TWI633117B - 結合至肌肉生長抑制素（ｍｙｏｓｔａｔｉｎ）以纖維連接蛋白爲主之支架結構域蛋白質 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於結合至肌肉生長抑制素以纖維連接蛋白為主之支架結構域蛋白質。本發明亦關於此等蛋白質在治療性應用中治療肌肉萎縮症、惡病質、少肌症、骨關節炎、骨質疏鬆症、糖尿病、肥胖症、COPD、慢性腎病、心臟衰竭、心肌梗塞及纖維化之用途。本發明進一步關於包含該等蛋白質之細胞、編碼該等蛋白質或其片段之聚核苷酸及包含編碼該等蛋白質之聚核苷酸的載體。

Description

結合至肌肉生長抑制素(MYOSTATIN)以纖維連接蛋白為主之支架結構域蛋白質 相關申請案之參考
本申請案主張2012年9月13日申請之名稱為「Fibronectin based scaffold domain proteins that bind to myostatin」的美國臨時申請案第61/700,697號及2013年3月13日申請之名稱為「Fibronectin based scaffold domain proteins that bind to myostatin」的美國臨時申請案第61/780,005號之優先權，其各自之全部內容以引用的方式併入本文中。
本發明係關於結合肌肉生長抑制素以纖維連接蛋白為主之支架結構域蛋白質。本發明亦關於該等創新性蛋白質在治療性應用中治療肌肉耗損疾病及代謝障礙之用途。本發明進一步關於包含該等蛋白質之細胞、編碼該等蛋白質或其片段之聚核苷酸及包含編碼該等創新性蛋白質之聚核苷酸的載體。
肌肉生長抑制素，亦稱為生長及分化因子-8(GDF-8)，其為分泌型生長因子之轉型生長因子-β(TGF-β)超家族之成員。肌肉生長抑制素具有為TGF-β家族蛋白質所共有之所有結構特徵：充當分泌信號之疏水性胺基端、九個無變化半胱胺酸殘基及「RXXR」弗林蛋白酶 (furin)型蛋白水解處理位點。蛋白質之蛋白水解裂解產生C端結構域，其形成作為肌肉生長抑制素之生物學活性形式的均二聚體(Thies等人，Growth Factors 2001；18(4)：251-9)。來自多個脊椎動物物種之肌肉生長抑制素胺基酸序列之C端片段之比對揭露該蛋白質在人類、猴、母牛、犬、小鼠、大鼠、火雞及雞之間高度保守(100%一致性)(McPherron等人PNAS,94：12457-61,1997)。
肌肉生長抑制素表現主要限於骨骼肌及脂肪組織，其中其已展示為骨骼肌發育之負性調節劑(Lee LS,Immunol Endocr Metab Agents Med Chem.2010；10：183-194)。在哺乳動物中，骨骼肌似乎為肌肉生長抑制素之主要目標組織，其中其結合至細胞表面受體，引起肌肉損失。肌肉生長抑制素遺傳性缺失之小鼠及牛展現出骨骼肌質量之顯著增加，亦即「雙肌性」表型，因此支持肌肉生長抑制素在抑制肌肉生長方面之作用(McPherron及Lee,Proc Natl Acad Sci U S A.2003年12月23日；100(26)：15842-6)。比利時藍牛(Belgian Blue)及皮爾蒙特牛(Piedmontese cattle)品種中之肌肉肥大係由於牛肌肉生長抑制素基因之第三外顯子內的誤義突變(Bass等人，Domest Anim Endocrinol.1999；17(2-3)：191-7)。肌肉生長抑制素抑制劑之轉殖基因過度表現亦引起過度肌肉發達。此等動物中之肌肉生長增強係由於細胞數目(或增生性生長)及細胞大小(或肥大性生長，其引起較大及較重肌纖維)兩者之增加。因肌肉生長抑制素突變所致之骨骼肌質量增加亦已在人類中有報導。肌肉生長抑制素抑制作用在產後階段及成年時均有效地增加骨骼肌質量及強度。
骨骼肌質量及強度之增加亦與正性影響身體組成、能量消耗、葡萄糖內穩定及胰島素需求之代謝適應力相關。遺傳及藥理學發現均指示肌肉生長抑制素調節能量代謝且其抑制作用可顯著減輕代謝疾病(包括肥胖症及糖尿病)之進展。舉例而言，肌肉生長抑制素缺失小鼠 在與同齡野生型小鼠相比時展現出體脂肪積累減少(McPherron及Lee,J.JCI 109：595,2002)。此體脂肪減少為脂肪細胞數目及大小減小之表現，指示肌肉生長抑制素在脂肪生成以及肌發生中之顯著作用。
因此，肌肉生長抑制素為用於治療以下各者之治療性或防治性介入術之所需目標：將得益於肌肉質量、肌力及/或代謝增加之病症或病狀(例如、肌肉萎縮症、虛弱、不用性萎縮及惡病質)、與肌肉耗損相關之病症(例如腎病、心衰竭或疾病及肝病)及代謝障礙(例如II型糖尿病、代謝症候群、肥胖症及骨關節炎)。
因此，將有利的是，獲得結合肌肉生長抑制素之改良之纖維連接蛋白結構域支架蛋白質以用於例如代謝障礙、肌肉耗損病症及因不活動所致之肌肉損失的治療性治療。
本發明至少部分基於結合且拮抗肌肉生長抑制素之黏附蛋白(Adnectin)之發現。特定言之，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白抑制肌肉生長抑制素活性，由此影響下游SMAD信號傳導。對本發明之一些抗肌肉生長抑制素黏附蛋白之改變的SMAD信號傳導作出解釋的一個機制涉及抑制Alk4募集至肌肉生長抑制素-ActRIIb複合物，其生理性後果為肌肉體積及體重增加。
在一個態樣中，本發明提供一種多肽，其包含纖維連接蛋白第十III型結構域(10Fn3)，其中10Fn3具有至少一個選自以下之環：相對於人類10Fn3結構域之相應環之序列胺基酸序列改變之環BC、DE及FG，且其中該多肽結合肌肉生長抑制素。在某些實施例中，該多肽以小於500nM之KD結合肌肉生長抑制素。
在一些實施例中，本發明之多肽之BC環包含根據式X1-L-P-X2-X3-X4-X5-X6-X7之胺基酸序列，其中(a)X1係選自由以下組成之群：S、T及Y；(b)X2係選自由以下組成之群：H、Y、N、R、F、G、S及 T；(c)X3係選自由以下組成之群：A、P、Q、S、F、H、N及R；(d)X4係選自由以下組成之群：G及A；(e)X5係選自由以下組成之群：H、L、R、V、N、D、F、I及K；(f)X6係選自由以下組成之群：A、L、G、M、F、I及V；及(g)X7係選自由以下組成之群：H及N。在某些實施例中，X1為S、及/或X2為H或Y，及/或X3為A或P，及/或X4為G，及/或X5為H、L或R，及/或X6為A或L，及/或X7為H。
在其他實施例中，BC環包含根據式X19-X20-P-X21-G-X22-A之胺基酸序列，其中(a)X19係選自由以下組成之群：D、E、V及W；(b)X20係選自由以下組成之群：A、S及V；(c)X21係選自由以下組成之群：R、A、G、K及L；及(d)X22係選自由以下組成之群：L及R。在某些實施例中，X19為D，及/或X20為A、S或V，及/或X22為L。
在一些實施例中，DE環包含根據式G-R-G-X8之胺基酸序列，其中X8為V或L。
在一些實施例中，DE環包含根據式X23-G-R-G-X24之胺基酸序列，其中(a)X23係選自由以下組成之群：V、P、F、I及L；及(b)X24係選自由以下組成之群：S、N及T。
在一些實施例中，本發明之多肽之FG環包含根據式X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18之胺基酸序列，其中(a)X9係選自由以下組成之群：L、V及I；(b)X10係選自由以下組成之群：T及S；(c)X11係選自由以下組成之群：K、R、A、G、S、D、H、N、T及P；(d)X12係選自由以下組成之群：S、T、A、E、H、K及N；(e)X13係選自由以下組成之群：K、G、Q、D、E、N、T及S；(f)X14係選自由以下組成之群：V、I、F、L、M、P、T及Y；(g)X15係選自由以下組成之群：I、L及Y；(h)X16係選自由以下組成之群：H、I、V、K、L、R、F、G、S及T；(i)X17係選自由以下組成之群：Y及H；及(j)X18係選自由以下組成之群：K、M、L、R及V。
在某些實施例中，X9為L或V，及/或X10為T，X11為K或R，及/或X12為S或T，及/或X13為K、G或Q，及/或X14為V或I，及/或X15為I，及/或X16為H、I或V，及/或X17為Y及/或X18為K或M。
在其他實施例中，FG環包含根據式X25-X26-R-X27-G-X28-X29-X30-X31-X32之胺基酸序列，其中(a)X25係選自由以下組成之群：I及V；(b)X26係選自由以下組成之群：F、D及Y；(c)X27係選自由以下組成之群：D及T；(d)X28係選自由以下組成之群：P、M、V及T；(e)X29係選自由以下組成之群：V、L、N、R及S；(f)X30係選自由以下組成之群：H、T、L、N、Q及S；(g)X31係選自由以下組成之群：F、W、Y、H及L；及(h)X32係選自由以下組成之群：D、A及G。
在某些實施例中，X25為I，及/或X26為F，及/或X27為D，及/或X28為P，及/或X29為V，及/或X30為H或T，及/或X31為F或W，及/或X32為D。
在一些實施例中，多肽包含BC環及DE環，或BC環及FG環，或DE環及FG環，或BC環、DE環及FG環。
在一些實施例中，多肽之BC環包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：7-38。在其他實施例中，DE環包含選自由以下組成之群的胺基酸：SEQ ID NO：39-45。在其他實施例中，FG環包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：46-79。在一些實施例中，BC、DE或FG環胺基酸序列分別與SEQ ID NO：7-38、39-45及46-79中之任一者至少80%一致。在其他實施例中，多肽包含與SEQ ID NO：80-123、228-239及252-273中之任一者至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致的胺基酸序列。在其他實施例中，多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：80-123、228-239及252-273。
在一些實施例中，多肽包含如表1中所示之BC、DE及FG環組 合。在一個實施例中，多肽具有分別如SEQ ID NO：34、39及75中所述之BC、DE及FG環。
在一些實施例中，多肽包含分別如SEQ ID NO：34、39及75中所述之BC、DE及FG環，其中BC環具有1、2、3、4、5或6個胺基酸取代，諸如保守胺基酸取代。在一些實施例中，BC環具有根據式X33-L-P-X34-X35-X36-X37-X38-X39之胺基酸序列，其中X33為T或Y；X34為Y、N、R、F、G、S或T；X35為A、P、S、F、H、N或R；X36為A；X37為H、L、R、V、N、D、F或I；X38為L、G、M、F、I或V；及X39為H。
在一些實施例中，多肽包含分別如SEQ ID NO：34、39及75中所述之BC、DE及FG環，其中DE環具有1個胺基酸取代，諸如保守胺基酸取代。在一些實施例中，DE環具有根據式G-R-G-X40之胺基酸序列，其中X40為L。
在一些實施例中，多肽包含分別如SEQ ID NO：34、39及75中所述之BC、DE及FG環，其中FG環具有1、2、3、4、5、6、7或8個胺基酸取代，諸如保守胺基酸取代。在一些實施例中，FG環具有根據式X41-X42-X43-X44-X45-X46-X47-X48-X49-X50之胺基酸序列，其中X41為L或I；X42為S；X43為K、R、A、G、S、H、N、T或P；X44為S、A、E、H、K或N；X45為K、Q、D、E、N、T或S；X46為V、I、F、L、M、P或T；X47為I或Y；X48為H、I、V、L、R、F、G、S或T；X49為H；及X50為M、L、R或V。
在一些實施例中，多肽包含分別如SEQ ID NO：34、39及75中所述之BC、DE及FG環，其中BC環具有1、2、3、4、5或6個胺基酸取代，諸如保守胺基酸取代，且DE環具有1個胺基酸取代，諸如保守胺基酸取代。在一些實施例中，BC環具有根據式X33-L-P-X34-X35-X36-X37-X38-X39之胺基酸序列，其中X33為T或Y；X34為Y、N、R、F、G、S或T；X35為A、P、S、F、H、N或R；X36為A；X37為H、L、R、 V、N、D、F或I；X38為L、G、M、F、I或V；及X39為H，且DE環具有根據式G-R-G-X40之胺基酸序列，其中X40為L。
在一些實施例中，多肽包含分別如SEQ ID NO：34、39及75中所述之BC、DE及FG環，其中BC環具有1、2、3、4、5或6個胺基酸取代，諸如保守胺基酸取代，且FG環具有1、2、3、4、5、6、7或8個胺基酸取代，諸如保守胺基酸取代。在一些實施例中，BC環具有根據式X33-L-P-X34-X35-X36-X37-X38-X39之胺基酸序列，其中X33為T或Y；X34為Y、N、R、F、G、S或T；X35為A、P、S、F、H、N或R；X36為A；X37為H、L、R、V、N、D、F或I；X38為L、G、M、F、I或V；及X39為H，且FG環具有根據式X41-X42-X43-X44-X45-X46-X47-X48-X49-X50之胺基酸序列，其中X41為L或I；X42為S；X43為K、R、A、G、S、H、N、T或P；X44為S、A、E、H、K或N；X45為K、Q、D、E、N、T或S；X46為V、I、F、L、M、P或T；X47為I或Y；X48為H、I、V、L、R、F、G、S或T；X49為H；及X50為M、L、R或V。
在一些實施例中，多肽包含分別如SEQ ID NO：34、39及75中所述之BC、DE及FG環，其中DE環具有1個胺基酸取代，諸如保守胺基酸取代，且FG環具有1、2、3、4、5、6、7或8個胺基酸取代，諸如保守胺基酸取代。在一些實施例中，DE環具有根據式G-R-G-X40之胺基酸序列，其中X40為L，且FG環具有根據式X41-X42-X43-X44-X45-X46-X47-X48-X49-X50之胺基酸序列，其中X41為L或I；X42為S；X43為K、R、A、G、S、H、N、T或P；X44為S、A、E、H、K或N；X45為K、Q、D、E、N、T或S；X46為V、I、F、L、M、P或T；X47為I或Y；X48為H、I、V、L、R、F、G、S或T；X49為H；及X50為M、L、R或V。
在一些實施例中，多肽包含分別如SEQ ID NO：34、39及75中所述之BC、DE及FG環，其中BC環具有1、2、3、4、5或6個胺基酸取 代，諸如保守胺基酸取代，且DE環具有1個胺基酸取代，諸如保守胺基酸取代，且FG環具有1、2、3、4、5、6、7或8個胺基酸取代，諸如保守胺基酸取代。在一些實施例中，BC環具有根據式X33-L-P-X34-X35-X36-X37-X38-X39之胺基酸序列，其中X33為T或Y；X34為Y、N、R、F、G、S或T；X35為A、P、S、F、H、N或R；X36為A；X37為H、L、R、V、N、D、F或I；X38為L、G、M、F、I或V；及X39為H；DE環具有根據式G-R-G-X40之胺基酸序列，其中X40為L；且FG環具有根據式X41-X42-X43-X44-X45-X46-X47-X48-X49-X50之胺基酸序列，其中X41為L或I；X42為S；X43為K、R、A、G、S、H、N、T或P；X44為S、A、E、H、K或N；X45為K、Q、D、E、N、T或S；X46為V、I、F、L、M、P或T；X47為I或Y；X48為H、I、V、L、R、F、G、S或T；X49為H；及X50為M、L、R或V。
在一些實施例中，多肽包含分別如SEQ ID NO：34、39及75中所述之BC、DE及FG環，且在BC、DE及FG環中具有允許多肽維持結合至肌肉生長抑制素之胺基酸取代。該等胺基酸取代可以藉由例如實例8中所描述之深度突變掃描來測定。因此，在一些實施例中，多肽具有BC環，該BC環包含根據式X51-X52-X53-X54-X55-X56-X57-X58-X59之胺基酸序列，其中：X51係選自由以下組成之群：A、C、D、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W及Y；X52係選自由以下組成之群：L、M及V；X53係選自由以下組成之群：A、C、D、E、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V及Y；X54係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；X55係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；X56係選自由以下組成之群：G及S；X57係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；X58係選自由以下組成之群： A、C、G、L、M、S及T；及X59係選自由以下組成之群：A、C、F、H、N、P、Q、R、S及Y。在一較佳實施例中，X51係選自由以下組成之群：C、F、I、S、V、W及Y；X52係選自由以下組成之群：L；X53係選自由以下組成之群：P；X54係選自由以下組成之群：C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；X55係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；X56係選自由以下組成之群：G；X57係選自由以下組成之群：A、C、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、V、W及Y；X58係選自由以下組成之群：A、G、L、M及S；及X59係選自由以下組成之群：C、H、N、Q、S及Y。在一更佳實施例中，X51係選自由以下組成之群：F、S及W；X52係選自由以下組成之群：L；X53係選自由以下組成之群：P；X54係選自由以下組成之群：C、F、G、I、K、L、M、N、R、S、T、V、W及Y；X55係選自由以下組成之群：A、C、E、F、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V及Y；X56係選自由以下組成之群：G；X57係選自由以下組成之群：A、C、H、K、L、M、N、R、V、W及Y；X58係選自由以下組成之群：A、G及L；及X59係選自由以下組成之群：H、N及Q。在一特定實施例中，X51為S；X52為L；X53為P；X54為H；X55為Q；X56為G；X57為K；X58為A；X59為N。
在一些實施例中，多肽包含DE環，該DE環包含根據式G-R-G-X60之胺基酸序列，其中X60為A、C、D、E、F、I、K、L、M、N、Q、S、T及V。在一較佳實施例中，X60為C、E、I、L、M、Q、T及V。在一更佳實施例中，X60為C、E、I、L、M及V。在一特定實施例中，X60為V。
在一些實施例中，多肽包含FG環，該FG環包含根據式X61-X62-X63-X64-X65-X66-X67-X68-X69-X70之胺基酸序列，其中X61係選自由以下 組成之群：A、C、F、I、L、M、Q、T、V、W及Y；X62係選自由以下組成之群：A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；X63係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；X64係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；X65係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；X66係選自由以下組成之群：A、C、F、H、I、L、M、N、P、S、T、V、W及Y；X67係選自由以下組成之群：A、C、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；X68係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；X69係選自由以下組成之群：F、W及Y；及X70係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y。在一較佳實施例中，X61係選自由以下組成之群：A、C、I、L、M及V；X62係選自由以下組成之群：C、F、H、I、L、M、Q、R、S、T、V、W及Y；X63係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、W及Y；X64係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；X65係選自由以下組成之群：A、D、E、F、G、H、I、L、M、N、Q、S、T、V、W及Y；X66係選自由以下組成之群：C、F、I、L、M、P、T、V、W及Y；X67係選自由以下組成之群：C、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W及Y；X68係選自由以下組成之群：A、C、E、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；X69係選自由以下組成之群：W及Y；及X70係選自由以下組成之群：A、C、D、E、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T及V。在一更佳實施例中，X61係選自由以下組成之群：I及V； X62係選自由以下組成之群：C、F、I、L、M、T、V、W及Y；X63係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、Q、S、T及V；X64係選自由以下組成之群：A、C、D、F、G、I、L、M、N、Q、S、T、V、W及Y；X65係選自由以下組成之群：A、G、S、T及W；X66係選自由以下組成之群：F、I、V、W及Y；X67係選自由以下組成之群：F、H、I、L、M、V、W及Y；X68係選自由以下組成之群：A、C、F、G、I、K、L、M、T、V及W；X69係選自由以下組成之群：W及Y；及X70係選自由以下組成之群：A、G、K、L、M、P、Q及R。在一特定實施例中，X61為V；X62為T；X63為D；X64為T；X65為G；X66為Y；X67為L；X68為K；X69為Y；及X70為K。
在一些實施例中，本發明之多肽包含BC、DE及FG環，其中BC環包含根據式X51-X52-X53-X54-X55-X56-X57-X58-X59之胺基酸序列，其中，X51係選自由以下組成之群：A、C、D、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W及Y；X52係選自由以下組成之群：L、M及V；X53係選自由以下組成之群：A、C、D、E、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V及Y；X54為A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；X55係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；X56係選自由以下組成之群：G及S；X57為A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；X58為A、C、G、L、M、S及T；及X59為A、C、F、H、N、P、Q、R、S及Y；DE環包含根據式G-R-G-X60之胺基酸序列，其中X60係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、I、K、L、M、N、Q、S、T及V；且FG環包含根據式X61-X62-X63-X64-X65-X66-X67-X68-X69-X70之胺基酸序列，其中X61係選自由以下組成之群：A、C、F、I、L、M、Q、T、V、W及Y；X62為A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及 Y；X63係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；X64係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；X65係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；X66係選自由以下組成之群：A、C、F、H、I、L、M、N、P、S、T、V、W及Y；X67係選自由以下組成之群：A、C、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；X68係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；X69係選自由以下組成之群：F、W及Y；及X70係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y。
在一較佳實施例中，本發明之多肽包含BC、DE及FG環，其中BC環包含根據式X51-X52-X53-X54-X55-X56-X57-X58-X59之胺基酸序列，其中，X51係選自由以下組成之群：C、F、I、S、V、W及Y；X52為L；X53為P；X54係選自由以下組成之群：C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；X55係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；X56為G；X57係選自由以下組成之群：A、C、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、V、W及Y；X58係選自由以下組成之群：A、G、L、M及S；及X59係選自由以下組成之群：C、H、N、Q、S及Y；DE環包含根據式G-R-G-X60之胺基酸序列，其中X60係選自由以下組成之群：C、E、I、L、M、Q、T及V；且FG環包含根據式X61-X62-X63-X64-X65-X66-X67-X68-X69-X70之胺基酸序列，其中X61係選自由以下組成之群：A、C、I、L、M及V；X62為C、F、H、I、L、M、Q、R、S、T、V、W及Y；X63係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、W及Y；X64係選自由以 下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；X65係選自由以下組成之群：A、D、E、F、G、H、I、L、M、N、Q、S、T、V、W及Y；X66係選自由以下組成之群：C、F、I、L、M、P、T、V、W及Y；X67係選自由以下組成之群：C、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W及Y；X68係選自由以下組成之群：A、C、E、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；X69係選自由以下組成之群：W及Y；及X70係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y。
在一更佳實施例中，本發明之多肽包含BC、DE及FG環，其中BC環包含根據式X51-X52-X53-X54-X55-X56-X57-X58-X59之胺基酸序列，其中，X51係選自由以下組成之群：F、S及W；X52為L；X53為P；X54係選自由以下組成之群：C、F、G、I、K、L、M、N、R、S、T、V、W及Y；X55係選自由以下組成之群：A、C、E、F、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V及Y；X56為G；X57係選自由以下組成之群：A、C、H、K、L、M、N、R、V、W及Y；X58係選自由以下組成之群：A、G及L；及X59係選自由以下組成之群：H、N及Q；DE環包含根據式G-R-G-X60之胺基酸序列，其中X60係選自由以下組成之群：C、E、I、L、M及V；且FG環包含根據式X61-X62-X63-X64-X65-X66-X67-X68-X69-X70之胺基酸序列，其中X61係選自由以下組成之群：I及V；X62為C、F、I、L、M、T、V、W及Y；X63係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、Q、S、T及V；X64係選自由以下組成之群：A、C、D、F、G、I、L、M、N、Q、S、T、V、W及Y；X65係選自由以下組成之群：A、G、S、T及W；X66係選自由以下組成之群：F、I、V、W及Y；X67係選自由以下組成之群：F、H、I、L、M、V、W及Y；X68係選自由以下組成之群：A、C、 F、G、I、K、L、M、T、V及W；X69係選自由以下組成之群：W及Y；及X70係選自由以下組成之群：A、G、K、L、M、P、Q及R。
在一特定實施例中，本發明之多肽包含BC、DE及FG環，其中BC環包含根據式X51-X52-X53-X54-X55-X56-X57-X58-X59之胺基酸序列，其中，X51為S；X52為L；X53為P；X54為H；X55為Q；X56為G；X57為K；X58為A；X59為N；DE環包含根據式G-R-G-X60之胺基酸序列，其中X60為V；且FG環包含根據式X61-X62-X63-X64-X65-X66-X67-X68-X69-X70之胺基酸序列，其中X61為V；X62為T；X63為D；X64為T；X65為G；X66為Y；X67為L；X68為K；X69為Y；及X70為K。
在另一實施例中，多肽包含與以下中所述之胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO：273[PRD-1474]、SEQ ID NO：118[3116_A06]、SEQ ID NO：281[前接N端延伸序列(GVSDVPRDL)且後接C端尾區(EI)之PRD-1474及3116_A06之核心黏附蛋白序列]或SEQ ID NO：331[無N端前導序列或C端尾區之PRD-1474及3116_A06之核心黏附蛋白序列]。在另一實施例中，多肽包含與SEQ ID NO：118、273、281或331之非BC、DE及FG環區至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供多肽，該等多肽結合至肌肉生長抑制素上之不連續黏附蛋白結合位點上。在一些實施例中，多肽結合在肌肉生長抑制素(SEQ ID NO：3)之胺基酸55-66內之區域。在一些實施例中，多肽結合在肌肉生長抑制素(SEQ ID NO：3)之胺基酸85-101內之區域。在其他實施例中，多肽結合在肌肉生長抑制素(SEQ ID NO：3)之胺基酸85-101及55-66兩個區域內。
在一些實施例中，本發明之多肽不與ActRIIB競爭結合至肌肉生長抑制素。在一些實施例中，本發明之多肽與ALK4及/或ALK5競爭 結合至肌肉生長抑制素。
在一些實施例中，上述多肽可包含一或多種藥物動力學(PK)部分，諸如聚乙二醇、唾液酸、Fc、Fc片段、運鐵蛋白、血清白蛋白、血清白蛋白結合蛋白及血清免疫球蛋白結合蛋白。在一個實施例中，PK部分為包含結合至例如HSA之10Fn3結構域之血清白蛋白結合蛋白。在另一實施例中，PK部分為Fc且可處於多肽之N端或C端上，且視情況形成二聚體。在其他實施例中，PK部分為聚乙二醇。在一些實施例中，PK部分及多肽經由至少一個二硫鍵、肽鍵、多肽、聚合糖或聚乙二醇部分連接。
在另一態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含上述多肽，該多肽視情況無內毒素。
在另一態樣中，本發明提供編碼上述多肽之經分離之核酸分子、包含核苷酸序列之表現載體及包含編碼該多肽之核酸的細胞。在另一態樣中，本發明提供一種藉由培養細胞來製造抗肌肉生長抑制素多肽之方法。
在另一態樣中，本發明提供一種減輕或抑制個體之肌肉生長抑制素相關之疾病或病症的方法，該方法藉由投與有效量之上述多肽或包含多肽之組合物來進行。在一些實施例中，待治療之疾病為肌肉萎縮症、肌肉萎縮性側索硬化、包涵體肌炎(IBM)、充血性阻塞性肺病、慢性心臟衰竭、癌症、AIDs、腎衰竭、慢性腎病、尿毒症、類風濕性關節炎、少肌症、因長期臥床休息所致之肌肉耗損、脊髓損傷、中風、骨折、衰老、糖尿病、肥胖症、高血糖症、惡病質、骨關節炎、骨質疏鬆症、心肌梗塞或纖維化。
在另一態樣中，本發明提供一種減輕或抑制個體之與肌肉退化或耗損相關之病症的方法。
在另一態樣中，本發明提供一種投與該多肽以在個體中增加肌 肉質量、增加肌細胞數目、增加肌細胞大小、增強肌力、體能及/或耐力的方法。
在另一態樣中，本發明提供一種減輕或抑制個體之代謝障礙之方法。在一些實施例中，代謝障礙為糖尿病(例如II型糖尿病)、高血糖症、高胰島素血症、高脂質血症、胰島素抗性、葡萄糖代謝受損、脂質營養不良、肥胖症或代謝症候群。在一些實施例中，可投與第二治療組合物。在其他實施例中，投與多肽引起胰島素敏感性增加、細胞對葡萄糖攝取增加、血糖含量降低及/或體脂肪減少。
在另一態樣中，本發明提供一種增加個體之瘦肌肉質量之方法，其包含投與有效量之上述多肽或組合物。
在另一態樣中，本發明提供一種增加個體之瘦肌肉質量與脂肪之比率的方法，其包含投與有效量之上述多肽或組合物。
在另一態樣中，本發明提供套組，其包含上述多肽或組合物及使用說明書。
在另一態樣中，本發明提供偵測或量測樣品中肌肉生長抑制素之方法，其包含使樣品與上述多肽接觸，及偵測或量測多肽與肌肉生長抑制素之結合。
在另一態樣中，本發明係關於抗肌肉生長抑制素結合黏附蛋白用於在個體中減輕或抑制肌肉生長抑制素相關之疾病或病症、減輕或抑制與肌肉退化或耗損相關之病症、增加肌肉質量、增加肌細胞數目、增加肌細胞大小、增強肌力、體能及/或耐力、減輕或抑制代謝障礙、增加瘦肌肉質量及/或增加瘦肌肉質量與脂肪之比率。在一些實施例中，抗肌肉生長抑制素黏附蛋白為在本文中描述者，例如SEQ ID NO：80-123、228-239及252-273中所述之抗肌肉生長抑制素。
在另一態樣中，本發明係關於抗肌肉生長抑制素結合黏附蛋白用於製備供以下用之藥物的用途：在個體中減輕或抑制肌肉生長抑制 素相關之疾病或病症、減輕或抑制與肌肉退化或耗損相關之病症、增加肌肉質量、增加肌細胞數目、增加肌細胞大小、增強肌力、體能及/或耐力、減輕或抑制代謝障礙、增加瘦肌肉質量及/或增加瘦肌肉質量與脂肪之比率。在一些實施例中，抗肌肉生長抑制素黏附蛋白為在本文中描述者，例如SEQ ID NO：80-123、228-239及252-273中所述之抗肌肉生長抑制素。
圖1展示例示性抗肌肉生長抑制素黏附蛋白胺基酸序列之比對。BC、DE及FG環胺基酸序列分別利用加下劃線、斜體/加下劃線或粗體/加下劃線識別。
圖2描繪抗肌肉生長抑制素黏附蛋白之1979_B06家族之BC環之變化殘基的基於WebLogo的分析。指示在PROfusion期間變化之BC環之各位置中之胺基酸的頻率。該圖像使用WebLogo形成(Crooks GE,Hon G,Chandonia JM,Brenner SE.WebLogo：A sequence logo generator.Genome Research 2004；14：1188-1190)。
圖3描繪抗肌肉生長抑制素黏附蛋白之1979_B06家族之DE環之變化殘基的基於WebLogo的分析。指示在PROfusion期間變化之DE環之各位置中之胺基酸的頻率。
圖4描繪抗肌肉生長抑制素黏附蛋白之1979_B06家族之FG環之變化殘基的基於WebLogo的分析。指示在PROfusion期間變化之FG環之各位置中之胺基酸的頻率。
圖5描繪抗肌肉生長抑制素黏附蛋白之2062_G02家族之BC環之變化殘基的基於WebLogo的分析。指示在PROfusion期間變化之BC環之各位置中之胺基酸的頻率。
圖6描繪抗肌肉生長抑制素黏附蛋白之2062_G02家族之DE環之變化殘基的基於WebLogo的分析。指示在PROfusion期間變化之DE環之 各位置中之胺基酸的頻率。
圖7描繪抗肌肉生長抑制素黏附蛋白之2062_G02家族之FG環之變化殘基的基於WebLogo的分析。指示在PROfusion期間變化之FG環之各位置中之胺基酸的頻率。
圖8描繪展示黏附蛋白3116_A06之不連續丙胺酸突變蛋白質之基於生物化學及細胞之資料的相關性的圖式，且其在深度突變掃描中根據序列位置之相對適合度。
圖9描繪展示來自黏附蛋白3116_A06之丙胺酸突變之NGS深度突變掃描之ERnorm的相關性的圖式，其中IC50利用HTRF量測。指示針對用於結合至肌肉生長抑制素之較佳、更佳及最佳單一位點突變之裝箱。
圖10描繪競爭性結合分析(競爭性ELISA)之圖式，其展示黏附蛋白PRD-1285、PRD-1286及PRD-1288不阻斷肌肉生長抑制素結合至ActRIIb-Fc。指示結合至肌肉生長抑制素之ActRIIb-Fc之競爭%。正如所料，陽性對照ActRIIb-Fc構築體與ActRIIb-Fc競爭結合至肌肉生長抑制素。
圖11描繪展示多種濃度黏附蛋白PRD-1285、PRD-1286及PRD-1288在ARE-螢光素酶分析中對肌肉生長抑制素活性之作用的圖式。實驗條件如實例3中所描述。PRD-1285、PRD-1286及PRD-1288中之各者抑制100%肌肉生長抑制素誘導之ARE-螢光素酶活性。
圖12為描繪本發明之黏附蛋白抑制肌肉生長抑制素活性之作用機制之示意圖。自然信號傳導複合物展示於圖12A中。特定言之，肌肉生長抑制素結合至ActRIIb，隨後募集活化素受體樣激酶4(ALK4)或ALK5，且ActRIIb及ALK4/5結合至肌肉生長抑制素之不同區域上。本發明之黏附蛋白防止ALK4/5而非ActRIIb結合至肌肉生長抑制素(圖12B)。
圖13展示描繪3116_A06及肌肉生長抑制素之複合物之計算模型。圖13A展示單獨肌肉生長抑制素之結構(灰色)，其中指示ALK4結合位點及ActRIIB結合位點。3116_A06結合至肌肉生長抑制素之區域(即區域1及2)以黑色指示，如由實例11中所述實驗測定。圖13B展示自如實例12中所描述之對接方案獲得之3116_A06(黑色)及肌肉生長抑制素(灰色)之較佳複合物。如由HDX-MS鑑別之肌肉生長抑制素區域1及2(實例11)以空間上填充形式表示在僅分子之一側上，且3116_A06之BC、DE及FG環以棍繪製形式表示。儘管此圖展示一個黏附蛋白結合至兩個黏附蛋白結合位點中之一者上，但應注意到個別黏附蛋白結合位點或兩個黏附蛋白結合位點可被佔據。
圖14描繪展示與對照小鼠相比用指示之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白治療之小鼠中第15天時體重增加百分比的條形圖。B6 SCID小鼠每兩週一次或每週一次用皮下注射抗肌肉生長抑制素黏附蛋白治療持續14天，如實例13中所描述。在整個治療週期中量測體重；描繪第15天之計算之變化百分比值。(*=指示與相應對照組之統計學差異；p0.01 t檢驗)。
圖15描繪展示與對照小鼠相比用指示之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白治療之小鼠中第15天時腿肌肉體積增加(cm3)的條形圖。B6 SCID小鼠每兩週一次或每週一次用皮下注射抗肌肉生長抑制素黏附蛋白治療持續14天，如實例13中所描述。(*=指示與相應對照組之統計學差異；p0.05 t檢驗)。
圖16描繪展示用不同指示劑量之PRD-1474治療之小鼠中第28天時腿肌肉體積增加(cm3)的條形圖。B6 SCID小鼠每兩週一次或每週一次用皮下注射PRD-1474治療持續28天，如實例14中所描述。(*p<0.0001；#組間不顯著)。
定義
除非另外定義，否則本文中使用之所有技術及科學術語均具有與熟練技工通常所瞭解相同的含義。儘管可在本發明之實踐或測試中使用與本文所述之方法及組合物相似或等效的任何方法及組合物，但在本文中描述較佳方法及組合物。
如本文所用之「全長肌肉生長抑制素」係指McPherron等人(1997)，前述中所述之全長多肽序列以及包括對偶基因變異體及種間同系物之相關全長多肽。術語「肌肉生長抑制素」或「成熟肌肉生長抑制素」係指生物學活性成熟肌肉生長抑制素之片段以及包括對偶基因變異體、剪接變異體及融合肽及多肽之相關多肽。已報導成熟C端蛋白質在包括人類、小鼠、雞、豬、火雞及大鼠在內之許多物種中具有100%序列一致性(Lee等人，PNAS 2001；98：9306)。人類前原肌肉生長抑制素之序列為： (SEQ ID NO：1)
人類原肌肉生長抑制素之序列為： (SEQ ID NO：2)
成熟肌肉生長抑制素之序列(在人類、鼠類、大鼠、雞、火雞、犬、馬及豬中保守)為： DFGLDCDEHSTESRCCRYPLTVDFEAFGWDWIIAPKRYKANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQANPRGSAGPCCTPTKMSPINMLYFNGKEQIIYGKIPAMVVDRCGCS(SEQ ID NO：3)。
如本文所用之「多肽」係指兩個或兩個以上胺基酸之任何序列，與長度、轉譯後修飾或功能無關。「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用。多肽可包括天然胺基酸及非天然胺基酸，諸如以引用的方式併入本文中之美國專利第6,559,126號中描述者。多肽亦可以多種標準化學方式中之任一者修飾(例如，胺基酸可經保護基修飾；可使羧基端胺基酸成為末端醯胺基；胺基端殘基可經基團修飾以例如增加親脂性；或多肽可以化學方式糖基化或以其他方式修飾以增加穩定性或體內半衰期)。多肽修飾可包括將諸如環狀化合物或其他分子之另一結構連接至多肽上，且亦可包括含有呈改變之組態(亦即R或S；或L或D)之一或多個胺基酸的多肽。本發明之肽為自纖維結合蛋白之第十III型結構域獲得之蛋白質，該等蛋白質已經修飾以結合至肌肉生長抑制素，且在本文中稱為「抗肌肉生長抑制素黏附蛋白」或「肌肉生長抑制素黏附蛋白」。
如本文所用之「多肽鏈」係指其結構域中之各者利用肽鍵(如與非共價相互作用或二硫鍵相對)連接至其他結構域上之多肽。
「經分離之」多肽為自其自然環境之組分鑑別及分離及/或回收之多肽。其自然環境之污染物組分為會干擾多肽之診斷或治療用途的物質，且可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶質。在較佳實施例中，多肽將純化(1)至如由勞立法(Lowry method)所測定，大於95重量%之多肽，且最佳大於99重量%；(2)至足以至少獲得N端或內部胺基酸序列之殘基的程度，藉由使用旋杯式測序儀；或(3)至均質，利用SDS-PAGE在還原或非還原條件下使用考馬斯藍(Coomassie blue)或較佳銀染色。經分離之多肽包括重組細胞內之原位多肽，因為多肽之 天然環境的至少一種組分將不存在。然而，通常分離之多肽將利用至少一個純化步驟來製備。
「胺基酸序列一致性百分比(%)」在本文中定義為在將序列對準且引入間隙(必要時)以獲得最大序列一致性百分比，且不將任何保守取代視為序列一致性之一部分之後，與選定序列中之胺基酸殘基一致之候選序列中之胺基酸殘基的百分比。出於測定胺基酸序列一致性百分比之目的，可以此項技術內之多種方式，例如使用公開可得之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTARTM)軟體達成比對。熟習此項技術者可易於決定用於量測比對之適當參數，包括達成在所比較之序列全長內之最大比對所需之任何演算法。舉例而言，給定胺基酸序列A對、與或針對給定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%(其可替代地表述為對、與或針對給定胺基酸序列B具有或包含特定胺基酸序列一致性%之給定胺基酸序列A)係如下計算：100×分數X/Y，其中X為藉由序列比對程式ALIGN-2在A及B之該程式比對中評分為一致匹配之胺基酸殘基之數目，且其中Y為B中胺基酸殘基之總數目。應瞭解當胺基酸序列A之長度與胺基酸序列B之長度不等時，A對B之胺基酸序列一致性%將不等於B對A之胺基酸序列一致性%。
如本文所用，「保守取代」表示在不改變肽之總體構形及功能之情況下，胺基酸殘基由另一者置換，包括(但不限於)胺基酸經具有相似性質(諸如極性、氫鍵勢能、酸性、鹼性、形狀、疏水性、芳族及其類似性質)之胺基酸置換。具有相似性質之胺基酸為此項技術中所熟知。舉例而言，精胺酸、組胺酸及離胺酸為親水性-鹼性胺基酸且可為可互換的。類似地，異白胺酸(一種疏水性胺基酸)可經白胺酸、甲硫胺酸或纈胺酸置換。可由彼此取代之中性親水性胺基酸包括天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸及蘇胺酸。藉由「經取代」或「經修飾」， 本發明包括已自天然產生之胺基酸改變或修飾之胺基酸。因此應理解，在本發明情形中，保守取代在此項技術中公認為一個胺基酸由具有相似性質之另一胺基酸取代。
如本文所用，術語「黏附蛋白結合位點」係指與特定黏附蛋白相互作用或結合之蛋白質(例如肌肉生長抑制素)之位點或部分(例如由抗體識別之抗原決定基)。黏附蛋白結合位點可由鄰接胺基酸或藉由蛋白質三重摺疊而毗連之非鄰接胺基酸形成。由鄰接胺基酸形成之黏附蛋白結合位點在暴露於變性溶劑時通常保留，而藉由三重摺疊而形成之黏附蛋白結合位點在變性溶劑處理時通常丟失。
本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白之黏附蛋白結合位點可藉由應用抗體之抗原決定基定位通常所用之標準技術來測定，包括(但不限於)蛋白酶定位及突變分析。或者，黏附蛋白結合位點可利用競爭分析使用參考黏附蛋白或結合至相同多肽(例如肌肉生長抑制素)之抗體來測定(如下文在「交叉競爭性黏附蛋白及/或結合至相同黏附蛋白結合位點之黏附蛋白」章節中進一步描述)。若測試黏附蛋白及參考分子(例如另一黏附蛋白或抗體)競爭，則其結合至相同黏附蛋白結合位點或足夠接近以致一個分子之結合會干擾其他分子之黏附蛋白結合位點。
如在本文中可互換使用之術語「特異性地結合」、「特異性結合」、「選擇性結合」及「選擇性地結合」係指對肌肉生長抑制素展現親和力但不顯著結合(例如小於約10%結合)至不同多肽之黏附蛋白，如利用此項技術中可利用之技術量測，諸如(但不限於)史卡查分析(Scatchard analysis)及/或競爭性結合分析(例如競爭ELISA、BIACORE分析)。當例如本發明之黏附蛋白之結合結構域對肌肉生長抑制素具有特異性時，該術語亦為可適用的。
如本文所用之術語「優先結合」係指如利用此項技術中可利用 之技術量測，諸如(但不限於)史卡查分析及/或競爭性結合分析(例如競爭ELISA、BIACORE分析)，本發明之黏附蛋白比其結合不同多肽多至少約20%地結合肌肉生長抑制素之情形。
如本文所用，術語「交叉反應性」係指結合至具有相同或極其相似黏附蛋白結合位點之一個以上不同蛋白質之黏附蛋白。
如本文所用之術語「KD」意欲指代特定黏附蛋白-蛋白質(例如肌肉生長抑制素)相互作用之解離平衡常數或黏附蛋白對蛋白質(例如肌肉生長抑制素)之親和力，如使用表面電漿子共振分析或細胞結合分析量測。如本文所用之「所需KD」係指對於預期目的足夠之黏附蛋白之KD。舉例而言，所需KD可指代在活體外分析(例如基於細胞之螢光素酶分析)中誘發功能性作用所需之黏附蛋白之KD。
如本文所用之術語「kass」意欲指代黏附蛋白結合至黏附蛋白/蛋白質複合物中之結合速率常數。
如本文所用之術語「kdiss」意欲指代黏附蛋白自黏附蛋白/蛋白質複合物解離之解離速率常數。
如本文所用之術語「IC50」係指在活體外或活體內分析中抑制反應至最大抑制反應之50%之程度(亦即介於最大抑制反應與未經處理之反應的中間值)的黏附蛋白濃度。
如本文所用之術語「肌肉生長抑制素活性」係指與活性肌肉生長抑制素蛋白質結合至ActRIIb以及Alk4或Alk5後續募集相關之生長調節性或形態形成活性中之一或多者。舉例而言，活性肌肉生長抑制素為骨骼肌質量之負性調節劑。活性肌肉生長抑制素亦可調節肌肉特異性酶(例如肌酸激酶)之產生、刺激肌母細胞增殖及調節前脂肪細胞分化成脂肪細胞。肌肉生長抑制素活性可使用技術公認之方法(諸如本文所述之方法)測定。
短語「抑制肌肉生長抑制素活性」或「拮抗肌肉生長抑制素活 性」或「拮抗肌肉生長抑制素」可互換使用以指代本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白活體內或活體外中和或拮抗肌肉生長抑制素活性之能力。如本文所用之術語「抑制」或「中和」就本發明之黏附蛋白活性而言意謂實質上拮抗、防止、預防、抑制、減緩、破壞、消除、終止、降低或逆轉例如包括(但不限於)生物活性或性質、疾病或病狀之受抑制者的進展或嚴重度的能力。抑制或中和較佳為至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或95%以上。
舉例而言，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白可降低通常見於脊椎動物個體中之生物學活性肌肉生長抑制素之循環含量，或患有引起肌肉生長抑制素之循環含量升高之病症之個體中生物學活性肌肉生長抑制素的循環含量降低。肌肉生長抑制素活性降低可使用如本文所述之活體外分析(例如結合分析)測定。或者，肌肉生長抑制素活性降低可引起體重增加、肌肉質量增加、肌力增強、肌肉與脂肪比率變化、無脂肌肉質量增加、肌細胞之大小及/或數目增加、及/或體脂肪含量降低。
術語「PK」為「藥物動力學(pharmacokinetic)」之首字母縮寫，且涵蓋包括例如由個體吸收、分佈、代謝及消除之化合物性質。如本文所用之「PK調節蛋白」或「PK部分」係指在融合至生物學活性分子或與生物學活性分子一起投與時影響生物學活性分子之藥物動力學性質的任何蛋白質、肽或部分。PK調節蛋白或PK部分之實例包括PEG、人血清白蛋白(HSA)黏合劑(如美國公開案第2005/0287153號及第2007/0003549號、PCT公開案第WO 2009/083804號及第WO 2009/133208號中所揭示)、人血清白蛋白、Fc或Fc片段及其變異體、及糖(例如唾液酸)。
胺基酸序列或化合物之「半衰期」通常可定義為活體內多肽之血清濃度減少50%所用時間，例如歸因於序列或化合物降解及/或序列 或化合物利用天然機制之清除或螯合。半衰期可以本身已知之任何方式(諸如利用藥物動力學分析)測定。熟習此項技術者將清楚適合之技術，且該等技術可例如通常涉及以下步驟：向個體適當投與適合劑量之本發明之胺基酸序列或化合物；定期自個體收集血液樣品或其他樣品；測定該血液樣品中本發明之胺基酸序列或化合物之含量或濃度；且自由此獲得之資料(之作圖)計算給藥後與初始含量相比直至本發明之胺基酸序列或化合物之含量或濃度已降低50%的時間。參考例如標準手冊，諸如Kenneth,A.等人，Chemical Stability of Pharmaceuticals：A Handbook for Pharmacists及Peters等人，Pharmacokinete Analysis：A Practical Approach(1996)。亦參考Gibaldi,M.等人，Pharmacokinetics，第2修訂版，Marcel Dekker(1982)。
半衰期可使用諸如t1/2-α、t1/2-β、HL_λ_z及曲線下面積(AUC)之參數表示。在本說明書中，「半衰期增加」係指任何一個此等參數、任何兩個此等參數、任何三個此等參數或所有四個此等參數增加。「半衰期增加」尤其指代t1/2-β及/或HL_λ_z增加，伴有或不伴有t1/2-α及/或AUC或兩者增加。
表示法「mpk」、「mg/kg」或「毫克/公斤」係指每公斤毫克數。所有表示法在整個本發明中可互換使用。
術語「個體(individual)」、「個體(subject)」及「患者」在本文中可互換使用，指代動物，較佳哺乳動物(包括非靈長類動物及靈長類動物)或禽類物種，包括(但不限於)鼠類、猴、人類、哺乳動物農場動物(例如牛、豬、綿羊)、哺乳動物體育動物(例如馬)及哺乳動物寵物(例如犬及貓)；該術語較佳係指人類。該術語亦指禽類物種，包括(但不限於)雞及火雞。在一特定實施例中，個體(較佳哺乳動物，較佳人類)之特徵進一步在於患有將得益於肌肉生長抑制素之含量降低或生物活性降低的疾病或病症或病況。在另一實施例中，個體(較佳哺乳 動物，較佳人類)之特徵進一步在於處於發展將得益於肌肉生長抑制素之含量降低或肌肉生長抑制素之生物活性降低的病症、疾病或病況的風險之中。
術語「治療有效量」係指為向個體賦予治療學益處所必需之藥劑之至少最少劑量但小於中毒劑量。舉例而言，治療有效量之本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白為在哺乳動物(較佳人類)中引起以下一或多者的量：肌肉體積及/或肌力增加、體脂肪減少、胰島素敏感性增加、或其中肌肉生長抑制素之存在引起或造成不良病理性作用或肌肉生長抑制素含量之降低引起有益治療性作用之病況的治療。
如本文所用之術語「虛弱的」或「虛弱」係指特徵可在於來自虛弱、體重損失、運動性減緩、疲勞、活動程度較低、耐力較差及對感官線索之受損行為反應之兩個或兩個以上症狀的病況。虛弱之一個標誌為「少肌症」或年齡相關之肌肉質量損失。
如本文所用之術語「惡病質」係指可由多種疾病產生之加速肌肉耗損及瘦體質損失之病況。
概述
本發明提供結合且拮抗肌肉生長抑制素之新穎多肽(在本文中稱為「抗肌肉生長抑制素黏附蛋白」)。為了鑑別肌肉生長抑制素拮抗劑，將肌肉生長抑制素呈遞至黏附蛋白之較大合成文庫。針對肌肉生長抑制素結合、針對生物物理學性質及針對肌肉生長抑制素抑制性活性篩選結合至肌肉生長抑制素之黏附蛋白。使抗肌肉生長抑制素黏附蛋白突變且藉由降低目標濃度及針對具有較慢解離速率之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白選擇來經受進一步選擇壓力。自此最佳化過程，將黏附蛋白之家族鑑別為具備有利生物化學及生物物理學活性之肌肉生長抑制素特異性抑制劑。本申請案中揭示之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白適用於治療已知抑制肌肉生長抑制素活性為有益之病症、疾病及病 況，包括(但不限於)治療肌肉耗損疾病、代謝障礙及因不活動所致之肌肉萎縮。
如Rebbapragada等人(MCB 2003；23：7230-42)中所揭示，肌肉生長抑制素信號傳導路徑涉及肌肉生長抑制素結合至ActRIIb，隨後募集活化素受體樣激酶4(ALK4)或ALK5。結合至ALK誘導Smad2/Smad3磷酸化，隨後活化TGFβ樣信號傳導路徑(參見例如Rebbapragada等人，MCB 2003；23：7230-42)。
I. 以纖維連接蛋白為主之支架
本申請案之一個態樣提供抗肌肉生長抑制素黏附蛋白，其包含Fn3結構域，其中一或多個溶劑可接近環已經隨機化或突變。在一些實施例中，Fn3結構域為自人類纖維結合蛋白III型結構域(10Fn3)之野生型第十組件獲得之Fn3結構域：VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO：4)(BC、DE及FG環加下劃線)。
在其他實施例中，10Fn3之非配位體結合序列，亦即「10Fn3支架」可經改變，其限制條件為10Fn3保留配位體結合功能及/或結構穩定性。已報導多種突變10Fn3支架。在一個態樣中，Asp 7、Glu 9及Asp 23中之一或多者經另一胺基酸(諸如非帶負電荷胺基酸殘基(例如Asn、Lys等))置換。已報導此等突變具有與野生型形式相比促進突變10Fn3在中性pH值下之較大穩定性之作用(參見例如PCT公開案第WO 02/04523號)。已揭示有益或中性之10Fn3支架中的各種其他變化。參見，例如Batori等人，Protein Eng.,15(12)：1015-1020(2002年12月)；Koide等人，Biochemistry,40(34)：10326-10333(2001年8月28日)。
變異及野生型10Fn3蛋白質兩者之特徵在於相同結構，亦即指定為A至G之七個β股結構域序列及連接該七個β股結構域序列之六個環 區域(AB環、BC環、CD環、DE環、EF環及FG環)。最接近N端及C端定位之β股可在溶液中採用β樣構形。在SEQ ID NO：4中，AB環對應於殘基15-16，BC環對應於殘基21-30，CD環對應於殘基39-45，DE環對應於殘基51-56，EF環對應於殘基60-66，且FG環對應於殘基76-87(Xu等人，Chemistry & Biology,9：933-942,2002)。
因此，在一些實施例中，抗肌肉生長抑制素黏附蛋白為10Fn3多肽，其與SEQ ID NO：4中所示之人類10Fn3結構域至少40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%一致。許多變異性通常將存在於一或多個環中。10Fn3多肽之β或β樣股中之各者可基本上由與SEQ ID NO：4之相應β或β樣股的序列至少80%、85%、90%、95%或100%一致的胺基酸序列組成，其限制條件為此類變化不破壞多肽在生理條件下之穩定性。
在一些實施例中，本發明提供一種抗肌肉生長抑制素黏附蛋白，其包含第十纖維結合蛋白III型(10Fn3)結構域，其中10Fn3結構域包含環AB；環BC；環CD；環DE；環EF及環FG；且具有至少一個選自以下之環：相對於人類10Fn3結構域之相應環之序列胺基酸序列改變之環BC、DE及FG。在一些實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白包含10Fn3結構域，該結構域包含與SEQ ID NO：4之非環區域至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列，其中選自BC、DE及FG之至少一個環改變。在一些實施例中，BC及FG環改變，且在一些實施例中，BC、DE及FG環改變，亦即10Fn3結構域包含非天然產生之環。在一些實施例中，AB、CD及/或EF環改變。「經改變」意謂相對於模板序列(相應人類纖維結合蛋白結構域)之一或多個胺基酸序列變化，且包括胺基酸添加、缺失、取代或其組合。改變胺基酸序列可經由通常核酸編碼序列之有意、盲目或自發性序列變化來實現，且可利用任何技術(例如PCR、易錯PCR或化 學DNA合成)進行。
在一些實施例中，選自BC、DE及FG之一或多個環之長度相對於相應人類纖維結合蛋白環可延長或縮短。在一些實施例中，環之長度可延長2-25個胺基酸。在一些實施例中，環之長度可減少1-11個胺基酸。因此，為了最佳化抗原結合，10Fn3之環之長度可在長度以及序列上進行改變以獲得在抗原結合方面之最大可能的可撓性及親和力。
在一些實施例中，多肽包含Fn3結構域，該結構域包含與SEQ ID NO：4之非環區域至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列，其中至少一個選自BC、DE及FG之環改變。在一些實施例中，改變之BC環具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸取代，至多1、2、3或4個胺基酸缺失，至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸插入或其組合。在一些實施例中，改變之DE環具有至多1、2、3、4、5或6個胺基酸取代，至多1、2、3或4個胺基酸缺失，至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13個胺基酸插入，或其組合。在一些實施例中，FG環具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個胺基酸取代，至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個胺基酸缺失，至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個胺基酸插入，或其組合。
本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白係以10Fn3支架為主且通常由以下序列定義：EVVAAT(Z)aSLLI(Z)xYYRITYGE(Z)bQEFTV(Z)yATI(Z)eDYTITVYAV(Z)zISINYRT(SEQ ID NO：5)，其中AB環由(Z)a表示，CD環由(Z)b表示，EF環由(Z)e表示，BC環由(Z)x表示，DE環由(Z)y表示，且FG環由(Z)z表示。Z表示任何胺基酸且Z之後的下標表示胺基酸數目之整數。詳言之，a可為1-15、2- 15、1-10、2-10、1-8、2-8、1-5、2-5、1-4、2-4、1-3、2-3或1-2個胺基酸中之任一者；且b、c、x、y及z可各自獨立地為2-20、2-15、2-10、2-8、5-20、5-15、5-10、5-8、6-20、6-15、6-10、6-8、2-7、5-7或6-7個胺基酸中之任一者。在較佳實施例中，a為2個胺基酸，b為7個胺基酸，c為7個胺基酸，x為11個胺基酸，y為6個胺基酸，且z為12個胺基酸。β股之序列相對於SEQ ID NO：4中所示之相應胺基酸在所有7個支架區域上可具有0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2或0至1個取代、缺失或添加中之任一者。在某些實施例中，β股之序列相對於SEQ ID NO：4中所示之相應胺基酸在所有7個支架區域上可具有0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2或0至1個保守取代中之任一者。在某些實施例中，核心胺基酸殘基為固定的，且任何取代、保守取代、缺失或添加出現在除核心胺基酸殘基以外之殘基處。
或者，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白係以10Fn3支架為主且通常由以下序列定義：EVVAATPTSLLI(Z)xYYRITYGETGGNSPVQEFTV(Z)yATISGLKPGVDYTITVYAV(Z)zISINYRT(SEQ ID NO：6)
其中BC環由(Z)x表示，DE環由(Z)y表示，且FG環由(Z)z表示。Z表示任何胺基酸且Z之後的下標表示胺基酸數目之整數。詳言之，x、y及z可各自獨立地為2-20、2-15、2-10、2-8、5-20、5-15、5-10、5-8、6-20、6-15、6-10、6-8、2-7、5-7或6-7個胺基酸中之任一者。在較佳實施例中，x為11個胺基酸，y為6個胺基酸，且z為12個胺基酸。β股之序列相對於SEQ ID NO：1中所示之相應胺基酸在所有7個支架區域上可具有0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2或0至1個取代、缺失或添加中之任一者。在某些實施例中，β股之序列相對於SEQ ID NO：4中所示之相應胺基酸在所有7個支架區域上可具有0至 10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2或0至1個保守取代中之任一者。在某些實施例中，核心胺基酸殘基為固定的，且取代、保守取代、缺失或添加出現在除核心胺基酸殘基以外之殘基處。
在某些實施例中，本文所述之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白可包含如SEQ ID NO：5或6中所述之序列，其中如分別由(Z)x、(Z)y及(Z)z表示之BC、DE及FG環中之至少一者改變。如上所述，對應於SEQ ID NO：4之殘基21-30、51-56及76-87之胺基酸殘基分別定義BC、DE及FG環。然而，應瞭解並非環區域內之每一殘基需要經修飾以便獲得對所需目標(例如肌肉生長抑制素)具有較強親和力之10Fn3黏合劑。
舉例而言，如SEQ ID NO：1中所示之BC環之殘基21(S)及22(W)不需要修飾用於結合肌肉生長抑制素。亦即，以較高親和力結合至肌肉生長抑制素之10Fn3結構域可藉由僅修飾如SEQ ID NO：4中所示之環BC之殘基23-30來獲得。此展示於表1中例示之BC環中，其指示僅加下劃線位置經修飾。
類似地，如SEQ ID NO：4中所示之環DE之位置51(P)及56(T)不需要修飾用於結合肌肉生長抑制素。亦即，以較高親和力結合至肌肉生長抑制素之10Fn3結構域可藉由僅修飾如SEQ ID NO：4中所示之環DE之殘基52-55來獲得。此展示於表1中例示之DE環中，其指示僅跨越加下劃線位置之殘基改變。
同樣地，如SEQ ID NO：1中所示之FG環之位置76(T)及87(P)不需要修飾用於結合肌肉生長抑制素。亦即，以較高親和力結合至肌肉生長抑制素之10Fn3結構域可藉由僅修飾如SEQ ID NO：4中所示之環FG之殘基77-86來獲得。此展示於表1中例示之FG環中，其指示僅跨越加下劃線位置之殘基改變。
因此，在一些實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白之BC、DE及FG環區可根據共同序列描述。此等共同序列由表1中所 示之BC、DE及FG環例示，且如由WebLogo分析所測定(圖2-7)(Crooks GE,Hon G,Chandonia JM,Brenner SE.WebLogo：A sequence logo generator.Genome Research 2004；14：1188-1190，其以全文引用的方式併入本文中)。WebLogo分析產生反映BC、DE或FG環之各改變位置中胺基酸之頻率的胺基酸特徵。
舉例而言，在一些實施例中，BC環(Z)x由共同序列X1-L-P-X2-X3-X4-X5-X6-X7定義，其中，X1為S、T或Y；X2為H、Y、N、R、F、G、S或T；X3為A、P、Q、S、F、H、N或R；X4為G或A；X5為H、L、R、V、N、D、F、I或K；X6為A、L、G、M、F、I或V；及X7為H或N。在某些較佳實施例中，BC環包含選自SEQ ID NO：7、11-21、23-31、34及36-38之胺基酸序列。在一個實施例中，BC環包含SEQ ID NO.34中所述之胺基酸。
在一些實施例中，DE環(Z)y由共同序列G-R-G-X8定義，其中X8為V或L。在某些較佳實施例中，DE環包含選自SEQ ID NO：39及42之胺基酸。在一個實施例中，DE環包含SEQ ID NO.39中所述之胺基酸。
在一些實施例中，FG環(Z)z由共同序列X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18定義，其中X9為L、V或I；X10為T或S；X11為K、R、A、G、S、D、H、N、T或P；X12為S、T、A、E、H、K或N；X13為K、G、Q、D、E、N、T或S；X14為V、I、F、L、M、P、T或Y；X15為I、L或Y；X16為H、I、V、K、L、R、F、G、S或T；X17為Y或H；及X18為K、M、L、R或V。在某些較佳實施例中，FG環包含選自SEQ ID NO：46、50-62、64-72、75-77及79之胺基酸序列。在一個實施例中，FG環包含SEQ ID NO.75中所述之胺基酸。
在其他實施例中，BC環(Z)x由共同序列X19-X20-P-X21-G-X22-A定義，其中X19為D、E、V或W；X20為A、S或V；X21為R、A、G、K或 L；且X22為L或R。在某些較佳實施例中，BC環包含選自SEQ ID NO：8-10、22、32、33及35之胺基酸序列。
在其他實施例中，DE環(Z)y由共同序列X23-G-R-G-X24定義，其中X23為V、P、F、I或L；且X24為S、N或T。在某些較佳實施例中，DE環包含選自SEQ ID NO：40、41及43-45之胺基酸序列。
在其他實施例中，FG環(Z)z由共同序列X25-X26-R-X27-G-X28-X29-X30-X31-X32定義，其中X25為I或V；X26為F、D或Y；X27為D或T；X28為P、M、V或T；X29為V、L、N、R或S；X30為H、T、L、N、Q或S；X31為F、W、Y、H或L；及X32為D、A或G。在某些較佳實施例中，FG環包含選自SEQ ID NO：47-49、63、73、74及78之胺基酸序列。
因此，在某些實施例中，本發明提供一種抗肌肉生長抑制素黏附蛋白，其包含BC環(Z)x，其具有序列X1-L-P-X2-X3-X4-X5-X6-X7；及DE環(Z)y，其具有序列G-R-G-X8，如以上所定義。在某些實施例中，BC環包含選自SEQ ID NO：7、11-21、23-31、34及36-38之胺基酸序列，且DE環包含選自SEQ ID NO：39及42之胺基酸序列。在一個實施例中，BC及DE環分別包含SEQ ID NO：34及39中所述之胺基酸序列。
在某些實施例中，抗肌肉生長抑制素黏附蛋白包含BC環(Z)x，其具有序列X1-L-P-X2-X3-X4-X5-X6-X7；及FG環(Z)z，其具有序列X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18，如以上所定義。在某些實施例中，BC環包含選自SEQ ID NO：7、11-21、23-31、34及36-38之胺基酸序列，且FG環包含選自SEQ ID NO：46、50-62、64-72、75-77及79之胺基酸序列。在一個實施例中，BC及FG環分別包含SEQ ID NO：34及75中所述之胺基酸序列。
在某些實施例中，抗肌肉生長抑制素黏附蛋白包含DE環(Z)y，其 具有序列G-R-G-X8；及FG環(Z)z，其具有序列X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18，如以上所定義。在某些實施例中，DE環包含選自SEQ ID NO：39及42之胺基酸序列，且FG環包含選自SEQ ID NO：46、50-62、64-72、75-77及79之胺基酸序列。在一個實施例中，DE及FG環分別包含SEQ ID NO：39及75中所述之胺基酸序列。
在某些實施例中，抗肌肉生長抑制素黏附蛋白包含BC環(Z)x，其具有序列X1-L-P-X2-X3-X4-X5-X6-X7；DE環(Z)y，其具有序列G-R-G-X8；及FG環(Z)z，其具有序列X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18，如以上所定義。在某些實施例中，BC環包含選自SEQ ID NO：7、11-21、23-31、34及36-38之胺基酸序列，DE環包含選自SEQ ID NO：39及42之胺基酸序列，且FG環包含選自SEQ ID NO：46、50-62、64-72、75-77及79之胺基酸序列。在一個實施例中，BC、DE及FG環分別包含SEQ ID NO：34、39及75中所述之胺基酸序列。
在其他實施例中，本發明提供一種抗肌肉生長抑制素黏附蛋白，其包含BC環(Z)x，其具有序列X19-X20-P-X21-G-X22-A；及DE環(Z)y，其具有序列X23-G-R-G-X24，如以上所定義。在某些實施例中，BC環包含選自SEQ ID NO：8-10、22、32、33及35之胺基酸序列，且DE環包含選自SEQ ID NO：40、41及43-45之胺基酸序列。
在其他實施例中，抗肌肉生長抑制素黏附蛋白包含BC環(Z)x，其具有序列X19-X20-P-X21-G-X22-A；及FG環(Z)z，其具有序列X25-X26-R-X27-G-X28-X29-X30-X30-X32，如以上所定義。在某些實施例中，BC環包含選自SEQ ID NO：8-10、22、32、33及35之胺基酸序列，且FG環包含選自SEQ ID NO：47-49、63、73、74及78之胺基酸序列。
在其他實施例中，抗肌肉生長抑制素黏附蛋白包含DE環(Z)y，其具有序列X23-G-R-G-X24；及FG環(Z)z，其具有序列X25-X26-R-X27-G-X28-X29-X30-X30-X32，如以上所定義。在某些實施例中，DE環包含選 自SEQ ID NO：40、41及43-45之胺基酸序列，且FG環包含選自SEQ ID NO：47-49、63、73、74及78之胺基酸序列。
在其他實施例中，抗肌肉生長抑制素黏附蛋白包含BC環(Z)x，其具有序列X19-X20-P-X21-G-X22-A；包含DE環(Z)y，其具有序列X23-G-R-G-X24；及FG環(Z)z，其具有序列X25-X26-R-X27-G-X28-X29-X30-X30-X32，如以上所定義。在某些實施例中，BC環包含選自SEQ ID NO：8-10、22、32、33及35之胺基酸序列，DE環包含選自SEQ ID NO：40、41及43-45之胺基酸序列，且FG環包含選自SEQ ID NO：47-49、63、73、74及78之胺基酸序列。
在某些較佳實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白包含SEQ ID NO：5或6中所述之序列，其中如分別由(Z)x、(Z)y及(Z)z表示之BC、DE及FG環分別經具有SEQ ID NO：7-38、39-45及46-79之共同序列的一組相應BC、DE及FG環置換。
在其他較佳實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白包含SEQ ID NO：5或6中所述之序列，其中如分別由(Z)x、(Z)y及(Z)z表示之BC、DE及FG環經具有與表1中所列純系之BC、DE或FG環序列至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之序列的一組相應BC、DE及FG環置換。
在例示性實施例中，如本文所述之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白由SEQ ID NO：5定義，且具有來自表1中所列之純系中之任一者的一組相應BC、DE及FG環序列。舉例而言，表1中之純系1979_B06包含分別如SEQ ID NO：7、39及46中所述之BC、DE及FG環。因此，基於此等環之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白可包含SEQ ID NO：5或6，其中(Z)x包含SEQ ID NO：7，(Z)y包含SEQ ID NO：39，且(Z)z包含SEQ ID NO：46。涵蓋分別使用來自表1中其他純系之BC、DE及FG環組或SEQ ID NO：7-38、39-45及46-79之共同序列的相似構築體。該等抗肌 肉生長抑制素黏附蛋白之支架區域可相對於SEQ ID NO：4之支架胺基酸殘基包含0至20、0至15、0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2或0至1個取代、保守取代、缺失或添加中之任一者。可進行該等支架修飾，只要抗肌肉生長抑制素黏附蛋白能夠以所需KD結合肌肉生長抑制素即可。
在較佳實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白之BC環包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SWSLPHAGHVN(SEQ ID NO：7)、SWVSPRGRAR(SEQ ID NO：8)、SWEVPRGLAR(SEQ ID NO：9)、SWWAPLGLAR(SEQ ID NO：10)、SWTLPHAGLAH(SEQ ID NO：11)、SWYLPYPAHMN(SEQ ID NO：12)、SWSLPFAGHLN(SEQ ID NO：13)、SWSLPYSGLAN(SEQ ID NO：14)、SWSLPHAGHAH(SEQ ID NO：15)、SWTLPNFGLIN(SEQ ID NO：16)、SWTLPHAGRAH(SEQ ID NO：17)、SWSLPYAGHLN(SEQ ID NO：18)、SWSLPYAAHMN(SEQ ID NO：19)、SWSLPYPGHLN(SEQ ID NO：20)、SWSLPYAGHAH(SEQ ID NO：21)、SWDAPGGLAR(SEQ ID NO：22)、SWSLPTPGLAH(SEQ ID NO：23)、SWSLPHRGVAN(SEQ ID NO：24)、SWSLPSSGVAH(SEQ ID NO：25)、SWSLPHHGFGH(SEQ ID NO：26)、SWSLPHAGDAH(SEQ ID NO：27)、SWSLPHNGVAH(SEQ ID NO：28)、SWSLPRQGLAN(SEQ ID NO：29)、SWSLPGPGHFH(SEQ ID NO：30)、SWSLPHPGLGH(SEQ ID NO：31)、SWDAPRGLAR(SEQ ID NO：32)、SWDAPAGLAR(SEQ ID NO：33)、SWSLPHQGKAN(SEQ ID NO：34)、SWDAPKGLAR(SEQ ID NO：35)、SWSLPNPGIAH(SEQ ID NO：36)、SWSLPRPGNAH(SEQ ID NO：37)及SWSLPNPGNAH(SEQ ID NO：38)。
在一些實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白之BC環 包含SEQ ID NO：7-38中之任一者之加下劃線部分，如表1中所示。在一個實施例中，BC環包含SEQ ID NO：34之加下劃線部分。
在一些實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白之DE環包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：PGRGVT(SEQ ID NO：39)、PGRGST(SEQ ID NO：40)、LGRGST(SEQ ID NO：41)、PGRGLT(SEQ ID NO：42)、IGRGST(SEQ ID NO：43)、FGRGTT(SEQ ID NO：44)及VGRGNT(SEQ ID NO：45)。在一些實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白之DE環包含SEQ ID NO：39-45中之任一者之加下劃線部分，如表1中所示。在一個實施例中，DE環包含SEQ ID NO：39之加下劃線部分。
在一些實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白之FG環包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：TLTKSQMIHYMP(SEQ ID NO：46)、TIYRDGMSHHDP(SEQ ID NO：47)、TVYRDGPLLLAP(SEQ ID NO：48)、TIFRTGMVQYDP(SEQ ID NO：49)、TLTNSEIILYKP(SEQ ID NO：50)、TLTKSQILHHRP(SEQ ID NO：51)、TLTRSKIIHYMP(SEQ ID NO：52)、TLTHSNIIRYVP(SEQ ID NO：53)、TVSSTKVIVYLP(SEQ ID NO：54)、TITKSTIIIYKP(SEQ ID NO：55)、TVTTTSVILYKP(SEQ ID NO：56)、TLTKSQLIHYMP(SEQ ID NO：57)、TLTRSQVIHYMP(SEQ ID NO：58)、TLTKSKIIHYMP(SEQ ID NO：59)、TVSSTKVIHYKP(SEQ ID NO：60)、TLTKSKVIHYMP(SEQ ID NO：61)、TVTTTKVIHYKP(SEQ ID NO：62)、TIDRDGVNHFAP(SEQ ID NO：63)、TVTHHGVIGYKP(SEQ ID NO：64)、TLTGANVIIYKP(SEQ ID NO：35)、TVTNTGVIIYKP(SEQ ID NO：66)、TVTATGIIIYKP(SEQ ID NO：67)、TVTRAGFYRYKP(SEQ ID NO：68)、TVTREEVISYKP(SEQ ID NO：69)、TVTAAGVIIYKP(SEQ ID NO：70)、TVTANQPIIYKP(SEQ ID NO：71)、TITPETIIVYKP(SEQ ID NO：72)、TIDRDGTRSFDP(SEQ ID NO：73)、TIFRDGPVTWDP(SEQ ID NO：74)、TVTDTGYLKYKP(SEQ ID NO：75)、TLTGSDTIFYKP(SEQ ID NO：76)、TVTGKDVIKYKP(SEQ ID NO：77)、TIFRDGVVNYGP(SEQ ID NO：78)及TVTDTGFITYKP(SEQ ID NO：79)。
在一些實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白之FG環包含SEQ ID NO：46-79中之任一者之加下劃線部分，如表1中所示。在一個實施例中，FG環包含SEQ ID NO：75之加下劃線部分。
在一些實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白包含一個BC環序列，其選自具有SEQ ID NO：7-38之BC環序列或SEQ ID NO：7-38中之任一者之加下劃線部分，如表1中所示；一個DE環序列，其選自具有SEQ ID NO：39-45之DE環序列或SEQ ID NO：39-45中之任一者之加下劃線部分，如表1中所示；及一個FG環序列，其選自具有SEQ ID NO：46-79之FG環序列或SEQ ID NO：46-79中之任一者之加下劃線部分，如表1中所示。在一些實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白包含分別與SEQ ID NO：7-38、39-45及46-79中之任一者至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的BC、DE及FG環胺基酸序列。在其他實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白包含分別與SEQ ID NO：7-38、39-45及46-79中之任一者之加下劃線部分至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的BC、DE及FG環胺基酸序列，如表1中所示。
在一些實施例中，抗肌肉生長抑制素黏附蛋白包含SEQ ID NO：80-123、228-239及252-273(來自表2、5及6之全長序列)中之任一者的胺基酸序列。在一個實施例中，抗肌肉生長抑制素黏附蛋白包含SEQ ID NO：273之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗肌肉生長抑制素黏附蛋白包含與SEQ ID NO：80-123、228-239及252-273中之任一者至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在其他實施例中，抗肌肉生長抑制素黏附蛋白包含與SEQ ID NO：80-123、228-239及252-273之非BC、DE及FG環區至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在一個實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白包含分別如SEQ ID NO：34、39及75中所述之BC、DE及FG環。在另一實施例中，抗肌肉生長抑制素黏附蛋白包含與以下中所述之胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO：273[PRD-1474]、SEQ ID NO：118[3116_A06]、SEQ ID NO：281[PRD-1474及3116_A06共有之核心黏附蛋白序列，前接N端延伸序列(GVSDVPRDL)且後接C端尾區(EI)]或SEQ ID NO：331[無N端前導序列或C端尾區之PRD-1474及3116_A06之核心黏附蛋白序列]。以下闡述PRD-1474及3116_A06之核心黏附蛋白序列：EVVAATPTSLLISWSLPHQGKANYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGRGVTATISGLKPGVDYTITVYAVTVTDTGYLKYKPISINYRT(SEQ ID NO：331)
在另一實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白包含與SEQ ID NO：118、273、281或331之非BC、DE及FG環區至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在一個實施例中，本發明及本文所揭示之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白可相對於如SEQ ID NO：34、39及75中所述之包含BC、DE及FG環之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白描述。
因此，在一些實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白包含分別如SEQ ID NO：34、39及75中所述之BC、DE及FG環，其中BC環包含1、2、3、4、5或6個胺基酸取代，諸如保守胺基酸取代。 因此，在一些實施例中，BC環由共同序列X33-L-P-X34-X35-X36-X37-X38-X39定義，其中X33為T或Y；X34為Y、N、R、F、G、S或T；X35為A、P、S、F、H、N或R；X36為A；X37為H、L、R、V、N、D、F或I；X38為L、G、M、F、I或V；及X39為H。
在一些實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白包含分別如SEQ ID NO：34、39及75中所述之BC、DE及FG環，其中DE環包含1個胺基酸取代，諸如保守胺基酸取代。因此，在一些實施例中，DE環由共同序列G-R-G-X40定義，其中X40為L。
在一些實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白包含分別如SEQ ID NO：34、39及75中所述之BC、DE及FG環，其中FG環包含1、2、3、4、5、6、7或8個胺基酸取代，諸如保守胺基酸取代。因此，在一些實施例中，FG環由共同序列X41-X42-X43-X44-X45-X46-X47-X48-X49-X50定義，其中X41為L或I；X42為S；X43為K、R、A、G、S、H、N、T或P；X44為S、A、E、H、K或N；X45為K、Q、D、E、N、T或S；X46為V、I、F、L、M、P或T；X47為I或Y；X48為H、I、V、L、R、F、G、S或T；X49為H；及X50為M、L、R或V。
在一些實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白包含分別如SEQ ID NO：34、39及75中所述之BC、DE及FG環，其中BC環具有1、2、3、4、5或6個胺基酸取代，諸如保守胺基酸取代，且DE環具有1個胺基酸取代，諸如保守胺基酸取代。在一些實施例中，BC環具有根據式X33-L-P-X34-X35-X36-X37-X38-X39之胺基酸序列，其中X33為T或Y；X34為Y、N、R、F、G、S或T；X35為A、P、S、F、H、N或R；X36為A；X37為H、L、R、V、N、D、F或I；X38為L、G、M、F、I或V；及X39為H，且DE環具有根據式G-R-G-X40之胺基酸序列，其中X40為L。
在一些實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白包含分 別如SEQ ID NO：34、39及75中所述之BC、DE及FG環，其中BC環具有1、2、3、4、5或6個胺基酸取代，諸如保守胺基酸取代，且FG環具有1、2、3、4、5、6、7或8個胺基酸取代，諸如保守胺基酸取代。在一些實施例中，BC環包含根據式X33-L-P-X34-X35-X36-X37-X38-X39之胺基酸序列，其中X33為T或Y；X34為Y、N、R、F、G、S或T；X35為A、P、S、F、H、N或R；X36為A；X37為H、L、R、V、N、D、F或I；X38為L、G、M、F、I或V；及X39為H、且FG環包含根據式X41-X42-X43-X44-X45-X46-X47-X48-X49-X50之胺基酸序列，其中X41為L或I；X42為S；X43為K、R、A、G、S、H、N、T或P；X44為S、A、E、H、K或N；X45為K、Q、D、E、N、T或S；X46為V、I、F、L、M、P或T；X47為I或Y；X48為H、I、V、L、R、F、G、S或T；X49為H；及X50為M、L、R或V。
在一些實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白包含分別如SEQ ID NO：34、39及75中所述之BC、DE及FG環，其中DE環具有1個胺基酸取代，諸如保守胺基酸取代，且FG環具有1、2、3、4、5、6、7或8個胺基酸取代，諸如保守胺基酸取代。在一些實施例中，DE環包含根據式G-R-G-X40之胺基酸序列，其中X40為L，且FG環具有根據式X41-X42-X43-X44-X45-X46-X47-X48-X49-X50之胺基酸序列，其中X41為L或I；X42為S；X43為K、R、A、G、S、H、N、T或P；X44為S、A、E、H、K或N；X45為K、Q、D、E、N、T或S；X46為V、I、F、L、M、P或T；X47為I或Y；X48為H、I、V、L、R、F、G、S或T；X49為H；及X50為M、L、R或V。
在一些實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白包含分別如SEQ ID NO：34、39及75中所述之BC、DE及FG環，其中BC環具有1、2、3、4、5或6個胺基酸取代，諸如保守胺基酸取代，且DE環具有1個胺基酸取代，諸如保守胺基酸取代，且FG環具有1、2、3、 4、5、6、7或8個胺基酸取代，諸如保守胺基酸取代。在一些實施例中，BC環包含根據式X33-L-P-X34-X35-X36-X37-X38-X39之胺基酸序列，其中X33為T或Y；X34為Y、N、R、F、G、S或T；X35為A、P、S、F、H、N或R；X36為A；X37為H、L、R、V、N、D、F或I；X38為L、G、M、F、I或V；及X39為H；DE環包含根據式G-R-G-X40之胺基酸序列，其中X40為L；且FG環具有根據式X41-X42-X43-X44-X45-X46-X47-X48-X49-X50之胺基酸序列，其中X41為L或I；X42為S；X43為K、R、A、G、S、H、N、T或P；X44為S、A、E、H、K或N；X45為K、Q、D、E、N、T或S；X46為V、I、F、L、M、P或T；X47為I或Y；X48為H、I、V、L、R、F、G、S或T；X49為H；及X50為M、L、R或V。
在一個實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白包含分別如SEQ ID NO：34、39及75中所述之BC、DE及FG環，且在BC、DE及FG環中具有允許抗肌肉生長抑制素黏附蛋白維持結合至肌肉生長抑制素之胺基酸取代。該等胺基酸取代可以藉由例如實例8中所描述之深度突變掃描來測定。
因此，在一些實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白包含BC環，該BC環包含根據式X51-X52-X53-X54-X55-X56-X57-X58-X59之胺基酸序列，其中：X51係選自由以下組成之群：A、C、D、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W及Y；X52係選自由以下組成之群：L、M及V；X53係選自由以下組成之群：A、C、D、E、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V及Y；X54係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；X55係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；X56係選自由以下組成之群：G及S；X57係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；X58係選自由以下組成 之群：A、C、G、L、M、S及T；及X59係選自由以下組成之群：A、C、F、H、N、P、Q、R、S及Y。在一較佳實施例中，X51係選自由以下組成之群：C、F、I、S、V、W及Y；X52係選自由以下組成之群：L；X53係選自由以下組成之群：P；X54係選自由以下組成之群：C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；X55係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；X56係選自由以下組成之群：G；X57係選自由以下組成之群：A、C、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、V、W及Y；X58係選自由以下組成之群：A、G、L、M及S；及X59係選自由以下組成之群：C、H、N、Q、S及Y。在一更佳實施例中，X51係選自由以下組成之群：F、S及W；X52係選自由以下組成之群：L；X53係選自由以下組成之群：P；X54係選自由以下組成之群：C、F、G、I、K、L、M、N、R、S、T、V、W及Y；X55係選自由以下組成之群：A、C、E、F、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V及Y；X56係選自由以下組成之群：G；X57係選自由以下組成之群：A、C、H、K、L、M、N、R、V、W及Y；X58係選自由以下組成之群：A、G及L；及X59係選自由以下組成之群：H、N及Q。
在一些實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白包含DE環，該DE環包含根據式G-R-G-X60之胺基酸序列，其中X60為A、C、D、E、F、I、K、L、M、N、Q、S、T及V。在一較佳實施例中，X60為C、E、I、L、M、Q、T及V。在一更佳實施例中，X60為C、E、I、L、M及V。
在一些實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白包含FG環，該FG環包含根據式X61-X62-X63-X64-X65-X66-X67-X68-X69-X70之胺基酸序列，其中X61係選自由以下組成之群：A、C、F、I、L、M、Q、T、V、W及Y；X62係選自由以下組成之群：A、C、F、G、H、 I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；X63係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；X64係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；X65係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；X66係選自由以下組成之群：A、C、F、H、I、L、M、N、P、S、T、V、W及Y；X67係選自由以下組成之群：A、C、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；X68係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；X69係選自由以下組成之群：F、W及Y；及X70係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y。在一較佳實施例中，X61係選自由以下組成之群：A、C、I、L、M及V；X62係選自由以下組成之群：C、F、H、I、L、M、Q、R、S、T、V、W及Y；X63係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、W及Y；X64係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；X65係選自由以下組成之群：A、D、E、F、G、H、I、L、M、N、Q、S、T、V、W及Y；X66係選自由以下組成之群：C、F、I、L、M、P、T、V、W及Y；X67係選自由以下組成之群：C、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W及Y；X68係選自由以下組成之群：A、C、E、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；X69係選自由以下組成之群：W及Y；及X70係選自由以下組成之群：A、C、D、E、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T及V。在一更佳實施例中，X61係選自由以下組成之群：I及V；X62係選自由以下組成之群：C、F、I、L、M、T、V、W及Y；X63係選自由以下組成之群：A、C、D、E、 F、G、H、I、L、M、N、Q、S、T及V；X64係選自由以下組成之群：A、C、D、F、G、I、L、M、N、Q、S、T、V、W及Y；X65係選自由以下組成之群：A、G、S、T及W；X66係選自由以下組成之群：F、I、V、W及Y；X67係選自由以下組成之群：F、H、I、L、M、V、W及Y；X68係選自由以下組成之群：A、C、F、G、I、K、L、M、T、V及W；X69係選自由以下組成之群：W及Y；及X70係選自由以下組成之群：A、G、K、L、M、P、Q及R。
在一些實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白包含BC、DE及FG環，其中BC環包含根據式X51-X52-X53-X54-X55-X56-X57-X58-X59之胺基酸序列，其中，X51係選自由以下組成之群：A、C、D、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W及Y；X52係選自由以下組成之群：L、M及V；X53係選自由以下組成之群：A、C、D、E、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V及Y；X54為A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；X55係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；X56係選自由以下組成之群：G及S；X57為A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；X58為A、C、G、L、M、S及T；及X59為A、C、F、H、N、P、Q、R、S及Y；DE環包含根據式G-R-G-X60之胺基酸序列，其中X60係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、I、K、L、M、N、Q、S、T及V；且FG環包含根據式X61-X62-X63-X64-X65-X66-X67-X68-X69-X70之胺基酸序列，其中X61係選自由以下組成之群：A、C、F、I、L、M、Q、T、V、W及Y；X62為A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；X63係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；X64係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、 L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；X65係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；X66係選自由以下組成之群：A、C、F、H、I、L、M、N、P、S、T、V、W及Y；X67係選自由以下組成之群：A、C、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；X68係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；X69係選自由以下組成之群：F、W及Y；及X70係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y。
在一較佳實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白包含BC、DE及FG環，其中BC環包含根據式X51-X52-X53-X54-X55-X56-X57-X58-X59之胺基酸序列，其中，X51係選自由以下組成之群：C、F、I、S、V、W及Y；X52為L；X53為P；X54係選自由以下組成之群：C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；X55係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；X56為G；X57係選自由以下組成之群：A、C、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、V、W及Y；X58係選自由以下組成之群：A、G、L、M及S；及X59係選自由以下組成之群：C、H、N、Q、S及Y；DE環包含根據式G-R-G-X60之胺基酸序列，其中X60係選自由以下組成之群：C、E、I、L、M、Q、T及V；且FG環包含根據式X61-X62-X63-X64-X65-X66-X67-X68-X69-X70之胺基酸序列，其中X61係選自由以下組成之群：A、C、I、L、M及V；X62為C、F、H、I、L、M、Q、R、S、T、V、W及Y；X63係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、W及Y；X64係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；X65係選自由以下組成 之群：A、D、E、F、G、H、I、L、M、N、Q、S、T、V、W及Y；X66係選自由以下組成之群：C、F、I、L、M、P、T、V、W及Y；X67係選自由以下組成之群：C、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W及Y；X68係選自由以下組成之群：A、C、E、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；X69係選自由以下組成之群：W及Y；及X70係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y。
在一更佳實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白包含BC、DE及FG環，其中BC環包含根據式X51-X52-X53-X54-X55-X56-X57-X58-X59之胺基酸序列，其中，X51係選自由以下組成之群：F、S及W；X52為L；X53為P；X54係選自由以下組成之群：C、F、G、I、K、L、M、N、R、S、T、V、W及Y；X55係選自由以下組成之群：A、C、E、F、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V及Y；X56為G；X57係選自由以下組成之群：A、C、H、K、L、M、N、R、V、W及Y；X58係選自由以下組成之群：A、G及L；及X59係選自由以下組成之群：H、N及Q；DE環包含根據式G-R-G-X60之胺基酸序列，其中X60係選自由以下組成之群：C、E、I、L、M及V；且FG環包含根據式X61-X62-X63-X64-X65-X66-X67-X68-X69-X70之胺基酸序列，其中X61係選自由以下組成之群：I及V；X62為C、F、I、L、M、T、V、W及Y；X63係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、Q、S、T及V；X64係選自由以下組成之群：A、C、D、F、G、I、L、M、N、Q、S、T、V、W及Y；X65係選自由以下組成之群：A、G、S、T及W；X66係選自由以下組成之群：F、I、V、W及Y；X67係選自由以下組成之群：F、H、I、L、M、V、W及Y；X68係選自由以下組成之群：A、C、F、G、I、K、L、M、T、V及W；X69係選自由以下組成之群：W及Y；及X70係選自由以下組成之群：A、G、 K、L、M、P、Q及R。
在一些實施例中，抗肌肉生長抑制素黏附蛋白由如SEQ ID NO：124-167、240-251及284-305(來自表2、5及6之全長序列)中之任一者中所述之核酸序列編碼。在一些實施例中，抗肌肉生長抑制素黏附蛋白由與SEQ ID NO：124-167、240-251及284-305中之任一者至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致之核酸序列編碼。
纖維結合蛋白經由其整合素結合基元「精胺酸-甘胺酸-天冬胺酸」(RGD)天然結合某些類型之整合素。在一些實施例中，多肽包含缺乏(RGD)整合素結合基元之10Fn3結構域。整合素結合結構域可藉由利用胺基酸取代、缺失或插入改變RGD序列來移除。
在一些實施例中，如表1中所示，分別與SEQ ID NO：7-38、39-45及46-79中之任一者之加下劃線部分一致的BC、DE及/或FG環胺基酸序列接枝至非10Fn3結構域蛋白質支架中。舉例而言，一或多個環胺基酸序列交換或插入抗體重鏈或輕鏈或其片段之一或多個CDR環。在其他實施例中，交換或插入一或多個胺基酸環序列之蛋白結構域包括(但不限於)共同Fn3結構域(Centocor,US)、錨蛋白重複序列蛋白(Molecular Partners AG,Zurich Switzerland)、結構域抗體(Domantis,Ltd,Cambridge,MA)、單結構域駱駝奈米抗體(Ablynx,Belgium)、脂質運載蛋白(例如抗運載蛋白；Pieris Proteolab AG,Freising,Germany)、高親和性多聚體(Amgen,CA)、親和體(Affibody AG,Sweden)、泛素(例如阿夫林(affilin)；Scil Proteins GmbH,Halle,Germany)、蛋白質抗原決定基模擬物(Polyphor Ltd,Allschwil,Switzerland)、螺旋束支架(例如α體，Complix,Belgium)、Fyn SH3結構域(Covagen AG,Switzerland)或阿去末(atrimer；Anaphor,Inc.,CA)。
本發明之例示性抗肌肉生長抑制素黏附蛋白之BC、DE及FG環之 SEQ ID NO呈現於表1中。
本發明之例示性抗肌肉生長抑制素單黏附蛋白之SEQ ID NO呈現於表2中。
交叉競爭性黏附蛋白及/或結合至相同黏附蛋白結合位點之黏附蛋白
在一個實施例中，本發明之黏附蛋白與本文所述之特定抗肌肉生長抑制素黏附蛋白競爭(例如交叉競爭)結合至肌肉生長抑制素。該等競爭性黏附蛋白可基於其在標準肌肉生長抑制素結合分析中競爭抑制本文所述之黏附蛋白結合至肌肉生長抑制素之能力來鑑別。舉例而言，可使用標準ELISA分析，其中將重組肌肉生長抑制素蛋白質固定在盤上，將黏附蛋白中之一者螢光標記，且評估未標記之黏附蛋白競爭終止標記之黏附蛋白之結合的能力。
在一個實施例中，可進行競爭性ELISA形式以測定兩個抗肌肉生長抑制素黏附蛋白是否結合肌肉生長抑制素上之重疊黏附蛋白結合位點。在一個形式中，將黏附蛋白#1塗佈在盤上，接著將其封閉且洗滌。向此盤中添加單獨肌肉生長抑制素、或與飽和濃度之黏附蛋白#2預培育之肌肉生長抑制素。在適合之培育期之後，洗滌盤，且用多株抗肌肉生長抑制素抗體(諸如生物素標記之山羊抗肌肉生長抑制素多 株抗體(R&D Systems))探查，隨後用抗生蛋白鏈菌素-HRP結合物及標準四甲基聯苯胺顯影程序偵測。若在存在或不存在與黏附蛋白#2預培育之情況下OD信號相同，則兩個黏附蛋白彼此獨立地結合，且其黏附蛋白結合位點不重疊。然而，若接受肌肉生長抑制素/黏附蛋白#2混合物之孔之OD信號低於接受單獨肌肉生長抑制素之孔的OD信號，則黏附蛋白#2之結合證實阻斷黏附蛋白#1結合至肌肉生長抑制素。
或者，利用表面電漿子共振(SPR，例如BIAcore)進行類似實驗。將黏附蛋白#1固定在SPR晶片表面上，隨後注射單獨肌肉生長抑制素或與飽和濃度之黏附蛋白#2預培育之肌肉生長抑制素。若肌肉生長抑制素/黏附蛋白#2混合物之結合信號與單獨肌肉生長抑制素之結合信號相比相同或較高，則兩個黏附蛋白彼此獨立地結合，且其黏附蛋白結合位點不重疊。然而，若肌肉生長抑制素/黏附蛋白#2混合物之結合信號低於單獨肌肉生長抑制素之結合信號，則黏附蛋白#2之結合證實阻斷黏附蛋白#1結合至肌肉生長抑制素。此等實驗之特徵為使用飽和濃度之黏附蛋白#2。若肌肉生長抑制素不經黏附蛋白#2飽和，則以上結論不成立。類似實驗可用於測定是否任何兩個肌肉生長抑制素結合蛋白結合至重疊黏附蛋白結合位點。
亦可以倒序進行以上例示之兩個分析，其中將黏附蛋白#2固定，且將肌肉生長抑制素-黏附蛋白#1添加至盤中。或者，黏附蛋白#1及/或#2可經單株抗體及/或可溶性受體-Fc融合蛋白質置換。
在另一實施例中，競爭可使用HTRF夾心分析測定，如實例4中所描述。
在其他實施例中，競爭性黏附蛋白為結合至與本文所述之特定抗肌肉生長抑制素黏附蛋白相同之肌肉生長抑制素上之黏附蛋白結合位點的黏附蛋白。標準定位技術，諸如蛋白酶定位、突變分析、x射線結晶學及2維核磁共振可用於測定黏附蛋白是否結合至與參考黏附 蛋白相同的黏附蛋白結合位點(參見例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris編(1996))。
候選競爭性抗肌肉生長抑制素黏附蛋白可至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%抑制本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白結合至肌肉生長抑制素。競爭%可使用上述方法測定。
在一些實施例中，與本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白競爭之分子不必為黏附蛋白，但可為結合至肌肉生長抑制素之任何類型分子，諸如(但不限於)抗體、小分子、肽及其類似物。
在一些實施例中，本發明之黏附蛋白結合至肌肉生長抑制素上之不連續黏附蛋白結合位點。在一些實施例中，多肽結合在肌肉生長抑制素(SEQ ID NO：3)之胺基酸55-66內之區域。在一些實施例中，多肽結合在肌肉生長抑制素(SEQ ID NO：3)之胺基酸85-101內之區域。在其他實施例中，多肽結合在肌肉生長抑制素(SEQ ID NO：3)之胺基酸85-101及55-66兩個區域內。
在一些實施例中，本發明之多肽不與ActRIIB競爭結合至肌肉生長抑制素。在一些實施例中，本發明之多肽與ALK4及/或ALK5競爭結合至肌肉生長抑制素。
II. 延伸序列
在某些實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白分子可經修飾以包含N端延伸序列及/或C端延伸。舉例而言，MG序列可位於由SEQ ID NO：4定義之10Fn3之N端。M通常將裂解掉，在N端留下G。或者，表2中展示之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白之前10個胺基酸經替代性N端序列(在本文中稱為N端延伸)置換，如表7中所示。另外，M、G或MG亦可置放在表7中所示之N端延伸中之任一者的N端。 本文所述之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白亦可包含替代性C端尾區序列，在本文中稱為C端延伸序列。舉例而言，表2中所示之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白序列可在對應於SEQ ID NO：4之T94之蘇胺酸處截斷(亦即，在序列之INYRT(SEQ ID NO：168)部分之後截斷)。該等截斷之型式可以截斷形式用作治療性分子，或可在蘇胺酸殘基之後添加替代性C端延伸。例示性C端延伸序列展示於表7中。包含C端延伸序列之例示性抗肌肉生長抑制素黏附蛋白在表2中展示為SEQ ID NO：80-123。舉例而言，SEQ ID NO：80(純系1979_B06)包含天然產生之C端延伸EIDKPSQ(SEQ ID NO：211)，其後接His6標籤(SEQ ID NO：328)。然而，應瞭解His6標籤完全視情況選用。
在某些實施例中，C端延伸序列(亦稱為「尾區」)包含E及D殘基，且長度可為8至50、10至30、10至20、5至10及2至4個胺基酸。在一些實施例中，尾區序列包括基於ED之連接子，其中序列包含ED之串聯重複序列。在例示性實施例中，尾區序列包含2-10、2-7、2-5、3-10、3-7、3-5、3、4或5個ED重複序列。在某些實施例中，基於ED之尾區序列亦可包括其他胺基酸殘基，例如：EI、EID、ES、EC、EGS及EGC。該等序列部分基於已知黏附蛋白尾區序列，諸如EIDKPSQ(SEQ ID NO：211)，其中殘基D及K已經移除。在例示性實施例中，基於ED之尾區在ED重複序列之前包含E、I或EI殘基。
在其他實施例中，N端或C端序列在設計抗肌肉生長抑制素黏附蛋白融合分子時必要時可與已知連接子序列(例如表4中之SEQ ID NO：181-227)組合。在一些實施例中，序列可位於10Fn3結構域之C端以促進藥物動力學部分之連接。舉例而言，含有半胱胺酸之連接子(諸如GSGC(SEQ ID NO：189))可添加至C端以促進半胱胺酸殘基上之定點聚乙二醇化。包含含有半胱胺酸之連接子之例示性抗肌肉生長抑制素黏附蛋白在表5中展示為SEQ ID NO：228-239。
III.藥物動力學部分
在一個態樣中，本申請案提供抗肌肉生長抑制素黏附蛋白，其進一步包含藥物動力學(PK)部分。改良之藥物動力學可根據感知之治療學需求評估。通常需要提高生物利用度及/或增加劑量之間的時間，可能藉由增加給藥後蛋白質在血清中保持可利用之時間來進行。在一些情況下，需要改良蛋白質隨時間之血清濃度之連續性(例如減小在給藥之後不久及在即將進行下一次給藥之前蛋白質之血清濃度的差異)。抗肌肉生長抑制素黏附蛋白可連接至使多肽在哺乳動物(例如小鼠、大鼠或人類)中之清除率相對於未經修飾之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白降低大於兩倍、大於三倍、大於四倍或大於五倍的部分。改良之藥物動力學之其他量度可包括血清半衰期，其通常分成α相及β相。任一或兩個階段可藉由添加適當部分而顯著改良。舉例而言，PK部分可使多肽之血清半衰期相對於單獨Fn3結構域增加超過5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、120%、150%、200%、400%、600%、800%、1000%或1000%以上。
減緩蛋白質自血液清除之部分(在本文中稱為「PK部分」)包括聚氧伸烷基部分(例如聚乙二醇)、糖(例如唾液酸)及充分耐受之蛋白質部分(例如Fc及其片段及變異體、運鐵蛋白或血清白蛋白)。抗肌肉生長抑制素黏附蛋白亦可融合至白蛋白或白蛋白之片段(部分)或變異體，如美國公開案第2007/0048282號中所描述，或可融合至一或多個血清白蛋白結合黏附蛋白，如本文所述。
可用於本發明之其他PK部分包括以引用的方式併入本文中之Kontermann等人，(Current Opinion in Biotechnology 2011；22：868-76)中所述之PK部分。該等PK部分包括(但不限於)人血清白蛋白融合體、人血清白蛋白結合物、人血清白蛋白黏合劑(例如黏附蛋白PKE、AlbudAb、ABD)、XTEN融合體、PAS融合體(亦即基於三種胺基酸脯 胺酸、丙胺酸及絲胺酸之重組PEG模擬物)、碳水化合物結合物(例如羥乙基澱粉(HES))、糖基化、聚唾液酸結合物及脂肪酸結合物。
因此，在一些實施例中，本發明提供融合至作為聚合糖之PK部分之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白。在一些實施例中，PK部分為聚乙二醇部分或Fc區。在一些實施例中，PK部分為血清白蛋白結合蛋白，諸如美國公開案第2007/0178082號及第2007/0269422號中所述者。在一些實施例中，PK部分為人血清白蛋白。在一些實施例中，PK部分為運鐵蛋白。
聚乙二醇
在一些實施例中，抗肌肉生長抑制素黏附蛋白包含聚乙二醇(PEG)。PEG為熟知水溶性聚合物，其可購得或可根據此項技術中熟知之方法藉由乙二醇開環聚合而製備(Sandler及Karo,Polymer Synthesis,Academic Press,New York，第3卷，第138-161頁)。術語「PEG」廣泛用於涵蓋任何聚乙二醇分子，不計及大小或PEG末端之修飾，且可由式X-O(CH2CH2O)n-1CH2CH2OH表示，其中n為20至2300，且X為H或末端修飾，例如C1-4烷基。PEG可含有其他化學基團，其為結合反應所需，其由分子之化學合成產生；或其充當分子之部分之最佳距離的間隔基。另外，該PEG可由連接在一起之一或多個PEG側鏈組成。具有一個以上PEG鏈之PEG稱作多臂或分支PEG。分支PEG描述於例如歐洲公開申請案第473084A號及美國專利第5,932,462號中。
一或多個PEG分子可連接在蛋白質上之不同位置處，且該連接可藉由與胺、硫醇或其他適合之反應性基團反應而達成。胺部分可例如為見於多肽之N端處之一級胺或胺基酸(諸如離胺酸或精胺酸)中存在之胺基。在一些實施例中，PEG部分連接在多肽上選自由以下組成之群的位置處：a)N端；b)N端與最N端β股或β樣股之間；c)置於相對於 目標結合位點之多肽之面的環；d)C端與最C端β股或β樣股之間；及e)在C端處。
聚乙二醇化可藉由定點聚乙二醇化達成，其中將適合之反應性基團引入蛋白質中以建立聚乙二醇化優先發生之位點。在一些實施例中，蛋白質經修飾以在所需位置處引入半胱胺酸殘基，允許半胱胺酸上之定點聚乙二醇化。突變可引入蛋白質編碼序列中以產生半胱胺酸殘基。此舉可例如藉由使一或多個胺基酸殘基突變成半胱胺酸來達成。突變成半胱胺酸殘基之較佳胺基酸包括絲胺酸、蘇胺酸、丙胺酸及其他親水性殘基。待突變成半胱胺酸之殘基較佳為表面暴露的殘基。用於基於一級序列或蛋白質預測殘基之表面可接近性之演算法為此項技術中熟知。或者，表面殘基可藉由比較結合多肽之胺基酸序列來預測，鑒於構架之晶體結構(基於該晶體結構設計且逐步形成結合多肽)已解決(參見Himanen等人，Nature 2001；414：933-8)且由此表面暴露的殘基經鑑別。半胱胺酸殘基之聚乙二醇化可使用例如PEG-順丁烯二醯亞胺、PEG-乙烯基碸、PEG-碘乙醯胺或PEG-鄰吡啶基二硫化物進行。
PEG通常用適於偶合至多肽上之所需位點之適合之活化基團活化。聚乙二醇化方法為此項技術中熟知且進一步描述於Zalipsky,S.等人，「Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycols)for Modification of Polypeptides」Polyethylene Glycol Chemistry：Biotechnical and Biomedical Applications,J.M.Harris,Plenus Press,New York(1992)及Zalipsky(1995)Advanced Drug Reviews 16：157-182中。
PEG之分子量可廣泛變化且可為分支或線性的。PEG之重量平均分子量通常為約100道爾頓(Dalton)至約150,000道爾頓。PEG之例示性重量平均分子量包括約20,000道爾頓、約40,000道爾頓、約60,000道爾頓及約80,000道爾頓。在某些實施例中，PEG之分子量為40,000道 爾頓。亦可使用具有前述中之任一者之總分子量之PEG之分支型式。在一些實施例中，PEG具有兩個分支。在其他實施例中，PEG具有四個分支。在另一實施例中，PEG為雙PEG(NOF Corporation，DE-200MA)，其中結合兩個黏附蛋白(參見例如實例1及表5之ATI-1341)。
此項技術中已知之習知分離及純化技術可用於純化聚乙二醇化抗肌肉生長抑制素黏附蛋白，諸如尺寸排阻(例如凝膠過濾)及離子交換層析法。產物亦可使用SDS-PAGE分離。可分離之產物包括單聚乙二醇化、二聚乙二醇化、三聚乙二醇化、多聚乙二醇化及未聚乙二醇化之黏附蛋白以及游離PEG。單PEG結合物之百分比可藉由將溶離峰周圍之較廣溶離份集中以增加組合物中單PEG之百分比來控制。約90%單PEG結合物表示產率及活性之良好平衡。
在一些實施例中，聚乙二醇化抗肌肉生長抑制素黏附蛋白將較佳保留至少約25%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%與未經修飾之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白相關之生物活性。在一些實施例中，生物活性係指其結合至肌肉生長抑制素之能力，如由KD、kon或koff評估。在一些實施例中，聚乙二醇化之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白展示相對於未聚乙二醇化之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白對肌肉生長抑制素的結合增加。
例示性PEG修飾之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白展示於表5中。
免疫球蛋白Fc結構域(及片段)
在一些實施例中，抗肌肉生長抑制素黏附蛋白融合至免疫球蛋白Fc結構域或其片段或變異體。如本文所用，「功能性Fc區」為保留結合FcRn之能力之Fc結構域或其片段。在一些實施例中，功能性Fc區結合至FcRn，但不具有效應功能。Fc區或其片段結合至FcRn之能力可利用此項技術中已知之標準結合分析來測定。在其他實施例中，Fc區或其片段結合至FcRn且具有天然Fc區之至少一種「效應功能」。 例示性「效應功能」包括C1q結合；補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)之下調等。該等效應功能通常需要Fc區與結合結構域(例如抗肌肉生長抑制素黏附蛋白)結合，且可使用此項技術中已知用於評估該等抗體效應功能之多種分析來評估。
「天然序列Fc區」包含與天然發現之Fc區之胺基酸序列相同的胺基酸序列。「變異Fc區」包含藉助於至少一種胺基酸修飾而與天然序列Fc區之序列不同的胺基酸序列。較佳地，變異Fc區與天然序列Fc區或親本多肽之Fc區相比，具有至少一個胺基酸取代，例如天然序列Fc區或親本多肽之Fc區中約一個至約十個胺基酸取代且較佳約一個至約五個胺基酸取代。本文中變異Fc區較佳將與天然序列Fc區及/或親本多肽之Fc區具有至少約80%序列一致性，且最佳與其具有至少約90%序列一致性，更佳與其具有至少約95%序列一致性。
在一例示性實施例中，Fc結構域來源於IgG1子類，然而，亦可使用其他子類(例如IgG2、IgG3及IgG4)。以下展示人類IgG1免疫球蛋白Fc結構域之序列： (SEQ ID NO：169)
核心鉸鏈序列經加下劃線，且CH2及CH3區呈常規本文形式。應理解C端離胺酸為視情況選用的。
融合體可藉由將抗肌肉生長抑制素黏附蛋白連接至Fc分子之任一末端(亦即Fc-抗肌肉生長抑制素黏附蛋白或抗肌肉生長抑制素黏附蛋白-Fc配置)而形成。在某些實施例中，Fc及抗肌肉生長抑制素黏附蛋白經由連接子融合。例示性連接子序列包括GAGGGGSG(SEQ ID NO：181)、EPKSSD(SEQ ID NO：182)、D、ESPKAQASSVPTAQPQAEGLA(SEQ ID NO：183)、ELQLEESAAEAQDGELD(SEQ ID NO：184)、GQPDEPGGS(SEQ ID NO：185)、GGSGSGSGSGSGS(SEQ ID NO：186)、ELQLEESAAEAQEGELE(SEQ ID NO：187)、GSGSG(SEQ ID NO：188)、GSGC(SEQ ID NO：189)、AGGGGSG(SEQ ID NO：190)、GSGS(SEQ ID NO：191)、QPDEPGGS(SEQ ID NO：192)、GSGSGS(SEQ ID NO：193)、TVAAPS(SEQ ID NO：194)、KAGGGGSG(SEQ ID NO：195)、KGSGSGSGSGSGS(SEQ ID NO：196)、KQPDEPGGS(SEQ ID NO：197)、KELQLEESAAEAQDGELD(SEQ ID NO：198)、KTVAAPS(SEQ ID NO：199)、KAGGGGSGG(SEQ ID NO：200)、KGSGSGSGSGSGSG(SEQ ID NO：201)、KQPDEPGGSG(SEQ ID NO：202)、KELQLEESAAEAQDGELDG(SEQ ID NO：203)、KTVAAPSG(SEQ ID NO：204)AGGGGSGG(SEQ ID NO：205)、AGGGGSG(SEQ ID NO：206)、GSGSGSGSGSGSG(SEQ ID NO：207)、QPDEPGGSG(SEQ ID NO：208)及TVAAPSG(SEQ ID NO：209)。
在一些實施例中，抗肌肉生長抑制素黏附蛋白融合體中所用Fc區包含Fc分子之鉸鏈區。如本文所用，「鉸鏈」區包含跨越IgG1 Fc區之SEQ ID NO：169之位置1-16(DKTHTCPPCPAPELLG；SEQ ID NO：170)的核心鉸鏈殘基。在某些實施例中，抗肌肉生長抑制素黏附蛋白-Fc融合體採用多聚結構(例如二聚體)，其部分歸因於鉸鏈區內SEQ ID NO：169之位置6及9處的半胱胺酸殘基。在其他實施例中，如本文所用之鉸鏈區可進一步包括自側接核心鉸鏈序列之CH1及CH2區獲得之殘基，如SEQ ID NO：169中所示。在其他實施例中，鉸鏈序列為GSTHTCPPCPAPELLG(亦即PRD-932之鉸鏈序列；SEQ ID NO：180)。
在一些實施例中，鉸鏈序列可包括賦予所需藥物動力學、生物 物理學及/或生物學性質之取代。一些例示性鉸鏈序列包括EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS(SEQ ID NO：171；核心鉸鏈區加下劃線)、EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS(SEQ ID NO 172；核心鉸鏈區加下劃線)、EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS(SEQ ID NO：173；核心鉸鏈區加下劃線)、DKTHTCPPCPAPELLGGPS(SEQ ID NO：174；核心鉸鏈區加下劃線)及DKTHTCPPCPAPELLGGSS(SEQ ID NO：175；核心鉸鏈區加下劃線)。在一個實施例中，SEQ ID NO：169之位置18處之殘基P已經S置換以除去Fc效應功能；此置換例示於具有SEQ ID NO：172、173及175中之任一者的鉸鏈中。在另一實施例中，SEQ ID NO：169之位置1-2處之殘基DK已經GS置換以移除潛在剪切位點；此置換例示於SEQ ID NO：173中。在另一實施例中，對應於人類IgG1之重鏈恆定區(亦即結構域CH1-CH3)之SEQ ID NO：176之位置103處的C已經S置換以防止在輕鏈不存在下不當半胱胺酸鍵形成；此置換例示於SEQ ID NO：171-173中。
(SEQ ID NO：176)
在某些實施例中，抗肌肉生長抑制素黏附蛋白-Fc融合體可具有以下組態：1)抗肌肉生長抑制素黏附蛋白-鉸鏈-Fc或2)鉸鏈-Fc-抗肌肉生長抑制素黏附蛋白。因此，本發明之任何抗肌肉生長抑制素黏附蛋白均可融合至包含根據此等組態之鉸鏈序列之Fc區。在一些實施例中，連接子可用於將抗肌肉生長抑制素黏附蛋白連接至鉸鏈-Fc部分上，舉例而言，例示性融合蛋白質可具有組態抗肌肉生長抑制素黏附蛋白-連接子-鉸鏈-Fc或鉸鏈-Fc-連接子-抗肌肉生長抑制素黏附蛋 白。另外，視製造融合多肽之系統而定，前導序列可位於融合多肽之N端。舉例而言，若融合體製造於哺乳動物系統中，則諸如METDTLLLWVLLLWVPGSTG(SEQ ID NO：177)之前導序列可添加至融合分子之N端。若融合體製造於大腸桿菌(E.coli)中，則融合體序列將前接甲硫胺酸。
以下序列例示抗肌肉生長抑制素黏附蛋白-鉸鏈-Fc構築體：GVSDVPRDL EVVAATPTSLLISWTLPHAGRAHYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGRGVTATISGLKPGVDYTITVYAVTVTTTKVIHYKPISINYRTEIEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(PRD-1171；SEQ ID NO：253)。前導序列呈粗體形式，抗肌肉生長抑制素黏附蛋白序列呈斜體形式，且鉸鏈區加下劃線。應理解C端離胺酸為視情況選用的。
此處，Fc結構域包含如下人類IgG1 CH2及CH3區：VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：178)及鉸鏈序列DKTHTCPPCPAPELLG(SEQ ID NO：170)。
以下序列例示Fc-抗肌肉生長抑制素黏附蛋白構築體：DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPELQLEESAAEAQEGELEGVSDVPRDL EVVAATPTSLLISWSLPHQGKANYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGRGVTATISGLKPGVDYTITVYAVTVTDTGYLKYKPISINYRTEI(PRD-1474；SEQ ID NO：273)。鉸鏈區加下劃線，前導序列呈粗體形式，且抗肌肉生長抑制素黏附蛋白序列呈斜體形式。
此處，Fc結構域包含如下人類IgG1 CH2及CH3區：VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP(SEQ ID NO：179)及鉸鏈序列DKTHTCPPCPAPELLG(SEQ ID NO：170)。
例示性抗肌肉生長抑制素黏附蛋白-Fc融合體及Fc-抗肌肉生長抑制素黏附蛋白融合體展示於表6中(SEQ ID NO：252-273)。所有序列均可始於甲硫胺酸或哺乳動物前導序列(例如SEQ ID NO：177)。
黏附蛋白
在一些實施例中，PK部分為例如對血清蛋白(例如人血清白蛋白)具有特異性之另一黏附蛋白，如US 2012/0094909中所描述，其以全文引用的方式併入本文中。可與本發明之黏附蛋白一起使用之其他PK部分揭示於Kontermann等人(Current Opinion in Biotechnology 2011；22：868-76)中，如上文所述。舉例而言，此類基於黏附蛋白之PK部分可經由多肽連接子直接或間接連接至抗肌肉生長抑制素黏附蛋白。用於連接Fn3結構域之適合之連接子為允許各別結構域彼此獨立摺疊且形成允許較高親和力結合至目標分子之三維結構的連接子。例 示性多肽連接子包括PSTSTST(SEQ ID NO：210)、EIDKPSQ(SEQ ID NO：211)及GS連接子，諸如GSGSGSGSGS(SEQ ID NO：213)及其多聚體。在一些實施例中，連接子為基於甘胺酸-絲胺酸之連接子。此等連接子包含甘胺酸及絲胺酸殘基且長度可為8至50、10至30及10至20個胺基酸。實例包括具有胺基酸序列(GS)7(SEQ ID NO：215)、G(GS)6(SEQ ID NO：216)及G(GS)7G(SEQ ID NO：217)之連接子。其他連接子含有麩胺酸，且包括例如(GSE)5(SEQ ID NO：218)及GGSEGGSE(SEQ ID NO：219)。其他例示性甘胺酸-絲胺酸連接子包括(GS)4(SEQ ID NO：212)、(GGGGS)7(SEQ ID NO：220)、(GGGGS)5(SEQ ID NO：221)及(GGGGS)3G(SEQ ID NO：222)。在一些實施例中，連接子為基於甘胺酸-脯胺酸之連接子。此等連接子包含甘胺酸及脯胺酸殘基且長度可為3至30、10至30及3至20個胺基酸。實例包括具有胺基酸序列(GP)3G(SEQ ID NO：223)、(GP)5G(SEQ ID NO：224)及GPG之連接子。在其他實施例中，連接子可為長度為3至30、10至30及3至20個胺基酸之基於脯胺酸-丙胺酸之連接子。基於脯胺酸丙胺酸之連接子之實例包括例如(PA)3(SEQ ID NO：225)、(PA)6(SEQ ID NO：226)及(PA)9(SEQ ID NO：227)。最佳連接子長度及胺基酸組成可鑒於本文提供之教示利用常規實驗測定。在一些實施例中，抗肌肉生長抑制素黏附蛋白經由多肽連接子連接至例如抗HSA黏附蛋白，該多肽連接子具有可由血液或目標組織中之蛋白酶裂解之蛋白酶位點。該等實施例可用於釋放抗肌肉生長抑制素黏附蛋白以用於較好傳遞或治療性質或較有效製造。
其他連接子或間隔子可引入Fn3結構域與多肽連接子之間的Fn3結構域之N端或C端。
在一些實施例中，抗肌肉生長抑制素黏附蛋白可經由聚合連接子直接或間接連接至例如抗HSA黏附蛋白。聚合連接子可用於最佳改 變融合體各組分之間的距離以形成具有一或多種以下特徵之蛋白質融合體：1)當結合於相關蛋白質時，結合一或多個蛋白結構域之位阻減小或增大；2)蛋白質穩定性或溶解度增加；3)蛋白質聚集減少；及4)蛋白質之總親合力或親和力增加。
在一些實施例中，抗肌肉生長抑制素黏附蛋白經由生物相容性聚合物(諸如聚合糖)連接至例如抗HSA黏附蛋白。該聚合糖可包括可由血液或目標組織中之酶裂解之酶促裂解位點。該等實施例可用於釋放抗肌肉生長抑制素黏附蛋白以用於較好傳遞或治療性質或較有效製造。
單黏附蛋白及其相應PK部分修飾形式(例如聚乙二醇化及Fc融合體)之概述呈現於表3中。
a 未經修飾之單黏附蛋白具有核心黏附蛋白序列，其前接N端延伸序列(MGVSDVPRDL；SEQ ID NO：306)且後接C端尾區 (EIDKPSQHHHHHH；SEQ ID NO：325)，如表2中所示。核心黏附蛋白序列對應於缺乏N端延伸及C端尾區序列之單黏附蛋白序列。
b 具有半胱胺酸突變之黏附蛋白具有第一欄中單黏附蛋白之核心黏附蛋白序列，且前接N端延伸序列(MGVSDVPRDL；SEQ ID NO：306)且後接C端尾區(GSGC[修飾]HHHHHH；SEQ ID NO：326或EGSGC[修飾]HHHHHH；SEQ ID NO：327)，如表5中所示。
c C端上具有Fc部分之黏附蛋白具有第一欄中單黏附蛋白之核心黏附蛋白序列，其前接N端延伸序列(GVSDVPRDL；SEQ ID NO：307)且後接C端尾區(EI)，該C端尾區後接連接子序列(表4)及Fc區序列，如表6中所描述。
d N端上具有Ec部分之黏附蛋白具有Fc區序列，其前接N端鉸鏈序列且後接連接子(表4)及第一欄中單黏附蛋白之核心黏附蛋白序列，該核心黏附蛋白序列自身前接N端延伸序列(GVSDVPRDL；SEQ ID NO：307)且後接C端尾區(EI)，如表6中所示。
本發明之例示性連接子之SEQ ID NO呈現於表4中。
本發明之例示性聚乙二醇化抗肌肉生長抑制素黏附蛋白之SEQ ID NO呈現於表5中。
本發明之例示性Fc融合之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白之SEQ ID NO呈現於表6中。
本發明之例示性前導區(N端延伸)及C端尾區序列之SEQ ID NO呈現於表7中。
IV. 核酸-蛋白質融合技術
在一個態樣中，本發明提供一種黏附蛋白，其包含結合肌肉生長抑制素之纖維結合蛋白III型結構域。迅速製造及測試具有特異性結合性質之Fn3結構域之一種方法為Adnexus,a Bristol-Myers Squibb R&D Company之核酸-蛋白質融合技術。本發明利用稱為『PROfusion』之活體外表現及標記技術，其利用核酸-蛋白質融合體(RNA-蛋白質及DNA-蛋白質融合體)來鑑別對於結合至蛋白質而言重要的新穎多肽及胺基酸基元。核酸-蛋白質融合技術為以共價方式將蛋白質偶合至其編碼遺傳信息之技術。關於RNA-蛋白質融合技術及以纖維連接蛋白為主之支架蛋白質文庫篩選法之詳細說明參見 Szostak等人，美國專利第6,258,558號、第6,261,804號、第6,214,553號、第6,281,344號、第6,207,446號、第6,518,018號及第6,818,418號；Roberts等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,1997；94：12297-12302；及Kurz等人，Molecules,2000；5：1259-64，所有該等文獻均以引用的方式併入本文中。
V. 載體及聚核苷酸
編碼本文所揭示之各種蛋白質或多肽中之任一者的核酸可以化學方式合成。可選擇密碼子用法以改良在細胞中之表現。該密碼子用法將視所選細胞類型而定。已開發用於大腸桿菌及其他細菌以及哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞及昆蟲細胞之特殊化密碼子用法模式。參見例如：Mayfield等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100(2)：438-442(2003年1月23日)；Sinclair等人，Protein Expr.Purif.,26(I)：96-105(2002年10月)；Connell,N.D.,Curr.Opin.Biotechnol.,12(5)：446-449(2001年10月)；Makrides等人，Microbiol.Rev.,60(3)：512-538(1996年9月)；及Sharp等人，Yeast,7(7)：657-678(1991年10月)。
核酸操作之通用技術描述於例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)或Ausubel,F.等人，Current Protocols in Molecular Biology,Green Publishing and Wiley-Interscience,New York(1987)及定期更新中，該等文獻以引用的方式併入本文中。編碼該多肽之DNA通常可操作地連接於自哺乳動物、病毒或昆蟲基因獲得之適合之轉錄或轉譯調節性元件。該等調節性元件包括轉錄啟動子、視情況存在之控制轉錄的操縱序列、編碼適合之mRNA核糖體結合位點的序列及控制轉錄及轉譯終止之序列。在宿主中複製之能力通常由複製起點賦予，且另外併有促進識別轉型體之選擇基因。
本文所述之蛋白質可不僅可直接而且可作為具有異源多肽之融 合多肽以重組方式製造，該異源多肽較佳為信號序列或在成熟蛋白質或多肽之N端處具有特異性裂解位點之其他多肽。所選擇之異源信號序列較佳為可由宿主細胞識別並處理(亦即由信號肽酶裂解)之信號序列。用於在哺乳動物系統中製造多肽之例示性N端前導序列為METDTLLLWVLLLWVPGSTG(SEQ ID NO：177)，其在表現之後由宿主細胞移除。
針對不識別及處理天然信號序列之原核宿主細胞，信號序列經例如選自由以下之群的原核信號序列取代：鹼性磷酸酶、青黴素酶、1 pp或熱穩定腸毒素II前導區。
針對酵母分泌，天然信號序列可經例如以下取代：酵母轉化酶前導區、因子前導區(包括酵母菌(Saccharomyce)及刻魯維拉菌(Kluyveromyce)α-因子前導區)、或酸性磷酸酯酶前導區、白色念珠菌(C.albicans)葡糖澱粉酶前導區或美國專利第5,631,144號中所述之信號序列。在哺乳動物細胞表現中，哺乳動物信號序列以及病毒分泌性前導區(例如單純疱疹gD信號)為可獲得的。該等前驅體區域之DNA可在閱讀框架中接合於編碼蛋白質之DNA。
表現及選殖載體均含有使載體能夠在一或多種所選宿主細胞中複製的核酸序列。一般而言，在選殖載體中，此序列為使載體能夠獨立於宿主染色體DNA複製之序列，且包括複製起點或自主複製序列。熟知用於多種細菌、酵母及病毒之該等序列。來自質體pBR322之複製起點適於大部分革蘭氏陰性細菌(Gram-negative bacteria)，2微米質體起點適於酵母，且各種病毒起點(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)適用於在哺乳動物細胞中選殖載體。一般而言，哺乳動物表現載體並不需要複製起點組分(通常可僅使用SV40起點，因為其含有早期啟動子)。
表現及選殖載體可含有選擇基因，亦稱為可選標記物。典型選 擇基因編碼以下蛋白質：(a)賦予耐抗生素或其他毒素(例如胺苄青黴素(ampicillin)、新黴素(neomycin)、甲胺喋呤(methotrexate)或四環素(tracycline))性，(b)補充營養缺陷缺乏，或(c)供應不可自複雜培養基中得到之關鍵營養，例如供給桿菌編碼D-丙胺酸消旋酶之基因。
表現及選殖載體通常含有啟動子，該啟動子由宿主生物體識別且可操作地連接於編碼本發明蛋白質(例如以纖維連接蛋白為主之支架蛋白質)之核酸。適於與原核宿主一起使用之啟動子包括phoA啟動子、β-內醯胺酶及乳糖啟動子系統、鹼性磷酸酶、色胺酸(trp)啟動子系統及雜交啟動子(諸如tan啟動子)。然而，其他已知之細菌啟動子亦適用。適用於細菌系統之啟動子亦將含有可操作地連接於編碼本發明蛋白質之DNA的夏因-達爾加諾(Shine-Dalgarno；S.D)序列。已知用於真核生物之啟動子序列。實際上所有真核基因均具有位於轉錄起始位點上游約25至30個鹼基處之富AT區。發現於多種基因之轉錄起始處上游70至80個鹼基處之另一序列為CNCAAT區，其中N可為任何核苷酸。大部分真核基因之3'端處為AATAAA序列，該序列可為編碼序列之3'端添加poly A尾之信號。所有此等序列均適於插入至真核表現載體中。
適於與酵母宿主一起使用之啟動序列之實例包括3-磷酸甘油酸激酶或其他醣解酶，諸如烯醇酶(enolase)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構酶、磷酸葡萄糖異構酶及葡萄糖激酶之啟動子。
在哺乳動物宿主細胞中自載體轉錄可例如藉由以下控制：獲自病毒(諸如多形瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、鳥肉瘤病毒、細胞巨大病毒、反轉錄病毒、肝炎-B病毒及最佳猿猴病毒40(SV40))之基因組的啟動子、異源哺乳動物啟動子(例 如，肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子)、熱休克啟動子，條件為該等啟動子與宿主細胞系統相容。
編碼本發明蛋白質之DNA經較高等真核生物之轉錄通常藉由將強化子序列插入載體而增加。現已知多種來自哺乳動物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白及胰島素)之強化子序列。然而，吾人通常將使用來自真核細胞病毒之強化子。實例包括複製起點後側之SV40強化子(bp 100-270)、細胞巨大病毒早期啟動子強化子、複製起點後側之多瘤病毒強化子及腺病毒強化子。關於用於活化真核啟動子之強化元件，亦參見Yaniv,Nature 297：17-18(1982)。強化子可剪接至載體中肽-編碼序列之5'或3'位置處，但較佳位於啟動子之5'位點。
用於真核宿主細胞(例如酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人類或來自其他多細胞生物體之有核細胞)之表現載體亦將含有終止轉錄及穩定mRNA所必需之序列。該等序列通常可自真核或病毒DNA或cDNA之5'且有時3'非轉譯區獲得。此等區域含有在編碼本發明蛋白質之mRNA之未轉譯部分中作為多聚腺嘌呤化片段轉錄之核苷酸區段。一種適用之轉錄終止組分為牛生長激素多聚腺嘌呤化區。參見WO 94/11026及其中所揭示之表現載體。
重組DNA亦可包括任何類型之蛋白質標籤序列，其可適用於純化蛋白質。蛋白質標籤之實例包括(但不限於)組胺酸標籤、FLAG標籤、myc標籤、HA標籤或GST標籤。與細菌、真菌、酵母及哺乳動物細胞宿主一起使用之適當選殖及表現載體可見於Cloning Vectors：A Laboratory Manual,(Elsevier,New York(1985))，其相關揭示內容以引用的方式併入本文中。
如熟習此項技術者將顯而易知，使用適合於宿主細胞之方法將表現構築體引入宿主細胞中。將核酸引入宿主細胞中之各種方法為此 項技術所已知，包括(但不限於)電穿孔；使用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其他物質轉染；微粒轟擊；脂質轉染；及感染(其中載體為感染劑)。
適合之宿主細胞包括原核生物、酵母、哺乳動物細胞或細菌細胞。適合之細菌包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性(gram positive)生物體，例如大腸桿菌或芽胞桿菌屬(Bacillus spp)。酵母(較佳來自酵母種(Saccharomyces species)，諸如釀酒酵母(S.cerevisiae))亦可用於製造多肽。亦可使用各種哺乳動物或昆蟲細胞培養系統來表現重組蛋白質。在昆蟲細胞中製造異源蛋白質之桿狀病毒系統由Luckow等人(Bio/Technology,6：47(1988))綜述。適合之哺乳動物宿主細胞株之實例包括內皮細胞、COS-7猴腎臟細胞、CV-1、L細胞、C127、3T3、中國倉鼠卵巢(CHO)、人類胚腎細胞、HeLa、293、293T及BHK細胞株。純化之多肽藉由培養適合之宿主/載體系統以表現重組蛋白質來製備。針對許多應用，本文所揭示之許多多肽之較小大小將使得在大腸桿菌中表現成為用於表現之較佳方法。蛋白質接著自培養基或細胞提取物純化。
VI. 蛋白質製造
本發明亦有關表現抗肌肉生長抑制素黏附蛋白或其融合多肽之細胞株。製造抗肌肉生長抑制素黏附蛋白之細胞株之形成及分離可使用此項技術中已知之標準技術(諸如本文所述之標準技術)實現。
用本文所述用於蛋白質製造之表現或選殖載體使宿主細胞轉型，且將宿主細胞培養於視情況經改良以用於誘導啟動子、選擇轉型體或擴增編碼所需序列之基因的習知營養培養基中。在此處所示實例中，用於高通量蛋白質製造(HTPP)及中等規模製造之宿主細胞為來自HMS174-細菌菌株之宿主細胞。
本發明之黏附蛋白亦可藉由在例如原核細胞(例如大腸桿菌)中製 造黏附蛋白而以非糖基化形式獲得。值得注意的是，本發明之黏附蛋白之無醣化形式展現與在活體外測試時糖基化黏附蛋白相同的親和力、效力及作用機制。
可將用於製造本發明之蛋白質的宿主細胞培養於各種培養基中。市售培養基，諸如漢氏F10(Ham's F10；Sigma)、最低必需培養基(MEM；Sigma)、RPMI-1640(Sigma)及杜貝可氏改良型伊格爾氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM；Sigma)適用於培養宿主細胞。另外，Ham等人，Meth.Enzymol.,58：44(1979)、Barites等人，Anal.Biochem.,102：255(1980)、美國專利第4,767,704號、第4,657,866號、第4,927,762號、第4,560,655號、第5,122,469號、第6,048,728號、第5,672,502號或美國專利第RE 30,985號中所述之許多培養基可用作宿主細胞之培養基。此等培養基中之任一者可視需要補充有激素及/或其他生長因子(諸如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂及磷酸鹽)、緩衝劑(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷及胸苷)、抗生素(諸如慶大黴素(Gentamycin)藥物)、痕量元素(定義為一般以微莫耳範圍內之最終濃度存在的無機化合物)及葡萄糖或等效能源。亦可包括熟習此項技術者已知之適當濃度的任何其他必需補充劑。培養條件(諸如溫度、pH值及其類似條件)為先前選擇進行表現之宿主細胞所用的條件，且一般熟習此項技術者將顯而易知。
本文所揭示之蛋白質亦可使用細胞轉譯系統製造。出於該等目的，編碼多肽之核酸必須經修飾以允許活體外轉錄以製造mRNA且允許使用特定無細胞系統(真核生物，諸如無哺乳動物或酵母細胞轉譯系統；或原核生物，諸如無細菌細胞轉譯系統)中mRNA之無細胞轉譯。
本發明之蛋白質亦可藉由化學合成(例如藉由Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，The Pierce Chemical Co.,Rockford,Ill.(1984)中所述之方法)製造。蛋白質之修飾亦可藉由化學合成產生。
本發明之蛋白質可藉由蛋白質化學領域中一般已知之蛋白質之分離/純化方法純化。非限制性實例包括萃取、再結晶、鹽析(例如使用硫酸銨或硫酸鈉)、離心、透析、超濾、吸附層析、離子交換層析、疏水性層析、正相層析、反相層析、凝膠過濾、凝膠滲透層析、親和層析、電泳、逆流分佈或此等方法之任何組合。純化後，可藉由此項技術已知之各種方法中之任一者(包括(但不限於)過濾及透析)將多肽交換至不同緩衝液中及/或濃縮。
純化之多肽較佳為至少85%純、或較佳至少95%純且最佳至少98%純。不考慮純度之精確數值，多肽純到足以用作醫藥產品。
VII. 生物物理學及生物化學表徵
本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白結合至目標分子(例如肌肉生長抑制素)可在平衡常數(例如解離，KD)方面及在動力學常數(例如結合速率常數kon及解離速率常數，koff)方面評估。黏附蛋白將通常以小於500nM、100nM、10nM、1nM、500pM、200pM或100pM結合至目標分子，不過在koff足夠低或kon足夠高時，可容許較高KD值。
結合親和力之活體外分析
結合及拮抗肌肉生長抑制素之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白可使用多種活體外分析鑑別。該等分析較佳為允許同時篩選多個候選黏附蛋白之高通量分析。在一些實施例中，與肌肉生長抑制素具有90%胺基酸一致性之BMP-11可在活體外分析中在飽和條件下進行該分析時用作肌肉生長抑制素之替代品。值得注意的是，融合至Fc結構域之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白可結合肌肉生長抑制素及BMP-11兩者上，而單黏附蛋白優先結合至肌肉生長抑制素上。在不受理論束縛之情況下，此現象可反映與單價黏附蛋白相比二價Fc融合之黏附蛋白之親合 力增強。在二價聚乙二醇化黏附蛋白(諸如ATI-1341，其包含融合至20 kDa PEG部分之兩個末端的黏附蛋白)情況下，觀察到對BMP11之相似增強的結合。
用於測定抗肌肉生長抑制素黏附蛋白之結合親和力之例示性分析描述於下文實例中，且包括(但不限於)溶液相方法，諸如動力學排除分析(KinExA)(Blake等人，JBC 1996；271：27677-85；Drake等人，Anal Biochem 2004；328：35-43)、使用Biacore系統(Uppsala,Sweden)之表面電漿子共振(SPR)(Welford等人，Opt.Quant.Elect 1991；23：1；Morton及Myszka,Methods in Enzymology 1998；295：268)及均質時差式螢光(HTRF)分析(Newton等人，J Biomol Screen 2008；13：674-82；Patel等人，Assay Drug Dev Technol 2008；6：55-68)。
在一些實施例中，生物分子相互作用可用Biacore系統實時監測，該系統使用SPR偵測因表面折射率變化高達300nm遠所致之玻璃支撐物上較薄金膜之表面處之光的共振角變化。Biacore分析產生結合速率常數、解離速率常數、平衡解離常數及親和力常數。結合親和力藉由使用Biacore表面電漿子共振系統(Biacore,Inc.)評估結合及解離速率常數來獲得。活化生物感測器晶片以用於目標之共價偶合。接著將目標稀釋且注射在晶片上以在固定材料之應答單元中獲得信號。由於共振單元(RU)中之信號與固定材料之質量成正比，故此表示基質上固定目標密度之範圍。將結合及解離資料同時擬合於整體分析中以求解1：1雙分子相互作用之淨速率式，得到kon、koff及Rmax(飽和時之最大應答)之最佳擬合值。用於結合之平衡解離常數KD由SPR量測值以koff/kon形式計算。
在一些實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白在實例6中所述之SPR親和力分析中展現以下KD：500nM或500nM以下、400nM或400nM以下、300nM或300nM以下、200nM或200nM以下、 150nM或150nM以下、100nM或100nM以下、90nM或90nM以下、80nM或80nM以下、70nM或70nM以下、60nM或60nM以下、50nM或50nM以下、40nM或40nM以下、30nM或30nM以下、20nM或20nM以下、15nM或15nM以下、10nM或10nM以下、5nM或5nM以下或1nM或1nM以下。KD較佳為15nM或15nM以下。KD更佳為2.0nM或2.0nM以下。
在一些實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白在實例4中所述之HTRF分析中展現以下IC50：5nM或5nM以下、4nM或4nM以下、3nM或3nM以下、2.5nM或2.5nM以下、2nM或2nM以下、1.5nM或1.5nM以下、1nM或1nM以下、0.5nM或0.5nM以下、0.2nM或0.2nM以下或0.1nM或0.1nM以下。IC50較佳為1.5nM或1.5nM以下。IC50更佳為0.5nM或0.5nM以下。
在一些實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白在實例7中所述之動力學排除分析中展現以下KD：2nM或2nM以下、1.5nM或1.5nM以下、1nM或1nM以下、900pM或900pM以下、850pM或850pM以下、800pM或800pM以下、750pM或750pM以下、700pM或700pM以下、650pM或650pM以下、600pM或600pM以下、550pM或550pM以下、500pM或500pM以下、450pM或450pM以下、400pM或400pM以下、350pM或350pM以下、340pM或340pM以下、330pM或330pM以下、300pM或300pM以下、250pM或250pM以下、200pM或200pM以下、150pM或150pM以下、或100pM或100pM以下。KD較佳為850pM或850pM以下。
應理解本文以上所述之分析為例示性的，且此項技術中已知用於測定蛋白質之間的結合親和力之任何方法(例如基於螢光之轉移(FRET)、酶聯免疫吸附分析法及競爭性結合分析法(例如放射免疫分析法))均可用於評估本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白之結合親和 力。
拮抗劑活性之活體外分析
抗肌肉生長抑制素黏附蛋白拮抗肌肉生長抑制素活性之能力可易於使用多種活體外分析測定。該等分析較佳為允許同時篩選多個候選黏附蛋白之高通量分析。在一些實施例中，抗肌肉生長抑制素黏附蛋白對肌肉生長抑制素活性之拮抗劑作用可在基於細胞之活化素響應元件(ARE)-螢光素酶報導體分析中測定，如實例3中所描述。在某些實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白在用混合物刺激細胞之前在肌肉生長抑制素與抗肌肉生長抑制素黏附蛋白共培育時相對於對照使肌肉生長抑制素誘導之ARE-螢光素酶活性減小至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或90%以上。例示性對照反應涉及用單獨肌肉生長抑制素或與過量基準肌肉生長抑制素抑制劑(諸如人類活化素RIIB Fc嵌合體(R&D Systems)或ActRIIB-Fc)預培育之肌肉生長抑制素處理細胞，如Morrison等人(Experimental Neurology 2009；217：258-68)中所描述。在其他實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白以下列IC50抑制ARE-螢光素酶報導體活性：500nM或500nM以下、400nM或400nM以下、300nM或300nM以下、200nM或200nM以下、100nM或100nM以下、50nM或50nM以下、10nM或10nM以下、5nM或5nM以下、1nM、0.5nM或0.5nM以下、0.4nM或0.4nM以下、0.3nM或0.3nM以下、0.2nM或0.2nM以下、或0.10nM或0.10nM以下，如實例3中所描述。
在其他實施例中，抗肌肉生長抑制素黏附蛋白對肌肉生長抑制素活性之拮抗效應可藉由量測肌肉生長抑制素處理之細胞中SMAD磷酸化之程度來測定，如實例5中所描述。在某些實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白在用混合物刺激細胞之前在肌肉生長抑制 素與抗肌肉生長抑制素黏附蛋白共培育時相對於對照使肌肉生長抑制素誘導之SMAD磷酸化減小至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少97%或97%以上。例示性對照反應涉及用單獨肌肉生長抑制素或與過量基準肌肉生長抑制素抑制劑(諸如人類活化素RIIB Fc嵌合體(R&D Systems)或ActRIIB-Fc)預培育之肌肉生長抑制素處理細胞，如Morrison等人(Experimental Neurology 2009；217：258-68)中所描述。在一些實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白在12點或4點抑制反應中以下列IC50抑制SMAD磷酸化：1nM或1nM以下、0.8nM或0.8nM以下、0.6nM或0.6nM以下、0.4nM或0.4nM以下、0.3nM或0.3nM以下、0.2nM或0.2nM以下、或0.1nM或0.1nM以下，如實例5中所描述。在其他實施例中，10nM之本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白抑制利用肌肉生長抑制素之SMAD磷酸化至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%或至少98%或98%以上，如實例5中所描述。
另外，已知用於研究運動神經元病之使用細胞、組織培養及組織學方法之數種活體外模型系統。舉例而言，經受麩胺酸鹽興奮性毒性之大鼠脊髓器官型切片適用作模型系統以測試抗肌肉生長抑制素黏附蛋白在防止運動神經元退化方面之有效性。Corse等人，Neurobiol.Dis.(1999)6：335 346。關於用於研究ALS之活體外系統之論述，參見例如Bar,P.R.,Eur.J.Pharmacol.(2000)405：285 295；Silani等人，J.Neurol.(2000)247增刊1：128 36；Martin等人，Int.J.Mol.Med.(2000)5：3 13。
應理解本文所述之分析為例示性的，且此項技術中已知之任何方法均可充當適用於測試本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白之肌肉 生長抑制素拮抗作用之肌肉生長抑制素活性的讀出(例如SMAD目標基因(例如Smad 7；Ciarmela等人，Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 2011；96；755-65)之mRNA或含ARE之基因之mRNA之實時RT-PCR)。
活體內模型
存在扼要重述與例如與肌肉、神經肌肉、神經及代謝病症相關之肌肉耗損相關之疾病、病症及病況之症狀的多種技術公認的動物模型。此等模型可用於測試本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白之功效。
舉例而言，該等動物模型之非限制性實例包括：例如X-性聯肌肉萎縮症小鼠(mdx)模型(US2011/0008375、Gehrig等人，Nature 2012；484：394-8)，包括mdx小鼠之4種其他品系-mdx2cv、mdx3cv、mdx4cv或mdx5cv小鼠(Phelps等人，Human Molecular Genetics.1996；5(8)：1149-1153)、另外除去肌縮蛋白同源物抗肌萎縮蛋白相關蛋白(utrophin)之mdx小鼠(mdx/utr - / - )(Deconinck等人，Cell.1997；90(4)：717-727)；α-SG-無效C57BL/6小鼠(Duclos等人(1998)J.Cell Biol.142,1461-1471)；及Nakamura等人，(J Biomed Biotechnol.2011；文章編號第184393號)中最近綜述之模型，例如mdx52小鼠，其中鼠類DMD基因之外顯子52缺失；金毛尋回犬肌肉萎縮症(GRMD)模型；犬X-性聯肌肉萎縮症(CXMDJ)模型；及肥大貓肌肉萎縮症(HFMD)模型(例如Shelton等人，Neuromuscular Disorders.2005；15(2)：127-138)。
用於研究運動神經元病症(諸如ALS)之動物模型為具有ALS-連鎖突變Cu/Zn超氧化歧化酶(SOD1)基因(mSOD1G93A及/或mSOD1G37R)之轉殖基因小鼠。此等小鼠發生具有家族性ALS之許多臨床及病理性特徵之顯性遺傳之成人發作型麻痹病症。(例如Gurney等人，Science (1994)264：1772 1775；Nagano等人，Life Sci(2002)72：541 548)。其他動物模型包括用於進行性運動神經元病變(pmn)及搖擺病(wobbler)之兩種天然產生之鼠類模型(Haegggeli及Kato,Neurosci.Lett.(2002)335：39 43)。關於用於研究運動神經元疾病(諸如ALS)之多種動物模型之綜述，參見例如Jankowsky等人，Curr Neurol Neurosci.Rep.(2002)2：457 464；Elliott,J.L.,Neurobiol.Dis.(1999)6：310 20；及Borchelt等人，Brain Pathol.(1998)8：735 757。
除ALS以外之其他神經退化性或神經病理性疾病之動物模型包括用於評估脊髓延髓性肌肉萎縮症(SBMA)之轉殖基因小鼠模型(Katsuno等人，Neuron(2002)35：843 854)、用於人類麻痹骨髓灰白質炎之動物模型(Ford等人，Microb.Pathog.(2002)33：97 107)、脊髓性肌萎縮之動物模型(Schmid等人，J.Child Neurol.22,1004-1012,2007)、遠端肌病及遺傳性包涵體肌病之動物模型(Malicdan等人，Acta Myol.2007年12月；26(3)：171-175)、遺傳髓鞘脫失病之鼠類模型(Suzuki等人，Microsc.Res.Tech.1995；32：204-214)及由Meyer ZuHörste等人.(Curr.Opin.Neurol.2006；19：464-473)描述之動物模型。
用於測試本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白對抗因萎縮及/或不活動所致之肌肉體積損失之功效的動物模型包括(但不限於)：單側固定化之小鼠模型(Madaro等人，Basic Applied Myology 2008；18：149-153)、跟腱撕裂(腱切斷術)(Bialek等人，Physiol Genomics 2011；43：1075-86)及Powers et al.(Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2005；288：R337-44)中揭示之動物模型，諸如動物之後肢懸吊、肢體制動及控制之機械通氣。
用於測試本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白在治療代謝障礙方面之功效之相關動物模型包括(但不限於)：Ramaro等人(Indian J Med Res 2007；125：451-472)及Kennedy等人(Disease Models & Mechanisms 2010；3：156-166)中揭示之動物模型，該等文獻均以其全文引用的方式併入本文中)。該等動物模型之非限制性實例包括Lepob/ob小鼠、Leprdb小鼠、Kuo Kondo小鼠、KK/Ay小鼠、新西蘭肥胖(New Zealand Obese；NZO)小鼠、NONcNZO10小鼠、津村鈴木肥胖糖尿病(Tsumara Suzuki Obese Diabets；TSOD)及津村鈴木非肥胖(Tsumara Suzuki Non Obese；TSNO)小鼠、M16小鼠、祖克肥胖大鼠(Zucker fatty rat)、祖克糖尿病肥胖大鼠(Zucker diabetic fatty rat)、SHR/N-cp大鼠、JCR/LA-cp大鼠、大塚龍埃文斯德島肥胖大鼠(Otsuka Long Evans Tokushima Fatty rat)、肥胖恆河猴、科恩糖尿病大鼠(Cohen diabetic rat)、後藤柿崎大鼠(Goto-Kakizaki rat)及非肥胖突變C57 BL/6(Akita)小鼠。2型糖尿病亦可藉由例如向非肥胖、非糖尿病C57BL6小鼠喂給高脂肪飼料而利用膳食誘導(Surwit等人，Diabetes 1988；37：1163-7)。2型糖尿病亦可用例如金硫代葡糖(Le Marchand Brustel等人，Am J Physiol 1978；234：E348-58)或鏈脲菌素以化學方式誘導或以手術方式誘導(例如部分胰切除之糖尿病動物)(McNeil JH.,Experimental models of diabetes.Florida,US：CRC Press LLc；1999；Sasaki等人，In Vivo 2000；14：535-41)。亦已知扼要重述代謝障礙之症狀及表型之許多遺傳動物模型，諸如Kennedy等人，2010(上文)中綜述者。
在一些實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白用於增加肌肉質量或體積之功效可藉由皮下注射小鼠來測試，如實例9中所描述。鑒於肌肉生長抑制素之抑制增加肌肉質量，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白預期增加體重及肌肉質量，其增加程度可用於測定黏附蛋白之效力。
在一些實施例中，尤其當需要抗肌肉生長抑制素黏附蛋白在小 鼠中為免疫原性的(例如歸因於使用人類纖維結合蛋白III型結構域)以及長期治療時，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白可投與SCID小鼠，其不能增加細胞或體液免疫反應。在一些實施例中，SCID小鼠可與其他遺傳模型(諸如本文所述之模型(例如糖尿病小鼠))雜交以發展可用於用本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白長期治療之免疫功能不全小鼠模型。
VIII.治療學應用
在一個態樣中，本發明提供適用於治療肌肉生長抑制素相關之疾病或病症(例如肌肉耗損病症、肌肉萎縮、代謝障礙及骨退化性病症)之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白。因此，在某些實施例中，本發明提供用於減輕或抑制個體之肌肉生長抑制素相關之疾病或病症的方法，該等方法包含向個體投與有效量之肌肉生長抑制素結合多肽，亦即抗肌肉生長抑制素黏附蛋白。在某些實施例中，個體為人類。在一些實施例中，抗肌肉生長抑制素黏附蛋白為哺乳動物(尤其人類)醫藥學上可接受的。「醫藥學上可接受之」多肽係指投與動物且無顯著不良醫藥後果之多肽，諸如基本上無內毒素或極低內毒素含量。
在一些實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白將與適用於所治療之特定病症或疾病之此項技術中已知的藥劑一起組合(同時或各別)投與個體。
在一些實施例中，抗肌肉生長抑制素黏附蛋白療法之目標患者群體為因例如年齡、先存病況、基因組成及/或共存疾病而不適於所治療之疾病、病症或病況之標準治療的患者群體。本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白可充當與實質上副作用(例如生殖效能)或安全性問題相關之現有療法的替代方案。
以下更詳細地描述本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白將適用之例示性疾病、病症及病況。
肌肉、神經及代謝疾病及病症
本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白可用於治療與肌肉耗損及/或肌肉萎縮相關之肌肉、神經及代謝病症。舉例而言，肌肉生長抑制素活體內過度表現誘導惡病質之病徵及症狀特徵，且肌肉生長抑制素結合劑可部分地解決肌肉生長抑制素之肌肉耗損作用(Zimmers等人，Science 2002；296：1486-8)。與未患有AIDS之患者或不展現體重損失之AIDS患者相比，患有AIDS之患者亦展現肌肉生長抑制素免疫反應性物質之血清含量增加(Gonzalez-Cadavid等人，PNAS 1998；95：14938-43)。亦已觀察到肌肉生長抑制素之心臟特異性消除減少患有心臟衰竭之小鼠之骨骼肌萎縮，且相反地心臟中特異性過度表現肌肉生長抑制素足以誘導肌肉耗損(Breitbart等人，AJP-Heart；2011；300：H1973-82)。相比之下，肌肉生長抑制素基因剔除小鼠與其野生型對應物相比展示肌肉質量增加及脂肪積累之年齡依賴性減少(McPherron等人，J.Clin.Invest.2002；109：595-601)。
可根據本發明方法治療之例示性病症包括肌病及神經病變，包括例如運動神經元病、神經肌肉及神經性病症。
舉例而言，抗肌肉生長抑制素黏附蛋白可用於治療遺傳肌病及神經肌肉病症(例如肌肉萎縮症(Gonzalez-Kadavid等人，PNAS,1998；95：14938-43)、運動神經元病症、先天性肌病、發炎肌病及代謝肌病)、以及後天性肌病(例如藥物誘發之肌病、毒素誘發之肌病、感染誘發之肌病、副腫瘤肌病及與重大疾病相關之其他肌病)。
該等病症包括(但不限於)杜興氏肌肉萎縮症(Duchenne's muscular dystrophy)、進行性肌營養不良、貝克爾型肌肉萎縮症(Becker's type muscular dystrophy)、代哲因-藍杜茲肌肉萎縮症(Dejerine-Landouzy muscular dystrophy)、鄂博氏肌肉萎縮症(Erb's muscular dystrophy)、艾-德肌肉萎縮症(Emery Dreifuss muscular dystrophy)、肢帶型肌肉萎 縮症(limb girdle muscular dystrophy)、眼咽型肌肉萎縮症(OPMD)、顏面肩胛臂肌肉萎縮症、先天性肌肉萎縮症、嬰兒神經軸肌肉萎縮症、肌強直營養不良(斯泰奈特氏疾病(Steinert's disease))、遠端型肌營養不良症、纖維狀肌病、家族性週期性癱瘓、非營養不良性肌強直、週期性麻痹、脊髓性肌萎縮、脊髓性肌萎縮(SMA)、肌肉萎縮性側索硬化(ALS)、原發性脊髓側索硬化(PLS)、進行性肌萎縮(PMA)、遠端肌病、肌管/中央核肌病、纖維狀肌病、微核病、中央軸空病、心肌病變、包涵體肌炎、皮肌炎、多發性肌炎、線粒體肌病、先天性類重症肌無力症候群、重症肌無力、脊髓灰質炎後肌肉功能障礙、類固醇肌病、酒精性肌病、圍手術期肌肉萎縮及ICU神經肌病。
可用抗肌肉生長抑制素黏附蛋白治療之遺傳及後天性神經病變及神經根病包括(但不限於)脊柱強直症候群、肌肉-眼-腦疾病、遺傳運動及感覺神經病變、夏-馬-度疾病(Carcot-Marie-Tooth disease)、長期發炎性神經病變、進行性肥大性神經病變、臘腸體樣神經病變、狼瘡、古立安-白瑞症候群(Guillain-Barre syndrome)、慢性發炎性髓鞘脫失多發性神經病變、多發性硬化症、類肉瘤病、糖尿病神經病變、酒精性神經病變、疾病相關之神經病變(例如HIV/AIDS，萊姆病(Lyme disease))、毒素相關神經病變(例如重金屬、化學療法)、壓迫神經病變(例如腫瘤、夾帶神經病變)及與損傷或創傷相關之神經病變(例如馬尾症候群、截癱、四肢麻痹)。
在一些實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白可用於治療肌肉性營養不良(例如杜興氏肌肉萎縮症、貝克爾型肌肉萎縮症)、ALS及少肌症。
可用本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白治療之與肌肉耗損相關之其他病症包括惡病質、耗損症候群、少肌症、充血性阻塞性肺病、囊腫性纖維化(肺部惡病質)、心臟病或衰竭(心臟惡病質)、癌 症、因AIDS所致之耗損、因腎衰竭所致之耗損、腎病、跛行、與透析相關之惡病質、尿毒症、類風濕性關節炎、肌肉損傷、手術、損傷肌肉修復、虛弱、不用性萎縮、骨質疏鬆症、骨關節炎、韌帶生長及修復。
本發明之方法亦可用於增加罹患因不用所致之肌肉萎縮之個體的肌肉體積。不用性萎縮可由許多原因引起，包括引起長期不活動或不用之任何病症或狀態，包括(但不限於)長期臥床休息、為輪椅所束縛、肢體制動、經由機械通氣之隔膜去負載、實體器官移植、關節置換、中風、CNS損傷相關之虛弱、脊髓損傷、自嚴重燒傷之恢復、久坐慢性血液透析、創傷後恢復、敗血症後恢復及暴露於微重力(Powers等人，Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2005；288：R337-44)。
另外，脂肪與肌肉比率之年齡相關之增加及年齡相關之肌肉萎縮似乎與肌肉生長抑制素有關。舉例而言，在青年(19至35歲大)、中年(36至75歲大)及年長(76至92歲大)男性及女性組中平均血清肌肉生長抑制素-免疫反應性蛋白隨年齡增加，而平均肌肉質量及無脂質量在此等組中隨年齡降低(Yarasheski等人J Nutr Aging 6(5)：343-8(2002))。因此，患有因衰老所致之肌肉萎縮之個體及/或因例如少肌症而虛弱之個體亦將得益於使用本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白的治療。
亦涵蓋使食物動物中之肌肉質量增加之方法，該等方法藉由向此等動物投與有效劑量之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白來進行。由於成熟C端肌肉生長抑制素多肽在所有物種中一致，故預期抗肌肉生長抑制素黏附蛋白將有效增加肌肉質量且減少任何農業上重要物種(例如(但不限於)牛、雞、火雞及豬)之脂肪。
抗肌肉生長抑制素黏附蛋白在治療肌肉耗損病症或肌肉萎縮方 面之功效可例如利用一或多種方法測定，該一或多種方法用於量測肌肉質量或體積之增加、肌細胞數目之增加(增生)、肌細胞大小之增加(肥大)及/或肌力之增強。舉例而言，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白之肌肉體積增強作用展示於下文所述實例中。用於測定「增加之肌肉質量」之方法為此項技術中所熟知。舉例而言，肌肉含量可在使用標準技術投與本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白之前和之後量測，該等標準技術諸如為水下稱重(參見例如Bhasin et al.New Eng.J.Med.(1996)335：1-7)及雙重能量X射線吸光測定法(參見例如Bhasin等人Mol.Endocrinol.(1998)83：3155-3162)。肌肉大小之增強可藉由重量增加至少約5%至10%、較佳至少約10%至20%或20%以上來證明。
代謝障礙
本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白(其減少肌肉生長抑制素活性及/或信號傳導)適用於治療代謝障礙，諸如肥胖症、II型糖尿病、糖尿病相關病症、代謝症候群及高血糖症。
肌肉生長抑制素與II型糖尿病之發病機制有關。肌肉生長抑制素表現於脂肪組織中，且肌肉生長抑制素缺乏小鼠隨著其衰老展現減少之脂肪積累。此外，葡萄糖負載、脂肪積累及總體重在肌肉生長抑制素缺乏性鼠灰色致死黃及肥胖(Lepob/ob)小鼠中降低(Yen等人，FASEB J.8：479,1994；McPherron等人，2002)。如US2011/0008375中所揭示，肌肉生長抑制素拮抗劑可減小衰老小鼠模型中脂肪與肌肉的比率，維持骨骼肌質量及瘦體質，且減輕STZ誘發之糖尿病小鼠之腎臟肥大。
如本文所用，「肥胖症」為過量體脂肪已積累至可負面影響健康狀況之程度的病況。其通常定義為30kg/m2或30kg/m2以上之身體質量指數(BMI)，該身體質量指數將其與如25kg/m2或25kg/m2以上之BMI所定義之超重區分開來(參見例如World Health Organization(2000)(PDF).Technical report series 894：Obesity：Preventing and managing the global epidemic.Geneva：World Health Organization)。過量體重與多種疾病相關，尤其心血管疾病、II型糖尿病、阻塞性睡眠呼吸暫停、某些類型癌症及骨關節炎。
患有肥胖症之個體可例如藉由以下方式鑑別：測定BMI(BMI藉由將個體質量除以他或她身高平方來計算)、腰圍及腰-臀比(絕對腰圍(男性>102cm及女性>88cm)及腰-臀比率(腰圍除以臀圍，男性>0.9及女性>0.85))(參見例如Yusuf S，等人，(2004)Lancet 364：937-52)、及/或體脂肪百分比(總體脂肪表示為總體重之百分比：體脂肪超過25%之男性及體脂肪超過33%之女性為肥胖；體脂肪百分比可由人之BMI藉由下式估算：體脂肪%=(1.2×BMI)+(0.23×年齡)-5.4-(10.8×性別)，其中性別若為女性則為0且若為男性則為1)。體脂肪百分比量測技術包括例如電腦斷層攝影術(CT掃描)、磁共振成像(MRI)及雙重能量X射線吸光測定法(DEXA)。
術語「II型糖尿病」係指當身體胰島素不有效工作時產生之慢性終身疾病。II型糖尿病之主要組分為「胰島素抗性」，其中由胰臟製造之胰島素無法接觸脂肪及肌細胞以允許內部葡萄糖產生能量，引起高血糖症(高血糖)。為了補償，胰臟產生較多胰島素，且感覺此胰島素潮之細胞變得甚至更耐受，引起較高葡萄糖含量及通常較高胰島素含量之惡性循環。
如本文所用之短語「與糖尿病相關之病症」或「糖尿病相關病症」或「糖尿病有關病症」係指通常與糖尿病相關或有關之病況及其他疾病。與糖尿病相關之病症之實例包括例如高血糖症、高胰島素血症、高脂質血症、胰島素抗性、葡萄糖代謝受損、肥胖症、糖尿病性視網膜病變、黃斑變性、白內障、糖尿病性腎病變、腎小球硬化、糖尿病神經病變、勃起障礙、經前症候群、血管再狹窄、潰瘍性結腸炎、冠心病、高血壓、心絞痛、心肌梗塞、中風、皮膚及結締組織病 症、腳潰瘍、代謝性酸中毒、關節炎及骨質疏鬆症。
抗肌肉生長抑制素黏附蛋白在治療代謝障礙方面之功效可例如藉由量測胰島素敏感性增加、來自個體之細胞攝取葡萄糖之增加、血糖含量降低及體脂肪減少的一或多種方法來測定。
舉例而言，在患有II型糖尿病或處於發生糖尿病風險之中的個體中，可監測HbA1c含量。如本文所用之術語「血色素1AC」或「HbA1c」係指血色素B鏈之非酶促糖基化之產物。患有糖尿病之人之HbA1c含量的所需目標範圍可由美國糖尿病協會(American Diabetes Association；ADA)指南(亦即標準糖尿病醫療護理(Standards of Medical Care in Diabetes)(Diabetes Care 2012；35(增刊1)：S511-563))測定。對於患有糖尿病之人而言，當前HbA1c目標含量通常<7.0%，且不患有糖尿病之人通常具有小於6%之HbA1c值。因此，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白之功效可藉由觀察到之個體HBA1c含量的減少來測定。
本發明之方法進一步包括抗肌肉生長抑制素黏附蛋白單獨、或與此項技術中已知用於血糖控制(例如胰島素GLP1)或用於治療技術公認之糖尿病相關併發症之其他藥劑組合投與。
其他病症
肌肉生長抑制素基因剔除小鼠展現肌肉質量增加、以及小鼠肱骨之礦物質含量及密度增加、及肌肉連接區域處之小樑骨及皮層骨兩者之礦物質含量增加(Hamrick等人Calcif Tissue Intl 2002；71：63-8)。此結果提示增加肌肉質量可幫助改良骨強度及減少骨質疏鬆症及其他退化性骨疾病。
本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白適用之其他疾病或病症包括創口癒合、抗纖維變性疾病、藍伯-伊頓症候群(Lambert-Eaton Syndrome)及帕金森氏症(Parkinson's Disease)。
組合療法
本文提供之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白可與以下組合使用：抗糖尿病藥劑、抗高血糖藥劑、抗高胰島素血症藥劑、抗視網膜病變藥劑、抗神經性病變藥劑、抗神經退化性藥劑、抗腎病變藥劑、抗動脈粥樣硬化藥劑、抗缺血藥劑、抗高血壓性藥劑、抗肥胖症藥劑、抗血脂異常藥劑、抗血脂異常藥劑、抗高脂質血症藥劑、抗高三酸甘油酯血症藥劑、抗高膽固醇血症藥劑、抗再狹窄藥劑、抗胰臟藥劑、降脂劑、減食慾劑、記憶增強藥劑、抗癡呆藥劑、或認知促進藥劑、食慾抑制劑、神經或肌肉恢復治療、用於心臟衰竭之治療、用於周邊動脈疾病之治療及抗發炎藥劑。
與抗肌肉生長抑制素黏附蛋白組合使用之抗糖尿病藥劑包括(但不限於)胰島素促泌素或胰島素增敏劑、GPR40受體調節劑或其他抗糖尿病藥劑。此等藥劑包括(但不限於)二肽基肽酶IV(DP4)抑制劑(例如西他列汀(sitagliptin)、薩格列汀(saxagliptin)、阿洛利停(alogliptin)、維格列汀(vildagliptin)及其類似物)、雙胍(例如二甲雙胍、苯乙雙胍及其類似物)、磺醯脲(例如格列本脲(gliburide)、格列美脲(glimepiride)、格列吡嗪(glipizide)及其類似物)、葡糖苷酶抑制劑(例如阿卡波糖(acarbose)、米格列醇(miglitol)及其類似物)、PPARγ促效劑(諸如噻唑啶二酮，例如羅格列酮(rosiglitazone)、吡格列酮(pioglitazone)及其類似物)、PPAR α/γ雙重促效劑(例如莫格列紮(muraglitazar)、替格列紮(tesaglitazar)、阿格列紮(aleglitazar)及其類似物)、葡糖激酶活化因子(如Fyfe等人，Drugs of the Future,34(8)：641-653(2009)中所述，且其以引用的方式併入本文中)、GPR119受體調節劑(MBX-2952、PSN821、APD597及其類似物)、SGLT2抑制劑(達格列淨(dapagliflozin)、卡格列淨(canagliflozin)、雷格列淨(remagliflozin)及其類似物)、支鏈澱粉類似物(諸如普蘭林肽 (pramlintide))及/或胰島素。用於治療糖尿病之當前及新興療法之綜述見於：Mohler等人，Medicinal Research Reviews,29(1)：125-195(2009)及Mizuno等人，Current Medicinal Chemistry,15：61-74(2008)。
本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白亦可視情況與一或多種降低食慾藥劑組合使用，該等藥劑諸如為二乙胺苯丙酮、苯二甲嗎啉、苯丁胺、羅氏鮮(orlistat)、諾美婷(sibutramine)、羅卡西林(lorcaserin)、普蘭林肽、托吡酯(topiramate)、MCHR1受體拮抗劑、調酸素(oxyntomodulin)、納曲酮(naltrexone)、澱粉素肽、NPY Y5受體調節劑、NPY Y2受體調節劑、NPY Y4受體調節劑、西替利司他(cetilistat)、5HT2c受體調節劑及其類似物。本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白亦可與胰升糖素樣肽-1受體(GLP-1 R)之促效劑組合使用，諸如艾塞那肽(exenatide)、利拉魯肽(liraglutide)、GPR-1(1-36)醯胺、GLP-1(7-36)醯胺、GLP-1(7-37)(如Habener之美國專利第5,614,492號中所揭示，其揭示內容以引用的方式併入本文中)，其可經由注射、經鼻內或利用經皮或經頰裝置投與。用於治療肥胖症之當前及新興療法之綜述可見於：Melnikova等人，Nature Reviews Drug Discovery,5：369-370(2006)；Jones,Nature Reviews：Drug Discovery,8：833-834(2009)；Obici,Endocrinology,150(6)：2512-2517(2009)；及Elangbam,Vet.Pathol.,46(1)：10-24(2009)。
本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白亦可與一或多種其他治療劑一起投與，視情況用於所治療之特定疾病或病症。其他藥劑之非限制性實例包括適用於治療諸如II型糖尿病及少肌症之代謝障礙且包括(但不限於)GLP-1、GLP-1樣、澱粉素及FGF21之藥劑；適用於治療抗纖維變性疾病、神經肌肉病疾病、運動神經元病及少肌症且包括(但不限於)胃內激素(ghrelin)、SARM、利魯唑(Riluzole)、睾酮、雄激素、生長激素、激素替補療法、COX-2抑制劑、肌鈣蛋白活化劑、β2 促效劑、CTLA4-Ig(例如阿貝塔西普(abetacept)、貝拉西普(belatacept))及抗TGFβ抗體之藥劑；適用於治療惡病質及其他耗損症候群且包括(但不限於)TGFβ受體激酶抑制劑、抗IL-6及泛素蛋白酶體抑制劑之藥劑；適用於治療與肌強直及PLS相關之肌肉痙攣之藥劑，其包括(但不限於)菲托寧(phytoin)、奎寧(quinine)、氯苯胺丁酸(Baclofen)及替紮尼定(tizanidine)；適用於神經病變之藥劑，其包括抗抑鬱劑(例如三環及選擇性血清素-去甲腎上腺素再攝取抑制劑(SNRI))、抗驚厥劑、大麻素(cannbinoid)、A型肉毒桿菌毒素、NMDA拮抗劑(例如氯胺酮(ketamine))、膳食補充劑(例如α硫辛酸及苯磷硫胺)；適用於治療慢性發炎神經病變之藥劑，其包括(但不限於)皮質類固醇、靜脈內免疫球蛋白及免疫抑制藥物(例如環磷醯胺、環孢素(ciclosporin)、硫唑嘌呤、黴酚酸嗎啉乙酯、抗胸腺細胞球蛋白、利妥昔單抗(rituximab))；及適用於治療古立安-白瑞症候群、少肌症、骨折及骨質流失且包括(但不限於)博尼瓦(Boniva；伊班膦酸鹽(ibandronate))及PTH之藥劑。
本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白可與症狀療法中所用之一或多種其他藥劑一起投與。用於治療ALS症狀之該等藥劑之非限制性實例包括線粒體通透性轉移(MPT)孔活化劑、快速支架肌鈣蛋白活化劑、巨噬細胞調節劑(例如NP001)、溶酶體貯積病治療藥劑(例如NP003)及菸鹼酸乙醯膽鹼受體(nAchR)拮抗劑。用於治療DMD/BMD之症狀之另一藥劑之非限制性實例為增加ATP含量之藥劑。
本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白亦可與疾病修飾療法中所用之一或多種其他藥劑一起投與。用於治療ALS之該等藥劑之非限制性實例包括自由基清除劑(例如依達拉奉(edaravone；諾非那宗(norphenazone))、CV-3611)、VEGF促效劑(例如sNN0029)、Nogo-A蛋白質I(例如GSK122324)、SOD1抑制劑(例如ISIS-SOD1Rx)及PGE合成 酶1抑制劑(例如AAD-2004)。用於治療DMD/BMD之該等藥劑之非限制性實例包括促進外顯子跳過之藥劑(例如反義分子，諸如屈沙培森(drisapersen；PRO051/GSK2402968)、PRO044、依替利森(Eteplirsen)、AVI-4658、AVI-5038、安他盧倫(Ataluren；PTC124))、基因療法藥劑、抗發炎劑(例如CRD007)及抗纖維變性藥劑(例如HT-100)。
如上所論述，促進外顯子跳過之藥劑可與本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白組合使用以用於治療杜興氏肌肉萎縮症及貝克爾型肌肉萎縮症。可靶向恢復功能性肌縮蛋白之特定外顯子之實例包括外顯子7、8、17、43、44、45、46、50、51、52、53及55(參見例如Lu等人，Molecular Therapy 2011；19：9-15)。在一些實施例中，一種以上藥劑(例如反義寡核苷酸)可用於誘導多個外顯子跳過。
IX. 醫藥組合物
本發明進一步提供醫藥組合物，其包含本文所述之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白或其融合蛋白質，其中該組合物基本上無內毒素，或至少含有不大於可接受含量之內毒素，如由適當管理機構(例如FDA)測定。
本發明之組合物可呈以下形式：丸劑、錠劑、膠囊、液體或持續釋放錠劑用於經口投與；液體用於靜脈內、皮下或非經腸投與；或凝膠、洗劑、軟膏劑、乳膏劑或聚合物或其他持續釋放媒劑用於局部投與。
用於製造組合物之此項技術中熟知之方法見於例如「Remington：The Science and Practice of Pharmacy」(第20版，A.R.Gennaro AR.編，2000,Lippincott Williams & Wilkins,Philadelphia,Pa.)中。用於非經腸投與之組合物可例如含有賦形劑、無菌水、鹽水、聚伸烷二醇(諸如聚乙二醇)、植物來源之油類或氫化萘。可使用生物相容性、生 物可降解丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物來控制化合物之釋放。奈米微粒組合物(例如生物可降解奈米粒子、固體脂質奈米粒子、脂質體)可用於控制化合物之生物分佈。其他潛在適用之非經腸傳遞系統包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物粒子、滲透泵、可植入輸注系統及脂質體。組合物中化合物之濃度視包括待投與之藥物劑量及投藥途徑在內之許多因素而變化。
可接受之載劑、賦形劑或穩定劑係在所用劑量及濃度下對接受者無毒且包括：緩衝液，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苄基銨；氯化六羥季銨；氯化苯甲烴銨、苄索氯銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合劑，諸如EDTA；糖類，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白錯合物)；及/或非離子界面活性劑，諸如Tween、PLURONICTM或聚乙二醇(PEG)。
本發明之多肽可視情況作為醫藥學上可接受之鹽，諸如製藥工業中常使用之無毒酸加成鹽或金屬錯合物投與。酸加成鹽之實例包括有機酸，諸如乙酸、乳酸、雙羥萘酸、順丁烯二酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、丁二酸、苯甲酸、棕櫚酸、辛二酸、水楊酸、酒石酸、甲烷磺酸、甲苯磺酸或三氟乙酸或其類似酸；聚合酸，諸如鞣酸、羧甲基纖維素或其類似酸；及無機酸，諸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸或其類似酸。金屬錯合物包括鋅、鐵及其類似物。在一個實 例中，在乙酸鈉存在下調配多肽以增加熱穩定性。
例如，亦可藉由凝聚技術或藉由界面聚合將活性成分裹入所製備之微囊中，例如分別將羥基甲基纖維素或明膠-微囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊裹入膠狀藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米囊劑)或巨乳液中。該等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.編(1980)中。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適合實例包括含有本發明蛋白質之固體疏水性聚合物的半透性基質，該等基質為成形物品之形式，例如膜或微囊。持續釋放基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸交酯(美國專利第3,773,919號)、L-麩胺酸與y乙基-L-麩胺酸酯之共聚物、不可降解乙烯-乙酸乙烯酯、諸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)組成之可注射性微球體)之可降解乳酸-乙醇酸共聚物及聚-D-(-)-3-羥丁酸。雖然聚合物(諸如乙烯-乙酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸)使分子能夠經100天釋放，但某些水凝膠經較短時期釋放蛋白質。當囊封之本發明蛋白質可長時間保持在身體中時，其可因暴露於37℃之水分而變性或聚集，引起生物活性損失及可能的免疫原性變化。視所涉及之機制而定，可設計合理策略以達成穩定。舉例而言，若發現聚集機制為經硫基-二硫化物互換形成分子間S-S鍵，則可藉由修飾硫氫基殘基、自酸性溶液凍乾、控制水分含量、使用適當添加劑及開發特定聚合物基質組合物來達成穩定。
用於經口使用之本發明之組合物包括在具有無毒醫藥學上可接受之賦形劑之混合物中含有活性成分的錠劑。此等賦形劑可例如為惰性稀釋劑或填充劑(例如蔗糖及山梨糖醇)、潤滑劑、助流劑及抗黏著劑(例如硬脂酸鎂、硬脂酸鋅、硬脂酸、二氧化矽、氫化植物油或滑石)。適於經口使用之組合物亦可以咀嚼錠形式，或以活性成分與惰 性固體稀釋劑混合之硬明膠膠囊形式，或以活性成分與水或油介質混合之軟明膠膠囊形式提供。
待用於活體內投與之醫藥組合物通常必須為無菌的。此可藉由經由無菌濾膜過濾完成。當組合物經凍乾時，使用此方法之殺菌可於凍乾及復水之前或之後執行。可將非經腸投與之組合物以凍乾形式或以溶液形式儲存。此外，一般將非經腸組合物置於具有無菌入口孔之容器中，例如具有可由皮下注射針穿透之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶中。
醫藥組合物一經調配，其即可以溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體或脫水或凍乾粉末形式儲存於無菌小瓶中。該等調配物可以即用形式或需要於投與前復水之形式(例如凍乾形式)儲存。
本文中之組合物亦可含有一種以上為所治療之特定適應症所必需之活性化合物，較佳為具有不會對彼此產生不利影響之互補活性的活性化合物。該等分子適合以可有效地達成預期目的之量組合存在。
X. 投與
包含本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白之醫藥組合物可使用包括以下之標準投藥技術投與如本文所述處於病理學風險之中或展現病理學之個體：經口、非經腸、經肺、經皮、肌肉內、鼻內、經頰、舌下或栓劑投藥。本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白之投與較佳為非經腸。如本文中所使用之術語非經腸包括靜脈內、肌肉內、皮下、直腸、陰道或腹膜內投藥。較佳為藉由靜脈內或腹膜內或皮下注射進行周邊全身傳遞。
治療有效劑量係指對所投與者產生治療學作用之劑量。治療上待使用之醫藥組合物之有效量將視例如治療背景及目的而定。熟習此項技術者應瞭解，用於治療之適當劑量水準因此將在某種程度上視所傳遞之分子、使用結合劑分子所針對之適應症、投藥途徑及患者之體 型(體重、體表或器官大小)及狀況(年齡及一般健康狀況)而改變。
舉例而言，治療有效劑量可起初在細胞培養分析中或在諸如小鼠、大鼠、兔、狗、豬或猴之動物模型中估算。亦可使用動物模型測定適當濃度範圍及投藥途徑。隨後可使用該等信息來確定適用於人類之劑量及投藥途徑。
精確劑量將根據與需要治療之個體有關之因素測定，且可使用標準技術確定。調節劑量及投藥以提供足夠含量之活性化合物或維持所需效果。可考慮之因素包括疾病病況之嚴重度、個體之一般健康、個體之年齡、體重及性別、投藥時間及頻率、藥物組合、反應敏感性及對療法之反應。一般而言，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白以每天約0.01mg/kg至約50mg/kg、較佳每天0.01mg/kg至約30mg/kg、最佳每天0.01mg/kg至約20mg/kg投與。在一些實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白以約1mg至50mg、更佳約10mg至50mg之每週一次劑量投與。在其他實施例中，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白以30mg至200mg、較佳50mg至150mg且更佳60mg至120mg之每月一次劑量投與。
給藥頻率將視所使用之調配物內結合劑分子之藥物動力學參數而定。通常，投與組合物直至達至達成所需效果之劑量。因此可將該組合物作為單次劑量、或作為隨時間推移之多次劑量(以相同或不同濃度/劑量)、或作為連續輸注投與。適當劑量之進一步改進係常規進行。適當劑量可經由使用適當劑量-反應資料來確定。舉例而言，抗肌肉生長抑制素黏附蛋白可每日(例如每日一次、兩次、三次或四次)或較不頻繁地(例如每隔一天一次、每週一或兩次或每月一次)給予。另外，如此項技術中已知，針對年齡以及體重、一般健康狀況、性別、膳食、投與時間、藥物相互作用及疾病之嚴重度之調節可為必需的，且將可用常規實驗由熟習此項技術者確定。在一次或經一系列治 療將抗肌肉生長抑制素黏附蛋白適當地投與患者。
無論共同投與抑或依序投與，抗肌肉生長抑制素黏附蛋白或其融合體及一或多種其他治療劑之投與可如上所述針對治療學應用進行。熟練技工將理解用於共同投與之適合之醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑及賦形劑視待投與之特定治療劑之身分而定。
XI. 偵測及診斷之方法
本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白亦適用於多種診斷應用。舉例而言，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白可用於診斷與肌肉生長抑制素含量增加相關之病症或疾病。以類似方式，抗肌肉生長抑制素黏附蛋白可在分析中用於監測針對肌肉生長抑制素相關病況治療之個體的肌肉生長抑制素含量。抗肌肉生長抑制素黏附蛋白可在存在或不存在修飾之情況下使用，且藉由可偵測部分之共價或非共價連接來標記。可偵測部分可為任何能夠直接或間接產生可偵測信號之部分。舉例而言，可偵測部分可為放射性同位素，諸如H3、C14或13、P32、S35或1131；螢光或化學發光化合物，諸如異硫氰酸螢光素、若丹明(rhodamine)或螢光素；或酶，諸如鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根過氧化物酶。
將蛋白質結合至可偵測部分之此項技術中已知之任何方法均可使用，包括由Hunter，等人，Nature 144：945(1962)；David，等人，Biochemistry 13：1014(1974)；Pain，等人，J.Immunol.Meth.40：219(1981)；及Nygren,J.Histochem.and Cytochem.30：407(1982)所述之方法。活體外方法包括此項技術中熟知之結合化學，包括與蛋白質相容之化學作用，諸如用於特定胺基酸(諸如Cys及Lys)之化學作用。為了將部分(諸如PEG)連接至本發明之蛋白質，使用鍵聯基團或反應性基團。適合之鍵聯基團為此項技術中所熟知且包括二硫基、硫醚基、酸不穩定基團、光不穩定基團、肽酶不穩定基團及酯酶不穩定基團。 較佳鍵聯基團視應用而定為二硫基及硫醚基。對於不具有Cys胺基酸之多肽，Cys可在位置中經工程化以允許存在蛋白質活性同時形成用於結合之位置。
與可偵測部分連接之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白亦適用於活體內成像。多肽可連接至射線透不過的藥劑或放射性同位素，投與個體，較佳進入血流，且分析個體中標記之蛋白質之存在及位置。此成像技術適用於惡性疾病之分階段及治療。蛋白質可利用無論核磁共振、放射學抑或此項技術中已知之其他偵測手段用在個體中可偵測之任何部分標記。
抗肌肉生長抑制素黏附蛋白亦適用作親和力純化藥劑。在此方法中，使用此項技術中熟知之方法將多肽固定在適合之支撐物(諸如Sephadex樹脂或濾紙)上。
抗肌肉生長抑制素黏附蛋白可用於任何已知分析方法，諸如競爭性結合分析、直接及間接夾心分析及免疫沈澱分析(Zola,Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques，第147-158頁(CRC Press,Inc.,1987))。
在某些態樣中，本發明提供偵測樣品中目標分子之方法。方法可包含使樣品與本文所述之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白接觸，其中該接觸在允許抗肌肉生長抑制素黏附蛋白-目標複合物形成之條件下進行；及偵測該複合物，由此偵測該樣品中之該目標。偵測可使用任何技術公認之技術進行，諸如例如射線照相術、免疫分析、螢光偵測、質譜或表面電漿子共振。樣品可來自人類或其他哺乳動物。抗肌肉生長抑制素黏附蛋白可用標記部分標記，諸如放射性部分、螢光部分、生色部分、化學發光部分或半抗原部分。抗肌肉生長抑制素黏附蛋白可固定在固體支撐物上。
XII. 套組及製品
本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白可提供於套組(呈預定量之試劑與使用說明書之經包裝之組合)中以用於本發明之治療或診斷方法。
舉例而言，在本發明之一個實施例中，提供一種製品，其含有適用於治療或預防上述病症或病狀之物質。該製品包含容器及標記。適合之容器包括例如瓶子、小瓶、注射器及試管。容器可由諸如玻璃或塑膠之各種材料形成。容器容納對於預防或治療病症或病狀有效之本發明之組合物且可具有無菌入口孔(例如容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。組合物中之活性劑為本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白。容器上或與容器相關聯之標記指示組合物係用於治療所選病況。製品可進一步包含第二容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝液，諸如磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及葡萄糖溶液。其可進一步包括就商業及使用者觀點而言合乎需要之其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針、注射器及具有使用說明之藥品說明書。
以引用的方式併入
本文所述之包括專利文件及網站之所有文件及參考文獻均個別地以引用的方式併入本文件中，其引用程度就如同全部或部分寫入本文件中一般。
實例
現藉由參考以下實例描述本發明，該等實例僅為說明性的且不意欲限制本發明。雖然本發明已詳細且參照其特定實施例描述，但熟習此項技術者將顯而易知可在不背離其精神及範疇之情況下對其作出各種改變及修改。
實例1-蛋白質製造 高通量蛋白質製造(HTPP)
將選殖至PET9d載體之HIS6標籤上游中且轉型至大腸桿菌BL21 DE3 plysS細胞中之所選黏合劑接種於24孔形式中之含有50μg/mL康黴素(kanamycin)的5ml LB培養基中，且在37℃下生長隔夜。針對誘導性表現，藉由吸入來自隔夜培養物之200μl且將其分配至適當孔中來製備新鮮5ml LB培養基(50μg/mL康黴素)培養物。培養物在37℃下生長直至A600 0.6-0.9為止。在用1mM異丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導之後，使培養物在30℃下表現6小時且藉由在4℃下在2750g下離心10分鐘來收集。
細胞集結粒(在24孔形式中)藉由再懸浮於450μl溶解緩衝液(50mM NaH2PO4、0.5M NaCl、1×CompleteTM蛋白酶抑制劑混合液-無EDTA(Roche)、1mM PMSF、10mM CHAPS、40mM咪唑、1mg/ml溶菌酶、30μg/ml DNAse、2μg/ml抑肽酶，pH 8.0)中來溶解且在室溫下振盪1至3小時。清除溶解物，且藉由轉移至裝備有96孔、1.2ml收集盤之96孔Whatman GF/D Unifilter中來再架在96孔形式中且利用正壓過濾。將清除之溶解物轉移至已用平衡緩衝液(50mM NaH2PO4、0.5M NaCl、40mM咪唑，pH 8.0)平衡之96孔鎳或鈷螯合盤中且培育5分鐘。未結合之物質利用正壓移除。樹脂用洗滌緩衝液#1(50mM NaH2PO4、0.5M NaCl、5mM CHAPS、40mM咪唑，pH 8.0)以0.3毫升/孔洗滌兩次。各洗滌液利用正壓移除。在溶離之前，各孔用50μl溶離緩衝液(PBS+20mM EDTA)洗滌，培育5分鐘，且此洗滌液利用正壓丟棄。蛋白質藉由向各孔中再施加100μl溶離緩衝液來溶離。在室溫下培育30分鐘後，將盤在200g下離心5分鐘，且將溶離之蛋白質收集於96孔收集盤中，該等收集盤含有在溶離之前添加至溶離收集盤底部之5μl 0.5M MgCl2。溶離之蛋白質使用總蛋白分析用野生型10Fn3結構域作為蛋白質標準進行定量。
不溶性以纖維連接蛋白為主之支架蛋白黏合劑之表現及純化
針對表現，依序將所選純系及HIS6標籤選殖至pET9d載體中且表現於大腸桿菌BL21 DE3 plysS細胞中。20ml接種培養物(由單一接種之群落產生)用於接種含有50μg/ml康黴素及34μg/ml氯黴素之1公升LB培養基或TB-隔夜表現培養基(自動誘導)。LB培養基中之培養物在37℃下培育直至A600 0.6-1.0為止，與此同時其用1mM異丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導且在30℃下生長4小時。在TB-隔夜表現培養基中生長之培養物在37℃下培育5小時，與此同時溫度降低至18℃且生長19小時。培養物藉由在4℃下在10,000g下離心30分鐘來收集。細胞集結粒在-80℃下冷凍。解凍後，細胞集結粒在冰上使用Ultra-turrax均質機(IKA works)再懸浮於25ml溶解緩衝液(20mM NaH2PO4、0.5M NaCl、1×CompleteTM蛋白酶抑制劑混合液-無EDTA(Roche)，pH 7.4)中。細胞溶解藉由高壓均質化(18,000psi)使用型號M-110S微射流機(Microfluidics)達成。不溶性部分藉由在4℃下在23,300g下離心30分鐘來分離。由溶解物離心回收之不溶性集結粒用20mM磷酸鈉/500mM NaCl(pH7.4)洗滌。集結粒在音波處理情況下再溶解於含6M鹽酸胍之20mM磷酸鈉/500mM NaCl(pH 7.4)中，隨後在37℃下培育1至2小時。再溶解之集結粒用0.45μm過濾器過濾且加載至用20mM磷酸鈉/500mM NaCl/6M胍(pH 7.4)緩衝液平衡之Histrap管柱上。加載後，管柱用相同緩衝液再洗滌25個管柱體積。結合之蛋白質用含50mM咪唑之20mM磷酸鈉/500mM NaCl/6M鹽酸胍(pH 7.4)溶離。純化之蛋白質藉由針對50mM乙酸鈉/150mM NaCl(pH 4.5)或PBS(pH 7.2)透析而再摺疊。
可溶性以纖維連接蛋白為主之支架蛋白黏合劑之表現及純化
作為不溶性黏合劑之純化之替代方案，亦可使用可溶性黏合劑之純化。針對表現，依序將所選純系及HIS6標籤選殖至pET9d載體中且表現於大腸桿菌BL21 DE3 plysS細胞中。20ml接種培養物(由單一 接種之群落產生)用於接種含有50μg/ml康黴素及34μg/ml氯黴素之1公升LB培養基或TB-隔夜表現培養基(自動誘導)。LB培養基中之培養物在37℃下培育直至A600 0.6-1.0為止，隨後用1mM異丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導且在30℃下生長4小時。在TB-隔夜表現培養基中生長之培養物在37℃下培育5小時，此後溫度降低至18℃且使其生長19小時。培養物藉由在4℃下在10,000g下離心30分鐘來收集。細胞集結粒在-80℃下冷凍。解凍之細胞集結粒在冰上使用Ultra-turrax均質機(IKA works)再懸浮於25ml溶解緩衝液(20mM NaH2PO4、0.5M NaCl、1×CompleteTM蛋白酶抑制劑混合液-無EDTA(Roche)，pH 7.4)中。細胞溶解藉由高壓均質化(18,000psi)使用型號M-110S微射流機(Microfluidics)達成。可溶性部分藉由在4℃下在23,300g下離心30分鐘來分離。上清液使用0.45μm過濾器淨化。將淨化之溶解物加載至用20mM磷酸鈉/500mM NaCl(pH 7.4)預平衡之Histrap管柱(GE)上。管柱接著依序用25個管柱體積之相同緩衝液及20個管柱體積之20mM磷酸鈉/500mM NaCl/25mM咪唑(pH 7.4)及35個管柱體積之20mM磷酸鈉/500mM NaCl/40mM咪唑(pH 7.4)洗滌。蛋白質用15個管柱體積之20mM磷酸鈉/500mM NaCl/500mM咪唑(pH 7.4)溶離，基於A280下之吸光度將溶離份集中，且針對1×PBS或50mM Tris、150mM NaCl(pH 8.5)或50mM NaOAc、150mM NaCl(pH 4.5)透析。沈澱藉由用0.22μm過濾器過濾而移除。
黏附蛋白用聚乙二醇(PEG)定點聚乙二醇化
含有工程化半胱胺酸殘基之黏附蛋白經由半胱胺酸上巰基與PEG或n-乙基順丁烯二醯亞胺(NEM)之順丁烯二醯亞胺官能基之間的邁克爾加成化學作用(Michael-addition chemistry)與PEG或半胱胺酸阻斷試劑結合。針對使用2-分支40 kDa PEG(NOF Corporation，P/N GL2-400MA)之聚乙二醇化，將PEG在微酸性至中性條件下以莫耳過量添 加至蛋白質溶液中。允許反應在室溫下進行2小時至隔夜。接著將反應物施加至離子交換管柱以自未反應之PEG-順丁烯二醯亞胺及非聚乙二醇化黏附蛋白中分離聚乙二醇化黏附蛋白。針對使用4-分支40 kDa PEG(NOF，P/N GL4-400MA)或20 kDa雙PEG(NOF corporation，P/N DE-200MA)之聚乙二醇化，在檸檬酸鹽緩衝液(pH 6.5)中自SP FF純化黏附蛋白。在用DTT還原之後，將樣品在G25管柱上脫鹽至相同緩衝液中以移除DTT且與20 kDa雙PEG或4-分支40K PEG以2：1(PEG：黏附蛋白)比率在室溫下反應2小時，且添加過量BME來終止反應。樣品藉由Resource 15S管柱(GE #17-0944-10)純化以選擇性移除非聚乙二醇化物質(及在20 kDa雙PEG反應情況下之單聚乙二醇化物質)。使用最終製備型SEC管柱(GE #17-1071-01，Superdex200，26/60)(必要時)以移除高分子物質及不起反應之黏附蛋白。為了製備CYS-阻斷之黏附蛋白，在上述於檸檬酸鹽(pH 6.5)緩衝液中之G25脫鹽步驟之後立即添加10倍莫耳過量之NEM(Pierce Chemical)。將此反應物在室溫下培育1小時，且藉由添加過量BME來終止反應。樣品接著針對PBS大規模透析。純化之結合之黏附蛋白利用SDS-PAGE及尺寸排阻層析法分析。
未標記之以纖維連接蛋白為主支架蛋白黏合劑之純化及聚乙二醇化
將所選黏合劑選殖至無HIS6標籤之pET9d載體中且表現於大腸桿菌BL21 DE3 plysS細胞中。使用pH 6.85培養基+50μg/ml康黴素(氯化銨、檸檬酸、檸檬酸鐵銨、硫酸鎂、單水合磷酸二氫鈉、無水葡萄糖、甘油、植物蛋白腖、粒狀酵母提取物、硫酸康黴素、硫酸銨用於pH值調節)，使自單一接種之群落預先分離之25ml接種培養物生長於125ml燒瓶中直至OD 600nm達至1-2為止。10L醱酵罐(7.5L分批培養基之起始體積)在0.003之最終OD 600nm下接種。培養物在25℃下生長隔夜，且在650rpm及>30%之溶解O2含量下持續混合，同時維持 pH值。次日，溫度變換至37℃，且使培養物生長直至OD 600nm達至20-25為止。一旦達成目標OD，即將溫度變換至30℃，且用IPTG(最終濃度：1mM)誘導培養物。以40毫升培養基/公升形成體積/小時之速率添加餵養培養基(甘油、植物蛋白腖、粒狀酵母提取物、硫酸康黴素及磷酸用於pH值調節)。細胞藉由在4℃下在10,000g下離心30分鐘來收集。細胞集結粒在-80℃下冷凍。
細胞糊在1×PBS中以10毫升緩衝液/公克細胞糊之比率解凍。一旦解凍，即用UltraTurrax均質機(IKA works)破壞樣品直至均質為止。溶液接著在18,000psi下通過微射流機兩次。可溶性部分藉由在4℃下在10,000g下離心30分鐘來分離。上清液用乙酸鈉(pH 4.5)1：1稀釋，且用0.2μm過濾器淨化。將淨化之溶解物加載至用50mM乙酸鈉(pH 4.5)預平衡之SP FF管柱(SP1；GE)上。管柱接著依序用2個管柱體積之相同緩衝液及8個管柱體積之50mM乙酸鈉/350mM NaCl(pH 4.5)洗滌。蛋白質用50mM乙酸鈉/700mM NaCl(pH 4.5)溶離。基於A280下之吸光度集中溶離物。
SP1溶離物用20mM磷酸鈉(pH 6.7)1：5稀釋，且加載至用20mM磷酸鈉/100mM NaCl(pH 6.7)預平衡之SP FF管柱(SP2)上。管柱接著用2個管柱體積之相同緩衝液洗滌。蛋白質用20mM磷酸鈉/0.5M NaCl(pH 6.7)自管柱溶離。基於A280下之吸光度集中溶離物。
SP2溶離物用20mM磷酸鈉(pH 6.7)稀釋至100mM NaCl，且加載至用20mM磷酸鈉/100mM NaCl(pH 6.7)預平衡之Q FF管柱(GE)上。收集FT峰(含有產物)。管柱用平衡緩衝液洗滌直至FT峰回至基線為止。
含有工程化半胱胺酸殘基之黏附蛋白經由半胱胺酸上巰基與PEG試劑之順丁烯二醯亞胺官能基之間的邁克爾加成化學作用與PEG結合。Q FT溶離份用40 kDa分支PEG以2：1 PEG：蛋白質之莫耳比聚乙二 醇化。將樣品在室溫下培育隔夜。聚乙二醇化反應物用2份50mM乙酸鈉(pH 4.5)稀釋，且加載至用50mM乙酸鈉(pH 4.5)預平衡之SP FF管柱(GE)上。管柱用2個管柱體積之相同緩衝液洗滌。聚乙二醇化之蛋白質用50mM乙酸鈉/200mM NaCl(pH 4.5)自管柱溶離。基於A280下之吸光度集中溶離物。聚乙二醇化蛋白質使用30 kDa Millipore Biomax膜濃縮。樣品在0.22μm過濾器上過濾，且儲存在例如4℃、-20℃或-80℃下。
Fc形式化之以纖維連接蛋白為主支架蛋白黏合劑之短暫表現及純化
針對DNA產生，將所選候選物選殖至pDV-16質體中，大腸桿菌Top10細胞自該質體轉型。pDV-16為pTT5(Yves Durocher,NRC Canada)之修飾型式，其中已引入人類IgG1-Fc編碼序列，前接信號序列，且包括限制性位點以允許黏附蛋白編碼序列在Fc之任一端插入。轉型之細胞藉由以下方式擴增：接種含有100μg/ml胺苄青黴素之1L Luria培養液，且在37℃下在旋轉培育箱中在225rpm下培育18小時。細菌集結粒藉由在4℃下在>10000g下離心30分鐘來收集。經純化之質體DNA使用QIAGEN Plasmid Plus Mega套組(QIAGEN)如製造商方案中所述分離。經純化之DNA使用260nm下之吸光度定量且在-80℃下冷凍直至使用。
HEK 293-EBNA1(純系6E)(Yves Durocher,NRC Canada)細胞在37℃、5% CO2下在2L F17培養基中在10L GE Healthcare波浪袋中擴增至2×106個細胞/毫升，且藉由在18rpm下以8°角度搖晃來混合。
如下製備DNA用於轉染：將F17培養基溫至37℃。DNA及PEI轉染試劑在無菌生物安全護罩中解凍。將DNA(2.25mg)添加至無菌聚丙烯培養燒瓶中之100ml溫熱之F17培養基中，且藉由渦旋來輕輕混合。在分離燒瓶中，將6.75mg PEI(1mg/ml)與100ml預溫熱之F17培養基合併且藉由渦旋來輕輕混合。允許燒瓶靜置5分鐘，隨後藉由將 PEI溶液添加至含有DNA之燒瓶中且藉由渦旋輕輕混合來合併內含物。
在生物安全護罩中在室溫下培育15分鐘後，將含有DNA：PEI混合物之燒瓶之內含物添加至含有HEK 293-6E細胞之波浪袋中。含有轉染之HEK 293-6E細胞之袋子在37℃、5% CO2下培育二十四小時，且藉由在18 RPM下以8°角度搖晃來混合。在24小時之後，將溶解於F17培養基中之100ml無菌過濾之20%胰化蛋白N1(Organotechnie,Canada)在無菌條件下添加至培養物中。如上所述再培育72小時後，收集細胞及培養基。或者，搖瓶(0.5L培養基於2L燒瓶中)中之短暫HEK表現可在1：2之DNA：PEI比率情況下進行。細胞藉由在4℃下在6000g下離心30分鐘而與條件培養基分離。保留條件培養基，經由0.2μm過濾器過濾，且儲存在4℃下。
將條件培養基以5毫升/分鐘之速率施加至含有在PBS中預平衡之GE MabSelect Sure樹脂之10ml層析管柱中。加載過濾之條件培養基後，管柱在室溫下用至少100ml PBS洗滌。純化之產物在施加100mM甘胺酸/100mM NaCl(pH 3.0)情況下自管柱溶離。溶離份藉由以下方式在pH值方面中和：收集至含有1/6體積之1M Tris(pH 8)之管中，或者根據A280吸光度集中繼而添加1M Tris(pH 8)至100mM。若在蛋白質A溶離之後高分子量物質之含量大於5%，則樣品藉由Superdex 200(26/60)管柱(GE Healthcare)在PBS中進一步純化。將含有單體之SEC溶離份集中且濃縮。所得蛋白質A或SEC池針對PBS在4℃下澈底透析，且使用0.22μm截止過濾器無菌過濾，隨後冷凍在-80℃下。
大批製造：哺乳動物表現及一級回收：UCOE CHO系統
哺乳動物研究細胞庫(mammalian Research Cell Bank；RCB)藉由將選殖至含有遍在染色質開放元件(Ubiquitous Chromatin Opening Element；UCOE)之pUCOE載體[來自Millipore之修飾之UCOE載體]中 的抗肌肉生長抑制素黏附蛋白-Fc融合體轉染至CHO-S細胞中而建立。RCB藉由在含有12.5μg/mL嘌呤黴素之選擇培養基(0.04%(v/v)L-麩醯胺酸(Invitrogen)及0.01%(v/v)HT補充劑(Invitrogen)於CD CHO培養基(Invitrogen)中)中擴增細胞而建立。較低繼代數目細胞經由離心在無菌條件下分離，再懸浮於庫培養基(0.04%(v/v)L-麩醯胺酸(Invitrogen)、0.01%(v/v)HT補充劑(Invitrogen)及7.5%(v/v)DMSO於CD CHO培養基(Invitrogen)中)中至1×107個細胞/毫升之最終濃度。此等細胞起初在-80℃下冷凍於70%異丙醇浴液中隔夜，且接著翌日轉移至液氮中長期儲存。
細胞培養藉由將單一RCB小瓶解凍至含有12.5μg/mL嘌呤黴素之25mL選擇培養基中且在相同培養基中擴增培養物而啟動。允許細胞達至1-2×106個細胞/毫升之間的濃度，隨後拆分回0.2×106個細胞/毫升。細胞通常維持在2-4週之間，隨後接種至生物反應器。將擴增培養物最後一次繼代且允許生長至含有8L製造培養基(含有0.01%(v/v)HT補充劑(Invitrogen)、0.04%(v/v)Glutamax(Gibco)及0.005%(v/v)普洛尼克(Pluronic)F-68(Gibco)之Invitrogen CD CHO培養基)之15L生物反應器可以0.2×106個細胞/毫升之最終密度接種之時。生物反應器培養物針對VCD(活細胞密度)、生存率百分比、pH值及葡萄糖濃度每日監測。在第3天及第6天用10%總體積團式添加餵養培養基來餵養生物反應器培養物。在生存率百分比>70%情況下在第7天與第9天之間收集培養物。在培養期間，將生物反應器培養物控制在7.1之pH值、37℃之溫度、40%之DO2%及100之恆定RPM下。
在收集當天，使生物反應器培養物直接通過6.0/3.0μm深度過濾器，隨後無菌0.8/0.2μm過濾至無菌袋中。淨化之無菌培養物在2℃至8℃下儲存隔夜。淨化之培養物接著經由flatsheet TFF使用30,000 kDa膜濃縮。視收集效價而定，近似濃度為6×。濃縮之上清液接著無菌過 濾至PETG瓶中，且直接處理或儲存在-80℃下。
抗肌肉生長抑制素-黏附蛋白-Fc融合體純化
將收集之培養物上清液(不含溶劑或濃縮的)加載至用PBS預先平衡之MabSelect蛋白質A管柱上。管柱用5 CV 50mM Tris pH 8.0、1M脲、10% PG洗滌。黏附蛋白-Fc融合體用100mM甘胺酸(pH 3.3)溶離，將峰收集至預先饋有1 CV 200mM乙酸鈉(pH 4.5)之容器中。峰溶離物係基於A280下之吸光度。
蛋白質A溶離物在添加2M檸檬酸情況下稀釋至pH 3.0，且在室溫下靜置1小時，用於病毒不活化。樣品接著用200mM磷酸三鈉稀釋直至達至pH 4.5為止。必要時，溶液用水稀進一步釋以將導電率降低在10ms/cm以下。
稀釋之蛋白質A溶離物在負性捕獲模式中在用50mM乙酸鈉(pH 4.5)預先調節之Tosoh Q 600C AR(Tosoh Bioscience)上通過。基於A280下之吸光度，收集流過的峰。管柱用50mM乙酸鈉洗滌且用0.2N NaOH清除。
Q 600C AR流過物利用30K NMWCO中空纖維膜(GE)使用切向流動過濾調配，且極其輕柔地混合保留物。黏附蛋白-Fc融合體透濾至25mM磷酸鈉150mM海藻糖(pH 7.0)中持續6個透濾體積，隨後濃縮至目標蛋白質濃度。
實例2-抗肌肉生長抑制素蛋白質之生物物理學評估
尺寸排阻層析： 對由中等規模製程所得之候選黏附蛋白進行標準尺寸排阻層析(SEC)。使用Superdex 200 10/30或Superdex 75 10/30管柱(GE Healthcare)，在Agilent 1100或1200 HPLC系統上進行中等規模物質之SEC，並在A214nm及A280nm下進行UV偵測及進行螢光偵測(激發280nm、發射350nm)。針對所用SEC管柱以適當流速使用100mM硫酸鈉/100mM磷酸鈉/150mM氯化鈉(pH 6.8)之緩衝液。使用凝 膠過濾標準物(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)進行分子量校準。對中等規模純化之黏附蛋白之SEC結果展示在10 kDa近似範圍內之主要單體黏附蛋白及溶離物相對於球形凝膠過濾標準物(BioRad)，如表9及表10中所示。
熱穩定性： 進行HTPP黏附蛋白之熱掃描螢光(TSF)分析以利用相對熱穩定性對其進行篩選。樣品在PBS中歸一化至0.2mg/ml。將用PBS 1：40稀釋之1μl Sypro橙色染料添加至25μl各樣品中，且盤用透明96孔微盤黏合密封件密封。樣品使用BioRad RT-PCR機器藉由使溫度由25℃斜變至95℃，以2度/分鐘之速率掃描。資料使用BioRad CFX manager 2.0軟體分析。利用TSF獲得之Th值已展示在40℃至70℃之熔融範圍內與利用DSC獲得之Tm值充分相關。此範圍被視為此技術之可接受之工作範圍。在轉變曲線之斜率過小以致不允許其導數峰值(隨時間螢光變化率)與噪聲不同時，獲得ND(「無資料」)之結果。 「ND」結果不能作為熱穩定性之指示解釋。進行經透析之HTPP及中等規模黏附蛋白之差示掃描量熱(DSC)分析以測定其相應Tm。0.5mg/ml溶液藉由使溫度自15℃斜變至110℃，以1度/分鐘之速率在70 p.s.i壓力下在VP-毛細管差示掃描量熱計(GE Microcal)中掃描。相對於適當緩衝液之對照操作，使用最佳擬合，使用Orgin軟體(OrginLab Corp)分析資料。TSF及DSC分析之結果概述於表8至表10中。如表8至表10中所示，許多純系展現超過60℃之展開溫度，指示適於醫藥調配物之高度生物物理學穩定結構。黏附蛋白通常耐受聚乙二醇化或Fc形式化，且在穩定性方面無明顯損失。在一些情況下，此等形式提供改良之穩定性。舉例而言，作為未經修飾之黏附蛋白之3116_A07具有60℃之根據TSF之Tm，但當聚乙二醇化(ATI-1377)時，根據DSC之Tm為68℃，且在Fc-X形式(PRD-1286)中，根據DSC之Tm為66℃。
實例3-基於細胞之螢光素酶分析
螢光素酶報導體質體活化素響應元素(ARE)-luc藉由將串聯的ARE之九個重複序列連接至螢火蟲螢光素酶報導體上而產生。將質體短暫轉染至HepG2細胞中。將質體pGL4.74[hRluc/TK]共轉染以針對轉染效率歸一化。在96孔盤中每孔接種10,000個細胞。當蛋白質(諸如肌肉生長抑制素、活化素或BMP-11)添加至細胞中且結合至其同源受體上時，觸發下游SMAD信號傳導，引起經磷酸化之SMAD複合物結合至ARE。暴露於細胞之例如肌肉生長抑制素的量與所產生之螢光素酶蛋白質的量且因此與量測之螢光素酶活性成正比。當肌肉生長抑制素拮抗劑(例如抗肌肉生長抑制素黏附蛋白)與肌肉生長抑制素同時添加至細胞中時，ARE之活化減少，引起螢光素酶製造及活性減少。
在此實驗中，將(1)抗肌肉生長抑制素黏附蛋白及肌肉生長抑制素、(2)抗肌肉生長抑制素黏附蛋白及活化素A或(3)抗肌肉生長抑制素黏附蛋白及BMP-11預培育，隨後添加至細胞中。肌肉生長抑制素(R&D Systems)以10pM至500pM使用，活化素A(R&D Systems)以10pM至500pM使用，且BMP-11(R&D Systems)以10pM至500pM使用。與此等多種組合一起隔夜培育後，溶解細胞，且使用Dual-Glo Luciferase Assay System®(EnVision)量測螢光素酶活性(發光)。IC50被定義為達至肌肉生長抑制素誘導之ARE-螢光素酶活性之50%抑制所需之黏附蛋白的濃度。
如表8至表10中所示，抗肌肉生長抑制素黏附蛋白抑制ARE-luc報導體活性之肌肉生長抑制素介導之增加。
實例4-HTRF結合分析
HTRF分析用於量測抗肌肉生長抑制素黏附蛋白與肌肉生長抑制素之結合親和力。該分析為使用Eu-W1024標記作為供體螢光團且Alexa Fluor® 647作為受體螢光團之競爭性HTRF分析。生物素標記之黏附蛋白1889E01及Alexa Fluor® 647標記之rhActRIIb-Fc可在兩個不 同結合位點處同時結合肌肉生長抑制素。Eu-W1024標記之抗生蛋白鏈菌素用於結合生物素標記之1889E01。兩種螢光團Eu-W1024及Alexa Fluor® 647藉由形成1889E01/肌肉生長抑制素/ActRIIb-Fc複合物而被放在一起，且HTRF信號可在EnVision讀盤器(Perkin Elmer)上使用HTRF方案讀取。在競爭性黏附蛋白存在下，HTRF信號減少。IC50呈現於表8至表10中。
表10：Fc融合之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白之生物物理學表徵、ARE-螢光素酶報導體分析及HTRF結合分析結果.
實例5-肌肉生長抑制素誘導之SMAD2磷酸化之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白介導之抑制
人類橫紋肌肉瘤RH41細胞(DSMZ,Braunschweig,Germany)用於下文所述之12點、2點及4點抑制反應分析。將細胞自培養基中移出，且洗滌以移除血清，且在含有BSA之分析培養基中靜息4小時。細胞使用維爾烯(versene)起離燒瓶且以5×105個細胞/孔轉移至96孔V形底聚丙烯盤中。針對12點抑制反應，將與起始於1000nM之5倍稀釋濃度範圍之黏附蛋白(亦即1000nM、200nM、40nM、8nM、1.6nM、0.32nM、0.064nM、0.0128nM、0.00256nM、0.000512nM、0.000102nM、0.0000204nM)一起預培育1小時之100pM重組肌肉生長抑制素(R&D Systems)添加至細胞中。針對4點抑制反應，將與一定濃度範圍之黏附蛋白(30nM、3nM、0.1nM或0.001nM)一起預培育1小時之100pM肌肉生長抑制素添加至細胞中。針對2點抑制反應，將與一定濃度範圍之黏附蛋白(10nM或0.5nM)一起預培育1小時之100pM肌肉生長抑制素添加至細胞中。細胞用肌肉生長抑制素-黏附蛋白混合物在37℃下處理1小時以誘導SMAD2磷酸化(pSmad2)。刺激藉由將細胞置放在冰上且添加冰冷的PBS來終止。細胞根據標準方案集結且溶解，且使用ELISA分析(Cell Signaling Technologies)偵測SMAD2磷酸化。利用黏附蛋白之濃度範圍達成之抑制使用GraphPad Prism軟體作圖，且將資料點歸一化至給出100%及0%抑制之對照。IC50被定義為達至肌肉生長抑制素誘導之SMAD2磷酸化之50%抑制所需之黏附蛋白的濃度。表11中呈現之資料指示自親本純系1979_B06及2062_G02之親和力最佳化獲得之黏附蛋白均有力且完全抑制肌肉生長抑制素誘導之pSMAD磷酸化，且展示在0.78nM至0.06nM範圍內之IC50值。此表示相較於親本純系1979_B06(IC50=12.8nM)及2062_G02(IC50=59.1nM)在IC50值方面大於16至75倍改良。
表11. 抗肌肉生長抑制素黏附蛋白對SMAD2磷酸化(pSMAD2)之抑制
實例6-抗肌肉生長抑制素黏附蛋白之SPR親和力量測使用SPR形式A之黏附蛋白結合動力學
抗人類Fc抗體(Biacore/GE)根據製造商說明書經由NHS/EDC偶合固定在Biacore CM5晶片上。在參考及活性流槽兩者上捕獲ActRIIb-Fc(R&D Systems)，隨後僅在活性流槽上捕獲人類肌肉生長抑制素(R&D Systems)、人類BMP-11(GDF-11；R&D Systems)或人類活化素A(R&D Systems)(各者根據製造商建議方案溶解且在HBSP運作緩衝液 中稀釋)。在HBSP運作緩衝液中在所有流槽上施加一定濃度範圍之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白。循環之間的晶片表面再生用3M MgCl2之兩次30秒脈衝實現。減去參考之感測器圖譜之動力學描繪圖使用Biaevaluation軟體擬合成1：1結合模型。Biacore動力學資料之概述展示於表12中。
表12中展示之資料指示與分別展示29nM及49之KD之親本黏附蛋白1979_B06及2062_G02相比，最佳化之子代黏附蛋白緊緊結合肌肉生長抑制素，其中KD在0.06nM至1.47nM範圍內。
在聚乙二醇化後，肌肉生長抑制素親和力存在一些損失，其中KD在0.76nM至14.4nM範圍內，不過在ARE-螢光素酶分析中聚乙二醇化對效力無作用(參見表8及表9)。
相較於BMP-11之黏附蛋白選擇性在完全無選擇性至至多17倍範圍內，而對活化素之結合或極弱或不存在，提示相較於活化素之較高選擇性。
使用SPR形式B之黏附蛋白結合動力學(適用於Fc形式化之黏附蛋白)
人類肌肉生長抑制素(R&D Systems)、人類BMP-11(GDF-11；R&D Systems)或人類活化素A(R&D Systems)根據製造商提示方案溶解，且使用標準NHS/EDC偶合在乙酸鹽(pH 4.0或pH 4.5)緩衝液中以1μg/mL至10μg/mL固定在Biacore CM5晶片上。將一定濃度範圍之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白施加於HBSP運作緩衝液中。循環之間的晶片表面再生用60秒之10mM至50mM NaOH實現。減去參考之感測器圖譜之動力學描繪圖使用Biaevaluation軟體擬合成1：1結合模型。針對Fc形式化之黏附蛋白，相互作用動力學即使在較低固定化密度下亦由二價Fc與二聚肌肉生長抑制素之親合力驅動。Biacore動力學資料之概述展示於表12中。表12中展示之資料指示此SPR形式中運作之一些黏附蛋白結合肌肉生長抑制素及BMP-11，且亦以相似親和力結合活化 素。然而，ARE-螢光素酶分析中相較於活化素之實質上選擇性提示活化素之親和力在此SPR分析形式中經人為增強。
實例7-抗肌肉生長抑制素黏附蛋白之溶液相親和力
PRD-1474(一種Fc融合之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白)對肌肉生長 抑制素之溶液親和力使用動力學排除分析(KinExA)量測。PRD-1474之一式四份的滴定用肌肉生長抑制素在2nM(n=2)、1nM(n=1)及0.7nM(n=1)之單體濃度下進行。相對未結合之肌肉生長抑制素濃度藉由以下方式量測：在ATI-1310固體基質(經由工程化游離半胱胺酸偶合至聚丙烯醯胺珠粒)上捕獲，隨後用可與黏附蛋白同時結合肌肉生長抑制素之肌肉生長抑制素共受體ActRIIB-Ig之螢光標記之構築體偵測。ATI-1310為與PRD-1474競爭結合至肌肉生長抑制素且允許捕獲未結合肌肉生長抑制素之相關黏附蛋白。表13中所示之整體Kd分析給出170pM之Kd，且95%置信區間為330pM至60pM。PRD-1177及ATI-1338之親和力亦使用相同分析形式量測。PRD-1177之一式三份的滴定用肌肉生長抑制素在1nM(n=2)及0.8nM(n=1)之單體濃度下進行。ATI-1338之一式三份的滴定用肌肉生長抑制素在5nM(n=1)、1.6nM(n=1)及1.4nM(n=1)之單體濃度下進行。此等分析指示PRD-1177以250pM之整體Kd值及340pM至130pM之95%置信區間結合肌肉生長抑制素(表13)。ATI-1338以850pM之整體Kd值及1400pM至330pM之95%置信區間結合肌肉生長抑制素。
實例8-3116_A06之突變分析
為了理解環位置對突變之相對耐受性，進行兩個相似但獨立的研究。第一個為傳統丙胺酸掃描，其中黏附蛋白3116_A06(SEQ ID NO：118)之環中之不連續丙胺酸突變的結合及功效在基於生物化學及細胞之分析中評估。第二個研究由深度突變掃描組成，其中吾人建立3116_A06(SEQ ID 118)之相同位置中之單一位點突變之文庫，但用20 個可能的胺基酸取代各位置。此等文庫組分接著表現為蛋白質-mRNA融合體且經受單輪mRNA展示(如第IV部分中所描述)，使用抗生蛋白鏈菌素磁性珠粒使與生物素標記之肌肉生長抑制素相關之文庫組分與保持未結合者分離。在此方法中，輸入及結合群體之下一代定序允許測定各序列之相對增濃/耗竭，反映其對肌肉生長抑制素之固有親和力。
丙胺酸掃描：PCR定點變突誘發用於在BC環(殘基25-33)、DE環(殘基55-58)及FG環(殘基80-89)中之3116_A06(SEQ ID NO：118)中建立單一位點丙胺酸突變。純系表現於大腸桿菌中且藉由如實例1中所描述之HTPP純化。尺寸排阻層析法(SEC，如實例2中所描述)證實所有丙胺酸取代之蛋白質主要為單體(表14)。進行ARE-螢光素酶(實例3)及HTRF分析(實例4)兩者。在HTRF競爭結合分析中，效力在IC50=1.5nM至>100nM範圍內(表14)。大多數位置在HTRF分析中在某種程度上耐受丙胺酸取代，其中例外為DE環之Gly55、Arg56及Gly57，對其結合急劇減少(IC50>100nM)。較小作用出現在BC環之Gly30及FG環之Val80、Thr81及Tyr88位置上，其仍然展示結合但相對於親本序列(「WT」)在IC50方面展示>10倍增加。在基於ARE-螢光素酶細胞之分析中，突變之效力在IC50=0.6nM至>100nM範圍內(表14)。丙胺酸突變之影響相對於HTRF分析在基於細胞之分析中通常較大。DE環之Gly55、Arg56及Gly57及FG環之Val80及Tyr88均在此分析中展示急劇降低之效力，其中IC50>100nM。對BC位置Leu26、Pro27、His28、Gly30及Asn33及FG位置Thr81、Tyr85及Leu86觀察到較緩和作用，其均具有大於親本序列10倍之IC50。
*SEC 1：高度單體；SEC 2：大部分單體
深度突變掃描：高通量定序與蛋白質展示組合以允許在對於如上述之傳統方法而言將繁重的規模上，同時量測每一可能的單一位點環突變之相對適合度(關於「深度突變掃描」方法之綜述，參見Araya等人，Trends in Biotechnology 29：435-442,2011；一種類似方法進一步例示於Forsyth等人，mAbs 5：523-532,2013中)。
文庫構建及選擇：建立三個各別文庫，該等文庫含有3116_A06(SEQ ID NO：118)之三個環：BC環(位置25-33)、DE環(位置55-58)及FG環(位置80-89)中之各者中的每一的可能的單一位點突變。針對各環，設計多個寡核苷酸，該等寡核苷酸在各位置處個別地併有NNK密碼子，其中N=A、C、G、T且K=G、T。使用此等簡併密碼子允許在併有NNK之位置處所有20個胺基酸(加上終止密碼子)之編 碼。寡核苷酸經由重疊延伸PCR組裝以產生全長黏附蛋白文庫，其中Lib-BC含有3116_A06之每一個胺基酸BC環突變，Lib-DE含有3116_A06之每一個胺基酸DE環突變，且Lib-FG含有3116_A06之每一個胺基酸FG環突變。三個文庫使用PROfusion根據Xu等人，Chemistry & Biology 9：933-942,2002表現為mRNA-蛋白質融合分子。Lib-BC、Lib-DE及Lib-FG PROfusion分子針對3nM生物素標記之肌肉生長抑制素各別地選擇，且結合分子隨後在抗生蛋白鏈菌素磁性珠粒上捕獲。黏合劑使用100mM KOH自珠粒溶離。自珠粒溶離之分子表示可仍然結合至肌肉生長抑制素之3116_A06之變異體，而存在於初始文庫中但並不見於溶離物中之分子表示同樣不結合至肌肉生長抑制素之3116_A06的變異體。
NGS條形編碼及混合：自三個文庫(Lib-BC、Lib-DE及Lib-FG)中之各者獲得之兩個群體輸入(在肌肉生長抑制素結合之前)及黏合劑(選擇後自珠粒溶離)經各別地收集及擴增。各群體附加由PCR條形編碼之5'-TruSeq通用接附子、3'-Truseq接附子II及獨特的6-核苷酸。總共六個條形編碼之群體接著基於各環中隨機化殘基之數目個別地定量及混合(Lib-BC：Lib-DE：Lib-FG=9：4：10)，以便獲得在統計學上每隨機化位置序列之相似數目。集中之樣品利用MiSeq 150bp雙端(Illumina)下一代定序來定序。
NGS資料分析：來自下一代定序之正向讀取序列將根據突變胺基酸之群體、突變位置及身分裝箱。所有品質不良之序列及含有多個突變位點之序列均自分析中剔除。接著，選擇後群體中各序列之頻率除以其在輸入群體中之頻率以得出增濃比率(ER)。親本序列(WT，其充當陽性對照)及含有終止密碼子之序列(其充當陰性對照，代表機遇存活之背景噪聲)之ER的比較展示信號與背景之比率(S/B)在三個環之間變化，估計可能由於各環文庫個別地完成選擇。為此，每一序列均歸一化至平均終止及平均wt ER以用於其自身特定環，以得出ERnorm。
深度突變掃描藉由將單一位點丙胺酸突變之相對適合度與來自傳統丙胺酸掃描之生物化學資料比較來驗證。總體而言，相關性十分強(圖8)。NGS ER定義環上丙胺酸突變之增濃及耗竭之概況，其與HTRF及ARE-螢光素酶分析中觀察到之影響充分相關。
生物化學HTRF IC50亦針對各丙胺酸突變相對於NGS ERnorm直接作圖，如圖9中所示。
基於丙胺酸相關性，建立三個類別，所有單一位點胺基酸突變均可經由其NGS增濃比率裝箱至該等類別中：最佳突變(ERnorm>0.8)、更佳突變(ERnorm>0.5)及較佳突變(ERnorm>距環平均ER stop 之3倍標準偏差)。定義後面類別之ERnorm之下限對三個環不同：BC=0.25；DE=0.15；FG=0.35。3116_A06之環中之所有單一位點突變均根據其歸一化之增濃比率裝箱以測定各位置對突變之相對耐受性(表15)。
使用全部深度突變掃描資料，BC環位置25、26、27、30、32及33、DE環位置55、56及57及FG環位置80及88似乎最保守，其中此等位置處之僅單一或幾個胺基酸類型維持結合至肌肉生長抑制素。另一方面，其他位置對突變高度耐受，包括BC環位置28、29及31以及FG環位置82、83及87。
實例9-抗肌肉生長抑制素黏附蛋白藥物動力學之評估
為了研究具有不同聚乙二醇化形式之黏附蛋白之藥物動力學概況，抗肌肉生長抑制素黏附蛋白2987_H07用2-分支40 KD PEG(ATI-1338)、4-分支40 KD PEG(ATI-1339)及雙20 KD PEG(ATI-1341)形式化。使用此三種聚乙二醇化黏附蛋白之皮下投與之單次劑量研究在C57BL6小鼠中進行。總藥物濃度藉由ELISA分析來測定。用於定量ATI-1338之生物分析PK免疫分析使用標準夾心形式ELISA分析，其中1338使用HIS-標籤蛋白質之單株抗體捕獲，接著使用多株抗PEG抗體偵測。如表16中所示，兩種40 KD聚乙二醇化形式ATI-1338及ATI-1339與雙-20 KD聚乙二醇化形式ATI-1341相比提供較顯著藥物動力學增強(亦即，較長半衰期(t1/2)及較高劑量歸一化暴露)。
在靜脈內及皮下投與Fc融合之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白(PRD-1177、PRD-1286及PRD-1474)之後的單次劑量研究在C57BL6小鼠中進行以評估Fc-融合體對藥物動力學參數之作用。總藥物濃度藉由ELISA分析來測定。用於PRD1177、1474及1286之Fc結合物之定量之生物分析PK免疫分析均使用利用ECL技術的標準夾心形式ELISA分析，其中1177用支架黏附蛋白之多株抗體捕獲，接著用抗人類IgG抗體偵測。如表17中所示，所有三種Fc融合之黏附蛋白與聚乙二醇化黏附蛋白ATI-1338(25h)相比均具有較長半衰期(58-172h)。較低SC生物利用度可能反映在生物分子之間質及淋巴轉運期間的蛋白水解。基於公開文獻(例如Richter等人，AAPS J.2012；14：559-70)，Fc融合之黏附蛋白之SC生物利用度在合理範圍之內。
實例10-抗肌肉生長抑制素黏附蛋白抑制之機制
競爭性ELISA：評估抗肌肉生長抑制素黏附蛋白與ActRIIB受體競爭結合肌肉生長抑制素之能力的競爭性結合分析使用競爭性ELISA 進行。Nunc Maxisorp盤在4℃下用含2μg/mL ActRIIb-Fc(R&D Systems)之0.2M碳酸鈉pH 9.6緩衝液塗佈隔夜。在用PBS-T(含有0.05% Tween-20之PBS)洗滌之後，孔在25℃下在振盪情況下用OptEIA緩衝液(BD Biosciences)封閉1小時。肌肉生長抑制素(10nM；R&D Systems)用一定濃度範圍之黏附蛋白或ActRIIb-Fc競爭劑(0.2pM至1μm)在OptEIA緩衝液中在25℃下在振盪情況下預培育1小時。封閉及塗佈之分析盤用PBS-T洗滌，隨後添加肌肉生長抑制素/競爭劑混合物且在25℃下在振盪情況下培育30分鐘。分析盤用PBS-T洗滌，此後結合之肌肉生長抑制素在25℃下在振盪情況下用在OptEIA中稀釋之1：1000生物素標記之山羊抗肌肉生長抑制素多株(R&D Systems)偵測持續1小時。在用PBS-T洗滌之後，添加在OptEIA中稀釋之1：5000抗生蛋白鏈菌素-HRP(Thermo/Pierce)，隨後在25℃下在振盪情況下培育30分鐘。分析盤用TMB(BD Biosciences)顯影，用2N硫酸淬滅，且在A450下讀取吸光度。如圖10中所示，正如所料，溶液中之ActRIIb-Fc完全阻斷肌肉生長抑制素結合至塗佈在盤上之ActRIIb-Fc。然而，相比之下，PRD-1288(僅在連接子序列方面與PRD-1474不同)、PRD-1285及PRD-1286在至多1μm之濃度下不阻斷肌肉生長抑制素結合ActRIIb。
競爭SPR：評估抗肌肉生長抑制素黏附蛋白與I型及II型受體競爭結合肌肉生長抑制素或BMP11(作為肌肉生長抑制素之替代品)之能力的競爭性結合分析亦使用SPR在Biacore T100儀器上在兩種不同實驗形式中進行。在「SPR形式A」中，感測器晶片表面藉由將含100μg/ml蛋白質A(Pierce)之10mM乙酸鹽(pH 4.5)使用標準乙基(二甲基胺基丙基)碳化二亞胺(EDC)/N-羥基丁二醯亞胺(NHS)化學作用(用乙醇胺阻斷)固定在CM5感測器晶片(Biacore/GE Healthcare)上至4500 RU來製備。ALK4-Fc(R&D Systems)、ALK5-Fc(R&D Systems)、 ActRIIB-Fc(內部製造)、與ActRIIB競爭結合至肌肉生長抑制素但不與3116A06競爭結合至肌肉生長抑制素之抗肌肉生長抑制素/BMP11單株抗體(mAb-A)(內部製造)或濃度為7μg/ml至13μg/ml之黏附蛋白-Fc PRD-1474使用以10微升/分鐘注射60秒經由Fc尾區捕獲至1600 RU至4300 RU的表面密度。競爭實驗藉由以下方式進行：使100nM肌肉生長抑制素(R&D Systems)或BMP11(R&D Systems)在此等表面上在200nM黏附蛋白ATI-1523不存在或存在下以30微升/分鐘流速流動，其中結合及解離時間為180秒。用於固定及競爭實驗之運作緩衝液為10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA及0.05% v/v界面活性劑P20(pH 7.4)，且表面在循環之間使用10mM甘胺酸(pH 1.5)以30微升/分鐘兩次注射30秒而再生。
在SPR形式A中，BMP11特異性結合至ALK4-Fc、ALK5-Fc、ActRIIB-Fc、mAb-A及PRD-1474表面，而肌肉生長抑制素特異性結合至ActRIIB-Fc、mAb-A及PRD-1474而非ALK4-Fc或ALK5-Fc。為了評估ATI-1523對肌肉生長抑制素或BMP11結合之作用，在180秒結合階段結束時將對各蛋白質之結合反應各自歸一化至100%，且與在ATI-1523存在下對肌肉生長抑制素或BMP11之結合反應相比(表18)。正如所料，ATI-1523完全阻斷肌肉生長抑制素或BMP11結合至對照PRD-1474表面。在評估ATI-1523阻斷肌肉生長抑制素與ALK4-Fc或ALK5-Fc之相互作用之能力的分析中，將亦結合至ALK4-Fc及ALK5-Fc之BMP-11用作肌肉生長抑制素之替代品，因為在此實驗形式下單獨肌肉生長抑制素不顯著結合至ALK4-Fc及ALK5-Fc。ATI-1523顯著降低BMP11對ALK4-Fc(98%降低)及ALK5-Fc(69%降低)之結合信號，提示黏附蛋白與I型受體競爭結合至肌肉生長抑制素。相比之下，觀察到ActRIIB-Fc或mAb-A表面上肌肉生長抑制素/ATI-1523或BMP11/ATI-1523複合物之結合反應增加，提示肌肉生長抑制素/ATI-1523或 BMP11/ATI-1523複合物能夠結合至此等表面，亦即黏附蛋白與ActRIIB-Fc或mAb-A為非競爭性的。ActRIIB-Fc及mAb-A表面上肌肉生長抑制素/ATI-1523複合物之結合反應中之較大增加(>1000%增加)與黏附蛋白對肌肉生長抑制素具有溶解作用一致。
使用「SPR形式B」之黏附蛋白競爭：對於抗肌肉生長抑制素黏附蛋白之作用之機制在「SPR形式B」中進一步評估，其中肌肉生長抑制素或BMP11(10μg/ml於10mM乙酸鹽(pH 4.5)中)使用EDC/NHS偶合化學作用直接固定在CM5感測器晶片表面上至985 RU(肌肉生長抑制素)或530 RU(BMP11)之密度。此時，對單獨注射(2μM以30微升/分鐘持續180秒)之受體ALK4-Fc(R&D Systems)、ALK5-Fc(R&D Systems)或ActRIIB-單體(內部製造)之結合反應與黏附蛋白-Fc融合體PRD-1474預結合至表面(1μM以30微升/分鐘持續480秒)之後對此等受體的結合反應相比。用於固定及競爭實驗之運作緩衝液為10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA及0.05% v/v界面活性劑P20(pH 7.4)，且表面在循環之間使用50mM NaOH以30微升/分鐘4次注射15秒而再生。
在PRD-1474不存在下，各受體特異性結合至固定化之BMP11，而僅ALK5-Fc及ActRIIB-單體而非ALK4-Fc結合至固定化之肌肉生長抑制素。PRD-1474之預結合顯著降低ALK4-Fc對BMP11之結合信號 (70%降低)且亦降低ALK5-Fc對肌肉生長抑制素或BMP11之結合(35%至41%降低)，但對ActRIIB-單體結合至肌肉生長抑制素或BMP11表面具有最小影響，表19。此等資料連同來自「SPR形式A」之SPR競爭資料(表18)、競爭性ELISA資料(圖10)及ARE-螢光素酶分析中觀察到之肌肉生長抑制素信號傳導之完全抑制(圖11)一起展示黏附蛋白作用機制為阻斷I型信號傳導受體(ALK4/5)之募集，及黏附蛋白不與II型受體(ActRIIB)競爭結合。
由於此等黏附蛋白代表本發明中例示之序列家族，且明確界定之序列家族內之個別純系維持相同結合位點，故由本發明涵蓋之序列藉由阻斷ALK4/5募集至肌肉生長抑制素-ActRIIb複合物來起作用。
藥物動力學資料進一步指示肌肉生長抑制素-黏附蛋白複合物含量隨時間累積，且此等複合物結合至ActRIIb，由此充當不依賴於游離藥物之信號傳導之主要負性抑制劑。此獨特機制將本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白與文獻(例如US 7632499)中描述之抗肌肉生長抑制素抗體區分開來，且指示本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白具有增加之活性。
實例11：使用HDX-MS定位肌肉生長抑制素上之黏附蛋白結合位點：
肌肉生長抑制素上之黏附蛋白結合位點使用氫-氘交換質譜分析(HDX-MS)進一步評估。
氫/氘交換質譜分析(HDX-MS)方法藉由監測主鏈醯胺氫之氘交換速率及程度來探查溶液中之蛋白質構形及構形動力學。HDX之含量視主鏈醯胺氫之溶劑可接近性及蛋白質之構形而定。HDX時蛋白質之質量增加可利用MS精確地量測。當此技術與酶促消化成對時，可獲得在肽水準下之結構特徵，能夠實現表面暴露之肽與摺疊在內部之肽或在蛋白質-蛋白質複合物界面處螯合之肽的區分。通常進行氘標記及後續淬滅實驗，隨後進行線上胃蛋白酶消化、肽分離及MS分析。
由於發現單獨肌肉生長抑制素在生理學上相關pH值條件下對HDX-MS具有不適宜地較低溶解度(<10μg/ml)，故吾人使用增加肌肉生長抑制素溶解度之替代策略，該策略藉由使蛋白質與來自mAb-A之Fab片段(Fab-A)複合來進行，該Fab片段使用實例10中所述之SPR實驗展示為與黏附蛋白為非競爭性的。HDX-MS樣品之寡聚狀態利用連接至多角度雷射光散射偵測器之尺寸排阻層析法(SEC-MALS)表徵，其中肌肉生長抑制素/Fab-A複合物(約120 kDa)之MALS測定之質量與結合至兩個Fab-A分子之一個肌肉生長抑制素均二聚體的預期化學計量一致，且肌肉生長抑制素/Fab-A/3116_A06複合物(142 kDa)之MALS測定之質量與結合至兩個Fab-A分子加上兩個3116_A06分子之一個肌肉生長抑制素均二聚體的預期化學計量一致。
在定位利用HDX-MS由黏附蛋白3116_A06識別之肌肉生長抑制素上之黏附蛋白結合位點之前，進行非氘化實驗以產生一系列常見胃酶解肽以用於來自肌肉生長抑制素/Fab-A(各自在30μM下1：1莫耳比)及肌肉生長抑制素/Fab-A/3116_A06(各自在30μM下1：1：1莫耳比)樣品之肌肉生長抑制素，達成針對肌肉生長抑制素之83.5%之序列覆蓋率。在此實驗中，在標記步驟期間使用10mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.0)，隨後添加淬滅緩衝液(具有4M GdnCl及0.5M TCEP之200mM磷酸鹽緩衝液，pH 2.5，1：1，v/v)。針對黏附蛋白結合位點定位實驗，將5μL 各樣品(肌肉生長抑制素/Fab-A或肌肉生長抑制素/Fab-A/3116_A06)與65μL HDX標記緩衝液(10mM磷酸鹽緩衝液於D2O中，pD 7.0)混合以在室溫(約25℃)下啟動標記反應。反應進行不同時間段：20秒、1分鐘、10分鐘、60分鐘及240分鐘。截至各標記反應階段結束之時，反應藉由添加淬滅緩衝液(1：1，v/v)來淬滅，且將淬滅之樣品注射至Waters HDX-MS系統中以用於分析。在3116_A06不存在/存在下針對所觀察之常見胃酶解肽之氘攝取程度對其進行監測。
自HDX-MS量測獲得之實驗資料指示黏附蛋白3116_A06識別不連續黏附蛋白結合位點，該黏附蛋白結合位點在肌肉生長抑制素中包含兩個肽區域：區域1：LYFNGKEQIIYGKIPAM(85-101)；SEQ ID NO：329
區域2：PHTHLVHQANP(56-66)；SEQ ID NO：330
基於相對氘攝取程度，兩個肽區域可排序為區域1>2，且區域1在氘攝取中具有最顯著變化。
實例12-黏附蛋白3116_A06計算機對接至肌肉生長抑制素上
使用計算方法來產生與HDX-MS資料一致之3116_A06-肌肉生長抑制素複合物之結構模型(圖13)。3116_A06蛋白質對接至人類肌肉生長抑制素之結構(自蛋白質資料庫獲取之PDB 3HH2，www.rcsb.org；Cash等人，EMBO J.28：2662-2676,2009)中如Accelrys軟體Discovery Studio v3.5(Accelrys)中所實施使用ZDOCK(Chen及Wang,Proteins 47：281-294,2002)進行。ZDOCK方案利用兩個蛋白質結構之剛體對接(配位體=3116_A06且受體=肌肉生長抑制素)。針對含有3116_A06FG(殘基Thr79至Tyr88)及BC(殘基Ser25至N33)環之構形之複合物，過濾對接位置。基於界面殘基之互補性連同由黏附蛋白突變誘發鑑別之環有利取代之相關性，選擇較佳複合物。圖13A展示定位至肌肉生長抑制素結構上之ALK4結合位點及ActRIIB結合位點(灰色)。如實例11 中所描述由HDX-MS實驗鑑別之區域1及區域2以黑色指示。圖13B展示來自對接之較佳複合物，其中3116_A06之BC、DE及FG環(黑色)以棍形式繪製，且肌肉生長抑制素之區域1及2(灰色)以空間填充形式表示。鑑別為環有利突變之若干殘基展示關鍵貢獻。舉例而言，在3116_A06之BC環中，殘基Ser25、Leu26及Pro27因維持總體環構形之結構限制而為重要的。相比之下，Ala32裝配至在複合物界面處形成之較小疏水性裂隙中，且殘基主鏈與肌肉生長抑制素形成氫鍵。位置32處之最佳取代為Gly或Leu，且預測其充分適合代替丙胺酸。類似地，Asn33參與肌肉生長抑制素之鄰近色胺酸殘基之氫鍵。位置33處之最佳取代為His及Gln，其亦含有可作為氫鍵供體貢獻之側鏈。DE環中之殘基為關鍵的：最有利的取代限於Gly55、Arg56及Gly57，且僅保守取代針對Val58較佳。在模型結構中，Arg56為貢獻與區域1中肌肉生長抑制素之Y86相互作用之π陽離子以及與其他區域1殘基之主鏈及側鏈之其他氫鍵的關鍵殘基。對於許多FG環殘基，最佳取代為保守性置換。經鑑別之一個關鍵位置為Tyr88，其具有π陽離子相互作用及與來自肌肉生長抑制素之區域2之Y55及其他殘基的π-π相互作用。FG環亦涉及與自突變誘發實驗鑑別之區域1及2兩者之若干疏水性相互作用。此等計算展示與HDX-MS及SPR實驗資料之最佳一致。
實例13-肌肉骨骼功效之活體內小鼠模型
雄性B6.SCID小鼠(9-13週大，Jackson Laboratories,Bar Harbor,Maine)圈養於具有逆轉12小時明/暗週期之溫度控制室中。水及標準食物可隨意獲取。將小鼠隨機化且分佈在治療組之間以基於體重(約20-22g)接受對照或本發明之測試化合物。為了展示本發明之化合物之活體內功效，藉由皮下注射每週一次(Fc-融合體抗肌肉生長抑制素黏附蛋白)或每週兩次(聚乙二醇化抗肌肉生長抑制素黏附蛋白)投與化 合物。向動物中投與於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中之測試化合物。用僅復原緩衝液治療對照。在14天時段內用例如5、6或10毫克/公斤/週之本發明之化合物皮下給予測試動物(n=8-10隻小鼠/組)。在隨機化前、在隨機化當天及在治療階段期間一週兩次或三次及在研究結束時記錄體重量測值。在研究結束時藉由定量磁共振成像(MRI，Echo Medical Systems,Tex)分析自身體遺骸記錄小腿肌肉質量。將測試組與對照組相比。結果展示與對照小鼠(例如與對照相比肌肉體積增加約7%-10%)相比，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白使體重百分比自基線增加(圖14)，且對骨骼肌體積具有顯著合成代謝作用(圖15)。
磁共振成像(MRI)
在具有16cm孔之Bruker PharmaScan 4.7 Tesla(Bruker Biospin,Billerica,Ma.USA)上進行腿肌肉體積量測之MRI。62mm體積線圈用於發射器及接收器。在收集小腿之定位器圖像之後，使用軸向切片計劃獲得T2權重圖像。快速自旋回波(RARE)順序由90°Hermite脈衝繼而180°Hermite脈衝組成，其中TR/TE=2000/23ms。自膝頂至踝關節中收集十一個軸向切片，其中矩陣尺寸為256×128個資料點。視場為5cm×2.5cm，具有1.25mm切片厚度及4及8個信號平均值之RARE因數。腿肌肉體積藉由將所有軸向切片面積之總和乘以各腿中總肌肉體積之1.25mm切片厚度來計算。圖像藉由圖像序列分析(ISA,Bruker Biospin,Billerica,Ma)作為相關區域(ROI)之面積平均值分析。在腿肌肉周圍繪製手動ROI，排除皮膚及皮下脂肪面積。兩腿之總平均肌肉體積展示於圖15中。
亦用相同MRI掃描器進行作為安全終點之心臟容積之MRI。在獲得胸部區域之初始定位器圖像之後，自心尖之大血管中收集9個軸向圖像。與腿肌肉之分析類似，軸面積加上且乘以1.25mm之切片厚度以獲得各動物之總心臟容積。利用MRI未觀察到心臟容積之顯著變 化。
統計
組間差異使用史都登氏(student's)t檢驗2尾配對分析來評估。
實例14-PRD-1474對活體內肌肉生長之功效
如實例10中所描述維持及治療雄性B6.SCID小鼠(n=10隻/組)，其中例外為PRD-1474以如圖16中指示之多種劑量投與，且治療之持續時間為28天。1mg/kg之PRD-1474展示出與PBS對照組相比小腿肌肉體積之顯著11.1%增加(p<0.0001)。亦分別在10mg/kg、30mg/kg及100mg/kg之PRD-1474情況下觀察到27.7%、29.7%及32.8%之小腿肌肉體積的顯著增加。相對於對照在所有治療劑量組中均未觀察到心臟容積之變化。資料以平均值±標準偏差之形式呈現。多種劑量組使用ANOVA比較。(*p<0.0001；#組間不顯著)。
資料展示本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白在顯著較低劑量下與先前所述之肌肉生長抑制素抑制劑(例如US 7632499,J.Clin.Onclo.30(增刊)：摘要.2516,2012)相比為有效的。因此，本發明之抗肌肉生長抑制素黏附蛋白當單獨或與其他肌肉生長抑制素抑制劑或其他藥物組合投與時，提供在較低劑量與降低之不當副作用組合下增加之功效，用於治療本文所述之肌肉耗損及代謝疾病。
實施例
1. 一種包含纖維連接蛋白III型第十結構域(10Fn3)之多肽，其中該10Fn3具有至少一個選自以下之環：相對於人類10Fn3結構域之相應環之序列胺基酸序列發生改變的環BC、DE及FG，且其中該多肽結合肌肉生長抑制素。
2. 如實施例1之多肽，其中該多肽以小於500nM之KD結合肌肉生長抑制素。
3. 如實施例1或2之多肽，其中該BC環包含根據式X1-L-P-X2- X3-X4-X5-X6-X7之胺基酸序列，其中，(a)X1係選自由以下組成之群：S、T及Y；(b)X2係選自由以下組成之群：H、Y、N、R、F、G、S及T；(c)X3係選自由以下組成之群：A、P、Q、S、F、H、N及R；(d)X4係選自由以下組成之群：G及A；(e)X5係選自由以下組成之群：H、L、R、V、N、D、F、I及K；(f)X6係選自由以下組成之群：A、L、G、M、F、I及V；及(g)X7係選自由以下組成之群：H及N。
4. 如實施例3之多肽，其中X1為S。
5. 如實施例3或4之多肽，其中X2為H或Y。
6. 如實施例3至5中任一項之多肽，其中X3為A或P。
7. 如實施例3至6中任一項之多肽，其中X4為G。
8. 如實施例3至7中任一項之多肽，其中X5為H、L或R。
9. 如實施例3至8中任一項之多肽，其中X6為A或L。
10. 如實施例3至9中任一項之多肽，其中X7為H。
11. 如實施例3之多肽，其中該BC環包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：7、11-21、23-31、34及36-38。
12. 如實施例11之多肽，其中該BC環包含SEQ ID NO：34中所述之胺基酸序列。
13. 如前述實施例中任一項之多肽，其中該DE環包含根據式G-R-G-X8之胺基酸序列，其中X8為V或L。
14. 如前述實施例中任一項之多肽，其中該DE環包含選自由以下組成之群的胺基酸：SEQ ID NO：39及42。
15. 如實施例14之多肽，其中該DE環包含SEQ ID NO：39中所述之胺基酸序列。
16. 如前述實施例中任一項之多肽，其中該FG環包含根據式X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18之胺基酸序列，其中(a)X9係選自由以下組成之群：L、V及I；(b)X10係選自由以下組成之群：T及S；(c)X11係選自由以下組成之群：K、R、A、G、S、D、H、N、T及P；(d)X12係選自由以下組成之群：S、T、A、E、H、K及N；(e)X13係選自由以下組成之群：K、G、Q、D、E、N、T及S；(f)X14係選自由以下組成之群：V、I、F、L、M、P、T及Y；(g)X15係選自由以下組成之群：I、L及Y；(h)X16係選自由以下組成之群：H、I、V、K、L、R、F、G、S及T；(i)X17係選自由以下組成之群：Y及H；及(j)X18係選自由以下組成之群：K、M、L、R及V。
17. 如實施例16之多肽，其中X9為L或V。
18. 如實施例16或17之多肽，其中X10為T。
19. 如實施例16至18中任一項之多肽，其中X11為K或R。
20. 如實施例16至19中任一項之多肽，其中X12為S或T。
21. 如實施例16至20中任一項之多肽，其中X13為K、G或Q。
22. 如實施例16至21中任一項之多肽，其中X14為V或I。
23. 如實施例16至22中任一項之多肽，其中X15為I。
24. 如實施例16至23中任一項之多肽，其中X16為H、I或V。
25. 如實施例16至24中任一項之多肽，其中X17為Y。
26. 如實施例16至25中任一項之多肽，其中X18為K或M。
27. 如前述實施例中任一項之多肽，其中該FG環包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：46、50-62、64-72、75-77及 79。
28. 如實施例27之多肽，其中該FG環包含SEQ ID NO：75中所述之胺基酸序列。
29. 如實施例1或2之多肽，其中該BC環包含根據式X19-X20-P-X21-G-X22-A之胺基酸序列，其中(a)X19係選自由以下組成之群：D、E、V及W；(b)X20係選自由以下組成之群：A、S及V；(c)X21係選自由以下組成之群：R、A、G、K及L；及(d)X22係選自由以下組成之群：L及R。
30. 如實施例29之多肽，其中X19為D。
31. 如實施例29或30之多肽，其中X20為A。
32. 如實施例29至31中任一項之多肽，其中X21為R或A。
33. 如實施例29至32中任一項之多肽，其中X22為L。
34. 如實施例29至33中任一項之多肽，其中該BC環包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：8-10、22、32、33及35。
35. 如實施例1、2及27至34之多肽，其中該DE環包含根據式X23-G-R-G-X24之胺基酸序列，其中(a)X23係選自由以下組成之群：V、P、F、I及L；及(b)X24係選自由以下組成之群：S、N及T。
36. 如實施例35之多肽，其中該DE環包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：40、41及43-45。
37. 如實施例1、2及29至36中任一項之多肽，其中該FG環包含根據式X25-X26-R-X27-G-X28-X29-X30-X31-X32之胺基酸序列，其中(a)X25係選自由以下組成之群：I及V；(b)X26係選自由以下組成之群：F、D及Y；(c)X27係選自由以下組成之群：D及T； (d)X28係選自由以下組成之群：P、M、V及T；(e)X29係選自由以下組成之群：V、L、N、R及S；(f)X30係選自由以下組成之群：H、T、L、N、Q及S；(g)X31係選自由以下組成之群：F、W、Y、H及L；及(h)X32係選自由以下組成之群：D、A及G。
38. 如實施例37之多肽，其中X25為I。
39. 如實施例37或38之多肽，其中X26為F。
40. 如實施例37至39中任一項之多肽，其中X27為D。
41. 如實施例37至40中任一項之多肽，其中X28為P。
42. 如實施例37至41中任一項之多肽，其中X29為V。
43. 如實施例37至42中任一項之多肽，其中X30為H或T。
44. 如實施例37至43中任一項之多肽，其中X31為F或W。
45. 如實施例37至44中任一項之多肽，其中X32為D。
46. 如實施例37至45中任一項之多肽，其中該FG環包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：47-49、63、73、74及78。
47. 如前述實施例中任一項之多肽，其中該多肽包含BC環及DE環。
48. 如實施例47之多肽，其中該BC環包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：7-38，且該DE環包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：39-45。
49. 如實施例1至46中任一項之多肽，其中該多肽包含BC環及FG環。
50. 如實施例49之多肽，其中該BC環包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：7-38，且該FG環包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：46-79。
51. 如實施例1至46中任一項之多肽，其中該多肽包含DE環及 FG環。
52. 如實施例51之多肽，其中該DE環包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：39-45，且該FG環包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：46-79。
53. 如前述實施例中任一項之多肽，其中該多肽包含BC環、DE環及FG環。
54. 如實施例53之多肽，其中該BC環包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：7-38，該DE環包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：39-45，且該FG環包含選自由以下組成之群的胺基酸序列；SEQ ID NO：46-79。
55. 如實施例54之多肽，其中該BC環包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列，該DE環包含SEQ ID NO：39，且該FG環包含SEQ ID NO：75。
56. 如實施例55之多肽，其中該BC環序列具有1、2、3、4、5或6個胺基酸取代；該DE環具有1個胺基酸取代，且該FG環具有1、2、3、4、5、6、7或8個胺基酸取代。
57. 如請求項56之多肽，其中：(a)該BC環包含根據式X33-L-P-X34-X35-X36-X37-X38-X39之胺基酸序列，其中，(i)X33係選自由以下組成之群：T及Y；(ii)X34係選自由以下組成之群：Y、N、R、F、G、S及T；(iii)X35係選自由以下組成之群：A、P、S、F、H、N及R；(iv)X36為A；(v)X37係選自由以下組成之群：H、L、R、V、N、D、F及I；(vi)X38係選自由以下組成之群：L、G、M、F、I及V；及(vii)X39為H； (b)該DE環包含根據式G-R-G-X40之胺基酸序列，其中X40為L；且(c)該FG環包含根據式X41-X42-X43-X44-X45-X46-X47-X48-X49-X50之胺基酸序列，其中(i)X41係選自由以下組成之群：L及I；(ii)X42為S；(iii)X43係選自由以下組成之群：K、R、A、G、S、H、N、T及P；(iv)X44係選自由以下組成之群：S、A、E、H、K及N；(v)X45係選自由以下組成之群：K、Q、D、E、N、T及S；(vi)X46係選自由以下組成之群：V、I、F、L、M、P及T；(vii)X47係選自由以下組成之群：I及Y；(viii)X48係選自由以下組成之群：H、I、V、L、R、F、G、S及T；(ix)X49為H；及(x)X50係選自由以下組成之群：M、L、R及V。
58. 如實施例1或2之多肽，其中該BC環包含根據式X51-X52-X53-X54-X55-X56-X57-X58-X59之胺基酸序列，其中，(a)X51係選自由以下組成之群：A、C、D、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W及Y；(b)X52係選自由以下組成之群：L、M及V；(c)X53係選自由以下組成之群：A、C、D、E、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V及Y；(d)X54係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；(e)X55係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、 K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；(f)X56係選自由以下組成之群：G及S；(g)X57係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；(h)X58係選自由以下組成之群：A、C、G、L、M、S及T；及(i)X59係選自由以下組成之群：A、C、F、H、N、P、Q、R、S及Y。
59. 如實施例58之多肽，其中：(a)X51係選自由以下組成之群：C、F、I、S、V、W及Y；(b)X52係選自由以下組成之群：L；(c)X53係選自由以下組成之群：P；(d)X54係選自由以下組成之群：C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；(e)X55係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；(f)X56係選自由以下組成之群：G；(g)X57係選自由以下組成之群：A、C、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、V、W及Y；(h)X58係選自由以下組成之群：A、G、L、M及S；及(i)X59係選自由以下組成之群：C、H、N、Q、S及Y。
60. 如實施例59之多肽，其中：(a)X51係選自由以下組成之群：F、S及W；(b)X52係選自由以下組成之群：L；(c)X53係選自由以下組成之群：P；(d)X54係選自由以下組成之群：C、F、G、I、K、L、M、N、R、S、T、V、W及Y； (e)X55係選自由以下組成之群：A、C、E、F、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V及Y；(f)X56係選自由以下組成之群：G；(g)X57係選自由以下組成之群：A、C、H、K、L、M、N、R、V、W及Y；(h)X58係選自由以下組成之群：A、G及L；及(i)X59係選自由以下組成之群：H、N及Q。
61. 如實施例58至60之多肽，其中X51為S。
62. 如實施例58之多肽，其中X52為L。
63. 如實施例58之多肽，其中X53為P。
64. 如實施例58、59及61至63中任一項之多肽，其中X54為H。
65. 如實施例58至64中任一項之多肽，其中X55為Q。
66. 如實施例58之多肽，其中X56為G。
67. 如實施例58至66中任一項之多肽，其中X57為K。
68. 如實施例58至67中任一項之多肽，其中X58為A。
69. 如實施例58至68中任一項之多肽，其中X59為N。
70. 如實施例58之多肽，其中該BC環包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：7、11-21、23-31、34及36-38。
71. 如實施例70之多肽，其中該BC環包含SEQ ID NO：34中所述之胺基酸序列。
72. 如實施例58至71中任一項之多肽，其中該DE環包含根據式G-R-G-X60之胺基酸序列，其中X60為A、C、D、E、F、I、K、L、M、N、Q、S、T及V。
73. 如實施例72之多肽，其中X60為C、E、I、L、M、Q、T及V。
74. 如實施例73之多肽，其中X60為C、E、I、L、M及V。
75. 如實施例72至74中任一項之多肽，其中X60為V。
76. 如實施例58至75中任一項之多肽，其中該DE環包含選自由以下組成之群的胺基酸：SEQ ID NO：39及42。
77. 如實施例76之多肽，其中該DE環包含SEQ ID NO：39中所述之胺基酸序列。
78. 如實施例58至77中任一項之多肽，其中該FG環包含根據式X61-X62-X63-X64-X65-X66-X67-X68-X69-X70之胺基酸序列，其中(a)X61係選自由以下組成之群：A、C、F、I、L、M、Q、T、V、W及Y；(b)X62係選自由以下組成之群：A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；(c)X63係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；(d)X64係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；(e)X65係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；(f)X66係選自由以下組成之群：A、C、F、H、I、L、M、N、P、S、T、V、W及Y；(g)X67係選自由以下組成之群：A、C、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；(h)X68係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；(i)X69係選自由以下組成之群：F、W及Y；及(j)X70係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y。
79. 如實施例78之多肽，其中：(a)X61係選自由以下組成之群：A、C、I、L、M及V；(b)X62係選自由以下組成之群：C、F、H、I、L、M、Q、R、S、T、V、W及Y；(c)X63係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、W及Y；(d)X64係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；(e)X65係選自由以下組成之群：A、D、E、F、G、H、I、L、M、N、Q、S、T、V、W及Y；(f)X66係選自由以下組成之群：C、F、I、L、M、P、T、V、W及Y；(g)X67係選自由以下組成之群：C、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W及Y；(h)X68係選自由以下組成之群：A、C、E、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；(i)X69係選自由以下組成之群：W及Y；及(j)X70係選自由以下組成之群：A、C、D、E、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T及V。
80. 如實施例79之多肽，其中：(a)X61係選自由以下組成之群：I及V；(b)X62係選自由以下組成之群：C、F、I、L、M、T、V、W及Y；(c)X63係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、Q、S、T及V；(d)X64係選自由以下組成之群：A、C、D、F、G、I、L、M、 N、Q、S、T、V、W及Y；(e)X65係選自由以下組成之群：A、G、S、T及W；(f)X66係選自由以下組成之群：F、I、V、W及Y；(g)X67係選自由以下組成之群：F、H、I、L、M、V、W及Y；(h)X68係選自由以下組成之群：A、C、F、G、I、K、L、M、T、V及W；(i)X69係選自由以下組成之群：W及Y；及(j)X70係選自由以下組成之群：A、G、K、L、M、P、Q及R。
81. 如實施例78至80中任一項之多肽，其中X61為V。
82. 如實施例78至81之多肽，其中X62為T。
83. 如實施例78至82中任一項之多肽，其中X63為D。
84. 如實施例78至83中任一項之多肽，其中X64為T。
85. 如實施例78至84中任一項之多肽，其中X65為G。
86. 如實施例78至85中任一項之多肽，其中X66為Y。
87. 如實施例78至86中任一項之多肽，其中X67為L。
88. 如實施例78至87中任一項之多肽，其中X68為K。
89. 如實施例78至88中任一項之多肽，其中X69為Y。
90. 如實施例78至89中任一項之多肽，其中X70為K。
91. 如實施例1或2之多肽，其中(a)該BC環包含根據式X51-X52-X53-X54-X55-X56-X57-X58-X59之胺基酸序列，其中，(i)X51係選自由以下組成之群：A、C、D、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W及Y；(ii)X52係選自由以下組成之群：L、M及V；(iii)X53係選自由以下組成之群：A、C、D、E、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V及Y； (iv)X54為A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；(v)X55係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；(vi)X56係選自由以下組成之群：G及S；(vii)X57為A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；(viii)X58為A、C、G、L、M、S及T；及(ix)X59為A、C、F、H、N、P、Q、R、S及Y；(b)該DE環包含根據式G-R-G-X30之胺基酸序列，其中X60係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、I、K、L、M、N、Q、S、T及V；且(c)該FG環包含根據式X61-X62-X63-X64-X65-X66-X67-X68-X69-X70之胺基酸序列，其中(i)X61係選自由以下組成之群：A、C、F、I、L、M、Q、T、V、W及Y；(ii)X62為A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；(iii)X63係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；(iv)X64係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；(v)X65係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；(vi)X66係選自由以下組成之群：A、C、F、H、I、L、M、N、P、S、T、V、W及Y； (vii)X67係選自由以下組成之群：A、C、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；(viii)X68係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；(ix)X69係選自由以下組成之群：F、W及Y；及(x)X70係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y。
92. 如實施例91之多肽，其中：(a)(i)X51係選自由以下組成之群：C、F、I、S、V、W及Y；(ii)X52為L；(iii)X53為P；(iv)X54係選自由以下組成之群：C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；(v)X55係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；(vi)X56為G；(vii)X57係選自由以下組成之群：A、C、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、V、W及Y；(viii)X58係選自由以下組成之群：A、G、L、M及S；及(ix)X59係選自由以下組成之群：C、H、N、Q、S及Y；(b)X60係選自由以下組成之群：C、E、I、L、M、Q、T及V；及(c)(i)X61係選自由以下組成之群：A、C、I、L、M及V；(ii)X62為C、F、H、I、L、M、Q、R、S、T、V、W及Y；(iii)X63係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、W及Y； (iv)X64係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；(v)X65係選自由以下組成之群：A、D、E、F、G、H、I、L、M、N、Q、S、T、V、W及Y；(vi)X66係選自由以下組成之群：C、F、I、L、M、P、T、V、W及Y；(vii)X67係選自由以下組成之群：C、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W及Y；(viii)X68係選自由以下組成之群：A、C、E、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；(ix)X69係選自由以下組成之群：W及Y；及(x)X70係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y。
93. 如實施例92之多肽，其中：(a)(i)X51係選自由以下組成之群：F、S及W；(ii)X52為L；(iii)X53為P；(iv)X54係選自由以下組成之群：C、F、G、I、K、L、M、N、R、S、T、V、W及Y；(v)X55係選自由以下組成之群：A、C、E、F、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V及Y；(vi)X56為G；(vii)X57係選自由以下組成之群：A、C、H、K、L、M、N、R、V、W及Y；(viii)X58係選自由以下組成之群：A、G及L；(ix)X59係選自由以下組成之群：H、N及Q； (b)X60係選自由以下組成之群：C、E、I、L、M及V；及(c)(i)X61係選自由以下組成之群：I及V；(ii)X62為C、F、I、L、M、T、V、W及Y；(iii)X63係選自由以下組成之群：A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、Q、S、T及V；(iv)X64係選自由以下組成之群：A、C、D、F、G、I、L、M、N、Q、S、T、V、W及Y；(v)X65係選自由以下組成之群：A、G、S、T及W；(vi)X66係選自由以下組成之群：F、I、V、W及Y；(vii)X67係選自由以下組成之群：F、H、I、L、M、V、W及Y；(viii)X68係選自由以下組成之群：A、C、F、G、I、K、L、M、T、V及W；(ix)X69係選自由以下組成之群：W及Y；及(x)X70係選自由以下組成之群：A、G、K、L、M、P、Q及R。
94. 如實施例92之多肽，其中：(a)(i)X51為S；(ii)X52為L；(iii)X53為P；(iv)X54為H；(v)X55為Q；(vi)X56為G；及(vii)X57為K；(viii)X58為A；及(ix)X59為N；(b)X60為V；及(c)(i)X61為V； (ii)X62為T；(iii)X63為D；(iv)X64為T；(v)X65為G；(vi)X66為Y；(vii)X67為L；(viii)X68為K；(ix)X69為Y；及(x)X70為K。
95. 如實施例1或2之多肽，其中該多肽包含與SEQ ID NO：118、273、281或331之非BC、DE及FG環區域至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
96. 如實施例1或2之多肽，其中該BC、DE或FG環胺基酸序列分別與SEQ ID NO：7-38、39-45及46-79中之任一者至少80%一致。
97. 如實施例1之多肽，其中該多肽包含與SEQ ID NO：80-123、228-239、252-273、281及331中之任一者至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致的胺基酸序列。
98. 如實施例97之多肽，其中該多肽包含與SEQ ID NO：331至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致的胺基酸序列。
99. 如實施例97之多肽，其中該多肽包含與SEQ ID NO：273至少80%、80%、85%、90%、95%、98%或99%一致的胺基酸序列。
100. 如實施例1之多肽，其中該多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：80-123、228-239、252-273、281及331。
101. 如實施例100之多肽，其中該多肽包含SEQ ID NO：331中所述之胺基酸序列。
102. 如實施例101之多肽，其中該多肽包含SEQ ID NO：273中所 述之胺基酸序列。
103. 如前述實施例中任一項之多肽，其中肌肉生長抑制素上之黏附蛋白結合位點為不連續的。
104. 如實施例103之多肽，其中該多肽結合至在胺基酸56-66內之區域。
105. 如實施例103之多肽，其中該多肽結合至在胺基酸85-101內之區域。
106. 如實施例103之多肽，其中該多肽結合至在SEQ ID NO：3之胺基酸85-101及56-66內之區域。
107. 如前述實施例中任一項之多肽，其中該多肽並不與ActRIIB競爭結合至肌肉生長抑制素。
108. 如前述實施例中任一項之多肽，其中該多肽與ALK4及/或ALK5競爭結合至肌肉生長抑制素。
109. 如前述實施例中任一項之多肽，其進一步包含一或多種選自由以下組成之群的藥物動力學(PK)部分：聚乙二醇、唾液酸、Fc、Fc片段、運鐵蛋白、血清白蛋白、血清白蛋白結合蛋白及血清免疫球蛋白結合蛋白。
110. 如實施例109之多肽，其中該PK部分及該多肽經由至少個二硫鍵、肽鍵、多肽、聚合糖或聚乙二醇部分連接。
111. 如實施例109之多肽，其中該PK部分及該多肽經由連接子連接，該連接子具有選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：181-227。
112. 如實施例109之多肽，其中該血清白蛋白結合蛋白包含纖維連接蛋白III型第十結構域(10Fn3)。
113. 如實施例109之多肽，其中該10Fn3結構域結合HSA。
114. 如實施例109之多肽，其中該PK部分為Fc。
115. 如實施例114之多肽，其中該Fc在該多肽之N端處。
116. 如實施例115之多肽，其中該Fc在該多肽之C端處。
117. 如實施例114至116中任一項之多肽，其中該多肽形成二聚體。
118. 如實施例109之多肽，其中該PK部分為聚乙二醇。
119. 一種醫藥組合物，其包含前述實施例中任一項之多肽及醫藥學上可接受之載劑。
120. 如實施例118之組合物，其中該組合物基本上無內毒素。
121. 一種經分離之核酸分子，其編碼如實施例1至116中任一項之多肽。
122. 如實施例121之經分離之核酸分子，其中該核酸分子具有選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO：124-167、240-251及284-305。
123. 一種表現載體，其包含編碼如實施例1至116中任一項之多肽的核苷酸序列。
124. 一種細胞，其包含編碼如實施例1至115中任一項之多肽的核酸。
125. 一種製造肌肉生長抑制素結合多肽之方法，其包含在適於表現該多肽之條件下培養如實施例124之細胞，及純化該多肽。
126. 一種減輕或抑制個體之肌肉生長抑制素相關之疾病或病症的方法，其包含投與有效量之如請求項1至120中任一項之多肽或組合物。
127. 如實施例126之方法，其中該疾病或病症係選自由以下組成之群：肌肉萎縮症、肌肉萎縮性側索硬化、充血性阻塞性肺病、慢性心臟衰竭、癌症、AIDs、腎衰竭、慢性腎病、尿毒症、類風濕性關節炎、少肌症、因長期臥床休息所致之肌肉耗損、脊髓損傷、中風、 骨折、衰老、糖尿病、肥胖症、高血糖症、惡病質、骨關節炎、骨質疏鬆症、心肌梗塞及纖維化。
128. 一種減輕或抑制個體之與肌肉退化或耗損相關之病症的方法，其包含投與有效量之如實施例1至120之多肽或組合物。
129. 如實施例128之方法，其中該病症係選自由以下組成之群：肌肉萎縮症、肌肉萎縮性側索硬化、充血性阻塞性肺病、慢性心臟衰竭、癌症、AIDs、惡病質、腎衰竭、慢性腎病、尿毒症、類風濕性關節炎、少肌症、因長期臥床休息所致之肌肉耗損、脊髓損傷、創傷性損傷、中風、骨折及衰老。
130. 如實施例129之方法，其中該疾病為肌肉萎縮症。
131. 如實施例128之方法，其中向該個體投與該多肽引起以下生物學作用中之至少一者：(a)肌肉質量增加；(b)肌細胞數目增加；(c)肌細胞大小增加；及(d)肌力增強。
132. 一種減輕或抑制個體之代謝障礙的方法，其包含投與有效量之如實施例1至120之多肽或組合物。
133. 如實施例132之方法，其中該個體患有選自由以下組成之群的疾病或病症：糖尿病、高血糖症、高胰島素血症、高脂質血症、胰島素抗性、葡萄糖代謝受損、肥胖症及代謝症候群。
134. 如實施例132之方法，其中該疾病或病症為II型糖尿病。
135. 如實施例134之方法，其進一步包含投與第二治療組合物以用於治療糖尿病。
136. 如實施例131至135中任一項之方法，其中向該個體投與該多肽引起以下生物學作用中之至少一者： (a)胰島素敏感性增加；(b)由該個體中細胞攝取之葡萄糖增加；(c)血糖含量降低；及(d)體脂肪減少。
137. 一種增加個體之瘦肌肉質量之方法，其包含投與有效量之如實施例1至120中任一項之多肽或組合物。
138. 一種增加個體之瘦肌肉質量與脂肪之比率的方法，其包含投與有效量之如實施例1至120中任一項之多肽或組合物。
139. 一種套組，其包含如實施例1至120中任一項之多肽或組合物及使用說明書。
140. 一種偵測或量測樣品中肌肉生長抑制素之方法，其包含使該樣品與如實施例1至117中任一項之多肽接觸，及偵測或量測該多肽與肌肉生長抑制素之結合。
<110> 美商必治妥美雅史谷比公司
<120> 結合至肌肉生長抑制素(MYOSTATIN)以纖維連接蛋白為主之支架結構域蛋白質
<130> MXI-514PC
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<220>
<223> 合成
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<223> 合成
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<220>
<223> 合成
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<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 294
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<220>
<223> 合成
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<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
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<220>
<223> 合成
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<220>
<223> 合成
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<220>
<223> 合成
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<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 300
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<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 301
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成
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<220>
<223> 合成
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<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 304
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<211> 1020
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 305
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
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<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 307
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<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
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<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 309
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 310
<210> 311
<211> 5
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 311
<210> 312
<211> 4
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 312
<210> 313
<211> 7
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 313
<210> 314
<211> 6
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 314
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 315
<210> 316
<211> 4
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 316
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 317
<210> 318
<211> 7
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 318
<210> 319
<211> 9
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 319
<210> 320
<211> 12
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 320
<210> 321
<211> 5
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 321
<210> 322
<211> 7
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 322
<210> 323
<211> 5
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 323
<210> 324
<211> 9
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 324
<210> 325
<211> 13
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 325
<210> 326
<211> 10
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 326
<210> 327
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 327
<210> 328
<211> 6
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 328
<210> 329
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 329
<210> 330
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 330
<210> 331
<211> 87
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成
<400> 331

Claims (13)

  1. 一種包含纖維連接蛋白III型第十結構域(10Fn3)之多肽，其以小於500nM之KD結合肌肉生長抑制素(myostatin)，其中該10Fn3結構域之該BC、DE及FG環分別包含SEQ ID NO：34、39及75之胺基酸序列。
  2. 如請求項1之多肽，其中該多肽包含與SEQ ID NO：331、273、281或118之非BC、DE及FG環區域至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
  3. 如請求項1之多肽，其中該多肽結合至在SEQ ID NO：3之胺基酸56-66內之區域。
  4. 如請求項3之多肽，其中該多肽結合至在SEQ ID NO：3之胺基酸85-101及56-66內之區域。
  5. 如請求項1之多肽，其中該多肽並不與ActRIIB競爭結合至肌肉生長抑制素，及/或該多肽與ALK4及/或ALK5競爭結合至肌肉生長抑制素。
  6. 一種多肽，其包含SEQ ID NO：331之胺基酸序列。
  7. 一種多肽，其包含SEQ ID NO：273之胺基酸序列。
  8. 一種包含纖維連接蛋白III型第十結構域(10Fn3)之多肽，其以小於500nM之KD結合肌肉生長抑制素，其中該BC、DE及FG環分別包含：(a)SEQ ID NO：7、39及46之胺基酸序列；(b)SEQ ID NO：8、40及47之胺基酸序列；(c)SEQ ID NO：12、42及51之胺基酸序列；(d)SEQ ID NO：17、39及56之胺基酸序列；(e)SEQ ID NO：18、39及57之胺基酸序列；(f)SEQ ID NO：17、39及62之胺基酸序列；(g)SEQ ID NO：32、44及73之胺基酸序列；(h)SEQ ID NO：33、45及74之胺基酸序列；(i)SEQ ID NO：34、39及75之胺基酸序列；或(j)SEQ ID NO：38、39及79之胺基酸序列。
  9. 如請求項1至8中任一項之多肽，其進一步包含一或多種選自由以下組成之群的藥物動力學(PK)部分：聚乙二醇、唾液酸、Fc、Fc片段、運鐵蛋白、血清白蛋白、血清白蛋白結合蛋白及血清免疫球蛋白結合蛋白。
  10. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至9中任一項之多肽及載劑。
  11. 一種經分離之核酸分子，其編碼如請求項1至9中任一項之多肽。
  12. 一種宿主細胞，其包含如請求項11之經分離之核酸分子。
  13. 一種如請求項1至9中任一項之多肽或如請求項10之組合物之用途，其用於製造適於增加肌肉質量之藥物。
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