CN116287280B - 基于单细胞转录组mRNA水平的EXT1或EXT2诊断试剂盒 - Google Patents

基于单细胞转录组mRNA水平的EXT1或EXT2诊断试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种对着床前的胚胎进行EXT1和/或EXT2基因序列检测的试剂盒及其应用，该试剂盒包括以下4个引物对中的一个或更多个，引物对1：第一上游引物：SEQ ID No：1、第一下游引物：SEQ ID No：2，引物对2：第二上游引物：SEQ ID No：3、第二下游引物：SEQ ID No：4，3)引物对3：第三上游引物：SEQ ID No：5、第三下游引物：SEQ ID No：6，4)引物对4：第四上游引物：SEQ ID No：7、第四下游引物：SEQ ID No：8，该方法基于转录组进行诊断，降低了脱扣的可能，提高在着床前胚胎细胞中EXT1和EXT2基因检测的精准性和成功率，为连锁分析困难的胚胎检测家系提供了新方法。

Description

基于单细胞转录组mRNA水平的EXT1或EXT2诊断试剂盒
技术领域
本发明涉及生物医疗领域，具体涉及一种基于单细胞转录组mRNA水平的EXT1或EXT2诊断试剂盒及其应用方法。
背景技术
遗传性多发性外生骨疣（Hereditary Multiple Exostoses，HME），又名遗传性多发性骨软骨瘤病（HMO），是一种以多发性外骨骼发育为特征的软骨生长紊乱性疾病，呈常染色体显性遗传。患者在儿童期和青春期长骨骨骺、肋骨、脊柱骨、肩胛骨末端的软骨细胞异常增殖突出相邻骨膜，软骨帽覆盖在其表面并充当骨骺生长板，当青春期末期生长板闭合时，患者骨骺呈现大量骨软骨瘤，呈家族遗传性发病。在临床上主要表现为干骺端骨性肿物，并伴有疼痛、骨骼畸形，肢体长度不等、弓形、关节功能受限，身材矮小，脊柱侧弯和周围神经血管受累等并发症。HME的全球发病率仅0.2‰，但因国内人口基数庞大，仍有大量患者遭受该病困扰。虽然骨软骨瘤是最常见的良性骨肿瘤，但约2%的患者会发生恶性转化，形成周围型软骨肉瘤或骨肉瘤，多见于成年患者的骨盆和股骨，因难以进行放射或药物治疗从而危及生命。手术切除是当前HME主要的治疗方法，但手术不能彻底根治，无法阻止疾病的发展。因此，对HME患者进行遗传诊断，并在此基础上进行胚胎着床前遗传学检测，是从出生缺陷一级预防角度降低HME发病率，减少患儿出生，减轻家庭和社会负担的根本举措。
90%以上的遗传性多发性骨软骨瘤与EXT1和EXT2基因的杂合功能突变有关，较少数病例与EXT3、EXTL1、EXTL2和EXTL3有关。EXT1和EXT2基因属于肿瘤抑制因子EXT多基因家族，分别编码定位于高尔基体上的Ⅱ型跨膜糖蛋白exostosin-1和exostosin-2，是一类具有高催化作用的糖基转移酶。该糖蛋白广泛存在于所有体细胞中，负责催化葡萄糖醛酸、N-乙酰葡糖胺交替附着并延伸肽链，以共价键结合核心蛋白，合成出软骨重要组分硫酸乙酰肝素。EXT1基因位于8号染色体q24.11-q24.13区域，包含11个外显子；EXT2基因位于11号染色体p12-p11区域，包含14个外显子。EXT1和EXT2基因突变影响硫酸乙酰肝素的合成，软骨细胞信号转导、细胞增殖及分化异常，软骨发育异常，导致遗传性多发性骨软骨瘤的发生。
当前HME患者EXT1和EXT2基因检测的样本都取自外周血，提取基因组后可获得几微克的DNA用于后续PCR检测。着床前胚胎的EXT1和EXT2基因检测样本取自活检的囊胚外滋养层细胞，但相较于外周血样本，胚胎滋养层细胞数量获得较少且基因组DNA仅皮克级，加之在全基因组扩增过程中可能脱扣，检测存在较大困难。因此，当前针对胚胎中EXT1和EXT2基因突变的诊断，主要是通过遗传标记位点进行家系连锁分析，进而判断胚胎是否携带来自父源（或母源）的EXT1和EXT2基因变异。
目前对于着床前胚胎EXT1和EXT2基因的检测是基于囊胚活检获得约5-8个细胞，进行全基因组扩增，单个细胞的基因组DNA含量约6皮克（皮克级），远低于成人通过外周血提取的DNA含量（微克级）。胚胎活检获得的细胞数量少，DNA起始量太低，因此需要灵敏的单细胞全基因组扩增（WGA）技术。目前的检测多使用多重置换扩增（MDA）、多重退火循环扩增（MALBAC）等WGA技术以满足检测需求，但扩增方法仍然存在覆盖度和等位基因脱扣两大难题。目前WGA覆盖度约80-85%，ADO率高达20%。对于致病突变位于WGA低覆盖区域的家系，会面临扩增失败；即便位于高覆盖区，也可能发生扩增随机出现的等位基因脱扣，增加致病变异检测失败的风险。针对上述情况，临床上只能采用男女双方单核苷酸多态性或短串联重复序列（SNP/STR）的家系连锁分析策略降低误诊率，间接检测胚胎是否携带EXT1和EXT2基因变异。
另外，根据目前胚胎EXT1和EXT2诊断的方法，对于无遗传家族史的HME新发变异患者，无法通过家系连锁分析对胚胎进行间接检测。
因此，仍有需要开发一种高效精准的监测方法与试剂。
发明内容
为了解决前述的问题，本发明提供一种基于转录组的，用于着床前胚胎EXT1和/或EXT2基因检测的试剂盒及其应用。
第一方面，本发明提供一种用于着床前胚胎EXT1基因检测的试剂盒，其包括以下4个引物对中的一个或更多个，所述4个引物对具体如下：
1)引物对1
第一上游引物：CGGACTGGAGCTGAAAGTG（SEQ ID No：1）
第一下游引物：CAATCTGGCTCTGCTGATGA（SEQ ID No：2）
2)引物对2
第二上游引物：GACTGGAGCTGAAAGTGTTGA（SEQ ID No：3）
第二下游引物：GGCCAAGTGCCGGAATATAA（SEQ ID No：4）
3)引物对3
第三上游引物：GACCAGTTGTCACCTCAGTATG（SEQ ID No：5）
第三下游引物：CCACGAGAAGCTTCAACACT（SEQ ID No：6）
4)引物对4：
第四上游引物：CTAGCACTTAGACAGCAGACAC（SEQ ID No：7）
第四下游引物：ATCTGCACTGGGAAGAGAGA（SEQ ID No：8）。
优选地，在一些实施例中，该试剂盒包含前述4个引物对。
第二方面，本发明提供一种用于着床前胚胎EXT2基因检测的试剂盒，其包括以下4个引物对中的一个或更多个，所述4个引物对具体如下：
1）引物对5
第五上游引物：CTTCCTGCTGCCACCTTC（SEQ ID No：9）
第五下游引物：CAACCTTCCACCCTTAACCTAC（SEQ ID No：10）
2）引物对6
第六上游引物：CAGCCACAGGGATCTGATT（SEQ ID No：11）
第六下游引物：CTTTCTCTGGAAGATCCACCTC（SEQ ID No：12）
3）引物对7
第七上游引物：ACTTACCGGCAAGGCTAC（SEQ ID No：13）
第七下游引物：CTCGTCAGAGGTCAGCATAAT（SEQ ID No：14）
4）引物对8
第八上游引物：GTGCCCAGTCTATCCAAACTAC（SEQ ID No：15）
第八下游引物：TGACATCAGAGTGCTGGGA（SEQ ID No：16）。
优选地，在一些实施例中，该试剂盒包含前述4个引物对。
第三方面，本发明提供一种用于着床前胚胎EXT1和/或EXT2基因检测的试剂盒套装，其包含前述第一方面的试剂盒和前述第二方面的试剂盒。
第四方面，本发明提供一种用于着床前胚胎EXT1和/或EXT2基因检测的系统，其包括：
样本预处理装置，所述样本预处理装置用于从外滋养层细胞获得核酸样本；
特定核酸序列扩增装置，所述特定核酸序列扩增装置与所述核酸提取装置相连，用于使用第一方面和/或第二方面的试剂盒对目标基因的至少一部分进行扩增；
测序装置，所述测序装置与所述核酸序列确定装置相连，以便对所述扩增得到的产物进行测序分析。
进一步地，在一些实施例中，所述样本预处理装置包括：
细胞裂解单元，所述细胞裂解单元中使得所述外滋养层细胞得到充分裂解，暴露出其中的mRNA；
反转录单元，所述反转录单元通过将反转录试剂加入所述细胞裂解单元得到，用于对所述mRNA进行反转录反应，继而获得cDNA；
核酸扩增单元，所述核酸扩增单元中使用随机引物对所述cDNA进行扩增，得到所述核酸样本。
可选地，所述外滋养层细胞是囊胚期的外滋养层细胞。
可选地，所述细胞裂解单元中裂解细胞是这样进行的：
将所述外滋养层细胞置于裂解液中，充分震荡30-60秒，然后72℃孵育，使细胞裂充分解，所述裂解液包含RNA酶抑制剂、dNTP、Triton X-100、无核酸酶水。
可选地，所述样本预处理装置还包括纯化单元，得到所述核酸样本之前，在所述纯化单元中使用磁珠对所述核酸扩增单元得到的产物进行纯化。
可选的，所述制备cDNA模板是这样进行的：将所述裂解后的外滋养层细胞加入反转录体系，进行互补cDNA链的合成，所述反转录体系包括RNA酶抑制剂、dNTP 、polyT引物、Triton X-100、SuperScript II逆转录酶、0.1M DTT、甜菜碱Betaine (5M)、MgCl2 (1M)Superscript II 第一链 buffer (5×)、无核酸酶水、末端固定序列；进一步优选的，反转录程序为：25°C 5min；42°C 60min；50°C 30min；70°C 10min； 4°C保存。
可选的，所述PCR扩增所述cDNA模板是这样进行的：向所述cDNA模板加入扩增混合液，所述扩增混合液包括Tag DNA合成酶、固定序列上游引物、固定序列下游引物、无核酸酶水；进一步优选的，扩增程序为： 95°C 3min；14至18 个循环：98°C 20s, 66°C 15s, 72°Cfor 5min; 72°C 5min；4°C保存。
可选的，所述纯化经扩增的cDNA模板这样进行的：使用0.8×磁珠（Beckman）对扩增后获得的产物进行纯化，去除反转录和扩增过程中的引物序列等，以及200bp以下的小片段序列。
可选的，所述PCR体系如下：PCR扩增试剂20μL（包含dNTP、DNA聚合酶、镁离子等）混合均匀；上下游引物各1μL ；cDNA模板2μL，ddH2O 17μL；进一步优选的PCR程序为：94°C5min；35个循环：94°C 30s, 57°C 30s, 72°C 4min; 72°C 10 min；4°C保存。
第五方面，本发明提供了本发明的试剂盒的应用方法，其包括以下步骤：
步骤1：活检样本收集，裂解细胞，制备cDNA模板,
步骤2：PCR扩增对所述cDNA模板进行富集，以及纯化经扩增的cDNA模板，
步骤3：使用所述cDNA模板，和第一方面或第二方面所述试剂盒的引物对进行扩增，
步骤4：对得到的序列进行测序并与参考序列比对。
进一步地，该应用方法的所述步骤4中将测序结果与参考基因组进行比对，如果一致，则不携带致病变异；如该位点为杂合，观察到致病变异等位基因，则携带致病变异。
本发明的优点至少包括以下：
1. 在成人基因组水平EXT1和/或EXT2的基因检测尚存在一定的困难，在胚胎单细胞水平基因组只有2个拷贝，经过全基因组扩增后，检测难度更大，存在检测失败和脱扣的风险；申请人通过分析发现EXT1和EXT2基因在胚胎发育早期囊胚外滋养层细胞中存在较高表达，并且细胞转录产生的mRNA拷贝数明显高于基因组的2个拷贝，在转录组进行逆转录、扩增过程中，降低了脱扣的可能，提高在着床前胚胎细胞中EXT1和EXT2基因检测的精准性。
2. 提供了一种对着床前的胚胎进行EXT1和/或EXT2基因序列检测的试剂盒，不依赖于家系连锁分析来进行双重诊断，可以直接针对胚胎的变异位点进行检测，扩增难度下降，检测成功率高，也为连锁分析困难的胚胎检测家系提供了新方法。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1. 实施例1家系胚胎1测序峰图；
图2. 实施例1家系胚胎2测序峰图；
图3. 实施例2家系胚胎1测序峰图；
图4. 实施例2家系胚胎2测序峰图；
图5. 实施例2家系胚胎3测序峰图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
用于着床前胚胎EXT1基因检测的试剂盒，其包括以下4个引物对：
1)引物对1
第一上游引物：CGGACTGGAGCTGAAAGTG（SEQ ID No：1）
第一下游引物：CAATCTGGCTCTGCTGATGA（SEQ ID No：2）
2)引物对2
第二上游引物：GACTGGAGCTGAAAGTGTTGA（SEQ ID No：3）
第二下游引物：GGCCAAGTGCCGGAATATAA（SEQ ID No：4）
3)引物对3
第三上游引物：GACCAGTTGTCACCTCAGTATG（SEQ ID No：5）
第三下游引物：CCACGAGAAGCTTCAACACT（SEQ ID No：6）
4)第四引物对：
第四上游引物：CTAGCACTTAGACAGCAGACAC（SEQ ID No：7）
第四下游引物：ATCTGCACTGGGAAGAGAGA（SEQ ID No：8）。
实施例2
用于着床前胚胎EXT2基因检测的试剂盒，其包括以下4个引物对：
1）引物对5
第五上游引物：CTTCCTGCTGCCACCTTC（SEQ ID No：9）
第五下游引物：CAACCTTCCACCCTTAACCTAC（SEQ ID No：10）
2）引物对6
第六上游引物：CAGCCACAGGGATCTGATT（SEQ ID No：11）
第六下游引物：CTTTCTCTGGAAGATCCACCTC（SEQ ID No：12）
3）引物对7
第七上游引物：ACTTACCGGCAAGGCTAC（SEQ ID No：13）
第七下游引物：CTCGTCAGAGGTCAGCATAAT（SEQ ID No：14）
4）引物对8
第八上游引物：GTGCCCAGTCTATCCAAACTAC（SEQ ID No：15）
第八下游引物：TGACATCAGAGTGCTGGGA（SEQ ID No：16）。
试剂盒的应用方法
试剂一（细胞样本裂解液）：Triton X-100、RNA酶抑制剂、无核酸酶水、dNTP
试剂二（逆转录混合液）：SuperScript II逆转录酶、Superscript II 一链合成buffer (5×)、末端固定序列（100μM）、polyT引物、RNA酶抑制剂、DTT（0.1M）、甜菜碱Betaine（5M）、dNTP、MgCl2（1M）、无核酸酶水；
试剂三（cDNA扩增混合液）：固定序列上游引物、固定序列下游引物、Taq DNA聚合酶、无核酸酶水
试剂四（目的片段扩增混合液）：dNTP、无核酸酶水、高保真DNA聚合酶、Mg2+等
实施例1或2的试剂盒的应用方法包括以下步骤：
S1：裂解活检后细胞、转录组mRNA逆转录；
S2：PCR扩增步骤S1所得cDNA模板、纯化扩增后的cDNA模板；
S3：使用实施例1或2的试剂盒的引物对和步骤S2所得纯化后的cDNA模板进行目的片段靶向扩增；
S4：对所得目的序列测序并与参考序列进行比对。
进一步地，
步骤S1具体包括如下步骤：
S1-1：获取胚胎细胞样本及储存：受精卵通过卵胞浆内单精子注射获得，活检囊胚外滋养层细胞，获得5-8个细胞的样本。将获得的细胞样本收集于试剂一，可短期存放于-80℃冰箱；
S1-2：裂解细胞：充分震荡40-60秒，72℃孵育3分钟，充分裂解细胞样本；
S1-3：逆转录：在裂解后的样本中加入试剂二，将转录组mRNA逆转录为cDNA。反转录程序为：25℃ 5分钟，42℃ 60分钟，50℃ 30分钟，70℃ 10分钟，4℃保存；
步骤S2具体包括如下步骤：
S2-1：扩增cDNA：向S1-3获得的cDNA产物中加入试剂三，进行PCR扩增。具体的反应程序为：95℃预变性3分钟，98℃变性20秒，67℃退火30秒，72℃延伸5分钟，16循环，72℃最终延伸5分钟，4℃保持；
S2-2：纯化cDNA产物：使用0.8x Agencourt AMPure XP Beads磁珠纯化扩增后cDNA产物，获得纯度较高的样本。
S3：以S2中获得的纯化后cDNA产物为模板，并使用所述引物对靶向扩增目标区域。PCR扩增体系为：试剂四18 μL，cDNA模板1-2 μL，每组引物对上、下游引物（10 μL mol/L）各0.5 μL。PCR扩增的反应程序为：98℃预变性2分钟，98℃变性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸45秒，35个循环，72℃最终延伸5分钟，4℃保持。
S4：对S3中获得的PCR目的产物测序并比对参考序列。
实施例3
男方有HME家族史，患儿、男方及男方父亲（已故）均为多发性骨软骨瘤患者。经基因检测患儿及男方携带EXT1基因c.1029delG（位于外显子2）杂合突变；女方正常。男女双方通过单基因病胚胎植入前遗传学检测技术进行HME疾病阻断。
1．样本获取：经卵胞浆内单精子显微注射后获得受精卵，最终有2枚受精卵发育至囊胚（胚胎1、2），对其进行囊胚外滋养层细胞活检，胚胎1收集3个细胞；胚胎2收集3个细胞；将2个胚胎收集到的细胞样本分别置于裂解液中，-80℃保存。
2．胚胎细胞样本的裂解、mRNA逆转录
2.1 将胚胎1、胚胎2细胞样本充分震荡40-60秒，然后72℃孵育3分钟，使细胞充分裂解。
2.2 逆转录：向充分裂解后的2个胚胎样本中加入试剂二，将转录组mRNA逆转录为cDNA，反转录程序为：25℃ 5分钟，42℃ 60分钟，50℃ 30分钟，70℃ 10分钟，4℃ 保存。
3. cDNA扩增以及纯化
3.1 cDNA的扩增：在步骤2.2获得2个胚胎样本的cDNA中分别加入试剂三配成扩增体系。具体PCR程序如下：95℃预变性3分钟，98℃变性20秒，67℃退火30秒，72℃延伸5分钟，16循环，72℃最终延伸5分钟，4℃保持。
3.2 cDNA扩增产物纯化：使用0.8× XP磁珠纯化2个胚胎样本cDNA扩增产物，最终溶解于30μL无核酸酶水中。
4. 靶向目标区域PCR扩增
使用设计好的EXT1基因引物对1和引物对3的上游、下游引物对2个胚胎目标区域进行PCR靶向扩增。PCR体系包括试剂四、所述EXT1基因引物对1及引物对3上游引物和下游引物、1-2微升模板，扩增程序为：98℃预变性2分钟，98℃变性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸45秒，35个循环，72℃最终延伸5分钟，4℃保持。
5. 目的产物测序与参考序列比对
数据分析采用chromas软件对2个胚胎的Sanger测序结果进行判读，如与参考基因组一致，则该胚胎不携带致病变异；若该位点为杂合，观察到致病突变等位基因，则携带致病变异，分析方法采用该软件默认设置。该家系两个胚胎的检测结果分别见图1-2。如图1所示，EXT1基因c.1029位置后呈现双峰，观察到致病突变等位基因，即该家系胚胎1携带EXT1基因c.1029delG杂合突变。如图2所示，测序基因组与参考基因组一致，说明该家系胚胎2不携带致病变异。
实施例4
男方存在HME家族史。男方和男方父亲均诊断为多发性骨软骨瘤病。男女双方均进行了基因检测，提示男方及其父亲均携带EXT2基因c.896delG（位于外显子5）杂合变异；女方正常。男女双方通过单基因胚胎着床前遗传学检测技术进行HME疾病阻断。
1．样本获取：
经单精子显微注射后获得受精卵，共有3枚受精卵发育至囊胚期（胚胎1、2、3）进行活检。活检囊胚外滋养层细胞，胚胎1收集3个细胞；胚胎2收集3个细胞；胚胎3收集5个细胞。将这3个胚胎收集到的所有细胞样本分别置于试剂一裂解液中，-80℃保存。
2．胚胎细胞样本的裂解、mRNA逆转录
2.1 裂解胚胎细胞样本：将胚胎1、胚胎2、胚胎3细胞样本充分震荡40-60秒，72℃孵育3分钟，使细胞裂解充分。
2.2 逆转录：在充分裂解后的3个胚胎样本中分别加入试剂二，将转录组mRNA逆转录为cDNA，具体反转录程序为：25℃ 5分钟，42℃ 60分钟，50℃ 30分钟，70℃ 10分钟，4℃保存。
3. cDNA扩增以及纯化
3.1 扩增cDNA：在步骤2.2中获得的3个胚胎样本cDNA中分别加入试剂三进行cDNA的扩增，具体扩增程序如下：95℃预变性3分钟，98℃变性20秒，67℃退火30秒，72℃延伸5分钟，16循环，72℃最终延伸5分钟，4℃保持。
3.2 纯化cDNA扩增产物：使用0.8x XP磁珠纯化3.1所获得的3个胚胎样本cDNA扩增后产物，最终溶解于30μL无核酸酶水中。
4．目标区域PCR扩增
使用设计好的EXT1基因引物对1和引物对3的上游、下游引物对3个胚胎目标区域进行PCR靶向扩增。PCR体系包括试剂四、所述EXT2基因引物对1及引物对3上游引物和下游引物、1-2微升模板，扩增程序为：98℃预变性2分钟，98℃变性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸45秒，35个循环，72℃最终延伸5分钟，4℃保持。
5. 目的产物测序及参考序列比对
数据分析采用chromas软件对3个胚胎的Sanger测序结果进行判读，如与参考基因组一致，则该胚胎不携带致病变异；若该位点为杂合，观察到致病突变等位基因，则携带致病变异，分析方法采用该软件默认设置。该家系三个胚胎的检测结果分别见图3-5。如图4所示，EXT2基因c.896位置后呈现双峰，观察到致病突变等位基因，即该家系胚胎2携带EXT2基因c.896delG杂合突变。如图3、5所示，测序基因组与参考基因组一致，说明该家系胚胎1和3不携带致病变异。

Claims (9)

1.一种用于着床前胚胎EXT1基因检测的试剂盒，其特征在于，包括以下4个引物对中的一个或更多个，所述4个引物对具体如下：
1)引物对1
第一上游引物：CGGACTGGAGCTGAAAGTG（SEQ ID No：1）
第一下游引物：CAATCTGGCTCTGCTGATGA（SEQ ID No：2）
2)引物对2
第二上游引物：GACTGGAGCTGAAAGTGTTGA（SEQ ID No：3）
第二下游引物：GGCCAAGTGCCGGAATATAA（SEQ ID No：4）
3)引物对3
第三上游引物：GACCAGTTGTCACCTCAGTATG（SEQ ID No：5）
第三下游引物：CCACGAGAAGCTTCAACACT（SEQ ID No：6）
4)第四引物对：
第四上游引物：CTAGCACTTAGACAGCAGACAC（SEQ ID No：7）
第四下游引物：ATCTGCACTGGGAAGAGAGA（SEQ ID No：8）。
2.一种用于着床前胚胎EXT2基因检测的试剂盒，其特征在于，包括以下4个引物对中的一个或更多个，所述4个引物对具体如下：
1）引物对5
第五上游引物：CTTCCTGCTGCCACCTTC（SEQ ID No：9）
第五下游引物：CAACCTTCCACCCTTAACCTAC（SEQ ID No：10）
2）引物对6
第六上游引物：CAGCCACAGGGATCTGATT（SEQ ID No：11）
第六下游引物：CTTTCTCTGGAAGATCCACCTC（SEQ ID No：12）
3）引物对7
第七上游引物：ACTTACCGGCAAGGCTAC（SEQ ID No：13）
第七下游引物：CTCGTCAGAGGTCAGCATAAT（SEQ ID No：14）
4）引物对8
第八上游引物：GTGCCCAGTCTATCCAAACTAC（SEQ ID No：15）
第八下游引物：TGACATCAGAGTGCTGGGA（SEQ ID No：16）。
3.一种用于着床前胚胎EXT1和/或EXT2基因检测的试剂盒套装，其特征在于，包含权利要求1所述的试剂盒和权利要求2所述的试剂盒。
4.一种用于着床前胚胎EXT1和/或EXT2基因检测的系统，其特征在于，
包括：
样本预处理装置，所述样本预处理装置用于从外滋养层细胞获得核酸样本；
核酸序列扩增装置，所述核酸序列扩增装置与所述样本预处理装置相连，用于使用权利要求1和/或2所述的试剂盒对目标基因的至少一部分进行扩增；
测序装置，所述测序装置与所述核酸序列扩增装置相连，以便对所述扩增得到的产物进行测序分析。
5.根据权利要求4所述的系统，其特征在于，所述样本预处理装置包括：
细胞裂解单元，所述细胞裂解单元中使得所述外滋养层细胞得到充分裂解，暴露出其中的mRNA；
反转录单元，所述反转录单元通过将反转录试剂加入所述细胞裂解单元得到，用于对所述mRNA进行反转录反应，继而获得cDNA；
核酸扩增单元，所述核酸扩增单元中使用随机引物对所述cDNA进行扩增，得到所述核酸样本。
6.根据权利要求4所述的系统，其特征在于，所述外滋养层细胞是囊胚期的外滋养层细胞。
7.根据权利要求5所述的系统，其特征在于，所述细胞裂解单元中裂解细胞是这样进行的：
将所述外滋养层细胞置于裂解液中，充分震荡30-60秒，然后72℃孵育，使细胞充分裂解，所述裂解液包含RNA酶抑制剂、dNTP、Triton X-100、无核酸酶水。
8.根据权利要求5所述的系统，其特征在于，所述样本预处理装置还包括纯化单元，得到所述核酸样本之前，在所述纯化单元中使用磁珠对所述核酸扩增单元得到的产物进行纯化。
9.权利要求1或2所述的试剂盒的非疾病诊断目的的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：活检样本收集，裂解细胞，制备cDNA模板,
步骤2：PCR扩增对所述cDNA模板进行富集，以及纯化经扩增的cDNA模板，
步骤3：使用所述cDNA模板和权利要求1或2所述试剂盒的引物对进行扩增，
步骤4：对得到的序列进行测序并与参考序列比对，如果一致，则不携带致病变异；如该位点为杂合，观察到致病变异等位基因，则携带致病变异。
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