CN113073135A - 一种检测耳聋基因的参考品及其制备方法与应用 - Google Patents
一种检测耳聋基因的参考品及其制备方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113073135A CN113073135A CN202110339486.1A CN202110339486A CN113073135A CN 113073135 A CN113073135 A CN 113073135A CN 202110339486 A CN202110339486 A CN 202110339486A CN 113073135 A CN113073135 A CN 113073135A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna
- fragmented
- deafness
- fetal
- sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 206010011878 Deafness Diseases 0.000 title claims abstract description 81
- 208000016354 hearing loss disease Diseases 0.000 title claims abstract description 78
- 231100000895 deafness Toxicity 0.000 title claims abstract description 77
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 67
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 title claims abstract description 26
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 claims abstract description 51
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 claims abstract description 34
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 21
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 32
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 31
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 31
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 claims description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 16
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 16
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 13
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 29
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 29
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 abstract description 25
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract description 8
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 abstract description 5
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 abstract description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 155
- 239000000047 product Substances 0.000 description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 9
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 8
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 6
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 6
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000003793 prenatal diagnosis Methods 0.000 description 4
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 3
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 3
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 201000006790 nonsyndromic deafness Diseases 0.000 description 2
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 206010000234 Abortion spontaneous Diseases 0.000 description 1
- 241000023308 Acca Species 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010016852 Foetal damage Diseases 0.000 description 1
- 102100037156 Gap junction beta-2 protein Human genes 0.000 description 1
- 101000954092 Homo sapiens Gap junction beta-2 protein Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010056254 Intrauterine infection Diseases 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000009097 Phosphorylases Human genes 0.000 description 1
- 108010073135 Phosphorylases Proteins 0.000 description 1
- 108091006507 SLC26A4 Proteins 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000002669 amniocentesis Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 208000021018 autosomal dominant inheritance Diseases 0.000 description 1
- 208000021024 autosomal recessive inheritance Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 210000000860 cochlear nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000888 hearing loss Toxicity 0.000 description 1
- 230000010370 hearing loss Effects 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 208000015994 miscarriage Diseases 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 1
- 230000036438 mutation frequency Effects 0.000 description 1
- 238000001921 nucleic acid quantification Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000035807 sensation Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 208000000995 spontaneous abortion Diseases 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种检测耳聋基因的参考品及其制备方法与应用。所述参考品包括片段化的母体基因组DNA和片段化的胎儿基因组DNA。使用本发明的参考品进行文库构建,并且分别使用用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的上、下游引物组进行两轮特异性扩增,能够准确、高效地检测耳聋基因突变,其结果与羊水穿刺检测分型一致,但安全性、无创性和高效性方面明显优于羊水穿刺检测。
Description
技术领域
本发明属于基因检测技术领域,具体涉及一种检测耳聋基因的参考品及其制备方法与应用。
背景技术
听觉系统中传音、感音及其听觉传导通路中的听神经和各级中枢发生病变,引起听功能障碍,产生不同程度的听力减退,统称为耳聋。耳聋的病因复杂,遗传因素是导致耳聋的主要原因。遗传性耳聋根据其临床表型分为非综合征型耳聋(non-syndromic hearingimpairment,NSHI)与综合征型耳聋(syndromic hearing impairment,SHI)。非综合征型耳聋最常见,占总数的70%。非综合性耳聋的遗传方式表现为:常染色体隐性遗传(约75%-80%)、常染色体显性遗传(约20%)、X-连锁(约2-5%)和线粒体母系遗传(约1%)。在这些遗传方式中,临床上已经明确了GJB2与SLC26A4基因突变是导致耳聋的第一位与第二位致病原因。
传统的耳聋基因产前诊断主要通过羊膜腔穿刺术(简称羊穿)、绒毛穿刺术或脐带血穿刺术等有创操作获取胎儿细胞进行检测,为侵入性产前诊断。侵入性产前诊断虽然准确度高,但可能造成胎儿损伤、流产或宫内感染等风险,降低了产前诊断的依从性。
有相关研究发现母体血液中存在着胎儿的游离DNA,同时,证明了游离DNA诊断遗传性疾病的可行性和实际性。因此,可以通过采集孕妇静脉血,利用高通量DNA测序技术对母体外周血浆中的游离DNA片段进行测序,并将测序结果进行生物信息分析,可以从中得到胎儿的遗传信息,从而检测胎儿耳聋相关基因的信息。
目前无创产前耳聋基因检测技术没有参考品,从而严重制约了相关产品研发和现有产品的质量控制。因此,本发明主要针对无创耳聋基因的检测技术,开发出一种应用于无创耳聋基因检测参考品的方法。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此,本发明提出一种检测耳聋基因的参考品,能够根据胎儿DNA含量和耳聋基因位点的检测频率,获得母体和胎儿的基因型信息。
本发明还提出一种上述参考品的制备方法。
本发明还提出一种用于检测耳聋基因突变型与缺失型的引物组。
本发明还提出一种检测胎儿耳聋基因的方法。
本发明还提出一种上述参考品的应用。
根据本发明的第一方面,提出了一种检测耳聋基因的参考品,所述参考品包括片段化的母体基因组DNA和片段化的胎儿基因组DNA。
在本发明的一些实施方式中,所述片段化的母体基因组DNA包括来源于耳聋基因纯合突变、杂合子和阴性母体组织或外周血白细胞的基因组的片段化核酸;所述片段化的胎儿基因组DNA包括来源于耳聋基因纯合突变、杂合子和阴性胎儿组织或外周血白细胞的基因组的片段化核酸。
在本发明的一些实施方式中,所述片段化的母体基因组DNA包括来源于母体组织或外周血的基因组的片段化核酸;片段化的胎儿基因组DNA包括来源于胎儿组织或外周血的基因组的片段化核酸。
在本发明的一些实施方式中,所述耳聋基因突变位点为SLC26A4 c.1174A>T位点突变。
在本发明的一些实施方式中,所述片段化的母体基因组DNA的耳聋基因位点突变为野生型、纯合突变或杂合突变;所述片段化的胎儿基因组DNA的耳聋基因位点突变为野生型、纯合突变或杂合突变。
在本发明的一些实施方式中,片段化的母体DNA和片段化的胎儿DNA的片段大小为150-200bp。
在本发明的一些实施方式中,片段化的胎儿DNA的含量占参考品总量的5-30%(v/v)。
根据本发明的第二方面,提出了上述参考品的制备方法,所述制备方法如下步骤:
S1、分别提取、纯化母体样本和胎儿样本的基因组DNA;
S2、将步骤S1所得的基因组DNA片段化;
S3、将步骤S2片段化的母体基因组DNA和胎儿基因组DNA按比例配制成参考品,其中,片段化的胎儿基因组DNA的含量占参考品总量的5-30%。
在本发明的一些实施方式,所述步骤S1中,所述母体样本的耳聋基因SLC26A4c.1174A>T位点为野生型或杂合突变;所述胎儿样本的耳聋基因SLC26A4 c.1174A>T位点为野生型、纯合突变或杂合突变。
在本发明的一些实施方式,所述步骤S1中,样本为人体组织或外周血。
在本发明的一些实施方式,所述步骤S1中,样本为外周血。
在本发明的一些实施方式,基因组DNA的样本类型分为样本1-样本6,其中,样本1为耳聋基因SLC26A4 c.1174A>T位点为纯合突变的胎儿组织样本,样本2为耳聋基因SLC26A4 c.1174A>T位点为杂合突变的胎儿组织样本,样本3为耳聋基因SLC26A4c.1174A>T位点为野生型的胎儿组织样本,样本4为耳聋基因SLC26A4 c.1174A>T位点为纯合突变的女性的外周血样本,样本5为耳聋基因SLC26A4 c.1174A>T位点为杂合突变的女性的外周血样本,样本6是耳聋基因SLC26A4 c.1174A>T位点为野生型的女性的外周血样本。
在本发明的一些实施方式,所述步骤S1中,基因组DNA提取采用基因组提取试剂盒Qiagen DNeasy Blood&Tissue Kit。
在本发明的一些实施方式,所述步骤S1中,基因组纯化采用试剂盒Genomic DNAClean&Concentrator-10进行纯化。
在本发明的一些实施方式,所述步骤S2中,基因组DNA片段化采用超声波细胞破碎仪破碎细胞。
在本发明的一些实施方式,所述超声波细胞破碎仪采用的参数为超声波功率70~80W,温度4~12℃,时间5~8min。
在本发明的一些实施方式,所述超声波细胞破碎仪采用的参数为超声波功75W,温度10℃,时间6min。
在本发明的一些实施方式,所述步骤S3中,所述参考品为R1-R7,所述参考品R1由90%样本4片段化的母体DNA(αα)和10%样本1片段化的胎儿DNA(bb)组成;所述参考品R2由90%样本4片段化的母体DNA(αα)和10%样本2片段化的胎儿DNA(Bb)组成;所述参考品R3由90%样本5片段化的母体DNA(Aa)和10%样本1片段化的胎儿DNA(bb)组成;所述参考品R4由90%样本5片段化的母体DNA(Aα)和10%样本2片段化的胎儿DNA(Bb)组成;所述参考品R5由90%样本5片段化的母体DNA(Aα)和10%样本3片段化的胎儿DNA(BB)组成;所述参考品R6由90%样本6片段化的母体DNA(AA)和10%样本2片段化的胎儿DNA(BB)组成;所述参考品R7由90%样本6片段化的母体DNA(AA)和10%样本3片段化的胎儿DNA(BB)组成。
本发明第三方面提供一种用于检测耳聋基因突变型与缺失型的引物组,所述引物组包括如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.44所示的引物。
在本发明的一些实施方式,所述的引物组包括引物分组1、引物分组2,其中,所述引物分组1由SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.22混合配制而成,所述引物分组2为SEQ IDNO.23~SEQ ID NO.44混合配制而成。
在本发明的一些实施方式,所述的引物组中上游特异性引物组1包括用于扩增耳聋基因的上游引物组1以及用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的上游引物组1;所述下游特异性引物组1包括用于扩增耳聋基因的下游引物组1以及用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的下游引物组1;所述上游特异性引物组2包括用于扩增耳聋基因的上游引物组2以及用于计算胎儿游离DNA比例的上游引物组2;所述下游特异性引物组2包括用于扩增耳聋基因的下游引物组2以及计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的下游引物组2。
在本发明的一些实施方式,所述用于扩增耳聋基因的上游引物组1序列如SEQ IDNO.1所示;所述用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的上游引物组1序列如SEQ IDNO.2-11所示;所述用于扩增耳聋基因的下游引物组1序列如SEQ ID NO.12所示;所述用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的下游引物组1序列如SEQ ID NO.13-22所示。所述用于扩增耳聋基因的上游引物组2序列如SEQ ID NO.23所示;所述用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的上游引物组2序列如SEQ ID NO.24-33所示;所述用于扩增耳聋基因的下游引物组2序列如SEQ ID NO.34所示;所述用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的下游引物组2序列如SEQ ID NO.35-44所示。
在本发明的一些实施方式,所述的引物组中的上游引物和下游引物分别位于检测点左侧和右侧,同侧的特异性引物1的3’端和特异性引物2的5’端有10-15个碱基的重合,特异性引物1的5’端有生物素修饰,特异性引物2的5’端含有用于高通量测序文库的接头序列。
本发明第四方面提供一种检测胎儿耳聋基因的方法,包括如下步骤:筛选SNP位点;提取孕妇血浆中游离DNA和上述参考品并构建相应的DNA文库,进行模板制备和富集;对所述游离DNA和上述参考品进行文库测序;构建所述耳聋基因上SNP位点的基因型,结合所述游离DNA和上述参考品文库测序信息,确定胎儿所述SNP位点相应的基因型,所述方法不以疾病的诊断和治疗为目的。
在本发明的一些实施方式,所述参考品建库的起始DNA量可以为5ng~50ng。
在本发明的一些实施方式,所述参考品建库的起始DNA量可以为10ng~20ng。
在本发明的一些实施方式,所述孕妇血浆中游离DNA从2ml血浆中提取得到,游离DNA量为5ng~30ng。
在本发明的一些实施方式,所述DNA文库的构建方法包括:对母体外周血游离DNA连接带有特异标签序列和任选的样本标签序列的接头序列;使用预文库扩增引物序列对上一步的连接产物进行预文库扩增,其中所述预文库扩增引物序列与所述接头序列互补结合;将上一步得到的预文库分为上游预文库和下游预文库,分别使用上游特异性引物组1和下游特异性引物组1对所述上游预文库和下游预文库进行特异性扩增,分别得到上游特异性扩增产物1和下游特异性扩增产物1;对所述上游特异性扩增产物1和下游特异性扩增产物1,分别使用上游特异性引物组2和下游特异性引物组2进行特异性扩增,分别得到上游特异性扩增产物2和下游特异性扩增产物2,将所述上游特异性扩增产物2和下游特异性扩增产物2混合后,使用两端的通用引物进行扩增,得到可上机测序的文库。
本发明第五方面上述参考品的应用,所述应用为上述参考品在制备用于检测耳聋基因试剂中的应用。
在本发明的一些实施方式,所述应用为提供一种检测耳聋基因的试剂盒,所述试剂盒包括上述的参考品和引物组。
在本发明的一些实施方式,所述应用为提供一种检测耳聋基因的试剂盒,所述试剂盒包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.44所示的引物组。
在本发明的一些实施方式,上述试剂盒还包括:
接头序列如SEQ ID NO.45-46所示;
预文库扩增引物序列如SEQ ID NO.47-48所示;
通用引物的序列如SEQ ID NO.49-50所示。
在本发明的一些实施方式,所述试剂盒用于制备胎儿耳聋基因的无创产前检测试剂。
本发明的有益效果在于:本发明提供了一种检测耳聋基因的参考品,通过高通量测序技术,构建相应的DNA文库,本发明采用的建库方法中,检测位点不仅包括耳聋基因,还包括用于计算胎儿DNA比例的多个SNP位点,针对SNP位点也使用不同的引物进行两轮特异性扩增,能够高效、准确的计算胎源DNA含量,因此可以根据胎儿DNA含量和耳聋基因位点的检测频率,获得母体和胎儿的基因型信息,使用本发明的参考品进行文库构建,能够准确、高效地检测耳聋基因突变;本发明通过孕妇外周血即可实现对胎儿基因型的准确检测,实现耳聋基因的无创产前检测,且本发明的方法所需的样本量少,仅需要2mL的外周血即可实现对样本的基因型准确检测,其结果与羊水穿刺检测分型一致,但安全性、无创性和高效性方面明显优于羊水穿刺检测。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明,其中:
图1为本发明实施例一中参考品配制的技术路线图;
图2为本发明实施例一中组织细胞和外周血白细胞的DNA的片段分布图,泳道1为Takara的100bp DNA Ladder,泳道2为样本1片段化核酸,泳道3为样本2片段化核酸,泳道4为样本3片段化核酸,泳道5为样本4片段化核酸,泳道6为样本5片段化核酸;
图3为本发明实施例二中孕妇外周血样本1的游离DNA的片段分布图;
图4为本发明实施例二中孕妇外周血样本2的游离DNA的片段分布图;
图5为本发明实施例二中孕妇外周血样本3的游离DNA的片段分布图;
图6为本发明实施例二中孕妇外周血样本4的游离DNA的片段分布图;
图7为本发明实施例二中孕妇外周血样本5的游离DNA的片段分布图;
图8为本发明实施例二中孕妇外周血样本6的游离DNA的片段分布图;
图9为本发明实施例二中孕妇外周血样本7的游离DNA的片段分布图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述,以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然,所描述的实施例只是本发明的一部分实施例,而不是全部实施例,基于本发明的实施例,本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例,均属于本发明保护的范围。
实施例1一种检测耳聋基因的参考品的制备方法
一种检测耳聋基因的参考品的制备方法如下:
1、样本选择:样本1是耳聋基因SLC26A4 c.1174A>T位点为纯合突变的胎儿组织样本,样本2是耳聋基因SLC26A4 c.1174A>T位点为杂合突变的胎儿组织样本,样本3是耳聋基因SLC26A4 c.1174A>T位点为野生型的胎儿组织样本。样本4是耳聋基因SLC26A4 c.1174A>T位点为纯合突变的女性的外周血样本,样本5是耳聋基因SLC26A4c.1174A>T位点为杂合突变的女性的外周血样本,样本6是耳聋基因SLC26A4c.1174A>T位点为野生型的女性的外周血样本。
2、基因组DNA提取
使用基因组提取试剂盒(Qiagen,Qiagen DNeasy Blood&Tissue Kit)基因组DNA对样本1,样本2,样本3,样本4,样本5,样本6进行gDNA提取,操作步骤如下:
(1)血液样本室温解冻,混匀,稍离心,取100μl白细胞至1.5mL离心管,加100μlPBS,混匀,稍离心;
(2)加入20μl proteinase K,涡旋离心,放置1min;加入10μl RNase A(100mg/ml),涡旋离心;加入200μl BufferAL,混匀离心;
(3)放入56℃水浴锅,消化10min;
(4)取下,待降至室温后,加入200μl无水乙醇,涡旋离心;
(5)将混合物转入DNeasy Mini spin column,室温放置5min;10000g离心1min;丢弃收集管并更换新的收集管;
(6)加入500μl AW1,10000g离心1min,丢弃收集管并更换新的收集管;
(7)加入500μl AW2,20000g离心3min,丢弃收集管并更换新的收集管;
(8)20000rpm离心1min,柱子转至新的1.5ml离心管上;开盖室温放置5min;
(9)加入100μl AE,关盖室温放置5min;10000g离心1min;加入100μl AE,10000g离心1min。
3、基因组的纯化
基因组DNA提取结束后,用基因组纯化试剂盒(ZYMO RESEARCH,Genomic DNAClean&Concentrator-10)进行纯化,操作步骤如下:
(1)在200μl的DNA中加400μl(2倍体积)DNAbinding buffer,混匀,稍离心;转移至柱子中,13000g,30s;弃滤液;
(2)加入200μl Wash Buffer,13000g,30s;弃滤液;
(3)重复步骤步骤(2)一次;
(4)柱子转移至新的离心管中,加入40μl Elution Buffer,放置1min;10000g,30s;加入40μl Elution Buffer放置1min;10000g,离心30s即得纯化后的gDNA。
纯化后的gDNA用Qubit核酸定量仪(Themo Fisher Scientific,Qubit2.0)进行定量。提取的核酸于-20℃保存,长期保存于-80℃。
4、基因组DNA片段化
使用covaris M220超声波破碎仪将样本1,样本2,样本3,样本4,样本5和样本6提取的基因组DNA进行片段化,基因组DNA放置于50μl的超声打断管中(microTUBE-50AFAFiber Screw-Cap),根据仪器说明书将超声打断的时间设置为360秒(具体实验参数见表1),以获得150bp-200bp的目的片段,得到片段化的母体DNA(样本4,样本5和样本6)和片段化的胎儿DNA(样本1,样本2和样本3)。
表1
Temperature(℃) | 10 |
Peak Incident Power(W) | 75 |
Duty Factor | 10% |
Cycles per Burst | 200 |
Treatment Time(s) | 360 |
片段化的核酸用2×Beckman Agencourt AMPure XP beads(100μl)进行纯化,Qubit2.0核酸定量仪进行定量。取适量片段化的核酸用2%的琼脂糖凝胶进行电泳,电泳图如图2所示,6个片段化的样本DNA主带在150-200bp之间。图2的Marker为100bp DNALadder。
5、参考品的配制
胎儿DNA含量可占参考品总量的5-30%,本实施例以胎儿DNA含量为10%进行配制。按照胎儿DNA:母体DNA的比例为1:9的比例将片段化的胎儿DNA(样本1,样本2和样本3)和片段化的母体DNA(样本4,样本5和样本6)按照不同基因型组合方式进行混合(具体见表2),总共有7种类型的组合,配制的参考品分别编号为R1,R2,R3,R4,R5,R6和R7,并根据胎儿DNA的含量计算出SLC26A4 c.1174A>T位点的突变频率理论值(表2),参考品配制的技术路线图如图1所示。
表2
实施例2样本游离DNA的提取
实施例1中的7种基因型组合的孕妇外周血样本来源于合作医院的送检样本(这7例样本已经过羊水穿刺检测,分型结果已知)。对送检孕妇的外周血样本进行游离DNA的提取,文库构建,高通量测序,生物信息分析,分析出母亲和胎儿的基因型。五例孕妇外周血样本的基因型信息见表3。
表3
孕妇样本编号 | 母亲基因型 | 胎儿基因型 |
S1 | aa | bb |
S2 | aa | Bb |
S3 | Aa | bb |
S4 | Aa | Bb |
S5 | Aa | BB |
S6 | AA | Bb |
S7 | AA | BB |
从孕妇外周血中提取游离DNA的流程如下:
1、从外周血中分离血浆:
(1)将装有孕妇外周血的采血管(约10ml)上下颠倒10次,放至预冷的大型离心机中,4℃,1600×g,离心10分钟。
(2)小心地将采血管从离心机中取出,放在15ml离心管架上。
(3)血样离心后,分为底部红细胞层,中间白细胞层(红白色薄层)以及上清血浆层;小心的将血浆转至1.5mL离心管中(血浆共3-4管)。
(4)最后将中间层的白细胞转至1.5mL离心管中。
(5)将3-4管血浆放入小型离心机中,室温,16000×g,离心10分钟。
(6)再次将血浆转至新的1.5mL离心管中(3-4管)。血浆于-20℃保存,长期保存置于-80℃。
2、血浆游离DNA提取:
采用QIAGEN公司的QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit进行血浆游离DNA的提取,提取血浆体积为2ml,提取结束后,Qubit2.0测定游离DNA的浓度,然后通过Bioanalyzer 2100(Agilent)电泳进行质控。7例孕妇血浆样本提取的游离DNA电泳图见图3-9,游离DNA的主峰在180bp左右。
实施例3DNA的文库构建及测序
为了对参考品和孕妇游离DNA的耳聋基因SLC26A4 c.1174A>T位点进行高通量测序,需要先对其进行文库的构建,文库构建采用本实验室的建库流程。参考品建库的起始DNA量为15ng。孕妇2ml血浆提取的游离DNA全部用于文库构建游离DNA量为20ng。
本发明中使用的引物均为生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1、引物设计
(1)针对耳聋基因SLC26A4 c.1174A>T突变位点设计合成引物
上游引物和下游引物分别位于检测点左侧和右侧。同侧的特异性引物1的3’端和特异性引物2的5’端有10-15个碱基的重合。特异性引物1的5’端有生物素修饰。特异性引物2的5’端含有用于高通量测序文库的接头序列。具体的,引物序列如表4所示:
表4
(2)带有特异标签序列和样本标签序列(index)的接头序列:
ADT-F:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNATTAAGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.45);ADT-R:pGATCGGAAGAGC(SEQ ID NO.46)。
其中,NNNNNNNN是特异标签序列,ATTAAGG是样本标签序列(index),以上接头序列需要退火成双链。
(3)预文库扩增引物序列:
Pre-lib-primer-F:CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQ ID NO.47);
Pre-lib-primer-R:GCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.48)。
(4)终文库扩增引物序列(通用引物)Seq-lib-primer-F:CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQ ID NO.49);Seq-lib-primer-R:ATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC(SEQ ID NO.50)。
5、本发明实施例的检测方法和检测试剂盒,具体建库步骤为:
(1)DNA末端修复,配置如表5所示反应体系(反应一),充分混匀,瞬时离心,在热循环仪上进行反应,程序如下:37℃20min;72℃20min;4℃保存。
表5
试剂 | 体积(μl) |
DNA | 40.5 |
T4 DNA连接酶缓冲液+10mM ATP | 5 |
10mM dNTP混合液 | 2 |
T4 DNA聚合酶(Enzymatics公司) | 1 |
T4 DNA磷酸化酶(Enzymatics公司) | 0.5 |
rTaq(Takara公司) | 1 |
总体积 | 50 |
(2)DNA片段连接带有特异性标签序列和样本标签序列的接头序列,配制反应体系(反应二)如表6所示。将配制好的反应体系充分混匀,瞬时离心,在热循环仪上进行如下反应:20℃15min;65℃10min;4℃保存。
表6
试剂 | 体积(μl) |
反应一 | 50 |
DNA连接酶缓冲液 | 27 |
DNA连接酶(Enzymatic公司) | 1 |
接头序列(SEQ ID NO.45-46) | 2 |
总体积 | 80 |
(3)反应结束后,立即使用30μl XP beads纯化,26μl超纯水或者洗脱液中洗脱。
(4)PCR预扩增:在冰上配制如下反应体系,如表7所示。
表7
充分混匀,瞬时离心,在热循环仪上进行如下反应:95℃,3min,1循环;95℃,15s,62℃,30s,72℃,30s,10循环;72℃,5min,1循环;4℃保存。
(5)反应终产物使用50μl XP beads回收纯化,使用Qubit定量,预文库浓度在20~80ng/μl,表明预文库构建成功。取两等份预文库,分别命名为上游预文库和下游预文库,每份100ng,进行下一步扩增。
(6)特异性扩增1:每份样品预文库为上游预文库和下游预文库,分别使用对应的上、下游特异性引物1和特异性引物2,直到使用通用引物扩增时将每份样品上、下游引物的扩增产物合并,再使用通用引物扩增。
在冰上配制如下反应体系,如表8所示:
表8
PCR反应程序如下:95℃,10min,1循环;(95℃,30s,62℃,30s,72℃,1min)20循环;72℃,7min,1循环,4℃保存。
(7)扩增产物用1.2×XP beads回收,24μl超纯水或者洗脱液洗脱,洗脱液进行下一步扩增。
(8)特异性扩增2:在冰上配制如表9所示反应体系。PCR反应程序如下:95℃,10min,1循环;(95℃,30s,62℃,30s,72℃,1min)15循环;72℃,7min,1循环,4℃保存。
表9
(9)扩增产物用1.2×XP beads回收,每一个样品的上下游扩增产物可以合并回收,最终用26μl超纯水或者洗脱液洗脱,洗脱液进行通用引物扩增。
(10)通用引物扩增:在冰上配置如如表10所示的反应体系,充分混匀,瞬时离心,在热循环仪上进行如下反应:98℃,45s,1循环;98℃,15s,60℃,30s,72℃,30s,10循环;72℃,1min,1循环;4℃保存。
表10
(11)反应产物用1.0×XP beads回收,最后使用30μl洗脱液洗脱,即为最终上机文库。
(12)用Illumina NEXTseq CN500测序仪进行75PE测序。
(13)测序数据信息分析
对上机数据进行生物信息学分析,根据位点的唯一的分子标签组序列的总深度和相关SNP位点等位基因(allele)的深度,计算胚胎DNA含量,并对胎儿耳聋基因SLC26A4c.1174A>T位点进行分型。
测试例:
根据上述实施例,对参考品R1~R7和五例孕妇进行耳聋基因检测,结果分别如表11和表12所示:
表11
表12
从表11和表12中可以看出,R1~R7采用本实验室的方法进行建库和分析后,得到的基因型信息与配制时使用的DNA样本的基因型信息一致。同时,将与参考品基因型相同的孕妇血浆样本S1~S7的游离DNA进行建库,也得到了同样的结果。表明本发明的方法配制的参考品可模拟真实样本,用于无创产前耳聋基因检测技术的研发质控。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明,但是本发明不限于上述实施例,在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内,还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外,在不冲突的情况下,本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
序列表
<110> 人和未来生物科技(长沙)有限公司
<120> 一种检测耳聋基因的参考品及其制备方法与应用
<160> 50
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caatttgtag gatcgttgtc atccagtctc ttcc 34
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgtagagcag aaaggtatgg gctcaactag 30
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctcttttatt ctatacttct ctaatactca cct 33
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gttctccctg ttccggggac atcaccttcc 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gatttttagg gcagtgaaac tcctctacag 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttagtcttac tttgcttttt taaattagct 30
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgttaggatg tacacacatt ttaat 25
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agacattact gctttgaaga ctttgtgtat 30
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cctatcgcca agtggtgaga caatcgccga 30
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tttagtcatg aagttttctg agtgccagtg 30
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtaataataa caacactaat ggcggtaaac 30
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agcagtggtg gccacaaaac aagagaag 28
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tataatccca caccactctt tgtttgctct 30
<210> 14
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
accctataat gctctgtgaa acacctattt gtt 33
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aagatggcca gggaagtgtg agtgacccta 30
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cagcgttata tgttctacag gtttagacaa 30
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tgggaaggct gcatggtgaa tataa 25
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ttcaagcatt cactgaaggt cttggaacgt 30
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tagaaccttt tggactagtt atgcc 25
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
caagtgaaag gggtccgatg gtactcactg 30
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aatcttcagt ggggatgtag cacattttgc 30
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
atcatgttgg caacatgctt ggagatcccc 30
<210> 23
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
agatgtgtat aagagacaga tcgttgtcat ccagtctctt ccttaggaat tca 53
<210> 24
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
agatgtgtat aagagacagt atgggctcaa ctagctatgt tacaacttc 49
<210> 25
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
agatgtgtat aagagacagc ttctctaata ctcacctgtt ctaatgagat tt 52
<210> 26
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
agatgtgtat aagagacagg ggacatcacc ttccagtctc caag 44
<210> 27
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
agatgtgtat aagagacagg aaactcctct acagcatact gtaatgatg 49
<210> 28
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
agatgtgtat aagagacagg cttttttaaa ttagctcttc atgcagcac 49
<210> 29
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
agatgtgtat aagagacagc acacatttta atattttggt acca 44
<210> 30
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
agatgtgtat aagagacagg aagactttgt gtatactaaa tgtgggtaa 49
<210> 31
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
agatgtgtat aagagacagg tgagacaatc gccgagcagt gagaccatc 49
<210> 32
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
agatgtgtat aagagacagt tctgagtgcc agtggaactg tcctggttc 49
<210> 33
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
agatgtgtat aagagacagc taatggcggt aaacaccatc atcatcttg 49
<210> 34
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
agatgtgtat aagagacagt ggtggccaca aaacaagaga agaatcc 47
<210> 35
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
agatgtgtat aagagacagc cactctttgt ttgctctatt ttggttctc 49
<210> 36
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
agatgtgtat aagagacagt ctgtgaaaca cctatttgtt agataaattg at 52
<210> 37
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
agatgtgtat aagagacagg aagtgtgagt gaccctaggg gttgtgccc 49
<210> 38
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
agatgtgtat aagagacagt tctacaggtt tagacaagtg tatcctaac 49
<210> 39
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
agatgtgtat aagagacagg ctgcatggtg aatataagaa ctgaattct 49
<210> 40
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
agatgtgtat aagagacagc tgaaggtctt ggaacgtatc ccctgtgga 49
<210> 41
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
agatgtgtat aagagacagt tttggactag ttatgccact cctgaggag 49
<210> 42
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
agatgtgtat aagagacagg tccgatggta ctcactgctc agcaatagg 49
<210> 43
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
agatgtgtat aagagacagg gatgtagcac attttgctat ttgagatgg 49
<210> 44
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
agatgtgtat aagagacaga catgcttgga gatccccaga tcaaaggtg 49
<210> 45
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn nnattaaggg tgactggagt tcagacgtgt 60
gctcttccga tct 73
<210> 46
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
gatcggaaga gc 12
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
caagcagaag acggcatacg a 21
<210> 48
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
gctcttccga tct 13
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
caagcagaag acggcatacg a 21
<210> 50
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
atgatacggc gaccaccgag atctacactc gtcggcagcg tc 42
Claims (10)
1.一种检测耳聋基因的参考品,其特征在于,包括:片段化的母体基因组DNA和片段化的胎儿基因组DNA。
2.根据权利要求1所述的参考品,其特征在于,片段化的母体基因组DNA的耳聋基因位点突变为野生型、纯合突变或杂合突变;片段化的胎儿基因组DNA的耳聋基因位点突变为野生型、纯合突变或杂合突变。
3.根据权利要求1所述的参考品,其特征在于,片段化的母体基因组DNA包括来源于母体组织或外周血的基因组的片段化核酸;片段化的胎儿基因组DNA包括来源于胎儿组织或外周血的基因组的片段化核酸;所述片段化的母体DNA和片段化的胎儿DNA的片段大小分别为150-200bp。
4.根据权利要求1-3任一项所述的参考品,其特征在于,片段化的胎儿基因组DNA的含量占参考品总量的5-30%。
5.一种用于检测耳聋基因的参考品的制备方法,其特征在于,所述制备方法如下步骤:
S1、分别提取、纯化母体样本和胎儿样本的基因组DNA;
S2、将步骤S1所得的基因组DNA片段化;
S3、将步骤S2片段化的母体基因组DNA和胎儿基因组DNA按比例配制成参考品,其中,片段化的胎儿基因组DNA的含量占参考品总量的5-30%。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,步骤S1中,所述母体样本的耳聋基因SLC26A4 c.1174A>T位点为野生型或杂合突变;所述胎儿样本的耳聋基因SLC26A4 c.1174A>T位点为野生型、纯合突变或杂合突变。
7.一种用于检测耳聋基因突变型与缺失型的引物组,其特征在于,所述引物组包括如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.44所示的引物。
8.根据权利要求1所述的参考品在制备用于检测耳聋基因试剂中的应用。
9.一种检测耳聋基因的试剂盒,其特征在于,包括权利要求1所述的参考品或权利要求7所述的引物组。
10.一种检测胎儿耳聋基因的方法,其特征在于,包括如下步骤:筛选SNP位点;提取孕妇血浆中游离DNA和权利要求1所述的参考品并构建相应的DNA文库,进行模板制备和富集;对所述游离DNA和参考品进行文库测序;构建所述耳聋基因上SNP位点的基因型,结合所述游离DNA和参考品文库测序信息,确定胎儿所述SNP位点相应的基因型,所述方法不以疾病的诊断和治疗为目的。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110339486.1A CN113073135B (zh) | 2021-03-30 | 2021-03-30 | 一种检测耳聋基因的参考品及其制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110339486.1A CN113073135B (zh) | 2021-03-30 | 2021-03-30 | 一种检测耳聋基因的参考品及其制备方法与应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113073135A true CN113073135A (zh) | 2021-07-06 |
CN113073135B CN113073135B (zh) | 2024-02-23 |
Family
ID=76611396
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202110339486.1A Active CN113073135B (zh) | 2021-03-30 | 2021-03-30 | 一种检测耳聋基因的参考品及其制备方法与应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN113073135B (zh) |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104404164A (zh) * | 2014-12-18 | 2015-03-11 | 亚能生物技术(深圳)有限公司 | 一种遗传性耳聋基因突变检测试剂盒 |
US20150307942A1 (en) * | 2014-04-23 | 2015-10-29 | Berry Genomics Co., Ltd. | Method and a kit for non-invasively detecting fetal deafness pathogenic gene mutations |
CN105255999A (zh) * | 2015-07-22 | 2016-01-20 | 广州市达瑞生物技术股份有限公司 | 一种检测耳聋基因20个突变位点的方法 |
US20160017412A1 (en) * | 2014-07-18 | 2016-01-21 | Illumina, Inc. | Non-invasive prenatal diagnosis of fetal genetic condition using cellular dna and cell free dna |
CN106755486A (zh) * | 2017-01-19 | 2017-05-31 | 人和未来生物科技(长沙)有限公司 | 无创产前胎儿β 型地贫基因突变检测文库构建方法、检测方法和试剂盒 |
CN109112209A (zh) * | 2017-06-25 | 2019-01-01 | 国家卫生计生委科学技术研究所 | 用于无创产前检测胎儿非整倍体染色体的参考品 |
CN112126677A (zh) * | 2020-11-25 | 2020-12-25 | 北京迈基诺基因科技股份有限公司 | 耳聋单倍型基因突变无创检测方法 |
-
2021
- 2021-03-30 CN CN202110339486.1A patent/CN113073135B/zh active Active
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20150307942A1 (en) * | 2014-04-23 | 2015-10-29 | Berry Genomics Co., Ltd. | Method and a kit for non-invasively detecting fetal deafness pathogenic gene mutations |
US20160017412A1 (en) * | 2014-07-18 | 2016-01-21 | Illumina, Inc. | Non-invasive prenatal diagnosis of fetal genetic condition using cellular dna and cell free dna |
CN104404164A (zh) * | 2014-12-18 | 2015-03-11 | 亚能生物技术(深圳)有限公司 | 一种遗传性耳聋基因突变检测试剂盒 |
CN105255999A (zh) * | 2015-07-22 | 2016-01-20 | 广州市达瑞生物技术股份有限公司 | 一种检测耳聋基因20个突变位点的方法 |
CN106755486A (zh) * | 2017-01-19 | 2017-05-31 | 人和未来生物科技(长沙)有限公司 | 无创产前胎儿β 型地贫基因突变检测文库构建方法、检测方法和试剂盒 |
CN109112209A (zh) * | 2017-06-25 | 2019-01-01 | 国家卫生计生委科学技术研究所 | 用于无创产前检测胎儿非整倍体染色体的参考品 |
CN112126677A (zh) * | 2020-11-25 | 2020-12-25 | 北京迈基诺基因科技股份有限公司 | 耳聋单倍型基因突变无创检测方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
曾溢滔: "遗传病分子基础与基因诊断》", 上海科学技术出版社, pages: 185 - 59 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN113073135B (zh) | 2024-02-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101855363B (zh) | 通过数字pcr对核酸的分析 | |
ES2688458T5 (es) | Recuento varietal de ácidos nucleicos para obtener información del número de copias genómicas | |
WO2016049878A1 (zh) | 一种基于snp分型的亲子鉴定方法及应用 | |
CN108070658B (zh) | 检测msi的非诊断方法 | |
WO2018147438A1 (ja) | Hla遺伝子のpcrプライマーセット及びそれを用いたシークエンス法 | |
CN113278611B (zh) | 捕获测序探针及其用途 | |
CN113913530B (zh) | 一种与绵羊体高相关的分子标记及其应用 | |
CN110628891A (zh) | 一种对胚胎进行基因异常筛查的方法 | |
CN113502335A (zh) | 一种与绵羊生长性状相关的分子标记及其应用 | |
CA3029167C (en) | Method for producing dna library and method for analyzing genomic dna using the dna library | |
CN110468211B (zh) | 膀胱癌肿瘤突变基因特异性引物、试剂盒和文库构建方法 | |
CN108624684B (zh) | 基于多个基因诊断结肠癌患者的检测试剂盒 | |
CN109295500B (zh) | 一种单细胞甲基化测序技术及其应用 | |
CN113249458A (zh) | 一种预测胎盘源性疾病的评估和预测的方法和试剂盒 | |
CN108913777B (zh) | 诊断肿瘤的dna甲基化相关的标记物及其应用 | |
CN112626214A (zh) | 检测1p/19q杂合性缺失的引物组、试剂盒及方法 | |
CN113073135B (zh) | 一种检测耳聋基因的参考品及其制备方法与应用 | |
CN113186291B (zh) | 基于多重pcr的引物组和试剂盒 | |
CN114774553A (zh) | 一种利用高通量测序技术检测多基因位点突变的方法 | |
CN112831555B (zh) | 一种检测地中海贫血基因的参考品及其制备方法与应用 | |
CN114032287A (zh) | Dna甲基化测序文库及其构建方法和检测方法 | |
EP3625371B1 (en) | Set of random primers and method for preparing dna library using the same | |
CN116926221B (zh) | 一种构建用于判断结核分枝杆菌分型的基因文库的引物组 | |
WO2002066639A1 (en) | Brain aneurysm-sensitive gene | |
CN108251531B (zh) | Ensg00000267549在判断骨肉瘤转移中的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |