CN103100092A - 人类细胞因子ccdc134的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了人类细胞因子CCDC134的基因或该基因所编码的蛋白质作为制备治疗肿瘤的药物的应用。本发明的CCDC134作为细胞因子，通过免疫系统发挥抑制肿瘤，进而治疗肿瘤的效果。细胞因子作为药物具有很多优越之处，如细胞因子为人体自身成分，可调节机体的生理过程和提高免疫功能，在很低剂量即可发挥作用，因而疗效显著，副作用小，是一种全新的生物疗法。

Description

人类细胞因子CCDC134的应用

技术领域

本发明涉及一种人类细胞因子的应用，具体地涉及人类细胞因子CCDC134的基因或该基因所编码的蛋白质作为制备治疗肿瘤的药物的应用。

背景技术

中国专利文献公开号CN101190944A(此处并入为本发明的参考文献)公开了一种人类新细胞因子及其用途，其中公开了人类细胞因子NS128(即人类细胞因子CCDC134(Coiled-Coil Domain Containing 134))基因的核苷酸序列SEQ ID NO.1及该核苷酸序列所编码蛋白质的氨基酸序列SEQ ID NO.2。该CCDC134在NCBI中对应的mRNA和蛋白质的记录号分别为NM_024821和NP_079097。

人类细胞因子CCDC134(Coiled-Coil Domain Containing 134)是本发明人2008年在国际上首先报道的具有功能活性的新分子。在前期工作中，已证实CCDC134是一个经典分泌蛋白，在MAPK(Mitogen-Activated ProteinKinase)信号通路的转录调节中发挥重要负向调控作用(Huang J，et al.Cell MolLife Sci.2008.65(2)：338-349)；CCDC134又可作为一个核蛋白，与其相互作用蛋白hADA2a(human Transcriptional Adaptor 2a)共同组成核蛋白复合物，发挥对p53基因转录活性的调节作用(Huang J，et al.Chinese Sci Bull.February，2011.Vol.56.No.4-5：397-405)。该基因在哺乳动物中进化保守，与已知的人类基因或蛋白没有同源性，编码229个氨基酸，蛋白分子量为26kDa，具有糖基化修饰位点，人与小鼠氨基酸序列同源性为89％，而去掉信号肽的分泌形式，二者的氨基酸序列同源性更高达95％。

CCDCl34基因在多种正常组织、胎儿组织、肿瘤组织都有表达，说明其为人体自身重要的一个分泌蛋白(Huang J，et al.Cell Mol LifeSci.2008.65(2)：338-349)。前期在免疫系统中的研究结果(黄晶，北京大学博士研究生学位论文，2008年4月)表明：CCDC134在多种免疫细胞中存在表达，实时定量PCR的结果显示CCDC134在T细胞多个亚群中均有表达并且丰度不同，另外，在刺激活化的人外周血淋巴细胞(PBL)中，CCDC134表达和分泌增加，同样在用PHA刺激活化的人CD8⁺T淋巴细胞中，CCDC134的表达也呈上升趋势；DC细胞活化和成熟时CCDC134表达上调，而B细胞活化时CCDC134表达下调(参考CN101190944A)。细胞因子是由多种细胞所分泌的能调节细胞生长分化、调节免疫功能、参与炎症发生和创伤愈合等小分子多肽的统称。免疫系统细胞的增殖、分化和功能都受到一系列细胞因子的调节。我们知道细胞因子一般是小分子量的分泌蛋白，多数为多肽或糖蛋白，它们的来源广谱并且主要在免疫系统或造血系统中表达，另外，在静息状态下表达量低，细胞活化后表达量明显增加。CCDC134与细胞因子的许多共性相符，我们推测CCDC134可能为一个潜在的细胞因子，在免疫系统中发挥着重要作用。另外，CCDC134在正常组织，肿瘤组织中表达量有差别(参考CN101190944A)，提示CCDC134可能与肿瘤的发生，发展有关。

细胞免疫是机体抗肿瘤免疫的主要途径，是一个由多种免疫细胞和细胞因子参与的复杂过程。而细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)是体内特异性杀伤肿瘤最主要的免疫活性细胞。CTL诱导细胞凋亡的主要机制为由fas介导的细胞凋亡及由穿孔素(perforin)/颗粒酶(granzyme)介导的细胞凋亡过程。效应细胞对肿瘤细胞的杀伤过程为：首先CTL表面T细胞受体(T cell receptor，TCR)识别APC表面分子MHC-递呈的抗原肽，CTL被激活；接着活化的CTL的表面T细胞受体识别靶细胞表面的抗原肽--MHC-I类分子复合物，将细胞凋亡信息传递给靶细胞；凋亡信息的传入使细胞凋亡效应分子被激活，随即靶细胞将出现染色质浓缩、DNA降解、细胞崩溃，从而实现对靶细胞的杀伤。CTL细胞还可以通过活化后产生大量细胞因子，如TNF-α、IFN-γ、IL-2等干扰肿瘤细胞信号传导蛋白C途径和酪氨酸途径，直接诱导肿瘤细胞进入凋亡程序。CTL还可通过非细胞毒机制影响肿瘤细胞的生长，这主要和不同CTL亚群的细胞因子分泌类型及表达不同膜表面分子密切相关。不同的CTL亚群分泌的细胞因子通过影响临近淋巴细胞表面黏附分子、趋化性细胞因子受体和其他细胞表面分子的表达而影响其活化、分化和迁移，从而影响抗肿瘤免疫的性质和结果。如IFN-γ、TNF-α和IL-4可调节多种肿瘤细胞表面抗原的表达及生长动力学变化，引起肿瘤细胞免疫原性增强，抑制肿瘤细胞的增殖。TNF-α是迄今发现的抗癌作用最强的细胞因子，TNF-α可以直接杀伤肿瘤细胞(Old LJ.Science，1985，230：630-632；Lejeune FJ，et al.Curr Opin Immunol，1998，10：573-580)，能促进细胞内游离Ca²⁺浓度升高，激活Ca²⁺依赖性核酸内切酶，引起DNA片段化和细胞凋亡。另外，TNF-α还能够阻滞细胞周期(cell cycle arrest)(Pusztai L，et al.Br JCancer，1993，67：290-296；Hu X，et al.J Bio Chem，2002，277：16528-16537)以及诱导肿瘤细胞凋亡(Fukui T，et al.Surg Today，2003，33：847-853；Cullinan AE，et al.Mol Vis，2004，10：315-322)。IFN-γ是一种具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节活性的多功能细胞因子，尤其以抗癌和免疫调节作用最引人注目，可使肿瘤细胞溶解，直接抑制或杀死癌细胞，其抗肿瘤机制是通过受体影响肿瘤细胞基因表达，抑制肿瘤细胞分裂，并可协同TNF杀伤肿瘤细胞，通过TNF相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)诱导肿瘤细胞凋亡(Shin EC，et al.Int J Cancer，2001，93：262-268；Abadie A，et al.Ann N Y AcadSci，2003，1010：117-120)。

在世界范围内，恶性肿瘤是危害人类生命健康的最严重疾病，其发病率和死亡率一直呈上升趋势，目前针对肿瘤手术、放疗、化疗三大常规治疗方法远远不能改变肿瘤治疗的现状，免疫治疗因其安全、有效、无毒副作用等特点，被公认为是21世纪肿瘤综合治疗模式中最活跃、最有前途的一种治疗手段。而且其适合于多种实体肿瘤，包括肺癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、脑转移瘤、恶性淋巴瘤、恶性黑色素瘤等，有效率达80％以上。

肿瘤的免疫治疗要求效应细胞对肿瘤具有特异性，才能更好的发挥杀伤效能并保持机体内环境的稳定。因此，具有肿瘤特异性的细胞毒T细胞(CTL)成为免疫治疗中常用效应细胞而倍受关注，并且其具有杀瘤谱广、杀瘤活性高、增殖能力强等特点。但由于肿瘤发生机制尚未完全明了，除少部分肿瘤的免疫原性较强外，绝大部分肿瘤免疫原性极弱，且与正常组织有交叉，给免疫治疗带来很多困难。如何提高CTL细胞数量及活性、增强其抗肿瘤特异性是提高免疫治疗效果的关键，也是长期以来是众多研究关注的热点。其中，利用基因工程技术生产的重组细胞因子作为CTL等免疫细胞的应答调节剂治疗肿瘤疗效良好，成为新一代的药物。重组细胞因子作为药物具有很多优越之处，如细胞因子为人体自身成分，可调节机体的生理过程和提高免疫功能，在很低剂量即可发挥作用，因而疗效显著，副作用小，是一种全新的生物疗法。

鼠EG7细胞是一种淋巴瘤细胞，由来源于C57BL/6(H-2b)的淋巴瘤细胞EL4稳定转染OVA衍生而来。EG7细胞组成性合成和分泌OVA，用该细胞免疫小鼠可诱导针对OVA_257-264这个短肽的特异性CTL的产生，它是在小鼠中研究MHC-I限制性的抗原特异性CTL免疫应答最常用的模型。

黑色素细胞瘤是临床上常见的恶性肿瘤之一，可发生于皮肤及肛周，手术彻底切除难度较大，且对化疗、放疗等常规治疗方法不敏感，预后极差。近年来研究表明黑色素细胞瘤对免疫治疗敏感。特别值得关注的是，DudleyME等过继回输经体外筛选和培养扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltratedlymphocyte，TIL)，治疗对化疗及大剂量IL-2耐药的晚期黑色素瘤病人，取得了突破性进展。鼠B16黑色素瘤是发生于C57BL/6小鼠耳根部的一种自发性肿瘤，为弱免疫原性、高恶性、高转移性肿瘤，与发生于人的肿瘤相似，是研究肿瘤免疫、发病机制、抗肿瘤药物筛查中较为理想的动物模型。

因此，在已知人类细胞因子CCDC134基因及所编码的蛋白质的基础上，致力于研究人类细胞因子CCDC134的基因及蛋白质作为制备治疗肿瘤的药物的应用，是本发明人需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的是解决人类细胞因子CCDC134的基因或蛋白质在制备治疗肿瘤的药物中的应用的问题。

为了达到上述目的，本发明提供了人类细胞因子CCDC134的基因或蛋白质作为制备治疗肿瘤的药物的应用。

进一步地，本发明所述的应用，其中所述的肿瘤是淋巴细胞瘤或黑色素细胞瘤。

进一步地，本发明所述的应用，其中所述治疗肿瘤是通过免疫系统治疗肿瘤的。

本发明的CCDC134作为细胞因子，通过免疫系统发挥抑制肿瘤，进而治疗肿瘤的效果。细胞因子作为药物具有很多优越之处，如细胞因子为人体自身成分，可调节机体的生理过程和提高免疫功能，在很低剂量即可发挥作用，因而疗效显著，副作用小，是一种全新的生物疗法。

为了更好地理解本发明，下面结合附图对本发明做进一步说明。

附图说明

图1：重组人CCDC134蛋白对人外周血分选获得的CD8⁺T淋巴细胞活化分子和效应分子的影响。

A为FACS的结果；B为ELISA的结果。

图2：mCcdc134相关生物信息学分析，在免疫细胞中表达情况以及表达纯化。

A为信号肽分析；B为人，鼠氨基酸同源性比对，其中，框中为信号肽序列；C为在CD8⁺T以及去掉CD8⁺T淋巴细胞的脾细胞活化过程中的表达变化情况；D为pcDB-mCcdc134-cmyc载体示意图以及纯化到的mCcdc134真核蛋白的鉴定，其中，CC-cmyc为带标签的人CCDC134真核蛋白，mCc-cmyc为带标签的鼠mCcdc134真核蛋白。

图3：小鼠体系中CCDC134对CD8⁺T淋巴细胞的作用。

A为小鼠CCDC134真核表达蛋白对小鼠脾脏中分选获得的CD8⁺T淋巴细胞活化分子和效应分子的影响；B为重组人CCDC134蛋白对小鼠脾脏中分选获得的CD8⁺T淋巴细胞活化分子的影响。

图4：重组人CCDC134蛋白对OT-1小鼠的CD8⁺T淋巴细胞杀伤活性的影响。其中T-CC代表于99℃加热10分钟灭活后的CCDC134蛋白。

图5：C57BL/6小鼠腹腔注射重组人CCDC134蛋白对B16细胞的抑制效应。

A为肿瘤体积；B为14天处死小鼠时各组小鼠血清中IFN-γ和IgE的含量。

图6：CCDC134转基因小鼠对肿瘤细胞的抑制效应。

A为CCDC134转基因小鼠对B16细胞的抑制效应；B为CCDC134转基因小鼠对EG7细胞的抑制效应。WT表示野生型对照组，弱阳性表示CCDC134低拷贝转基因小鼠组，TG表示CCDC134高拷贝转基因小鼠组；C为14天处死EG7成瘤小鼠时各组小鼠血清中IFN-γ和IgE的含量。

图7：CCDC134的肿瘤抑制效应与免疫系统的关系。

A为SCID-beige小鼠腹腔注射重组人CCDC134蛋白对B16细胞的抑制效应；B为在体外，重组人CCDC134蛋白对B16和EG7细胞增殖和凋亡的影响，其中显示的是细胞铺板48小时时的凋亡情况。

图8：重组人CCDC134蛋白治疗对肿瘤组织中免疫细胞的募集情况。

A为B16肿瘤模型的结果；B为EG7肿瘤模型的结果。

具体实施方式

首先为明确CCDC134作为潜在细胞因子在免疫系统中的作用，发明人在体外探讨了重组CCDC134蛋白对不同免疫细胞活化，分化以及效应的影响，发现CCDC134具有促进CD8⁺T淋巴细胞活化以及增强其效应细胞CTL细胞毒作用的功能。

发明人发现CCDC134作为潜在细胞因子，可增强CTL的细胞毒作用，发明人一方面利用EG7淋巴细胞瘤动物模型，确定了在肿瘤细胞抗原性较强的情况下CCDC134的抗肿瘤效应，另一方面，发明人建立了B16黑色素细胞瘤动物模型，探讨了CCDC134对自发性肿瘤的作用，以明确其作为细胞因子药物促进CTL功能从而发挥抗肿瘤效应的可能性。

一、材料

1.1主要材料(除了特别注明外均商购得到)

1.1.1实验动物：6～8周龄雌性SPF级C57BL/6小鼠，5周龄雌性SPF级Balb/c小鼠；6～8周龄雌性SCID-beige鼠；OT-1小鼠；CCDC134转基因小鼠。

1.1.2细胞系：小鼠黑色素瘤细胞系B16及小鼠淋巴瘤细胞系EG7。

1.2主要试剂(除了特别注明外均商购得到)：

1.2.1细胞培养试剂：

小牛血清(FBS)

DMEM，RPMI1640培养基

胰蛋白酶(trypsin)，G418

二甲基亚砜(DMSO)

1.2.2RNA提取及RT-PCR试剂

RT-PCR二步法试剂盒

琼脂糖，Trizol Reagent

DNA Marker

氯仿，异丙醇，乙醇

溴化乙啶(EB)

引物合成

1.2.3ELISA试剂盒及相关试剂

人IFN-γ，TNF-α试剂盒

人perforin试剂盒

鼠IFN-γ，TNF-α，Gran-B试剂盒

鼠IgE试剂盒

鼠IgG，IgM试剂盒

H₂SO₄

HRP-羊抗鼠IgG

1.2.4质粒构建试剂

pcDNA3.1-Myc-his(-)B载体

pGEM-Teasy T载体

XhoI，HindIII

XL-1Blue

DNA琼脂糖回收试剂盒

核苷酸序列测定

1.2.5FACS抗体及相关试剂

抗人CD8，CD25，CD69抗体

抗人IFN-γ，TNF-α，perforin抗体

抗鼠CD8，CD4，TNF-α，CD69抗体

抗鼠CD25，MHC-I OVA peptide抗体

抗鼠CD3，B220，NK1.1，Vβ5.1抗体

抗鼠perforin，IFN-γ，Gran-B抗体

相应isotype对照

打孔封闭液

1.2.6其他试剂

福氏不完全佐剂；PEG(MW.4000)；IRDye^TM偶联的所有二抗；proteinG，Percoll；淋巴细胞分离液；人，鼠CD8⁺T淋巴细胞磁珠分选试剂盒；BFA，DNA酶I；抗人CD3抗体(OKT3)，抗人CD28抗体(15E8)，抗鼠CD3抗体(OKT3)，抗鼠CD28抗体(15E8)；非放射性细胞毒作用检测试剂盒；胶原酶I；rhIL-2。

OVA_257-264短肽由杭州中肽公司合成。

重组人类CCDC134蛋白由本实验室表达纯化(参考CN101190944A)或委托中美冠科生物有限公司合成(见实施例1)，小鼠mCcdc134真核表达蛋白由本实验室表达纯化(见实施例2)，内毒素均小于1EU/mg。

1.3主要仪器与器材

1.4.统计学处理

组间指标差异用t检验进行统计，软件使用Prizm(GraphPad，San Diego，CA，USA)。P值小于0.05认为有统计学意义(^*：P＜0.05；^**：P＜0.01；^***：P＜0.001)。

未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆实验指南》(第三版)(Cold Spring Harbor Laboratory(CSHL)Press，2001)；《精编免疫学实验指南》(第一版)(John Wiley&Sons，Inc.2005)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

二、方法和结果

实施例1：重组人CCDC134蛋白的制备

首先，我们制备了重组人CCDC134蛋白，一部分由本发明人构建的真核表达载体(pCDB-NS128(tag))进行表达纯化(整个制备过程见中国专利文献公开号CN101190944A中说明书第23页第2段)，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示；一部分委托中美冠科生物有限公司合成，其制备了两种形式的重组人CCDC134真核表达蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。其中SEQ ID NO.1的序列为自身信号肽-CCDC134-接头-cmyc-his tag，SEQ ID NO.2的序列为自身信号肽-CCDC134-接头-his tag，SEQ ID NO.3的序列为IgGkSP(人免疫球蛋白信号肽)-NheI-CCDC134-EcoRI V-Xba I-TEV-Fc

为了方便说明，下述实施例中所述的重组人CCDC134蛋白，仅仅是SEQID NO.2所示的人重组蛋白。但是，发明人使用上述三种形式的重组CCDC134蛋白进行体外功能研究和体内抑瘤效应探讨，结果相似，发明人认为，包含CCDC134分泌形式完整氨基酸序列的真核表达蛋白均具有实施例所述的活性和功能。

实施例2：重组人CCDC134蛋白对CD8⁺T淋巴细胞活化的影响

1.人CD8⁺T淋巴细胞的获得

从北京血液中心获得2U的浓缩白细胞血样，首先应用淋巴细胞分离液从正常人外周血中分离得到正常人外周血单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cell，PBMC)，然后从中用阳性分选磁珠(参照说明书)纯化得到CD8⁺T淋巴细胞；从中取出一部分(5*10⁵)，用FACS检测其纯度，步骤如下：加入200ul预冷的封闭液(5％FBS/PBS，v/v)，4℃封闭30min，1800rpm离心5min，随后加入FITC标记的抗人CD8抗体(抗体用量参照说明书)，4℃避光孵育30min；使用相应IgG作为同型对照。最后用PBS洗涤两次后，通过流式细胞仪收集细胞，使用Cellquest软件对结果进行分析，纯度达90％以上。

2.CD8⁺T淋巴细胞的体外活化：

将上述磁珠分选得到的CD8⁺T淋巴细胞培养于用抗人CD3抗体(1μg/ml)和抗人CD28抗体(1μg/ml)包被的细胞培养板中，密度为2×10⁶个细胞/ml，培养基为RPMI 1640，含10％补体灭活的FBS，37℃，5％CO₂条件下培养。

3.CD8⁺T淋巴细胞活化分子和效应分子水平检测

于0hr时，在上述活化培养体系中加入不同终浓度(1，10，100ng/ml)的人或鼠重组CCDC134蛋白和等体积PBS，继续培养，于铺板后24，48，72小时收集细胞培养上清和细胞，分别用ELISA和FACS进行相关细胞因子水平的检测：

ELISA：参照试剂盒说明书，步骤如下：100ul包被抗体(capture antibody)包被过夜；PBST(0.05％Tween/PBS，v/v)洗五遍；200ul封闭液(1×assaydiluent)封闭，室温1小时；PBST洗五遍；加入100ul细胞培养上清，室温孵育2小时；PBST洗五遍；100ul检测抗体(biotin-detection antibody)，室温孵育2小时；PBST洗五遍；100ul Avidin-HR，室温孵育1小时；PBST洗五遍；加入50ul TMB显色5分钟，50ul 2M H₂SO₄终止；酶标仪测定OD490-570。每个样本设立三个复孔。

细胞内分子检测：在指定时间提前两小时加入BFA(终浓度：10ug/ml)抑制细胞因子的分泌，之后收获细胞，用冷的PBS洗涤两次，首先用4％多聚甲醛冰上固定30min；然后用打孔封闭液室温孵育10min，1800rpm离心5min，弃上清，随后加入不同标记的抗体，4℃避光孵育40min；使用相应IgG作为同型对照。最后用PBS洗涤两次后，通过流式细胞仪收集细胞，使用Cellquest软件对结果进行分析。

结果：在抗CD3，CD28抗体联合刺激条件下，重组CCDC134蛋白可促进CD8⁺T淋巴细胞活化分子和效应分子的表达：用抗CD3，CD28抗体联合刺激模拟抗原信号活化分离纯化获得的人外周血CD8⁺T淋巴细胞，同时加入不同浓度的重组人CCDC134蛋白作用，结果证实三个不同浓度的人CCDC134真核蛋白均可促进CD8⁺T淋巴细胞中的活化标记分子CD25，CD69和杀伤效应分子IFN-γ(Interferon-γ)，穿孔素(perforin)和TNF-α(Tumor necrosis factor-α)的表达，尤以10ng/ml最为明显(图1)。

实施例2：mCcdc134的生物信息学分析以及载体构建，蛋白表达纯化

1.生物信息学分析

mCcdc134信号肽分析使用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；蛋白同源性比对使用blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。

结果：生物信息学分析鼠Ccdc134与人CCDC134一样N端22个氨基酸为信号肽(图2A)，并且去掉信号肽后，二者的氨基酸序列同源性高达95％(图2B)，提示鼠Ccdc134蛋白可能也是一个分泌蛋白，并发挥着与人CCDC134蛋白类似的作用。

2.真核表达质粒pcDB-mCcdc134的构建

使用带XhoI的上游引物和带HindIII的下游引物从小鼠cDNA中扩增mCcdc134(带信号肽)，产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后连入pGEM-TeasyT载体，连接产物转化大肠杆菌XL-1Blue，PCR筛选阳性克隆，并测序验证无误。再使用XhoI，HindIII酶切构建好的pGEM-Teasy-mCcdc134质粒，释放mCcdc134片段，电泳，回收纯化后，分别连接至XhoI，HindIII酶切的pcDB载体中，连接产物转化大肠杆菌XL-1Blue，PCR筛选阳性克隆，测序验证，获得pcDB-mCcdc134和pcDB-mCcdc134-cmyc-his两个质粒。上游引物：SEQ ID NO.4，下游引物SEQ ID NO.5(带终止密码子)，下游引物SEQ IDNO.6(不带终止密码子)。

3.mCcdc134真核蛋白的表达和纯化

(1)细胞培养：将Hela细胞(ATCC Number：CCL-2)用含10％胎牛血清的RPMI 1640以4.0×10⁵个/10mm平皿传代，在5％CO2，37℃的培养箱中培养24小时。

(2)电穿孔方法转染：消化Hela细胞，用无血清RPMI 1640培养基洗细胞2遍，3×10⁶个细胞中分别加入上述pcDB-mCcdc134-cmyc-his质粒15ug，混匀后移入2mm电转杯，电击条件120v，20ms；转染后室温放置10分钟，吸出并重悬于7ml DMEM培养基中，铺于10cm细胞培养皿，细胞浓度为3.0×10⁶个，培养5小时细胞贴壁后，用常温的1×PBS洗涤细胞三次，更换新鲜的无血清培养基(但含有低蛋白的培养细胞因子)，在5％CO₂，37℃的培养箱中培养。48-60小时后收集细胞培养上清，于4℃，800g离心5分钟，目的是去除细胞培养上清的细胞，弃沉淀，再于4℃，18000g离心20分钟，去除上清中的小颗粒物质，留取处理后的细胞培养上清。

(3)用Ni2⁺柱纯化上述处理后的细胞培养上清：先将上清经过0.45μm滤器过滤后，在上清中加入咪唑(10mM)/β-巯基乙醇(10mM)/NaCl(300mM)，再与柱料结合，流速控制在10滴每分钟，再用平衡缓冲液【咪唑(20mM)β-巯基乙醇(10mM)/NaCl(300mM)in 1×PBS(PH7.4)】冲洗柱料，以洗去未结合的杂蛋白，至分光光度计测量值回至基线后，用柱料相同体积的洗脱液【咪唑(500mM)/β-巯基乙醇(10mM)/NaCl(300mM)in 1×PBS(PH7.4)】洗脱结合蛋白，收集洗脱液，即为CCDC134蛋白，用BCA的方法进行定量，SDS-PAGE检测蛋白纯度，用兔抗CCDC134 C端抗体(HuangJ，et al.Cell Mol Life Sci.2008.65(2)：338-349；anti-C-CCDC134)作为一抗进行Western blot检测蛋白性质。

结果：我们成功构建了pcDB-mCcdc134和pCDB-mCcdc134-cmyc真核表达载体，转染Hela细胞，验证了mCcdc134的分泌，并从过表达上清中纯化得到了鼠重组Ccdc134蛋白(图2D)。

实施例3：内源性mCcdc134蛋白在免疫细胞活化过程中的表达变化情况

1.CCDC134鼠源多克隆抗体的制备

免疫动物选用5周龄Balb/c雌鼠，采用基因免疫联合蛋白免疫的方式，首先进行三次质粒免疫，然后用两次蛋白免疫加强，每次间隔14天，胫前肌电转pCDB-NS128(tag)，每只小鼠50ug(0.1ml)，蛋白免疫用75ug CCDC134真核表达蛋白(0.2ml)与等体积不完全弗氏佐剂(IFA)充分乳化后，于腹腔注射。最后一次免疫后七天，内眦取血检测抗体效价，效价最高一只为1∶320000。七天后，放血处死该小鼠，血清用protein G柱纯化获得抗体(步骤参照说明书)，WB鉴定抗体的特异性，结果表明抗体能特异性识别外源性表达的CCDC134，同时也能识别外源性表达的小鼠mCcdc134蛋白。

2.小鼠CD8⁺T淋巴细胞的获得：

无菌操作取出小鼠脾脏，于RPMI 1640中研磨，之后过200目筛网，制备成单细胞悬液，然后用阳性分选磁珠(参照说明书)纯化得到CD8⁺T淋巴细胞；从中取出一部分(5*10⁵)，用FACS检测其纯度，步骤同上，分选纯度达90％以上。

3.CD8⁺T淋巴细胞和脾细胞的体外活化

将上述磁珠分选得到的CD8⁺T淋巴细胞或者去掉CD8⁺T的脾细胞培养于用抗鼠CD3抗体(3μg/ml)和抗鼠CD28抗体(1μg/ml；)抗体包被的细胞培养板或含PHA终浓度为20ug/ml的细胞培养板中，密度为2×10⁶个细胞/ml，培养基为RPMI 1640，含10％补体灭活的FBS，37℃，5％CO2条件下培养。

4.内源性mCcdc134蛋白含量测定：

在指定时间收集上述培养上清和细胞，上清用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测蛋白的分泌，细胞用实时定量PCR(real-time PCR)检测转录水平。

ELISA：100ul兔抗CCDC134抗体(Huang J，et al.Cell Mol LifeSci.2008.65(2)：338-349；anti-C-CCDC134)包被过夜；PBST(0.05％Tween/PBS，v/v)洗五遍；300ul封闭液(3％BSA/PBST，w/v)封闭，37℃，2小时；PBST洗五遍；加入100ul细胞培养上清，37℃孵育2小时；PBST洗五遍；100ul鼠抗CCDC134抗体(见CCDC134鼠源多克隆抗体的制备)，37℃孵育2小时；PBST洗五遍；100ul HRP-羊抗鼠IgG，37℃孵育1小时；PBST洗五遍；加入50ul TMB显色5分钟，50ul 2M H₂SO₄终止；酶标仪测定OD490-570。每个样本设立三个复孔。

Real time-PCR：收集细胞，参照说明书提取总RNA，每个样品取1ug，逆转录合成单链cDNA文库。mCcdc134使用上游特异性的引物SEQ ID NO.7与下游特异性的引物SEQ ID NO.8，进行PCR扩增；Gapdh使用5’引物SEQID NO.9与3’引物SEQ ID NO.10扩增。试剂PCR master Mix购自PowerSYBR Green公司，引物由六合通公司合成。通过7500HT Fast Real-Time PCRSystem完成测试分析。

结果：我们检测了内源性mCcdc134蛋白的表达情况，RT-PCR和ELISA结果显示在PHA或抗CD3，CD28抗体联合刺激的CD8⁺T淋巴细胞或去掉CD8⁺T淋巴细胞的脾细胞中，mCcdc134表达上调(图2C)。

实施例4：重组鼠或人CCDC134蛋白对鼠CD8⁺T淋巴细胞活化的影响

方法如实施例2，结果发现与预想一致，小鼠Ccdc134真核表达蛋白对小鼠脾脏分选获得的CD8⁺T淋巴细胞具有与人CCDC134蛋白相同的效应(图3A)，并且蛋白在99℃加热10分钟后，其活性消失(图3A：T-mCc)。同时，我们还惊喜地发现与很多细胞因子(如IL-2)相似，CCDC134人源蛋白也能作用于小鼠CD8⁺T淋巴细胞，使其活化标记分子CD25和CD69表达上调(图3B)。鉴于小鼠模型本身所具有的优势，因此之后的功能试验我们选择小鼠体系进一步研究人CCDC134真核表达蛋白的免疫效应。

实施例5：重组人CCDC134蛋白对效应细胞CTL杀伤效应的影响

针对OVA(卵清蛋白)-抗原特异性的杀伤体系是研究MHC限制性的特异性CTL细胞毒作用最常用的模型，在该体系中，靶细胞是EG7细胞，它是由T淋巴瘤EL4细胞系稳定转染OVA衍生而来，能够以MHC-抗原肽复合物的形式呈递OVA；而效应细胞也就是针对OVA-特异性的CD8⁺T淋巴细胞，来源于OT-1转基因小鼠。我们利用该体系研究了人CCDC134真核表达蛋白对CTL细胞毒作用的影响。

如前述方法从6～8周龄OT-1转基因小鼠中获得CD8⁺T淋巴细胞，以2*10⁶/ml的密度培养于用抗鼠CD3(3μg/ml)和抗鼠CD28(1μg/m)抗体联合刺激的活化体系中，同时加入不同终浓度(1，10，100ng/ml)的人重组CCDC134蛋白或等体积PBS，或IL-2100U/ml作为阳性对照，继续培养4天后，收集不同处理组的效应细胞，以不同效靶比例(1∶1；5∶1；10∶1；20∶1)与靶细胞EG7(10000个)在圆底96孔板中共孵育(每孔200ul，每组设4个复孔)，杀伤8小时后，通过检测被杀伤靶细胞死亡后释放到上清中的LDH的含量来反应杀伤程度(参照说明书)。杀伤率(％)＝(OD_实验组-OD_{效应细胞自发死 亡}-OD_{靶细胞自发死亡})/(OD_{靶细胞全部死亡}-OD_{靶细胞自发死亡})*100％。

结果：重组CCDC134蛋白可增强CD8⁺T效应细胞的细胞毒作用：如图4，重组人CCDC134蛋白能促进CTL对靶细胞的杀伤作用，具有一定的剂量依赖性，且稍强于rhIL-2的作用，如在效靶比为10∶1时，CCDC134 100ng/ml剂量组的杀伤率是PBS对照组的3.6倍，强于rhIL-2 100U/ml的作用(2.3倍)。

实施例6：重组CCDC134蛋白体内给药对肿瘤的抑制效应

CCDC134增强CTL细胞的免疫应答和促进IFN-γ和TNF-α产生的能力表明它可能具有抗肿瘤作用。我们利用C57BL/6小鼠成瘤模型，探讨了重组CCDC134蛋白对肿瘤生长的影响。

1.细胞培养

B16细胞常规传代培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，并置于37℃，5％CO2孵箱中培养；用0.25％胰酶+EDTA消化细胞；EG7细胞常规传代培养于含10％胎牛血清和0.4mg/ml G418的RPMI 1640培养基中，并置于37℃，5％CO2孵箱中培养，离心传代。

2.小鼠瘤细胞接种和CCDC134给药方式

常规培养的B16或EG7细胞在对数生长期收获，用PBS洗两遍，在第0天，C57BL/6小鼠皮下接种B16(每只小鼠2*10⁵个细胞，悬于100ulPBS中)或EG7(每只小鼠1*10⁶个细胞，悬于100ulPBS中)，到出现肉眼可见，体积可测量的实体瘤时，不同剂量CCDC134腹腔给药(溶于200ul PBS)，对照组给予相同体积的PBS，每天观察小鼠肿瘤生长情况并计算瘤体积(V＝A*B²/2；V：肿瘤体积；A：肿瘤长径；B：肿瘤短径)。CCDC134转基因老鼠瘤细胞接种步骤同前。

结果：重组人CCDC134蛋白全身给药或CCDC134转基因小鼠均能明显抑制恶性肿瘤细胞B16和EG7的生长：如图5A所示，在小鼠B16种植模型中，C57BL/6小鼠皮下接种B16细胞后6天出现肿瘤。单独给予重组人CCDC134蛋白腹腔注射治疗小鼠肿瘤体积明显缩小，肿瘤生长减缓，并且随着CCDC134蛋白剂量的增大，效果越来越明显，在CCDC134蛋白为40ug/只时，肿瘤体积明显缩小，肿瘤生长缓慢，肿瘤抑制率可达60％(图5A)。进而我们利用CCDC134转基因小鼠模型，验证了CCDC134的抗肿瘤活性。相同方法于C57BL/6-CCDC134转基因小鼠和野生型对照小鼠皮下接种B16或EG7细胞后，5-7天出现肿瘤，15天处死小鼠。CCDC134转基因小鼠肿瘤体积明显缩小，肿瘤生长减缓，肿瘤抑制率可达60％以上(图6A、B)。

3.小鼠血清IFN-γ和免疫球蛋白含量测定

接受肿瘤种植的小鼠在指定日期取血处死，血液室温静置两小时，4℃以3000rpm的速度离心20分钟，吸出上清，于4℃以14000rpm的速度高速离心20分钟，收集上清作为检测样本，用ELISA的方法(方法见实施例1)检测相关指标。

结果：检测小鼠血清中IFN-γ和IgM，IgG，IgE的含量结果提示IFN-γ(图5B)IgM，IgG(数据未给)未见明显变化，而IgE随着CCDC134蛋白剂量的增大而上升，具有CCDC134剂量依赖性(图5B)。

同时检测CCDC134转基因小鼠血清中IFN-γ和IgE的含量得到相同的结果：两组IFN-γ未见明显变化，而CCDC134转基因小鼠血清中IgE含量明显高于野生型小鼠组(图6B)。

实施例7：CCDC134抗肿瘤效应机制探讨

为探讨重组人CCDC134蛋白的抗肿瘤效应是直接作用于肿瘤细胞还是通过免疫系统发挥，我们在体外探讨了重组CCDC134蛋白对肿瘤细胞的凋亡和增殖的影响，以及利用免疫缺陷鼠种植肿瘤，体内探讨了CCDCl34在免疫系统缺陷情况下的肿瘤抑制效应。

1.肿瘤细胞体外凋亡实验

取常规培养处于对数生长期的细胞铺于6孔板(B16：密度为5*10⁴/ml，每孔2ml；EG7：密度为1*10⁵/ml，每孔2ml；)，分别加入不同终浓度(1，10，100，500ng/ml)的人重组CCDC134蛋白和等体积PBS，正常条件培养，分别于铺板后24，48，72小时收集细胞，PBS洗两遍，1500rpm离心5分钟，制备成悬于100μl结合缓冲液(binding buffer)的单细胞悬液，加入终浓度为1μg/ml的FITC-Annexin-V，室温避光反应30分钟后加入终浓度为1μg/ml的PE-PI，根据细胞浓度补上100μl结合缓冲液，立即用FACSCalibur流式分析仪进行细胞凋亡检测。

结果发现重组人CCDC134蛋白对B16和EG7细胞的凋亡没有作用(图7B)。

2.肿瘤细胞体外增殖实验

取常规培养处于对数生长期的细胞铺于96孔板(B16：密度为5*10⁴/ml，每孔100ul；EG7：密度为1*10⁵/ml，每孔100ul；)，分别加入不同终浓度(1，10，100，500ng/ml)的人重组CCDC134蛋白和等体积PBS，正常条件培养，用MTT方法分别检测铺板后0，24，48，72，96小时时细胞的数目，步骤如下：在指定时间，每孔加入10ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h，每孔加入100ul裂解液，37℃过夜，使结晶完全溶解，在酶标仪OD570nm处测量各孔的吸光值，同时需设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)。

结果发现重组人CCDC134蛋白对B16和EG7细胞的增殖没有作用(图7B)。

3.SCID-beige鼠成瘤模型

我们利用T，B淋巴细胞功能丧失，NK细胞功能低下的SCID-beige小鼠做了相同的B16体内成瘤实验(成瘤方法见实施例6)，6天后同样出现肿瘤。结果如图7A，给予重组人CCDC134蛋白腹腔注射治疗组，肿瘤体积未见明显改变，肿瘤生长与对照组一致，未见减缓。

综上，我们发现重组人CCDC134蛋白对B16和EG7细胞的凋亡，增殖没有作用，并且CCDC134的抑瘤效应在荷瘤动物免疫缺陷的情况下消失，提示重组人CCDC134蛋白对肿瘤细胞无直接杀伤作用，而是通过免疫系统发挥抗肿瘤效应。实施例8：肿瘤组织中浸润免疫细胞分析

肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes，TILs)是指存在于肿瘤间质内以T淋巴细胞为主的一种异质性淋巴细胞群体，是机体淋巴细胞侵入到肿瘤组织中，并对肿瘤起抵抗作用的一群细胞，它们产生的抗肿瘤效应主要是细胞免疫反应。并且已有报道证实，TILs与黑色素瘤的预后极其相关，是转移性黑色素瘤细胞治疗的关键(Journal of Clinical Oncology，2007ASCO Annual Meeting Proceedings Part I.Vol 25，No.18S(June 20 Supplement)，2007：8519.)。因此，我们分析了重组人CCDC134蛋白给药后，对肿瘤组织中TIL数量和免疫细胞亚群比例的影响。

同前述方法，C57BL/6小鼠皮下接种B16或EG7细胞并给予重组人CCDC134蛋白治疗，待对照组肿瘤体积达到1500mm³时，处死小鼠完整取下肿瘤组织，剪碎，研磨，在含有(EG7)或不含有(B16)胶原酶I(终浓度：1mg/ml)和DNA酶I(终浓度0.5mg/ml)的RPMI 1640中于37孵育2小时，过150目筛网得到单细胞悬液并计数肿瘤细胞数。之后采用percoll密度梯度离心的经典方法从该悬液中分离淋巴细胞，对于EG7肿瘤得到的单细胞悬液，用3ml 40％的percoll重悬，轻轻铺于3ml 60％的percoll之上；对于B16肿瘤得到的单细胞悬液，用4ml 80％的percoll重悬，铺于管底，在之上依次轻轻铺上2ml 60％和2ml 40％的percoll，400g无刹车离心30分钟，吸净淋巴细胞层的细胞，计数该层总细胞数，用PBS洗两遍，之后按前述方法进行胞膜染色，用FACS检测分析相关指标。

结果如图8，与之前结果一致，CCDC134能够抑制恶性肿瘤B16和EG7的生长；浸润免疫细胞分析显示，与PBS对照组相比，20ug重组人CCDC134蛋白治疗组，肿瘤组织中有更多的免疫细胞细胞浸润(1.63 vs 11.2*10⁴/10⁷total B16 tumor cells；13 vs 68*10⁴/10⁷ total EG7 tumor cells)，具体到各种免疫细胞亚群，在B16和EG7这两种肿瘤模型中，变化趋势一致。以黑色素瘤细胞B16模型为例，浸润免疫细胞中，NK细胞比例很低，对照组与实验组数目变化不大；浸润细胞以淋巴细胞为主，两组相比，B/T比例分别为2.56和4.43，其中，B淋巴细胞增高明显(7.3倍)，CD8⁺T/CD4⁺T比例倒置(0.65vs0.94)，CD4⁺T淋巴细胞有一定的增高(4.5倍左右)，而CD8+T淋巴细胞增高明显(7.5倍)，说明重组人CCDC134蛋白可促进B16，EG7恶性肿瘤中TILs的浸润，以CD8⁺T和B淋巴细胞为主。

Claims (3)

1.人类细胞因子CCDC134的基因或蛋白质作为制备治疗肿瘤的药物的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其中所述的肿瘤是淋巴细胞瘤或黑色素细胞瘤。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述治疗肿瘤是通过免疫系统治疗肿瘤的。

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