JPH10502811A

JPH10502811A - 増殖分化因子−１１

Info

Publication number: JPH10502811A
Application number: JP8504413A
Authority: JP
Inventors: リー，セ−ジン; シー．マックファーロン，アレクサンドラ
Original assignee: ザジョーンズホプキンスユニバーシティースクールオブメディシン
Priority date: 1994-07-08
Filing date: 1995-07-07
Publication date: 1998-03-17
Also published as: EP1574577A3; WO1996001845A1; EP0776337A4; DE69534468T2; DE69534468D1; CA2194660C; DK0776337T3; CA2194660A1; US20020150577A1; US5914234A; EP1574577A2; EP0776337B1; ES2251721T3; EP0776337A1; ATE305036T1

Abstract

(57)【要約】増殖分化因子−１１（ＧＤＦ−１１）を、そのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列とともに記載する。また、ＧＤＦ−１１ポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列を用いる診断ならびに治療方法も記載する。

Description

【発明の詳細な説明】増殖分化因子-11 発明の背景１．発明の分野本発明は増殖因子に関し、特に増殖分化因子-11（ＧＤＦ-11）と称する、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーの新しいメンバーに関する。２．関連技術の説明トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーは、胚発生期の広範な分化過程に影響を与える構造的に関連した１群のタンパク質を包含する。このファミリーは、正常な雄性発達に必要なミュラー(Mullerian)抑制物質（ＭＩＳ）(Behringerら，Nature，345:167，1990)、背−腹軸形成および成虫原基の形態形成に必要なショウジョウバエデカペンタプレジック(decapentapleg ic)(ＤＰＰ)遺伝子産物(Padgettら，Nature，325:81-84，1987)、卵の植物極に局在するアフリカツメガエルVg-1遺伝子産物(Weeksら，Cell，51:861-867，1987 )、アフリカツメガエル胚における中胚葉および前葉構造の形成を誘導することができる(Thomsenら，Cell，63:485，1990)アクチビン(activin)(Masonら，Bioc hem．Biophys．Res．Commun.，135:957-964，1986)、およびde novo で軟骨および骨形成を誘導することができる(Sampathら，J．Biol．Chem.，265:13198，199 0)骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ、オステオゲニン、ＯＰ−１）を含む。ＴＧＦ −β類は、脂肪組織形成、筋形成、軟骨形成、造血および上皮細胞分化を含む種々の分化過程に影響を及ぼすことができる（総論については、Massague，Cell 4 9:437，1987 参照）。ＴＧＦ−βファミリーのタンパク質は最初大きい前駆体タンパク質として合成され、これは次にＣ末端から約110〜140アミノ酸はなれた塩基性残基の集団（クラスター）の箇所で加水分解開裂を受ける。このタンパク質のＣ末端領域、つまり成熟領域はすべて構造的に関連しており、また異なるファミリーメンバーは相同性の程度に基づいて個別のサブグループに分類することができる。特定サブグループ内の相同性はアミノ酸配列同一性が70%から90%の範囲であるが、サブグループ間の相同性はこれより有意に低く、一般に20%から50%に過ぎない。各場合において、活性種はＣ末端断片のジスルフィド結合二量体であるように思われる。研究は、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーの前領域(pro-region)をＴＧＦ−βファミリーの別のメンバーの成熟領域と共に同時発現させた場合、生物的に活性なホモ二量体の細胞内二量体化および分泌が起こることを示した(Gray，A.およびM aston，A.，Science，247:1328，1990)。Hammondsら(Molec．Emdocrin，5:149， 1991)によるさらなる研究は、BMP-4成熟領域と組み合わせたBMP-2前領域の使用が、成熟BMP-4の発現を劇的に向上させることを示した。研究されたファミリーメンバーの殆どについて、ホモ二量体種が生物的に活性であることが判明したが、インヒビン類(Lingら，Nature，321:779，1986)およびＴＧＦ−β類(Cheifetz ら，Cell，48:409，1987)のような他のファミリーメンバーについては、ヘテロ二量体もまた検出された。そして、これらは個々のホモ二量体とは異なる生物的特性を有するように思われる。発現パターンが組織特異的である新規な因子の同定は、その組織の発生および機能の理解をより深めるであろう。発明の概略本発明は、細胞増殖および分化因子ＧＤＦ-11、この因子をコードするポリヌクレオチド配列、およびこの因子に結合する抗体を提供する。この因子は、種々の細胞増殖疾患、特に筋肉、神経および子宮細胞に関与する細胞増殖疾患、ならびに免疫系の機能に関連する疾患に関連するように思われる。したがって、本発明は１つの実施態様において、ＧＤＦ-11に関連する、筋肉、神経、子宮、脾臓または胸腺起源の細胞増殖疾患を検出する方法を提供する。また別の実施態様において、本発明はＧＤＦ-11活性を抑制または増強することによる細胞増殖疾患または免疫疾患の治療法を提供する。図面の簡単な説明図１は、マウス（図1a）およびヒト（図1b）ＧＤＦ-11のヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配列を示す。推定上のタンパク質分解プロセシング部位が、陰をつけた四角で示されている。ヒト配列において、潜在的N-結合グリコシル化シグナルは白抜きの四角で示されており、共通ポリアデニル化シグナルには下線がほどこしてある。ポリＡ尾部は図示されていない。図２は、マウスＧＤＦ-11プローブを用いて釣り上げた、成体（図2a）または胎児および新生児（図2b）組織より調製したＲＮＡのノーザンブロットを示す。図３は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの異なるメンバーとのアミノ酸相同性を示す。数字は、第１番目の保存されたシステインからＣ末端までの間で計算された各対間のアミノ酸同一性パーセントを示す。四角は、特定サブグループ内の高度に関連したメンバー間の相同性を示す。図４は、ヒトＧＤＦ-11（上段）およびヒトＧＤＦ-8（下段）の推定されるアミノ酸配列を並べて示す。縦の線は同一であることを示す。点は列を最大限にそろえるために導入された空隙(gap)を表す。数字はＮ末端からのアミノ酸の位置を表す。推定上のタンパク質分解プロセシング部位を白抜き四角で示す。Ｃ末端領域の保存されたシステイン残基を陰をつけた四角で示す。図５は、哺乳動物細胞におけるＧＤＦ-11の発現を示す。MSXND 発現ベクター中にアンチセンス（レーン１）またはセンス（レーン２）方向にクローン化したハイブリッドＧＤＦ-8/ ＧＤＦ-11 遺伝子（本文参照）を用いてトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣細胞から調製したならし培地を、透析し、凍結乾燥し、そしてＧＤＦ-8タンパク質のＣ末端部分に対して作成された抗体を用いるウエスタン分析にかけた。右側の矢印は、推定上のプロセシングされていない（前ＧＤＦ-8/ ＧＤＦ-11）またはプロセシングされたＧＤＦ-11タンパク質を示す。左側の数字は、分子量標準物質の移動度を示す。図６は、ヒトＧＤＦ-11の染色体マッピングを示す。ヒト／齧歯類体細胞系より調製したＤＮＡサンプルをＰＣＲにかけ、アガロースゲル上で電気泳動し、ブロットし、プローブで釣り上げた。ハイブリッド細胞系の各々に含有されるヒト染色体が、最初の２４レーン（1〜22、ＸおよびＹ）のそれぞれの一番上に同定される。CHO、ＭおよびＨと記したレーンでは、最初のＤＮＡ鋳型がそれぞれハムスター、マウス、およびヒト由来の全ゲノムＤＮＡであった。Ｂ１と記したレーンでは、鋳型ＤＮＡを全く用いなかった。左側の数字は、ＤＮＡ標準物質の移動度を示す。図７は、ＧＤＦ-11のＦＩＳＨ局在化を示す。末梢血リンパ細胞より誘導した分裂中期染色体をジゴキシゲニン(digoxigenin)標識化ヒトＧＤＦ-11プローブ(a )、またはヒトＧＤＦ-11ゲノムプローブと染色体12特異的セントロメアプローブとの混合物(b)にハイブリダイズさせ、そして本文中に記述するように分析した。ＧＤＦ-11が位置12q13に存在することを示す図が、パネル(c)に掲げられている。図８は、マウスＧＤＦ-8のヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配列を示す。発明の詳細な説明本発明は、増殖および分化因子ＧＤＦ-11、およびＧＤＦ-11をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。ＧＤＦ-11は筋肉、脳、子宮、脾臓および胸腺において最高レベルで発現され、他の組織においてはより低いレベルで発現される。１つの実施態様において、本発明はＧＤＦ-11の発現または機能に関連する、筋肉、神経、子宮、脾臓または胸腺起源の細胞増殖疾患又は免疫疾患の検出法を提供する。また別の実施態様において、本発明はＧＤＦ-11活性を抑制または増進する作用物質を用いることによる細胞増殖疾患または免疫疾患の治療法を提供する。ＴＧＦ−βスーパーファミリーは、多数の細胞型において増殖、分化、および他の機能を制御する多機能性ポリペプチドから成る。これらペプチドの多くは他のペプチド増殖因子に対し正および負の両方の調節効果を有する。本発明のＧＤＦ-11タンパク質とＴＧＦ−βファミリーメンバーとの間の構造的相同性は、ＧＤＦ-11がこの増殖および分化因子のファミリーの新規なメンバーであることを示している。他の多数のメンバーの公知の活性に基づいて、ＧＤＦ-11もまた診断および治療用試薬として有用な生物活性を有することが予想できる。このスーパーファミリーのあるメンバーは、神経系の機能に関連する発現パターンまたは活性を有する。例えば、ファミリーの１メンバーであるＧＤＮＦは、ドーパミン作動性ニューロンの生存を促進することができる強力な神経栄養性因子であることが示されている(Linら，Science，260:1130)。別のファミリーメンバーであるドルサリン-1(dorsalin-1)は、神経堤細胞の分化を促進しうる(Basle rら，Cell，73:687，1993)。インヒビンおよびアクチビンは脳で発現されることが示されている(Meunierら，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，85:247，1988; S awchenkoら，Nature，334:615，1988)。そして、アクチビンは神経細胞生存分子として機能しうることが示されている(Schubertら，Nature，344:868，1990)。別のファミリーメンバーであるＧＤＦ−１は、発現パターンにおいて神経系特異的であり(Lee，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，88:4250，1991)、また、他のファミリーメンバーのあるもの、例えばＶｇｒ−１(Lyonsら，Proc．Natl．Acad ．Sci．U.S.A.，86:4554，1989; Jonesら，Development，111:581，1991)、ＯＰ −１(Ozkaynakら，J．Biol．Chem.，267:25220，1992)、およびＢＭＰ−４(Jone sら，Development，111:531，1991)もまた、神経系で発現されることが知られている。脳および筋肉におけるＧＤＦ-11の発現は、ＧＤＦ-11もまた神経系の機能に関連した活性を有する可能性があることを示唆する。特に、例えば、骨格筋は運動ニューロンの生存を促進する１つまたは複数の因子を生ずることが知られている(Brown，Trends Neurosci.，7:10，1984)。このファミリーの他のメンバーの公知の神経栄養性活性および筋肉におけるＧＤＦ-11の発現は、ＧＤＦ-11の活性の１つは運動ニューロンに対する栄養因子としての活性でありうることを示唆する。実際、ＧＤＦ-11は、発現パターンにおいて殆ど筋肉特異的であるＧＤＦ- 8に高度に関連している。または、ＧＤＦ-11は他のニューロン集団に対する神経栄養性活性を有するのかもしれない。したがって、ＧＤＦ-11は筋萎縮性側索硬化等の神経変性疾患の治療において、または移植前培養中の細胞または組織の維持において、in vitroおよびin vivoの用途を持ちうる。ＧＤＦ-11はまた、筋肉変性疾患または傷による組織修復、等の筋肉が関与する疾患過程の治療においても用途をもちうる。この点に関して、ＴＧＦ−βファミリーの他の多くのメンバーは組織補修の重要な媒介体でもある。ＴＧＦ−βはコラーゲンの形成に対して顕著な効果を及ぼし、そして新生マウスにおいてめざましい血管形成応答を引き起こすことが示されている(Robertら，Proc．Natl．A cad．Sci．USA 83:4167，1986)。ＴＧＦ−βはまた、培養中の筋芽細胞の分化を抑制することが示されている(Massagueら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 83:820 6，1986)。さらに、筋芽細胞は遺伝子療法において遺伝子を筋肉に運ぶ伝達体として用いることができるので、移植前の細胞を維持するため、または融合プロセスの効率を高めるためにＧＤＦ-11の特性を利用することができるであろう。ＧＤＦ-11はまた、免疫疾患の治療においても用途をもちうる。特に、ＴＧＦ −βは、ＢおよびＴ細胞の増殖および機能に対する強力な抑制効果を含む広範な免疫調節活性を有することが示されている（総論については、Palladinoら，Ann ．N.Y．Acad．Sci.，593:181，1990参照）。脾臓および胸腺におけるＧＤＦ-11 の発現は、ＧＤＦ-11が類似の活性を有しうること、そしてそれゆえ抗炎症剤として、またはリンパ細胞の異常な増殖若しくは機能に関連する疾患の治療に使用しうることを示唆している。本明細書で用いる「実質的に純粋な」という用語は、天然において関連している他のタンパク質、脂質、炭水化物、または他の物質を実質的に含まないＧＤＦ -11をさす。当業者はタンパク質精製のための標準的技法を用いてＧＤＦ-11を精製することができる。実質的に純粋なポリペプチドは非還元性ポリアクリルアミドゲル上に単一の主要バンドを生じる。ＧＤＦ-11ポリペプチドの純度は、アミノ末端アミノ酸配列分析によっても確認できる。ＧＤＦ-11ポリペプチドには、ＧＤＦ-11の活性が残存するものであれば該ポリペプチドの機能性断片が含まれる。ＧＤＦ-11の生物活性を有するより小さいペプチドも本発明に包含される。本発明はＧＤＦ-11タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。これらのポリヌクレオチドには、ＧＤＦ-11をコードするＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡ配列が含まれる。ＧＤＦ-11の全部または一部をコードする全てのポリヌクレオチドもまた、ＧＤＦ-11活性を有するポリペプチドをコードする限り、ここに含まれることが理解される。そのようなポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、および意図的に操作されたポリヌクレオチドを包含する。例えば、ＧＤＦ-11ポリヌクレオチドを部位特異的突然変異誘発にかけることが可能である。ＧＤＦ-11のポリヌクレオチド配列は、アンチセンス配列をも含む。本発明のポリヌクレオチドは、遺伝暗号の縮重の結果、縮重した配列をも包含する。20個の天然のアミノ酸が存在するが、それらの殆どは２個以上のコドンによって特定される。したがって、ヌクレオチド配列によってコードされるＧＤＦ-11ポリペプチドのアミノ酸配列が機能的に変化していないかぎり、すべての縮重したヌクレオチド配列は本発明に包含される。本明細書では、ヒトＧＤＦ-11遺伝子を含有するＤＮＡ配列を具体的に開示する。この配列は、長さが407アミノ酸であるポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含有する。この配列はアミノ酸295〜298に推定上のRXXR タンパク質分解開裂部位を有する。この部位における前駆体の開裂は、長さが10 9アミノ酸で、予想される分子量が約12,500 kDである活性なＣ末端断片を生じるであろう。本明細書はまた、部分的マウスゲノム配列を開示する。好ましくは、ヒトＧＤＦ-11ヌクレオチド配列は配列番号：１であり、マウスヌクレオチド配列は配列番号：３である。ＧＤＦ-11をコードするポリヌクレオチドは、配列番号：１および３、ならびに配列番号：１および３に相補的な核酸配列を含む。相補配列はアンチセンスヌクレオチドを含みうる。配列がＲＮＡの場合、配列番号：１および３のデオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、ＣおよびＴは、それぞれリボヌクレオチドＡ、Ｇ、ＣおよびＵに置き換えられる。長さが少なくとも15塩基の、上記の核酸配列の断片もまた本発明に含まれる。この長さは、断片が配列番号：２または４のタンパク質をコードするＤＮＡに生理的条件下で選択的にハイブリダイズするのを可能とするに十分である。推定上のタンパク質分解プロセシング部位に続くＧＤＦ-11のＣ末端領域は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの公知メンバーに有意な相同性を示す。ＧＤＦ-1 1配列は、他のファミリーメンバーにおいて高度に保存されている残基の殆どを含有している（図１参照）。ＴＧＦ−βおよびインヒビンβと同様、ＧＤＦ-11 は他のファミリーメンバーの殆どに見いだされる７個のシステインに加え、システイン残基の余分な対を有する。公知のファミリーメンバーのうち、ＧＤＦ-11 はＧＤＦ-8に最も相同的である(92%配列同一性)（図３参照）。組換えＧＤＦ-11一次アミノ酸配列のマイナーな改変は、本明細書に記載のＧＤＦ-11ポリペプチドに比較して実質的に同等の活性を有するタンパク質をもたらしうる。このような改変は、部位特異的突然変異誘発によるもののように意図的なものも、また自然発生的なものもある。このような改変によってもたらされたポリペプチドはすべて、ＧＤＦ-11の生物活性が存在するかぎり、本発明に包含される。さらに、１個または複数のアミノ酸の欠失もまた、生物活性を有意に変更することなく、結果として生ずる分子の構造の改変をもたらしうる。これは、より広い有用性をもつ、より小さい活性分子の開発をもたらしうる。例えば、ＧＤＦ-11生物活性に必要とされないアミノまたはカルボキシ末端アミノ酸を除去することができる。本発明のＧＤＦ-11ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、開示された配列およびその同類変形を包含する。ここで使用する「同類変形(conservativ e variation)」という用語は、アミノ酸残基を別の、生物学的に類似の残基で置換することをさす。同類変形の例は、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニン等の疎水性残基の別の疎水性残基との置換、またはある極性残基の別の極性残基との置換（例えば、アルギニンをリシンに、グルタミン酸をアスパラギン酸に、またはグルタミンをアスパラギンに置換する）等を含む。「同類変形」という用語は、置換したポリペプチドに対して作成された抗体が非置換ポリペプチドとも免疫反応するならば、非置換親アミノ酸の代わりに置換したアミノ酸を使用することをも含む。本発明のＤＮＡ配列は、幾つかの方法によって取得できる。例えば、上記ＤＮＡは当分野で周知のハイブリダイゼーション技法を用いて単離することができる。これらの方法には以下のものが含まれるがそれだけに限定されない。すなわち、１）相同的ヌクレオチド配列を検出するための、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーのプローブとのハイブリダイゼーション、２）興味のあるＤＮＡ配列とアニーリングが可能なプライマーを用いた、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）、および３）共通の構造的特徴をもつクローン化ＤＮＡ断片を検出するための、発現ライブラリーの抗体スクリーニングである。好ましくは、本発明のＧＤＦ-11ポリヌクレオチドは哺乳動物、そして最も好ましくはマウス、ラットまたはヒトから引き出される。核酸ハイブリダイゼーションに依存するスクリーニング手順は、適切なプローブがあれば、任意の生物から任意の遺伝子配列を単離することを可能とする。当該タンパク質をコードする配列の一部に対応するオリゴヌクレオチドプローブは、化学的に合成することができる。このためには、アミノ酸配列の中の短い、一続きのオリゴペプチドが分かっていなければならない。タンパク質をコードするＤＮＡ配列は遺伝子暗号から推論することができるが、暗号の縮重を考慮しなければならない。配列が縮重している場合、混合付加反応を実施することができる。これは、変性２本鎖ＤＮＡの異種混合物を包含する。このようなスクリーニングのためには、１本鎖ＤＮＡまたは変性２本鎖ＤＮＡを用いてハイブリダイゼーションを実施するのが好ましい。興味のあるポリペプチドに関連するｍＲＮＡ配列が極めて少量しか存在しない供給源より引き出したｃＤＮＡクローンの検出には、ハイブリダイゼーションが特に有用である。つまり、非特異的結合を避けるためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を用いることにより、例えば、標的ＤＮＡと混合物中の単一プローブ（該ＤＮＡの完全な相補体である）とのハイブリダイゼーションによって、特定ｃＤＮＡクローンのオートラジオグラフィーによる視覚化を可能とすることができる(Wallaceら，Nucl．Acid Res.，9:879，1981; Maniatisら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor，N.Y.，198 9)。ＧＤＦ-11をコードする特定ＤＮＡ配列の展開もまた、１）ゲノムＤＮＡからの２本鎖ＤＮＡの単離；２）興味のあるポリペプチドに必要なコドンを提供するＤＮＡ配列の化学的製造；および３）真核ドナー細胞から単離したｍＲＮＡの逆転写による２本鎖ＤＮＡ配列のin vitro合成、によって得ることができる。後者の場合、一般にｃＤＮＡと呼ばれる、ｍＲＮＡの２本鎖ＤＮＡ相補体が最後に形成される。組換え手順に使用する特定ＤＮＡ配列を展開するための上記の３つの方法のうち、ゲノムＤＮＡ単離体の単離は最も一般的でない方法である。イントロンの存在ゆえに、哺乳動物ポリペプチドの微生物による発現を得ることが望ましい場合は、特にそうである。所望のポリペプチド産物のアミノ酸残基の全配列が分かっている場合、ＤＮＡ配列の合成はしばしば最良の方法である。所望のポリペプチドのアミノ酸残基の全配列が分かっていない場合、ＤＮＡ配列の直接合成は不可能であり、最良の方法はｃＤＮＡ配列の合成である。興味のあるｃＤＮＡ配列を単離するための標準的手順の中に、高レベルで遺伝子を発現するドナー細胞中に豊富に存在するｍＲＮＡの逆転写によって引き出される、プラスミドまたはファージに担持されるｃＤＮＡライブラリーの形成がある。ポリメラーゼチェーンリアクション技術と組み合わせて用いた場合、稀少な発現産物であってもクローン化が可能である。ポリペプチドのアミノ酸配列の重要な部分が分かっている場合、標的ｃＤＮＡに存在すると推定される配列を写した、標識化１本または２本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプローブ配列の作成を、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション手順に採用しうる。この手順は、１本鎖形態に変性させたｃＤＮＡのクローン化コピーを用いて実施される(Jayら，Nucl．Acid Res.，11:2325，1983)。ＧＤＦ-11に特異的な抗体を用いて、少なくとも１個のエピトープを有するＧＤＦ-11ペプチドについて、λ gt11 等のｃＤＮＡ発現ライブラリーを間接的にスクリーニングすることができる。そのような抗体はポリクローナル的またはモノクローナル的に誘導して、ＧＤＦ-11 ｃＤＮＡの存在を示す発現産物の検出に使用することができる。ＧＤＦ-11をコードするＤＮＡ配列は、適切な宿主細胞へのＤＮＡ導入によりi n vitroで発現させることができる。「宿主細胞」とは、その中でベクターが増殖可能であって、そのＤＮＡが発現される細胞をいう。この用語はまた、本宿主細胞の任意の子孫をも包含する。全ての子孫が親細胞と同一ではないかもしれない、ということが理解される。なぜなら、複製の際に起こる突然変異がありうるからである。しかし、「宿主細胞」という用語を用いるとき、そのような子孫も包含される。安定した（外来ＤＮＡが宿主中に継続的に維持される、の意）ＤＮＡ導入法は当分野で公知である。本発明において、ＧＤＦ-11ポリヌクレオチド配列を組換え発現ベクターに挿入することができる。「組換え発現ベクター」という用語は、ＧＤＦ-11遺伝子配列の挿入または組み込みにより遺伝子的に操作された、プラスミド、ウイルス、または当分野で公知の他の伝達体をいう。このような発現ベクターは、宿主の挿入遺伝子配列の効率的転写を促進するプロモーター配列を含有する。発現ベクターは典型的には複製起点、プロモーター、および形質転換細胞の表現型選択を可能とする特定の遺伝子を含有する。本発明に使用するのに適切なベクターは、以下のものを含むがそれらだけに限定されない。すなわち、細菌における発現のためのＴ７に基づく発現ベクター(Rosenbergら，Gene，56:125，1987)、哺乳動物細胞における発現のためのpMSXND発現ベクター(LeeおよびNathans，J．Biol．Ch em.，263:3521，1988)および昆虫細胞における発現のためのバキュロウイルス由来のベクターである。ＤＮＡセグメントは、調節エレメント、例えばプロモーター（例：Ｔ７、メタロチオネインＩ、またはポリヘドリンプロモーター）に機能しうる形で連結されてベクター内に存在しうる。ＧＤＦ-11をコードするポリヌクレオチド配列は、原核生物または真核生物において発現させることができる。宿主は、微生物、酵母、昆虫および哺乳動物を含みうる。真核生物またはウイルスの配列を有するＤＮＡ配列を原核生物において発現させる方法は、当分野で周知である。宿主中で発現および複製が可能な、生物的に機能性のウイルスおよびプラスミドＤＮＡベクターが、当分野で公知である。そのようなベクターは、本発明のＤＮＡ配列を組み込むために使用される。好ましくは、ＧＤＦ-11の全コード配列を含有するｃＤＮＡクローンから、ＧＤＦ-11の成熟Ｃ末端領域を発現させる。または、ＧＤＦ-11のＣ末端部分を、ＴＧＦ−βファミリーの他のメンバーの前領域を有する融合タンパク質として発現させるか、あるいは他の前領域とともに同時発現させることができる（例えば、 Hammondsら，Molec．Endocrin．5:149，1991; Gray，A およびMason，A.，Scien ce，247:1328，1990参照）。組換えＤＮＡを用いた宿主細胞の形質転換は、当業者に周知の通常の技法により実施することができる。宿主が大腸菌等の原核生物の場合、ＤＮＡ取り込みが可能なコンピテント細胞は、周知の手順を用いて指数増殖期の後に集菌し、次いでCaCl₂法で処理した菌体から調製することができる。あるいは、MgCl₂またはRb Clを用いることができる。所望であれば、宿主細胞の原形質体を形成してから形質転換を実施することもできる。宿主が真核生物の場合、リン酸カルシウム共沈降法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等の通常の機械的手順、リポソームに封入したプラスミドの挿入、またはウイルスベクター等のＤＮＡトランスフェクション法が使用できる。真核細胞はまた、本発明のＧＤＦ-11をコードするＤＮＡ配列および選択可能な表現型をコードする第２の外来ＤＮＡ分子（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子等）を用いて、同時形質転換することができる。別な方法は、サルウイルス40（ＳＶ40）またはウシパピローマウイルス等の真核細胞ウイルスベクターを用いて、真核細胞を一過性に感染させ、または形質転換し、タンパク質を発現させるものである（例えば、Eukaryotic Viral Vectors，Cold Spr ing Harbor Laboratory，Gluzman編，1982参照）。微生物により発現された本発明のポリペプチド、またはその断片の単離および精製は、分取クロマトグラフィー、およびモノクローナルまたはポリクローナル抗体を使用する免疫学的分離を含む通常の手段により実施することができる。本発明のＧＤＦ-11ポリペプチドは、ＧＤＦ-11ポリペプチドのエピトープに免疫反応する、または結合する抗体を作成するためにも使用できる。異なる抗原決定基特異性を有するプールされたモノクローナル抗体より本質的に成る抗体、および個別のモノクローナル抗体調製物が提供される。モノクローナル抗体は、上記タンパク質の断片を含有する抗原から当業者に周知の方法により作成される(K ohlerら，Nature,256:495，1975; Current Protocols in Molecular Biology，A usubelら編，1989)。本発明に用いる「抗体」という用語は、抗原決定基と結合可能な完全な分子およびその断片(Fab、F(ab')₂およびFv、等)を包含する。これらの抗体断片は、その抗原または受容体に選択的に結合する多少の能力を保持しており、以下の用に定義される： (1) Fab:抗体分子の一価の抗原結合断片を含有する断片で、全抗体を酵素パパインで消化し、完全なＬ鎖および一本のＨ鎖の一部を生じさせることにより作成できる； (2) Fab': 抗体分子の断片で、全抗体をペプシンで処理し、次いで還元し、完全なＬ鎖およびＨ鎖の一部を生じさせることにより得られる；抗体分子１個につき２個のFab'断片が得られる； (3) F(ab')₂: 全抗体を酵素ペプシンで処理し、その後の還元をしないで得ることができる抗体断片: F(ab')₂は、２つのジスルフィド結合によってつながれている２個のFab'断片からなる二量体である； (4) Fv: ２本の鎖として発現されるＬ鎖の可変部およびＨ鎖の可変部を有する、遺伝子工学的に作成された断片と定義される；および (5) １本鎖抗体("SCA"): 適切なポリペプチドリンカーによって連結されたＬ鎖の可変部およびＨ鎖の可変部を遺伝子工学的に融合させた１本鎖分子として有する、遺伝子工学的に作成された分子と定義される。これらの断片の作成方法は当分野で公知である（例えば、参照としてここに組み入れる Harlow およびLane，Antibodies: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1988参照）。本発明に用いる「エピトープ」という用語は、抗体のパラトープが結合する、抗原上の任意の抗原決定基を意味する。抗原決定基は通常、アミノ酸または糖側鎖等の化学的に活性な分子の表面配置からなり、そして通常特異的三次構造特性および特異的電荷特性を有する。本発明のＧＤＦ-11ポリペプチドに結合する抗体は、免疫感作抗原として、完全なポリペプチドまたは興味のある小さいペプチドを含有する断片を用いて調製することができる。動物を免疫感作するのに使用するポリペプチドまたはペプチドは、所望であればキャリアータンパク質と結合させることができる翻訳されたｃＤＮＡまたは化学合成物から誘導することが可能である。ペプチドに化学的に結合させる、このような一般的に使用されるキャリアーは、スカシ貝ヘモシアニン(KLH)、チログロブリン、ウシ血清アルブミン(BSA)、および破傷風菌トキソイドを含む。次に、結合ペプチドは動物（例えば、マウス、ラットまたはウサギ）を免疫感作するのに使用される。所望であれば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体をさらに精製することができる。例えば、マトリックスに結合させ、そしてポリペプチドまたはペプチド（これに対して上記抗体が作成された）が結合しているマトリックスから溶出させる、などして実施できる。当業者はポリクローナルおよびモノクローナル抗体の精製および／または濃縮のための、免疫学技術において一般的な種々の技法を知っているであろう（例えば、参照としてここに組み入れるColiganら，Uni t 9，Current Protocols in Immunology，Wiley Interscience，1991参照）。抗イディオタイプ技術を用いて、エピトープを模倣したモノクローナル抗体を作成することもまた可能である。例えば、第１のモノクローナル抗体に対して作成された抗イディオタイプモノクローナル抗体は、超可変部に第１のモノクローナル抗体によって結合されたエピトープの「イメージ」である結合ドメインをもつであろう。「細胞増殖疾患」という用語は、しばしば形態学的にも遺伝子型的にも周囲の組織と相違するように見える悪性および非悪性細胞集団をさす。悪性細胞（例：ガン）は、多段階過程の結果として発生する。アンチセンス分子であるＧＤＦ-1 1ポリヌクレオチドは種々の器官系、特に例えば筋肉、子宮、脾臓、胸腺または神経組織の細胞の悪性疾患を治療するのに有用である。本質的に、ＧＤＦ-11の変更された発現と病因的に関連している任意の疾患は、ＧＤＦ-11抑制試薬による治療が可能であると考えられる。そのような疾患の１つは、例えば悪性細胞増殖疾患である。本発明は、抗ＧＤＦ-11抗体をＧＤＦ-11関連疾患を有する疑いのある細胞と接触させ、そして上記抗体への結合を検出することを含んでなる、例えば筋肉、子宮または神経組織の細胞増殖疾患を検出する方法を提供する。ＧＤＦ-11に反応性の抗体は、ＧＤＦ-11への結合の検出を可能とする化合物を用いて標識される。本発明の目的のため、ＧＤＦ-11ポリペプチドに特異的な抗体を使用して、体液および組織におけるＧＤＦ-11のレベルを検出することができる。検出可能な量の抗原を含有する任意の標本が使用できる。本発明の好ましいサンプルは、筋肉、子宮、脾臓、胸腺または神経組織である。疑わしい細胞におけるＧＤＦ-11 のレベルを正常細胞におけるレベルと比較して、被験者がＧＤＦ-11関連細胞増殖疾患を有するかどうかを決定することができる。好ましくは、被験者はヒトである。本発明の抗体は、in vitroまたは in vivo免疫診断または免疫療法を施すことが望ましい任意の被験者に使用することができる。本発明の抗体は、例えば、イムノアッセイにおいて使用するのに適している。そこでは、上記抗体は液相で、または固相キャリアーに結合させて使用できる。さらに、これらのイムノアッセイにおける抗体は、種々の方法で検出可能に標識することができる。本発明の抗体を使用できるイムノアッセイの種類の例は、直接または間接様式の競合および非競合イムノアッセイである。そのようなイムノアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ(RIA)およびサンドイッチ（免疫計量）アッセイである。本発明の抗体を用いた抗原の検出は、フォワード、逆向き、または同時モードで行なわれるイムノアッセイ（生理的サンプルを用いる免疫組織化学的アッセイを含む）を用いて実施することができる。当業者は他のイムノアッセイ様式を知っているであろう。または、過度の実験をすることなく容易に突き止めることができる。本発明の抗体は、多数の異なるキャリアーに結合させて、本発明のポリペプチドを含む抗原の存在を検出するために使用できる。周知のキャリアーの例は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよび磁鉄鉱を含む。本発明の目的のためには、キャリアーの性質は可溶性であっても、不溶性であってもよい。当業者は、抗体を結合させるための他の適切なキャリアーを知っているか、または通常の実験を用いてそれらを突き止めることができるであろう。当業者に公知の多数の異なる標識および標識法が存在する。本発明に使用できる標識の種類の例は、酵素、放射性同位体、蛍光化合物、コロイド金属、化学発光化合物、リン光化合物、および生物発光化合物である。当業者は、抗体に結合させるための他の適切な標識を知っているか、または通常の実験を用いてそれらを突き止めることができるであろう。より大きい感受性をもたらしうる別の技法は、抗体を低分子量のハプテン類に結合させることからなる。次に、第２反応という手段により、これらのハプテン類を特異的に検出することが可能である。例えば、アビジンと反応するビオチン、または、特異的抗ハプテン抗体と反応することができるジニトロフェニル、プリドキサール(puridoxal)、およびフルオレセイン等のハプテン類を使用するのが一般的である。本発明のモノクローナル抗体を抗原のin vivo 検出のために使用する場合は、検出可能に標識した抗体を診断的に有効な投与量で投与する。「診断的に有効」という表現は、検出可能に標識したモノクローナル抗体を、本発明のポリペプチト（上記抗体は、これに対して特異的である）を含む抗原を有する部位の検出を可能とするのに十分な量で投与することを意味する。投与される検出可能に標識したモノクローナル抗体の濃度は、上記ポリペプチドを有する細胞への結合がバックグラウンドに比較して検出可能であるほど、十分でなければならない。さらに、最良の標的対バックグラウンドシグナル比をもたらすために、検出可能に標識したモノクローナル抗体は迅速に循環系から除去されることが望ましい。概して、in vivo 診断のための検出可能に標識したモノクローナル抗体の投与量は、年齢、性別、および個人の疾患の程度、等の因子によって変わる。そのような投与量は、例えば、多数の注射が行なわれるかどうか、抗原負荷、および当業者に公知の他の因子によって変わりうる。 in vivo 診断イメージングのためには、利用可能な検出機器の種類が放射性同位体を選択する上での主要な因子である。選択された放射性同位体は、与えられた種類の機器で検出可能な種類の崩壊を有するものでなければならない。in viv o 診断のための放射性同位体の選択におけるさらに別の重要な因子は、宿主に対して危険な放射を最小限にすることである。理想的には、in vivo イメージングに使われる放射性同位体は粒子放出を欠くものであるが、140〜250 keV の範囲で多数の光子を生じる。これらの光子は通常のガンマカメラで容易に検出できる。 in vivo 診断のためには、放射性同位体を直接、または中間の官能基を用いて間接に、免疫グロブリンに結合させることができる。金属イオンとして存在する放射性同位体を免疫グロブリンに結合させるためにしばしば用いられる中間官能基は、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)および類似の分子等の二官能キレート化剤である。本発明のモノクローナル抗体に結合させることのできる金属イオンの典型的例は、¹¹¹In、⁹⁷Ru、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁷²A s、⁸⁹Zrおよび²⁰¹Tlである。本発明のモノクローナル抗体もまた、磁気共鳴画像法(MRI)または電子スピン共鳴(ESR)等におけるin vivo 診断のため、常磁性同位体を用いて標識することができる。一般に、診断画像を視覚化するための任意の常用の方法が使用できる。通常は、γおよび陽電子を放出する放射性同位体がカメライメージングに、また常磁性同位体がMRI に使用される。そのような技法において特に有用な元素は、¹⁵⁷ Gd、⁵⁵Mn、¹⁶²Dy、⁵²Crおよび⁵⁶Feである。本発明のモノクローナル抗体は、被験者におけるＧＤＦ-11関連疾患の改善の経過をin vitroおよびin vivoでモニターするのに使用できる。したがって、例えば、本発明のポリペプチドを含む抗原を発現する細胞数の増加または減少、あるいは種々の体液中に存在するそのような抗原の濃度変化を測定することにより、ＧＤＦ-11関連疾患の改善を目的とする特定の治療法が有効かどうかを決定することが可能であろう。「改善する」という用語は、治療を受けている被験者において、ＧＤＦ-11関連疾患の有害な影響が少なくなることをさす。本発明は、正常細胞における発現と比較して、変わった様式で発現されている可能性のあるヌクレオチド配列を同定する。それゆえ、この配列に向けられた適切な治療または診断技法を設計することが可能である。したがって、細胞増殖疾患がＧＤＦ-11の発現と関連している場合は、翻訳レベルでＧＤＦ-11発現を妨害する核酸配列が使用できる。このアプローチは、例えば、アンチセンス核酸およびリボザイムを使用して、ｍＲＮＡをアンチセンス核酸でマスキングするか、またはそれをリボザイムで開裂することにより、特定のＧＤＦ-11 ｍＲＮＡの翻訳をブロックする。このような疾患は、例えば、神経変性疾患を含む。アンチセンス核酸とは、特定のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部に相補的なＤＮＡまたはＲＮＡ分子である(Weintraub，Scientific American，262:40，1990)。細胞において、アンチセンス核酸は対応するｍＲＮＡとハイブリダイズし、２本鎖分子を形成する。アンチセンス核酸は、ｍＲＮＡの翻訳を妨害する。なぜなら、細胞は２本鎖となったｍＲＮＡを翻訳しないからである。約15個のヌクレオチドよりなるアンチセンスオリゴマーが好ましい。なぜなら、それらは簡単に合成され、そして標的のＧＤＦ-11産生細胞に導入された時、大きい分子よりも問題を起こさないからである。遺伝子のin vitro翻訳を抑制するためのアンチセンス法の使用は、当分野で周知である(Marcus-Sakura，Anal．Biochem.，172:289，1 988)。リボザイムは、ＤＮＡ制限酵素と類似の方法で他の一本鎖ＲＮＡを特異的に切断することのできるＲＮＡ分子である。これらのＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を修飾することによって、ＲＮＡ分子中の特異的ヌクレオチド配列を認識し、これを切断する分子を作製することができる（Cech，J．Amer．Med．Assn. ，260:3030，1988）。このアプローチの主な利点は、これが配列特異的であるために特定の配列をもつｍＲＮＡのみが不活性化されることである。リボザイムには、テトラヒメナ型（Hasselhoff，Nature，334:585，1988）と “ハンマーヘッド”型の２つの基本的型がある。テトラヒメナ型リボザイムは長さ４塩基の配列を認識し、“ハンマーヘッド”型リボザイムは長さ１１−１８塩基の塩基配列を認識する。認識配列が長いほど、配列が標的ｍＲＮＡで示す排他性が高くなる。従って、ハンマーヘッド型リボザイムがテトラヒメナ型リボザイムよりも特定ｍＲＮＡ種を不活性化するうえで好ましく、１８塩基の認識配列が短い認識配列よりも好ましい。本発明はまた、ＧＤＦ−１１タンパク質によって媒介される細胞増殖性または免疫性疾患の治療のための遺伝子治療を提供する。このような治療は増殖性疾患を有する細胞中にＧＤＦ−１１アンチセンスポリヌクレオチドを導入することによって治療効果を達成する。アンチセンスＧＤＦ−１１ポリヌクレオチドの送達は、キメラウイルスやコロイド分散系などの組換え発現ベクターを用いて達成することができる。アンチセンス配列を治療用に送達するのに特に好ましいのはターゲッティングされたリポソームを使用することである。本明細書で教示する遺伝子治療に使用できる各種ウイルスベクターには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアまたは好ましくはレトロウイルスなどのＲＮＡウイルスを含む。好ましくは、レトロウイルスベクターはネズミまたはトリレトロウイルスの誘導体である。１つの外来遺伝子を挿入することのできるレトロウイルスベクターの例には、モロニーネズミ白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイネズミ肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、ネズミ乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）を含むがこれに限定されない。さらに多数のレトロウイルスベクターが複数の遺伝子を導入することができる。これらすべてのベクターは、形質導入された細胞が同定、生成できるように選択可能なマーカー用の遺伝子を伝達または導入することができる。例えば、特定標的細胞上の受容体のためのリガンドをコードする別の遺伝子とともに、関心のあるＧＤＦ−１１配列をウイルスベクターに挿入することによって、ベクターはターゲット特異性となる。レトロウイルスベクターは例えば糖、糖脂質、またはタンパク質を結合させることによってターゲット特異性とすることができる。レトロウイルスベクターをターゲットとする抗体を用いることによって好ましいターゲッティングを達成することができる。当業者であれば過度の実験を行うことなく、ＧＤＦ−１１アンチセンスポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターをターゲット特異的に送達できるようにレトロウイルスゲノム中に挿入したり、あるいはウイルスエンベロープに結合させることのできる特異的ポリヌクレオチド配列を知ることができ、また容易に確認することができる。組換えレトロウイルスは欠損性であるので、感染ベクター粒子を生成するには補助を必要とする。この補助は例えば、ＬＴＲ中の制御配列のコントロール下にレトロウイルスの構造遺伝子すべてをコードするプラスミドを含むヘルパーセルラインを用いることによって提供することができる。これらのプラスミドは、封入化のためのＲＮＡ転写物を認識するパッケージングメカニズムを可能にするヌクレオチド配列をもたない。パッケージングシグナルを欠失するヘルパーセルラインには、例えばψ２、ＰＡ３１７およびＰＡ１２を含むが、これに限定されない。ゲノムは全くパッケージングされないので、これらのセルラインは空のビリオンを作り出す。もしもパッケージングシグナルが完全であるが構造遺伝子が関心のある別の遺伝子で置き換わった細胞中にレトロウイルスベクターを導入した場合には、ベクターはパッケージングされベクタービリオンが作り出される。あるいは、慣用のリン酸カルシウムトランスフェクションを用いてレトロウイルス構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖをコードするプラスミドでＮＩＨ３Ｔ３またはその他の組織培養細胞を直接トランスフェクトできる。これらの細胞を次に関心のある遺伝子を含むベクタープラスミドでトランスフェクトする。得られる細胞は培地中にレトロウイルスベクターを放出する。ＧＤＦ−１１アンチセンスポリヌクレオチドのための別のターゲッティングされた送達系はコロイド分散系である。コロイド分散系には、巨大分子複合体、ナノカプセル、小球、ビーズ、ならびに水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む脂質系を含む。本発明の好ましいコロイド系はリポソームである。リポソームはin vitroおよびin vivoでの送達ベヒクルとして有用な人工膜小胞である。０．２−４．０μｍの大きさの単ラメラ小胞（ＬＵＶ）は巨大分子を含む水性バッファーの実質的部分を封入することができることが知られている。ＲＮＡ、ＤＮＡおよび完全なビリオンを水性の内部に封入して生物学的に活性な形で細胞に送達することができる（Fraley，et al.，Trends Biochem． Sci.，6:77，1981）。哺乳動物に加えて、リポソームは植物、酵母および細菌細胞にポリヌクレオチドを送達するのにも使用できる。リポソームが有用な遺伝子伝達ベヒクルとなるためには、以下の特徴が存在していなければならない：（１）生物学的活性を損なうことなく高率で関心のある遺伝子を封入できること、（２）非標的細胞に比較して標的細胞に優先的かつ実質的に結合すること、（３）高率で標的細胞の細胞質に小胞の水性含有物を送達すること、および（４）遺伝子情報が正確かつ有効に発現すること（Mannino，et al.，Biotechniques，6:68 2，1988）。リポソームの組成は通常ステロイド、特にコレステロールと組み合わせたリン脂質、特に高相転移温度（high-phase-transition-temperature）リン脂質の組み合わせである。その他のリン脂質または脂質も使用できる。リポソームの物理的性質はｐＨ、イオン強度、および２価カチオンの存在に依存する。リポソーム製造に使用できる脂質の例には、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシドおよびガングリオシドなどのホスファチジル化合物を含む。特に有用なのは、脂質部分が１４−１８炭素原子、特に１６−１８炭素原子を含み飽和であるジアシルホスファチジルグリセロールである。リン脂質の例には卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンを含む。リポソームのターゲッティングは解剖学的および機械的要因に基づいて分類できる。解剖学的分類は選択性のレベル、例えば器官特異性、細胞特異性およびオルガネラ特異性に基づく。機械的ターゲッティングはそれが受動か能動かに基づいて区別できる。受動ターゲッティングは、類洞毛細管を含む器官内の細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞へのリポソームの自然な分布傾向を利用する。一方、能動ターゲッティングは、モノクローナル抗体、糖、糖脂質またはタンパク質などの特異的リガンドへのリポソームの結合によるか、あるいは自然に起きる局在部位以外の器官および細胞型へのターゲッティングを達成するためにリポソームの組成や大きさを変更することによるリポソームの変更を含む。ターゲッティング送達系の表面は各種の方法で修飾することができる。リポソームターゲッティング送達系の場合、標的リガンドをリポソーム二重層と安定な関係に維持するために脂質基をリポソームの脂質二重層に挿入することができる。脂質鎖をターゲッティングリガンドと結合するために各種の結合基を用いることができる。筋肉、脾臓、子宮、胸腺および神経組織でＧＤＦ−１１は発現するので、これらの組織と関連する本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体を様々に応用できる。このような応用にはこれらの組織およびその他の組織を含む細胞増殖性および免疫性疾患の治療を含む。さらに、ＧＤＦ−１１は各種の遺伝子治療法に使用できる。以下の実施例は本発明を説明するものであってこれを限定するものではない。これらの実施例は典型的使用例を示すものであるが、当業者に公知のその他の方法もこれに代えて使用できる。実施例１：新規なＴＧＦ−βファミリーメンバーの同定と単離ＴＧＦ−βスーパーファミリーの新規なメンバーを同定するために、ＧＤＦ− ８前駆体タンパク質のＣ末端部分をコードする領域にまたがるネズミＧＤＦ−８プローブ（図８：ヌクレオチド８６５−１２３４）を用いてゆるやかなストリンジェンシーでネズミゲノムライブラリーをスクリーニングした。文献（Lee，Mol ．Endocrinol.，4:1034，1990）記載の方法を用い６５℃でハイブリダイゼーションを行い、最終洗浄は同じ温度で０．５ＭＮａＣｌを含むバッファー中で行った。ハイブリダイズしたファージのうち、ＧＤＦ−８プローブとのより弱いハイブリダイゼーション強度によってＧＤＦ−８含有ファージから区別されるものがあった。この弱くハイブリダイズするファージ中に存在するゲノムインサートの部分ヌクレオチド配列を分析したところ、このクローンがネズミＧＤＦ−８と強く関連するがこれとは異なる配列を含むことを示した。このファージに存在するゲノムインサートの部分ヌクレオチド配列を図１ａに示す。この配列は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの公知のメンバーと有意な相同性を示すヌクレオチド１９８から５７５にわたるオープンリーディングフレームを含んでいた（下記参照）。この配列の前には、ＧＤＦ−８遺伝子と全く同じ位置に３’スプライスコンセンサス配列があった。この新規なＴＧＦ−βファミリーメンバーをＧＤＦ−１１（増殖／分化因子−１１）と命名した。実施例２：ＧＤＦ−１１の発現ＧＤＦ−１１の発現パターンを調べるため、各種組織から調製したＲＮＡサンプルをノーザン分析によってスクリーニングした。ＲＮＡの単離とノーザン分析は文献（Lee，Mol．Endocrinol.，4:1034，1990）記載の方法で行い、ただしハイブリダイゼーションは５ｘＳＳＰＥ、１０％硫酸デキストラン、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌサケＤＮＡおよび各０．１％のウシ血清アルブミン、フィコールおよびポリビニルピロリドン中で行った。各組織から調製したポリＡで２回選択したＲＮＡ５μｇ（ただし、２日齢の新生児脳では３．３μｇのＲＮＡを用いた）をホルムアルデヒドゲルで電気泳動し、ブロットし、ＧＤＦ−１１をプローブとした。図２に示すように、ＧＤＦ−１１プローブは、成人胸腺、脳、脾臓、子宮および筋肉、ならびに１２．５日または１８．５日に単離した全胚、および発生の各段階で取り出した脳サンプル中に、約４．２ｋｂおよび３．２ｋｂの長さの２つのＲＮＡ種を検出した。これらのブロットをより長く暴露すると、低レベルのＧＤＦ−１１ＲＮＡがその他の多くの組織に検出された。実施例３：ＧＤＦ−１１をコードするｃＤＮＡクローンの単離ＧＤＦ−１１をコードするｃＤＮＡクローンを単離するために、ヒト成人脾臓から調製したＲＮＡを用いてλＺＡＰＩＩベクター（Stratagene）中にｃＤＮＡライブラリーを調製した。ヒト脾臓から調製したポリＡで２回選択したＲＮＡ５μｇから、Stratageneの説明書に従って２１００万個の組換えファージからなるｃＤＮＡライブラリーを構築した。このライブラリーを増幅せずにスクリーニングした。ライブラリースクリーニングとｃＤＮＡインサートの性状決定は文献（Lee，Mol．Endocrinol.，4:1034，1990）記載の方法で行った。ライブラリーから２３個のハイブリダイズするファージを得た。遺伝子の５’末端から最も遠くまで伸びているクローンの全ヌクレオチド配列を決定した。１２５８塩基対の配列は、クローンの５’末端から始まりＴＡＡストップコドンに至る１つの長いオープンリーディングフレームを含んでいた。このオープンリーディングフレームとクローンの５’最末端まで伸びるＧＤＦ−８との相同性（下記参照）から、このクローンにはＧＤＦ−１１前駆体タンパク質のＮ末端部分に対応するコーディング配列が欠けていると思われた。ＧＤＦ−１１配列の残り部分を得るために、ヒトＧＤＦ−１１ｃＤＮＡプローブを用いてヒトゲノムライブラリーをスクリーニングして幾つかのゲノムクローンを単離した。これらのゲノムクローンの１つの部分配列を分析してこのクローンがＧＤＦ− １１遺伝子を含むことが明らかとなった。このクローンから残りのＧＤＦ−１１コーディング配列を得た。図１ｂはゲノムおよびｃＤＮＡ配列から組み立てたＧＤＦ−１１の予測配列を示す。ヌクレオチド１３６−１３９３はｃＤＮＡクローンから得た配列を表す。ヌクレオチド１−１３５はゲノムクローンから得た。配列はゲノムクローン中に存在するＳａｃＩＩ部位から始めて任意に番号付けを行ったが、ｍＲＮＡのスタート部位は分かっていない。配列にはヌクレオチド５４に推定の開始メチオニンを含む。このメチオニンコドンの上流の配列がｍＲＮＡ中に全て存在するか否かは分かっていない。メチオニンコドンから始めて、オープンリーディングフレームは４０７アミノ酸の長さである。配列にはアスパラギン９４に推定のＮ−結合性グリコシル化部位を１つ含む。配列にはアミノ酸２９５−２９８にＲＸＸＲタンパク質分解性切断部位と予測される部位を含み、この部位での前駆体の切断により、長さ１０９アミノ酸で予測分子量約１２，５００ｋＤの活性なＣ末端断片を生成する。この領域では、ネズミとヒトの予測ＧＤＦ−１１アミノ酸配列は１００％同一である。種を越えて高度に配列が保存されていることはＧＤＦ−１１がin vivoで重要な役割を演じていることを示唆する。予測される切断部位に続くＣ末端領域は、その他のＴＧＦ−βファミリーメンバーに存在する全ての特徴を含む。ＧＤＦ−１１は、７つのシステイン残基とその特徴的な空間配置を含む、その他のファミリーメンバーで高度に保存されている残基のほとんどを含む。ＴＧＦ−β、インヒビンβおよびＧＤＦ−８と同様に、ＧＤＦ−１１も２つのシステイン残基をさらに含む。ＴＧＦ−β２の場合、これらの付加的システイン残基は分子内ジスルフィド結合を形成することが知られている（Daopin，et al.，Science，257:369，1992; Schlunegger and Grutter ，Nature，358:430，1992）。ＧＤＦ−１１とその他のＴＧＦ−βファミリーメンバーとの間のアミノ酸配列相同性を図３に表として示す。数字は、最初の保存システインからＣ末端までを用いて計算した各対の間のアミノ酸の同一性を表す。箱は、特定のサブグループ内の高度に関連するメンバー間の相同性を表す。この領域では、ＧＤＦ−１１はＧＤＦ−８と最もよく関連している（９２％配列同一性）。ＧＤＦ−８（配列番号５）とＧＤＦ−１１（配列番号６）のアミノ酸を並べたものを図４に示す。２つの配列には、類似の部位にＮ−結合性グリコシル化シグナル（ＮＩＳ）の可能性と推定のタンパク質分解性プロセシング部位（ＲＳＲＲ）を含む。２つの配列は推定の切断部位に続くＣ末端領域（９０％アミノ酸配列の同一性）のみでなく、分子のプロ領域（４５％アミノ酸配列の同一性）においても関連している。実施例４：ハイブリッドＧＤＦ−８／ＧＤＦ−１１遺伝子の構築ＧＤＦ−１１タンパク質を発現させるために、ＧＤＦ−１１のＮ末端領域をＧＤＦ−８の類似領域で置換した。このようなハイブリッド構築体が生物学的に活性なＢＭP−４（Hammonds，et al.，Mol．Endocrinol.，5:149，1991）およびＶｇ−１（Thomsen and Melton，Cell，74:433，1993）を生産するために使用されている。ハイブリッド構築体から生産されるＧＤＦ−１１タンパク質が真性のＧＤＦ−１１であることを確認するために、２つの遺伝子断片の融合が予測される切断部位で正確に起こるようにハイブリッド遺伝子を構築した。特に、予測されるタンパク質分解性切断部位に対応する位置において、両方の配列にＡｖａＩＩ制限部位が存在する。このＡｖａＩＩ部位までのＧＤＦ−８のＮ末端プロ領域をＡｖａＩＩをもつクローンを部分消化することによって得て、これをＡｖａＩＩ部位で始まるＧＤＦ−１１のＣ末端領域と融合した。得られるハイブリッド構築体を次にｐＭＳＸＮＤ哺乳動物発現ベクター（Lee and Nathans，J．Biol．Ch em.，263:3521）中に挿入し、チャイニーズハムスター卵巣細胞を形質転換した。図５に示すように，ＧＤＦ−８のＣ末端部分に対する抗体を用いてＧ４１８耐性細胞由来のならし培地をウエスタン分析したところ、これらの細胞がＧＤＦ− １１タンパク質を培地に分泌しており、ハイブリッドタンパク質のうちの少なくともいくつかはプロセシングされてタンパク質分解されていることを示した。さらにこの研究からＧＤＦ−８のＣ末端部分に対する抗体はＧＤＦ−１１タンパク質とも反応することが示された。実施例５：ＧＤＦ−１１の染色体上の位置ＧＤＦ−１１の染色体上の位置を決定するために、ヒト／齧歯類体細胞ハイブリッドからのＤＮＡサンプル（Drwings，et al.，Genomics，16:311-313，1993; Dubois and Naylor，Genomics，16:315-319，1993）をポリメラーゼチェインリアクションとそれに続くサザンブロッティングによって分析した。ポリメラーゼチェインリアクションはプライマー＃１０１、５’−ＧＡＧＴＣＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣ−３’（配列番号７）およびプライマー＃１０２、５’ −ＴＡＧＡＧＣＡＴＧＴＴＧＡＴＴＧＧＧＧＡＣＡＴ−３’（配列番号８）を用いて９４℃で２分、５８℃で１分、７２℃で１分、３５サイクル行った。これらのプライマーはヒトＧＤＦ−１１配列のヌクレオチド９８１−１００３およびヌクレオチド１１８２−１２０４の逆相補鎖にそれぞれ対応する。ＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動し、ブロットし、プライマー＃１０１と＃１０２に隣接する領域の内部配列に対応するオリゴヌクレオチド＃１０４、５’−ＡＡＡＴＡＴＣＣＧＣＡＴＡＣＣＣＡＴＴＴ−３’（配列番号９）をプローブとして用いた。フィルターを６ｘＳＳＣ，１ｘＤｅｎｈａｒｄ’ｓ溶液、１００μｇ／ｍｌ酵母トランスファーＲＮＡ、および０．０５％ピロリン酸ナトリウム中、５０℃でハイブリダイズした。図６に示すように、ヒト特異的プローブは陽性対照サンプル（全ヒトゲノムＤＮＡ）中、およびヒト／齧歯類ハイブリッドパネルからの１つのＤＮＡサンプル中の予測されたサイズ（約２２４塩基対）のバンドを検出した。この陽性シグナルはヒト染色体１２に対応する。ハイブリッドセルラインのそれぞれに含まれるヒト染色体を最初の２４レーン（１−２２、Ｘ、およびＹ）のそれぞれの頂部で同定した。ＣＨＯ、Ｍ、およびＨと命名するレーンでは、出発ＤＮＡの鋳型はそれぞれハムスター、マウスおよびヒト由来の全ゲノムＤＮＡであった。Ｂ１と印をつけたレーンでは、鋳型ＤＮＡを用いなかった。左の数字はＤＮＡ標準品の移動度を示す。これらのデータはヒトＧＤＦ−１１遺伝子が染色体１２に位置することを示す。染色体１２上でのＧＤＦ−１１のより正確な位置を決定するために、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によってＧＤＦ−１１遺伝子の位置を決めた。ＦＩＳＨ位置決定研究はＢＩＯＳラボラトリーズ（New Haven，Con necticut）との契約により行った。ヒトＧＤＦ−１１ゲノムクローン由来の精製ＤＮＡをニックトランスレーションによりジゴキシゲニンｄＵＴＰで標識した。標識プローブを剪断ヒトＤＮＡと合わせて、５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストランおよび２ｘＳＳＣを含む溶液中，ＰＨＡで刺激した末梢血白血球由来の正常中期染色体とハイブリダイズした。ハイブリダイズしたスライドを蛍光結合したヒツジ抗ジゴキシゲニン抗体中でインキュベートすることにより特異的ハブリダイゼーションシグナルを検出した。次にスライドをヨウ化プロピジウムで対比染色して分析した。図７ａに示すように、この実験の結果、グループＣ染色体（その大きさと形態は染色体１２と一致する）の近位長腕が特異的に標識された。特異的に標識された染色体の同定を確認するために、染色体１２特異的セントロメアプローブをＧＤＦ−１１と同時ハイブリダイズさせる第２の実験を行った。図７ｂに示すように、この実験では、ＧＤＦ−１１が染色体１２の長いアームのセントロメアからテロメアへの距離の２３％の位置にあることを明瞭に示し、この領域はバンド１２ｑ１３に対応する（図７ｃ）。全部で８５個の中期細胞を分析し、このうち８０個が特異的標識を示した。本発明を現在好ましい態様と関連させて説明したが、本発明の精神を逸脱することなく各種の修飾が可能なことが理解されよう。従って本発明は以下の請求の範囲によってのみ限定されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 39/395 7433−4ＣＡ６１Ｋ 47/48 Ｚ 47/48 9051−4Ｃ 48/00 ＡＤＳ 48/00 ＡＤＳ 9356−4ＨＣ０７Ｋ 14/495 Ｃ０７Ｋ 14/495 9356−4Ｈ 16/22 16/22 9735−4ＢＣ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ 5/10 9735−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 ＢＧ０１Ｎ 33/53 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＢＢ (72)発明者マックファーロン，アレクサンドラシー. アメリカ合衆国 21211 メリーランド州バルチモア，ケスウィックロード 3905番地

Claims

【特許請求の範囲】１．実質的に純粋な増殖分化因子−１１（ＧＤＦ−１１）。２．請求項１のＧＤＦ−１１ポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド配列。３．ＧＤＦ−１１ヌクレオチド配列が次のａ〜ｆ：ａ．ＴがＵであり得る配列番号１；ｂ．ＴがＵであり得る配列番号３；ｃ．配列番号１に相補的な核酸配列；ｄ．配列番号３に相補的な核酸配列；ｅ．鎖長が少なくとも１５塩基で、配列番号２のＧＤＦ−１１タンパク質をコードするＤＮＡに選択的にハイブリダイズするａまたはｃの断片；およびｆ．鎖長が少なくとも１５塩基で、配列番号４のＧＤＦ−１１タンパク質をコードするＤＮＡに選択的にハイブリダイズするｂまたはｄの断片；よりなる群から選ばれる、請求項２に記載のポリヌクレオチド配列。４．ポリヌクレオチドが哺乳動物の細胞から単離される、請求項２に記載のポリヌクレオチド配列。５．哺乳動物の細胞がマウス、ラットおよびヒトの細胞よりなる群から選ばれる、請求項４に記載のポリヌクレオチド配列。６．請求項２のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。７．ベクターがプラスミドである、請求項６に記載のベクター。８．ベクターがウイルスである、請求項６に記載のベクター。９．請求項６のベクターで安定に形質転換された宿主細胞。 10．細胞が原核細胞である、請求項９に記載の宿主細胞。 11．細胞が真核細胞である、請求項９に記載の宿主細胞。 12．請求項１のポリペプチドまたはその断片に結合する抗体。 13．抗体がポリクローナルである、請求項12に記載の抗体。 14．抗体がモノクローナルである、請求項12に記載の抗体。 15．請求項12の抗体を、ＧＤＦ−１１関連疾患の疑いがある被検者の検体と接触させ、該抗体の結合を検出することを含んでなる、細胞増殖性疾患の検出方法。 16．細胞が筋細胞である、請求項15に記載の方法。 17．検出をin vivo で行う、請求項15に記載の方法。 18．抗体が検出可能に標識される、請求項17に記載の方法。 19．検出可能な標識が放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物および化学発光化合物よりなる群から選ばれる、請求項18に記載の方法。 20．検出をin vitroで行う、請求項15に記載の方法。 21．抗体が検出可能に標識される、請求項20に記載の方法。 22．標識が放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物および酵素よりなる群から選ばれる、請求項18に記載の方法。 23．細胞を、ＧＤＦ−１１活性を抑制する試薬と接触させることを含んでなる、ＧＤＦ−１１の発現と関連した細胞増殖性疾患の治療方法。 24．試薬が抗ＧＤＦ−１１抗体である、請求項23に記載の方法。 25．試薬がＧＤＦ−１１アンチセンス配列である、請求項23に記載の方法。 26．細胞が筋細胞である、請求項23に記載の方法。 27．ＧＤＦ−１１活性を抑制する試薬がベクターを用いて細胞に導入される、請求項23に記載の方法。 28．ベクターがコロイド分散系である、請求項27に記載の方法。 29．コロイド分散系がリポソームである、請求項28に記載の方法。 30．リポソームが本質的にターゲット特異性である、請求項29に記載の方法。 31．リポソームが解剖的にターゲッティングされる、請求項30に記載の方法。 32．リポソームが機械的にターゲッティングされる、請求項31に記載の方法。 33．機械的ターゲッティングが受動的である、請求項32に記載の方法。 34．機械的ターゲッティングが能動的である、請求項32に記載の方法。 35．リポソームが糖、糖脂質およびタンパク質よりなる群から選ばれる成分とカップリングすることにより能動的にターゲッティングされる、請求項34に記載の方法。 36．タンパク質成分が抗体である、請求項35に記載の方法。 37．ベクターがウイルスである、請求項36に記載の方法。 38．ウイルスがＲＮＡウイルスである、請求項37に記載の方法。 39．ＲＮＡウイルスがレトロウイルスである、請求項38に記載の方法。 40．レトロウイルスが本質的にターゲット特異性である、請求項39に記載の方法。 41．ターゲット特異性の成分がレトロウイルスゲノムに挿入されたポリヌクレオチドによりコードされる、請求項40に記載の方法。 42．ターゲット特異性の成分が糖、糖脂質およびタンパク質よりなる群から選ばれる、請求項40に記載の方法。 43．タンパク質が抗体である、請求項42に記載の方法。