CN115807073A - 实现高着床潜能囊胚筛选的标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种着床潜能囊胚筛选的标志物及其应用,属于辅助生殖技术领域,所述标志物包括基因PET100或其表达产物和基因RAB25或其表达产物。本发明基于已构建的高着床潜能模型,在重新选择的独立样本中,通过对高着床潜能胚胎的成功筛选,证明本研究构建的着床潜能预测标志物在临床应用中真实有效。
Description
技术领域
本发明属于辅助生殖技术领域,具体涉及一种实现高着床潜能囊胚筛选的标志物及其应用。
背景技术
辅助生殖技术(Assisted Reproductive Technology,ART)作为治疗不孕症的有效方法,已帮助众多不孕夫妇成功获得后代。促排卵方案、体外受精技术以及胚胎培养系统等关键技术持续优化更新,但是ART总体成功率仍仅为30-40%左右。挑选发育潜能好的胚胎移植将缩短ART周期、提高临床妊娠率。
在辅助生殖的临床过程中,还没有单一的标准可以确保筛选到具着床潜能的胚胎。胚胎形态学检查和胚胎植入前遗传学检测(Preimplantation Genetic Testing,PGT)是目前评估胚胎着床及发育潜能的常用手段。胚胎着床前非整倍体检测(PreimplantationGenetic Testing for Aneuploidy,PGT-A)主要通过基因组测序或基因组杂交芯片检测胚胎染色体数目,通过PGT-A挑选染色体数目正常的整倍体胚胎;胚胎着床前染色体结构变异检测(Preimplantation Genetic Testing for Chromosomal StructuralRearrangements,PGT-SR)能够区分染色体数目和结构是否正常;同时可通过胚胎着床前单基因病检测(Preimplantation Genetic Testing for Monogenic Diseases,PGT-M)帮助选择优质胚胎,避免遗传病患儿出生。经过形态学和PGT筛选的胚胎,移植后着床失败率仍然高达30%-50%。因此,高着床潜能胚胎的筛选仍旧是临床面临的重要问题。
中国专利申请CN105861658A(对应文章Li G,Yu Y,Fan Y,et al.Genome wideabnormal DNA methylome of human blastocyst in assisted reproductivetechnology[J].Journal of Genetics and Genomics,2017,44(10):475-481.)公开了一种通过囊胚甲基化水平和加纳德形态囊胚分级筛选发育优良囊胚的方法。基于加德纳形态囊胚分级系统对不同等级囊胚进行甲基化测序,建立高形态等级(AA)、中形态等级(AB、BA或BB)和低形态等级(CC、BC或CB)囊胚DNA甲基化模型;对应滋养层的甲基化状态与囊胚的形态分级相关。该方法利用少量囊胚活检滋养层细胞的甲基化数据来预测整个囊胚甲基化水平、检测囊胚的非整倍性,通过滋养层的甲基化水平与形态学评级为AA的优良囊胚甲基化水平的接近程度预测胚胎发育潜能。该专利申请根据加德纳形态囊胚分级系统,将AA级胚胎的甲基化水平作为标准参考,但是部分AB、BA、BB级胚胎仍具发育潜能,临床上部分夫妇往往得不到AA级胚胎,此方法浪费和丢弃了部分仍具发育潜能的胚胎。
中国专利申请CN114480629A公开了一种同时实现囊胚非整倍体检测和高着床潜能筛选的方法。该方法通过囊胚活检得到的滋养层细胞的甲基化数据检测全基因组的拷贝数变异、预测囊胚移植后着床潜能。该方法纳入了12例临床中真实的囊胚移植后妊娠结局,使预测模型更准确。该专利申请通过甲基化水平实现囊胚非整倍体检测和高着床潜能胚胎筛选,但是临床上染色体倍性正常的胚胎仍然会出现发育异常或移植后妊娠失败的情况。针对由于转录异常而非基因结构异常导致的发育失败的情况,该筛选方法不适用。
Groff A F,Resetkova N,DiDomenico F,et al.RNA-seq as a tool forevaluating human embryo competence[J].Genome research,2019,29(10):1705-1718.)构建了一种可以同时评估胚胎染色体核型和发育潜能的方法。该文章将囊胚转录组信息与染色体核型、胚胎形态关联,以整倍体胚胎和形态优良胚胎为高发育潜能胚胎,构建预测模型。通过囊胚滋养层细胞的转录组数据推导胚胎染色体核型和发育潜能。然而,临床上只能获得4-8个滋养层细胞,由于不同滋养层细胞间转录水平变异大,通过滋养层转录组数据推导胚胎染色体核型,准确率较低。该方法缺乏临床中胚胎移植、移植后着床和妊娠等信息,预测结局准确性未知。
随着单细胞组学技术的发展,转录组测序能产生高通量数据,可以在当前筛选标准的基础上,额外补充有价值的筛选信息,促成优化和开发全新植入前优质胚胎筛查方法。但是在临床中,通过转录组筛选优质胚胎的体系尚不完善,同时目前研究缺乏胚胎移植及后续妊娠结局等相关信息,使用已有方法无法评估发育潜能预测的准确率。
人早期胚胎发育受多层次精准调控,转录组是连接基因组遗传信息与具有生物功能蛋白质的关键,并且基因表达具有时空特异性。部分囊胚是由于转录异常而非基因结构异常导致的发育和着床失败,因此,转录组在指示囊胚着床中具有主要作用。然而,目前缺乏一种通过单细胞转录组实现高着床潜能囊胚筛选的方法。
发明内容
基于上述原因,本发明提出一种着床潜能囊胚筛选的标志物及其应用。为了实现本发明的目的,拟采用如下技术方案:
本发明一方面涉及一种着床潜能囊胚筛选的标志物,所述标志物包括基因PET100或其表达产物和基因RAB25或其表达产物。
PET100(PET100 cytochrome c oxidase chaperone)是指细胞色素氧化酶装配因子PET100,细胞色素c氧化酶(COX)即线粒体复合体IV,是线粒体呼吸链的末端酶复合物,催化从细胞色素c到分子氧的电子转移,从而有助于跨线粒体内膜的质子梯度,驱动ATP合成。PET100定位于线粒体内膜,是一种COX装配因子,参与COX成熟和组装。细胞色素c氧化酶缺乏是儿童和成人线粒体疾病的重要原因,PET100突变导致婴儿乳酸酸中毒和细胞色素c氧化酶缺乏症。
RAB25是小GTP酶RAS超家族的成员,Rab25控制细胞表面受体循环和细胞信号通路激活,使其能够控制多种细胞功能,包括细胞增殖、细胞运动和细胞死亡。已发现该基因是肿瘤抑制基因和致癌基因,Rab25的异常表达与癌症发展有关,在癌症的病理生理学中起关键作用。大多数研究结果表明,Rab25是一种致癌基因。Rab25的表达升高与肾癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌和其他癌症的不良预后和侵袭性相关。然而,Rab25的肿瘤抑制功能在几种癌症中也有报道,例如结直肠癌。
本发明另一方面涉及一种着床潜能囊胚筛选的试剂盒,所述试剂盒包括用于测定基因PET100和基因RAB25表达量的试剂。
在本发明的一个优选实施方式中,所述用于测定基因PET100和基因RAB25表达量的试剂包括过单细胞转录组测序得到PET100和RAB25的表达量的试剂、用于QPCR的试剂、蛋白质组学试剂或western blot试剂。
本发明另一方面涉及上述标志物或试剂盒在制备着床潜能囊胚筛选试剂盒中的应用。
在本发明的一个优选实施方式中,所述用于囊胚筛选的囊胚为CNV未见异常的囊胚。本发明在选择了囊胚CNV未见异常的前提下,根据临床囊胚移植后妊娠结局,进行滋养层细胞分组和着床潜能囊胚的预测;重新选择独立样本,根据预测模型进行着床预测,将囊胚进一步移植观察,进行临床应用探究。
在本发明的一个优选实施方式中,所述用于囊胚筛选的囊胚为AA级囊胚、AB级囊胚、BA级囊胚、BB级囊胚中的一种、两种或者多种的组合。本发明的标志物除了AA级囊胚外,还可以包括具有着床潜能的AB、BA、BB胚胎,提高了囊胚的利用率。
有益效果
本发明基于已构建的高着床潜能模型,在重新选择的独立样本中,通过对高着床潜能胚胎的成功筛选,证明本研究构建的着床潜能预测标志物,在临床应用中真实有效。
具体实施方式
为了进一步理解本发明,下面将结合本发明实施例,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明,本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品,均可以通过商业渠道购买获得。
实施例1:
一、胚胎着床潜能模型建立
1.收集囊胚滋养层细胞:
临床中行辅助生殖技术助孕的夫妇,卵母细胞通过单精子注射方式获得受精卵,培养5-6天发育至囊胚期的胚胎进行囊胚滋养层活检;活检5-8个细胞,使用混合酶(accutase:胰酶=1:1)在37℃反应40-60min;分离单细胞后,分别挑选两份活检单细胞样本,一份用于临床常规基于DNA的胚胎着床前非整倍体检测(PGT-A)或临床单基因疾病诊断(PGT-M),另一份用于构建转录组文库。
挑选8对夫妇的8个囊胚(E1-E8),使用囊胚活检时的1个滋养层细胞作为检测样本。具体信息如下:
表1:活检滋养层细胞及囊胚移植后信息
2.细胞裂解:
口吸管吸取单个滋养层于裂解液中(0.1μl RNA酶抑制剂(40U ul-1),0.19μl10%聚乙二醇辛基苯基醚,3.21μl无RNA酶水,0.3μl 3’P2-barcode引物(10uM),1μl脱氧核糖核苷三磷酸(10mM),0.1μlERCC(1x 105)),充分涡旋1分钟,72℃孵育3分钟。
3.反转
加入0.5μl SuperScriptTMII逆转录酶(200U ul-1),0.25μl RNA酶抑制剂(40Uul-1),2μl SuperScriptTMII第一链合成缓冲液(5x),0.5μl 0.1M二硫苏糖醇,2μl甜菜碱(5M),0.06μl氯化镁(1M),0.1μl模板转换寡核苷酸(100uM),0.29μl无RNA酶水。
程序:
25℃ 5分钟;42℃ 60分钟;50℃ 30分钟;70℃ 10分钟,4℃∞.
4.预扩增
加入12.5μl KAPA HiFi高保真热启动DNA聚合酶预混液(2x),1.5μl 3’P2引物(10uM),0.5μl IS PCR引物(10uM),0.5μl无RNA酶水。
程序:
(1)95℃ 3分钟;
(2)98℃ 20秒,65℃ 30秒,72℃ 5分钟,共四个循环;
(3)98℃ 20秒,67℃ 15秒,72℃ 5分钟,共10-16个循环;
(4)72℃ 5分钟,4℃∞。
5.纯化
用0.8x XP磁柱纯化两次,21μl H2O洗脱。
6.Biotin primer扩增
加入25μl KAPA HiFi高保真热启动DNA聚合酶预混液(2x),2μl IS PCR引物(10uM),2μl Biotin primer(10uM)。
程序:
(1)95℃ 3分钟;
(2)98℃ 20秒,67℃ 15秒,72℃ 5分钟,共5个循环;
(3)72℃ 5分钟,4℃∞。
用0.8x XP磁柱纯化,30μl洗脱液洗脱。
7.文库构建
取30ng DNA,Covaris超声打断,使用Vistech DNA concentrator纯化,50μl H2O洗脱。用1x XP beads纯化,50μl H2O洗脱。使用UltraTMDNA Library Prep Kit试剂盒构建文库。
8.产物纯化
(1)向DNA文库产物中,加入0.9×Ampure XP beads;
(2)室温孵育10min;
(3)80%乙醇洗两次;
(4)使用32μL EB洗脱。
9.使用测序仪对构建的转录组文库进行测序,得到囊胚滋养层细胞单细胞转录组数据。
10.数据分析及植入潜能预测
(1)使用过滤软件trim_galore去除测序原始数据中的低质量、接头污染以及未知碱基N含量过高的reads,得到clean reads。
(2)使用STAR将clean reads比对到参考基因组序列,计算比对率。
(3)使用RSEM计算基因和转录本表达水平。
(4)根据基因表达水平,检测着床成功组和着床失败组且为整倍体囊胚之间的差异表达基因(DEG)
(5)通过着床成功和着床失败囊胚的差异表达基因和基因表达的平均FPKM值,筛选候选预测因子。
(6)将待测胚胎滋养层细胞放入裂解液后,进行以上2-8步,使用得到的cDNA进行QPCR;根据待鉴定胚胎中候选因子表达量的分布,进行胚胎移植后的发育和着床预测。
11.实验结果及植入预测模型构建
根据各个样本的基因表达情况,在着床成功和着床失败囊胚的差异表达基因中,选取了2个候选预测因子PET100和RAB25。相较于着床失败的胚胎,着床成功的胚胎滋养层中PET100表达水平均升高,RAB25表达水平均降低(具体见表2)。
表2:滋养层细胞单细胞转录组测序结果中基因表达情况
综上,在同批次检测样本中,通过同时比较PET100和RAB25的表达水平预测着床能力并构建预测模型:PET100表达水平高同时RAB25表达水平低的囊胚具有更高着床潜能。
二、临床应用及着床潜能预测
1.收集囊胚滋养层细胞:
临床中行辅助生殖技术助孕的夫妇,卵母细胞通过单精子注射方式获得受精卵,培养5-6天发育至囊胚期的胚胎进行囊胚滋养层活检;活检5-8个细胞,使用混合酶(accutase:胰酶=1:1)在37℃反应40-60min;分离单细胞后,分别挑选两份活检单细胞样本,一份用于临床常规基于DNA的胚胎着床前非整倍体检测(PGT-A)或临床单基因疾病诊断(PGT-M),另一份用于构建转录组文库。
挑选5对夫妇的5个囊胚(E9-E13),分别选取囊胚活检时的1个滋养层细胞作为检测样本。具体信息如下:
表3:活检滋养层细胞信息
2.细胞裂解:
口吸管吸取单个滋养层于裂解液中(0.1μl RNA酶抑制剂(40U ul-1),0.19μl10%聚乙二醇辛基苯基醚,3.21μl无RNA酶水,0.3μl 3’P2-barcode引物(10uM),1μl脱氧核糖核苷三磷酸(10mM),0.1μlERCC(1x 105)),充分涡旋1分钟,72℃孵育3分钟。
3.反转
加入0.5μl SuperScriptTMII逆转录酶(200U ul-1),0.25μl RNA酶抑制剂(40Uul-1),2μl SuperScriptTMII第一链合成缓冲液(5x),0.5μl 0.1M二硫苏糖醇,2μl甜菜碱(5M),0.06μl氯化镁(1M),0.1μl模板转换寡核苷酸(100uM),0.29μl无RNA酶水。
程序:
25℃ 5分钟;42℃ 60分钟;50℃ 30分钟;70℃ 10分钟,4℃∞.
4.预扩增
加入12.5μl KAPA HiFi高保真热启动DNA聚合酶预混液(2x),1.5μl 3’P2引物(10uM),0.5μl IS PCR引物(10uM),0.5μl无RNA酶水。
程序:
(1)95℃ 3min;
(2)98℃ 20s,65℃ 30s,72℃ 5min,共四个循环;
(3)98℃ 20s,67℃ 15s,72℃ 5min,共10-16个循环;
(4)72℃ 5min,4℃ hold。
5.纯化
用0.8x XP beads纯化两次,21μl H2O洗脱。
6.荧光定量PCR检测PET100和RAB25的表达水平
设计PET100和RAB25引物;反应体系为20μL,反应体系如下:
PCR反应程序如下:
其中内参基因ACTB、PET100和RAB25引物序列如表4:
表4:引物序列
7.实验结果及囊胚着床预测
QPCR结果如表5:
表5:QPCR检测滋养层细胞中ACTB、PET100和RAB25的CT值
根据样本的CT值,计算各样本的2-△△Ct,得到不同胚胎的相对表达量。根据构建的预测模型,在同批次检测样本中,通过同时比较PET100和RAB25的表达水平预测着床能力并构建预测模型:PET100表达水平高同时RAB25表达水平低的囊胚具有更高着床潜能。E9的PET100表达水平是其他滋养层的25倍以上,E9的RAB25表达水平低于其他滋养层的1/6,因此预测囊胚E9具有较高的着床潜能,囊胚E10-E13着床潜能较差。(如表6)
表6:不同滋养层细胞中PET100和RAB25的相对表达量及胚胎着床潜能预测
8.移植后妊娠结局
来自5对夫妇的5个囊胚(E9-E13)分别进行了移植(本项目预测E9植入潜能高)。结果表明:只有囊胚E9在移植14天后,移植后40天超声检查宫内可见妊娠囊,可探及胎心搏动,确定临床宫内妊娠;E10-E13移植后均显示着床失败。
基于已构建的高着床潜能模型,在重新选择的独立样本中,通过对该实施例高着床潜能胚胎E9的成功筛选,证明本研究构建的着床潜能预测标志物,在临床应用中真实有效。
以上描述了本发明优选实施方式,然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。
Claims (8)
1.一种着床潜能囊胚筛选的标志物,所述标志物包括基因PET100或其表达产物和基因RAB25或其表达产物。
2.一种着床潜能囊胚筛选的试剂盒,所述试剂盒包括用于测定基因PET100和基因RAB25表达量的试剂。
3.根据权利要求2所述的试剂盒,所述用于测定基因PET100和基因RAB25表达量的试剂包括过单细胞转录组测序得到PET100和RAB25的表达量的试剂、用于QPCR的试剂、蛋白质组学试剂或western blot试剂。
4.权利要求1所述的标志物在制备着床潜能囊胚筛选试剂盒中的应用。
5.权利要求2或3所述的试剂盒在制备着床潜能囊胚筛选试剂盒中的应用。
6.根据权利要求4或5所述的应用,所述用于囊胚筛选的囊胚为CNV未见异常的囊胚。
7.根据权利要求4或5所述的应用,所述用于囊胚筛选的囊胚为AA级囊胚、AB级囊胚、BA级囊胚、BB级囊胚中的一种、两种或者多种的组合。
8.根据权利要求7所述的应用,所述用于囊胚筛选的囊胚为AA级囊胚、AB级囊胚、BA级囊胚和BB级囊胚的组合。
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