HU217803B - Új citokin - Google Patents

Új citokin Download PDF

Info

Publication number
HU217803B
HU217803B HU9301330A HU133093A HU217803B HU 217803 B HU217803 B HU 217803B HU 9301330 A HU9301330 A HU 9301330A HU 133093 A HU133093 A HU 133093A HU 217803 B HU217803 B HU 217803B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
ctg
leu
protein
pro
arg
Prior art date
Application number
HU9301330A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9301330D0 (en
HUT66624A (en
Inventor
Ichiro Kawashima
Kenji Miyadai
Jun Oshumi
Yo Takiguchi
Original Assignee
Sankyo Co. Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26343378&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU217803(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Sankyo Co. Ltd. filed Critical Sankyo Co. Ltd.
Publication of HU9301330D0 publication Critical patent/HU9301330D0/hu
Publication of HUT66624A publication Critical patent/HUT66624A/hu
Publication of HU217803B publication Critical patent/HU217803B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5431—IL-11
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Emberi csontvelő kötőszöveti sejtjeiből izolált mRNS segítségévelcDNS-t készítettek, melyet klónozás után emlőssejtekben expresszáltak.A sejttenyészet felülúszójában adipogenezist gátló aktivitást fedeztekfel, majd a szóban forgó tulajdonsággal rendelkező fehérjét asejttenyészet felülúszójából izolálták és tisztították. Ez a fehérjereduktív körülmények között végzett SDS–PAGE-vizsgálat során 23 000 Damolekulatömegűnek mutatkozott, és az Edman-lebontással végzett N-terminális aminosavszekvencia-meghatározás szerint N-terminálisaprolin. Mindezek és a génklónozás eredményeképp a fehérje teljeselsődleges szerkezetét felderítették, és bebizonyították, hogy aszóban forgó fehérje új szerkezetű, adipogenezist gátló aktivitássalrendelkező citokin. Az új, adipogenezist gátló faktor rekombináns DNS-technológia alkalmazásával a találmánynak megfelelően nagymennyiségben állítható elő, lehetővé téve így a különféle citopéniákés más betegségek kezelését és diagnosztizálását. ŕ

Description

A találmány olyan új, egységes fehérje előállítására vonatkozik, amely képes a sejtek adipocitákká való differenciálódását gátolni, képes az adipocitákban a lipoprotein-lipázt (LPL) gátolni és/vagy képes kolóniastimuláló faktort (CSF) indukálni. A találmány tárgyát képezi továbbá a szóban forgó fehérjét kódoló DNS, az ezen DNS-t tartalmazó rekombináns DNS-expressziós vektor, az ezzel a rekombináns vektorral transzformált gazdaszervezet, valamint a szóban forgó fehérje hatásos mennyiségét tartalmazó készítmény.
Közismert tény, hogy az élő szervezetben a vérsejtek képződéséhez elengedhetetlenül szükség van a csontvelő vérsejtképződést elősegítő kötőszöveti sejtjeire, a vérképző őssejtekre és különböző vérsejtképző faktorokra, vagyis a vérsejtképző mikrokömyezetre. Embernél a születéskor aktív vérsejtképződés folyik a csontvelőben a test minden részén. Amikor azonban a felnőtté válás után a vérsejtképződésre már nincs ennyire szükség, a csontvelőt fokozatosan elfoglalják az adipociták, a végtagok végétől kezdődően, a velőcsatomában lévő üres rész megnövekedése következtében. A csontvelőnek azt a részét, amelyben vérképződés folyik, vörös csontvelőnek, azt a részt pedig, ahol a csontvelő helyét adipociták foglalták el, sárga csontvelőnek nevezik. Amikor a vérképződés folyamata vérzés vagy hemolízis miatt felgyorsul, a vérképződés újraindul a sárga csontvelőben [Kashiwamura, M., „IGAKU NO AYUMI (History of Medicine)”, 146., 264-268. (1988)].
A vérképző mikrokömyezetben vérsejtképző funkciót betöltő sejtek elsődlegesen preadipociták. Ismeretes, hogy amikor ezek a sejtek adipocitákká differenciálódnak, elvesztik ezt a képességüket [Kodama, H., „SOSHIKI BAIYO (Tissue Culture)”, 12., 191-195. (1986)].
A PA6 jelű, egércsontvelő típusú preadipocita-sejtvonal például képes elősegíteni a vérképző őssejtek szaporodását. Amikor azonban ezek a sejtek adipocitákká differenciálódtak, ez az aktivitás elenyészik [Kodama, H. etal., J. Cell. Physiol. 118., 233-240. (1984)]. Ismeretes, hogy a blasztsejtek, a megakariocita- és a makrofágkolóniák indukálhatók, midőn PA6 sejteket és egércsontvelősejteket együtt tenyésztenek [Kodama, H., „JIKKEN IGAKU (Experimental Medicine)”, 5., 826-830. (1987)]. Az adipogenezis gátlására képes fehérje így a csontvelő preadipocitáira és adipocitáira hat, elősegítvén vérsejtképző képességüket, avagy más szavakkal azt a tulajdonságukat, hogy leukocitákat, makrofágokat és trombocitákat (melyek a megakariocitákban képződnek) indukáljanak.
A szakirodalomból ismeretes [Nakamura, M. et al., Proc. Soc. Exp. Bioi. Med., 179., 283-287. (1985)] az is, hogy az egércsontvelő eredetű Η - 1/A preadipocitasejtvonalban képződő CSF-mennyiség csökken, midőn ezek a sejtek adipocitákká differenciálódnak.
Az alábbiakban ismertetendő módon a találmány szerinti adipogenezist gátló faktor úgy hat a Η- 1/A preadipocita-sejtvonalra, hogy fokozza a makrofágkolóniastimuláló faktor (M-CSF) termelését. A monocitákra és a makrofágokra gyakorolt stimuláló hatásán túlmenően az M-CSF megakariocitapotenciátorként (Meg-PÓT) is képes működni [Teramura, M. et al., Int. J. Cell. Cloning, 8., 245-252. (1990)]. Ismeretes az is, hogy az M-CSF a monocitákra úgy hat, hogy Meg-POT-termelő képességüket fokozza. A klinikai terápiás adatok jelzik továbbá azt is, hogy az M-CSF elősegíti a rákellenes kemoterápiás kezelést követő neutropéniából és trombocitopéniából való felépülést [Motoyoshi, K., „GAN TO KAGAKURYOHO (Cancer and Chemotherapy)”, 16., 3531-3536. (1986)].
így a találmány szerinti adipogenezist gátló faktor úgy hat a csontvelőre, illetve a perifériális preadipocitákra és adipocitákra, hogy fokozza képességüket a vérsejtképződés támogatásában.
A találmánynál korábbról ismert adipocitadifferenciálódást, valamint az adipocitákban az LPL működését gátló hatással rendelkező fehéijék például tumomekrózis-faktor-α (TNFa) [Price, S. R. et al., Arch. Biochem. Biophys., 251., 738-746. (1986) és Kawakami, M. et al., J. Biochem. 101., 331-338. (1987)]; interleukin-1 (IL—1) [Beutler, B. A. and Cerami, A., J. Immunoi., 135., 3969-3971. (1985)]; interferonok (IFN) [Keay, S. and Grossberg, S. E., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4099-4103. (1980) és Patton, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83., 8323-8317. (1986)]; leukémiagátló faktor (LIF) [Móri, M. et al., Biochem. Biophys. Rés. Commun., 160., 1085-1092. (1989)]. Ezeknek a faktoroknak a cDNS-eit már mind klónozták és teljes szerkezetüket felderítették.
Közlemény jelent meg a találmány bejelentésének napja előtt, mely a majominterleukin-11 prekurzor cDNS izolálását és expresszióját ismerteti, beszámolva plazmacitóma-növekedést és megakariocitakolónia-képződést stimuláló hatás felfedezéséről a tenyészet felülúszójában [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87., 7512-7516. (1990)], azonban ez nem áll közvetlen összefüggésben a találmánnyal, minthogy a közlemény nem specifikálja világosan sem a majom interleukin-11 pontos azonosítását, sem a humán interleukin-11 expressziójának és aktivitásának igazolását.
Olyan egységes fehérjét fedeztünk fel, amely elsődlegesen azzal a hatással rendelkezik, hogy gátolja a sejtek adipocitákká történő differenciálódását, gátolja az adipocitákban a lipoprotein-lipázt (LPL), és indukálja a kolóniastimuláló faktort (CSF) (CSF-indukáló faktor), valamint kidolgoztuk ennek a fehérjének nagyléptékű előállítását génmanipulációs módszerek alkalmazásával, és eredményeiket találmányban foglaltuk össze.
A találmány az adipogenezist gátló faktor nagy mennyiségének előállítását teszi lehetségessé. A szóban forgó faktor, mint olyan, eredményesen használható különböző anémiák és más vérbetegségek kezelésére és diagnosztizálására. A szóban forgó faktor alkalmazható például aplasztikus anémia, toxin vagy sugárzás okozta leukopénia, vírus-, baktérium-, illetve parazitafertőzések, valamint csontvelő-átültetést, illetve karcinosztatikus kemoterápiát követően fellépő citopénia esetén. A szóban forgó faktor alkalmazható továbbá vértranszfúziós összetevők konzerválására, ami jelenleg nagy méretekben folyik. Ezeken az immunkompetenciát fokozó hatásokon túl a találmány szerinti faktor
HU 217 803 Β felhasználható a kóros elhízás megakadályozására és gyógykezelésére is.
A „citopénia” a találmány szerinti értelemben valamennyi felsorolt betegségre, valamint az ezekkel kapcsolatban előforduló különféle immunbetegségekre vonatkozik. „Citopénia amelioráns” az általános neve azoknak a gyógyszereknek, melyek hatásosnak mutatkoznak a citopénia megelőzésében és kezelésében.
Az olyan aktivitások mindegyikére, amelyek legalább egyik jellemzője: a preadipocitasejtek adipocitákká való morfológiai differenciálódásának megakadályozása; az adipocitákban a lipoprotein-lipáz (LPL) gátlása; és a preadipociták CSF-termelő képességének fenntartása vagy fokozása, vonatkozik az „adipogenezist gátló aktivitás”, és az olyan fehérje, amely ilyen aktivitással rendelkezik, „adipogenezist gátló faktor”.
A találmány tárgya:
1. génmanipulációval előállított fehérje, amely alapvetően nem tartalmaz más, emberi eredetű fehérjét, adipogenezist gátló aktivitással rendelkezik és az alábbi tulajdonságokat mutatja:
1. látszólagos molekulatömege 23 000 Da (SDS poliakrilamidgél-elektroforézissel, redukálókörülmények között, 12,5%-os gélben),
2. N-terminális első tíz aminosavjának sorrendje megfelel a szekvencialista 2. számú szekvenciájában közöltnek, és
3. gyenge kationcserélővei végzett kromatografálás során 220 és 290 mmol/1 NaCl-koncentráció között eluálódik az alábbi körülmények között:
a) CM-Toyopearl Pack 650M (2,2x20 cm, Tosoh Corporation) oszloptöltet,
b) eluens: A oldat [10 mmol/1 bórsav-NaOH (pH 9,0), 13 mmol/1 KC1], B oldat (300 mmol/1 NaCl-tartalmú A oldat),
c) áramlási sebesség: 3 ml/perc,
d) lineáris koncentrációgradiens 100% A oldattól 100% B oldatig 50 perc alatt;
2. génmanipulációval előállított fehérje, amely alapvetően nem tartalmaz más, emberi eredetű fehérjét, adipogenezist gátló aktivitással rendelkezik, és aminosavsorrendje megfelel a szekvencialista 2. számú szekvenciájában szereplő 1 és 178 közötti aminosavsorrendnek;
3. az 1. vagy 2. pont szerinti fehérje, melynek Nterminálisán hidrogénatom, vagy metionin van;
4. az 1., 2. vagy 3. pont szerinti fehérjét kódoló DNS;
5. az 1. vagy 2. pont szerinti fehérjét kódoló DNS, amelynek nukleotidszekvenciája megegyezik a szekvencialista 1. számú szekvenciájában szereplő 81 és 614 közötti nukleotidszekvenciával;
6. a 4. vagy 5. pont szerinti DNS, melynek 5’-vége ATG;
7. olyan rekombináns DNS-expressziós vektor, amely tartalmazza a 4., 5. vagy 6. pont szerinti DNS-t, és a szóban forgó DNS expresszálható és replikálható;
8. a 7. pont szerinti expressziós vektorral transzformáit gazdaszervezet;
9. eljárás fehérje előállítására, melynek lépései a következők :
- az 1., 2. vagy 3. pont szerinti fehérjét kódoló DNS-t expresszálható és replikálható módon tartalmazó, rekombináns DNS-expressziós vektorral transzformált gazdaszervezet tenyésztése és
- a szóban forgó fehérje kinyerése a sejtekből és/vagy a tenyészet felülúszójából;
10. gyógyszerkészítmény, amely terápiásán hatásos mennyiségben tartalmazza az 1., 2. és/vagy a 3. pont szerinti fehérjét, gyógyászatilag elfogadható hordozóés vivőanyagokkal együtt;
11. citopénia amelioráns, amely terápiásán hatásos mennyiségben tartalmazza az 1., 2. és/vagy a 3. pont szerinti fehérjét, gyógyászatilag elfogadott hordozó- és vivőanyagokkal együtt;
12. elhízás elleni készítmény, amely terápiásán hatásos mennyiségben tartalmazza az 1., 2. és/vagy 3. pont szerinti fehérjét, gyógyászatilag elfogadott hordozó- és vivőanyagokkal együtt;
13. terápiás vagy preventív módszer, amely megakadályozza a preadipociták adipocitákká történő differenciálódását az 1., 2. és/vagy 3. pont szerinti fehérjék terápiásán hatásos mennyiségének citopéniás betegeken való alkalmazásával; valamint
14. terápiás vagy preventív módszer, amely megakadályozza a preadipociták adipocitákká történő differenciálódását az 1., 2. és/vagy 3. pont szerinti fehérjék terápiásán hatásos mennyiségének elhízott betegeken való alkalmazásával.
A találmány szerinti fehérje előnyösen a 2. pont szerinti fehérje, a találmány szerinti DNS pedig előnyösen a 2. pont szerinti fehérjét kódoló DNS.
Az 1. pont szerinti fehérje másképpen a következő módon definiálható:
15. génmanipulációval előállított fehérje, amely alapvetően nem tartalmaz más, emberi eredetű fehérjét, adipogenezist gátló hatású, és az alábbi tulajdonságokkal rendelkezik:
1. látszólagos molekulatömege 23 000 Da (SDS poliakrilamidgél-elektroforézissel, reduktív körülmények között, 12,5%-os gél alkalmazásával);
2. N-terminális aminosavsorrendje (N)-Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val, és
3. gyenge kationcserélőn kromatografálva 220 és 290 mmol/1 NaCl-koncentráció-tartományban eluálódik a következő körülmények között:
a) oszloptöltet: CM-Toyopearl Pack 650M (2,2 χ 20 cm Tosoh Corporation);
b) eluens: A oldat (10 mmol/1 bórsav-NaOH (pH 9,0), 13 mmol/1 K.C1) és B oldat (300 mmol/1 NaCl-tartalmú A oldat);
c) áramlási sebesség: 3 ml/perc;
d) lineáris gradiens 100% A oldattól 100 B oldatig 50 perc alatt.
A 2. pont szerinti fehérje másképpen a következő módon definiálható:
16. génmanipulációval előállított fehérje, amely alapvetően nem tartalmaz más, emberi eredetű fehérjét, adipogenezist gátló hatású, és aminosavsorrendje a következő :
HU 217 803 Β
(N)
Pro G1 y Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Va 1 Ser Pro As p Pro Arg
Al a Glu Leu As p Ser Thr Val Leu Leu Thr Arg Ser Le u Leu Al a
As p Thr Arg Gin Leu Al a Al a Gin Leu Arg Asp Ly s Phe Pro Al a
As p Gly As p Hi s Asn Leu As p Ser Leu Pro Thr Le u Al a Me t Ser
Al a Gly Al a Leu Gly Al a Leu Gin Leu Pro Gly Va 1 Le u Thr Arg
Leu Arg Al a As p Leu Leu Ser Tyr Leu Arg Hi s Va 1 Gin Trp Leu
Arg Arg Al a Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu
Gly Thr Leu Gin Al a Arg Leu As p Arg Le u Leu Arg Arg Leu Gin
Leu Leu Me t Ser Arg Leu Al a Leu Pro Gin Pro Pro Pro As p Pro
Pro Al a Pro Pro Leu Al a Pro Pro Ser Ser A1 a Trp Gly Gly I 1 e
Arg Al a Al a Hi s Al a I 1 e Leu Gly Gly Leu H i s Leu Thr Leu As p
Trp Al a Va 1 Arg Gly Leu Leu Leu Leu I. szekvencia Ly s Thr Arg Le u -(C)
Az 5. pont szerinti DNS másképpen a következő módon definiálható: a 17., a 15. vagy 16. pont szerinti fehérjét kódoló DNS, amelynek bázissorrendje a következő:
CCT GGC CCC CCT CGA GTT TCC CCA GAC CCT (5’)- CGG CCT GCC GGG GAG CCA CTG CCA GAC
AGC ACC GTG CTG CTG ACC CGC TCT CTC CTG GCG GAC ACG CGG CAG
CTG GCT GCA CAG CTG AGG GAC AAA TTC CCA GCT GAC GGG GAC CAC
AAC CTG GAT TCC CTG CCC ACC CTG GCC ATG AGT GCG GGG GCA CTG
GGA GCT CTA CAG CTC CCA GGT GTG CTG ACA AGG CTG CGA GCG GAC
CTA CTG TCC TAC CTG CGG CAC GTG CAG TGG CTG CGC CGG GCA GGT
GGC TCT TCC CTG AAG ACC CTG GAG CCC GAG CTG GGC ACC CTG CAG
GCC CGA CTG GAC CGG CTG CTG CGC CGG CTG CAG CTC CTG ATG TCC
CGC CTG GCC CTG CCC CAG CCA CCC CCG GAC CCG CCG GCG CCC CCG
CTG GCG CCC CCC TCC TCA GCC TGG GGG GGC ATC AGG GCC GCC CAC
GCC ATC CTG GGG GGG CTG CAC CTG ACA CTT GAC TGG GCC GTG AGG
GGA CTG CTG CTG CTG AAG ACT II. CGG CTG szekvencia -(3’ )
A találmány szerinti DNS-ek előállíthatok például adipogenezist gátló aktivitású fehéijét kódoló mRNS elkülönítésével olyan emlőssejtekből, melyek képesek a szóban forgó fehérje termelésére, majd az mRNS-ről ismert módon kettős láncú cDNS-t készítve. Jóllehet a találmány szerint előnyösen a humán csontvelő kötőszöveti eredetű KM-102 sejtvonal [Harigaya, K. and Handa, H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82., 3477-3480, (1985)] sejtjei szolgálnak a szóban forgó mRNS forrásául, nemcsak tumorsejtek, hanem emlősökből izolált sejtek és szövetek, valamint más sejtvonalak is használhatók erre a célra.
Az mRNS kinyerésére mind a guanidin-tiocianátforró fenol, mind pedig a guanidin-tiocianát-guanidinHCl-módszer alkalmas, legkedvezőbb a guanidin-tiocianát-cézium-klorid-módszer.
Mivel az eukariótasejtek citoplazmájában lévő mRNS-ek zöme - mint ismeretes - poli-A szekvenciát hordoz a 3’-végén, ezt a jellemzőjüket kihasználva oligo(dT) cellulóz oszlopon megköthetők, majd elúcióval tisztíthatók. Az így kapott mRNS tovább frakcionálható szacharózsűrűséggradiens-centrifugálással vagy más hasonló módon.
Annak érdekében, hogy igazoljuk az így kapott mRNS-adipogenezist gátló fehérje kódolótulajdonságát, fehérjét kell átírnunk róla a fiziológiai aktivitás vizsgálatához vagy a szóban forgó fehérjére specifikus antitesttel történő azonosításhoz. Ez megoldható például az mRNS-nek afrikai levelibéka (Xenopus laevis) petesejtjébe történő injektálásával, a fehérje átírása érdekében [Gurdon, J. B. et al., Natúré, 233., 177-182. (1972)], vagy olyan transzlációs rendszerek alkalmazásával, mint a nyúlretikulocita-lizátum vagy a búzacsíra-kivonat [Schleif, R. F. and Wensink, P. C. (1981), „Practical Methods in Molecular Biology”, Springer Verlag, NY],
Az adipocitogenezist gátló aktivitás kimutatása történhet a preadipociták adipocitákká differenciálódását kísérő morfológiai változást visszaszorító aktivitás mérésével, például a 3T3-L1 egérsejtvonal alkalmazásával, vagy az LPL-aktivitás mérése alapján [Beutler, B. A. et al.,3. Immunoi., 135., 3972-3977. (1985)].
Miután az mRNS-templátról reverz transzkriptázzal egy láncú cDNS készült, a kettős láncú cDNS ennek felhasználásával szintetizálható. Jóllehet ez a szintézis kivitelezhető többek között az SÍ nukleázmódszerrel [Efstratiadis, A. et al., Cell, 7., 279-288. (1976)], a Land-módszerrel [Land, H. et al., Nucleic Acid Rés.,
9., 2251-2266. (1981)], valamint az O. Joon Yoo-módszerrel [Yoo, O. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
79., 1049-1053. (1983)], a legelőnyösebb azonban az Okayama-Berg-módszer [Okayama, H. and Berg, P., Mól. Cell Bioi., 2., 161-170. (1982)] alkalmazása a találmány célja érdekében.
HU 217 803 Β
Ezt követően a keletkező rekombináns plazmidot Escherichia coli sejtbe, például a DH5a törzs sejtjeibe juttatjuk a szóban forgó gazdaszervezet transzformálására. A kívánt rekombináns szelektíven megkapható tetraciklin- vagy ampicillinrezisztencia-marker alkalmazásával. Escherichia coli gazdasejt használata esetén a transzformáció kivitelezhető például Hanahan módszerével [Hanahan, D., J. Mól. Bioi., 166., 557-580. (1983)]. Pontosabban a transzformáció kivitelezhető a szóban forgó rekombináns DNS-t olyan kompetens sejtekhez adva, melyeket kalcium-klorid, magnézium-klorid vagy rubídium-klorid jelenlétében készítettünk elő. Adott esetben plazmid helyett lambda-fág eredetű vektorok is használhatók.
Az alábbiakban közölt különböző módszerek a fentiek szerinti módon kapott, transzformált gazdaszervezet azon törzsének szelekciójára alkalmasak, mely hordozza a kívánt, adipogenezist gátló faktort kódoló DNS-t.
1. Szűrővizsgálati módszer szintetikus oligonukleotid-próba alkalmazásával
Midőn a kívánt fehérje aminosavsorrendje teljesen vagy részben (a kívánt fehérje bármely olyan szakasza, amely többszörösen ismétlődő specifikus szekvenciából áll), vagy teljesen felderített, a szóban forgó aminosavaknak megfelelő oligonukleotid szintetizálható (a nukleotidszekvencia a kodonhasznosítási frekvencia alapján tervezhető, avagy olyan ismétlődő nukleotid szekvenciákból áll, amelyekben a lehetséges nukleotid szekvenciák keverednek. Utóbbi esetben a szóban forgó szekvenciák száma inozin beépítésével csökkenthető). Ez oligonukleotid-próbaként használva (32P vagy 35S jelöléssel) a transzformált törzs cellulóz-nitrát-szűrőmembránon immobilizált, denaturált DNS-ével hibridizálva lehetőséget ad a pozitív eredményt adó törzs megkeresésére és kiválasztására.
2. Szűrővizsgálati módszer polimeráz láncreakcióval előállított próba alkalmazásával
Midőn a célfehérje aminosavsorrendje részben vagy teljesen ismert, a szóban forgó aminosavak egy részletének megfelelő oligonukleotid-szakasz mindkét szála szintetizálható. Polimeráz láncreakciót [Saiki, R. K. et al., Science, 239., 487-491. (1988)] végezve ennek az oligonukleotidnak a használatával a kívánt, adipogenezist gátló faktort kódoló DNS-fragmens amplifikálódik. Ehhez a művelethez templátként az adipogenezist gátló faktor termelésére képes sejtből származó mRNS-ről reverz transzkriptázzal készült cDNS vagy az eredeti genom DNS egyaránt felhasználható. Az így előállított DNSfragmens 32P vagy 35S jelölését követően a kívánt kiónt kolónia- vagy plakkhibridizáció kivitelezésével választjuk ki, ajelölt DNS-fragmenst próbaként alkalmazva.
3. Szűrővizsgálat adipogenezist gátló faktor más állati sejt segítségével történő előállítása révén
A kívánt, adipogenezist gátló faktort kódoló cDNS-t tartalmazó törzs oly módon is kiválasztható, hogy az eredeti transzformált törzs sejtjeit tenyésztjük, a gént amplifikáljuk, majd állati sejteket fertőzünk vele (ebben az esetben akár transzkripcióspromoter-régiót tartalmazó, önreplikációra képes plazmid, akár pedig az állati sejt kromoszómájába integrálódni képes plazmid alkalmazása szóba jöhet), termeltetjük a gén által kódolt fehérjét, és mérjük a sejtben és/vagy a tenyészet felülúszójában az adipogenezist gátló aktivitást, vagy másképpen, specifikus antitesttel mutatjuk ki az adipogenezist gátló faktort.
4. Szűrővizsgálati módszer adipogenezist gátló faktorra specifikus antitest alkalmazásával
A kívánt törzs kiválasztása úgy is történhet, hogy az előzetesen expressziós vektorba épített cDNS segítségével a transzformánsban fehérjét termeltetünk, és a kívánt, adipogenezist gátló faktort termelő transzformánst adipogenezist gátló faktorra specifikus antitest, majd egy, az előző antitestre specifikus második antitest alkalmazásával azonosítjuk.
5. Szűrővizsgálati módszer szelektív hibridizációstranszlációs rendszer alkalmazásával
Ebben a módszerben a transzformánsból származó cDNS-t cellulóz-nitrát-szűrőmembránon megkötve adipogenezist gátló faktort termelő sejtből származó mRNS-sel hibridizáljuk, a cDNS-hez kötődött mRNS-t leválasztjuk és kinyerjük. Az így nyert mRNS-t fehérjetranszlációs rendszerbe - például afrikailevelibéka-petesejt - injektálva vagy sejtmentes transzlációs rendszerhez - például nyúlretikulocita-lizátumhoz vagy búzacsíra-kivonathoz - adva megvizsgáljuk a keletkező fehérje adipogenezist gátló aktivitását, vagy másképpen az adipogenezist gátló faktort a rá specifikus antitest alkalmazásával kimutatva választjuk ki a kívánt törzset.
A későbbiekben ismertetendő példákban egy előzetes, a citokinek mRNS-ében általánosan előforduló AUUUA motívum alapján tervezett szintetikus oligonukleotid-próbával végzett [Shaw, G. and Kamen, R., Cell, 46., 659-667. (1986)] szűrővizsgálat után a kívánt transzformáns kiválasztása a pozitív eredményt adók közül a fentiekben ismertetett 3. módszer alkalmazásával történt, azaz pontosabban adipogenezist gátló faktornak más állati sejtben való előállításával és ezt követő szkrineléssel.
Az így előállított és kiválasztott transzformánsból az adipogenezist gátló faktort kódoló DNS ismert módon kinyerhető [Maniatis, T. et al., „Molecular Cloning - A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1982)]. Történhet ez például a sejtekből plazmid DNS preparálásával, majd a szóban forgó plazmidból a cDNS-szakasz izolálásával.
Az így kapott DNS szekvenciája meghatározható olyan ismert módszerekkel, mint például a MaxamGilbert-féle kémiai módosításos eljárás [Maxam, A. M. and Gilbert, W., „Methods in Enzymology”, 65., 499-559. (1980)] vagy a didezoxinukleotidlánc-terminációs módszer, M13 fág alkalmazásával [Messing, J. and Vieira, J., Gene, 19., 269-276. (1982)].
Az adipogenezist gátló faktort kódoló fragmenst alkalmas DNS-vektorba visszaillesztve, más prokariótaés eukariótasejtek transzformálhatok. Továbbmenve, alkalmas promoter és az expressziót befolyásoló szekvencia beépítésével ezekbe a vektorokba, a gén expreszszálható az adott gazdasejtekben.
HU 217 803 Β
A prokarióta-gazdasejtek lehetnek például egyebek között Escherichia coli és Bacillus subtilis sejtek. A számunkra érdekes génnek ezekben a gazdasejtekben való expressziója érdekében a gazdasejteket olyan replikonnal transzformáljuk, amely a gazdaszervezettel kompatibilis fajból származik, azaz olyan plazmidvektorral, amely tartalmaz replikációs origót és szabályozószekvenciákat. Kívánatos továbbá, hogy a vektor olyan szekvenciát is tartalmazzon, amely a transzformált sejteket szelektálható expressziós tulajdonsággal (fenotípus) ruházza fel.
Az Escherichia coli KI2 törzs például gyakran használatos gazdaszervezetként, a pBR322 és pUC plazmidok pedig megszokott vektorok. A találmány azonban nem korlátozódik ezeknek a használatára, hanem bármely ismert, különféle baktériumtörzs és vektor alkalmazásával kivitelezhető. A promoterekre példák egyebek között a triptofán (trp) promoter, a laktóz (lac) promoter, a triptofán-laktóz (tac) promoter, a lipoprotein (lpp) promoter, a bakteriofág eredetű lambdaPL promoter, valamint Tu polipeptidlánc-hosszabbító (tufB) promoter Escherichia coliban. Ezeknek a promotereknek bármelyike felhasználható a találmány szerinti, adipogenezist gátló faktor előállítására.
A Bacillus subtilis törzsek esetében előnyösen használható a 207-25 jelű promoter, vektorként pedig a pTUB228 plazmid [Ohmura, K. et al., J. Biochem., 95., 87-93. (1984)]. Mindazonáltal a találmány nem korlátozódik csupán ezeknek az alkalmazására. Promoterként gyakran használatos a Bacillus subtilis a-amilázgénjének szabályozószakasza. Kívánt esetben a fehérjének a sejtből való szekretálása is megoldható, például az α-amiláz szignálpeptid-szekvenciáját kódoló DNSszakasz alkalmazásával.
Az eukarióta-gazdasejtek származhatnak gerincesekből, rovarokból, élesztőkből stb. Jóllehet a COSsejtek, melyek majomból származnak [Gluzman, Y., Cell, 23., 175-182. (1981)], valamint a dihidrofolát deficiens CHO-sejtek, melyek kínaihörcsögpetefészeksejtekből erednek [Urlaub, G. and Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77., 4216-4220. (1980)] gyakran használt gerincessejtek, a találmány nem korlátozódik csupán ezekre.
A gerincessejtekben használható vektorok az expresszálandó gén előtt elhelyezkedő promoterszekvenciát, valamint RNS kötőhelyet, poliadenilálási helyet vagy transzkripciós terminációs szekvenciát stb. tartalmaznak. A vektor szükség esetén tartalmazhat replikációs origót is. Expressziós vektorra példa lehet a pSV2dhfr, amely az SV40 korai promoterét tartalmazza [Subramani, S. et al., Mól. Cell Bioi., 1., 854-864. (1981)]. A találmány azonban nem korlátozódik csak erre az expressziós vektorra.
Az élesztő széles körben használt eukariótamikroorganizmus-gazdaszervezet. Pontosabban a Saccharomyces fajok, mint például a Saccharomyces cerevisiae alkalmazhatók előnyösen. Az eukariótamikroorganizmusokban, így az élesztőben használható expressziós vektoroknál például az alkohol dehidrogenáz gén promoterét [Bennetzen, J. L. and Hall, B. D., J. Bioi.
Chem., 257., 3018-3025. (1982)], vagy a savas foszfatáz gén promoterét [Miyanohara, A. et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 80., 1-5. (1983)] alkalmazzák.
Tekintettel a gazdasejtekre, a COS-sejteket véve példának, a COS-sejtekben használható expressziós vektorként olyan, autonóm replikációra képes vektor jöhet szóba, amely rendelkezik SV40 replikációs origóval, transzkripciós promoterrel, transzkripciós terminációs szignállal és RNS kötőhellyel. A szóban forgó vektor bejuttatható a COS-sejtekbe a DEAE-dextrán módszerrel [Luthman, H. and Magnusson, G., Nucleic Acid Rés., 11., 1295-1308. (1983)], a kalcium-foszfátDNS koprecipitációs módszerrel [Graham, F. L. and van dér Ed, A. J., Virology, 52., 456-457. (1973)] vagy elektroporációval [Neumann, E. et al., EMBO J., ]., 841 -845. (1982)], létrehozva így a kívánt transzformáit sejteket. Emellett a CHO-sejtek gazdasejtekként való alkalmazása esetén az adipogenezist gátló faktort stabilan termelő transzformánsok úgy is előállíthatók, hogy az expressziós vektorral és egy, a neogén expreszsziójára képes és így G418 markerként funkcionáló másik vektorral, amilyen például a pRSVneo [Sambrook,
J. et al., „Molecular Cloning - A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1989)] vagy a pSV2neo [Southern, P. J. and Berg, P., J. Mól. Appl. Génét., 1., 327-341. (1982)] kotranszfekciót végzünk, majd a G418 rezisztens kolóniákat szelektáljuk.
Az így nyert, kívánt transzformáns hagyományos módon tenyészthető, és az adipogenezist gátló faktor termeltethető akár a sejtben, akár azon kívül. Az említett tenyésztés során a rendelkezésre álló sokféle táptalajból célszerűen azt választjuk, amelyik az adott gazdaszervezetnek a legmegfelelőbb. A fentiekben említett esetre vonatkozóan, midőn COS-sejtek kerültek alkalmazásra gazdasejtként, a használható táptalaj lehet egyebek között RPMI-1640 vagy Dulbecco-féle módosított Eagles minimáltáptalaj (DMEM), melyet szükségképpen szérumkomponenssel, például magzatiborjúszérummal (FBS) egészítünk ki.
Az ilyen módon, a transzformáns sejtekben vagy a sejteken kívül előállított, adipogenezist gátló faktor kinyerhető és tisztítható az ismert eljárások valamelyikével, figyelembe véve az adipogenezist gátló faktor fizikai, kémiai és egyéb tulajdonságait. Az említett módszerek gyakorlati kivitelezése történhet egyebek között közönséges fehérjekicsapással, ultraszűréssel, különféle folyadékkromatográfiás módszerekkel, például gélszűréssel, adszorpciós kromatográfiával, ioncserés kromatográfiával, affínitáskromatográfiával, nagynyomású folyadékkromatográfíával (HPLC), dialízissel, illetve ezek kombinációjával.
A fenti módszer szerint a kívánt, adipogenezist gátló faktor könnyűszerrel gyártható ipari méretben, magas hozammal, nagy tisztaságban. Az így előállított, találmány szerinti, adipogenezist gátló faktor különböző fizikai tulajdonságait részletesen a későbbi példák ismertetik. Ez a faktor biológiai aktivitása következtében különféle területeken használható fel, amint azt korábban leírtuk.
Ahhoz, hogy a találmány szerinti DNS alkalmazásával, génmanipulációs úton, a fentiekben ismertetett mó6
HU 217 803 Β dón előállított anyag adipogenezist gátló aktivitással rendelkezzék, nem okvetlenül szükséges, hogy az anyag tartalmazza a szekvencialista 2. számú szekvenciáján jelzett prekurzor (a -21 és +178 közötti aminosavakat tartalmazó fehérje) valamennyi aminosavját, hanem ennek például csak egy részletét, és ezek az aminosavszekvenciák vannak jelen a találmány szerinti fehérjében, amennyiben az adott szekvencia adipogenezist gátló hatást mutat.
Ilyen, adipogenezist gátló hatással rendelkező fehérje például egy 178 aminosavból álló, N-terminális végén az elsőként Pro maradékot tartalmazó fehérje, amint az a szekvencialista 2. számú szekvenciájában látható, azaz az ilyen fehérjék érett adipogenezist gátló faktornak tekinthetők. Történetesen ez a fehérje 23 000 Da molekulatömegű (SDS poliakrilamidgél-elektroforézissel reduktív körülmények között).
Az érett adipogenezist gátló faktort kódoló DNS a találmány szerinti DNS egyik további példája. Közelebbről, a szóban forgó DNS a szekvencialista 1. számú szekvenciáján szereplő nukleotidszekvencia 81. és 614. bázisok által határolt részlete.
Közismert, hogy az eukariótagének általában polimorfizmust mutatnak, ahogy az interferongén és mások [például Nishi, T. et al., J. Biochem., 97. 153-159. (1985)]. E polimorfizmus eredményeképp egy vagy több aminosav kicserélődhet a fehéijében, de ugyanakkor vannak esetek, amikor a nukleotid szekvencia megváltozása ellenére valamennyi aminosav változatlanul marad.
Még azok a fehérjék is rendelkezhetnek azonban adipogenezistgátlófaktor-aktivitással, amelyeknél kimaradt, beékelődött vagy kicserélődött egy vagy több aminosav legalább egy helyütt az adipogenezist gátló faktor prekurzorának (-21 és +178 közötti aminosavak a szekvencialista 2. számú szekvenciájában) vagy magának az érett adipogenezist gátló faktornak (+1 és + 178 közötti aminosavak a szekvencialista 2. számú szekvenciájában) az aminosavláncában. Az ilyen fehérjékre az adipogenezist gátló faktor ekvivalenseiként utalunk.
Ismeretes például, hogy az a fehérje, amely az interleukin-2 (11-2) génjében egy ciszteinnek megfelelő nukleotid szekvencia szerint kódoló nukleotid szekvenciára való kicserélését követően keletkezik, megtartja IL-2-aktivitását [Wang, A. et al., Science, 224., 1431-1433. (1984)]. Emiatt minden olyan fehérje, legyen akár természetes, akár szintetikus eredetű, amely adipogenezist gátló aktivitással rendelkezik, a találmány tárgyát képezi.
Szintén a találmány tárgyát képezik mindazok a DNS-ek is, amelyek ezeket a fehérjéket kódolják és ekvivalens hatású nukleotid szekvenciával rendelkeznek.
A találmány szerinti különféle DNS-ek előállíthatok hagyományos módon kémiai szintézissel, amilyen például a foszfit-triészter-módszer [Hunkapiller, M. et al., Natúré, 310. 105-111. (1984)] a fentiekben ismertetett adipogenezist gátló faktor adatai alapján.
Történetesen a kívánt aminosavak egyedi kodonjai is ismeretesek. A megfelelő kodon önkényesen kiválasztható és közismert módszerekkel meghatározható [Grandiam, R. et al., Nucleic Acid Rés., 9., r43-r47. (1981)], figyelembe véve például az adott gazdaszervezet kodonhasználati gyakoriságát. Ezekben a nukleotid szekvenciákban részleges kodonváltoztatás hagyományos módszerekkel, például helyspecifikus mutagenezissel [Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
81., 5662-5666. (1984)] előidézhető, a kívánt változtatást kódoló szintetikus oligonukleotidokból álló primer alkalmazásával.
A mellékelt 1. ábra az adipogenezist gátló faktort kódoló cDNS restrikciós térképe, melyen ORF jelöli az „open reading frame”-et.
A 2. ábra az adipogenezist gátló faktort expresszáló plazmid előállításának sémája a leírás 6. példájának megfelelően.
A 3. ábra SDS poliakrilamidgél-elektroforetikus és Western blot-képek, melyek antipeptidantitest alkalmazásával, redukáló körülmények között készültek a pcDL-SRa296 és pSRa20-2 vektorokkal fertőzött COS-1 sejt tenyészetének felülúszójában lévő összfehérjéről.
Az alábbi példák a találmány jobb megértését szolgálják, céljuk semmiképpen sem a találmány körének korlátozása. Elsőnek az adipogenezist gátló aktivitás mérési módszerét ismertetjük részletesen a referenciapéldában.
Referenciapélda
A találmány szerinti módszer az adipogenezist gátló faktor aktivitásának mérésére a következő. A mérés során használt sejt 3T3-L1 egérembriófibroblaszt-sejtvonal [Green, H. and Kehinde, O., Cell, 1. 113-116. (1974)], melyet az American Type Culture Collection-től (ATCC) szereztünk be. Valamennyi sejttenyésztés 37°-on 10% CO2- és 90% levegőtartalmú nedvesített gázelegyben történt. A sejttenyésztést 10% immobilizált FBS (Hyclone) és 10 mmol/1 HEPES pH 7.2 (Sigma) tartalmú A táptalajon (DMEM 4,5 g/1 glükóz, Gibco) végeztük. A 3T3-L1 sejtek adipocitákká való differenciálódását Rubin módszerével indukáltuk [Rubin, C. S. et al., J. Bioi. Chem., 253., 7570-7578. (1978)].
Mérési módszer a 3T3-L1 sejtek adipocitákká történő átalakulásakor bekövetkező morfológiai változást gátló aktivitás értékelésére
A 3T3-L1 sejtek tenyésztése úgy történt, hogy a sejtekből 1,0 χ 104 sejt/ml koncentrációjú szuszpenziót készítettünk A táptalajjal, majd a sejtszuszpenziót 0.5 ml-enként 48 lyukú mikrotitertálcákba (Costar) pipettáztuk. A sejtek 3 nap alatt összefüggő tenyészetet képeztek. A táptalajt ekkor friss A táptalajra cseréltük, és a tenyésztést további két napig folytattuk. Ezután a táptalajt B táptalajra cseréltük, amely az adipogéndifferenciálódást indukálja [DMEM (4,5 g/1 glükóz), 10 mmol/1 HEPES (pH 7,2), 3% nem aktivált FBS, 5 pg/ml marhainzulin (Sigma), 8 pg/ml d-biotin (Sigma), 4 pg/ml pantoténsav (Sigma), 1,0 pmol/l dexametazon (Sigma) és 0,5 pmol/l izobutil-metil-xantin (Aldrich)]. Ezzel egyidejűleg hozzáadtuk a vizsgálandó
HU 217 803 Β mintát. A továbbiakban a táptalajt kétnaponta friss B táptalajra cseréltük, és újabb mintát adtunk hozzá. Az első minta és a B táptalaj-adagolást követő 4-7. napon a táptalajt C táptalajra cseréltük, amely fenntartja az adipocitákat [DMEM (4,5 g/1 glükóz, 5% immobilizált FBS, 10 mmol/1 HEPES (pH 7,2) és 100 ng/1 marhainzulin].
A C táptalajon végzett további két nap tenyésztés után a sejteket 5% formaldehiddel rögzítettük. A sejtben és a sejtmagban összegyűlt olajcseppecskéket olajvörös O, illetve hematoxilin hozzáadásával megfestettük. Mikroszkóp alatt megszámláltuk a citoplazmában, illetve a magban elszíneződést mutató sejteket. Az adipocitákká történt differenciálódás mértékét az alábbi képlet szerint számítottuk:
Adipogéndifferenciálódás (%)= 100 χ
Zsírcseppecskét tartalmazó sejtek száma Magban színeződött sejtek száma
A sejtrögzítés, az olajvörös O-val és a hematoxilinnel való festés kísérleti kézikönyvben leírtak alapján [Mitomo, Y. and Takayama, S. „RINSHOK.ENSAK.OZA (Clinical Testing Seminar)”, 12. „Pathology” (1982), Ishiyaku Publishing] alapján történt.
Mérési módszer az LPL-gátló aktivitás meghatározására
A mérés kivitelezése Beutler módszerének [Beutler, B. A. et al., J. Immunoi., 135., 3972-3977. (1985)] megfelelően történt az alábbiak szerint. A zsírsejtté transzformált 3T3-L1 adipocitákat a „Mérési módszer a 3T3-L1 sejtek adipocitákká történő átalakulásakor bekövetkező morfológiai változást gátló aktivitás értékelésére” című fejezetben leírt módon állítottuk elő. Az adipocitákká való differenciálódás indukciója során azonban mintaadagolást nem végeztünk. A táptalajt ezután friss C táptalajra cseréltük, és hozzáadtuk a vizsgálandó mintát. További 18 órás tenyésztés után a táptalajt eltávolítottuk, és a sejteket kétszer mostuk PBS pufferrel (Nissui Seiyaku). Ezt követően minden lyukba 300 μΐ D táptalajt [DMEM (4,5 g/1 glükóz), 5% immobilizált FBS, 10 mmol/1 HEPES (pH 7,2), 100 ng marhainzulin, 10 egység/ml heparin-nátriumsó (Nobo Industries)] mértünk. Egy óra tenyésztés után a tenyészetek felülúszójából 100-100 μΐ mintát vettünk LPL-aktivitás méréséhez. Az LPL-aktivitást gátló hatás mérését három párhuzamos mintából három érték átlagaként végeztük.
Az LPL-aktivitás mérése Nilsson-Ehle és Schotz módszerének [Nilsson-Ehle, P, and Schotz, M. C., J. Lipid Rés., 17., 536-541. (1976)] megfelelően történt. 100 μΐ, fentiek szerint készült felülúszót azonos térfogatú szubsztrátoldattal {13 mmol/1 glÍcerin-tri[9,10(n)3H]oleát (51,8 KBq/pmol, Amersham), 1,3 mg/ml foszfatidil-kolin-disztearát (Sigma), 20 mg/ml marhaszérumalbumin (Sigma), 135 mmol/1 TRIS-HC1 (pH 8,1, Sigma), 16,5 térfogat% glicerin, valamint 16,5 térfogat% immobilizált FBS} elegyítettünk, és 37 °C-on 120 percen át állni hagytunk. A reakciót ezután 1,05 ml 0,1 mol/1 kálium-karbonát-bórsav puffer (pH 10,5), valamint
3,25 ml metanol-kloroform-heptán (141:125:100) elegy hozzáadásával leállítottuk. Intenzív keverés után a reakcióelegyet 3000 g gyorsulással 15 percen át centrifugáltuk. A vizes-metanolos fázis 3H beütésszámát folyadékszcintillációs számlálóval meghatároztuk. Az LPL-aktivitás egységét egy perc alatt egy mikronról zsírsav előállításaként definiáltuk. Esetünkben a 13 pmol/l glicerin-tri[9,10(n)-3H]oleát-tartalmú szubsztrátoldatot úgy állítottuk elő, hogy glicerin-tri[9,10(n)-3H]oleátot (370 GBq/mmol, Amersham) trioleinnel (Sigma) hígítottunk, majd szilikagéloszlop-kromatografálással tisztítottuk.
1. példa
Poli A±RNS kinyerése KM-102 sejtekből
KM-102 sejteket 36 műanyag edényben (15 cm átmérő) tenyésztettünk Iscove-féle módosított minimáltáptalajon (Boehringer-Mannheim), mely 10% FBS-t tartalmaz. Összefüggő sejtnövekedés elérése után forbol-mirisztát-acetátot és A23187 kalcium ionofórt adtunk hozzá 10 ng/ml, illetve 0,2 pmol/l koncentrációban. A tenyésztést ezután folytattuk, és időközönként 12 edény sejtjeit guanidin-tiocianát-oldattal [4 mol/1 guanidin-tiocianát, 1% szarkozil, 20 mmol/1 etilén-diamin-tetraecetsav (EDTA), 25 mmol/1 nátrium-citrát (pH 7,0), 100 mmol/1 2-merkapto-etanol és 0,1% A habzásgátló] lizáltuk 3, 6, illetve 14 órás korban, majd a felülúszót elkülönítettük.
A poli(A)+RNS kinyerése lényegében a „Molecular Cloning — A Laboratory Manual” [Maniatis, T. etal., 196-198. (1982)] című műben leírtak szerint történt. Pontosabban az izolálást az alábbiak szerint végeztük.
Az elkülönített sejtlizátum-felülúszót 21G tűvel ellátott fecskendővel többször felszívtuk, majd kinyomtuk. Polialomaranyagú, RPS-40T rotorhoz (Hitachi Koki) illő centrifugacsövekbe 3 ml 5,7 mol/1 CsCl - 0,1 mol/1 EDTA (pH 7,5) összetételű oldatot mértünk, majd felülrétegeztük az említett sejtlizátum-felülúszóval, hogy a csövet megtöltse. A csöveket 20 °C-on, 30 000 rpm fordulaton 18 órán át centrifugáltuk, majd a képződő üledéket 400 μΐ desztillált vízben felvettük és etanollal kicsapjuk. Az így kapott csapadékot ismét feloldottuk 400 μΐ desztillált vízben, majd azonos térfogatú kloroform-1-butanol (4:1) elegyet adtunk hozzá, és jól összekevertük. A vizes fázist centrifugálással elkülönítettük. A vizes fázisból etanollal kicsapott üledéket 600 μΐ desztillált vízben felvéve kaptuk az összes RNS-t. A PMA-A23187 stimulálást követő 3, 6 és 14 órás mintákból egyaránt körülbelül 4,5 mg összes RNS volt kinyerhető.
A fent leírt módon előállított háromféle össz-RNS 600-600 pg-ját összekevertük, és az elegyet a poli(A)+RNS tisztítása érdekében oligo(dT) cellulóz oszlopon kromatografáltuk. Pontosabban az össz-RNS-t az adszorpciós pufferben [0,5 mol/1 NaCl, 20 mmol/1 TRIS-HC1 (pH 7,5), 1 mmol/1 EDTA és 0,1% nátriumlauril-szulfát (SDS)] feloldottuk, 5 percen át 65 °C-on tartottuk, majd az így kapott oldatot felvittük az oligo(dT) cellulóz oszlopra (Pharmacia, 7-es típus), mely
HU 217 803 Β azonos összetételű oldattal volt töltve. A poli(A)+RNS kinyerése érdekében végzett elúció [eluens: 10 mmol/1 TRIS-HC1 (pH 7,5), 1 mmol/1 EDTA és 0,05% SDS] eredményeképp 100 pg poli (A)+RNS-t: kaptunk.
2. példa cDNS-könyvtár készítése
A cDNS-könyvtár készítése Okayama és Berg módszerével történt. Közelebbről 5 pg poli(A)+RNS-t és 24 egység reverz transzkriptázt alkalmas reakcióelegyben {50 mmol/1 TRIS-HC1 (pH 8,3), 8 mmol/1 MgCl2, 30 mmol/1 KC1, 0,3 mmol/1 ditiotreitol (DTT), 2 mmol/1 dATP, 2 mmol/1 dGTP, 2 mmol/1 dCTP, 2 mmol/1 dTTP, 10 pmol/1 Ci[a-32P]dCTP és 1,4 pg vektor primer DNS [3’-oligo(dT)-farokkal rendelkező pcDV-1, Pharmacia]} összehozva 60 percen át 42 °Con tartottunk.
A reakciót 2 pl 0,25 mol/1 EDTA és 1 pl 10%-os SDS hozzáadásával leállítottuk, majd a fehérjét 20 pl fenol-kloroform (1:1) eleggyel kezelve eltávolítottuk. A centrifugálással elkülönített vizes fázishoz 20 pl 4 mol/1 ammónium-acetát-oldatot és 80 pl etanolt adtunk, majd az elegyet -70 °C-on tartottuk 15 percen át. Ezután a keletkező üledéket centrifugálással elkülönítettük, 75%-os etanollal mostuk, majd vákuumban megszárítottuk.
Ezután a száraz csapadékot feloldottuk 15 pl terminális transzferáz reakcióelegyben [140 mmol/1 káliumkakodilát, 30 mmol/1 TRIS-HC1 (pH 6,8), 1 mmol/1 CoCl2, 0,5 mmol/1 DTT, 0,2 pg poliA és 100 mmol/1 dCTP], A reakcióelegyet 3 percen át 37 °C -on tartottuk, majd 18 egység terminális dezoxinukleotidil-transzferázt adtunk hozzá, és további 5 percen át állni hagytuk. Ezt követően a reakciót 1 pl 0,25 mol/1 EDTA és 0,5 pl 10% SDS-oldat hozzáadásával leállítottuk, és a fehérjét fenol-kloroformos kezeléssel eltávolítottuk. A reakcióelegyet centrifugáltuk, a vizes fázist elkülönítettük, 15 pl 4 mol/1 ammónium-acetátot és 60 pl etanolt adtunk hozzá, majd alaposan összekevertük. Az így kapott elegyet 15 percen át -70 °C-on hűtöttük, végül a képződő csapadékot centrifugálással elkülönítettük.
Az üledéket feloldottuk 10 pl restrikciósenzimpufferben [50 mmol/1 NaCl, 10 mmol/1 TRIS-HC1 (pH 7,5), 10 mmol/1 MgCl2, és 1 mmol/1 DTT], 2,5 egység HindlII restrikciós enzimet adtunk hozzá, és ezzel emésztettük 37 °C-on 1 órán át. Ezután a fehérjét fenolkloroformos kezeléssel eltávolítottuk, és etanolos precipitációt végeztünk. A reakcióelegyet 15 percen át -70 °C-on tartottuk, a csapadékot centrifugálással elkülönítettük, és feloldottuk 10 pl TE-pufferben [ 10 mmol/1 TRIS-HC1 (pH 7,5) és 1 mmol/1 EDTA]. Ennek az oldatnak 1 pl-ét 9 pl reakcióelegyhez [10 mmol/1 TRISHC1 (pH 7,5), 1 mmol/1 EDTA és 100 mmol/1 NaCl] mértük, amelyhez 10 ng oligo(dG)-farkú linker-DNS-t [3’-oligo(dG)-farkú pL-1 HindlII linker, Pharmacia] adtunk, majd 5 percen át 65 °C-on melegítettük. A reakcióelegyet ezután 42 °C-on 30 percen át pihentettük, majd jeges vízben lehűtöttük és 10 pl lOxligázpuffert [10 mmol/1 ATP, 660 mmol/1 TRIS-HC1 (pH 7,5), 66 mmol/1 MgCl2 és 100 mmol/1 DTT], 78 pl desztillált vizet és 8 egység T4 DNS-ligázt adtunk hozzá, végül 12 °C-on egy éjszakán át állni hagytuk.
Ezután az elegyhez 10 pl 1 mol/1 KCl-oldatot, 1 egység H-ribonukleázt, 33 egység DNS polimeráz I-et, 4 egység T4 DNS-ligázt, 0,5 pl nukleotidoldatot (20 mmol/1 dATP, 20 mmol/1 dGTP, 20 mmol/1 dCTP és 20 mmol/1 dTTP), valamint 0,1 pl, 50 pg/pl koncentrációjú marhaszérumalbumin-oldatot adtunk, és a reakcióelegyet 12 °C-on egy órát, majd 25 °C-on egy órát állni hagytuk. A továbbiakban a reakcióelegyet desztillált vízzel ötszörösére hígítottuk, és azonnal felhasználtuk Escherichia coli DH5a törzs transzformációjára, melyet Hanahan módszerével [Hanahan, D., J. Mól. Bioi., 166., 557-580. (1983)] végeztünk a KM-102 cDNS-könyvtár előállítása érdekében.
3. példa
Oligonukleotid-próba készítése
A 15 bázisból álló, ATT—3 jelű, 5’-TAAATAAATAAATAA-3’ szekvenciájú oligonukleotid kémiai szintézissel készült, a citokinek mRNSében, a 3’ nem transzlálódó részben meglévő AUUUA szekvencia alapján. A szintézis 380B Automata DNSszintetizátorral (Applied Biosystems), a készülék protokolljában ismertetett módszernek megfelelően történt. Ez a módszer a Caruthers által leírt elveken [Metteucci, M. D. and Caruthers, Μ. H., J. Am. Chem. Soc., 1()3., 3185-3191. (1981)] alapszik, és általában foszforamidit-módszemek nevezik. Miután a 15 nukleotidot összekapcsoltuk, a nukleotidokat a hordozógyantáról lehasítottuk, és a kapott elegyet fagyasztva szárítottuk, hogy oligonukleotid port kapjunk. Az oligonukleotid port ezután feloldottuk desztillált vízben, és felhasználásig -20 °C-on fagyasztva tároltuk.
4. példa
A cDNS-könyvtár szűrővizsgálata
A fentiek szerint elkészített KM-102 cDNS-könyvtár 6500 fajta rekombináns DNS-ét cellulóz-nitrát-szűrőmembránon rögzítettük Grunstein, M. és Hogness, D.
S. módszere szerint [Grunstein, M. and Hogness, D. S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72., 3961-3965. (1975)]. Ezután kolóniahibridizációt végeztünk a próba (ATT3) 5’-végének 32P jelölését követően, mely a szokásos módszerrel (lásd „Molecular Cloning - A Laboratory Manual”) történt. A prehibridizációt 6xSSC (lxSSC összetétele: 150 mmol/1 NaCl és 15 mmol/1 trinátrium-citrát), 1 χ Denhardt-oldat, 0,25% SDS, 0,05% nátrium-pirofoszfát és 100 pg/ml lazacsperma összetételű elegyben végeztük 37 °C-on 3 órán át, majd a hibridizáció a 32P jelölt próbát (ATT-3) tartalmazó 6xSSC, 1 χ Denhardt-oldat, 17 pg/ml élesztő tRNS és 0,05% nátrium-pirofoszfát összetételű reakcióelegyben történt, 31 °C-on egy éjszakán át. A reakció lezajlását követően a cellulóz-nitrát-szűrőmembránt 0,05% nátrium-pirofoszfát-tartalmú 6x SSC-oldattal mostuk szobahőmérsékleten 2 órán át, és ezután autoradiográfiásan vizsgáltuk. A vizsgálat eredményeképp 33 pozitív kiónt kaptunk. Ezekből a klónokból a szokott módon plazmid DNS-t izoláltunk, néhány véletlenszerűen kivá9
HU 217 803 Β lasztott kiónból elvégeztük a cDNS parciális nukleotidszekvenciájának meghatározását a didezoximódszer szerint. Az EMBL vagy GenBank adatbázisokban regisztrált nukleotidszekvenciákkal való homológia vizsgálata személyi számítógéppel történt. Ezzel a módszerrel kimutattuk, hogy az ATT-3 próbával hibridizált szakaszok homológok voltak az Alu ismétlődő szekvenciát tartalmazó nukleotidok némelyikével [Schmidt, C. W. and Jelinek, W. R., Science, 216., 1065-1070.(1982)].
Midőn humán genomból származó, 32P-vel jelölt, Alu ismétlődő szekvenciát tartalmazó DNS-fragmenst használtunk a próbában, és ezzel hibridizáltuk a fenti 33 kiónt, azt találtuk, hogy 12 hordozza közülük az Alu ismétlődő szekvenciát. A maradék 21 klón cDNSinszertjének hosszát vizsgálva kiderítettük, hogy ezek az inszertek 50 és 3600 bázis közötti nagyságúak. A 21 klón cDNS-ének restrikciós enzimekkel végzett térképezése révén részlegesen meghatároztuk a szóban forgó cDNS-ek nukleotidszekvenciáját. Megvizsgáltuk, hogy ezek a nukleotidszekvenciák tartalmaznak-e a fenti adatbázisokban szereplő nukleotidszekvenciákkal homológ szakaszokat, és ennek alapján kiválasztottuk azokat a kiónokat, amelyek új, az adatbázisokban nem szereplő szekvenciával rendelkeznek.
Mivel ezek a plazmidok SV40 eredetű korai promotert és replikációs origót tartalmaznak, alkalmasak COS-1 sejtekben cDNS-expresszióra. Ezért a fentiek szerint kiválasztott kiónok plazmid DNS-eit COS-1 sejtekbe juttattuk. A COS-1 sejtek fertőzését elektroporációval, Shimadzu-GTE-1 génbeültető készülékkel végeztük. Közelebbről, a COS-1 sejtekből félig összefüggő tenyészetet állítottunk elő, majd tripszin-EDTA kezeléssel elkülönítettük és PBS(-) pufferrel (Nissui Seiyaku) kétszer mostuk őket. Ezután a sejtekből PBS(-) pufferben 6xl07 sejt/ml koncentrációjú sejtszuszpenziót készítettünk. A cézium-kloridos módszerrel készült plazmid DNS-ekből 200 pg/ml koncentrációjú oldatot készítettünk PBS(-) pufferben. A fentiek szerint előállított sejtszuszpenzió, illetve DNS-oldat 2020 μΐ-ét elegyítettük, és olyan cellába helyeztük, melyben az elektródák távolsága 2 mm. A kezelést 600 voltos, 30 mikroszekundum időtartamú impulzusokkal másodpercenként kétszer végeztük. A cellát 5 percen át 4 °C-on tartottuk, majd 10 ml, 10% FBS-t tartalmazó DMEM táptalajt mértünk bele. Az így keletkezett elegyet tény észedénybe töltöttük, és a sejteket 37 °C-on, 5% CO2 jelenlétében egy éjszakán át tenyésztettük. Ezután a tenyészet-felülúszóját eltávolítottuk, a sejteket szérummentes táptalajjal (DMEM) mostuk, majd 10 ml DMEM hozzáadásával további 3 napig tenyésztettük őket. Az így előállított tenyészet-felülúszóját elkülönítettük, és a korábban leírt módon elvégeztük benne az adipocitákká történő morfológiai átalakulást gátló aktivitás mérésére szolgáló vizsgálatot.
Ennek eredményeképp adipocitagátló aktivitást egyetlen tenyészet-felülúszójában sikerült kimutatnunk, ahol a COS-1 sejteket a 20-2 számú klón plazmidjával (pcD-20-2) fertőztük. Az adiopogenezis gátlására vonatkozó adatokat az 1. táblázat tartalmazza.
1. táblázat
Minta Adipogéndifferenciálódás aránya (%)
Szérummentes DMEM (vak) 72
pUC-CAT plazmiddal fertőzött COS-1 sejttenyészet-felülúszója (4% adagolás) 41
pcD-20-2 plazmiddal fertőzött COS-1 sejttenyészet-felülúszója (4% adagolás) 13
A pUC-CAT plazmidot, mely kloramfenikol-acetiltranszferázgénnek pUC-vektorba való beépítésével készült, negatív kontrollként használtuk, mivel nem tartalmaz emlőssejtekben működőképes promotert. A transzfekció a psD-20-2 plazmiddal végzettel azonos módon történt. Amint a táblázat adataiból látható, a 3T3-L1 sejtek adipocitákká alakulását kísérő morfológiai változást gátló aktivitást sikerült kimutatni a pcD-20-2 plazmiddal fertőzött COS-1 sejtek tenyészetének felülúszójában. Azokban a 3T3-L1 sejtekben pedig, melyeknek adipocitákká alakulását indukáltuk, az LPL-aktivitás erőteljesen gátolt volt (2. táblázat). A táblázatban közölt adatok relatív értékek (%), a szérummentes DMEM (vak) adagolása esetében mért LPL-aktivitásra (100%) vonatkoztatva.
2. táblázat
Minta Az LPL-aktivitás relatív érteke (%)
Szérummentes DMEM (vak) 100
pUC-CAT plazmiddal fertőzött COS-1 sejttenyészet-felülúszója (4% adagolás) 95
pcD-20-2 plazmiddal fertőzött COS-1 sejttenyészet-felülúszója (4% adagolás) 38
Ennek megfelelően elkészítettük a pcD-20-2 plazmidba épített cDNS restrikciós térképét (1. ábra). Ezt követően a cDNS teljes nukleotidszekvenciáját meghatároztuk didezoximódszerrel, aminek eredményeképp a szekvencialista 1. számú szekvenciáján látható nukleotidsorrendet kaptuk. Azt találtuk, hogy a pcD-20-2 plazmidba épített cDNS 1065 bázisból és egy poli(A) farokból (41 A egység) áll. Az is kiderült, hogy a cDNS olyan „open reading frame”-et (ORF) tartalmaz, mely metioninnal kezdődik és 199 aminosavból áll. Midőn a kapott nukleotidszekvenciát összehasonlítottuk az EMBL és GenBank adatbázisokban fellelhetőkkel, egyetlen ismert szekvenciával sem találtunk homológiát. Az ORF által kódolt aminosavszekvenciát az NBRF és SWISS prot adatbázisokban lévőkkel összehasonlítva egyetlen ismert szekvenciával sem észleltünk homológiát. Ilyen módon igazolást nyert, hogy a pcD20-2 plazmidba épített cDNS ORF szakasza új, eddig nem ismert polipeptidet kódol. Az ORF által kódolt
HU 217 803 Β aminosavsorrendet a szekvencialista 2. számú szekvenciája tartalmazza.
Különböző szekréciós fehérjékben megfigyelt, erősen hidrofób aminosavakból álló szakasz (szignálpeptid) van a szekvencia N-terminális részén, mely metioninnal kezdődik. Ez azt valószínűsíti, hogy a fehérje szekréciós protein.
5. példa
Peptidszintézis és antipeptidantiszérum készítése
Az N-terminális metionintól számított 27. és 41. aminosav közötti szekvenciának (NH2-Gly-Pro-ProArg-Val-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-Leu-AspSer-COOH) megfelelő peptidet szintetizáltuk annak érdekében, hogy igazoljuk a pcD-20-2 plazmid cDNSinszertjének ORF szakasza által kódolt új peptid szekréciós fehérje voltát, valamint azért is, hogy ezt a peptidet felhasználjuk az adipogenezist gátló faktor kimutatására a szóban forgó faktor későbbiekben ismertetendő tisztítása során. Az így előállított peptidet ennek megfelelően antigénként nyúl immunizálására és antiszérum előállítására is felhasználtuk. A peptidszintézist a szilárd fázisú tBOC-aminosav-módszemek [Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc., 85., 2149-2154. (1963)] megfelelően végeztük, szabvány automatikus szintézisprogram szerint, 430A típusú peptidszintetizátor (Applied Biosystems) alkalmazásával. A védőcsoport és a gyanta eltávolítása után a peptidet anioncserélő oszlopon tisztítottuk. Az elúciót fordított fázisú oszlopon, HPLC-módszer segítségével követtük nyomon. A peptidet ezt követően fagyasztva szárítással koncentráltuk, a csúcsokat fordított fázisú oszlopon végzett HPLC alkalmazásával elválasztottuk. Újabb fagyasztva szárításos koncentrálást követően HPLC- és aminosavanalízist végeztünk. Az aminosav analízis Pico Tag-rendszerrel, Waters gyártmányú automata aminosavanalizátorral történt.
Az így kapott peptidhez glutáraldehides (GAD) módszerrel [Konopka, J. B. et al., J. Virol., 57., 223-232. (1984)] hordozó fehérjeként kürtőscsiga-hemocianint (KLH) kapcsoltunk. Ezt használtuk antigénként nyúl immunizálására. Az antigént Freund-féle komplett adjuvánssal (FCA) homogenizáltuk, és ezzel a szuszpenzióval háton történő szubdermális kezeléssel nyulat immunizáltunk. A kezelést kéthetes intervallumokban összesen háromszor végeztük a szuszpenzióval, majd a teljes vért összegyűjtöttük. A nyúlszérum antitesttiterének meghatározása enzimkötött immunszorbens kimutatással (ELISA) történt. A kapott antiszérumból az IgG-frakciót Protein A-Sepharose 6MB oszlop (Pharmacia) alkalmazásával különítettük el, és a továbbiakban ezt használtuk elsődleges antitestként.
6. példa
Adipogenezist gátló faktor előállítása és tisztítása
COS-1 sejtek alkalmazásával i) Nagy hatékonyságú expressziós vektor létrehozása és expresszió COS-1 sejtekben
A pcD-20-2 plazmid BamH 1 emésztését követően a cDNS-inszertet tartalmazó, 1240 bázispár méretű fragmenst izoláltuk és tisztítottuk. A pcDL-SRa296 nagy hatékonyságú expressziós vektort [Takebe, Y. et al. (1988), Mól. Cell Bioi., 8., 466-472.] BamHI-gyel emésztettük, és az SRa promotert tartalmazó 3,4 kb méretű fragmenst kinyertük, majd T4 DNS-ligáz alkalmazásával hozzáligáltuk a cDNS-t tartalmazó BamH 1 fragmenst. Az így kapott DNS-t Escherichia coli DH5a transzformációjára használtuk fel, és elvégeztük a keletkezett transzformánsban lévő plazmid analízisét. Azt a törzset, melyben a cDNS transzkripciójának iránya megegyező volt az SRa promoterével, kiválasztottuk, és a szóban forgó plazmidnak a pSRa-20-2 elnevezést adtuk (2. ábra).
Az SRa promoter az SV40 korai promoteréből, valamint a HTLV-1 hosszú terminális ismétlődéses (LTR) szakaszának R-U5 szekvenciájából áll, és promoteraktivitását illetően 10-100-szor olyan hatékony, mint az SV40 korai promotere.
Ezt követően COS-1 sejteket fertőztünk a kapott pSRa-20-2 plazmiddal annak érdekében, hogy az 5. példa szerint előállított antitest alkalmazásával igazoljuk az adipogenezist gátló faktornak a tenyészet-felülúszójába történő szekrécióját. A COS-1 sejtek fertőzését elektroporációs, illetve DEAE-dextrán-módszerrel [Luthman, H. and Magnusson, G. (1983), Nucleic Acid Rés., 77., 1295-1308.] végeztük. A negatív kontrollként pcDLSRa296 plazmiddal fertőzött, valamint a pSRa-20-2 plazmiddal fertőzött, adipogenezist gátló faktort expresszáló COS-1 szérummentes sejttenyészetek felülúszójának 160-160 μΐ-ét a fehérje kicsapása érdekében triklór-ecetsavval (TCA) kezeltük, majd a keletkező csapadékot centrifugálással elkülönítettük. Az üledéket jéghideg acetonnal mostuk, levegőn megszárítottuk, majd 2-merkapto-etanol-tartalmú, SDS poliakrilamidgél-elektroforézishez (SDS-PAGE) használt mintapufferben felvéve, reduktív körülmények között, 12,5% géllel végzett SDS-PAGE-analízisnek vetettük alá. Az elektroforézis után a proteinsávokat ezüstfestéssel hívtuk elő, melyet Silbest Stain színezékkel (Nacalai Tesque) végeztünk (lásd a 3. ábra bal oldali részén). Egyetlen specifikus mintázatú sávot sikerült kimutatnunk a nyíllal jelölt magasságban (körülbelül 23 000 Da molekulatömeg) a pSRa-20-2 plazmiddal fertőzött COS-1 sejtek tenyészetének felülúszójában.
A poliakrilamid gélből származó proteinsávokat cellulóz-nitrát-szűrőmembránon, gélmembrán blotter (KS-8441, Marysol) alkalmazásával rögzítve Towbin módszere szerint [Towbin, H. et al. (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76., 4350-4354.] Western blot-analízist végeztünk az 5. példa szerint előállított elsődleges antitest felhasználásával. A Western blot-eljárást ImmunBiot (GAR-HRP) Assay Kit (Bio-Rad) segítségével, a gyártó előírásainak megfelelően hajtottuk végre (lásd 3. ábra, jobb oldali kép). Csak egy specifikus sávot sikerült kimutatnunk ezüstfestéssel (körülbelül 23 000 Da molekulatömeg), mely reagált az antipeptidantitesttel, igazolván így, hogy a pcD-20-2 plazmidban lévő cDNS ORF szakasza által kódolt fehérje szekréciós protein.
Ezután a pSRa-20-2 plazmiddal fertőzött COS-1 sejtek tenyészetének felülúszójában vizsgáltuk meg az
HU 217 803 Β adipogenetikus differenciálódást gátló aktivitás jelenlétét. Az aktivitásmérésre vonatkozó adatok egy részét a 3. táblázat tartalmazza.
3. táblázat
Minta Az adipogcndiffcrenciálódás mértéke (%)
Szérummentes DMEM (vak) 85
pcDL-SRa296 plazmiddal fertőzött COS-1 sejttenyészet-felülúszója (0,6% adagolás) 84
pSRa-20-2 plazmiddal fertőzött COS-1 sejttenyészet-felülúszója (0,6% adagolás) 29
A negatív kontrollként szolgáló, cDNS-inszertet nem tartalmazó pcDL-SRa296 plazmiddal fertőzött COS-1 sejtek tenyészetének felülúszójában nem volt kimutatható adipogéndifferenciálódást gátló aktivitás, a pSRa-20-2 plazmiddal fertőzött COS-1 sejtek tenyészetének felülúszójában viszont jelentős aktivitást mutattunk ki. Ezenfelül az adipocitákká való differenciálódásra indukált 3T3-L1 sejtek LPL-aktivitásának jelentős csökkenését is megfigyeltük (4. táblázat). A 3. és 4. táblázat adipogenezist gátló aktivitásra vonatkozó adatai azt mutatják, hogy a pSRa-20-2 esetében a gátlás szignifikánsan erősebb, mint a pcD-20-2 plazmid alkalmazásakor (1. és 2. táblázat).
4. táblázat
Minta Az LPL-aktivitás relatív értéke (%)
Szérummentes DMEM (vak) 100
pcDL-SRa296 plazmiddal fertőzött COS-1 sejttenyészet-felülúszója (0,8% adagolás) 117
pSRa-20-2 plazmiddal fertőzött COS-1 sejttenyészet-felülúszója (0,8% adagolás) 17
ii) Tisztítás és az N-terminális aminosavsorrend meghatározása
A fenti módon készített, pSRa-20-2 plazmiddal fertőzött COS-1 sejttenyészet-felülúszójának 7 literét 20szoros térfogatú dialízispufferrel [10 mmol/1 bórsavNaOH (pH 9,0) és 13 mmol/1 KC1] 4 °C-on 15 órán át dializáltuk, majd gyenge kationcserélőn kromatografáljuk Pharmacia gyártmányú FPLC-készüléken az alábbi körülmények között:
Oszlop: CM-Toyopearl Pack 650M (2,2x20 cm,
Tosoh)
Eluens: A pufferoldat: 10 mmol/1 bórsav-NaOH (pH 9,0) és 13 mmol/1 KC1
B pufferoldat: 300 mmol/1 NaCl-tartalmú A pufferoldat
Áramlási sebesség: 3 ml/perc
Frakciótérfogat: 3 ml/cső
Koncentrációgradiens: lineáris gradiens 100%
A- oldattól 100% B oldatig 50 perc alatt.
Az egyes frakciók Western blot-analízisét elvégeztük az 5. példa szerint készített antipeptidantitest alkalmazásával, hogy meghatározzuk az adipogenezist gátló faktort tartalmazó frakciókat (35 és 45 közötti sorszámú frakciók). Az adipogenezist gátló faktort legnagyobb mennyiségben tartalmazó, 260 mmol/1 NaCl-koncentrációnál eluálódó (41. sorszámú) frakció teljes mennyiségét TCA-precipitációval koncentráltuk, majd SDS-PAGE-analízisnek vetettük alá, melyet reduktív körülmények között, 12,5% gélkoncentrációval végeztünk. Az elektroforézis után a poliakrilamid gél fehérjesávjait polivinilidén-difluorid-membránon (Immobilon, Millipore) rögzítettük KS-8441 gélmembrán blotter (Marysol) alkalmazásával, 0,8 mA/cm2 áramfluxussal, transzferpufferben [0,02% SDS, 20% metanol és 25 mmol/1 TRIS-borát (pH 9,5)], 4 °C-on 15 órán át. A rögzítés befejeztével a membránt rázás közben előbb 5 percen át 25 mmol/1 NaCl-tartalmú 10 mmol/1 nátrium-borát-pufferrel (pH 8,0), majd 5 percen át desztillált vízzel mostuk, végül levegőn megszárítottuk. Ezután a membránnak az adipogenezist gátló faktort tartalmazó részét kivágtuk, és az N-terminális vég első tíz aminosavjának sorrendjét gázfázisú proteinszekvenátorral (Model 475A, Applied Biosystems) meghatároztuk.
A reakcióciklusokban keletkező fenil-tiohidantoinaminosavakat (ΡΗΤ-aminosavakat) fordított fázisú HPLC (Model 120A, Applied Biosystems) alkalmazásával elválasztottuk és azonosítottuk. Az ezzel a módszerrel meghatározott aminosavsorrend az alábbi:
Pro-Gly-Pro-Pro-Pro-Gly-Pro-Pro-Arg-ValEz azt jelzi, hogy a humán adipogenezist gátló faktor prolinnal kezdődő érett formájában szekretálódik a sejten kívülre, azt követően, hogy 199 aminosavból álló prekurzorként bioszintetizálódott, amelyről az N-terminális végen lévő, 21 aminosavból álló szignálpeptid lehasadt.
7. példa
A tisztított adipogenezist gátló faktor biológiai aktivitása
A pSRa-20-2 plazmiddal fertőzött COS-1 sejtek szérummentes tenyészetének felülúszójából származó adipogenezist gátló faktort ismert módszerekkel, gyenge kationcserélő kromatografálás, hidrofób kromatografálás, gélszűréses kromatografálás és hasonlók kombinálásával megtisztítottuk és a szóban forgó faktort SDS-PAGE-analízissel egyetlen sávként mutattuk ki. Ennek a tisztított, adipogenezist gátló faktornak az adipogéndifferenciálódást gátló hatását, valamint az LPL-gátló hatását vizsgálva figyelemre méltó aktivitást mutattunk ki.
Következésképpen a találmány szerinti, adipogenezist gátló faktor egységes fehérje, amely adipogenezistgátlófaktor-aktivitással rendelkezik.
HU 217 803 Β
8. példa
Adipogéntranszformációt gátló faktor előállítása
CHO-sejtekben, szekrécióval
Exponenciális növekedési fázisban lévő CHO-sejteken kalcium-foszfát-DNS koprecipitációs módszerrel, 5:1 DNS-arányban jelen lévő pSRa-202 és pSRVneo plazmiddal kotranszfekciót végeztünk. A transzformáns törzsek szelekciójára 400 pg/ml G418 (Gibco Orientál) és 10% FBS-tartalmú HamF12 (Nissui Seiyaku) táptalajon való 9 napos tenyésztés után került sor. A keletkező rezisztens kolóniákból kiválasztott 15 törzs telepeit klónozógyűrű alkalmazásával 24 lyukú mikrotitertálcára vittük át, és folytattuk a tenyésztést. Miután a sejtek összefüggő tenyészetet képeztek, tenyészedényekbe vittük át őket, és az így készített szubkultúrákban 15 törzsnél megvizsgáltuk az adipogenezistgátlófaktor-termelést, a fentiekben ismertetett Western blot-módszer alkalmazásával.
Ennek eredményeképp kiválasztottuk azt a kiónt, amely a legerőteljesebb adipogenezistgátlófaktor-termelést mutatta. Ezt a kiónt határhígításos módszerrel 96 lyukú mikrotitertálcában tenyésztettük, és 4, egyetlen sejtből származó kiónt választottunk ki. Ezt a 4 törzset tenyészedényekbe vittük át, és az összefüggő növekedés elérése után a termelt adipogenezist gátló faktor mennyiségét mindegyik tenyészet-felül úszójában megvizsgáltuk Western blot-módszerrel. A megtermelt és szekretált, adipogenezist gátló faktor mennyisége stabil volt, és nem mutatott nagy ingadozást a 4 törzs között. A tenyészetek felülúszójának a 3T3-L1 sejtek LPLaktivitására gyakorolt hatását vizsgálva LPL-gátló aktivitást mutattunk ki mind a 4 klón esetében. Ezután a négy törzs egyikét szérummentes táptalajon (CHO komplett táptalaj, Ventrex) tenyésztettük. A szérummentes táptalajon való kétnapos növesztés után a szubkultúrát tripszin-EDTA kezelésnek vetettük alá, majd a törzset további három napon át tenyésztettük. A tenyészet-felülúszóját elkülönítettük, és Western blot-módszerrel vizsgálva igazoltuk az adipogenezist gátló faktor stabil termelődését.
9. példa
Egércsontvelő eredetű H-l/A preadipocita-sejtvonal adipogéndifferenciálódásának gátlása Egércsontvelő eredetű H-l/A preadipocita-sejtvonalból [Nakamura M, et al., Proc. Soc. Exp. Bioi. Med., 179., 283-287. (1985)] 2,0xl04 sejt/ml sejtkoncentrációjú sejtszuszpenziót készítettünk E táptalajban [Fischer táptalaj (Gibco), mely 10% immobilizált FBS-t (Hyclone) tartalmaz]. Ezt a sejtszuszpenziót 0,5 ml-enként Celltight C-1 Plate 48F tálca (Sumimoto Bakelité) lyukaiba pipettáztuk, és 5% CO2- és 95% levegőtartalmú nedves gázelegyben, 33 °C-on tenyésztettük. Három nap múlva a táptalajt F táptalajra [1 pmol/l hidrokortizon- (Sigma) tartamú E táptalaj] cseréltük az adipogéndifferenciálódás indukálása érdekében. Ezzel egyidejűleg pSRa-20-2 plazmiddal fertőzött COS-1 sejttenyészet-felülúszóját, pcDL-SRa296 plazmiddal fertőzött COS -1 sejttenyészet-felülúszóját, illetve szérummentes DMEM táptalajt adtunk a tenyészetekhez. Ezután négynaponként a táptalajt friss F táptalajra cseréltük, és megismételtük a COS-1 sejttenyészet-felülúszók, valamint a DMEM táptalaj adagolását. Az F táptalaj alkalmazását követő 26. napon a sejteket 5%-os formaldehiddel rögzítettük, és a sejtben, illetve a sejtmagban képződött zsírcseppecskéket olajvörös O, illetve hematoxilin használatával megfestettük. Az adipogéndifferenciálódás mértékét a 3T3-L1 sejtek adipogéndifferenciálódását gátló hatás mérésénél alkalmazottal azonos módon számítottuk. Az 5. táblázat adataiból látható, hogy a pSRa-20-2 plazmiddal fertőzött COS-1 sejttenyészet-felülúszójában jelentős, a H-l/A sejtek adipogéndifferenciálódását gátló aktivitás volt kimutatható. A pSRa-20-2 plazmiddal fertőzött COS-1 sejttenyészet-felülúszójából kinyert és tisztított adipogenezist gátló faktor szintén erőteljesen gátolta a Η- 1/A sejtek adipogéndifferenciálódását.
5. táblázat
Minta Az adipogéndifferenciálódás mérteke (%)
Szérummentes DMEM (8% adagolás) 34
pcDL-SRa296 plazmiddal fertőzött COS-1 sejttenyészet-felülúszója (8% adagolás) 36
pSRa-20-2 plazmiddal fertőzött COS-1 sejttenyészet-felülúszója (8% adagolás) 5
10. példa
CSF-indukáló aktivitás csontvelő eredetű H-l/A preadipocita-sejtvonalon
H-l/A sejtekből 1,0χ 104 sejt/ml koncentrációjú sejtszuszpenziót készítettünk Etáptalajjal, és 3 ml-enként 6 lyukú csoportos tálca (Cosaer) lyukaiba pipettáztuk. A sejteket 5% CO2- és 95% levegőtartalmú nedvesgázelegyben, 33 °C-on tenyésztettük 6 napon át, majd a táptalajt friss Etáptalajra cseréltük. Ugyanekkor pSRa20-2 plazmiddal fertőzött COS-1 sejttenyészet-felülúszót, pcDL-SRa296 plazmiddal fertőzött COS-1 sejttenyészet-felülúszót, illetve szérummentes DMEM táptalajt adtunk a sejtekhez, majd további 5 napon át tenyésztettük őket.
Ezt követően a sejteket háromszor mostuk szérummentes Fischer táptalajjal, a lyukakba 3 ml friss E táptalajt mértünk, és a tenyésztést további 14 órán át folytattuk, majd a tenyészetek felülúszóját valamennyi lyukból elkülönítettük. A felülúszókat 0,22 pm pórusméretű Millex GV szűrőmembránon (Nippon Millipore Industries) szűrtük, és a szűrletet használtuk a kolóniastimulációs aktivitás vizsgálatához. A kolóniastimulációs aktivitás vizsgálatát Kubota módszere szerint [Kubota, K. et al., Cancer Rés., 41., 3052-3057. (1981)] végeztük. C3H He/N nőstény egerekből (Japan Charles River) származó combcsontvelősejtekből 1,0 xlO5 sejt/ml sejtkoncentrációjú sejtszuszpenziót készítettünk
HU 217 803 Β az 5% pcDL-SRa.296 plazmiddal fertőzött COS-1 sejttenyészet-felülúszót tartalmazó E-táptalajjal kezelt
H -l/A sejtekben (lásd a 7. táblázatot).
RPMI 1640 táptalajban (Gibco), melyhez 0,3% agart (Difco), 20% FBS-t és 10% H-l/A sejttenyészet-felülúszót adtunk. A sejtszuszpenziót 1 ml-enként 35 χ 10 mm méretű műanyag tenyészedényekbe (Lux) pipettáztuk. A sejteket 5% CO2- és 95% levegőtartalmú nedves gázelegyben, 37 °C-on tenyésztettük 7 napon át, majd az edényekben kinőtt telepeket megszámoltuk.
Az az E táptalajjal kezelt Η- 1/A sejttenyészet-felülúszó, amelyhez pSRa-20-2 plazmiddal fertőzött COS-1 sejttenyészet-felülúszót adtunk, jelentősen nagyobb kolóniastimuláló aktivitást mutatott (p<0,01), mint azok az E-táptalajjal kezelt H-l/A sejttenyészet-felülúszók, melyekhez pcDL-SRa296 plazmiddal fertőzött COS-1 sejttenyészet-felülúszót vagy szérummentes DMEM táptalajt adtunk. Az eredményeket a 6. táblázatban foglaltuk össze.
6. táblázat
Minta A telepek száma (átlagis. d., n=6)
2,5% szérummentes DMEM-tartalmú E táptalajjal kezelt H-l/A sejttenyészet-felülúszója 46,7±13,8
pcDL-SRa296 plazmiddal fertőzött COS-1 sejttenyészet-felülúszót tartalmazó E táptalajjal kezelt H-l/A sejttenyészet-felülúszója 44,5± 13,6
pSRa-20-2 plazmiddal fertőzött COS-1 sejttenyészet-felülúszót tartalmazó E táptalajjal kezelt H- 1/A sejttenyészet-felülúszója 72,0± 14,3
5,0χ 106 H-l/A sejtet 50 ml E-táptalajban szuszpendáltunk és Accel-lombikban (Costar) 5 napon át tenyésztettünk. Ezután a táptalajt friss E-táptalajra cseréltük, és egyidejűleg pSRa-20-2 plazmiddal fertőzött COS-1 sejttenyészet-felülúszót, pcDL-SRa296 plazmiddal fertőzött COS-1 sejttenyészet-felülúszót, illetve szérummentes DMEM táptalajt adtunk hozzá. A tenyésztést további 18 órán át folytattuk, majd a sejtekből az 1. példa szerinti módon össz-RNS-t izoláltunk. Az M-CSF mRNS-mennyiségét Northern hibridizációs módszerrel [Thomas, P. S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77., 5201-5205. (1980)] végeztük az egyes összRNS-mintákból 20 pg használatával. Próbaként polimeráz láncreakcióval készített [Ladner, Μ. B. etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85., 6706-6710. (198F3)], Multiprime DNA Labelling System (Amersham) segítségével 32P-vel jelölt egér M-CSF cDNS szolgált. A hibridizált 32P-vel jelölt próba mennyiségét képanalizátorral (Fuji Photo Film) határoztuk meg. A 32P-vel jelölt próba körülbelül 2,5 kilobázis és körülbelül 4,5 kilobázis méretű RNS-ekkel hibridizált. Midőn az ilyen méretű RNS-ekkel hibridizálódott próba teljes mennyiségét megvizsgáltuk, minden tenyészetnél azt kaptuk, hogy az M-CSF mRNS mennyisége az össz-RNS-hez viszonyítva több az 5% pSRa-202 plazmiddal fertőzött COS-1 sejttenyészet-felülúszót tartalmazó E táptalajjal kezelt H-l/A sejtekben, mint
7. táblázat
Adalék M-CSF mRNS relatív mennyisége (%)
pcDL-SRa296 plazmiddal fertőzött COS-1 sejttenyészet-felülúszója (5% adagolás) 100
pSRa-20-2 plazmiddal fertőzött COS-1 sejttenyészet-felülúszója (5% adagolás) 154
11. példa
CSF-indukáló hatás adipocitákká differenciálódott
Η- 1/A sejteken
5,0 χ ΙΟ6 Η- 1/A sejtet 50 ml F táptalajban szuszpendáltunk és Accel-lombikban 33 °C-on 12 napon át tenyésztettük. A tenyésztés ideje alatt a táptalajt négynaponta friss F táptalajra cseréltük. Ezután a táptalajt Etáptalajra cseréltük, és a tenyésztést további három napon át folytattuk. Ennek eredményeképp a sejtek több mint 40%-ában olajcseppecskéket lehetett megfigyelni, ami jelezte az adipocitákká történt átalakulást. A táptalajt ezt követően olyan E táptalajra cseréltük, amelyhez 5%, pSRa-20-2 plazmiddal fertőzött COS-1 sejttenyészet-felülúszót, pcDL-SRa.296 plazmiddal fertőzött COS-1 sejttenyészet-felülúszót, illetve szérummentes DMEM táptalajt adtunk, és a tenyésztést további 18 órán át folytattuk. A tenyésztés után a táptalajt eltávolítottuk, és a sejteket kétszer mostuk PBS(-) pufferrel, majd 25 ml, 10 egység/ml nátrium-heparint tartalmazó E táptalajt adtunk hozzájuk. A tenyésztést ilyen körülmények között végeztük a továbbiakban 33 °C-on, 15 percen át. Midőn a tenyészetek felülúszójának LPL aktivitását megmértük, számottevő gátlást csak a pSRa-20-2 plazmiddal fertőzött COS-1 sejttenyészet felülúszó hozzáadása esetén tapasztaltunk (lásd a 8. táblázatot).
8. táblázat
Adalék Az LPL-aktivitás relatív értéke (%)
Szérummentes DMEM (vak) 100
pcDL-SRa.296 plazmiddal fertőzött COS-1 sejttenyészet-felülúszója (5% adagolás) 80
pSRa-20-2 plazmiddal fertőzött COS-1 sejttenyészet-felülúszója (5% adagolás) 10
Ezután a fentiekben előállított sejtekből az 1. példa szerinti módon össz-RNS-t izoláltunk. Az M-CSF mRNS mennyiségét a 10. példában ismertetettek szerint vizsgáltuk azzal az eltéréssel, hogy valamennyi alkalommal 10 pg össz-RNS-t használtunk. Az 5%
HU 217 803 Β pSRa-20-2 plazmiddal fertőzött COS-1 sejttenyészet-felülúszót tartalmazó E táptalajjal kezelt H-l/A sejtek egységnyi össz-RNS-re vonatkoztatott M-CSF mRNS-tartalma jelentősen felülmúlta az 5% pcDLSRa296 plazmiddal fertőzött COS-1 sejttenyészet-felülúszót tartalmazó E táptalajjal kezelt H-l/A sejtekét (9. táblázat).
9. táblázat
Adalék M-CSF mRNS relatív mennyisége (%)
pcDL-SRa296 plazmiddal fertőzött COS-1 sejttenyészet-felülúszója (5% adagolás) 100
pSRa-20-2 plazmiddal fertőzött COS-1 sejttenyészet-felülúszója (5% adagolás) 172
12. példa
Adipogenezist gátló faktort tartalmazó (50%) intesztinoszolvens granulátum rész (tömegrész, a továbbiakban is) tisztított, a
8. példa szerint készített, adipogenezist gátló faktort 10 rész laktózzal és 20 rész mikrokristályos cellulózzal összemérve mozsárban alaposan összekevertünk, és megfelelő mennyiségű vízzel összegyúrtuk. Az összegyúrt masszát 1,2 mm pórusméretű feltéttel ellátott hengeres granulálón extrudálva szemcsés készítményt állítottunk elő. A szemcséket MARUMERIZER-en átengedve granulátumot készítettünk. A granulátumot 40 °C-on 2 órán át szárítottuk levegőcirkulácíós szárítóban, majd a száraz szemcséket 0,5 mm lyukméretű szitával osztályoztuk. A 0,5 mm-nél nagyobb szemcséket használtuk fel az intesztinoszolvens bevonattal ellátott granulátum készítésére. Először a szakmában megszokott módon 5% hidroxi-propilmetil-cellulózt feloldottunk egyenlő arányú metilénklorid-etanol elegyben, és 100 rész, fentiek szerint előállított száraz szemcsét az oldat 100 résznyi mennyiségével bevonókészülékben porlasztással bevontuk. Ezután az így elkészített szemcséket ugyanolyan módon 300 rész, 10 hidroxi-propil-metil-cellulóz-ftalátból (HP-55, Shin-Etsu Chemical), 1,5% sztearinból, 50% acetonból és 38,5% etanolból a szokott módon készült eleggyel porlasztással bevontuk. A bevonattal ellátott szemcséket 40 °C-on 1 órán át szárítottuk levegőcirkulációs szárítóban, az adipogenezistgátlófaktor-tartalmú, bélben oldódó készítmény előállítására. Ez a granulátum 50%, adipogenezist gátló faktort tartalmaz.
13. példa
Kapszula
200 mg fentiek szerint készített, bélben oldódó, 50% adipogenezist gátló faktort tartalmazó granulátumot 3-as számú kapszulába töltöttünk, hogy kapszulánként 100 mg, adipogenezist gátló faktort tartalmazó kemény kapszulát állítsunk elő.
14. példa
Injekció
Az adipogenezist gátló faktor olyan ampullakészítmény alakjában is felhasználható, amely a faktornak vízzel vagy más, gyógyászatilag elfogadható folyadékkal készült oldatát vagy szuszpenzióját tartalmazza. Más részről steril porampulla-készítmény is előállítható (előnyösen fagyasztva szárított, adipogenezist gátló faktort tartalmazó), amely felhasználáskor hígítható gyógyászatilag elfogadható folyadékkal.
Ipari alkalmazás
A találmány szerinti, adipogenezist gátló faktor gyógyászati alkalmazása történhet önmagában vagy más gyógyszerkészítményekkel együtt az aplasztikus anémia, a toxinok vagy sugárzás okozta leukopénia, vírus-, baktérium- vagy parazitafertőzések, csontvelő-átültetést követő citopénia kezelésére éppúgy, mint egyéb immun-rendellenességek kapcsán jelentkező reffakter páncitopénia esetén. Az adipogenezist gátló faktor szintén felhasználható egyedül vagy más gyógyszerekkel kombinálva a kóros elhízás prevenciójára és kezelésére.
A találmány szerinti citopénia amelioráns készítmény, valamint elhízásellenes készítmény, mely a szóban forgó kóros állapot gyógykezelésére használatos, gyógyászatilag elfogadható vivőanyag és az adipogenezist gátló faktor hatásos mennyiségének keverékéből áll. A szóban forgó készítmény alkalmazható különböző formában, például tablettaként, kapszulaként, granulátumként, por alakban vagy szirupban orális kezelésre; valamint injekció, intravénás csepegtető vagy kúp alakjában parenterális alkalmazásra.
Injekciós vagy intravénás cseppinfuziós alkalmazás esetén a találmány szerinti gyógyászati készítmény alakja pirogénmentes, parenterálisan elfogadható vizes oldat. A parenterálisan elfogadható fehéijeoldat előállítása a pH, az izotónia és a stabilitás figyelembevételével a szakmában jártas szakember számára nyilvánvaló módon elvégezhető.
Az adagolást és a terápiás alkalmazás módját a fenti betegségek gyógykezelése során orvos határozhatja meg, figyelembe véve mindazokat a tényezőket, melyek hatással lehetnek a szóban forgó készítmény aktivitására, mint például a beteg általános állapota, testtömege, neme, életkora, táplálkozása, más fertőzések fontossága, a kezelés időtartama és egyéb, klinikai jelentőségű faktorok. Orális kezelés esetén normális esetben felnőttnek naponta 0,01-1000 mg adható egyszeri dózisban vagy több részletben. Parenterális alkalmazás esetén körülbelül 0,01-100 mg injektálható egyszerre szubkután, intramuszkulárisan vagy intravénásán.
A találmány szerinti citopénia amelioráns készítmény használható kombinálva egyéb, vérsejtképzést befolyásoló faktorokkal, mint az interleukinok IL-1-től IL-10-ig, LIF, őssejtfaktor, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, Meg-CSF, TNF, IFN vagy EPO. Ebben az esetben az egyéb vérsejtképző faktorok lehetnek a jelen találmány szerinti citopénia amelioráns készítmény komponensei, vagy adhatók külön készítményként az adott betegnek. A jelen készítmény addicionális alkal15
HU 217 803 Β mazása elősegítheti vagy javíthatja a más vérsejtképző faktorokkal végzett gyógykezelés hatását.
Ugyanakkor a találmány szerinti, elhízás elleni készítmény használható kombinációban más alkalmas elhízásellenes gyógyszerekkel, így anorektikumokkal, 5 felszívódásgátlókkal, emésztőenzim-gátlókkal, anyagcsere-gyorsító hormonkészítményekkel, zsírsavszintézis-gátlókkal vagy inzulinszekréció-gátlókkal együtt. Alkalmazható a készítmény továbbá étkezési vagy gyakorlatterápiával kombinálva is. Ezekben az esetekben 10 az elhízás elleni készítmény alkalmazása elősegítheti vagy javíthatja a más, elhízás elleni készítményekkel vagy terápiás módszerekkel végzett gyógykezelés hatását.
Minthogy a találmány szerinti citopénia amelio- 15 ráns, valamint elhízás elleni készítmények biológiai, illetve genetikai rekombináns eredetűek, csak csekély mértékben toxikusak. A DDY törzshöz tartozó felnőtt hím egereken (20 g körüli testtömegű egyedek) végzett 5 napos orális kezelés során a jelen találmány szerinti 20 fehérjék egyike sem mutatott toxicitást 500 mg/kg vagy ez alatti dózisban.
SZEKVENCIALISTA
1. Információk az 1. szekvenciához:
i) Szekvenciajellemzők:
Hossz: 1065
Típus: nukleinsav
Szálszám: kettős
Topológia: lineáris
Molekula típusa: cDNS vagy mRNS
Hipotetikus: nem
Antiszensz: nem
Forrás:
Szervezet: Homo sapiens Sejtvonal: KM-102
Szekvencia jellemzői:
18-614 E CDS 81 - 614 E mat_peptid 18-80 E sig_peptid xi) Szekvencia leírása: 1. szekvencia:
CCTGGCCCTG TGGGGAC ATG AAC TGT GTT TGC CGC CTG GTC 41
Met Asn Cys Val Cys Arg Leu Val -21 -20 -15
CTG Leu GTC Va 1 GTG Va 1 CTG AGC CTG Leu TGG CCA GAT ACA GCT GTC GCC 80
Leu -10 Ser Trp Pro As p -5 Thr Al a Va 1 Al a
CCT GGG CCA CCA CCT GGC CCC CCT CGA GTT TCC CCA GAC 1 19
Pro 1 Gly Pro Pro Pro 5 Gly Pro Pro Arg Va 1 10 Ser Pro As p
CCT CGG GCC GAG CTG GAC AGC ACC GTG CTC CTG ACC CGC 158
Pro Arg 15 Al a Glu Leu As p Ser 20 Thr Va 1 Le u Leu Thr 25 Arg
TCT CTC CTG GCG GAC ACG CGG CAG CTG GCT GCA CAG CTG 197
Ser Leu Leu Al a 30 As p Thr Arg Gin Leu 35 Al a Al a Gin Leu
AGG GAC AAA TTC CCA GCT GAC GGG GAC CAC AAC CTG GAT 236
Arg 40 Asp Ly s Phe Pro Al a 45 Asp Gly As p Hi s As n 50 Leu As p
TCC CTG CCC ACC CTG GCC ATG AGT GCG GGG GCA CTG GGA 275
Ser Leu Pro 55 Thr Leu Al a Me t Ser 60 Alá Gly Al a Leu Gly 65
GCT CTA CAG CTC CCA GGT GTG CTG ACA AGG CTG CGA GCG 314
Al a Leu Gin Leu Pro 70 Gly Val Leu Thr Arg 75 Leu Arg Al a
GAC CTA CTG TCC TAC CTG CGG CAC GTG CAG TGG CTG CGC 353
As p Leu 80 Leu Ser Tyr Leu Arg 85 Hi s Val Gin Trp Le u 90 Arg
CGG GCA GGT GGC TCT TCC CTG AAG ACC CTG GAG CCC GAG 392
Arg Al a Gly Gly 95 Ser Ser Leu Ly s Thr 100 Leu Glu Pro Glu
HU 217 803 Β
CTG Le u 105 GGC Gly ACC Thr CTG Leu CAG Gin GCC Al a 110 CGA Arg CTG GAC CGG CTG CTG CGC 431
Leu As p Arg Leu 1 15 Leu Arg
CGG CTG CAG CTC CTG ATG TCC CGC CTG GCC CTG CCC CAG 470
Arg Leu Gin Leu Leu Me t Ser Arg Leu Al a Leu Pro Gin
120 125 130
CCA CCC CCG GAC CCG CCG GCG CCC CCG CTG GCG CCC CCC 509
Pro Pro Pro Asp Pro Pro Al a Pro Pro Leu Al a Pro Pro
135 140
TCC TCA GCC TGG GGG GGC ATC AGG GCC GCC CAC GCC ATC 548
Ser Ser Al a Trp Gly Gly I 1 e Arg Al a Al a Hi s Al a I le
145 150 155
CTG GGG GGG CTG CAC CTG ACA CTT GAC TGG GCC GTG AGG 587
Leu Gly Gly Leu Hi s Leu Thr Leu As p Trp Ala Val Arg
160 165
GGA CTG CTG CTG CTG AAG ACT CGG CTG TGACCCGGGG 624
Gly Leu Leu Leu Leu Ly s Thr Arg Leu
170 175 178
CCCAAAGCCA CCACCGTCCT TCCAAAGCCA TTCAGTACTG GGGGCGAAAC AGCCAGGTGA CCTAGTTAGA GACAGTCCTT CCGTGAGGCC TTTATACTTA TTTATTTCAG GAGCAGGGGT GGTCCCCGAG GAGGAGGGGA CTGGGGTCCC AGTCTGTCCA CAGACTTCTG CCCTGGCTCT GGAACATATA TTATTTATTT AAGCAATTAC CGGAGGGGAA AGGGAAGCCT GGGTTTTTGT TGTGAGACAG AGAACAGGGA ATTAAATGTG
GATCTTATTT ATTTATTTAT 674 TCCCCCCGCC ATTATCTCCC 724 TGGGGGACAT CTGTGCCTTA 774 GGGAGGCAGG TGGACTCCTG 824 GGATTCTTGG GTCTCCAAGA 874 TCCCCATCTA GGCCTGGGCA 924 TTTTCATGTT GGGGTGGGGA 974 ACAAAAATGT GAGAAACCTT 1024 TCATACATAT C 1065
2. Információk a 2. szekvenciához: i) Szekvenciajellemzők:
Hossz: 199 Típus: aminosav Topológia: lineáris Hipotetikus: nem Forrás:
Szervezet: Homo sapiens
Sejtvonal: KM-102
Szekvencia jellemzői:
-21--1 E sig peptid
1-178 E mát peptid xi) Szekvencia leírása: 2. szekvencia
Met Asn Cys Val Cys Arg Leu -21 -20 -15
Trp Pro Asp Thr Ala Val Ala -5
Pro Arg Val Ser Pro Asp Pro 10
Val Leu Leu Thr Arg Ser Leu 25
Ala Ala Gin Leu Arg Asp Lys 40
Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr 50 55
Val Leu Val Val Leu -10 Ser Leu
Pro 1 Gly Pro Pro Pro 5 Gly Pro
Arg 15 Al a Glu Leu As p Ser 20 Thr
Leu Al a 30 As p Thr Arg Gin Leu 35
Phe Pro Al a 45 Asp Gly As p Hi s
Leu Al a Me t Ser Al a G1 y Al a
HU 217 803 Β
Leu Gly 65 Al a Leu Gin Leu Pro 70 Gly Va 1 Leu Thr Arg 75 Leu Arg
Al a As p Leu 80 Leu Ser Tyr Leu Arg 85 Hi s Va 1 Gin Trp Leu 90 Arg
Arg Al a Gly Gly 95 Ser Ser Leu Ly s Thr 100 Leu Glu Pro Glu Leu 105
Gly Thr Leu GI n Alá Arg 110 Leu Asp Arg Leu Leu 1 15 Arg Arg Leu
Gin 120 Leu Leu Me t Ser Arg 125 Le u Al a Leu Pro Gin Pro 130 Pro Pro
As p Pro 135 Pro Al a Pro Pro Leu 140 Al a Pro Pro Ser Ser 145 Al a Trp
Gly Gly I le 150 Arg Alá Alá Hi s Al a 155 I le Le u Gly Gly Leu 160 Hi s
Leu Thr Leu As p 165 Trp Alá Va 1 Arg GI y 170 Le u Leu Leu Leu Ly s 175
Thr Arg Leu

Claims (17)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Génmanipulációval előállított fehérje, azzal jellemezve, hogy alapvetően nem tartalmaz más, emberi eredetű fehérjét, adipogenezist gátló aktivitással rendelkezik és az alábbi tulajdonságokkal jellemezhető:
    1. látszólagos molekulatömege 23 000 Da (SDS poliakrilamidgél-elektroforézissel, redukáló körülmények között, 12,5%-os gélben);
  2. 2. N-terminális első tíz aminosavjának sorrendje megfelel a szekvencialista 2. számú szekvenciájában közöltnek; és
  3. 3. gyenge kationcserélővei végzett kromatografálás során 220 és 290 mmol/1 NaCl-koncentráció között eluálódik az alábbi körülmények között:
    a) CM-Toyopearl Pack 650M (2,2x20 cm, Tosoh Corporation) oszloptöltet,
    b) A-oldat [10 mmol/1 bórsav-NaOH (pH 9,0), 13 mmol/1 KC1] és B-oldat (300 mmol/1 NaCl-tartalmú A-oldat) eluáló pufferoldat,
    c) 3 ml/perc áramlási sebesség,
    d) lineáris koncentrációgradiens 100% A-oldattól 100% B-oldatig 50 perc alatt.
    2. Génmanipulációval előállított fehérje, azzal jellemezve, hogy alapvetően nem tartalmaz más, emberi eredetű fehérjét, adipogenezist gátló aktivitással rendelkezik, és aminosavsorrendje megfelel a szekvencialista 2. szekvenciájában közölt 1 és 178 közötti aminosavszekvenciának.
    3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti fehérje, azzal jellemezve, hogy N-terminálisán hidrogénatomja vagy metionincsoportja van.
  4. 4. DNS, azzal jellemezve, hogy az 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti fehérjét kódolja.
  5. 5. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti fehérjét kódoló DNS, azzal jellemezve, hogy nukleotidszekvenciája megfelel a szekvencialista 1. szekvenciájában szereplő 81 és 614 közötti nukleotidszekvenciának, vagy azzal ekvivalens.
  6. 6. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti fehérjét kódoló DNS, azzal jellemezve, hogy nukleotidszekvenciája megfelel a szekvencialista 1. szekvenciájában szereplő 81 és 614 közötti nukleotidszekvenciának.
  7. 7. A 4., 5. vagy 6. igénypont szerinti DNS, azzal jellemezve, hogy 5’-vége ATG.
  8. 8. Rekombináns DNS-expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy a 4., 5., 6. vagy 7. igénypont szerinti DNS-t tartalmazza, és a szóban forgó DNS expresszálható és replikálható.
  9. 9. Gazdaszervezet, azzal jellemezve, hogy a 8. igénypont szerinti expressziós vektorral van transzformálva.
  10. 10. Eljárás fehérje előállítására, azzal jellemezve, hogy
    - egy, az 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti fehéijét kódoló DNS-t tartalmazó rekombináns DNS-expressziós vektorral transzformált gazdaszervezetet tenyésztünk, ahol a szóban forgó DNS expresszálható és replikálható, és
    - a kapott fehérjét a sejtekből vagy a tenyészléből kinyerjük.
  11. 11. Gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy valamely, az 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti fehérje terápiásán hatásos mennyiségét tartalmazza, gyógyászatilag elfogadható hordozó- vagy segédanyagokkal együtt.
    HU 217 803 Β
  12. 12. Citopénia amelioráns készítmény, azzal jellemezve, hogy valamely, az 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti fehérje terápiásán hatásos mennyiségét tartalmazza, gyógyászatilag elfogadható hordozó- vagy segédanyagokkal együtt.
  13. 13. Elhízás elleni készítmény, azzal jellemezve, hogy valamely, az 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti fehérje terápiásán hatásos mennyiségét tartalmazza, gyógyászatilag elfogadható hordozó- vagy segédanyagokkal együtt.
  14. 14. Génmanipulációval előállított fehérje, azzal jellemezve, hogy alapvetően nem tartalmaz más, emberi eredetű fehéijét, adipogenezist gátló aktivitással rendelkezik és az alábbi tulajdonságokkal jellemezhető:
    1. látszólagos molekulatömege 23 000 Da (SDS poliakrilamidgél-elektroforézissel, redukáló körülmények között, 12,5%-os gélben);
    2. N-terminális első tíz aminosavjának szekvenciája: (N)-Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val; és
    3. gyenge kationcserélővei végzett kromatografálás során 220 és 290 mmol/1 NaCl-koncentráció
    5 között eluálódik az alábbi körülmények között:
    a) CM-Toyopearl Pack 650M (2,2x20 cm, Tosoh Corporation) oszloptöltet,
    b) A-oldat [10 mmol/1 bórsav-NaOH (pH 9,0), 13 mmol/1 KC1] és B-oldat (300 mmol/1
    10 NaCl-tartalmú A-oldat) eluáló pufferoldat,
    c) 3 ml/perc áramlási sebesség,
    d) lineáris koncentrációgradiens 100% A-oldattól 100% B-oldatig 50 perc alatt.
  15. 15. Génmanipulációval előállított fehérje, azzal jel15 lemezve, hogy alapvetően nem tartalmaz más, emberi eredetű fehérjét, adipogenezist gátló hatású és aminosavsorrendje a következő:
    (N) - -Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Va 1 Ser Pro Asp Pro Arg Al a Glu Le u As p Ser Thr Va 1 Leu Leu Thr Arg Ser Leu Leu Al a As p Thr Arg Gin Leu Al a Al a Gin Leu Arg As p Ly s Phe Pro Al a Asp Gly As p Hi s As n Leu As p Ser Leu Pro Thr Leu Al a Me t Ser Al a Gly ALa Leu Gly Al a Leu Gin Leu Pro Gly Va 1 Leu Thr Arg Leu Arg Al a Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg Hi s Val Gl n Trp Leu Arg Arg Al a Gly Gly Ser Ser Le u Ly s Thr Leu Glu Pro Glu Le u Gly Thr Leu Gin Al a Arg Le u As p Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gl n Leu Leu Me t Ser Arg Leu Al a Leu Pro Gin Pro Pro Pro Asp Pro Pro Al a Pro Pro Leu Al a Pro Pro Ser Ser Al a Trp Gly Gly I 1 e Arg Alá Al a Hi s Al a I 1 e Leu Gly Gly Leu Hi s Le u Thr Leu As p Trp Al a Va 1 Arg Gly Leu Leu Leu Leu Ly s Thr Arg Leu -(C)
    (I) szekvencia
  16. 16. DNS, azzal jellemezve, hogy egy, a 16. vagy 17. igénypont szerinti fehérjét kódol, és nukleotidszekvenciája a következő vagy azzal egyenértékű: 35
    CCT GGC CCC CCT CGA GTT TCC CCA GAC CCT (5’)-CCT GGG CCA CCA GAC CGG GCC GAG CTG AGC ACC GTG CTG CTG ACC CGC TCT CTC CTG GCG GAC ACG CGG CAG CTG GCT GCA CAG CTG AGG GAC AAA TTC CCA GCT GAC GGG GAC CAC AAC CTG GAT TCC CTG CCC ACC CTG GCC ATG AGT GCG GGG GCA CTG GGA GCT CTA CAG CTC CCA GGT GTG CTG ACA AGG CTG CGA GCG GAC CTA CTG TCC TAC CTG CGG CAC GTG CAG TGG CTG CGC CGG GCA GGT GGC TCT TCC CTG AAG ACC CTG GAG CCC GAG CTG GGC ACC CTG CAG GCC CGA CTG GAC CGG CTG CTG CGC CGG CTG CAG CTC CTG ATG TCC CGC CTG GCC CTG CCC CAG CCA CCC CCG GAC CCG CCG GCG CCC CCG CTG GCG CCC CCC TCC TCA GCC TGG GGG GGC ATC AGG GCC GCC CAC GCC ATC CTG GGG GGG CTG CAC CTG ACA CTT GAC TGG GCC GTG AGG GGA CTG CTG CTG CTG AAG ACT CGG CTG -(3’ )
    (II) szekvencia
  17. 17. DNS, azzal jellemezve, hogy egy, a 16. vagy 17. igénypont szerinti fehérjét kódol, és nukleotidszekvenciája a következő:
    (5’)- CCT GGG CCA CCA CCT GGC CCC CCT CGA GTT TCC CCA GAC CCT CGG GCC GAG CTG GAC AGC ACC GTG CTG CTG ACC CGC TCT CTC CTG GCG GAC ACG CGG CAG CTG GCT GCA CAG CTG AGG GAC AAA TTC CCA GCT GAC GGG GAC CAC AAC CTG GAT TCC CTG CCC ACC CTG GCC ATG AGT GCG GGG GCA CTG
    HU 217 803 Β
    GGA GCT CTA CAG CTC CCA GGT GTG CTG ACA AGG CTG CGA GCG GAC CTA CTG TCC TAC CTG CGG CAC GTG CAG TGG CTG CGC CGG GCA GGT GGC TCT TCC CTG AAG ACC CTG GAG CCC GAG CTG GGC ACC CTG CAG GCC CGA CTG GAC CGG CTG CTG CGC CGG CTG CAG CTC CTG ATG TCC CGC CTG GCC CTG CCC CAG CCA CCC CCG GAC CCG CCG GCG CCC CCG CTG GCG CCC CCC TCC TCA GCC TGG GGG GGC ATC AGG GCC GCC CAC GCC ATC CTG GGG GGG CTG CAC CTG ACA CTT GAC TGG GCC GTG AGG GGA CTG CTG CTG CTG AAG ACT CGG CTG- (3’)
    (II) szekvencia
HU9301330A 1990-11-08 1991-11-07 Új citokin HU217803B (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP30355890 1990-11-08
JP878591 1991-01-29

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9301330D0 HU9301330D0 (en) 1993-09-28
HUT66624A HUT66624A (en) 1994-12-28
HU217803B true HU217803B (hu) 2000-04-28

Family

ID=26343378

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9301330A HU217803B (hu) 1990-11-08 1991-11-07 Új citokin

Country Status (11)

Country Link
EP (1) EP0556395B1 (hu)
JP (1) JP2752819B2 (hu)
KR (1) KR0139095B1 (hu)
AT (1) ATE250935T1 (hu)
CA (1) CA2095840A1 (hu)
DE (1) DE69133321T2 (hu)
DK (1) DK0556395T3 (hu)
ES (1) ES2206440T3 (hu)
HK (1) HK1017817A1 (hu)
HU (1) HU217803B (hu)
WO (1) WO1992008735A1 (hu)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0566410A3 (en) 1992-04-17 1994-08-24 Sankyo Co Derivatives of adipogenesis inhibitory factor, their preparation and their use

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5215895A (en) * 1989-11-22 1993-06-01 Genetics Institute, Inc. Dna encoding a mammalian cytokine, interleukin-11

Also Published As

Publication number Publication date
EP0556395B1 (en) 2003-10-01
CA2095840A1 (en) 1992-05-09
WO1992008735A1 (en) 1992-05-29
EP0556395A4 (en) 1994-08-24
ES2206440T3 (es) 2004-05-16
HK1017817A1 (en) 1999-11-26
HU9301330D0 (en) 1993-09-28
DE69133321T2 (de) 2004-07-29
ATE250935T1 (de) 2003-10-15
EP0556395A1 (en) 1993-08-25
DE69133321D1 (de) 2003-11-06
KR930702525A (ko) 1993-09-09
HUT66624A (en) 1994-12-28
KR0139095B1 (ko) 1998-04-30
DK0556395T3 (da) 2004-02-02
JPH0592997A (ja) 1993-04-16
JP2752819B2 (ja) 1998-05-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Nagata et al. Molecular cloning and expression of cDNA for human granulocyte colony-stimulating factor
Yokota et al. Use of a cDNA expression vector for isolation of mouse interleukin 2 cDNA clones: expression of T-cell growth-factor activity after transfection of monkey cells.
US6790826B2 (en) Human haemopoietic maturation factor
Matsumura et al. Thrombopoietin-induced differentiation of a human megakaryoblastic leukemia cell line, CMK, involves transcriptional activation of p21 WAF1/Cip1 by STAT5
EP0473724B1 (en) A human cytokine, interleukin-9
EP0256843A1 (en) Expression of g-csf and muteins thereof and their use
FI100972B (fi) Pesäkkeitä stimuloivaa tekijä-1:tä (CSF-1) koodaava DNA-sekvenssi ja m enetelmä CSF-1-proteiinin valmistamiseksi
AU606585B2 (en) Human granulocyte-macrophage colony stimulating factor-like polypeptides and processes for producing them in high yields in microbial cells
CA1341461C (en) T helper cell growth factor
JP2003047492A (ja) ヒトケモカインベータ−９
CN101190944A (zh) 人类新细胞因子及其用途
JP2002507125A (ja) カルジオトロフィン様サイトカイン
US6180773B1 (en) Tandem cDNAs encoding chemokines CC-1, CC-2, and CC-3
EP0328061A2 (en) Human colony-stimulating factors
HU217803B (hu) Új citokin
US5681723A (en) Mutant interleukin 6 with improved biological activity over wild interleukin 6
US5650297A (en) DNA encoding human colony-stimulating factors
JP2004505021A (ja) 多発性硬化症治療のための新規なインターフェロン
CN1451016A (zh) 人子宫颈癌抑制蛋白,编码该蛋白的多核苷酸,用该多核苷酸转化的细胞和用表达载体抑制癌细胞增殖的方法
RU2158307C2 (ru) Рекомбинантный белок-фактор ингибирования липогенеза, днк, его кодирующая, вектор экспрессии, рекомбинантный штамм клеток млекопитающих соs 1-продуцент фактора ингибирования липогенеза, способ его получения и композиция, обладающая активностью ингибирования липогенеза
CN1244584A (zh) 具有免疫细胞趋化和造血刺激活性的趋化因子
US6518043B1 (en) Proteins suppressing proliferation of lympho-hematopoietic cells
AU599891B2 (en) CDNA clones coding for polypeptides exhibiting murine interleukin-2 activity
JP3689111B2 (ja) インターロイキン１５
Miller et al. Thioredoxin Acts as a B Cell Growth Factor