CN110846400A - 人外周血循环FST mRNA检测试剂盒及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种人外周血循环FST mRNA检测试剂盒及其用途，属于检测试剂盒及用途。包括外周血循环mRNA提取液、逆转录反应液、特异引物、标准FST阳性模板、SYBR Green I实时荧光定量PCR反应液。从人外周血血清或血浆中提取mRNA，进行逆转录为cDNA，之后进行荧光定量PCR反应，同时引入标准阳性模板，用特异引物扩增。采用实时定量RT‑PCR方法检测人外周血循环FST mRNA水平，用于妊娠女性子宫蜕膜发育状况判断以及妊娠女性胚胎死亡的预警诊断，其检测结果更加准确、可靠、稳定性及重复性好。

Description

人外周血循环FST mRNA检测试剂盒及其用途

技术领域

本发明属于检测试剂盒，尤其是指外周血循环FST mRNA荧光实时定量RT-PCR检测试剂盒检测人外周血循环FST mRNA水平在胚胎死亡早期预警中的应用，不仅可以用来判断妊娠早期蜕膜发育状况，还可以用于妊娠早期胚胎死亡性流产临床预警诊断应用。

背景技术

女性妊娠期间，如果胚胎不可逆转地丧失了持续和整合细胞分裂、生长和分化能力，即为胚胎死亡。胚胎死亡后自然排除母体即为流产，早期胚胎死亡是自然流产的主要原因。引起胚胎死亡的原因极其复杂，可以是遗传所致胚胎自身发育异常、母体病毒感染或母体子宫蜕膜发育不良等因素引起。

卵泡抑素(Follistatin,FST)是从猪卵泡液中提取出来的单链糖蛋白，具有抑制垂体前叶腺细胞分泌卵泡刺激素(FSH)，以及与激活素(Activin)结合的作用。FST广泛分布在卵巢、脑垂体、肾上腺、胰腺、子宫、心脏等多种组织，通过与激活素结合并中和其生物学功能，从而二者联合参与机体多种生理、病理过程调控。有研究表明，FST是一种重要的生殖调节因子，在正常妊娠期随孕龄增加而升高，对维持正常生理性妊娠及胚胎发育生长均具有重要作用，如调节颗粒细胞功能、调节雌激素和雄激素分泌等。

已有研究证实，在人类妊娠早期蜕膜FST蛋白表达上调，血中FST水平异常与复发性流产及妊娠期高血压等疾病有关。而且，对体外受精后植入失败的妇女，FST蛋白表达异常也与怀孕早期流产有关。虽然蜕膜组织FST蛋白表达异常与妊娠女性流产有关，但是蜕膜组织在临床检测中很难取得，所以无法在实际预警诊断中获得应用。

发明内容

本发明提供一种人外周血循环FST mRNA检测试剂盒及其用途，以解决因蜕膜组织在临床检测中很难取得，导致无法进行胚胎死亡早期预警的问题。

本发明采取的技术方案是：

一种人外周血循环FST mRNA检测试剂盒，包括外周血循环mRNA提取液、逆转录反应液、特异引物、标准FST阳性模板、SYBR Green I实时荧光定量PCR反应液。

本发明所述特异引物包括：正义引物：5’-AGGAGGAGTGCTGCAGCACC-3’，反义引物：5’-CAGGTCCACAGTCCACGTTC-3’。

本发明所述的标准阳性FST DNA模板核苷酸序列如下：

aggaggagtgctgcagcaccggccggctgagcacctcgtggaccgaggaggacgtgaatgacaacacactcttcaagtggatgattttcaacgggggcgcccccaactgcatcccctgtaaagaaacgtgtgagaacgtggactgtggac ctg。

本发明所述人外周血循环FST mRNA来源于人外周血血清或血浆。

本发明所述SYBR Green I实时荧光定量PCR反应液是由2×iTaq SYBR GreenSupermix、10μM的正义引物和反义引物及灭菌双蒸水组成。

一种人外周血循环FST mRNA检测试剂盒在检测人外周血循环FST mRNA水平中的应用。

一种人外周血循环FST mRNA检测试剂盒通过检测人外周血循环FST mRNA水平，在胚胎死亡早期预警中的应用。

一种人外周血循环FST mRNA检测试剂盒通过检测人外周血循环FST mRNA水平，在判断妊娠女性子宫蜕膜发育状况中的应用。

一种人外周血循环FST mRNA检测试剂盒通过检测人外周血循环FST mRNA水平，在妊娠女性胚胎死亡性流产早期预警诊断中的应用。

本发明从人外周血血清或血浆中提取mRNA，进行逆转录为cDNA，之后进行荧光定量PCR反应，同时引入标准阳性模板，引物序列分别为正义引物：5’-AGGAGGAGTGCTGCAGCACC-3’，反义引物：5’-CAGGTCCACAGTCCACGTTC-3’，扩增的cDNA片段大小为153bp，扩增片段序列同标准FST DNA模板序列。标准阳性FST DNA模板由DNA合成获得。可以采用任何实时定量RT-PCR方法检测人外周血循环FST mRNA水平，用于妊娠女性子宫蜕膜发育状况判断以及妊娠女性胚胎死亡的预警诊断。

本发明证实在妊娠小鼠子宫蜕膜组织中FST mRNA表达水平随着孕期增加而增加，表明蜕膜组织FST表达水平与妊娠子宫蜕膜组织发育呈正相关。同时发现外周血循环FST水平变化也随孕期增加而增加，与子宫蜕膜组织FST变化一致，说明外周血循环FST水平变化可以反映妊娠子宫蜕膜发育情况。研究进一步检测了正常妊娠女性和胚胎死亡患者行人工流产术的子宫蜕膜组织FST表达情况，结果发现FST表达水平在胚胎死亡患者子宫蜕膜组织显著低于正常早孕女性子宫蜕膜组织；研究同时发现胚胎死亡患者外周血循环FST mRNA水平也显著低于正常早孕女性外周血循环FST mRNA水平，与蜕膜组织FST表达水平变化一致，表明外周血循环FST mRNA检测同样可以反映妊娠早期胚胎死亡。因此，本发明外周血循环FST mRNA荧光实时定量RT-PCR专用检测试剂盒，检测外周血循环FST mRNA水平变化，不仅可以反映妊娠子宫蜕膜发育情况，还可以作为胚胎死亡性流产诊断的早期预警。检测结果更加准确、可靠、稳定性及重复性好。

本发明的积极效果在于：

妊娠子宫蜕膜组织FST表达水平与早期蜕膜发育有关，其水平均随孕龄增加而增加，外周血循环FST mRNA水平变化与蜕膜组织FST表达水平变化一致。在妊娠期胚胎死亡时，蜕膜组织FST表达水平及外周血FST mRNA水平均明显下降。尽管子宫蜕膜组织FST表达水平可以更直接的反映子宫蜕膜发育和胚胎死亡情况，但子宫蜕膜组织在临床上难以获取，限制了其应用。而外周血取材简便，并能及时检测。因此，本发明用来检测血循环FSTmRNA水平，不仅可以用来判断妊娠早期蜕膜发育状况，还可以作为妊娠早期胚胎死亡性流产的预警诊断。检测结果更加准确、可靠、稳定性及重复性好。

附图说明

图1是荧光实时定量RT-PCR检测FST mRNA的FST cDNA标准曲线图；

图2是不同孕期小鼠子宫蜕膜组织FST mRNA表达水平图；M，分子量标准品；GAPDH：内参，选取未孕雌鼠(对照)、妊娠5天、7天及9天孕鼠子宫内膜组织，RT-PCR方法检测FSTmRNA表达；

图3A是早期妊娠女性及早期妊娠胚胎死亡患者子宫蜕膜组织FST mRNA表达水平图；

图3B是早期妊娠女性及早期妊娠胚胎死亡患者子宫蜕膜组织FST mRNA的相对水平柱状图，其中正常早期妊娠女性组FST mRNA水平调整为100％。**：P<0.01，胚胎死亡患者组与正常早期妊娠女性组比较；

图4是实时定量RT-PCR检测的正常早期妊娠女性及胚胎死亡患者外周血循环FSTmRNA水平图，其中正常早期妊娠女性组血循环FST mRNA水平调整为100％，**：P<0.01，胚胎死亡患者组与正常早期妊娠女性组比较，例数(n)＝40。

具体实施方式

一种人外周血循环FST mRNA检测试剂盒，包括外周血循环mRNA提取液、逆转录反应液、特异引物、标准FST阳性模板、SYBR Green I实时荧光定量PCR反应液。

所涉及试剂及设备如下：

一、试剂

1.微量血浆/血清RNA/DNA提取试剂(TaKaRa MiniBEST Universal RNAExtraction Kit,Takara)

2.二步法逆转录试剂盒(PrimeScript^TMRT reagent Kit,Takara)

3.实时定量PCR试剂盒：(PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix,Takara)二、主要仪器

1.荧光定量PCR仪：ABI 7300，美国；

2.PCR仪：ABI 9700，美国；

3.-80℃低温冰箱：ThermoFisher,美国；

4.高速低温台式离心机：Eppendorf,德国；

本发明血循环FST mRNA检测方法：包括

(1)利用微量血浆/血清RNA/DNA提取试剂(TaKaRa MiniBEST Universal RNAExtraction Kit,Takara)提取人外周血游离循环总RNA；

A)外周血样本于4℃，经200g/min离心10分钟，将上清移到新的离心管经1600g/min离心10分钟，之后再将上清移到新的离心管内继续以1 600g/min离心10分钟，分离血清，-80℃保存待用；

B)首先取560μl事先配置好的含有Carrier RNA的Buffer AVL放入1.5ml的微量离心管中，加入140μl血清，混合15秒；在室温下孵育10分钟，并将离心管盖子上沾有的液体全部离心下来；在样品中加入560μl的乙醇(100％)混匀15秒，将离心管盖子上沾有的液体全部离心下来；分两次将上述混合液加入到离心柱中，下面放置一个2ml的收集管收取离心后的液体，各8 000rpm离心1分钟；将离心柱放置到一个新的2ml的收集管上，加入500μlBuffer AW1，8000rpm离心1分钟；将离心柱放置到一个新的2ml的收集管上，加入500μlBuffer AW2，14000rpm离心3分钟；重复一次，将离心柱放置到一个新的1.5ml的EP管上，加入60μl Buffer AVE，室温放置1分钟，8000rpm离心1分钟洗脱RNA；

(2)利用提取的人外周血游离循环总RNA，通过反转录(PrimeScript^TMRT reagentKit,Takara)获得各mRNA样本的cDNA；

反应液配置：10×RT Buffer 2.0μl，25×dNTP Mix 0.8μl，特异反义引物为2.0μl，逆转录酶1.0μl，RNA模板10μl，RNase Free dH₂O 4.2μl；

反应条件：25℃10分钟，37℃120分钟,85℃5秒，4℃保存；

(3)利用设计的FST特异性引物，以标准阳性cDNA(ng)为模板，采用荧光实时定量PCR，绘制FST cDNA标准曲线：以cDNA量(ng)为横坐标，PCR扩展ct值为纵坐标；

特异引物序列分别为：

正义引物：5’-AGGAGGAGTGCTGCAGCACC-3’；

反义引物：5’-CAGGTCCACAGTCCACGTTC-3’。

(4)利用设计的FST特异性引物，以(2)中获得的各mRNA样本的cDNA为模板，采用荧光实时定量PCR扩增产物，利用扩展产物ct值，通过FST cDNA标准曲线计算出血循环FSTmRNA对应的cDNA绝对值水平，用以反映样本中FST mRNA水平。

引物序列分别为：

正义引物：5’-AGGAGGAGTGCTGCAGCACC-3’；

反义引物：5’-CAGGTCCACAGTCCACGTTC-3’。

(5)反应液配置：2×PowerUp SYBR Green Master Mx 10.0μl，正向引物和反义引物(10μM)各为1.0μl，cDNA模板(1-10ng)+RNase Free dH₂O共8μl。

(6)荧光实时定量PCR体系的反应步骤为：

Stage 1：UDG酶激活，50℃2分钟；

Stage 2：95℃预变性2分钟；

Stage 3：95℃15秒，60℃退火15秒，72℃1分钟，40次循环，此阶段进行荧光采集；

Stage 4：95℃15秒，60℃1分钟，95℃15秒，1个循环。溶解曲线。

所述的标准阳性DNA模板核苷酸序列如下：

aggaggagtgctgcagcaccggccggctgagcacctcgtggaccgaggaggacgtgaatgacaacacact cttcaagtggatgattttcaacgggggcgcccccaactgcatcccctgtaaagaaacgtgtgagaacgtggactgtggac ctg；

所述非特异性荧光染料SYBR Green I是一种能够与双链DNA小沟结合的染料。没有与双链DNA结合时，其荧光信号很弱，当其与双链DNA结合后荧光信号大大增强并能够被仪器检测。利用SYBR Green I这种特点可以检测PCR扩增产物。SYBR Green I的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。SYBR Green I在核酸的实时检测方面有很多优点。它能够与体系中所有的双链DNA相结合，无需为不同的模板特殊定制，因此价格相对较低。此外，由于一个PCR产物可以与多个SYBR Green I染料相结合，因此灵敏度较高。对mRNA定量可通过与标准品的循环阈值(Ct，Threshold Cycle)相比较得出。Ct值是PCR过程中，荧光量的积累超过基底荧光量的循环数，Ct值与起始模板数的常用对数呈线性关系(log(起始模板数)＝Ct值/斜率+X轴截距)，Ct值越小，起始模板数越多，相反，Ct值越大，起始模板数越少。利用阳性梯度标准模板的Ct值制成标准曲线，再根据待测样品的Ct值可准确测出该样品的起始量。

下边通过实验例来进一步说明本发明。

实验例1荧光实时定量PCR检测FST cDNA标准曲线

分别以不同浓度(1ng、10ng、100ng及100ng)、长度153bp的合成FST cDNA(aggaggagtgctgcagcaccggccggctgagcacctcgtggaccgaggaggacgtgaatgacaacacactcttcaagtggatgattttcaacgggggcgcccccaactgcatcccctgtaaagaaacgtgtgagaacgtggactgtggac ctg)为模板，采用正义引物：5’-AGGAGGAGTGCTGCAGCACC-3’；及反义引物：5’-CAGGTCCACAGTCCACGTTC-3’，按照荧光实时定量PCR反应步骤为A：95℃预变性2分钟；B：95℃15秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒，40次循环，扩增目的产物，绘制FST cDNA标准曲线：以cDNA量(ng)为横坐标，PCR扩展ct值为纵坐标(图1)。

实施例2不同孕期小鼠子宫蜕膜组织FST mRNA表达水平测定

将雌性Balb/c小鼠与雄性Balb/c小鼠合笼交配(雌：雄为2:1)，建立正常妊娠模型。于合笼后次日清晨检查阴道栓，如发现阴道栓则计为妊娠第1日，并将雌鼠隔离饲养。选取妊娠第4.5天(E4.5)、第6.5天(E6.5)以及第8.5天(E8.5)的雌鼠，麻醉处死后，在解剖显微镜下采集子宫蜕膜化内膜组织，提取RNA，采用RT-PCR检测FST mRNA表达水平。研究结果表明，在妊娠小鼠子宫蜕膜组织中FST mRNA表达水平随着孕期增加而增加(图2)，表明蜕膜组织FST表达水平与妊娠子宫蜕膜组织发育呈正相关。

实施例3正常早期妊娠女性及早期妊娠胚胎死亡患者子宫蜕膜组织FST mRNA水平测定

正常早期妊娠(8～9周)自愿行人工流产术女性及早期妊娠诊断为子宫内胚胎死亡行人工流产术患者。所有病例均除外父母染色体异常、子宫发育异常、感染及合并内分泌系统疾病等。采集正常妊娠女性及妊娠期胚胎死亡患者外周静脉血，EDTA抗凝，3000rpm，离心15min分离血浆，-80℃冰箱保存。同时留取正常早期妊娠女性及胚胎死亡患者行人工流产术的子宫蜕膜组织，一部分用于免疫组织化学染色检测FST蛋白表达，一部分提取RNA，采用RT-PCR检测FST mRNA表达水平。结果发现FST mRNA表达水平在胚胎死亡患者子宫蜕膜组织显著低于正常早孕女性子宫蜕膜组织FST mRNA表达水平(图3A、3B)。

实施例4正常孕早期女性及胚胎死亡患者血循环FST mRNA水平比较

由于子宫蜕膜组织在临床上难以获取，限制了其应用。因此，研究进一步检测了正常早期妊娠女性及早期妊娠胚胎死亡患者血循环FST mRNA水平。结果表明，早期妊娠胚胎死亡患者血循环FST mRNA水平明显低于正常妊娠女性组(图4)，与蜕膜组织FST mRNA表达水平变化一致，表明外周血循环FST mRNA检测同样可以反映妊娠早期胚胎死亡。因此，外周血循环FST mRNA水平变化不仅可以反映妊娠子宫蜕膜发育状况，还可以作为胚胎死亡性流产诊断的早期预警指标应用。

若外周血循环FST mRNA的绝对含量低于正常妊娠女性平均值(X)-标准差(SD)，则判断子宫蜕膜发育异常，可能发生胚胎死亡。

Claims (8)

1.一种人外周血循环FST mRNA检测试剂盒，其特征在于：包括外周血循环mRNA提取液、逆转录反应液、特异引物、标准FST阳性模板、SYBR Green I实时荧光定量PCR反应液。

2.根据权利要求1所述的一种人外周血循环FST mRNA检测试剂盒，其特征在于，所述特异引物包括：正义引物：5’-AGGAGGAGTGCTGCAGCACC-3’，反义引物：5’-CAGGTCCACAGTCCACGTTC-3’。

3.根据权利要求1所述的一种人外周血循环FST mRNA检测试剂盒，其特征在于，所述的标准阳性FST DNA模板核苷酸序列如下：

aggaggagtgctgcagcaccggccggctgagcacctcgtggaccgaggaggacgtgaatgacaacacact cttcaagtggatgattttcaacgggggcgcccccaactgcatcccctgtaaagaaacgtgtgagaacgtggactgtggac ctg。

4.根据权利要求1所述的一种人外周血循环FST mRNA检测试剂盒，其特征在于：所述人外周血循环FST mRNA来源于人外周血血清或血浆。

5.根据权利要求1所述的一种人外周血循环FST mRNA检测试剂盒，其特征在于：所述SYBR Green I实时荧光定量PCR反应液是由SYBR Green、10μM的正义引物和反义引物及灭菌双蒸水组成。

6.如权利要求1所述的一种人外周血循环FST mRNA检测试剂盒在检测人外周血循环FST mRNA水平中的应用。

7.如权利要求1所述的一种人外周血循环FST mRNA检测试剂盒通过检测人外周血循环FST mRNA水平，在胚胎死亡早期预警中的应用。

8.如权利要求1所述的一种人外周血循环FST mRNA检测试剂盒通过检测人外周血循环FST mRNA水平，在判断妊娠女性子宫蜕膜发育状况中的应用。

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