JPH09294599A - 遺伝上明確な群に対する特異的なヌクレオチド配列するヌクレオチド配列のスクリーニング方法 - Google Patents

遺伝上明確な群に対する特異的なヌクレオチド配列するヌクレオチド配列のスクリーニング方法

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JPH09294599A
JPH09294599A JP8294218A JP29421896A JPH09294599A JP H09294599 A JPH09294599 A JP H09294599A JP 8294218 A JP8294218 A JP 8294218A JP 29421896 A JP29421896 A JP 29421896A JP H09294599 A JPH09294599 A JP H09294599A
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 遺伝上明確な群に対する特異的なヌクレオチ
ド配列するヌクレオチド配列のスクリーニング方法を提
供する。 【解決手段】 遺伝上明確な群に対し特異的なヌクレオ
チド配列をスクリーニングするに際し、スクリーニング
すべき試料につき別々の試験ドットをマトリックス上に
形成し、前記試験ドットをハイブリダイズ条件下で前記
ヌクレオチド配列と接触させ、前記ヌクレオチド配列は
バクテリオファージＤＮＡにおける一本鎖ヌクレオチド
配列挿入物であり、前記試験ドットにハイブリダイズし
なかったヌクレオチド配列を前記試験ドットにハイブリ
ダイズしたヌクレオチド配列から分離し、前記試験ドッ
トにハイブリダイズしたバクテリオファージの二重鎖Ｄ
ＮＡを前記試験ドットにハイブリダイズしなかったバク
テリオファージの二重鎖ＤＮＡから分離し、かつヌクレ
オチド配列を前記検出可能なマーカによって検出する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は特異的な個々のヌク
レオチド配列に関し、さらに詳細には本発明は下記する
淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）
に特異的な個々のヌクレオチド配列からなる組成物に関
し、すなわち本発明の組成物は淋菌染色体ＤＮＡ、した
がって淋菌を検出するのに使用することができる。
【０００２】
【従来の技術】人間において健康上の主問題として報告
されている最も多い細菌病の一種である淋菌の永続性は
多くの淋菌検出方法の開発をもたらした。
【０００３】淋菌感染を測定するための現在認められて
いる方法は、主として培養技術に基づくものである。典
型的な培養技術は、ジョージア州アトランタ在の病気管
理センターにより出版された「淋病の診断に対する基準
および技術」という論文に記載された方法を包含する。
この培養法においては、例えば尿道試料または頸管試料
などの試料を許容しうる培地（例えばタイヤーマーチン
培地）に載せる。これら培養物を３７℃にて５％二酸化
炭素雰囲気中で２４〜４８時間培養する。次いで、培養
プレートを淋菌コロニーの出現につき検査する。疑わし
いコロニーをグラム染色して、オキシダーゼ活性につき
試験する。一般に、男性における淋病感染の推定的診断
は、タイヤーマーチン培地上で培養した際にグラム陰性
のコーヒー豆状の双球菌のオキシダーゼ陽性コロニーを
示す尿道培養物を得ることによって決定される。女性の
場合、淋菌感染は、頸管培養物をタイヤーマーチン培地
上で検査し、グラム陽性双球菌のオキシダーゼ陽性コロ
ニーが出現することにより診断される。淋菌の推定的に
同定されたコロニーから得られる微生物は、しばしば糖
発酵、蛍光性抗体染色または共凝集によって確認され
る。しかしながら、この種の培養法は労力を要しかつ時
間がかかり、一般に「生細胞」の検出に制限される。培
養法を利用する場合、試料はある場所で採取されて一般
に他の場所に位置する実験室まで運ばれ、ここで微生物
を培養しかつ同定する。したがって、これらの培養法
は、結果が得られるまでに数日を要する。さらに、これ
ら培養法から得られる結果は、細菌の保存、運搬および
培養に対するかなり正確な条件にしたがわなければ不正
確となる。
【０００４】例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡのような標的
遺伝子材料を検出しかつ同定する手段としては、核酸ハ
イブリダイズ分析が使用されている。核酸ハイブリダイ
ズ分析は、標的遺伝子材料が特定のヌクレオチド配列を
有するという事実を前提とする。検出されるのは、この
ヌクレオチド配列である。この種の検出および同定は特
異的遺伝子あるいはＤＮＡもしくはＲＮＡ配列またはそ
の点突然変異もしくは欠失に対するものである。この種
の分析を行うには多数の技術が存在する〔メソッド・イ
ン・エンザイモロジー(Mothos In Enzymoloby)、第６８
巻、Ｒ．Ｗｕ（編）、第３７９−４６９頁（１９７
９）；およびＡ．Ｒ．ジュンおよびＪ．サムブルック、
メソッド・イン・エンザイモロジー、第６５巻、第１
部、第４６８−４７８頁（１９８０）〕。最も広く使用
されている方法の一つはサウザンブロット・フイルタ・
ハイブリダイゼーション法と呼ばれる〔Ｅ．サウザン、
ジャーナル・モレキュラ・バイオロジー、第９８巻、第
５０３頁（１９７５）〕。この方法は、一般にＤＮＡ断
片の混合物から電気泳動技術によって分離された特定の
ＤＮＡ断片を同定するのに用いられる。この方法は一般
に、ＤＮＡの試料をある種の微生物から分離することに
より行われる。分離したＤＮＡを制限エンドヌクレアー
ゼ切断にかけ、かつゲル（アガロース、アクリルアミド
など）にて電気泳動にかける。分離されたＤＮＡ断片を
含有するゲルを適当なマトリックス（例えばニトロセル
ロース濾紙またはジアゾ化した紙などの適当なマトリッ
クス）に吸い取らせると、これら断片がマトリックスま
で移動して結合する。次いで、ＤＮＡ断片を含有するマ
トリックスを加熱してＤＮＡを変性させる。この時点
で、マトリックスを変性標識ポリヌクレオチドプローブ
を含有する溶液で処理し、かつハイブリダイズさせる。
標識されたポリヌクレオチドプローブは、検出すること
が望ましいＤＮＡ断片に対し相補的であり、かつ検出可
能なマーカを結合しているヌクレオチド配列である。こ
の検出可能なマーカにより、検出することが望ましいＤ
ＮＡ断片に対しポリヌクレオチドプローブがハイブリダ
イズしたことを確認することができる。検出可能なマー
カによってポリヌクレオチドプローブを標識する多くの
技術が知られている。例えば、ヨーロッパ特許出願公開
第００６３８７３号および第００９７３７３号公報を参
照することができ、これらの開示を参考のためここに引
用する。次いで、ハイブリダイズしなかった標識ポリヌ
クレオチドプローブを検出することが望ましいＤＮＡ断
片に対しハイブリダイズした標識ポリヌクレオチドプロ
ーブから分離する。この分離は一般に洗浄によって行わ
れる。ＤＮＡプローブの検出可能なマーカを次いで検出
する。
【０００５】淋菌を検出するには、ポリヌクレオチドプ
ローブを得ることが有益である。淋菌の潜在プラスミド
から誘導されたヌクレオチド配列をポリヌクレオチドプ
ローブとして利用することにより淋菌を検出している。
しかしながら、この種のポリヌクレオチドプローブはせ
いぜいプラスミドＤＮＡを含有するような種類の淋菌し
か検出することができない。淋菌の菌株の約４０〜約９
６％がその配置に応じてプラスミドＤＮＡを含有すると
思われる。この種のポリヌクレオチドプローブはプラス
ミドＤＮＡを含有するような種類の淋菌しか検出し得な
いので、この種のポリヌクレオチドプローブは国際的に
用途が制限されている〔例えば、「尿道炎を有するヒト
における淋菌検出のためのＤＮＡハイブリダイゼーショ
ン技術」、ジャーナル・インフェクチャス・ディジー
ズ、第１４８巻、第３号、第４６２−４７１頁、１９８
３年９月参照〕。したがって、淋菌染色体ＤＮＡに対し
ハイブリダイズしうるようなヌクレオチド配列をポリヌ
クレオチドプローブとして利用するのが好適である。
【０００６】淋菌と髄膜炎菌（これら両者はナイセリア
属の種である）の染色体ＤＮＡには極めて高度のＤＮＡ
ホモロジーが存在する。淋菌のある菌株と髄膜炎菌のあ
る菌株とは約８０〜約９３％程度の染色体ＤＮＡホモロ
ジーを有すると報告されている〔「ナイセリア属の種に
おけるデオキシリボ核酸のホモロジー」、ジャーナル・
オブ・バクテリオロジー、第９４巻、第４号、１９６７
年１０月、第８７０−８７４頁、並びに「ナイセリアの
分類学；デオキシリボ核酸塩基組成、種間形質転換、お
よびデオキシリボ核酸ハイブリダイゼーション」、イン
ターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティック
・バクテリオロジー、第３２巻、第１号１９８２年１
月、第５７−６６頁〕。これは、特に７０％程度に低い
ＤＮＡホモロジーを有する微生物が同じ亜種に存在しう
るという事実において、極めて高いレベルのＤＮＡホモ
ロジーである〔バージース・マニュアル・オブ・システ
マティック・バクテリオロジー、第１巻、第１１頁、ウ
イリアムおよびウイルキンスにより出版（１９８
４）〕。
【０００７】さらにそれよりさらに高程度のＤＮＡホモ
ロジーがある種の淋菌と多くの種類の髄膜炎菌の全体と
の間に存在すると思われる。これは、髄膜炎菌の各菌株
における染色体ＤＮＡに対しホモロジーのある淋菌ゲノ
ムの部分が同一でないことに基づいている。したがっ
て、存在したとしても極く低い割合の淋菌ゲノムが多く
の種類の髄膜炎菌の全体に対してホモロジーがない。他
の技術的問題は、多くの種類の髄膜炎菌全体に対しホモ
ロジーのない淋菌染色体ＤＮＡの部分が個々のヌクレオ
チド配列として存在せずに、淋菌ゲノム全体に分散した
極く僅かのヌクレオチドのヌクレオチド配列として存在
することである。本発明の目的で、「個々のヌクレオチ
ド配列」は約１２個以上のヌクレオチドよりなるヌクレ
オチド配列である。
【０００８】さらに、淋菌の個々のヌクレオチド配列が
存在してこの配列がこれから誘導された淋菌の菌株に対
し特異的となって、この配列をポリヌクレオチドプロー
ブとして使用することができるとしても、これは他の淋
菌の菌株についても特異的であることが必須である。さ
もないと、淋菌に潜在するプラスミドに由来するポリヌ
クレオチドプローブの場合と同様に、この種のヌクレオ
チド配列自身も極めて用途が制限されるであろう。
【０００９】淋菌及び髄膜炎菌の全ゆる菌株のゲノムは
それぞれ約３，０００，０００個のヌクレオチドである
ことに注目すべきである。当業者は、１ヶ月当たり約
２，０００個のヌクレオチド配列を決定することができ
る。したがって、ある種の淋菌及びある種の髄膜炎菌の
ゲノムを配列決定するには３，０００人の技術者で１ヶ
月を要する。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、下記するような淋菌染色体ＤＮＡに対し特異的
である個々のヌクレオチド配列からなる組成物を提供す
ることにある。
【００１１】さらに本発明の目的は、遺伝子学上異なる
群に対し特異的な個々のヌクレオチド配列の取得方法を
提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
本発明は、少なくとも１種の個々のヌクレオチド配列を
含む淋菌に対し特異的な物質の組成物において次の６種
の淋菌： １）ＡＴＣＣ ５３４２０ ２）ＡＴＣＣ ５３４２１ ３）ＡＴＣＣ ５３４２２ ４）ＡＴＣＣ ５３４２３ ５）ＡＴＣＣ ５３４２４ ６）ＡＴＣＣ ５３４２５ の精製染色体ＤＮＡにハイブリダイズした前記組成物の
平均量を前記６種の淋菌の精製染色体ＤＮＡの等量に基
準化した最低値と次の６種の髄膜炎菌： １）ＡＴＣＣ ５３４１４ ２）ＡＴＣＣ ５３４１５ ３）ＡＴＣＣ ５３４１６ ４）ＡＴＣＣ ５３４１７ ５）ＡＴＣＣ ５３４１８ ６）ＡＴＣＣ ５３４１９ の精製染色体ＤＮＡにハイブリダイズした前記組成物の
平均量を前記６種の髄膜炎菌の精製染色体ＤＮＡの等量
に基準化した最高値との比が、約５より大であることを
特徴とする淋菌に特異的な物質の組成物を提供する。
【００１３】さらに本発明は遺伝上明確な群に対し特異
的なヌクレオチド配列をスクリーニングする際に、
（ａ）スクリーニングすべきヌクレオチド配列の各試料
につき別々の試験ドットをマトリックス上に形成し、各
試験ドットは前記試験試料の１つから得られる一本鎖型
の精製ＤＮＡを含み、（ｂ）前記試験ドットをハイブリ
ダイゼーション条件下で前記ヌクレオチド配列と接触さ
せ、前記ヌクレオチド配列はバクテリオファージＤＮＡ
における一本鎖ヌクレオチド配列挿入物であり、前記バ
クテリオファージはそのライフサイクル中に一本鎖ＤＮ
Ａ段階を有するバクテリオファージであり、（ｃ）前記
試験ドットにハイブリダイズしなかったヌクレオチド配
列を前記試験ドットにハイブリダイズしたヌクレオチド
配列から分離し、（ｄ）前記試験ドットをハイブリダイ
ズ条件下で前記バクテリオファージの変性二重鎖ＤＮＡ
断片と接触させ、前記バクテリオファージの前記変性二
重鎖ＤＮＡはこれに結合した検出可能なマーカを有し、
（ｅ）前記試験ドットにハイブリダイズしたバクテリオ
ファージの二重鎖ＤＮＡを前記試験ドットにハイブリダ
イズしなかったバクテリオファージの二重鎖ＤＮＡから
分離し、かつ（ｆ）ヌクレオチド配列を前記検出可能な
マーカによって検出することを特徴とするヌクレオチド
配列のスクリーニング方法をも提供する。
【００１４】下記する淋菌染色体ＤＮＡに対し特異的で
ある本発明の組成物における個々のヌクレオチド配列を
同定する方法は、ほぼ全ゆるスクリーニング技術によっ
て行うことができる。従来、この種の技術は一般的にコ
ロニーハイブリダイゼーションと呼ばれている〔Ｍ．グ
ルンスタイン等、「コロニーハイブリダイゼーション；
特異的遺伝子を含有するクローン化ＤＮＡの単離方
法」、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンス、第７２巻、第３９６１頁（１９７
５）〕。この種の他の技術は一般にプラークハイブリダ
イゼーションと呼ばれている〔ベントン等、「その場で
の単一プラークに対するハイブリダイゼーションによる
λｇｔ組換クローンのスクリーニング」、サイエンス、
第１９６巻第１８０頁（１９７７）；ウー、「組換ファ
ージのための鋭敏かつ迅速なスクリーニング方法」、メ
ソッズ・イン・エンザイモロジー、第６８巻、第３８９
頁（１９７９）；およびウー等、「オブアルブミン遺伝
子：天然遺伝子のクローニング」、プロシーディング・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス、第７５
巻、第３６８８頁（１９７８）〕。さらに、スクリーニ
ング技術を詳細に開示している優れた文献は、コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリーにより出版され
たマニアチス等の「モレキュラ・クローニング」であ
る。
【００１５】本発明の方法は次の工程を使用する： Ａ．プラスミドを含まない淋菌染色体ＤＮＡの精製およ
び切断 Ｂ．組換分子の形成 Ｃ．組換分子の形質転換 Ｄ．宿主細胞のスクリーニング Ｅ．組換分子の増幅 Ｆ．スクリーニング過程 Ｇ．組換バクテリオファージＤＮＡ／試験ドット複合体
の検出 Ｈ．淋菌染色体ＤＮＡに対し特異的である個々のヌクレ
オチド配列を含有する組換バクテリオファージの同定
【００１６】これらの工程のそれぞれには次のように行
うことができる： Ａ．プラスミドを含まない淋菌染色体ＤＮＡの精製およ
び切断 淋菌染色体ＤＮＡに対し特異的な個々のヌクレオチド配
列を単離するには、染色体ＤＮＡを細胞の残部から分離
せねばならない。これは、任意の淋菌の菌株を採種し、
これを適当な寒天培地（例えば、タイヤーマーチンもし
くはチョコレート寒天）に載せかつこの菌株を５％ＣＯ
２を含有する雰囲気内で培養して増殖させることにより
行うことができる。約１６〜１８時間増殖させた後、菌
体を試験管中に集め、かつこれら菌体を溶菌剤（例えば
洗剤）で溶菌させる。好適洗剤はドデシル硫酸ナトリウ
ム（ＳＤＳ）である。この結果、細胞残骸から精製し、
淋菌染色体ＤＮＡを得ることができる。
【００１７】次いで、淋菌染色体ＤＮＡをその細胞残骸
から精製する。これは例えばフェノール抽出に続いてア
ルコール沈殿させかつ塩化セシウム−臭化エチジウム密
度勾配遠心分離にて分離するような標準技術によって行
うことができる。
【００１８】使用する淋菌の菌株は、潜在プラスミドを
含めいかなるプラスミドをも含有しないことが好まし
い。プラスミドを含有する淋菌の菌株を使用する場合
は、先ず最初にこのプラスミドを除去し、次いで淋菌染
色体ＤＮＡを単離することが必須である。プラスミドの
除去は、塩化セシウム−臭化エチジウム密度勾配または
蔗糖密度勾配における遠心分離によって、あるいはアガ
ロースゲル電気泳動によって行うことができる。
【００１９】次いで、精製されたプラスミドを含まない
淋菌染色体ＤＮＡを消化して断片にする。これは、淋菌
染色体ＤＮＡを切断しうる任意の制限酵素を用いて行う
ことができる。この目的で使用しうる適する制限酵素は
ＭｂｏＩ，ＴａｑＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを包含する。
しかしながら、例えばＭｂｏＩのように４種の塩基のみ
を認識する酵素を使用するのが好適である。４種の塩基
のみを認識する酵素を使用するのが好適である理由は、
より少ない塩基対を含有するＤＮＡ断片が得られるから
である。淋菌染色体ＤＮＡと髄膜炎菌ＤＮＡとの間の高
度のホモロジーにおいて、ＤＮＡ断片が小さい程、この
ＤＮＡ断片は髄膜炎菌に対しハイブリダイズしうるヌク
レオチド配列を含有する程度が低くなる。理論的に、Ｍ
ｂｏＩ切断は平均して約２５６塩基対を含有するＤＮＡ
断片を生成する。これらＤＮＡ断片は約１２個よりなる
ヌクレオチドより大きいことが必須であることに注目す
べきである。約１２個より少ないヌクレオチドを含有す
るＤＮＡ断片は、所定の生物に対し特異的となるには充
分な複雑性を持たなくなる。
【００２０】下記するように適当なベクター中へのクロ
ーンニングに対し切断が充分に進行したかどうかを証明
するため、アガロースゲル電気泳動技術を用いてＤＮＡ
断片のサイズを測定することができる。
【００２１】Ｂ．組換分子の生成 淋菌染色体ＤＮＡ断片のそれぞれを次いでベクター中へ
挿入して、組換分子を形成させることができる。本発明
のスクリーニング法には、ベクターとしてバクテリオフ
ァージＤＮＡを使用しかつさらにライフサイクルにて一
本鎖ＤＮＡ段階を有するようなバクテリオファージを使
用することが必須である。
【００２２】バクテリオファージは、このバクテリオフ
ァージで感染した細菌の増殖に際しバクテリオファージ
が細菌から排出されるという利点を与える。すなわち、
バクテリオファージを宿主細菌から容易に精製すること
ができる。精製ＤＮＡは、ＤＮＡを効率的に標識しかつ
ＤＮＡをその標的ＤＮＡへ効果的にハイブリダイズさせ
るのに必須である。さらに、未精製ＤＮＡ中に存在する
細胞残骸は非特異的結合を生じさせる。非特異的結合は
誤信号をもたらす。さらに、バクテリオファージは細菌
から排出されるので、必然的にバクテリオファージは細
菌から自然に精製され、さもなければこれは極めて時間
のかかるものとなる。
【００２３】ライフサイクルに一本鎖ＤＮＡ段階を有す
るバクテリオファージを使用すれば、一本鎖ＤＮＡとの
ハイブリダイゼーションはこの種のＤＮＡが標的ＤＮＡ
でなくそれ自体で融合するという可能性を排除する利点
が得られる。すなわち、より大きい割合の一本鎖ＤＮＡ
が標的ＤＮＡにハイブリダイズして、感受性を増大させ
ることができる。適するバクテリオファージはｆ１バク
テリオファージ、ｆｄバクテリオファージ、Ｍ１３バク
テリオファージおよびそれらの誘導体、例えばＭ１３バ
クテリオファージのｍｐシリーズを包含する。
【００２４】組換分子を作成するため、環状である二重
鎖複製型（ＲＦ）のバクテリオファージＤＮＡを直鎖化
させる。これは、適当な制限酵素で行われる。制限酵素
の選択は淋菌染色体ＤＮＡ断片を直鎖化されたＲＦバク
テリオファージＤＮＡ中にライゲーションできるものと
すべきである。このライゲーションは平滑末端ライゲー
ションまたは突出末端ライゲーションによって行うこと
ができ、これら両技術は標準技術である。〔マニアチス
等、「モレキュラー・クローニング」、コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリー出版〕。ＭｂｏＩ淋菌
染色体ＤＮＡ断片をＭ１３ｍｐベクターのＢａｍＨＩ部
位に挿入するのが好適である。
【００２５】Ｃ．組換分子の形質転換 適する宿主細胞への組換分子の形質転換を次いで行うこ
とができる。任意の宿主細胞を使用しうると思われる
が、宿主細胞は雄（ｍａｌｅ）イー・コリとするのが好
適である。雄イー・コリが好適である理由は、組換分子
を作成するのに使用される本発明のベクターが雄の特定
バクテリオファージから誘導されるからである。すなわ
ち、下記するように組換バクテリオファージを雄イー・
コリにて増殖させる際、生成されたバクテリオファージ
は雄イー・コリに再感染し、かくして雄イー・コリの増
殖を阻止し、プラークの形成を生じさせることができ
る。プラークは肉眼確認することができる。したがっ
て、雄イー・コリの集団から形質転換した雄イー・コリ
を容易に選択することができる。
【００２６】雄イー・コリはベクターのみ（例えばＪＭ
１０３およびＪＭ１０５）を含有するプラークから組換
分子を含有するプラークを容易に区別するような雄イー
・コリよりなる群から選択するのが好適である。ＪＭ１
０３およびＪＭ１０５によってイソプロピル−Ｂ−Ｄ−
チオ−ガラクトピラノシドプレート上に形成されるプラ
ークは、Ｍ−１３バクテリオファージを使用したと仮定
すれば組換分子が存在する場合白色となり、かつベクタ
ーのみが存在する場合は青色となる。
【００２７】形質転換を行いうるいくつかの方法が存在
する。例えば、形質転換は塩化カルシウム法または塩化
カルシウム／塩化ルビジウム法によって行うことができ
る。これらの方法は標準技術である。〔マニアチス参
照〕。
【００２８】Ｄ．宿主細胞のスクリーニング 次いで、形質転換されてない宿主から形質転換されてい
る宿主を区別する宿主細胞のスクリーニングを行うこと
ができる。この種のスクリーニング過程は、任意の標準
技術で行うことができる。好適技術は次の通りである：
【００２９】使用前に新たに次の試薬を作成する。 １．ＩＰＴＧ（１００ｍＭ） ＩＰＴＧはイソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオ−ガラクトピラ
ノシド（Ｈ２Ｏ中１００ｍＭである）。 ２．Ｘ−ｇａｌ（ジメチルホルムアミド中２％） Ｘ−ＧＡＬは５−ブロモ−４−クロル−３−インドリル
−Ｂ−ガラクトシドである。 ３．新たな２００μｌバッチの宿主細胞を作成する。
【００３０】ＩＰＴＧとＸ−ｇａｌと宿主細胞とをバッ
チで作成することができる。Ｘ−ｇａｌおよびＩＰＴＧ
は要事調製して氷上で保存すべきである。宿主細胞は、
宿主細胞の１晩培養物の１滴を２０ｍｌの新たな２×Ｔ
Ｙ（１ｌ当たり１６ｇのバクトトリプトン、１０ｇの酵
母抽出物、５ｇのＮａＣｌ）へ添加して宿主細胞を作成
するのが好適である。
【００３１】２７０μｌの宿主細胞／Ｘ−ｇａｌ／ＩＰ
ＴＧ混合物を形質転換体細胞のチューブへ添加する。３
ｍｌの溶融したＨトップアガー（１ｌ当たり１０ｇのバ
クトトリプトン、８ｇのＮａＣｌ、８ｇの寒天）を添加
し、４２℃に保つ。回転させ混合し、直ちに予備加温
（３７℃）のＨプレート（１ｌ当たり１０ｇのバクトト
リプトン、８ｇのＮａＣｌ、１２ｇの寒天）の上に注ぎ
込む。室温で放置して固化させる。プレートを裏返し
て、３７℃にて１晩培養する。
【００３２】１晩増殖した後、すなわち約１２〜約１８
時間増殖させた後、形質転換細胞は、雄イー・コリの場
合には増殖が阻止された領域であるプラークを形成す
る。次いで、どのプラークが組換分子を含有するかを決
定しなければならない。
【００３３】この決定は、宿主細胞がそれ自身で組換分
子を含有するプラークをベクターのみ（例えばＪＭ１０
３およびＪＭ１０５）を含有するものから肉眼で判別で
きるようなものであれば容易に行うことができる。宿主
細胞が、容易に肉眼でこの決定を成しえないものであれ
ば、この決定は32Ｐ標識された淋菌ゲノムＤＮＡをプロ
ーブとして用いるハイブリダイゼーション〔マニアチス
参照〕でのプラークのスクリーニングによって行うこと
ができる。このプローブは、クローニング用に用いられ
ているものと同じ淋菌菌株に由来するものとすべきであ
る。
【００３４】Ｅ．組換分子の増殖 宿主細胞における組換分子の増殖を次いで行うことがで
きる。増殖の目的は組換分子の個数を増加させることで
あり、任意の標準技術で行うことができる。好適技術は
次の通りである：
【００３５】組換分子を含有するプラークを釣り上げ、
かつ宿主細胞を含有する容器（例えばエッペンドルフチ
ューブ）において培養することができる。この容器を１
晩中振とうしながら３７℃にて培養する。この培養の結
果、バクテリオファージが増殖する。培養期間中、成熟
したバクテリオファージが宿主細胞から排出する。遠心
分離を用いて、排出されたバクテリオファージを宿主細
胞から分離することができる。上澄液はバクテリオファ
ージを含有し、これを用いて下記するようにスクリーニ
ングすることができる。
【００３６】Ｆ．スクリーニング工程 次いで、排出されたバクテリオファージを用いてスクリ
ーニングすることができる。排出されたバクテリオファ
ージを試験ドットに対してスクリーニングする。試験ド
ットは、適当なマトリックスに結合した変性の精製染色
体ＤＮＡである。
【００３７】試験ドットのそれぞれは変性された精製染
色体ＤＮＡで構成され、この染色体ＤＮＡは１９８６年
１月８日付でそれぞれ寄託されてアメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）受託番号によっ
て次のように示される淋菌および髄膜炎菌の菌株の１種
から単離される。ＡＴＣＣはミズ−リ州、ロックビル在
１２３０１パークローン ドライブに所在する：髄膜炎菌 淋菌 １． ５３４１４ １． ５３４２０ ２． ５３４１５ ２． ５３４２１ ３． ５３４１６ ３． ５３４２２ ４． ５３４１７ ４． ５３４２３ ５． ５３４１８ ５． ５３４２４ ６． ５３４１９ ６． ５３４２５
【００３８】試験ドットは次のように作成することがで
きる：ＡＴＣＣは、菌株の試料を凍結乾燥状態で供給す
る。この試料を適当な培地中で増殖させて、細菌菌体の
個数を増大させる。次いで、染色体ＤＮＡを、例えば洗
剤（例えばＳＤＳ）を用いて菌体を溶菌させ、ＲＮアー
ゼを用いてＲＮＡを消化し、かつ次いでフェノール抽出
によって染色体ＤＮＡを精製するような標準技術によ
り、細菌菌体から分離する。精製した染色体ＤＮＡをア
ルカリ、例えばＮａＯＨまたは熱によって変性させる。
この変性した精製染色体ＤＮＡを１Ｍ ＮＨ４Ａｃ−
０．０２Ｎ ＮａＯＨの添加によりｐＨを約７．８〜約
８．０となるように調整する〔ヌクレイック・アシド・
リサーチ、第７巻、第１５４１頁（１９７９）、カファ
ドス等〕。次いで、この溶液を適当なマトリックス、例
えばニトロセルロースフイルタにドットする。かくし
て、染色体ＤＮＡが一本鎖型としてマトリックスに結合
し、これが試験ドットを構成する。各試験ドットは約
１．０μｇの変性した精製染色体ＤＮＡを含有すべきで
ある。１２個の試験ドットのそれぞれが同一マトリック
ス上に存在させる。
【００３９】次いで、これら試験ドットをマトリックス
に固定させかつブロッキングすることができる。固定を
行って試験ドットを安定化することにより、変性した精
製染色体ＤＮＡが次のハイブリダイズ／洗浄工程の際に
マトリックスから洗浄除去されるのを防止すると共に、
ブロッキングを行って組換バクテリオファージＤＮＡお
よび標識プローブによるマトリックスへの非特異的結合
を防止する。固定は、マトリックスを減圧化に８０℃に
て約２時間放置して行うことができる。ブロッキングは
マトリックスを任意の標準ハイブリダイズ溶液（例えば
２×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．１％ＳＤＳおよ
び２００μｇ／ｍｌの音波処理した熱変性牛胸腺ＤＮ
Ａ）中で約６５℃にて少なくとも約２時間温置して行な
うことができる。このハイブリダイズ溶液を捨て、かつ
試験ドッドを含有するマトリックスを組換バクテリオフ
ァージによって容易にスクリーニングすることができ
る。
【００４０】次いで、マトリックスを２×ＳＳＣ、５×
デンハルト溶液および０．１％ＳＤＳ並びに２００μｇ
／ｍｌの音波処理した熱変性牛胸腺ＤＮＡよりなる新た
なハイブリダイゼーション溶液に入れ、これに組換バク
テリオファージを含有する上澄液を添加する。かくし
て、組換バクテリオファージＤＮＡにおける淋菌挿入物
は、バクテリオファージＤＮＡをマトリックスに対し６
５℃にて約１６〜２０時間にわたり接触させ続けること
により試験ドットのハイブリダイズさせることができ
る。６５℃におけるハイブリダイゼーションはさらに組
換バクテリオファージＤＮＡの蛋白質被覆を破壊するこ
とも注目すべきである。次いで、ハイブリダイゼーショ
ン溶液を除去し、かつマトリックスをそれぞれ２×ＳＳ
Ｃ、０．１％ＳＤＳにてそれぞれ約３０分間ずつ２回洗
浄し、次いでさらに０．２×ＳＳＣ０．１％ＳＤＳ（全
て６５℃にて）３０分間ずつ２回洗浄し、これら４回の
洗浄のそれぞれの際に緩和に振とうする。
【００４１】各組換バクテリオファージをスクリーニン
グするには、各組換バクテリオファージを１２個の試験
ドットを含有する適当なマトリックスに対し別々にスク
リーニングせねばならないことに注目すべきである。
【００４２】６種の淋菌の菌株および６種の髄膜炎菌の
菌株のそれぞれに対し組換バクテリオファージをスクリ
ーニングする代わりに、淋菌の菌株の１種および髄膜炎
菌の菌株の１種についてのみスクリーニングしうること
も注目すべきである。何故なら、これらナイセリア属の
各菌株のＤＮＡにハイブリダイズするほぼ全ての組換バ
クテリオファ−ジは、ナイセリア属の他の菌株にもハイ
ブリダイズするからである。ハイブリダイズしない組換
バクテリオファ−ジは、工程Ｈで除去される。これらナ
イセリア属における１種のみの菌株スクリ−ニングは、
このスクリ−ニング工程を極めて短時間で行うことを可
能にする。
【００４３】Ｇ．組換バクテリオファージドット複合体
ＤＮＡ／試験の検出 組換バクテリオファージＤＮＡ／試験ドット複合体のそ
れぞれを次いで検出することができる。この検出は、二
重鎖複製型（ＲＦ）の親バクテリオファージを標識プロ
ーブとして用いて行うことができる。このＲＦ ＤＮＡ
は、組換バクテリオファージＤＮＡ／試験ドット複合体
のベクター部分にハイブリダイズして、試験ドットにハ
イブリダイズされる組換バクテリファージＤＮＡに対し
ハイブリダイズしたＲＦ ＤＮＡよりなる架橋を形成す
ることができる。次いで、この架橋をＲＦ ＤＮＡの標
識によって検出する。
【００４４】複合体のこの検出方法は多くの利点を与え
る。第１に、この方法は１つの標識工程、すなわちＲＦ
ＤＮＡの標識しか必要としない。この標識されたＲＦ
ＤＮＡを用いて全ての組換バクテリオファージを検出
することができる。さもなければ、各組換バクテリオフ
ァージを別々に標識せねばならず、これは極めて時間が
かかりかつ労力を要する工程となる。第２に、この検出
方法によれば、さらに全ての組換バクテリオファージＤ
ＮＡ試験ドット複合体を同時に検出することができる。
これは、検出工程の時間を著しく節約する。最後に、こ
の検出方法は、組換バクテリオファージを標識せねばな
らない場合に比べて感度の増大をもたらす。これは、ニ
ック翻訳反応がベクターを多数のＤＮＡ断片に切断する
という事実に基づいている。したがって、ニック翻訳に
より組換バクテリオファージを標識する場合には、淋菌
を含有するＤＮＡ断片のみが信号に寄与するであろう。
しかしながら、ＲＦ ＤＮＡをニック翻訳によって標識
すれば、全ての得られるＤＮＡ断片が組換バクテリオフ
ァージのベクター部分にハイブリダイズして、感度の増
大を与えることができる。
【００４５】親バクテリオファージのＲＦ ＤＮＡを例
えばニック翻訳によって32Ｐで標識し、かつこれをプロ
ーブとして使用することにより組換バクテリオファージ
／試験ドット複合体を検出する32Ｐ標識したＲＦ ＤＮ
Ａの作成は標準技術によって行うことができる〔リグビ
ー等、ジャーナル・モレキュラ・バイオロジー（１９７
７）、第１１３巻、２３７−２５１頁〕。次いで、32Ｐ
標識したＲＦ ＤＮＡを用いて組換バクテリオファージ
／試験ドット複合体を検出することができる。これは次
のようにして行うことができる：32Ｐ標識したＲＦ Ｄ
ＮＡを、例えば水中で煮沸して変性させる。変性した32
Ｐ標識のＲＦ ＤＮＡを２×ＳＳＣと５×デンハルト溶
液と０．１％ＳＤＳと２００μｇ／ｍｌの音波処理した
熱変性牛胸腺ＤＮＡとよりなるハイブリダイズ溶液に添
加して混合物を作成し、次いでこれを組換バクテリオフ
ァージＤＮＡ／試験ドット複合体を含有するマトリック
スと６５℃にて約１２〜１６時間接触させる。この結
果、32Ｐ標識されたＲＦ ＤＮＡ組換バクテリオファー
ジＤＮＡ／試験ドット複合体のベクター部分にハイブリ
ダイズして、32Ｐ標識されたＲＦ ＤＮＡ／組換バクテ
リオファージＤＮＡ／試験ドット架橋を形成する。次い
で、このマトリックスをそれぞれ２×ＳＳＣ、０．１％
ＳＤＳにて約３０分間２回洗浄し、次いで０．２×ＳＳ
Ｃ、０．１％ＳＤＳにてさらに２回３０分間洗浄し（こ
れらは全て６５℃にて行う）、これら４回の各洗浄に際
し緩やかに振とうする。次いで、マトリックスを風乾す
る。
【００４６】次いで、架橋における32Ｐの放射能を定量
化する。これはマトリックスをＸ線フィルムに露出して
行うことができる。Ｘ線フィルムを基準マーカとして使
用し、その際32Ｐ染料マーカを基準点として使用するこ
とによりマトリックス上に載せて、フィルム上の信号ド
ットを対応の試験ドットと整列させ、かくして試験ドッ
トをマトリックス上に配置することができる。次いで、
各試験ドットをマトリックスから切除しかつシンチレー
ション液を含有する小瓶に入れる。
【００４７】次いで、この小瓶をシンチレーションカウ
ンタに入れ、架橋の放射能定量化する。マトリックスの
バックグランドを引算した後、各淋菌試験ドットおよび
各髄膜炎菌試験ドットの毎分のカウント数を各組換バク
テリオファージＤＮＡにつき計算する。各組換バクテリ
オファージＤＮＡにつき毎分の最小カウント数を有する
淋菌菌株の毎分のカウント数を毎分の最大カウント数を
有する髄膜炎菌の菌株の毎分のカウント数と比較し、か
つ毎分のカウント数に基づき淋菌：髄膜炎菌の比が約５
より大となるような組換バクテリオファージＤＮＡを次
の工程に使用する。
【００４８】Ｈ．淋菌染色体ＤＮＡに対し特異的である
個々のヌクレオチド配列を含有する組換バクテリオファ
ージの同定 次いで、約５より大きい淋菌：髄膜炎菌の比を与えるよ
うな組換バクテリオファージをさらに分析する。この分
析は、これら組換バクテリオファージのＲＦＤＮＡの直
接標識を利用する。これら組換バクテリオファージのＲ
Ｆ ＤＮＡの直接標識は、淋菌：髄膜炎菌の上記比を一
層正確に定量することを可能にし、したがって淋菌染色
体ＤＮＡに対し特異的な個々のヌクレオチド配列を持っ
た組換バクテリオファージを正確に同定し、かくして本
発明の組成物を規定することを可能にする。
【００４９】この分析は次のように行うことができる：
約５より大きい淋菌：髄膜炎菌の比を与える各組換バク
テリオファージの一部分を、例えば２×ＴＹ培地または
ＬＢ培地のような増殖培地中へ未感染の宿主細胞と共に
接種し、かつ３７℃にて約５時間培養する。この結果、
組換バクテリオファージが増殖する。ここで新たに感染
した宿主細胞を遠心分離しかつ淋菌染色体ＤＮＡ断片を
含有するＲＦ ＤＮＡを標準技術によって単離する〔マ
ニアチス参照〕。１００ｍｌの培養物は約４０〜５０μ
ｇのＲＦ ＤＮＡを生成する。
【００５０】次いで、ＲＦ ＤＮＡを、例えばニック翻
訳により32Ｐで標識する。次いで、32Ｐ標識されたＲＦ
ＤＮＡをプローブとして使用することにより、下記の
変性された精製染色体ＤＮＡからなる試験ドットに対し
てスクリーニングし、前記染色体ＤＮＡは上記で使用し
たと同じ菌株の淋菌および髄膜炎菌から誘導され、次の
ＡＴＣＣ受託番号によって示される：髄膜炎菌 淋菌 １． ５３４１４ １． ５３４２０ ２． ５３４１５ ２． ５３４２１ ３． ５３４１６ ３． ５３４２２ ４． ５３４１７ ４． ５３４２３ ５． ５３４１８ ５． ５３４２４ ６． ５３４１９ ６． ５３４２５
【００５１】試験ドットは上記のように作成される。し
かしながら、淋菌および髄膜炎菌の各菌株は６個の試験
ドットを持たねばならず、各菌株に対する各試験ドット
は１／１０のファクターでシリーズとして希釈し、かく
して６個の試験ドットは次の量の変性された精製染色体
ＤＮＡを含有する：５００ｎｇ（ナノグラム），５０ｎ
ｇ，５ｎｇ，０．５ｎｇ，５０ｐｇ（ピコグラム）およ
び５ｐｇ。かくして、スクリーニングすべき各組換バク
テリオファージにつき全部で７２個の試験ドットを与え
る６個の試験ドットが各菌株につき存在する。全部で７
２個の試験ドットは同じマトリックス上に存在させ、ハ
イブリダイゼーションを32Ｐ標識ＲＦＤＮＡで行った際
に、このＤＮＡが同一条件下で試験ドットにハイブリダ
イズするようにするのが好適である。
【００５２】次いで、32Ｐ標識されたＲＦ ＤＮＡを利
用して、試験ドットにハイブリダイズさせる。これは次
のように行うことができる：32Ｐ標識されたＲＦ ＤＮ
Ａを、例えば水中で煮沸することにより変性させる。変
性した32Ｐ標識ＲＦ ＤＮＡを２×ＳＳＣと５×デンハ
ルト溶液と０．１％ＳＤＳ並びに２００μｇ／ｍｌの音
波処理した熱変性牛胸腺ＤＮＡよりなるハイブリダイズ
溶液へ添加して混合物を生成させ、これを次いで試験ド
ットを含有するマトリックスに対し６５℃にて約１２〜
１６時間接触させる。この結果、32Ｐ標識ＲＦ ＤＮＡ
は試験ドットにハイブリダイズし、ただし、この場合試
験ドットは32Ｐ標識ＲＦ ＤＮＡ中に含有された淋菌染
色体ＤＮＡ断片に対し実質的に相補的ＤＮＡ配列を含有
してハイブリッドを形成しうるものとする。次いで、こ
のマトリックスをそれぞれ２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ
にて約３０分間にわたり２回洗浄し、次いで０．２×Ｓ
ＳＣ、０．１％ＳＤＳにて３０分間ずつさらに２回洗浄
しこれら４回の洗浄はそれぞれ全て緩やか攪拌しながら
６５℃にて行った。次いで、このマトリックスを風乾す
る。このハイブリダイゼーションおよび洗浄は、上記の
温度および塩濃度で行うことが必須である。
【００５３】次いで、ハイブリッドにおける32Ｐの放射
能を定量化する。これはマトリックスをＸ線フィルムに
露出させて行うことができる。Ｘ線フィルムを基準マー
カとして使用され、その際基準点として32Ｐ染料マーカ
を用いることによりマトリックス上に載置し、フィルム
上の信号ドットを対応の試験ドットと整列させることに
より行われる。次いで、各試験ドットをマトリックスか
ら切除し、これをシンチレーション液を含有する小瓶中
に入れる。
【００５４】次いで、この小瓶をシンチレーションカウ
ンタに入れて、ハイブリッドにおける32Ｐの放射能定量
化する。各組換バクテリオファージＤＮＡにつき、各淋
菌試験ドットにおける毎分のカウント数および各髄膜炎
菌ドットにおける毎分のカウント数を計算しかつ比較す
る。
【００５５】この計算は次のように行われる：マトリッ
クスのバックグランドを引算した後、各淋菌試験および
各髄膜炎菌の菌株における６個の試験ドットのそれぞれ
につき５００ｎｇの試験ドットの精製染色体ＤＮＡを用
いて毎分のカウント数を計算し、すなわち試験ドットの
精製染色体ＤＮＡの等量（５００ｎｇ）に基準化した試
験ドットに対しハイブリダイズした淋菌ＤＮＡの量を計
算する。勿論、５００ｎｇ以外の数値を使用することも
でき、毎分のカウント数を基準化することのみが必須で
ある。次いで、淋菌および髄膜炎菌の各菌株における６
個の試験ドットのそれぞれにつき各数値のうち２個を採
用し、これらは：（１）殆ど同一であって直線関係に最
も近いものであり、かつ（２）これら試験ドットにおけ
る精製染色体ＤＮＡの量はファクター１０で相違しかつ
その平均値、すなわち所定菌株の淋菌もしくは髄膜炎菌
の精製染色体ＤＮＡの等量に基準化された所定菌株の淋
菌もしくは髄膜炎菌の精製染色体ＤＮＡに対しハイブリ
ダイズした淋菌ＤＮＡの平均量を計算する。各組換バク
テリオファージＤＮＡにつき６種の菌株の各淋菌におけ
る精製染色体ＤＮＡの等量に対し基準化した６種の各淋
菌菌株における精製染色体ＤＮＡに対しハイブリダイズ
した淋菌ＤＮＡの平均量の最低値を、６種の髄膜炎菌菌
株のそれぞれにおける精製染色体ＤＮＡの等量に対し基
準化した６種の髄膜炎菌の各菌株における精製染色体Ｄ
ＮＡにハイブリダイズした淋菌ＤＮＡの最高平均値とを
取り、これら最低平均値と最高平均値との比を計算す
る。
【００５６】約５より大きい淋菌：髄膜炎菌の比を与え
るような個々のヌクレオチド配列からなる組成物は、淋
菌染色体ＤＮＡ（したがって淋菌そのもの）に対し特異
的である個々のヌクレオチド配列からなる組成物を規定
し、かくして本発明の組成物を構成する。本発明の目的
で「個々のヌクレオチド配列」という用語は、約１２個
より多いヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を意味
する。好適具体例において、本発明の組成物は約２５以
上、より好ましくは約５０以上の淋菌：髄膜炎菌の比を
与えるよう個々のヌクレオチド配列で構成される。個々
のヌクレオチド配列が約５より大きい淋菌：髄膜炎菌の
比を与えれば、この種の個々のヌクレオチド配列はほぼ
全ての淋菌の菌株に対しハイブリダイズするが、髄膜炎
菌の菌株にはハイブリダイズしないと思われる。
【００５７】本発明の組成物は、淋菌に対し特異的な個
々のヌクレオチド配列以外の成分、例えば非ナイセリア
ＤＮＡ、細胞残骸などを含有することがあり、ただしこ
れらの成分は本発明の組成物を無効にするものではな
い。さらに、本発明の個々のヌクレオチド配列は、個々
のヌクレオチド配列の一部分として、適切でない他のヌ
クレオチド配列（例えばベクターのヌクレオチド配列ま
たは例えば酵素標識された末端であるヌクレオチド配
列）をも含有しうることは勿論である。
【００５８】約５０より大きい淋菌：髄膜炎菌の比を与
えるような３種の個々のヌクレオチド配列を１９８６年
１月９日付けでＡＴＣＣに寄託し、かつ、ＡＴＣＣ受託
番号５３４０９，５３４１０，および５３４１１を得
た。これらの個々のヌクレオチド配列は、淋菌の臨床試
料から得られ、上記の方法により制限酵素ＭｂｏＩで切
断された約３０，０００種の組換バクテリオファージを
スクリーニングした後に同定された。この場合、使用し
たベクターはＭ１３ｍｐ８ベクターとし、かつ使用した
宿主ベクターはイー・コリＪＭ１０３とした。これら３
種の個々のヌクレオチド配列をさらに約２０種の淋菌お
よび１０種の髄膜炎菌、並びに２０種の淋菌の染色体Ｄ
ＮＡにハイブリダイズしたが１０種の髄膜炎菌の染色体
ＤＮＡにはハイブリダイズしなかった３種の個々のヌク
レオチド配列につき試験した。
【００５９】これら３種の個々のヌクレオチド配列をＭ
１３ｍｐ８ベクター（この組換分子は細菌宿主イー・コ
リＪＭ１０３に形質転換させた）のＢａｍＨＩ部位に別
々に挿入した組換ＤＮＡ分子として寄託した。個々のヌ
クレオチド配列挿入物を所望に応じ適当な制限酵素の使
用によってＭ１３ｍｐ８ベクターから分離することがで
きる。制限酵素Ｓａｕ３Ａを使用して個々のヌクレオチ
ド配列挿入物を分離することができる。
【００６０】この酵素は、Ｍ１３ｍｐ８ベクターを次の
サイズの７個のＤＮＡ断片に切断する：４，０１４ｂ
ｐ、１，６９６ｂｐ、５０７ｂｐ、４３４ｂｐ、３３２
ｂｐ、１４９ｂｐおよび９６ｂｐ。さらに、この挿入物
のベクターの部分を含有しない１種の個別ヌクレオチド
配列として切断する。代案として、制限酵素ＥｃｏＲＩ
およびＳａｌＩを組み合わせて用いることにより、ベク
ターを切断することもできる。この切断は２個のみの断
片を与え、一方は約８ｋｂでありかつ他方は個々のヌク
レオチド配列挿入物とさらに約２０ｂｐのベクターＤＮ
Ａを含有する。ＡＴＣＣ５３４０９およびＡＴＣＣ５３
４１１の個々のヌクレオチド配列挿入物はそれぞれ約８
５０ｂｐであり、またＡＴＣＣ５３４１０のものは約
１，３００ｂｐである。適当な制限酵素で切断した後、
個々のヌクレオチド配列挿入物は、ＤＮＡ断片のサイズ
により分離するゲル電気泳動技術によって単離すること
ができる。制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを用いる
ことにより、この切断が２個のみのＤＮＡ断片を与える
ため個々のヌクレオチド配列挿入物を分離するのが一層
容易となることに注目すべきである。さらに、個々のヌ
クレオチド配列挿入物を含有するＤＮＡ断片は、ベクタ
ーの約２０ｂｐを含有し、ただしこの２０ｂｐは個々の
ヌクレオチド配列挿入物の特異性を阻害しない。
【００６１】本発明は、さらに淋菌に対し特異的である
寄託した個々のヌクレオチド配列を有する、淋菌に対し
特異的な個々のフランキングヌクレオチド配列をも含
む。本発明の目的で、淋菌に対し特異的な寄託された個
々のヌクレオチド配列のフランキングヌクレオチド配列
は、淋菌に対し特異的である寄託した個々のヌクレオチ
ド配列がハイブリダイズする個々のヌクレオチド配列に
対し直接隣接する淋菌６種の寄託菌株全てにおける淋菌
染色体ＤＮＡのヌクレオチド配列である。フランキング
ヌクレオチド配列の少なくとも一部分は淋菌に対し特異
的であると思われる。淋菌に対し特異的である個々のフ
ランキングヌクレオチド配列は、後記する実施例Ｉに記
載する手順で得ることができる。
【００６２】さらに本発明の範囲内には、淋菌に対し特
異的である寄託した個々のヌクレオチド配列における個
々のヌクレオチド配列に対し相補的なヌクレオチド配
列、並びに上記淋菌に対し特異的である個々のフランキ
ングヌクレオチド配列のヌクレオチド配列に対し相補的
なヌクレオチド配列も包含される。これらの個々のヌク
レオチド配列に対し相補的なヌクレオチド配列は、寄託
された個々のヌクレオチド配列にハイブリダイズさせる
ことができる。
【００６３】さらに本発明の範囲内には、淋菌に対し特
異的である寄託した個々のヌクレオチド配列の突然変異
に由来する個々のヌクレオチド配列、淋菌に対し特異的
であるその個々のフランキングヌクレオチド配列並びに
淋菌に対し特異的であるそのヌクレオチド配列に対し相
補的なヌクレオチド配列も包含され、ただしこれらの突
然変異した個々のヌクレオチド配列は上記したように淋
菌に対し特異的であるものとする。さらに、本発明は上
記淋菌に対し特異的でありかつ淋菌に対し特異的の寄託
した個々のヌクレオチド配列に対しハイブリダイズしう
るような個々のヌクレオチド配列、あるいは淋菌に対し
特異的である個々のフランキングヌクレオチド配列をも
包含する。
【００６４】淋菌に対し特異的である寄託した個々のヌ
クレオチド配列、並びに淋菌に対し特異的であるその個
々のフランキングヌクレオチド配列をプローブとして使
用することにより、淋菌に対し特異的となりうる個々の
ヌクレオチド配列を迅速にスクリーニングすることがで
きる。淋菌に対し特異的である寄託した個々のヌクレオ
チド配列、あるいは淋菌に対し特異的であるその個々の
フランキングヌクレオチド配列に対しハイブリダイズす
る個々のヌクレオチド配列を試験して、これらが淋菌に
対し特異的であるかどうかを決定せねばならない。
【００６５】さらに本発明の範囲内には、淋菌に対し特
異的である個々のフランキングヌクレオチド配列、また
は淋菌に対し特異的である個々のヌクレオチド配列であ
って、淋菌に対し特異的な寄託した個々のヌクレオチド
配列あるいは淋菌に対し特異的であるその個々のフラン
キングヌクレオチド配列に対しハイブリダイズしうるも
のも包含される。これらのフランキングヌクレオチド配
列は、淋菌に対し特異的である個々のヌクレオチド配列
の染色体ＤＮＡに直接隣接した個々のヌクレオチド配列
であり、これらは淋菌に対し特異的な寄託した個々のヌ
クレオチド配列または淋菌に対し特異的であるその個々
のフランキングヌクレオチド配列に対しハイブリダイズ
させることができる。これら個々のフランキングヌクレ
オチド配列は、後記実施例Ｉに記載する手順で得ること
ができる。
【００６６】さらに本発明の範囲内には、淋菌に対し特
異的である個々のヌクレオチド配列における淋菌に対し
特異的な個々のヌクレオチド配列に対し相補的なヌクレ
オチド配列、並びに淋菌に対し特異的でありかつこの淋
菌に対し特異的な寄託した個々のフランキングヌクレオ
チド配列に対しハイブリダイズしうる個々のヌクレオチ
ド配列、あるいは淋菌に対し特異的な個々のフランキン
グヌクレオチド配列をも包含する。
【００６７】さらに本発明の範囲内には、淋菌に対し特
異的でありかつ次の突然変異から生ずる個々のヌクレオ
チド配列をも包含する：（１）淋菌に対し特異的であり
かつ淋菌に対し特異的な寄託した個々のヌクレオチド配
列または淋菌に対し特異的なその個々のフランキングヌ
クレオチド配列に対しハイブリダイズしうる個々のヌク
レオチド配列、（２）淋菌に対し特異的である上記
（１）の個々のフランキングヌクレオチド配列、および
（３）淋菌に対し特異的である上記（１）および（２）
の個々のヌクレオチドヌクレオチド配列に対し相補的な
ヌクレオチド配列。
【００６８】上記のスクリーニング法を用いて、ＡＴＣ
Ｃに寄託した以外の淋菌に対し特異的である個々のヌク
レオチド配列を同定することができる。この種の他の個
々のヌクレオチド配列も本発明の範囲内に含まれる。こ
れらの他のヌクレオチド配列は、次のパラメータの１つ
もしくはそれ以上を変化させて同定することができる：
【００６９】１．より多数の組換バクテリオファージ分
子をスクリーニングすることができる。より多数の組換
バクテリオファージ分子をスクリーニングする程、淋菌
に対し特異的な個々のヌクレオチド配列をより容易に同
定することができる。 ２．淋菌ゲノムを切断しうるＭｂｏＩ以外の制限酵素を
使用することができる。異なる制限酵素は異なる淋菌Ｄ
ＮＡ断片をもたらす。さらに２種以上の制限酵素を用い
て淋菌ゲノムを切断することもできる。これは、より小
さい淋菌ゲノムのＤＮＡ断片を生成し、したがってこれ
らＤＮＡ断片は髄膜炎菌菌株のＤＮＡにハイブリダイズ
しないと思われる。 ３．淋菌ＤＮＡを制限酵素で切断するのではなく、例え
ば音波処理によってゲノムのランダムせん断によりゲノ
ムを断片に破壊することもできる。これは制限酵素での
切断によっては生成されずしかも淋菌に対し特異的であ
る個々のヌクレオチド配列となるような淋菌ＤＮＡ断片
を作成することができる。 ４．使用する淋菌の菌株を変えて淋菌ＤＮＡ断片を作成
することもできる。
【００７０】さらに、本発明による組成物の要件を満た
す任意の組成物も、これら組成物がどのように得られる
かとは無関係に本発明の範囲内に含まれることを特記す
べきである。すなわち、たとえ組成物が上記スクリーニ
ング法以外の方法で得られたとしてもこれは本発明に包
含される。
【００７１】組成物が本発明に含まれるかどうか決定す
る工程「Ｈ」で記載した試験は、組成物が主として個々
のオリゴヌクレオチド配列、すなわち約５０個未満の塩
基対の個々のヌクレオチド配列よりなる場合には若干変
更せねばならない。個々のオリゴヌクレオチド配列にお
いては、ハイブリダイゼーションおよび洗浄温度を変化
させる必要がある。６５℃においてオリゴヌクレオチド
配列は、ハイブリダイゼーション反応後、殆どハイブリ
ダイズせずに残る。ハイブリダイゼーションおよび洗浄
を行う温度が個々のオリゴヌクレオチド配列を含有する
組成物のＴｍ（℃）−３０℃であれば、この決定を２×
ＳＳＣの塩濃度を有する溶液で行い、かつＴｍは個々の
オリゴヌクレオチド配列の変性温度である。組成物のＴ
ｍは、標準技術によって計算しまたは決定することがで
きる。個々のオリゴヌクレオチド配列を合成する場合、
この種のオリゴマー相補配列を合成してＴｍを決定せね
ばならない。さらに本発明の目的には、末端結合した非
淋菌ポリヌクレオチド（例えばポリＡ）を有する個々の
オリゴヌクレオチド配列を個々のヌクレオチド配列と考
えねばならないことに注目すべきである。
【００７２】本発明の組成物は１個の分離したヌクレオ
チド配列あるいは多数の個々のヌクレオチド配列で構成
しうることに注目すべきである。すなわち、本発明の組
成物が多数の個々のヌクレオチド配列からなる場合、個
々の各ヌクレオチド配列は、淋菌に対し特異的であって
はならないが、この組成物は淋菌に対し特異的である。
これは、各個々のヌクレオチド配列が６種の髄膜炎菌の
いずれかにおける髄膜炎菌ＤＮＡに対しハイブリダイズ
することができず、また６種の淋菌菌株の全てにおける
淋菌ＤＮＡに対してもハイブリダイズし得ないという事
実に基づいている。多数の個々のヌクレオチド配列から
なる本発明の組成物は２種以上の組換バクテリオファー
ジＤＮＡに由来する個々のヌクレオチド配列の混合物、
あるいはヌクレオチド配列挿入物を多数の個々のヌクレ
オチド配列まで、例えばニック翻訳の結果として切断す
る１個の組換バクテリオファージＤＮＡのいずれかによ
って得ることができる。
【００７３】２個以上の組換バクテリオファージＤＮＡ
に由来する本発明の組成物は、毎分の最大カウント数を
与える淋菌の菌株と毎分の最大カウント数を与える髄膜
炎菌の菌株との比が５より大であるような組換バクテリ
オファージＤＮＡを工程Ｈの手順で使用しうる工程Ｇで
得ることができる。すなわち、これらの組換バクテリオ
ファージＤＮＡは、淋菌の菌株の全部ではないが少なく
とも１種を同定することができる。さらに、これらは約
５より大きい比を有する他の組換バクテリオファージＤ
ＮＡと組合わせて使用することもでき、この種の「カク
テル」も発明の構成物を与える。
【００７４】淋菌の検出方法 本発明の他の面は、淋菌を検出するためのハイブリダイ
ゼーション分析に本発明の組成物を使用する方法であ
る。現在公知または将来開発されるであろう全てのハイ
ブリダイゼーション法を本発明に使用することができる
〔例えばファルコン等にかかる米国特許第４，４５８，
５３５号、その開示を参考のためここに引用する〕。
【００７５】本発明の組成物をハイブリダイゼーション
分析で使用するに先立ち、この組成物は検出可能なマー
カ（例えば放射同位元素、酵素など）で標識せねばなら
ない。ハイブリダイゼーション分析は一般に、限定はし
ないが、淋菌試料または本発明の組成物のいずれかをマ
トリックスに固定化させ、かつこのマトリックスを処理
してマトリックスに対する本発明の組成物の非特異的結
合を阻止することからなっている。次いで、本発明の標
識された組成物を用いて、ハイブリダイゼーション条件
下でマトリックス上の試料と接触させる。淋菌試料に対
し特異的にハイブリダイズしなかった成分を例えばマト
リックスの洗浄によって除去する。次いで組成物の標識
を検出し、かつ標識が存在すれば淋菌が存在する。
【００７６】遺伝学上明確な群の検出方法 本発明のさらに他の局面において、上記スクリーニング
方法は、遺伝学上明確な群（例えば淋菌）に対し特異的
なヌクレオチド配列をスクリーニングするための極めて
便利な方法を提供する。
【００７７】この方法は次の工程からなっている：すな
わち遺伝学上明確な群に対し特異的なヌクレオチド配列
をスクリーニングする方法は、（ａ）スクリーニングす
べきヌクレオチド配列の各試料につき別々の試験ドット
をマトリックス上に形成し、各試験ドットは前記試料の
１つから得られる一本鎖型の精製ＤＮＡを含み、（ｂ）
前記試験ドットをハイブリダイゼーション条件下で前記
ヌクレオチド配列と接触させ、前記ヌクレオチド配列は
バクテリオファージＤＮＡにおける一本鎖ヌクレオチド
配列挿入物であり、前記バクテリオファージはそのライ
フサイクル中に一本鎖ＤＮＡ段階を有するバクテリオフ
ァージであり、（ｃ）前記試験ドットにハイブリダイズ
しなかったヌクレオチド配列を前記試験ドットにハイブ
リダイズしたヌクレオチド配列から分離し、（ｄ）前記
試験ドットをハイブリダイズ条件下で前記バクテリオフ
ァージと変性二重鎖ＤＮＡと接触させ、前記バクテリオ
ファージの前記変性二重鎖ＤＮＡはこれに結合した検出
可能なマーカを有し、（ｅ）前記試験ドットにハイブリ
ダイズしたバクテリオファージの二重鎖ＤＮＡを前記試
験ドットにハイブリダイズしなかったバクテリオファー
ジの二重鎖ＤＮＡから分離し、かつ（ｆ）ヌクレオチド
配列を前記検出可能なマーカによって検出することを特
徴とする。
【００７８】
【実施例】以下、実施例により限定せずに本発明をさら
に説明する。
【００７９】実施例１ ＡＴＣＣ５３４０９，ＡＴＣＣ５３４１０およびＡＴＣ
Ｃ５３４１１の淋菌挿入物におけるフランキングヌクレ
オチド配列の同定および分離方法（これは、一般に化学
文献において「クロモソマル・ウォーキング」と言われ
る）。
【００８０】この方法は、ＡＴＣＣ５３４０９，ＡＴＣ
Ｃ５３４１０およびＡＴＣＣ５３４１１の淋菌挿入物に
おけるフランキングヌクレオチド配列を有するクローン
を分離し、ついでこれら配列の特異性をその淋菌および
髄膜炎菌ＤＮＡに対する反応性につき検査することによ
って行われる。この方法は、さらに淋菌に対し特異的で
ある個々の整列ヌクレオチド配列のサイズをも明らかに
する。
【００８１】（Ａ）クローニング：ＡＴＣＣ５３４０
９，ＡＴＣＣ５３４１０およびＡＴＣＣ５３４１１の個
々のヌクレオチド配列挿入物のサイズは約０．８５〜約
１．３ｋｂの範囲である。ＡＴＣＣ５３４０９，ＡＴＣ
Ｃ５３４１０およびＡＴＣＣ５３４１１のフランキング
ヌクレオチド配列を有する淋菌ＤＮＡの大きい断片を得
るため、バクテリオファージλクローニング系を用い
る。ＥＭＢＬ３およびＥＭＢＬ４は、９〜２３ｋｂをク
ローニングできるるλベクターである〔Ａ．フリシャウ
フ等（１９８３）、ジャーナル・モレキュラ・バイオロ
ジー、第１７０巻、第８２７−８４２頁〕。先ず最初
に、６種の寄託した淋菌菌株のいずれかから得られた淋
菌ＤＮＡをＢａｍＨＩにより部分切断して、約１５ｋｂ
の平均サイズを得る。ついでこれら断片を使用して、Ｂ
ａｍＨＩ切断されたＥＭＢＬ３ベクターを含むライブラ
リーを作成する。これら断片は、さらに脱燐酸化して、
各λクローンが１個のみのＢａｍ切断ＤＮＡを含有する
ように確保せねばならない〔マニアチス等〕。ライゲー
ション後、ＤＮＡにはベクター・クローニング・システ
ム社〔サン・ジエゴ、カリフォルニア州（ＧＰ１０）〕
から得られる「ギガパック」パッケージング混合物をパ
ッケージングする。
【００８２】（Ｂ）インビドロパッケージング：ベクタ
ー・クローニング・システム社から得られる「ギガパッ
ク」インビドロパッケージングキットは、音波処理され
た凍結／解凍抽出物のセットを含有する。準備ができた
ら、適当な数個のセットを−８０℃の凍結装置から取り
出して氷上に載置する。凍結／解凍抽出物を、丁度解凍
するまで指の間で転がし、これを氷へ戻す。同様に、音
波処理した抽出物も解凍する。ＤＮＡを凍結／解凍チュ
ーブに加え、氷へ戻す。１５μｌの音波処理抽出物をＤ
ＮＡ／凍結／解凍混合物へ添加し、かつ充分混合する。
この反応物を２２℃にて２時間温置する。その後、０．
５ｍｌのバクテリオファージ希釈緩衝液（５．８ｇのＮ
ａＣｌ，２ｇのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ，５０ｍｌの１Ｍ
トリスＣｌ（ｐＨ７．５），５ｍｌの２％ゼラチン／
ｌ）と２０μｌのクロロホルム（ポリスチレンチューブ
にはクロロホルムを加えず、反応物をポリプロピレンチ
ューブ中に入れねばならない）を加えて緩和に混合す
る。この溶液を次いでバクテリオファージ保存物として
処理する。バクテリオファージ希釈緩衝液における１／
１０の４種の連続希釈物（最終希釈物は１０−５希釈で
ある）を作成し、各チューブからの１０μｌを塗抹す
る。３７℃で１２時間培養した後にプラークが出現す
る。充填抽出物は、抽出物に加えられたＤＮＡの１μｇ
毎に１０4 〜１０8 個のプラークを与える。
【００８３】（Ｃ）組換バクテリオファージの塗抹：宿
主として使用したイー・コリの菌株はＮＭ５３９、すな
わち組換λバクテリオファージのみを感染させうるバク
テリオファージＰ１溶原菌である。宿主細菌の培養物を
１晩増殖させた後、ＴＢ培地（１０ｇのバクト−トリプ
トン（ディフコ社）と５ｇのＮａＣｌ／脱イオン水１
ｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭのＭｇＳＯ4と０．２％マル
トースとがオートクレーブ処理後に充填されたもの）に
充填した。１Ｍ ＭｇＳＯ4 と２０％マルトースの保存
溶液を濾過滅菌した。ＮＭ５３９培養物を３０℃の振と
う水槽内で２００ｒｐｍにて１晩培養した。より低い温
度は、バクテリアの過大増殖を防止する。翌日、細菌を
２５００ｒｐｍにて１０分間沈殿させ、かつ１０ｍＭの
ＭｇＳＯ4 中へ初期培養容積の０．４倍の容積で再懸濁
させた。６００ｎｍの吸光度で読み取った。吸光度０．
５に調整した０．２ｍｌの細菌（１ｍｌ当たり約３×１
０8 の細菌）を無菌バクテリオファージ希釈緩衝液およ
び３ｍｌのトップアガロース（ＮＺＹ培地における０．
７％低ＥＥＤアガロース）と共に使用した。細菌用プレ
ートにＮＺＹ寒天を注ぎ入れた〔ＮＺＹ培地＋１．５％
バクト寒天：ＮＺＹ培地は１０ｇのＮＺアミン（ＩＣＮ
ファーマスーチカル社）と５ｇのＮａＣｌと５ｇのイー
スト抽出物と２ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ２Ｏ／１ｌであ
り、ＮａＯＨによりｐＨ７．５に調整〕。これらプレー
トを室温にて１晩乾燥させ、かつバクテリオファージを
塗抹する前に３７℃まで加温する。各プレートにおける
プラークの最適数は約２００〜３００個のプラークであ
る。
【００８４】（Ｄ）フィルタの作成：ナイロン膜フィル
タ（ポール・ウルトラファイン・フィルトレーション・
コーポレーション社）をプレート上へ３０秒間載置す
る。これにより、幾分かのバクテリオファージがプラー
クから膜へ移動してプレートの「レプリカ」を形成す
る。プレートおよび膜のそれぞれは、予め各膜がその後
に適当なプレートと整合しうるようかつプレート上のフ
ィルタの物理的配向をも決定しうるようマークする。
【００８５】次いで、各膜を予め１．５Ｍ ＮａＣｌ／
０．５Ｍ ＮａＯＨにて１分間飽和させたワットマンN
o. ３の濾紙に載せることによって処理する。次いで、
これらフィルタを１．５Ｍ ＮａＣｌ／０．５Ｍ トリ
ス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）で飽和された紙へ５分間移し、
次いで２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣ
ｌ、０．０１５Ｍ Ｎａ3 クエン酸）へ５分間移動させ
る。これらフィルタを風乾し、次いで減圧下に８０℃に
て１時間焼成する。
【００８６】（Ｅ）プレハイブリダイゼーション：焼成
したフィルタを６×ＳＳＣの表面上へ、下側から完全に
濡れるまで（約５分間）浮遊させる。次いで、フィルタ
を１００ｍｌの予備洗浄溶液（５０ｍｌトリス−Ｃｌ
（ｐＨ８．０）、１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡお
よび０．１％ＳＤＳ）を含有するプラスチック袋（例え
ばシール−ア−ミール袋）へ移して、緩和に攪拌しなが
ら４２℃にて１〜２時間培養する。フィルタを取り出し
かつ排液した後、これをプレハイブリダイゼーション溶
液（６×ＳＳＣ，５×デンハルト溶液，０．１％ＳＤ
Ｓ，１００μｇ／ｍｌの音波処理された熱変性牛胸腺Ｄ
ＮＡ）を含有する袋に入れる。プレハイブリダイゼーシ
ョンは、５０ｒｐｍに設定された振とう水槽中にて６５
℃で２〜４時間行う。
【００８７】（Ｆ）ハイブリダイゼーション：ＡＴＣＣ
５３４０９，ＡＴＣＣ５３４１０またはＡＴＣＣ５３４
１１からのＤＮＡをニック翻訳によって32Ｐで標識し、
かつプローブとして使用する。使用する準備ができた際
プローブを、このプローブを含有するチューブを煮沸水
中へ５分間浸漬し次いで氷水中で急冷することにより変
性させる。プレハイブリダイゼーション後、このプレハ
イブリダイゼーション溶液を絞り出しかつハイブリダイ
ゼーション溶液（プレハイブリダイゼーション溶液＋１
００μｇ／ｍｌの酵母ｔＲＮＡおよび上記したような熱
変性された32Ｐ標識プローブ）で置換する。ハイブリダ
イゼーションは、緩和に攪拌しながら水槽中で６５℃に
て４０〜４８時間行う。
【００８８】（Ｇ）洗浄：ハイブリダイゼーション後、
これらの膜をプラスチック袋から取り出し、かつプラス
チック箱中に入れる。これら膜を次いでゆっくり攪拌し
ながら６５℃にて２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳにてそれ
ぞれ３０分間ずつ３回洗浄する。
【００８９】（Ｈ）オートラジオグラフィー：洗浄した
膜を風乾しかつコダックＸＲＰ−５のＸ線フィルムに露
出させる。プローブに対しハイブリダイズしたこれらの
プラークは、フィルム上に黒い斑点を生ずる。
【００９０】（Ｉ）プラークの証明：次いで、プローブ
とハイブリダイズしうる能力によって候補であると確認
されたプラークを釣り上げ、かつ各プラークから新たな
宿主細菌を含有するＴＬＡの上層を有するＮＺＹ寒天プ
レート上へ穿刺して再検査する。この手順を（Ｃ）から
（Ｈ）まで反復する。
【００９１】（Ｊ）バクテリオファージ保存物：ＡＴＣ
Ｃ５３４０９，ＡＴＣＣ５３４１０またはＡＴＣＣ５３
４１１に対しホモロジーを有すると積極的に確認された
プラークを用いて、プラークから新たな増殖宿主細菌へ
刺通することにより保存物を増殖させる。これらの保存
物を必要に応じて増幅することができる。
【００９２】（Ｋ）工程Ａ〜Ｊの結果：この時点でＡＴ
ＣＣ５３４０９，ＡＴＣＣ５３４１０もしくはＡＴＣＣ
５３４１１の淋菌挿入物に対するホモロジーに基づいて
プラークを選択する。したがって、これらはＡＴＣＣ５
３４０９，ＡＴＣＣ５３４１０もしくはＡＴＣＣ５３４
１１の淋菌挿入物の全部又は一部分を含有する淋菌から
得られた大きい範囲のＤＮＡを有する。
【００９３】（Ｌ）ファージ保存物からのＤＮＡの調
製：ファージ保存物１．５ｍｌを１０ｍＭのＭｇＳＯ4
の存在下に１０μｇ／ｍｌのデオキシリボヌクレアーゼ
Ｉ（シグマ・ケミカル・カンパニー社）により２５〜３
０℃（室温）で２時間消化する。この工程は宿主細胞の
溶解後にバクテリオファージ保存物に存在する全ての染
色体ＤＮＡを消化する一方、バクテリオファージ粒子の
内部に存在するＤＮＡはバクテリオファージコート蛋白
質によって保護される。ついで、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ
トリス−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭＥＤＴＡ）で中和し
た等容量のフェノールをバクテリオファージ溶液に添加
しかつ激しく攪拌する。高速度遠心分離器（またはその
均等物）にて９０００ｒｐｍにて５分間遠心分離する
と、界面に蛋白質が存在する２相の分離が生じる。ＤＮ
Ａを含有する上層（水性）を慎重に採取し、かつ１／１
０容積の３Ｍ ＮａＯＡc と２容量の９５％ＥＴＯＨを
添加し、次いでドライアイス／ＥＴＯＨ浴槽内で冷却す
ることによりＤＮＡを沈殿させる。上澄液を９０００ｒ
ｐｍでの１０分間の遠心分離により除去し、７０％ＥＴ
ＯＨ／３０％Ｈ2 Ｏの溶液で迅速に洗浄する。次いで、
このペレットを凍結乾燥機で乾燥させ、かつ０．１ｍｌ
のＴＥ緩衝液に懸濁させる。
【００９４】（Ｍ）制限酵素マッピング：ついで５μｌ
を種々の制限酵素の単独又は組合せで切断し、かつ得ら
れた断片をゲル電気泳動によってＴＢＥ緩衝液（０．０
８９Ｍトリス−ホウ酸、０．８９Ｍホウ酸、０．００２
Ｍ ＥＤＴＡ）における０．７〜２．０％アガロースゲ
ルでの電気泳動によって分離する。これらゲルを、５ｍ
ｇ／ｍｌの臭化エチジウム中に浸漬し次いで２４０〜３
４０ｎＭ波長の紫外線照射によってゲルを染色する。こ
の時点で、全切断生成物（又は多過ぎる）を可視化する
のに充分なＤＮＡが存在するかどうか、および切断が完
全であったかどうかを決定すべきである。ＤＮＡおよび
制限酵素の量を変化させて、次の切断に際し調整を行う
ことができる。これら切断の各生成物の分析は、各クロ
ーンにおける制限酵素部位の位置に関する直線地図を与
える。この種の分析から、各種のクローン間の重複領域
を確認することができる。さらに、これはサブクローニ
ングのためどの酵素を使用すべきかの選択を可能にす
る。サザンブロットは、種々の制限酵素切断物を含有す
るゲルで構成させることができ、ＡＴＣＣ５３４０９，
５３４１０もしくは５３４１１に由来する挿入物の位置
を制限酵素地図上に位置決定することができる。この時
点で、これら挿入物に直接隣接して切断する制限酵素を
選択することができ、かくして挿入物に直接隣接しかつ
フランキングヌクレオチド配列となる配列をサブクロー
ニングしかつ特異性につき試験する。
【００９５】（Ｎ）断片のサブクローンニング：バクテ
リオファージの保存物を増幅し、かつＤＮＡを調製し
（上記Ｋに記載したように）、各クローンにつきＤＮＡ
の充分な供給量を得ることができる。ＤＮＡを、上記工
程で決定した適当な酵素により切断し、対応部位を有す
るベクターをも切断する。この工程に対する適当なベク
ターは、サブクローニング用に使用する制限酵素の選択
によって決定される。有用と思われる１種のベクターは
ｐＩＢＩ７６である。何故なら、これは多くの一般的に
使用される制限部位の人工的に作成した配列の「ポリリ
ンカー」を有するからである。さらにこのベクターは、
ベクターと挿入ＤＮＡのライゲーション混合物で形質転
換させた後、クローンをアンピシリン耐性によりベクタ
ーの存在、そしてさらにＭ１３クローンにおいて上記し
たように青色対白色表現型によりベクター中の挿入物の
存在に対し選択することができ、この場合白色プラーク
の代わりに白色コロニーを探す点で相違している。次い
で、クローンを釣り上げ、増殖させかつマニアチスによ
り記載された標準法によってプラスミドＤＮＡを分離す
る。次いで、これらクローンを32Ｐ標識でニック翻訳
し、かつ淋菌に対し特異的であるクローンの同定を工程
Ｈにおいて上記したと同様に行うことができる。ＡＴＣ
Ｃ５３４０９，５３４１０もしくはＡＴＣＣ５３４１１
からの淋菌挿入物のフランキングヌクレオチド配列であ
るヌクレオチド配列から得られたＤＮＡのクローンが上
記したように淋菌に対し特異的であると証明されれば、
これらフランキングヌクレオチド配列に直接隣接したヌ
クレオチド配列をもクローンニングしてその特異性につ
き試験することができる。これは、元の挿入物からもは
や淋菌に対し特異的でなくなるまで離間したクローンを
釣り上げるまで反復することができ、ゲノム上のこの点
を越える全てのヌクレオチド配列はフランキングヌクレ
オチド配列ではなく、従って本発明の範囲内でない。淋
菌に対し特異的である各クローンのＤＮＡ挿入物はＡＴ
ＣＣ５３４０９，ＡＴＣＣ５３４１０およびＡＴＣＣ５
３４１１の各側における個々のフランキングヌクレオチ
ド配列を規定し、従って本発明の範囲内である。
【００９６】実施例２ この実施例は個々のヌクレオチド配列が本発明の組成物
であるかどうかを決定する。
【００９７】試験ドットの作成 下記のＡＴＣＣ受託番号を有する６種の髄膜炎菌および
６種の淋菌を用いて試験ドットを作成した： 髄膜炎菌 淋菌 １． ５３４１４ １． ５３４２０ ２． ５３４１５ ２． ５３４２１ ３． ５３４１６ ３． ５３４２２ ４． ５３４１７ ４． ５３４２３ ５． ５３４１８ ５． ５３４２４ ６． ５３４１９ ６． ５３４２５
【００９８】ＡＴＣＣは、上記淋菌の試料を凍結状態で
供給する。１２種の株菌のそれぞれを４〜６枚のチョコ
レート寒天プレート上にて培養物を綿棒で塗抹すること
により増殖させた。ＣＯ2 培養器（１０％ＣＯ2 ）にて
１晩培養した後、菌体を綿棒上に集めて収穫し、かつこ
れらをＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ８．
０、１ｍＭ ＥＤＴＡにて再懸濁させた。各プレートに
つき１ｍｌのＴＥ緩衝液を用いた。ナイセリアの染色体
ＤＮＡを、ＳＤＳ（最終濃度０．１％）で菌体を溶菌す
ることにより単離した。ＤＮＡをNo. ２２の注射器針に
３〜４回通過させて剪断し、次いでＲＮアーゼで切断し
（１０μｇ／ｍｌ最終濃度の室温にて３０分間の培養）
かつフェノール抽出（ＴＥ飽和フェノールで３回）を行
った。酢酸ナトリウム（ｐＨ７．４）を最終濃度０．３
Ｍまで添加し、次いで２倍容積の９５％エタノールを添
加した。次いで、染色体ＤＮＡをパスールピペットを用
いて集め、その際沈殿ＤＮＡをエタノール溶液から吸い
上げた。ＤＮＡ繊維を試験管に移し、かつ７５％エタノ
ール（２５％ＴＥ緩衝液）で２回洗浄した。残留するエ
タノールを除去し、その際試験管をスピードバック遠心
分離器に入れかつ減圧下で数分間操作した。次いで、Ｄ
ＮＡを小容量のＴＥ緩衝液（培養物６枚につき約１ｍ
ｌ）を加えて溶解させ、かつ時々緩和に攪拌しながら４
℃にて１晩静置させた。ＤＮＡの純度を、アガロースゲ
ル電気泳動によりかつ２６０ｎｍおよび２８０ｎｍにお
ける吸光度の比を比較して検査した（ＤＮＡの良好な調
製物は１．８より高い比を有する。）次いで、精製され
た染色体ＤＮＡを０．２Ｎ ＮａＯＨ（最終濃度）にて
室温で１０分間変性させ、かつｐＨをＮＨ4 Ａc の添加
により約７．８に調整し、１Ｍ ＮＨ4 Ａc −０．０２
Ｎ ＮａＯＨの最終濃度にした。
【００９９】１２種の変性した精製染色体ＤＮＡのそれ
ぞれにつき、６個の試験ドットを作成した。６個の試験
ドットのそれぞれを１／１０のファクターにより１Ｍ
ＮＨ4 ＯＡc でシリーズ希釈して、６個の試験ドットが
次の量の変性した精製染色体ＤＮＡを含有するようにし
た：５００ｎｇ、５０ｎｇ、５ｎｇ、０．５ｎｇ、５０
ｐｇ、および５ｐｇ。かくして、各菌株には全部で７２
試験ドットをもたらすような６個の試験ドットが存在し
た。
【０１００】試験ＤＮＡドットの作成 適当量のＤＮＡを含有する１００〜２００μｇの１Ｍ
ＮＨ4 ＯＡc を、３６個の試料マニホールドを有するド
ット吸い取り装置により１０インチＨｇの減圧下でニト
ロセルロース膜へ施した。各試料を１Ｍ ＮＨ4 ＯＡc
および４×ＳＳＣで洗浄した。次いで、ニトロセルロー
ス膜を風乾し、かつ減圧オーブン内で８０℃にて減圧下
に１時間焼成した。このニトロセルロース膜は、乾燥剤
を入れた気密なプラスチック袋内に１ヶ月程度の長い期
間にわたり使用前に貯蔵することができる。
【０１０１】試験ドットに対するハイブリダイゼーショ
ン ＡＴＣＣ５３４０９、ＡＴＣＣ５３４１０およびＡＴＣ
Ｃ５３４１１の各組換ＤＮＡ分子のＲＦ ＤＮＡを、そ
のイー・コリ宿主から分離した。それぞれは、Ｍ１３バ
クテリオファージから得られたベクター中へ挿入した淋
菌ＤＮＡよりなる組換ＤＮＡ分子を含有する。次いで、
これら組換ＤＮＡ分子を、標準プラスミドＤＮＡ製造法
〔マニアチス参照〕を用いて細菌からＲＦ型として分離
する。
【０１０２】ついで、ＲＦ ＤＮＡを標準技術〔マニア
チス参照〕によりニック翻訳で32Ｐ標識して、32Ｐ標識
の比活性を１０7 〜１０8cpm／ＤＮＡμｇとした。
【０１０３】ついで、 32 Ｐ標識したＲＦ ＤＮＡを用
いて、下記するように試験ドットにハイブリダイズさせ
た：ハイブリダイゼーション前に、ニトロセルロース膜
をプラスチック袋（例えばシール・ア・ミール袋）内に
入れ、この袋は２×ＳＳＣと５×デンハルト溶液と０．
１％ＳＤＳと１００μｇ／ｍｌの音波処理した変性牛胸
腺ＤＮＡとを含有し、このニトロセルロース膜をゆっく
り振とうしながら６５℃にて２時間温置した。このプレ
ハイブリダイゼーション工程を用いて、マトリックス上
に位置するあるいはニトロセルロース膜状に又は試験Ｄ
ＮＡドットに位置する全ての非特異的結合部位をブロッ
キングする。
【０１０４】32Ｐ標識ＲＦ ＤＮＡを水浴中で１０分間
煮沸することにより変性させた。この変性した32Ｐ標識
ＲＦ ＤＮＡを氷水中で急速冷却させ、次いで２×ＳＳ
Ｃと５×デンハルト溶液と０．１％ＳＤＳと１００ｍｇ
／ｍｌの音波処理した熱変性牛胸腺ＤＮＡと１００μｇ
／ｍｌの酵母＋ｔＲＮＡよりなるハイブリダイゼーショ
ン溶液に添加した。次いで、この混合物を１枚もしくは
数枚のニトロセルロース濾紙を含むプラスチック袋内に
入れ、フィルタのそれぞれは試験ドットを含み、これを
ゆっくり攪拌しながら６５℃にて約４０時間置いた。ハ
イブリダイズの後、ニトロセルロース膜を袋から取り出
し、かつそれぞれ予備加温した２×ＳＳＣ、０．１％Ｓ
ＤＳで約３０分間にわたり２回洗浄し、これら４回の洗
浄は全てゆっくり攪拌しながら６５℃にて行った。次い
で、この混合物を風乾した。
【０１０５】ハイブリッドにおける32Ｐの放射能の定量 次いで、ニトロセルロース濾紙をＸ線フィルムに露出し
た。次いで、現像したＸ線フィルムを基準マーカとして
使用し、その際これをフィルタ上へ載置し各試験ドット
をフィルタから切除すると共に、シンチレーション液を
含有する小瓶内に入れた。
【０１０６】次いで各小瓶をシンチレーションカウンタ
に入れ、かつハイブリッドにおける32Ｐの放射能を定量
化した。ただし、32Ｐの放射能（ここで試験ドットにお
ける変性した精製染色体ＤＮＡの量は０．５ｎｇ、５０
ｐｇおよび５ｐｇであった）は定量化しなかった。何故
なら、０．５ｎｇにおけるカウント数／毎分は、マトリ
ックスのバックグラウンドにおけるよりも少ないカウン
ト数／毎分を与えるからである。毎分のカウント数とし
てマトリックスバックグランドを引算した後に得られる
結果を示せば次の通りである：
【０１０７】
【表１】
【０１０８】
【表２】
【０１０９】
【表３】
【０１１０】試験ドットの精製染色体ＤＮＡ５００ｎｇ
によるカウント数／min 、すなわち試験ドットの精製染
色体ＤＮＡの等量（５００ｎｇ）に基準化された試験ド
ットにハイブリット化する淋菌ＤＮＡの量を次いでＡＴ
ＣＣ５３４０９，ＡＴＣＣ５３４１０およびＡＴＣＣ５
３４１１につき計算した。
【０１１１】
【表４】
【０１１２】
【表５】
【０１１３】
【表６】
【０１１４】試験ドットの精製染色体ＤＮＡの等量（５
００ｎｇ）に基準化したドットに対しハイブリダイズす
る淋菌ＤＮＡの平均量を次いで表４〜６のデータを用い
て計算し、淋菌および髄膜炎菌の各菌株における６個の
試験ドットにつきそれぞれ計算した。これらは（１）殆
ど同一であるもの、および（２）の１０のファクタだけ
異なる試験ドットの精製染色体ＤＮＡの量によって平均
を計算する。それらの結果は次の通りであった：
【０１１５】
【表７】
【０１１６】
【表８】
【０１１７】
【表９】
【０１１８】ＡＴＣＣ５３４０９，ＡＴＣＣ５３４１０
およびＡＴＣＣ５３４１１につき淋菌に関する表７〜９
のデータにおけるカウント数／min の最低数、およびＡ
ＴＣＣ５３４０９，ＡＴＣＣ５３４１０およびＡＴＣＣ
５３４１１につき髄膜炎菌に関する表７〜９のカウント
数／min の最高数を次いで計算した。それらの結果は次
の通りであった：
【０１１９】
【表１０】
【０１２０】かくして、淋菌の６種の各菌株における精
製染色体ＤＮＡの等量に基準化した６種の淋菌の各菌株
における精製染色体ＤＮＡに対しハイブリダイズした淋
菌ＤＮＡの平均量の最低値と、髄膜炎菌の６種の各菌株
における精製染色体ＤＮＡの等量に基準化した６種の髄
膜炎菌の各菌株における精製染色体ＤＮＡに対しハイブ
リダイズした淋菌ＤＮＡの最高平均量との比は次の通り
である： ＡＴＣＣ ５３４０９ − ３８２２：０ ＡＴＣＣ ５３４１０ − ５１０：０ ＡＴＣＣ ５３４１１ − １１２１：２０ 従って、この比は約５より大であるため、ＡＴＣＣ５３
４０９，ＡＴＣＣ５３４１０およびＡＴＣＣ５３４１１
の淋菌ＤＮＡ挿入物はそれぞれ本発明の組成物となる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｇ０１Ｎ 33/571 Ｇ０１Ｎ 33/571 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:36） (72)発明者 ヒューイ−ラン ヤン アメリカ合衆国、ニュー ジャージー州 07670、ティナフライ、エングル ストリ ート 76番

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 遺伝上明確な群に対し特異的なヌクレオ
    チド配列をスクリーニングする方法において、（ａ）ス
    クリーニングすべき試料につき別々の試験ドットをマト
    リックス上に形成し、各試験ドットは前記試料の１つか
    ら得られる一本鎖型の精製ＤＮＡを含み、（ｂ）前記試
    験ドットをハイブリダイズ条件下で前記ヌクレオチド配
    列と接触させ、前記ヌクレオチド配列はバクテリオファ
    ージＤＮＡにおける一本鎖ヌクレオチド配列挿入物であ
    り、前記バクテリオファージはそのライフサイクル中に
    一本鎖ＤＮＡ段階を有するバクテリオファージであり、
    （ｃ）前記試験ドットにハイブリダイズしなかったヌク
    レオチド配列を前記試験ドットにハイブリダイズしたヌ
    クレオチド配列から分離し、（ｄ）前記試験ドットをハ
    イブリダイズ条件下で、バクテリオファージ変性二重鎖
    ＤＮＡと接触させ、前記変性二重鎖ＤＮＡはこれに結合
    した検出可能なマーカを有し、（ｅ）前記試験ドットに
    ハイブリダイズしたバクテリオファージの二重鎖ＤＮＡ
    を前記試験ドットにハイブリダイズしなかったバクテリ
    オファージの二重鎖ＤＮＡから分離し、かつ（ｆ）ヌク
    レオチド配列を前記検出可能なマーカによって検出する
    ことを特徴とするヌクレオチド配列のスクリーニング方
    法。
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Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7090972B1 (en) 1986-11-24 2006-08-15 Gen-Probe Incorporated Methods for determining the presence of non-viral organisms in a sample
US7087742B1 (en) 1986-11-24 2006-08-08 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotide probes for the detection and/or quantitation of non-viral organisms
CA1340100C (en) * 1987-05-08 1998-10-27 Huey-Lang Yang Polynucleotide commposition and method
EP0311388B1 (en) * 1987-10-06 1995-02-22 Ortho Diagnostic Systems Inc. A rapid method for identifying a specific nucleic acid sequence
US5359100A (en) * 1987-10-15 1994-10-25 Chiron Corporation Bifunctional blocked phosphoramidites useful in making nucleic acid mutimers
US5124246A (en) * 1987-10-15 1992-06-23 Chiron Corporation Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same
EP0337896B1 (en) * 1988-04-15 1993-07-28 N.V. Innogenetics S.A. Hybridization probes for detecting neisseria strains
US5099011A (en) * 1988-08-02 1992-03-24 Ortho Diagnostic Systems Inc. Nucleic acid probe for detection of Neisseria gonorrhoea
JPH0242437A (ja) * 1988-08-02 1990-02-13 Fuji Photo Film Co Ltd ハロゲン化銀カラー写真感光材料
US5047523A (en) * 1988-08-02 1991-09-10 Ortho Diagnostic Systems Inc. Nucleic acid probe for detection of neisseria gonorrhoea
US5108895A (en) * 1988-08-02 1992-04-28 Ortho Diagnostic System Inc. Nucleic acid probe for detection of Neisseria gonorrhoea
GR1002090B (en) * 1988-09-30 1995-12-28 Ortho Diagnostic Systems Inc A rapid method for identifying a specific nucleic acid sequence
US7172863B1 (en) 1988-12-09 2007-02-06 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes and methods for detecting Neisseria gonorrhoeae
US5324829A (en) * 1988-12-16 1994-06-28 Ortho Diagnostic Systems, Inc. High specific activity nucleic acid probes having target recognition and signal generating moieties
GR1000347B (el) * 1988-12-21 1992-06-25 Ortho Diagnostic Systems Inc Μεθοδος παραγωγης νουκλεοτιδικων ανιχνευτων χρησιμοποιωντας ενα συμπληρωμα γεφυρωσεως.
GB8906821D0 (en) * 1989-03-23 1989-05-10 Ici Plc Thermal transfer printing
AU5966990A (en) * 1989-05-24 1990-12-18 Gene-Trak Systems Nucleic acid probes for the detection of neisseria gonorrhoeae
US5217862A (en) * 1989-05-24 1993-06-08 Amoco Corporation Method for the detection of Neisseria gonorrhoeae
DE3925613A1 (de) * 1989-06-22 1991-01-03 Boehringer Mannheim Gmbh Neisseria-spezifische dna-sonde
DE3923341A1 (de) * 1989-07-14 1991-01-24 Boehringer Mannheim Gmbh Neisseria gonorrhoeae-nachweis
EP0452596A1 (en) 1990-04-18 1991-10-23 N.V. Innogenetics S.A. Hybridization probes derived from the spacer region between the 16S and 23S rRNA genes for the detection of non-viral microorganisms
US5536638A (en) * 1990-04-18 1996-07-16 N.V. Innogenetics S.A. Hybridization probes derived from the spacer region between the 16S and 23S rRNA genes for the detection of Neisseria gonorrhoeae
GB9020621D0 (en) * 1990-09-21 1990-10-31 Imp Cancer Res Tech Identification of organisms
GB2262987A (en) * 1990-09-21 1993-07-07 Imp Cancer Res Tech Identification of organisms
US5256536A (en) * 1990-11-09 1993-10-26 Syntex (U.S.A.) Inc. Nucleotide probe for Neisseria gonrrhoeae
DE4219821A1 (de) * 1992-06-17 1993-12-23 Boehringer Mannheim Gmbh Spezifischer Nachweis von Neisseria Gonorrhoeae
US5389515A (en) * 1992-09-15 1995-02-14 Boehringer Mannheim Corporation Isolated nucleotide sequences for identifying Neisseria gonorrhoeae
US5550040A (en) * 1993-06-23 1996-08-27 Hoffman-La Roche Inc. Method, reagents and kits for the detection of Neisseria gonorrhoeae
WO1998044156A1 (en) * 1997-03-27 1998-10-08 Life Technologies, Inc. Nucleic acid ladders
ES2357877T3 (es) 1997-07-15 2011-05-03 Life Technologies, Inc. Escalas de ácido nucleico.
US5976805A (en) * 1998-04-27 1999-11-02 Becton Dickinson And Company Neisseria gonorrhoeae specific DNA fragment--GC3
US6756493B1 (en) 1998-09-01 2004-06-29 Antex Biologics, Inc. Nucleic acid sequence and uses thereof
US6693186B2 (en) 1998-09-01 2004-02-17 Antex Biologics Inc Neisseria meningitidis polypeptide, nucleic acid sequence and uses thereof
US7371516B1 (en) * 1999-07-16 2008-05-13 Rosetta Inpharmatics Llc Methods for determining the specificity and sensitivity of oligonucleo tides for hybridization
US7229800B2 (en) * 2004-04-16 2007-06-12 Becton, Dickinson And Company Neisseria gonorrhoeae assay
NZ630628A (en) 2013-10-08 2015-04-24 Seminis Vegetable Seeds Inc Methods and compositions for peronospora resistance in spinach
NZ630710A (en) * 2014-02-27 2016-03-31 Seminis Vegetable Seeds Inc Compositions and methods for peronospora resistance in spinach

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4446230A (en) * 1981-10-30 1984-05-01 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Test method for the laboratory diagnosis of Gonorrhea and test strain of neisseria gonorrhoeae
US4689295A (en) * 1983-01-20 1987-08-25 Integrated Genetics, Inc. Test for Salmonella
CA1228811A (en) * 1983-05-05 1987-11-03 Robert G. Pergolizzi Assay method utilizing polynucleotide sequences
DK219084D0 (da) * 1984-05-02 1984-05-02 Frederik Carl Peter Lindberg Antigen
GB8405437D0 (en) * 1984-03-01 1984-04-04 Amersham Int Plc Detecting polynucleotide sequences
CA1254114A (en) * 1984-05-07 1989-05-16 Allied Corporation Displacement polynucleotide assay employing recombination protein and diagnostic kit
US4755458A (en) * 1984-08-30 1988-07-05 Enzo Biochem, Inc. Composition and method for the detection of the presence of a polynucleotide sequence of interest
WO1987004165A1 (en) * 1985-12-27 1987-07-16 Toray Industries, Inc. Dna probe and method of preparing the same
EP0238332A2 (en) * 1986-03-19 1987-09-23 Cetus Corporation Liquid hybridization method and kit for detecting the presence of nucleic acid sequences in samples

Also Published As

Publication number Publication date
CA1299073C (en) 1992-04-21
DE3787299T2 (de) 1994-04-21
DE3787299D1 (de) 1993-10-14
EP0237737B1 (en) 1993-09-08
EP0237737A3 (en) 1990-05-23
JPH09262087A (ja) 1997-10-07
JP3532045B2 (ja) 2004-05-31
JP2820675B2 (ja) 1998-11-05
US4900659A (en) 1990-02-13
JPS62208300A (ja) 1987-09-12
EP0237737A2 (en) 1987-09-23

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