CN104195149A

CN104195149A - 一种ext1基因突变序列

Info

Publication number: CN104195149A
Application number: CN201410364178.4A
Authority: CN
Inventors: 吴松; 王大平; 杨雷; 刘红杰; 蔡志明
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-07-28
Filing date: 2014-07-28
Publication date: 2014-12-10
Anticipated expiration: 2034-07-28
Also published as: CN104195149B

Abstract

本发明一种EXT1基因突变序列，属于基因工程技术领域。所述EXT1基因突变序列与EXT1正常基因序列相比具有c.1325delC突变。本发明具有提供了HME致病的新突变，可能用于早期诊断HME，并且可以应用于早期产前基因筛查的优点。

Description

一种EXT1基因突变序列

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种EXT1基因突变序列。

背景技术

骨软骨瘤是最常见的软骨结构的良性肿瘤之一，它包括遗传性多发性外生骨疣和遗传性单一性外生骨疣。骨软骨瘤(HME)是一种常染色体显性遗传病伴随有五万分之一得发生率，使之成为流行的遗传性肌肉骨骼疾病之一。约20％的报道说明多发性外生骨疣是没有家族史的。HME具有三个特点，第一，HME病人表现出多发的良性外生骨疣，；第二，具有明显的遗传性；最后，是严重的并发症，具有0.5％到2％的概率转化为恶性肿瘤。

已有的研究证明EXT基因家族与大多数HME有很大的关系。在该基因家族，拥有Exostosin-1(EXT1)，Exostosin-2(EXT2)，Exostosin-3(EXT3)和Exostosin-like1(EXTL1)，Exostosin-like2(EXTL2)，Exostosin-like3(EXTL3)基因。EXT1含有11个外显子编码区域，它位于8号染色体长臂24.1位置。EXT1基因的突变被认为导致了大部分的HME。EXT基因家族被报道是编码一种蛋白，该蛋白与硫酸乙酰肝素合成相关。先前的研究表明硫酸乙酰肝素是一种必需分子，并且硫酸乙酰肝素的功能紊乱会导致HME。由EXT1基因突变导致的HME相比于EXT2基因引发的HME更易癌变。尽管已经有许多关于EXT基因家族的研究，但是一小部分病人并不含有EXT基因的突变。所以HME的发病机理和遗传基础尚未彻底弄清。

随着DNA测序技术的快速发展，疾病基因图谱的外显子比对得到证实，由于它包含有所有外显子区域，新的基因变异能够被证实。

发明内容

在该研究中，发明人对来自HME家庭的三个病人和三个健康人进行了全外显子测序。对外显子数据分析得到突变进行了过滤后，锁定了EXT1中的一个突变，并对这个突变在所有家庭成员中进行了sanger验证。另外，免疫组化实验用于更深入探究，去鉴定相关基因突变的重要性。

本发明的目的在于公开了一种EXT1基因突变序列。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种EXT1基因突变序列，其中，所述EXT1基因突变序列与EXT1正常基因序列相比具有c.1325delC突变。

本发明的EXT1基因是负链翻译，其对应的NCBI上的正链序列的登录号为NM_000127.2GI:46370065，序列如SEQ ID No.1所示，EXT1基因突变序列对应的正链序列如SEQ ID No.2所示，其中突变位点为在SEQ ID No.1序列的第2098位删除了g。

EXT1基因是EXT基因家族的一员，位于8号染色体长臂24.1位置，包含有11个外显子区域。EXT1基因编码的蛋白具有葡萄糖醛酸糖基转移酶和N乙酰氨基葡萄糖糖基转移酶(它能催化合成聚合硫酸乙酰肝素链在内质网和高尔基体内)的活性。硫酸乙酰肝素在细胞表面广泛表达并且是细胞外基质糖蛋白的组成部分，调停细胞的黏着，信号传导，受体配体的结合过程。以前的研究表明硫酸乙酰肝素是个必要的分子，硫酸乙酰肝素的功能紊乱可能会导致HME。

本发明发现了新的突变c.1325delC位于5号外显子区域，该移码突变在除了22号病人和健康家庭成员外的所有患者身上都有发现。

这个c.1325delC位于exostosin基因和糖基转移酶区域，该突变导致密码子442位点的移码突变，导致丝氨酸到异亮氨酸的改变。在密码子443位置出现的终止密码子，导致了包括有糖基转移酶区域的丢失的截断的蛋白产物。免疫组化实验证明了突变EXT1的表达量的下降。HME在病人身上截断的EXT1基因产物可能导致不能正确的折叠被快速降解掉。该结果与之前关于HME病人存在减少的EXT1蛋白的研究一致根据所有HME突变数据内关于EXT1基因的突变，所有不同类型的变异几乎平等的分布在11个外显子上。

合起来看，本发明通过对一个HME家族进行全外显子测序发现了位于EXT1基因的一个新的移码突变，c.1325delC。通过桑格测序和免疫组化实验对HME家族的c.1325delC的突变进行了验证。本发明的结果提供了一个关于HME致病的新的突变，可能用于早期诊断HME。并且可以应用于早期产前基因筛查。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了HME致病的新突变，可能用于早期诊断HME。并且可以应用于早期产前基因筛查。

附图说明：

1、图1为用于软骨瘤研究的家族的谱系情况；

2、图2为桑格测序的色谱图痕迹；

3、图3为EXT1基因的编码区域结构；

4、图4为免疫组化结果显示基因突变前后蛋白表达量变化图谱。

具体实施方式：

为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明一种EXT1基因突变序列作进一步的说明。

实施例1：

一、样本来源：

在中国河南省的一个五代人都出现HME的家族内，挑选了3个患者(I9、II3和II19，其中1个发生了恶性转移)和3个健康个体(I10、II2和II26)进行外显子测序。该家族内的16个患者和13个未患HME的人，还有3个非该家族的人(其中包括2个患者和1个未患HME的人)，共32个样本都通过了PCR实验确认，样本信息如表1和图1所示，其中图1为用于软骨瘤研究的家族的谱系情况，“+”标明这些个体经过了检查和测序，病人的箭头指向标明原发病患者，黑框或椭圆表示活着的病人，白框或者椭圆标示健康个体，充满线条的框或者椭圆代表已故的病人，框或者椭圆被线条隔断标示已故的健康个体：

表1 样本信息

该家族外显子测序临床表现

对所有参与者进行静脉血采集，使用标准方法提取了他们的外周血基因组DNA。并且DNA的含量足够外显子测序使用。该研究通过了河南省医疗机构审查委员会的审查，并且所有步骤都遵循赫尔辛基宣言原则的指导。

二、检测过程：

1、外显子捕获和测序：

外显子捕获使用的是安捷伦(Agilent)的All Human Exon V3试剂盒，通过Hiseq2000(Illumina,San Diego,USA)平台对其进行测序。基因组DNA被随即打断，选择其中150-200bp的片段构建文库，在文库双末端连上接头，使用Agencourt AMPure SPRI磁珠对连接接头的文库进行纯化，并且插入片段约为200bp的文库将会得到富集。通过连接介导PCR方法(LM-PCR，参见Optimal conditions to use Pfu exo–DNA polymerase for highly efficient ligation-mediated polymerase chain reaction protocolsNucleic Acids Research,2001,Vol.29,No.16 e83)对提取的DNA进行扩增，纯化，通过SureSelect Biotinylated RNA Library(BAITS)对其进行杂交富集。经过24小时的杂交富集后，杂交上BAITS的文库片段被链霉亲和素的磁珠吸附，同时没有杂交上BAITS的文库片段的片段会被洗掉。使用安捷伦2100(Agilent)生物分析仪对经过杂交捕获后的LM-PCR文库产物进行富集程度的检测。所有操作均遵循规范操作说明。接着对所有杂交捕获后的文库开始Hiseq2000平台的操作。经过读取长度为90bp的高通量测序，测序结果显示每个样本至少有50倍的覆盖深度。

2、Reads比对和突变检测：

在带有接头的reads里面，使用SOAPnuke对reads中未知碱基的百分比率超过了10％和那些低质量的reads(质量值小于或者等于5的低质量的碱基数超过了reads的50％)进行过滤筛选，使用BWA将经过过滤筛选的独立reads比对到人类参考基因(NCBI build36.3,hg19)；参数设置为“-o 1-e 50-m 100000-t 4-i 15-q 10”。比对过程中，删除那些具有多个起始位点的reads；收集剩下的能够比对到靶序列或者接近靶序列reads，进行接下来的分析和突变检出。

对于SNP(单核苷酸多态性)的检出，发明人使用SOAPsnp、GATK和SAMtoolsmpileup三种软件进行分析。至少为20Phred-like质量和4倍的覆盖深度的一致的基因型会被认为是高度可信的基因型。不同于参考序列的基因型会被作为候选的SNP，且SNP的过滤筛选过程为：Phred-like SNP大于等于20，4倍到1000倍的总测序深度。

GATK和mpileup软件用来检出插入缺失，筛选过滤过程如下：Phred-like SNP质量值大于等于20，4倍到1000倍的总测序深度。通过人类基因组(hg19)自定义的参数对测序的reads进行间隙序列排列比对，对BWA-aligned的局部重排的reads进行GATK IndelRealigner处理，使用推荐的软件GATK IndelGentotyperV2对最终的插入缺失进行检出。同时使用mpileup做插入缺失的检出的参数设置为“-m 2-C 50-g–E”.

3、功能注释和遗传变异：

对“Reads比对和突变检测”步骤中通过不同工具检出的变异进行合并，通过内部的途径进行注释，变异被注释并且分类为错义，无义，同义，剪接位点变化，插入/缺失突变。过滤掉其中同义和非转移突变，获得那些有害的突变，然后使用dbSNP database内的Chinese Han SNP对这些有害的突变再次筛选，该SNP数据是HME的人类基因中出现频率为1％的稀有疾病。并且选择那些在所有患者出现而在健康人群没有出现的突变作为该家族变异的候选突变。

4、桑格测序：

使用桑格测序对该HME家族成员通过外显子测序发现的变异进行确认核实，该家族成员包括可以获得DNA样本的16个患者、13个健康人，另外还有3个非该家族的成员 (三个成员中包括两个患者和一位来自其他不相干HME家庭的健康人)，共32个人；通过对三个非该家族的成员其中包括两个患者和一位来自其他不相干HME家庭的健康人进行桑格测序对与HME相关的变异进行进一步的评估验证。测序过程遵循桑格标准操作，人工设计桑格测序引物，引物序列为F：5’-GATGGACCCCATTAGAGTAG-3’和R：5’-AGAGTAGTGACTCTACCCTC-3’，引物序列由上海生工合成。

PCR反应体系30ul，包括：模板50ng；引物F 1ul和引物R 1ul；2×MIX 15ul(takara premix taq ver2.0plus dye)；H₂O补足至30ul；

PCR反应程序：95℃5min；(95℃30s；56℃30s；72℃30s)×40个循环；72℃6min；4℃保存。

使用Chromas2软件进行序列比较和分析。

5、组织化学染色和免疫组织化学：

将来自HME病人的软骨瘤组织用1％的多聚甲醛(PFA,Sigma-Aldrich)固定，冲洗,脱钙，嵌入在石蜡，对石蜡包埋的软骨瘤组织进行切片(5um厚)，然后装到载玻片上。对其进行组织化学研究，使用二甲苯对HME的组织切片进行脱蜡，使用梯度酒精对切片进行水合，分别使用甲苯胺蓝(TB)和苏木精(HE)对其进行着色。

对其进行免疫组化实验，将经过脱蜡的HME的水合的软骨瘤切片，用3％的过氧化氢溶液处理10分钟，使用PBS漂洗，随后用5％的驴血清阻断，用兔多克隆anti-EXT1抗体(1：50的工作稀释，abcam plc,MA,UK)4度过夜孵育。使用第二抗体(ZHONGSHAN golden bridge biotechnology,China)对软骨瘤切片进行37度30分钟的孵育，接着DAB substrate kit(Vector Laboratories,Burlingame,CA)和Meyer hematoxylin着色

三、结果：

本发明使用All Human Exon V3捕获芯片(Agilent50M)对HME家族的三个患者(I9,II3,II19)和三个健康个体(I10,II2,II26)进行外显子捕获(如图1所示)，经过大量平行的测序后，对于每个个体平均获得了120M的数据量和80M的reads。当比对到hg19时，所有个体的比对率能达到99％，几乎，92％的目标区域伴随着10倍的覆盖度都通过了数据比对。在所有捕获区域中，每个个体有接近8万个突变被证实。

注释后，发明人将研究集中在位于外显子、URT和剪接位点的突变，对该家族遗传的显著模式进行汇总，选择了在三个病人身上同时出现且没有出现在那些健康人身上的突变；用公共可使用的HME的数据(dbSNP)对其进行过滤筛选。进一步，聚焦于HME 变异基因的非同义突变，stopgain,、stoplose和移码突变。经过前期的筛选，获得了三个杂合突变。根据已经报道的EXT基因家族很可能于HME有关系，在这三个突变里面，只有一个位于EXT1基因的杂合删除(c.1325delC)很可能是治病的。在HME突变数据库中还没有这一点的突变，这是一个新位点，发明人选择它进行更深入研究。

为排除假阳性突变的可能，发明人对患者(I9、II3、II19)进行桑格测序检查该突变，并且该突变得到证实；杂合删除突变g.chr8:118834796delC(如图3所示，图3为EXT1基因的编码区域结构，刻度板标注了746个氨基酸顺序，灰色部分表明由于EXT1基因的突变导致的EXT1基因蛋白截断部位)在三个病人身上得到证实且在健康个体身上没有发现。该突变导致密码子442的移码突变，导致两个主要的结果是丝氨酸变成异亮氨酸和在443位置生成了终止密码子，导致蛋白的截断伴随着糖基转移酶区域的丢失(见图3所示)。

为更深一步确认在HME家族该删除是疾病产生的基因突变。本发明对该家族所有个体和另外3个(I1,I2,II7)来自其他与之无关的家族个体进行PCR试验和桑格测序，如图2所示，除了所有的健康个体和II22号病人，该突变在所有病人身上都检测到了(图示2)，图2为桑格测序的色谱图痕迹，展示了经过验证的位于EXT1基因的删除突变g.chr8:118834796delC，其中A-C标示健康个体(依次为I10,II2,II26)；D-F标示患者(依次为I9,II3,II19)。红框标示正常基因型，黑色箭头指明突变位点；Sanger测序结果：本发明对病人进行桑格测序检查验证了位于EXT1基因的杂合删除(c.1325delC)并且该突变达到证实。

免疫组织化学研究被用来在两个无关的家族间检测EXT1基因的蛋白表达水平。通过免疫组织化学研究，结果如图4所示，其中图4A为基因突变后的蛋白表达情况，图4B为基因没有突变的蛋白表达情况，我们发现伴随有新突变的HME病人的EXT1基因蛋白含量(图4A所示)低于那些源于与之无关家族且不含有EXT1基因突变的HME病人的EXT1基因蛋白含量(图4B所示)。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims

1.一种EXT1基因突变序列，其特征在于：所述EXT1基因突变序列与EXT1正常基因序列相比具有c.1325delC突变。