC3'
31R：5'TTACATCCTCCCACAAAA3'
32F：5'TATGCCTGGCTGTGACTC3'
32R：5'TGTGCCCACTACTGACCC3'
33F：5'TTCGGGAGCATTGATTGG3'
33R：5'CGACTTGGGACTTGACACC3'
34F：5'CTGGTAGTCAGGCATTGTGG3'
34R：5'AGTGAAGTGAGCCGTGGG3'
35F：5'CATGCCATGCAATTTACC3'
35R：5'TCACTTCTTCCTCCCTCA3'
36F：5'CCATTTGGCTTTTGCCTTTA3'
36R：5'TTGCTGTTTGTCATTTGTCCC3'
37F：5'ACAACAGGAAGGGCATAGGAG3'
37R：5'CAGGAGCCAAACCGCAAG3'
38F：5'CCATTTGGCTTTTGCCTTTA3'
38R：5'TTGCTGTTTGTCATTTGTCCC3'
39F：5'TTGGCATTGACAGTTGAGG3'
39R：5'TGAAGCTGGAATAAGGAAGAA3'
40F：5'ATTAGGGATACAGATGGGATT3'
40R：5'GGTTAGCAGAGGTGGTCAA3'
41F：5'TACCCTACTCCCAACTATCATC3'
41R：5'CTCAACATAAACTCTGCTTCACTC3'
42F：5'AGAGTAAACCAAAGGGTCAGAAAGC3'
42R：5'CATAGGTCCTAAGTGCCACATAAT3'
43F：5'CATGGTTGTGGCGCTGTATG3'
43R：5'CAGGTTGGCAGAATGTTGAGT3'
44F：5'CTTCCTGTCCGCAATAAATGG3'
44R：5'ACCCTCCCTTTTCTCACCACC3'
45F：5'ATGAAGCAGTTGGCAGAGGAG3'
45R：5'GAAATGGATGTGAGTAGCGTGT3'
46F：5'CCACGGGAAGAGTGGTGAG3'
46R：5'GAGAAGGGAGACTGGGCTGT3'
47F：5'GATTACTGGTGCTGAGTTGGC3'
47R：5'TGGCATTGGAGTGGTAGGAT3'
48F：5'GGGAGTGAGAAGGGCTGTTT3'
48R：5'CGCTTGGTGATTTTGGAATT3'
49F：5'TATTGTATGTGAGGTGAATGGGT3'
49R：5'GAGGGTTTGAGACTGTTTCTTGT3'
50F：5'CTGGGGATATTGTGCTTGTT3'
50R：5'ACTGGAGTCCTGCCTTTGTC3'
51F：5'GGGTAGGCAGGATATGGGTT3'
51R：5'GAAGGGGCTGGACATTTCTC3'
52F：5'CTCTTTTGGCACCCCTCACT3'
52R：5'CCCTGCTTCCTAATCACTTCC3'
53F：5'TTGATTCCCATCTCCTCCTT3'
53R：5'GTACAGTATGTCAGCATTCCAG3'
54F：5'ATTTGCCACTCACTGCTATGTT3'
54R：5'CTGCTTTGTCACCCTTTACG3'
55F：5'CACAGAAAGCAGCACTGAGAC3'
55R：5'TCCCAGGGAGAAAGGAACATAC3'
56F：5'AACCCATGTCACCTCCTTATT3'
56R：5'GGTAGTGTCTGCTGTTACTTTCC3'
57F：5'CTGTATTGATCCAGACAAACTC3'
57R：5'CGGTTGCATTATTACTACATAGCT3'
58F：5'CCCACAACAAATACTCCTGC3'
58R：5'TCAATCAATCCCTCCCCATC3'
59F：5'CTGGGGTATGTTTACAGGTTCAC3'
59R：5'TGCCCAAGCAGGCATTGTTTCT3'
60F：5'AAGATGGGCTCAGTGTTGGAT3'
60R：5'GAGGCTTTGGTTGCTGTTGT3'
61F：5'GAGTTAAGCTCCCCACCAAT3'
61R：5'TTTCTAAGCCCAAGACTTTCAG3'
62F：5'TCATTCTTCTCCTCCTCCCAG3'
62R：5'CCTGACCCACTCCCTACAGC3'
63F：5'GAGCAAGCAGTTGGGGAAAG3'
63R：5'TATGGAGGGTGGATGGGAAG3'
64F：5'CCAGACCAGCCTTCTCCTTC3'
64R：5'CCTGCACAGATAGCTCCACCCT3'
65F：5'TAAGAAAACTGTAAACCAGCAC3'
65R：5'CCCTGAGTCTCCCATCTGTC3'
66F：5'ATGGAACCTGTGGTTTCTGC3'
66R：5'TTGAGTGACCTCGTTGACGG3'
67F：5'CAAGTCATTGGGTCTTTAGTT3'
67R：5'AAAGGTCCCCTTTCTGGAAT3'
68F：5'CTCATAAAGATGCTTTTGGTCAG3'
68R：5'CAATGGAGATAGTAGCGGATG3'
69F：5'GATTGGTGCTGTCTTTAGGGT3'
69R：5'AAGTCTTGGCTTGGGGTATG3'
70F：5'CCTAATGCTTCCCCACTGCT3'
70R：5'TGCCTTGTCCATTCTTGTCTG3'
71F：5'GTAACTCCACTCGCAGCACTAC3'
71R：5'GAATCTGGCAGGTACTTCAGG3'
72F：5'AGGAATGGGGTGCTTCTGTT3'
72R：5'GGGTCAAGGCTGTTCAGTTTC3'
73F：5'CCACTCACCCACTTCCCTCTT3'
73R：5'ACGGATTTCTTCTTCTATCACAT3'
74F：5'GGCAAGACCTCCTCCATCAG3'
74R：5'GGGCTTCCAGTTCTTCACCT3'
75F：5'GGATTCACTTGCCCCTTACAT3'
75R：5'TGATGTTCACAGCATGATGTCC3'
76F：5'CCCTCTGTTATCTGACTTTTCC3'
76R：5'TGCATGTCTAGCCTGGTGTT3'
77F：5'CTTTGGAGTGCTGCTATGGG3'
77R：5'TGAGGGTGCGAACTCGTCTAG3'
78F：5'ATTACGGCTACCAGCAACAG3'
78R：5'GGAAACATCTATGACCCCAAC3'。
其中1、2、3……78为引物名称，F为上游引物，R为下游引物。进一步，将上述78对引物组的5’端均添加通用标签序列：CGCTTTACTGACGCGTTGC，用于PCR产物的二次扩增。
实施例2
ALK基因BAC克隆构建，其步骤如下：
①基因组DNA制备：采用市售DNA提取试剂盒对非小细胞肺癌组织中的DNA进行提取；
②基因组DNA酶切：选择限制性内切酶HindⅢ对基因组DNA进行酶切，酶切产物进行DNA电泳，电泳后选取并回收200～300kb片段的DNA片段；
③大片段DNA与BAC克隆连接：采用市售pIndigoBAC-5为载体，按照载体与大片段DNA的质量比为1:10比例构建连接体系：
16℃，连接16小时；65℃处理20分钟灭活T4连接酶；连接产物用0.025umMillipore膜透析3小时，透析完的连接产物分装于0.5ml的离心管中，转化入DH10B细胞中并培养筛选；
④ALK基因克隆筛选：针对ALK基因设计引物，采用PCR方法对上述构建的BAC克隆进行筛选，将具有PCR产物的片段进行回收，转入T载体后进行测序分析，比对ALK基因序列，与ALK基因匹配者即为含有ALK基因的BAC克隆。
实施例3
用实施例1中合成的78对引物组PCR扩增实施例2制备得到的ALK基因BAC克隆，包括如下步骤：
①培养ALK基因BAC克隆菌，涂抹于培养基平板上，培养，挑选单克隆，摇瓶培养该克隆菌，从该菌中提取BAC克隆DNA；
②用PCR反应扩增不含重复序列的BAC克隆DNA，PCR反应体系为25ul：
PCR扩增程序：
③通过PCR扩增的电泳结果如图2所示，PCR产物长度为350-800bp不等。
实施例4
将实施例3所得PCR产物克隆到市售T载体中，以便保存，PCR产物克隆到T载体中，包括如下步骤：
①取4个灭菌的200ul微量离心管，反应体系10ul：
②上述混合液轻轻震荡后，12000rpm，30秒离心，然后置于14℃中保温过夜（12-16h）；
③连接后的产物置4℃冰箱备用或-85℃长期保存。
当需要二次PCR扩增时，对通用标签序列CGCTTTACTGACGCGTTGC进行扩增，上游引物为CGCTTTACTGACGCGTTGC，下游引物为GCAACGCGTCAGTAAGCG，扩增反应体系和反应程序如实施例3所述，得到大量的不含重复序列的PCR产物，减少生产环节和成本，提高生产效率。
实施例5
一种ALK基因不含重复序列荧光探针的制备，本实施例中，利用上述实施例3中用78对特异性引物制备的PCR产物，通过常规的随机引物方法来制备FISH探针。使用Life Technology公司的随机引物标记试剂盒，其中使用红色荧光素标记试剂盒制备得到红色荧光探针，使用绿色荧光素标记试剂盒制备得到绿色荧光探针，操作过程为：
（1）将100mg PCR产物DNA溶入24ul水中，冰浴，加入20ul随机引物溶液，混合后的DNA煮沸变性5分钟，立即置于冰上；
（2）加入5ul10×dNTP溶液，混匀，再加入1ul Taq酶溶液；
（3）混匀后，将反应物在37℃中培养1小时，取2ul做凝胶电泳检查，如果被标记的DNA探针片段在150-350bp之间，标记效果最佳；
（4）75℃加热10分钟终止反应，或者加入5ul反应终止液，即得到荧光标记的不含重复序列ALK基因FISH探针。
实施例6
一种不含重复序列ALK探针荧光原位杂交试剂盒，包括荧光原位双色探针：ALK红色荧光探针及ALK绿色荧光探针，所述双色探针为液体试剂，通过ALK红色荧光探针及ALK绿色荧光探针溶液于200ul缓冲液得到，其中ALK红色荧光探针浓度为5ng/ul，ALK绿色荧光探针浓度为20ng/ul，所述缓冲液为：氯化钠8.8g，柠檬酸钠4.4g，去离子水400ml配置而成的2x柠檬酸钠缓冲液。
本试剂盒还包括：4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）复染液300ul。
利用上述不含重复序列ALK探针荧光原位杂交试剂盒对ALK基因进行检测的方法：
①待测样品石蜡切片的预处理：a.经10%福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片3～5um，置于干净的涂胶玻片上，将组织切片置于65℃下烘烤过夜（12～16小时），老化玻片，再将组织切片浸于二甲苯中室温脱蜡2次，每次10分钟，随后浸入100%（vt%）乙醇中5分钟；b.将组织切片依次置于100%（vt%）乙醇、85%（vt%）乙醇和70%（vt%）乙醇中各2分钟，再将组织切片在室温下浸入去离子水中3分钟，取出后用吸水纸吸取多余的水分；c.用30%（wt%）酸性亚硫酸钠在50℃下处理组织切片20～30分钟，90℃下用水处理切片30分钟，然后于室温下用2×柠檬酸钠缓冲液中漂洗2次，每次5分钟，再将组织切片浸泡于200ug/ul蛋白酶K溶液中，37℃，10～20分钟，随后用2×柠檬酸钠缓冲液漂洗2次，每次5分钟；d.室温下用甲醛固定5分钟，再将组织切片依次置于70%（vt%）乙醇、85%（vt%）乙醇和100%（vt%）乙醇中脱水，各2分钟，最后待破片自然干燥后，加热至56摄氏度，备用；
②探针与待测组织核苷酸序列杂交：a.室温下将如下液体加入到试管中，
2×柠檬酸钠缓冲液 7.0ul
去离子水 1.0ul
探针 2.0ul
离心1～3秒，混匀后再次离心1～3秒，将试管置于78℃水浴箱中变性5分钟，迅速置于45℃水浴箱中，杂交前取出；b.将上述预处理后的玻片浸入78℃预热的70%（wt%）甲酰胺/2×柠檬酸钠缓冲液中30分钟，再依次置于-20℃预冷的70%（vt%）乙醇、85%（vt%）乙醇和100%（vt%）乙醇中，各2分钟，室温下自然干燥，置于45℃预热5分钟；c.将上述10ul的探针混合液滴于破片杂交区域，立即加盖盖玻片，用橡皮胶封边，将玻片置于湿盒中，45℃中过夜杂交；
③玻片洗涤：移去盖玻片，将玻片置于0.3%（wt%）乙基苯基聚乙二醇/0.4×柠檬酸钠缓冲液中，振荡1～3秒，漂洗2分钟；再将破片置于0.1%（wt%）乙基苯基聚乙二醇/2×柠檬酸钠缓冲液中，振荡1～3秒，漂洗30秒；最后将玻片置于70%（vt%）乙醇中，漂洗3分钟；
④复染：暗处自然晾干玻片，将15ul DAPI复染剂加于杂交区域，立即盖上盖玻片，暗处放置10～20分钟；
⑤FISH结果观察：使用荧光显微镜对杂交区域的标本进行观察。
结果如图3所示，图3为不含重复序列ALK探针荧光原位杂交图，其中模板是非小细胞肺癌样本。图中①是ALK绿色荧光探针标记DNA片段；②是ALK红色荧光标记DNA片段；③是ALK红色探针和绿色探针标记DNA片段融合一起。红色和绿色探针标记DNA片段融合者为野生型ALK基因，如图中白色箭头所示；红色或绿色荧光探针标记DNA未融合、彼此分离者为突变型ALK基因，如图中黑色箭头所示，表现为ALK基因断裂形式。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于检测ALK基因不含重复序列的FISH探针，其特征在于，所述FISH探针DNA以ALK基因为模板，利用78对PCR引物组或与引物组具有同一性的核苷酸序列，进行PCR扩增反应制备得到，所述78对PCR引物组为：
1F：5'ACTGTTGTTCCACCCAAGATG3'
1R：5'ACCAGGCTGTTCCAAGTATGA3'
2F：5'GGAAGATACACCCAATCC3'
2R：5'AACCTCCTCCACTACCTC3'
3F：5'TGCCAGGTAGTCACATCAT3'
3R：5'AGGCCACATTCCTAAACA3'
4F：5'ACCCTTTGTATTCTTCTTCATCTTG3'
4R：5'GCCTTTTAGTAGTCCTTCCAGTG3'
5F：5'GGGATGGCTGCTGCTCTT3'
5R：5'GATGCTGCCTGGGAAACAA3'
6F：5'GAGTCAAAGAATGCTGGGTA3'
6R：5'CTTCCTTGGAGGATAAACA3'
7F：5'CGATTTCTGTGCCTCTTG3'
7R：5'GCTCTGCTCTGCCTACCT3'
8F：5'GAGGTCATTGTAAGGAGGAT3'
8R：5'AGGTCAGCACATGCCACT3'
9F：5'ATGTAGTCAAGGCAGGTTTC3'
9R：5'CAAGCGTTAAGGGTTAGG3'
10F：5'GCAGGCTGGAAATCTATG3'
10R：5'TCCCACTGGAAGGGTTAT3'
11F：5'CTGGGCAGGCTGCTTATC3'
11R：5'GTGGCACAGAGTTTGTTTCC3'
12F：5'TTCGGGAGAAGGCACAAT3'
12R：5'CAAGGGCAAAGCCAGCAA3'
13F：5'TAATGCTTTGCTGGTCTG3'
13R：5'AGGGCTCTTAAATTGGTC3'
14F：5'TAGGGCTGGAAAGGTGATGG3'
14R：5'TGGCTCTGGCTTGCTGAA3'
15F：5'TGCCTATGTGCCACCCTC3'
15R：5'CAGCCTGTTAGTGCTCCAAG3'
16F：5'GGCAGATGTGGATGCTGTAGA3'
16R：5'TGAGGGGAATTAGGGAGTGG3'
17F：5'AGGAACAAGCCCTGAGAC3'
17R：5'CTTAGACAACCCGACCAC3'
18F：5'CAGCCTAAGTTGTTTGTTCC3'
18R：5'TTCCGATTGCTCTATGTTTCA3'
19F：5'CCAGGGAAATCCTCAGAACA3'
19R：5'ATGGCATCCGCAGCAATC3'
20F：5'ACCGTTCATCACCCATCA3'
20R：5'TTCTATCCCACCCTCTACC3'
21F：5'GACCAAGGGCTACAAGTT3'
21R：5'GGAGGCAAGGAGAATACA3'
22F：5'CTGCTGACTGTATTTTGGTGCT3'
22R：5'GCTAGGGAGTTGGAGGGATTA3'
23F：5'AGGGCTTAGCACCATTCG3'
23R：5'AACTCTGCCTCCCACATC3'
24F：5'GGTTCTGAAGAGGAGGCA3'
24R：5'AGGATAGTGGTGTTGAGGC3'
25F：5'ATAAAGTAGGGATGGAGGC3'
25R：5'ATAGGGAGCTGAGGGAAT3'
26F：5'CGTTGCCAGGAACAAGAAAG3'
26R：5'CCACAAAAGGGGAATAGGGA3'
27F：5'ACTCATCATTAGCCACCCATTT3'
27R：5'GGTCATCCCCAACTTCAACAT3'
28F：5'AGGCTGTGAGTCTGAGGT3'
28R：5'AGCTTTCCCAGTTCTTCC3'
29F：5'ATTCCACCAAGTCACCAT3'
29R：5'AAGACTGCCCAGAAAGAT3'
30F：5'ACTAACAGGCAGGCAGAA3'
30R：5'AACTTGAGATACTTGGAGGG3'
31F：5'GAGTCTCCAACGGTGTTC3'
31R：5'TTACATCCTCCCACAAAA3'
32F：5'TATGCCTGGCTGTGACTC3'
32R：5'TGTGCCCACTACTGACCC3'
33F：5'TTCGGGAGCATTGATTGG3'
33R：5'CGACTTGGGACTTGACACC3'
34F：5'CTGGTAGTCAGGCATTGTGG3'
34R：5'AGTGAAGTGAGCCGTGGG3'
35F：5'CATGCCATGCAATTTACC3'
35R：5'TCACTTCTTCCTCCCTCA3'
36F：5'CCATTTGGCTTTTGCCTTTA3'
36R：5'TTGCTGTTTGTCATTTGTCCC3'
37F：5'ACAACAGGAAGGGCATAGGAG3'
37R：5'CAGGAGCCAAACCGCAAG3'
38F：5'CCATTTGGCTTTTGCCTTTA3'
38R：5'TTGCTGTTTGTCATTTGTCCC3'
39F：5'TTGGCATTGACAGTTGAGG3'
39R：5'TGAAGCTGGAATAAGGAAGAA3'
40F：5'ATTAGGGATACAGATGGGATT3'
40R：5'GGTTAGCAGAGGTGGTCAA3'
41F：5'TACCCTACTCCCAACTATCATC3'
41R：5'CTCAACATAAACTCTGCTTCACTC3'
42F：5'AGAGTAAACCAAAGGGTCAGAAAGC3'
42R：5'CATAGGTCCTAAGTGCCACATAAT3'
43F：5'CATGGTTGTGGCGCTGTATG3'
43R：5'CAGGTTGGCAGAATGTTGAGT3'
44F：5'CTTCCTGTCCGCAATAAATGG3'
44R：5'ACCCTCCCTTTTCTCACCACC3'
45F：5'ATGAAGCAGTTGGCAGAGGAG3'
45R：5'GAAATGGATGTGAGTAGCGTGT3'
46F：5'CCACGGGAAGAGTGGTGAG3'
46R：5'GAGAAGGGAGACTGGGCTGT3'
47F：5'GATTACTGGTGCTGAGTTGGC3'
47R：5'TGGCATTGGAGTGGTAGGAT3'
48F：5'GGGAGTGAGAAGGGCTGTTT3'
48R：5'CGCTTGGTGATTTTGGAATT3'
49F：5'TATTGTATGTGAGGTGAATGGGT3'
49R：5'GAGGGTTTGAGACTGTTTCTTGT3'
50F：5'CTGGGGATATTGTGCTTGTT3'
50R：5'ACTGGAGTCCTGCCTTTGTC3'
51F：5'GGGTAGGCAGGATATGGGTT3'
51R：5'GAAGGGGCTGGACATTTCTC3'
52F：5'CTCTTTTGGCACCCCTCACT3'
52R：5'CCCTGCTTCCTAATCACTTCC3'
53F：5'TTGATTCCCATCTCCTCCTT3'
53R：5'GTACAGTATGTCAGCATTCCAG3'
54F：5'ATTTGCCACTCACTGCTATGTT3'
54R：5'CTGCTTTGTCACCCTTTACG3'
55F：5'CACAGAAAGCAGCACTGAGAC3'
55R：5'TCCCAGGGAGAAAGGAACATAC3'
56F：5'AACCCATGTCACCTCCTTATT3'
56R：5'GGTAGTGTCTGCTGTTACTTTCC3'
57F：5'CTGTATTGATCCAGACAAACTC3'
57R：5'CGGTTGCATTATTACTACATAGCT3'
58F：5'CCCACAACAAATACTCCTGC3'
58R：5'TCAATCAATCCCTCCCCATC3'
59F：5'CTGGGGTATGTTTACAGGTTCAC3'
59R：5'TGCCCAAGCAGGCATTGTTTCT3'
60F：5'AAGATGGGCTCAGTGTTGGAT3'
60R：5'GAGGCTTTGGTTGCTGTTGT3'
61F：5'GAGTTAAGCTCCCCACCAAT3'
61R：5'TTTCTAAGCCCAAGACTTTCAG3'
62F：5'TCATTCTTCTCCTCCTCCCAG3'
62R：5'CCTGACCCACTCCCTACAGC3'
63F：5'GAGCAAGCAGTTGGGGAAAG3'
63R：5'TATGGAGGGTGGATGGGAAG3'
64F：5'CCAGACCAGCCTTCTCCTTC3'
64R：5'CCTGCACAGATAGCTCCACCCT3'
65F：5'TAAGAAAACTGTAAACCAGCAC3'
65R：5'CCCTGAGTCTCCCATCTGTC3'
66F：5'ATGGAACCTGTGGTTTCTGC3'
66R：5'TTGAGTGACCTCGTTGACGG3'
67F：5'CAAGTCATTGGGTCTTTAGTT3'
67R：5'AAAGGTCCCCTTTCTGGAAT3'
68F：5'CTCATAAAGATGCTTTTGGTCAG3'
68R：5'CAATGGAGATAGTAGCGGATG3'
69F：5'GATTGGTGCTGTCTTTAGGGT3'
69R：5'AAGTCTTGGCTTGGGGTATG3'
70F：5'CCTAATGCTTCCCCACTGCT3'
70R：5'TGCCTTGTCCATTCTTGTCTG3'
71F：5'GTAACTCCACTCGCAGCACTAC3'
71R：5'GAATCTGGCAGGTACTTCAGG3'
72F：5'AGGAATGGGGTGCTTCTGTT3'
72R：5'GGGTCAAGGCTGTTCAGTTTC3'
73F：5'CCACTCACCCACTTCCCTCTT3'
73R：5'ACGGATTTCTTCTTCTATCACAT3'
74F：5'GGCAAGACCTCCTCCATCAG3'
74R：5'GGGCTTCCAGTTCTTCACCT3'
75F：5'GGATTCACTTGCCCCTTACAT3'
75R：5'TGATGTTCACAGCATGATGTCC3'
76F：5'CCCTCTGTTATCTGACTTTTCC3'
76R：5'TGCATGTCTAGCCTGGTGTT3'
77F：5'CTTTGGAGTGCTGCTATGGG3'
77R：5'TGAGGGTGCGAACTCGTCTAG3'
78F：5'ATTACGGCTACCAGCAACAG3'
78R：5'GGAAACATCTATGACCCCAAC3'。
2.根据权利要求1所述FISH探针，其特征在于在所述78对引物组的5’端均插入通用标签序列：CGCTTTACTGACGCGTTGC。
3.一种包含权利要求1～2所述用于检测ALK基因不含重复序列的FISH探针的试剂盒。
4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于所述FISH探针为荧光原位杂交双色探针，所述FISH双色探针为粉剂，所述FISH双色探针包括ALK红色荧光探针及ALK绿色荧光探针，所述ALK红色荧光探针与ALK绿色荧光探针的质量比为1:4。
5.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于所述FISH探针为荧光原位杂交双色探针，所述FISH双色探针为液体试剂，所述FISH双色探针是通过将ALK红色荧光探针及ALK绿色荧光探针溶解在2x柠檬酸钠缓冲液得到，其中ALK红色荧光探针的浓度为5ng/ul（w/v），ALK绿色荧光探针的浓度为20ng/ul（w/v）。
6.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）复染液。
7.一种利用权利要求3～6所述试剂盒对ALK基因进行检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将待检测组织固定在玻片上，对玻片上的待测组织进行预处理；（2）将探针与玻片上的待测组织进行核苷酸序列的变性杂交；（3）杂交后，对玻片进行洗涤；（4）使用复染液对玻片上的杂交区域进行复染；（5）使用荧光显微镜观察玻片的杂交区域。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于步骤（2）所述探针与待测组织的核苷酸序列变性杂交为：（1）取探针试剂2ul，2x柠檬酸钠缓冲液7ul，去离子水1ul，混合得到探针混合液，于78℃条件下变性5分钟，再迅速置于45℃条件下，杂交前取出；（2）将经预处理后的待测组织玻片浸入到78℃甲酰胺/2×柠檬酸钠缓冲液中变性处理30分钟，再依次置于-20℃预冷的70%（vt%）、85%（vt%）、100%（vt%）乙醇梯度溶液中进行脱水处理，然后将玻片自然干燥后，置于45℃条件预热5分钟；（3）将上述变性后的探针混合液滴于玻片杂交区域，置于45℃条件下杂交12～16小时。
9.根据权利要求7所述检测方法，其特征在于步骤（1）所述待检测组织的预处理为：（1）将待测石蜡组织切片置于破片上，再将玻片置于65℃下烘烤12～16小时，然后用二甲苯脱蜡，随后将玻片依次置于100%（vt%）、85%（vt%）、70%（vt%）乙醇梯度溶液中进行水化处理；（2）用酸性亚硫酸钠在50℃下处理组织玻片20～30分钟，90℃下用水处理玻片30分钟，再用2×柠檬酸钠缓冲液漂洗，然后于37℃下将玻片浸泡在蛋白酶K溶液中10～20分钟，随后用2×柠檬酸钠缓冲液漂洗；（3）用甲醛固定玻片，再将玻片置于乙醇梯度溶液中脱水，最后经自然晾干，并加热到56℃，备用。
10.根据权利要求7所述检测方法，其特征在于步骤（3）所述玻片洗涤为：将玻片置于0.3%（wt%）乙基苯基聚乙二醇/0.4×柠檬酸钠缓冲液中，漂洗2分钟；再将破片置于0.1%（wt%）乙基苯基聚乙二醇/2×柠檬酸钠缓冲液中，漂洗30秒；最后将玻片置于70%（vt%）乙醇中，漂洗3分钟。
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2013102603988A Pending CN103409506A (zh) | 2013-06-26 | 2013-06-26 | 一种用于检测alk基因不含重复序列的fish探针、试剂盒及其检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103409506A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105087770A (zh) * | 2015-04-14 | 2015-11-25 | 广州安必平医药科技股份有限公司 | 一种用于快速检测唐氏综合征无重复片段的fish探针、试剂盒及其制备方法 |
| CN107227350A (zh) * | 2017-06-09 | 2017-10-03 | 苏州达麦迪生物医学科技有限公司 | 一种快速检测alk基因断裂的探针组、试剂盒及方法 |
| WO2018014845A1 (zh) * | 2016-07-22 | 2018-01-25 | 厦门艾德生物医药科技股份有限公司 | 一种fish探针的制备方法 |
| CN113913500A (zh) * | 2021-09-15 | 2022-01-11 | 武汉友芝友医疗科技股份有限公司 | 一种用于检测alk基因重排的探针组及其应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003014385A1 (fr) * | 2001-07-27 | 2003-02-20 | The University Of Hong Kong | Nouveau procede d'elimination d'une sequence de repetition dans le genome, et sa mise en oeuvre pour la preparation d'une sonde fish |
| CN102719525A (zh) * | 2012-04-12 | 2012-10-10 | 厦门艾德生物医药科技有限公司 | 用于检测eml4-alk融合基因突变的引物、探针及检测试剂盒 |
| CN102952794A (zh) * | 2012-09-05 | 2013-03-06 | 张家港蓝苏生物工程有限公司 | 靶向基因dna分子探针的制备方法 |
-
2013
- 2013-06-26 CN CN2013102603988A patent/CN103409506A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| WO2003014385A1 (fr) * | 2001-07-27 | 2003-02-20 | The University Of Hong Kong | Nouveau procede d'elimination d'une sequence de repetition dans le genome, et sa mise en oeuvre pour la preparation d'une sonde fish |
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| CN102952794A (zh) * | 2012-09-05 | 2013-03-06 | 张家港蓝苏生物工程有限公司 | 靶向基因dna分子探针的制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
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|---|
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| 章钧,等: "建立非重复序列FISH探针及在21/13三体产前诊断中的应用", 《分子诊断与治疗杂志》 * |
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