PL217626B1 - Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu raka - Google Patents

Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu raka

Info

Publication number
PL217626B1
PL217626B1 PL374675A PL37467503A PL217626B1 PL 217626 B1 PL217626 B1 PL 217626B1 PL 374675 A PL374675 A PL 374675A PL 37467503 A PL37467503 A PL 37467503A PL 217626 B1 PL217626 B1 PL 217626B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
urease
cells
tumor
composition
cell
Prior art date
Application number
PL374675A
Other languages
English (en)
Other versions
PL374675A1 (pl
Inventor
Heman Chao
Wah Wong
Donald Segal
Jerry Mcelroy
John Docherty
Jodi Dickstein
Original Assignee
Helix Biopharma Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Helix Biopharma Corp filed Critical Helix Biopharma Corp
Publication of PL374675A1 publication Critical patent/PL374675A1/pl
Publication of PL217626B1 publication Critical patent/PL217626B1/pl

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/50—Hydrolases (3) acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5), e.g. asparaginase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/66—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid the modifying agent being a pre-targeting system involving a peptide or protein for targeting specific cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6891—Pre-targeting systems involving an antibody for targeting specific cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Ujawniono kompozycję farmaceutyczną i sposób stosowane do hamowania wzrostu komórek rakowych u ssaka. Kompozycja obejmuje enzym ureazy i związany z nim, chemiczny element skuteczny we wspomaganiu dostarczania enzymu do komórek rakowych, gdy kompozycja jest podawana osobnikowi. Ujawniono również sposób zwiększania skuteczności słabo zasadowych związków przeciwrakowych, sposób oznaczania obecności, wielkości lub stanu guzów litych u osobnika i kompozycję do terapii genowej do leczenia raka u osobnika.

Description

Niniejsze zgłoszenie zastrzega pierwszeństwo i korzysta z warunkowego zgłoszenia amerykańskiego o nr kolejnym 60/397, 244, zgłoszonym 18 Iipca 2002, którego ujawnienie jest włączone tutaj w całości jako odnośnik w każdym odniesieniu.
Dziedzina wynalazku
Niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej do zastosowania w leczeniu raka.
Podstawa wynalazku
Rak jest powodem jednej piątej całej śmiertelności w Stanach Zjednoczonych i jest drugą wiodącą przyczyną raka. Rak typowo charakteryzuje się niekontrolowanymi podziałami komórek w populacji. Te niekontrolowane podziały mogą dotyczyć komórek krwi, takich jak różne typy limfocytów, lub komórek które agregują lub naturalnie występują w danej tkance lub organie, np. guzy lite, takie jak wtórne lub pierwotne guzy sutka, wątroby, przełyku, żołądka, jelit, mózgu, kości, lub prostaty.
Proponowano wiele różnych typów terapii raka. Terapie te ogólnie obejmują chirurgiczne usunięcie guzów litych, terapię naświetlaniem, takim jak promieniowanie X, chemoterapię, terapię immunologiczną i terapię genową. Rodzaje terapii, które są wybrane dla danej postaci raka będą zależeć od takich czynników jak wiek pacjenta, poziom umiejscowienia i rodzaj raka, i stadium raka. Często terapia będzie wymagać połączenia dwóch lub więcej odmian terapii, takich jak terapia promieniowaniem X w połączeniu z chemoterapią, lub terapia immunologiczna w połączeniu z chemoterapią.
W leczeniu różnych typów raka stosuje się wiele chemoterapeutycznych związków i kompozycji, jak i strategii. Wiele przeciwnowotworowych związków zaprojektowano tak, aby przerwać replikację w komórkach, w których szybko zachodzą podziały, lub aby hamować kluczowe połączenia metaboliczne w komórkach aktywnie namnażających się. Pomimo, że stosując takie rozwiązania osiągnięto pewien poziom sukcesu w przypadkach pewnych typów raka, lub w przypadku raka na pewnych etapach, chemoterapia jest ogólnie związana z nieprzyjemnymi, do wyniszczających, szkodliwych działaniach ubocznych, takich jak złe samopoczucie, nudności, utrata apetytu, łysienie i anemia. Ponadto, związki które działają na poziomie replikacji komórkowej, zarówno poprzez wprowadzenie analogów nukleotydów do dzielących się komórek lub przez przerywanie normalnej replikacji, skutecznie wprowadzają szeroko rozprzestrzeniające się mutacje genetyczne do normalnych komórek w organizmie pacjenta. Ponadto, komórki rakowe mogą rozwinąć oporność na wiele rodzajów przeciwnowotworowych środków, zarówno przez ograniczenie pobierania środka przez komórki rakowe jak i przez zmianę metabolizmu środka w obrębie komórek.
W odpowiedzi na te ograniczenia, próbowano zmodyfikować chemoterapeutyczne środki aby zmniejszyć ich działania uboczne, przezwyciężyć problemy związane z opornością, lub poprawić ich działanie w danym, docelowym miejscu występowania guza. Podczas gdy te wysiłki prowadziły do uzyskania ulepszonych środków terapeutycznych w pewnych przypadkach, pozostaje potrzeba dostarczenia ulepszonych chemoterapeutycznych środków i sposobów. Zwłaszcza, taki środek powinien być skuteczny w zabijaniu lub hamowaniu wzrostu komórek rakowych, powinien być stosunkowo nietoksyczny zarówno w odniesieniu do działań ubocznych, jak i długoterminowego zachowania integralności genetycznej u leczonego osobnika, i korzystnie powinien być dostarczany w postaci, która umożliwia bezpośrednie wprowadzenie do guza lub selektywne dotarcie do guza.
Podsumowanie wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu raka charakteryzującą się tym, że zawiera ureazę ugrupowanie naprowadzające, sprzężone z ureazą, wybrane z grupy składającej się z przeciwciała przeciwko antygenowi przeciwrakowemu, przeciwciała anty-hCG i Iigandu zdolnego do specyficznego wiązania z receptorami powierzchniowymi komórek raka, przy czym to ugrupowanie naprowadzające poprawia dostarczanie enzymu do komórki rakowej po podaniu kompozycji pacjentowi; oraz nośnik farmaceutyczny.
Korzystnie, kompozycja zawiera białko fuzyjne ugrupowania naprowadzającego i ureazy. Korzystnie, ureaza jest ureazą roślinną lub bakteryjną. Korzystnie, kompozycja zawiera również słabo zasadowy środek przeciwnowotworowy, którego skuteczność jest obniżona przez wyższy wewnątrzkomórkowy/niższy zewnątrzkomórkowy gradient pH w guzie litym.
Korzystnie, środek przeciwnowotworowy jest wybrany z grupy złożonej z doksorubicyny, daunorubicyny, mitoksantronu, epirubicyny, mitomycyny, bleomycyny, alkaloidów Vinca takich, jak winblaPL 217 626 B1 styna i winkrystyna, środków alkilujących takich jak cyklofosfamid i chlorowodorek mechloroetaminy i przeciwnowotworowych pochodnych puryny i pirymidyny.
Korzystnie, kompozycja przeznaczona jest do leczenia guza litego u ssaka leczonego przeciwnowotworowym związkiem słabo zasadowym, którego efektywność jest obniżona przez niższy wewnątrzkomórkowy/wyższy zewnątrzkomórkowy gradient pH w guzie litym.
Korzystnie, przeciwnowotworowy związek jest wybrany z grupy złożonej z doksorubicyny, daunorubicyny, mitoksantronu, epirubicyny, mitomycyny, bleomicyny, alkaloidów Vinca takich jak winblastyna i winkrystyna, środków alkilujących takich jak cyklofosfamid i chlorowodorek mechloroetaminy oraz przeciwnowotworowych pochodnych puryny i pirymidyny.
Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku stosowana jest do hamowania wzrostu komórek rakowych u ssaka.
Gdy ugropowanie naprowadzające jest polipeptydem, kompozycja może stanowić białko fuzyjne złożone z ugrupowania naprowadzającego i enzymu ureazy. W innym rozwiązaniu, ureaza może obejmować, na swoim końcu C- lub N-, jeden peptyd tworzący zwój (coil-forming peptide) charakteryzujący się wybranym ładunkiem i zdolnością do oddziaływania z drugim, przeciwnie naładowanym peptydem tworzącym zwój, tworząc stabilny heterodimer zwinięty w α-helisowy solenoid (coiled-coil); α cząstka chemiczna może zawierać ugrupowanie naprowadzające, które obejmuje drugi peptyd tworzący zwój.
Enzym ureazy może być również zamknięty w pęcherzykach. Przykładowe pęcherzyki obejmują liposomy, które długo krążą w organizmie dzięki powłoce zewnętrznej z łańcuchów poli(glikolu etylenowego) i mają taką wielkość, aby mogły przechodzić poza naczynie do okolic guza, gdy kompozycja jest podawana dożylnie; i liposomy mające związane na powierzchni ugrupowania naprowadzające. Pęcherzyki mogą zawierać dodatkowe środki, takie jak mocznik, aktywny terapeutycznie środek przeciwnowotworowy lub środek obrazujący.
Cząstka chemiczna może obejmować związany z nią inhibitor ureazy, w ilości dostatecznej aby hamować aktywność tego enzymu.
Wynalazek może być stosowany w sposobie hamowania wzrostu komórek rakowych u ssaka. Sposób obejmuje działanie na komórki ureazą w ilości skutecznej, aby hamować wzrost komórek rakowych.
Gdy komórki rakowe stanowią guz lity, ureaza może być podana przez wstrzykiwanie bezpośrednio do guza u osobnika, lub przez pozajelitowe podawanie, np. iniekcję, inne niż podawanie bezpośrednie. Oprócz ureazy w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku do stosowania według wynalazku, odpowiednie są różne kompozycje zawierające ureazę, wymienione powyżej.
Sposób może obejmować regulowanie aktywności ureazy w komórkach rakowych przez podawanie osobnikowi, ilości inhibitora ureazy skutecznej do obniżenia aktywności ureazy w tych komórkach rakowych. Aktywność ureazy może być regulowana przeciwnie przez podawanie mocznika osobnikowi, przed, w czasie, lub po podawaniu ureazy.
Ureaza może być podawana w dwóch etapach: pierwszy etap obejmuje ko n iugat ugrupowania naprowadzającego na guz z pierwszą wiążącą częścią cząsteczki mającą zdolność do oddziaływania z drugą częścią wiążącą; i drugi koniugat w drugim etapie, zawierający drugą wiążącą część cząsteczki sprzężoną z ureazą.
W jeszcze innym rozwiązaniu, sposób może obejmować podawanie osobnikowi, kompozycji do terapii genowej złożonej z ukierunkowanego wektora skutecznego, gdy jest podawany osobnikowi, do selektywnej transfekcji komórek rakowych i niesionej przez ten wektor, zrekombinowanej sekwencji kwasu nukleinowego skutecznej do wytwarzania mRNA kodującego ureazę w transfekowanych komórkach rakowych. Przykładowym wektorem jest adenowirus. Przykładowa sekwencja kwasu nukleinowego koduje ureazę i wydzielniczą sekwencję liderową skuteczną do wzmacniania wydzielania ureazy z transfekowanych komórek rakowych.
Wynalazek może również być stosowany do zwiększania skuteczności terapeutycznej słabo zasadowego przeciwnowotworowego związku, którego skuteczność jest obniżona przez wyższy wewnątrzkomórkowy/niższy zewnątrzkomórkowy gradient pH w guzie litym, u osobnika otrzymującego środek do leczenia guza. Sposób ten obejmuje podawanie osobnikowi ilości ureazy skutecznej do obniżania lub odwracania wyższego wewnątrzkomórkowego/niższego zewnątrzkomórkowego gradientu pH w guzie litym.
PL 217 626 B1
Korzystnie, ilość ureazy podawana jest skuteczna do podniesienia wartości pH zewnątrzkomórkowego płynu w guzie do pH przynajmniej 7,2. Ureaza może być podana przez wstrzykiwanie bezpośrednio do guza, lub przez pozajelitowe podawanie inne niż podawanie bezpośrednie, jak powyżej.
Przeciwnowotworowym związkiem może być, na przykład, doksorubicyna, daunorubicyna, mitoksantron, epirubicyna, mitomycyna, bleomycyna, alkaloidy Vinca, takie jak winblastyna i winkrystyna, środki alkilujące, takie jak cyklofosfamid i chlorowodorek mechloroetaminy, jak i przeciwnowotworowe pochodne puryny lub pirymidyny.
Wynalazek może być również użyteczny w określaniu obecności, wielkości lub stanu guza litego u osobnika. W tym zastosowaniu, ureaza jest podawana osobnikowi mającemu, lub u którego podejrzewa się guz lity, w warunkach skutecznych do zlokalizowania ureazy w guzie litym u pacjenta. Osobnik następnie jest badany narzędziami diagnostycznymi, takimi jak fluoroskopia, MRI, lub komputerowa tomografia emisyjna, zdolnymi do wykrywania zmian w tkance osobnika zewnątrzkomórkowego pH, zarówno w obecności lub bez środka znacznikowego czułego na zmianę pH, w celu identyfikacji regionu tkanki u pacjenta, która wykazuje wzrost wartości zewnątrzkomórkowego pH.
Sposób ten może być stosowany w połączeniu z powyżej opisanym sposobem leczenia, mając na celu wyznaczenie zakresu i/lub skuteczności dawkowania lub leczenie z użyciem ureazy. Zatem, na przykład, w podawaniu ureazy osobnikowi, zakres i stopień zmian pH w obszarze guza mogą być monitorowane, co umożliwi poprowadzenie podawania ureazy, lub aby wyznaczyć zmiany w wielkości guza lub zakresu w czasie leczenia.
Ujawniono również zestaw stosowany do hamowania wzrostu komórek rakowych u ssaka. Zestaw obejmuje kompozycję farmaceutyczną zawierającą enzym ureazy i materiały instruktażowe określające podawanie kompozycji osobnikowi, do leczenia raka u pacjenta.
Materiały instruktażowe mogą przedstawiać podawanie kompozycji z ureazą osobnikowi w ilości, która zależy od wielkości guza i stanowi od 0,1 do 100 jednostek międzynarodowych, korzystnie 3
0,5 do 10, aktywność ureazy na mm3 guza, gdy kompozycja jest podawana przez bezpośrednią iniekcję do guza, a w ilości od 100-100000 jednostek międzynarodowych/kg, korzystnie 500-10000 jednostek międzynarodowych/kg jednostek międzynarodowych aktywności ureazy/kg masy ciała osobnika, gdy kompozycja jest podawana osobnikowi pozajelitowo, inaczej niż przez bezpośrednią iniekcję do guza.
Materiały instruktażowe mogą przedstawiać podawanie ureazy osobnikowi, który również otrzymuje słabo zasadowy przeciwnowotworowy związek, którego skuteczność jest obniżona przez wysoki wewnątrzkomórkowy/niższy zewnątrzkomórkowy gradient pH w guzie litym, w ilości ureazy skutecznej do obniżania lub odwracania wysokiego wewnątrzkomórkowego/niższego zewnątrzkomórkowego gradientu pH w guzie litym.
Materiały instruktażowe mogą przedstawiać podawanie ureazy osobnikowi, u którego występuje, lub u którego podejrzewa się występowanie guza litego, w warunkach skutecznych do zlokalizowania ureazy w guzie litym u pacjenta, badanie osobnika środkami diagnostycznymi do wykrywania zmiany zewnątrzkomórkowego pH w tkance osobnika i zidentyfikowanie obszaru tkanki u pacjenta, który wykazuje podwyższenie zewnątrzkomórkowe pH po podawaniu leku.
Ujawniona jest również kompozycja do terapii genowej stosowana do hamowania wzrostu komórek rakowych u ssaka. Kompozycja ta obejmuje, jak zauważono powyżej, naprowadzający wektor skuteczny, gdy jest podawany osobnikowi, do selektywnej transfekcji komórek rakowych, i niesioną przez ten wektor, zrekombinowaną sekwencję kwasu nukleinowego skuteczną do wytwarzania mRNA kodującego ureazę w transfekowanych komórkach rakowych.
Te i inne przedmioty, i cechy wynalazku będą bardziej zrozumiałe, po zapoznaniu się z poniższym szczegółowym opisem wynalazku w połączeniu z załączonymi rysunkami.
Krótki opis rysunku
Fig. 1A-1D ilustrują etapy reakcji ureazy. Mocznik jest cięty przez ureazę do utworzenia jednej cząsteczki amoniaku i jednej karbaminianu (A).
Karbaminian spontanicznie rozkłada się na amoniak i kwas węglowy (B). Kwas węglowy ulega równoważeniu w wodzie (C), podobnie jak dwie cząsteczki amoniaku, które ulegają protonowaniu, co prowadzi do utworzenia jonów amonowego i wodorotlenkowego (D). Reakcja prowadzi do podwyższenia wartości pH w środowisku reakcji;
Fig. 2 przedstawia uzyskany techniką spektrometrii mas profil nieoczyszczonej próbki zawierającej ureazę, wytworzoną zgodnie z jednym wariantem wynalazku;
PL 217 626 B1
Fig. 3 przedstawia wyniki oczyszczania ureazy z wykorzystaniem powinowactwa, w czasie różnych etapów procesu oczyszczania, zgodnie z innym wariantem wynalazku;
Fig. 4 przedstawia oczyszczanie koniugatu E-zwój-ahEGFR IgG z zastosowaniem kolumny z białkiem G, wytworzonego zgodnie z jednym wariantem wynalazku oraz
Fig. 5 przedstawia miano przeciwciała oczyszczonego koniugatu E-zwój-ahEGFR IgG wytworzonego zgodnie z jednym wariantem wynalazku jak wyznaczono stosując ELISA z unieruchomionym K-zwojem.
Szczegółowy opis wynalazku
I. Definicje
Jeśli nie wskazano inaczej, wszystkie techniczne i naukowe terminy stosowane w niniejszym zgłoszeniu mają takie samo znaczenie jak je rozumie biegły w dziedzinie niniejszego wynalazku. Osobom realizującym niniejszy wynalazek szczególnie polecany jest podręcznik Sambrooka i wsp (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, wyd. 3.; i Ausubela, F. M., i wsp. (1993) w Current Protocols in Molecular Biology, gdzie znajdują się definicje i określenia z tej dziedziny. Zrozumiałe jest, że niniejszy wynalazek nie jest ograniczony do opisanej szczególnej metodyki, protokołów i odczynników, gdyż mogą być one różne.
Określenie ureaza odnosi się do enzymu mającego enzymatyczną aktywność amidohydrolazy mocznikowej (E.C. 3,5,1,5), zarówno występującej naturalnie jak i otrzymywanej z wykorzystaniem np. technik rekombinacji kwasu nukleinowego i/lub syntezy chemicznej. Termin ureaza również obejmuje białka fuzyjne zawierające całą ureazę, jej podjednostki, lub jej fragmenty i/lub ureazę z aminokwasowymi podstawieniami, delecjami lub addycjami, która zachowuje aktywność amidohydrolazy mocznikowej polipeptydu. Skrócona sekwencja ureazy jak stosowano tutaj jest fragmentem ureazy, która jest pozbawiona części niezmienionej sekwencji ureazy rozpoczynającej się na końcu aminowym lub karboksylowym ureazy. Sposoby wyodrębnienia natywnej ureazy, rekombinowanego syntetyzowania ureazy i identyfikacji fragmentów aktywnych, i zmodyfikowanych polipeptydów ureazy przedstawiono poniżej.
Określenie rak (nowotwór) ma odnosić się do nieprawidłowej komórki lub komórek, lub masy tkanki. Wzrost tych komórek lub tkanek jest nadmierny i jest nieskoordynowany w porównaniu do normalnych tkanek lub komórek, i trwa w ten sam nadmierny sposób po zaprzestaniu bodźców, które wywołują zmianę. Te nowotworowe tkanki lub komórki wykazują brak organizacji strukturalnej i koordynacji względem normalnych tkanek lub komórek, co może prowadzić do masy tkanek lub komórek, które mogą być zarówno łagodne lub złośliwe. Jak stosowano tutaj, rak obejmuje dowolny nowotwór. Objęte są, lecz nie ograniczając zakresu, czerniak, gruczalakorak, złośliwy glejak, rak gruczołu krokowego, rak nerek, rak pęcherza, rak trzustki, rak tarczyczy, rak płuc, rak okrężnicy, rak odbytu, rak mózgu, rak wątroby, rak sutka, rak jajnika i tym podobne.
Guz lub guz lity odnosi się do wspólnej masy komórek rakowych, obejmując lecz nie ograniczając zakresu, guzy półstałe i guzy lite, przerzuty guzów litych, naczyniakowłókniaki, pozasoczewkowy rozrost włóknisty, naczyniak krwionośny i mięsak Kaposiego.
Jak stosowano tutaj określenie ugrupowanie naprowadzające odnosi się do cząsteczki, która wiąże się ze zdefiniowaną populacją komórek lub wybranym typem komórek. Ugrupowanie naprowadzające może wiązać receptor, oligonukleotyd, substrat enzymatyczny, determinantę antygenową, lub inne wiążące miejsce obecne na lub w docelowej komórce lub populacji komórek. Przykładowym ugrupowaniem naprowadzającym jest przeciwciało. Sekwencje fragmentów przeciwciała i małych peptydów zdolne do rozpoznawania ulegających ekspresji antygenów są również rozważane jako ugrupowania naprowadzające.
Jak stosowano tutaj, określenie hamuje wzrost komórek rakowych lub hamowanie wzrostu komórek raka odnosi się do dowolnego spowolnienia szybkości proliferacji i/lub migracji komórek raka, zatrzymania proliferacji i/lub migracji komórek raka, lub zabicia komórek rakowych, tak że szybkość wzrostu komórek rakowych jest obniżona w porównaniu z obserwowaną lub przewidywaną szybkością wzrostu w przypadku nietraktowanych, kontrolnych komórek raka. Określenie hamuje wzrost może również odnosić się do zmniejszenia wielkości lub zniknięcia komórek raka lub guza, jak i do zmniejszenia jego skłonności do przerzutów. Korzystnie, takie hamowanie na poziomie komórkowym może obniżać wielkość, powstrzymywać wzrost, zmniejszać agresywność, lub zapobiegać lub hamować przerzuty raka u pacjenta. Osoby biegłe w tej dziedzinie mogą z łatwością określić, dowolnym z wielu odpowiednich wskaźników, czy wzrost komórek raka został zahamowany.
PL 217 626 B1
Hamowanie wzrostu komórek raka może być udowodnione, na przykład, przez wykazanie zatrzymania komórek rakowych w danej fazie cyklu komórkowego, np. zatrzymanie w fazie G2/M cyklu komórkowego. Hamowanie wzrostu komórek raka może być również wykazane przez bezpośredni lub pośredni pomiar wielkości komórek raka lub guza. U pacjentów będących ludźmi, cierpiących na raka, takie pomiary ogólnie są wykonywane stosując dobrze znane sposoby obrazowania, takie jak obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego, obrazowanie metodą osiowej tomografii komputerowej i promieniami X. Wzrost komórek raka może być również wyznaczony pośrednio, na przykład przez oznaczanie poziomów krążącego antygenu rakowo płodowego, antygenu specyficznego dla prostaty lub innych antygenów specyficznych dla danego typu raka, które są skorelowane ze wzrostem komórek raka. Hamowanie wzrostu raka jest również ogólnie skorelowane z przedłużonym przeżyciem i/lub poprawą zdrowia i dobrym samopoczuciem pacjenta.
Jak stosowano tutaj, określenie indukuje apoptozę odnosi się do doprowadzenia do postaci programowanej śmierci komórki charakteryzującej się fragmentacją DNA. Apoptoza może być określona sposobami znanymi w tej dziedzinie. Na przykład, na rynku dostępne są zestawy, które wykrywają obecność pofragmentowanego DNA z wykorzystaniem immunohistochemii in situ (np. Apoptag, dostępny z Intergen, Purchase, N. Y.). Dodatkowo, apoptoza może być również wyznaczona poprzez analizę FACS, w której apoptotyczne komórki wykazują obecność DNA asub-G1, co wskazuje na fragmentację DNA.
Jak stosowano tutaj, termin przeciwciało odnosi się do peptydu, polipeptydu, lub białka zawierającego jeden lub więcej peptydy lub polipeptydy zasadniczo lub częściowo kodowane przez przynajmniej jedną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą immunoglobuliny lub gen kodujący immunoglobuliny lub fragment przynajmniej jednej cząsteczki immunoglobuliny lub genu kodującego immunoglobulinę. Rozpoznane geny immunoglobulin obejmują geny stałych regionów kappa, lambda, alfa, gamma, delta, epsilon i mi, jak i wiele (104) genów zmiennych regionów immunoglobulin. Lekkie łańcuchy są sklasyfikowane bądź jako kappa lub jako lambda. Ciężkie łańcuchy są sklasyfikowane jako gamma, mi, alfa, delta, lub epsilon, które z kolei definiują klasy immunoglobulin odpowiednio IgG, IgM, IgA, IgD i IgE. Typowa immunoglobulinowa (np. przeciwciało) jednostka strukturalna obejmuje tetramer. Każdy tetramer złożony jest z dwóch identycznych par łańcuchów polipeptydowych, każda para ma jeden lekki łańcuch (około 25 kD) i jeden ciężki łańcuch (około 50-70 kD). Koniec N każdego łańcucha definiuje region zmienny o około 100 do 110 lub więcej aminokwasów głównie odpowiedzialny z rozpoznawanie antygenu. Określenia zmienny lekki łańcuch (VL) oraz zmienny ciężki łańcuch (VH) odnoszą się odpowiednio do lekkich i ciężkich łańcuchów. Przeciwciała występują jako niezmienione immunoglobuliny lub jako wiele dobrze scharakteryzowanych fragmentów wytwarzanych w wyniku trawienia różnymi peptydazami. Zatem, na przykład, pepsyna trawi przeciwciało poniżej wiązań dwusiarczkowych w regionie zgięcia tworząc F(ab)'2, dimer Fab, który sam jest lekkim łańcuchem połączonym z VH-CH1 wiązaniem dwusiarczkowym. F(ab)'2 może ulec redukcji w łagodnych warunkach do zniesienia wiązań dwusiarczkowych w regionie zgięcia, przez co dimer (Fab')2 ulega przekształceniu w monomer Fab'. Monomer Fab' stanowi zasadniczo Fab z częścią regionu zgięcia (patrz Fundamental Immunology, W. E. Paul, ed., Raven Press, N. Y. (1993), zawierający bardziej szczegółowy opis innych fragmentów przeciwciała). Podczas gdy różne fragmenty przeciwciała są zdefiniowane w odniesieniu do trawienia nieuszkodzonego przeciwciała, osoba o typowej wiedzy w tej dziedzinie doceni, że takie fragmenty Fab' mogą być syntetyzowane de novo zarówno chemicznie jak i przez zastosowanie technologii rekombinacji DNA. Zatem, termin przeciwciało, jak stosowano tutaj, również obejmuje fragmenty przeciwciała zarówno wytwarzane przez modyfikację całego przeciwciała lub zsyntetyzowane de novo stosując technologie rekombinacji DNA. Przeciwciała obejmują pojedynczy łańcuch przeciwciała, włącznie z przeciwciałami o pojedynczym łańcuchu Fv (sFv), w których VH i VL są połączone razem (bezpośrednio lub przez łącznik peptydowy) aby utworzyć jednolity polipeptyd. Fragment wiążący antygen przeciwciała jest peptydowym lub polipeptydowym fragmentem przeciwciała, który wiąże się z antygenem. Miejsce wiążące antygen jest tworzone przez te aminokwasy przeciwciała, które biorą udział, lub są zaangażowane lub wpływają na wiązanie antygenu. Patrz Scott, T. A. i Mercer, E. I., Concise encyclopedia: biochemistry and molecular biology (de Gruyter, 3d ed. 1997) i Watson, J. D. i wsp., Recombinant DNA (2d ed. 1992), z których każda jest włączona tutaj jako odnośnik w całości w każdym odniesieniu. Określenie fragment przeciwciała również obejmuje dowolne syntetyczne lub uzyskane metodami inżynierii genetycznej białko, które ma aktywność taką jak przeciwciało przez wiązanie ze specyficznym antygenem, tworząc kompleks.
PL 217 626 B1
Określenia środek aktywny, lek oraz środek aktywny farmakologicznie są stosowane wymiennie i odnoszą się do chemicznego materiału lub związku który, gdy jest podawany osobnikowi indukuje żądany skutek farmakologiczny i ma obejmować środek diagnostyczny lub terapeutyczny, włącznie z radioizotopami, lekami, środkami przeciwnowotworowymi, toksynami i tym podobnymi. Korzystnie, określenie środek aktywny obejmuje białka, glikoproteiny, naturalne i syntetyczne peptydy, alkaloidy, polisacharydy, cząsteczki kwasu nukleinowego, małe cząsteczki i tym podobne. Korzystniej, określenie środek aktywny odnosi się białek. Przykładowym środkiem aktywnym jest ureaza.
Termin środek aktywny wrażliwy na pH odnosi się do środka aktywnego, którego zdolność do indukcji żądanego działania farmakologicznego zależy od, przynajmniej w części, od pH otaczającego zewnątrzkomórkowego środowiska.
Określenie środek oczyszczający (usuwający), jak stosowano tutaj, odnosi się do środka zdolnego do wiązania, kompleksowania lub w inny sposób łączenia się z podawaną częścią cząsteczki, np. ugrupowanie naprowadzające - ligand, ugrupowanie naprowadzające-anty-ligand lub sam antyligand, obecną w krwioobiegu osobnika, któremu jest podawany, dzięki czemu usunięcie (klirens) części cząsteczki z krwioobiegu ciała osobnika, który ją otrzymał jest ułatwiony, podobnie jak usuwanie z krwioobiegu, lub jego inaktywacja w krwioobiegu. Środek oczyszczający jest korzystnie charakteryzowany fizycznymi właściwościami, takimi jak wielkość, ładunek, konfiguracja lub ich skład, które ograniczają dostęp środka oczyszczającego do populacji docelowych komórek rozpoznawanych przez ugrupowanie naprowadzające stosowane według tego samego protokołu leczenia jak środek oczyszczający.
Określenie środek obrazujący ma odnosić się do związków, które mogą być wykrywane.
Termin adiuwant odnosi się do substancji lub środka dodawanego do preparatu lub kompozycji, aby wspomóc działanie głównego składnika.
Terminy płyn tkankowy oraz zewnątrzkomórkowy odnoszą się do płynu znajdującego się między zanurzonymi w nim komórkami ssaków.
Określenia osobnik, organizm pacjenta oraz pacjent są tutaj stosowane wymiennie i odnoszą się do dowolnego celu leczenia. Wynalazek może być również wykorzystany w sposobie leczenia komórek guza in situ, lub w ich normalnym umiejscowieniu lub lokalizacji, na przykład nowotworowe komórki guzów sutka lub prostaty. Te guzy in situ mogą być zlokalizowane w obrębie lub na wielu różnych organizmach gospodarzy; na przykład, u ludzi, psów, kotów, koni, bydła, świń i tym podobnych. Może być leczony dowolny organizm gospodarza, w którym stwierdzono guz lub komórki guza. Osobnik zatem obejmuje kręgowca, korzystnie ssaka, korzystniej człowieka.
Terminem czas pozostawania w obrębie docelowej komórki oznaczono ilość czasu, w którym cząsteczka ureazy lub innego środka aktywnego pozostaje na powierzchni docelowej komórki lub w docelowej komórce.
Jak stosowano tutaj, określenie koniugat obejmuje chemiczne koniugat (związane kowalencyjnie lub niekowalencyjnie), białka fuzyjne i tym podobne.
Określenia białko, polipeptyd lub peptyd, jak stosowano tutaj, odnosi się wymiennie do biopolimerów złożonych z podjednostek aminokwasowych lub analogów aminokwasów, typowo pewne lub wszystkie z 20 typowych L-aminokwasów występujących w biologicznych białkach, związanych peptydowymi wiązaniami pomiędzy podjednostkami, lub innymi wiązaniami pomiędzy podjednostkami.
Białko ma pierwszorzędową strukturę przedstawioną przez sekwencję poszczególnych podjednostek i może mieć strukturę drugorzędową helisy lub struktury pofałdowane, jak i ogólną trójwymiarową strukturę. Pomimo, że białko ogólnie odnosi się stosunkowo dużego polipeptydu, np. zawierającego 100 lub więcej aminokwasów, a peptyd odnosi się do mniejszych polipeptydów, określenia te są tutaj stosowane wymiennie. To jest, określenie białko może odnosić się do większego polipeptydu, jak i do mniejszego peptydu, i vice versa.
Termin modulator/regulator ureazy oznacza zarówno inhibitor ureazy jak i środek zwiększający aktywność ureazy.
Termin inhibitor ureazy obejmuje cząsteczkę lub grupę cząsteczek które wpływają na: (1) ekspresję, modyfikację, regulację, aktywację lub degradację ureazy; lub (2) jedną lub więcej normalnych funkcji ureazy. Normalne funkcje ureazy obejmują hydrolizę mocznika, prowadzącą do utworzenia karbaminianu i amoniaku. Inhibitor działa bezpośrednio na ureazę gdy inhibitor wiąże się z ureazą przez oddziaływania elektrostatyczne lub chemiczne. W takich oddziaływaniach mogą lub nie pośredniczyć inne cząsteczki. Inhibitor działa pośrednio na ureazę gdy jego najbardziej bezpośrednie działanie wpływa na cząsteczkę inną niż ureaza, która to cząsteczka wpływa na ekspresję, aktywację lub funkcjonowanie ureazy.
PL 217 626 B1
Środek zwiększający aktywność ureazy obejmuje cząsteczkę lub grupę cząsteczek, która wzmacnia: (1) ekspresję, modyfikację, regulację, aktywację lub degradację ureazy; lub (2) jedną lub więcej normalnych funkcji ureazy. Środek zwiększający aktywność działa pośrednio na ureazę gdy jego najbardziej bezpośrednie działanie wpływa na cząsteczkę inną niż ureaza, która to cząsteczka wpływa na ekspresję, aktywację lub funkcjonowanie ureazy.
Termin zaprojektowana mutacja w genie kodującym ureazę, obejmuje zmiany w sekwencji nukleotydowej genu kodującego ureazę, która prowadzi do utworzenia 1) zwiększonej lub obniżonej ilości białka ureazy względem ilości wytwarzanej przy braku takiej zmiany; lub (2) białko ureazy mające zwiększone lub uszkodzone normalne funkcjonowanie względem takiego samego funkcjonowania bez takiej zmiany.
Termin kompozycja farmaceutyczna oznacza kompozycję odpowiednią do zastosowania farmaceutycznego u osobnika, obejmującego zwierzę lub człowieka. Kompozycja farmaceutyczna ogólnie obejmuje skuteczne ilości środka aktywnego i nośnik, obejmujący, np. farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
Termin farmaceutycznie dopuszczalny preparat obejmuje preparat, który jest odpowiedni do podawania środka aktywnego (np. ureazy lub modulatora ureazy) w sposób, który prowadzi do żądanych wyników i nie wytwarza żadnych dodatkowych szkodliwych działań ubocznych, dostatecznych aby przekonać lekarza, że ewentualna szkoda dla pacjenta jest większa niż ewentualna korzyść dla pacjenta. Podstawowym składnikiem do preparatu do iniekcji jest typowo nośnik wodny. Nośniki będące roztworami wodnymi, które są użyteczne obejmują roztwór chlorku sodu (NaCI), roztwór Ringera, roztwór NaCI/dekstroza i tym podobne. Mieszające się z wodą nośniki są również użyteczne do uzyskania pełnej rozpuszczalności środka aktywnego. Środki przeciwbakteryjne, bufory i przeciwutleniacze mogą być użyteczne, w zależności od potrzeby. Podobnie, farmaceutycznie dopuszczalna” sól farmaceutycznie dopuszczalna pochodna związku, jak określono tutaj, jest solą lub inną pochodną, która nie jest biologicznie lub w inny sposób niepożądana.
Określenie kontrolowane uwalnianie ma odnosić się do dowolnego preparatu zawierającego lek, w którym sposób i profil uwalniania leku z preparatu są kontrolowane. Określenie kontrolowane uwalnianie odnosi się do preparatów o natychmiastowym jak i nie natychmiastowym uwalnianiu, w przypadku preparatów o nienatychmiastowym uwalnianiu obejmują one, lecz nie ograniczając zakresu, preparat o przedłużonym uwalnianiu i opóźnionym uwalnianiu.
Określenie przedłużone uwalnianie (również określane jako wydłużone uwalnianie) zastosowano w znaczeniu tradycyjnym i odnosi się do preparatu leku, który zapewnia stopniowe uwalnianie leku w dłuższym okresie czasu, i korzystnie, pomimo, że nie jest to konieczne, prowadzi do zasadniczo stałego poziomu leku we krwi przez dłuższy okres czasu. Określenie opóźnione uwalnianie zastosowano w znaczeniu tradycyjnym i odnosi się do preparatu leku, w którym występuje opóźnienie w czasie pomiędzy podaniem preparatu a uwalnianiem leku z tego preparatu. Termin opóźnione uwalnianie może lub nie wymagać stopniowego uwalniania leku przez dłuższy okres czasu, a zatem może lub nie być przedłużonym uwalnianiem.
Termin traktowanie lecznicze oznacza stosowanie leczenia u osobnika, u którego występują objawy lub znaki patologii, choroby, lub zaburzenia, przy czym leczenie stosuje się u osobnika, aby złagodzić lub usunąć te oznaki lub objawy patologii, choroby, lub zaburzenia. Termin aktywność terapeutyczna oznacza aktywność środka, takiego jak kwas nukleinowy, wektor, gen, polipeptyd, białko, substancja, lub ich kompozycji, które łagodzą lub usuwają znaki lub objawy patologii, choroby lub zaburzenia, gdy stosuje się u osobnika cierpiącego z powodu tych znaków lub objawów. Środek lub związek użyteczny terapeutycznie (np. kwas nukleinowy lub polipeptyd) wskazuje, że środek lub związek jest użyteczny w łagodzeniu, leczeniu, lub eliminacji znaków lub objawów patologii, choroby lub zaburzenia.
Określenie mała cząsteczka obejmuje związek lub kompleks cząsteczek, zarówno syntetycznych, pochodzenia naturalnego, jak i częściowo syntetycznych, które korzystnie mają masę cząsteczkową poniżej 5000 Daltonów. Korzystniej, mała cząsteczka ma masę cząsteczkową od 100 do 1500 Daltonów.
Określenia cząsteczka kwasu nukleinowego lub oligonukleotyd” lub ich gramatyczne równoważniki, odnoszą się tutaj do przynajmniej dwóch nukleotydów kowalencyjnie związanych razem, i typowo do cząsteczek RNA, DNA i cDNA. Kwas nukleinowy korzystnie oznacza cząsteczkę jednoniciową lub dwuniciową, i będzie ogólnie zawierać wiązania fosfodiestrowe, pomimo, że w pewnych przypadkach analogi kwasu nukleinowego, mogą mieć inne szkielety zawierające, na przykład, wiązaPL 217 626 B1 nia fosforamidowe, fosforotiolanowe, fosforoditionianowe, i/lub O-metylofosforoamidynowe. Będzie zrozumiałe, że na skutek degeneracji kodu genetycznego, może być utworzonych wiele sekwencji nukleotydowych kodujących dane peptydy, takie jak ureaza.
Heterologiczny konstrukt lub sekwencja kwasu nukleinowego oznacza, że zawiera część sekwencji, która nie jest natywna względem komórki, w której zachodzi ekspresja. Heterologiczny, w odniesieniu do sekwencji kontrolnej, odnosi się sekwencji kontrolnej (to jest, promotora lub środka zwiększającego aktywność) który nie funkcjonuje w naturze, do regulacji ekspresji tego samego genu, który jest w tym momencie regulowany. Ogólnie, heterologiczne sekwencje kwasu nukleinowego nie są endogenne dla komórki lub nie są częścią genomu, w którym są one obecne, i zostały dodane do komórki, przez infekcję, transfekcję, mikroiniekcję, elektroporację, i tym podobne. Heterologiczny konstrukt kwasu nukleinowego może zawierać połączenie sekwencja kontrolna/sekwencja DNA, która jest taka sama jak, lub różna od takiego połączenia sekwencja kontrolna/sekwencja DNA naturalnie występującego w komórce.
Jak stosowano tutaj, określenie wektor odnosi się do konstruktu kwasu nukleinowego projektowanego do przeniesienia materiału genetycznego pomiędzy różnymi komórkami gospodarza. Termin wektor ekspresyjny odnosi się do wektora, który ma zdolności do wbudowywania i prowadzenia ekspresji heterologicznych fragmentów DNA w kolejnej komórce. Wiele prokariotyczynch i eukariotycznych wektorów ekspresyjnych jest komercyjnie dostępnych. Wybór odpowiednich wektorów ekspresyjnych należy do biegłego w tej dziedzinie.
Jak stosowano tutaj, kaseta ekspresyjna lub „wektor ekspresyjny oznacza konstrukt kwasu nukleinowego wytworzony technikami rekombinacji lub syntetycznie, z kolejnymi szczególnymi elementami kwasu nukleinowego, które umożliwiają transkrypcję danego kwasu nukleinowego w docelowej komórce lub in vitro. Zrekombinowana kaseta ekspresyjna może być włączona do plazmidu, chromosomu, mitochondrialnego DNA, plastydowego DNA, wirusa, lub fragmentu kwasu nukleinowego. Typowo, część zrekombinowanej kasety ekspresyjnej wektora ekspresyjnego obejmuje, między innymi sekwencje, sekwencję kwasu nukleinowego która ma ulegać transkrypcji i promotor.
Jak stosowano tutaj, określenie plazmid odnosi się do kołowego dwuniciowego konstruktu DNA stosowanego jako wektor klonujący i który tworzy pozachromosomowy, samoreplikujący się element genetyczny w wielu bakteriach i pewnych komórkach eukariotycznych.
Jak stosowano tutaj, określenie marker (znacznik) do selekcji kodującej sekwencji kwasu nukleinowego odnosi się do sekwencji nukleotydowej, która jest zdolna do ekspresji komórkach gospodarza i gdzie ekspresja markera do selekcji nadaje komórkom zawierającym gen, który ulega ekspresji zdolność do wzrostu w obecności odpowiedniego selektywnego środka.
Jak stosowano tutaj, określenia promotor oraz inicjator transkrypcji odnoszą się do sekwencji kwasu nukleinowego, która wpływa poprzez zapoczątkowanie transkrypcji na ekspresję genów położonych funkcjonalnie za nim. Promotor ogólnie będzie odpowiednio dobrany do komórki gospodarza, w których docelowy gen ulega ekspresji. Promotor, razem z innymi transkrypcyjnymi i translacyjnymi sekwencjami regulatorowymi kwasu nukleinowego (również nazwanymi sekwencjami kontrolnymi), są konieczne aby uzyskać ekspresję danego genu. Ogólnie, transkrypcyjne i translacyjne sekwencje regulatorowe obejmują, nie ograniczając zakresu, sekwencje promotora, rybosomowe miejsca wiążące, sekwencje rozpoczęcia i zakończenia transkrypcji, sekwencje rozpoczęcia i zakończenia translacji, i sekwencje enhansera lub aktywatora.
Gen chimeryczny lub heterologiczny konstrukt kwasu nukleinowego, jak zdefiniowano tutaj odnosi się do nie występującego naturalnie genu (to jest, genu, który został wprowadzony do gospodarza), który może być złożony z części różnych genów, obejmujących elementy regulatorowe. Konstrukt genu chimerycznego do transformacji komórki gospodarza jest typowo złożony z regionu regulatorowego transkrypcji (promotor) funkcjonalnie związanego z heterologiczną sekwencją kodującą białko, lub w genie chimerycznym z markerem do selekcji, z gen kodującym białko markera do selekcji, nadające transformowanym komórkom gospodarza oporność na antybiotyki. Typowy gen chimeryczny, do transformacji komórki gospodarza, obejmuje region regulatorowy transkrypcji, który stale ulega ekspresji lub polega indukcji, sekwencję kodującą białko i sekwencję terminatora. Konstrukt genu chimerycznego może również obejmować drugą sekwencję DNA kodującą peptyd sygnałowy jeśli wydzielanie docelowego białka jest pożądane.
Kwas nukleinowy jest funkcjonalnie związany, gdy jest umieszczony w połączeniu funkcjonalnym z inną sekwencją kwasu nukleinowego. Na przykład, DNA kodujący wydzielniczą sekwencję liderową jest funkcjonalnie związany z DNA kodującym polipeptyd, jeśli ulega on ekspresji jako wstępny
PL 217 626 B1 produkt białkowy, który uczestniczy w wydzielaniu polipeptydu; promotor lub środek zwiększający aktywność jest funkcjonalnie związany z sekwencją kodującą, jeśli wpływa na transkrypcję sekwencji; lub miejsce wiążące rybosom jest funkcjonalnie związane z sekwencją kodującą, jeśli jest umieszczone tak aby ułatwiać translację. Ogólnie funkcjonalnie związany oznacza, że sekwencje DNA będące połączone sąsiadują ze sobą, a w przypadku wydzielniczej sekwencji liderowej, przylegające i w fazie odczytu. Jednakże, środki zwiększające aktywność nie muszą do siebie przylegać. Połączenie uzyskuje się w wyniku Ligacji i dogodnych miejsc restrykcyjnych. Jeśli takie miejsca nie istnieją, syntetyczne oligonukleotydowe adaptory lub łączniki są stosowane zgodnie z tradycyjną praktyką.
Jak stosowano tutaj, określenie gen oznacza segment DNA biorący udział w produkcji polipeptydowego łańcucha, który może lub nie obejmować regiony przed i po regionie kodującym, np. 5' nie ulegające translacji (5'UTR) lub Iiderowe sekwencje i 3'UTR lub dodane sekwencje, jak i sekwencje przerywnikowe (introny) pomiędzy poszczególnymi segmentami kodującymi (egzony).
Jak stosowano tutaj, zrekombinowany/a obejmuje odniesienia do komórki lub wektora, które zostały zmodyfikowane przez wprowadzenie heterologicznej sekwencji kwasu nukleinowego lub że komórka pochodzi z tak zmodyfikowanej komórki. Zatem, na przykład, zrekombinowane komórki prowadzą ekspresję genów, które nie występują w naturze w identycznej postaci w obrębie natywnej (niezrekombinowanej) postaci komórki lub prowadzą ekspresję natywnych genów, które w innym przypadku ulegają nietypowej ekspresji, obniżonej ekspresji lub nie ulegają ekspresji jako wynik celowego działania ludzi.
Termin wprowadzona, w kontekście wprowadzenia sekwencji kwasu nukleinowego do komórki, oznacza transfekcję, transformację lub transdukcję i obejmuje odniesienie do włączenia sekwencji kwasu nukleinowego do eukariotycznej lub prokariotycznej komórki, przy czym sekwencja kwasu nukleinowego może być włączona do genomu komórki (na przykład, chromosomowy, plazmidowy, plastydowy, lub mitochondrialny DNA), przekształcane do autonomicznej replikacji, lub czasowo ulega ekspresji (na przykład, transfekowany mRNA).
Jak stosowano tutaj, określenie ekspresja, ulegać ekspresji odnosi się do procesu w wyniku którego w oparciu o sekwencję kwasu nukleinowego genu, wytwarzany jest polipeptyd. Proces obejmuje zarówno transkrypcję jak i translację.
Określenie sekwencja sygnałowa odnosi się do sekwencji aminokwasowej w części końca N białka, która ułatwia wydzielanie dojrzałej formy białka poza komórkę. Dojrzała forma zewnątrzkomórkowego białka pozbawiona jest sekwencji sygnałowej, która jest odcinana w czasie procesu wydzielania.
Przez określenie komórka gospodarza rozumie się komórkę, która zawiera wektor i umożliwia replikację, lub transkrypcję i translację (ekspresję) konstruktu ekspresyjnego. Komórki gospodarza stosowane według niniejszego wynalazku mogą być prokariotycznymi komórkami, takimi jak E. coli, lub eukaryotycznymi komórkami takimi jak komórki drożdży, komórki roślinne, owadzie, komórki płazów lub ssaków.
Jak stosowano tutaj, skuteczna ilość lub farmaceutycznie skuteczna ilość” środka aktywnego odnosi się do ilości dostatecznej, aby uzyskać mierzalną zmianę parametru fizjologicznego docelowej komórki lub osobnika i/lub aby dostarczyć lub modulować ekspresję środka aktywnego lub aktywność przez podanie jednej lub więcej niż jednej farmaceutycznych jednostek i dawkowania. Taka skuteczna ilość może być różna w zależności od osoby, w zależności od jej stanu, wzrostu, masy ciała, wieku i/lub zdrowia, trybu podawania środka aktywnego (np. ureazy Iub modulatora ureazy), danego podawanego środka aktywnego i innych czynników. W wyniku tego może być użyteczne określenie empirycznej skutecznej ilości dla danego pacjenta w odniesieniu do zgromadzonego zbioru warunków.
Wszystkie publikacje i patenty tutaj cytowane są włączone jako odnośnik celem lepszego opisu i ujawnienia kompozycji i metodyki, które mogą być stosowane w odniesieniu do wynalazku.
II. Kompozycja według wynalazku
Wynalazek obejmuje, w jednym aspekcie, kompozycję zawierającą ureazę jako środek aktywny stosowany do hamowania wzrostu komórek rakowych. Z ureazą sprzężone jest ugrupowanie naprowadzające jak opisano poniżej, do zwiększenia dostarczania środka aktywnego do komórek raka. Stwierdzono, że narażenie komórek rakowych u pacjenta na działanie ureazy, jak opisano tutaj, stanowi skuteczny sposób leczenia raka u pacjenta. Komórki rakowe mogą być częścią guza, np. guza litego lub półstałego. W innym rozwiązaniu, komórki rakowe mogą krążyć w krwioobiegu osobnika.
Rodzaje raka, guzy i/lub nowotwory obejmują nowotworowy wzrost komórek lub tkanki, w którym namnażanie komórek jest niekontrolowane i progresywne. Niektóre takie przerosty są łagodne,
PL 217 626 B1 lecz inne są nazwane złośliwymi prowadząc do śmierci organizmu. Złośliwe nowotwory są rozpoznawalne od rozrostu łagodnego poprzez to, że oprócz wykazywania agresywnej proliferacji komórek, złośliwe rodzaje raka naruszają otoczenie tkanek i dają przerzuty. Ponadto, złośliwe nowotwory są charakteryzowane poprzez to, że wykazują większe obniżenie różnicowania i ich organizacji względem siebie i otaczających ich tkanek.
Poniżej rozważane są związki będące przedmiotem kompozycji według wynalazku.
A. Ureaza
Jak wspomniano powyżej, środkiem aktywnym w kompozycji jest ureaza. Ureaza może być dowolnego pochodzenia, włącznie np. z bakterii, roślin, grzybów i wirusów. Wiele badań dostarczyło szczegółowe informacje dotyczące genetyki ureaz z wielu różnych, pod względem ewolucyjnym, odmiennych bakterii, roślin, grzybów i wirusów (Mobley, H. L. T. i wsp. (1995) Microbiol. Rev. 59: 451480; Eur. J. Biochem., 175, 151-165 (1988); Labigne, A. (1990) Międzynarodowe zgłoszenie opublikowane za nr WO90/04030; Clayon, C. L. i wsp. (1990) Nucleic Acid Res. 18,362; i Patenty U. S. o nr 6,248, 330 i 5,298,399, z których każdy jest włączony tutaj jako odnośnik). Szczególnie należy zwrócić uwagę na ureazę, którą odkryto w roślinach (Sirko, A. i Brodzik, R. (2000) Acta Biochim Pol 47 (4): 1189-95). Jedną z przykładowych ureaz roślinnych jest ureaza z kanawalii mieczokształtnej, którą opisano w przykładach 2-3. Przykładową sekwencję aminokwasową ureazy z kanawalii mieczokształtnej przedstawiono jako SEQ ID NO: 7. Użyteczne sekwencje ureazy mogą być znalezione w ogólnodostępnych bazach danych, np. Entrez (http://www.ncbi.nim.nih.gov/Entrez/). Dodatkowo, mogą być zastosowane startery, które są użyteczne do amplifikacji ureaz z wielu różnych organizmów, jak opisano w pracy Bakera, Κ. M. i Colliera, J. L. (http://www.sciencesmith.edu/departments//Biology/ /webpage/abstracts.html) lub stosując program do projektowania starterów CODEHOP (COnsensusdEgenrate Hybrid Oligonukleotyd Primer) jak opisano w Rose i wsp. (1998) Nucl. Acid Res. 26: 1628.
Ureaza może kontaktować się z komórkami guza, być zlokalizowana w środowisku zewnątrzkomórkowym lub w płynie tkankowym otaczającym komórki guza, lub ulegać ekspresji w komórkach rakowych lub w komórkach w pobliżu komórek rakowych. Niechcąc wiązać się z żadnymi mechanizmami molekularnymi leżącymi u podstawy pomyślnego hamowania wzrostu komórek rakowych przez ureazę, związek, ureaza może podnosić pH płynu tkankowego, w którym komórki rakowe są zanurzone, przez dodanie ureazy do płynu tkankowego u pacjenta. Ureaza może przekształcać substrat, jakim jest mocznik w amoniak i karbaminian. Ta aktywność enzymatyczna może zwiększać pH powodując, że środowisko będzie bardziej zasadowe (Fig. 1A-1D). Środowisko otaczające komórki raka jest typowo kwasowe (Webb, S. D., i wsp. (2001) Novartis Found Symp 240: 169-81). Zatem, przez podnoszenie w ten sposób pH zewnątrzkomórkowego środowiska, zahamowany zostaje wzrost komórek raka. Zgodnie z powyższym, w pewnych wariantach wynalazku dodanie środka aktywnego powoduje, że pH płynu tkankowego będzie podniesione o około 0,1 jednostkę pH, np. 0,1-0,5 jednostki pH lub więcej. Zatem, zgodnie z wynalazkiem środki aktywne obejmują naturalnie występujące postacie ureazy jak i funkcjonalnie aktywne jej odmiany. Dwa zasadnicze typy odmian sekwencji aminokwasowych są rozważane. Odmiany sekwencji aminokwasowej obejmują te mające jeden lub więcej podstawników w szczególnych aminokwasach, które nie niszczą aktywności ureazy. Odmiany te obejmują odmiany nieme i konserwatywnie zmodyfikowane odmiany które są zasadniczo homologicznie i funkcjonalnie równoważne z naturalnie występującym białkiem. Odmiana naturalnie występującego białka jest zasadniczo homologiczna z naturalnie występującym białkiem gdy wykazuje przynajmniej około 80%, korzystniej przynajmniej około 90%, jeszcze korzystniej przynajmniej około 95%, jeszcze bardziej korzystnie 98%, i najkorzystniej przynajmniej około 99% identyczności jej sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową naturalnie występującego białka. Odmiana może różnić się tylko 1 lub aż do 10 lub więcej aminokwasami.
Drugi rodzaj odmian obejmuje odmiany wielkościowe ureazy które są wyodrębnione - fragmenty aktywne ureazy. Odmiany wielkościowe mogą być utworzone np. przez fragmentowanie ureazy, przez chemiczne modyfikacje, w wyniku proteolitycznego cięcia enzymami, lub w wyniku połączenia tych metod. Dodatkowo do wytwarzania odmian wielkościowych mogą być zastosowane techniki inżynierii genetycznej, jak i metody syntezy polipeptydów bezpośrednio z reszt amin okwasowych.
Terminem równoważnik funkcjonalny określa się, że sekwencja odmiany definiuje łańcuch, który produkuje białko mające zasadniczo taką samą biologiczną aktywność jak ureaza występująca naturalnie. Takie równoważne funkcjonalnie odmiany, które obejmują zasadnicze odmiany sekwencji są również objęte zakresem wynalazku. Zatem, równoważne funkcjonalnie odmiany białka ureazy występującego naturalnie będą wykazały dostateczną biologiczną aktywność aby były terapeutycznie
PL 217 626 B1 użyteczne. Metody do oznaczania równoważności funkcjonalnej są dostępne w stanie techniki. Biologiczna aktywność może być mierzona stosując testy specyficznie zaprojektowane do pomiaru aktywności białka ureazy występującego naturalnie, jak w przykładzie 3. Dodatkowo, przeciwciała wytworzone przeciwko biologicznie aktywnemu, naturalnie występującemu białku mogą być badane pod kątem ich zdolności do wiązania z równoważną funkcjonalnie odmianą, gdzie skuteczne wiązanie wskazuje na białko mające podobną konformację jak naturalnie występujące białko.
Znawca zdaje sobie sprawę, że ze względu na degenerację kodu genetycznego, wiele różnych sekwencji kwasu nukleotydowego kodujących polipeptydy ureazy według wynalazku może być uzyskanych, z których niektóre mogą nieść minimalną homologię sekwencji ze znanymi sekwencjami kwasu nukleinowego kodującymi ureazę. Takie odmiany nieme są jednym z typów konserwatywnie zmodyfikowanych odmian, jak przedyskutowano poniżej. Zgodnie z wynalazkiem dostarczone są wszystkie i dowolne możliwe odmiany sekwencji kwasu nukleinowego kodujące polipeptyd, który może być wytworzony w wyniku wybrania odpowiednich kombinacji opartych na wyborze odpowiednich możliwych kodonów. Kombinacje te są wykonywane zgodnie ze standardowym trójkowym kodem genetycznym, jaki występuje w sekwencjach kwasu nukleinowego kodujących polipeptyd białka ureazy zgodnie z wynalazkiem.
Polipeptydy ureazy według niniejszego wynalazku obejmują jeden lub więcej konserwatywnie zmodyfikowane odmiany (lub po prostu odmiany konserwatywne) sekwencji znanych polipeptydów ureaz. Takie konserwatywne odmiany obejmują podstawienia, addycje lub delecje, które zmieniają, dodają lub usuwają jeden aminokwas lub niewielki procent aminokwasów. Osoba o typowej wiedzy w tej dziedzinie z pewnością rozpozna, że poszczególne: podstawienie, delecja, lub addycja które powodują podstawienia, delecje lub dodanie jednego aminokwasu lub niewielkiego procentu aminokwasów (typowo poniżej 5%, bardziej typowo poniżej 4%, 2%, 1%, lub mniej) w sekwencji typowo tworzy odmiany konserwatywne, w których w wyniku takich zmian uzyskuje się usunięcie aminokwasu, dodanie aminokwasu, lub podstawienie aminokwasu przez chemicznie podobny aminokwas.
Tabele podstawień konserwatywnych zapewniających funkcjonalnie podobne aminokwasy są dobrze znane specjalistom o typowej wiedzy w tej dziedzinie. Tabela 1 przedstawia sześć grup, które zawierają aminokwasy, które obejmują podstawienia konserwatywne lub odmiany konserwatywne względem siebie.
T a b e l a 1. Grupa podstawień konserwatywnych
1 Alanina (A) Seryna (S) Treonina (T)
2 Kwas asparaginowy (D) Kwas glutaminowy (E)
3 Asparagina (N) Glutamina (Q)
4 Arginina (R) Lizyna (K)
5 Izoleucyna (I) Leucyna (L) Metionina (M) Walina (V)
6 Fenyloalanina (F) Tyrozyna (Y) Tryptofan (W)
Mogą być również utworzone kolejne grupy aminokwasów. Na przykład, aminokwasy mogą być podzielone na grupy, które mają podobną funkcję lub chemiczną strukturę lub skład (np. kwasowe, zasadowe, alifatyczne, aromatyczne, zawierające siarkę). Na przykład, grupowanie ze względu na alifatyczność może obejmować: glicynę, alaninę, walinę, leucynę, izoleucynę. Inne grupy zawierające aminokwasy, które stanowią podstawienia konserwatywne względem siebie obejmują poniższe: (i) aromatyczne: fenyloalanina, tyrozyna, tryptofan (ii) zawierające siarkę: metionina, cysteina; (iii) zasadowe: arginina, lizyna, histydyna i (iv) kwasowe: kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, asparagina, glutamina. Patrz Creighton (1984) Proteins, W. H. Freeman and Company, pod kątem dalszego grupowania aminokwasów.
Sekwencje białka ureazy według wynalazku, włącznie z konserwatywnie podstawionymi sekwencjami, mogą być obecne jako część większych polipeptydowych sekwencji takich jak te, które występują w wyniku dodania jednej lub więcej niż jednej domen koniecznych do oczyszczania białka
PL 217 626 B1 (np. segmenty poli his, segmenty etykiet FLAG, itp.), np. gdzie dodatkowe funkcyjne domeny mają miały lub nie mają żadnego wpływu na aktywność części obejmującej białko ureazy, lub gdzie dodatkowe domeny mogą być usunięte przez etapy obróbki po syntezie, takie jak działanie proteazą.
Dodanie jednego lub więcej niż jednego kwasu nukleinowego lub sekwencji, które nie zmieniają kodowanej aktywności cząsteczki kwasu nukleinowego, takie jak dodatkowe niefunkcjonalne sekwencje, prowadzi do odmiany konserwatywnej podstawowej cząsteczki kwasu nukleinowego, a dodanie jednej lub więcej niż jednej reszty aminokwasowej, która nie zmienia aktywności polipeptydu według wynalazku jest odmianą konserwatywną podstawowego polipeptydu. Oba takie typy dodania są rozwiązaniami według wynalazku. Osoba o typowej wiedzy w tej dziedzinie doceni, że wiele odmian konserwatywnych konstruktów kwasu nukleinowego, który ujawniono daje funkcjonalnie identyczny konstrukt.
Może być stosowanych wiele różnych metod oznaczania powiązań pomiędzy sekwencjami, obejmujących przypisanie ręczne oraz przypisanie i analizę sekwencji przy pomocy oprogramowania komputerowego. To ostatnie podejście jest korzystne według niniejszego wynalazku, ze względu na zwiększoną wydajność uzyskaną przy metodach z zastosowaniem oprogramowania komputerowego. Dostępnych jest wiele różnych programów komputerowych do przeprowadzenia przypisania sekwencji, lub mogą one być opracowane przez specjalistę w dziedzinie.
Jak zauważono powyżej, sekwencje kwasów nukleinowych i polipeptydów (i ich fragmenty) zastosowane w wynalazku nie muszą być identyczne, lecz mogą być zasadniczo identyczne (lub zasadniczo podobne), do odpowiedniej sekwencji polipeptydu ureazy lub cząsteczki kwasu nukleinowego (lub jego fragmentu) lub pokrewnej cząsteczki. Na przykład, polipeptydy mogą być przedmiotem różnych zmian, takich jak insercje, delecje i podstawienia jednego lub więcej aminokwasu lub kwasu nukleinowego, zarówno konserwatywnych jak i nie konserwatywnych, obejmujących przypadki, w których np. takie zmiany mogłyby zapewnić pewne korzyści w ich zastosowaniu np. w zastosowaniu terapeutycznym lub profilaktycznym lub podawaniu lub w zastosowaniu diagnostycznym.
Przypisanie i porównanie stosunkowo krótkich sekwencji aminokwasowych (krótszych niż około 30 reszt) jest typowo bezpośrednie. Porównanie dłuższych sekwencji może wymagać bardziej skomplikowanych metod, aby osiągnąć optymalne przypisane dwóch sekwencji. Optymalne przypisanie sekwencji w celu przypisania porównywanych okienek może być przeprowadzone stosując algorytm miejscowych homologii według Smitha i Watermana (1981) Adv Appl Math 2: 482; stosując algorytm przypisania homologii według Needlemana i Wunscha (1970) J Mol Biol 48: 443, przez przeszukiwania pod kątem podobieństwa metodą Pearsona i Lipmana (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444, stosując implementację komputerową tych algorytmów (GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA w oprogramowaniu Wisconsin Gentics Software Package Release 7.0, Gentics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.; i BLAST, patrz np. Altschul i wsp. (1977) Nuc Acids Res 25: 3389-3402 i Altschul i wsp. (1990) J Mol Biol 215: 403-410), lub przez badanie pod kątem najlepszego przypisania (to jest, uzyskanie największego procenta podobieństwa sekwencji lub identyczności sekwencji w obszarze porównywanego okienka) wytworzone dowolną metodą wybraną z różnych metod.
Przykładowym algorytmem, który jest odpowiedni do oznaczania procentu identyczności sekwencji (procent identyczności) i podobieństwa sekwencji jest algorytm FASTA, który opisano w Pearson, W. R. & Lipman, D. J. (1988) Proc Nat'I Acad Sci USA 85: 2444. Patrz również, W. R. Pearson (1996) Methods Enzymology 266: 227-258. Korzystne parametry stosowane w przypisaniu FASTA sekwencji DNA aby obliczyć procent identyczności są zoptymalizowane, BL50 macierz 15:-5, k-krotny=2; utrata punktów w wyniku łączenia (joining penalty) =40, optymalizacja =28; utrata punktów za przerwę =-12, utrata punktów za długość przerwy =-2; i szerokość = 16.
Będzie zrozumiałe dla osoby o typowej wiedzy w tej dziedzinie, że powyższa dyskusja dotycząca algorytmów przeszukiwania i porównywania również dotyczy identyfikacji i określania sekwencji polinukleotydowych, z podstawieniem rozpatrywanych sekwencji zawierającym nukleotydowe sekwencje, i gdy jest to odpowiednie wybranie baz danych dla kwasu nukleinowego.
B. Związana cząstka chemiczna
Kompozycja według wynalazku może obejmować cząstkę chemiczną która jest związana z ureazą, aby zwiększyć dostarczanie ureazy do komórek rakowych. Szeroki wybór związanych chemiczne cząstek jest możliwy do stosowania jak opisano poniżej.
B1. Ugrupowania naprowadzające
PL 217 626 B1
Ugrupowania naprowadzające są rozważane jako chemiczne cząstki według niniejszego wynalazku i wiążą się ze zdefiniowanym, wybranym typem komórki lub docelową populacją komórek, takich jak komórki rakowe. Ugrupowania naprowadzające użyteczne w tym względzie obejmują przeciwciała i fragmenty przeciwciał, peptydy i hormony. Białka odpowiadające znanym receptorom powierzchniowym komórek (obejmujące Iipoproteiny o małej gęstości, transferynę i insulinę), enzymy fibrinolityczne, anty-HER2, białka wiążące płytek takie jak aneksyny i czynniki modyfikujące biologiczną odpowiedź (obejmujące interleukinę, interferon, erytropoetynę i czynnik stymulacji wzrostu kolonii) są również rozważane jako ugrupowania naprowadzające.
Oligonukleotydy np. antysensowe oligonukleotydy, które są komplementarne z częścią kwasu nukleinowego docelowej komórki, mogą być stosowane jako ugrupowania naprowadzające zgodnie z niniejszym wynalazkiem. Ugrupowania naprowadzające mogą również być oligonukleotydami, które wiążą się z powierzchnią docelowej komórki. Analogi powyżej wymienionych ugrupowań naprowadzających, które zachowują zdolność do wiązania się ze zdefiniowaną docelową populacją komórek mogą również być stosowane jako ugrupowania naprowadzające.
Funkcjonalne równoważniki wymienionych powyżej ugrupowań naprowadzających są również użyteczne jako ugrupowania naprowadzające zgodnie z niniejszym wynalazkiem wynalazku. Przykładowymi funkcjonalnymi równoważnikami ugrupowań naprowadzających jest organiczny chemiczny konstrukt zaprojektowany, aby naśladować odpowiednie układy (konfiguracje) i/lub orientację w celu wiązania się z komórką docelową dla ugrupowania naprowadzajacego. Inny funkcjonalny równoważnik ugrupowania naprowadzającego stanowi krótki polipeptyd, który wykazuje powinowactwo wiązania takie jak ugrupowanie naprowadzające. Korzystne ugrupowania naprowadzające zgodnie z niniejszym wynalazkiem stanowią przeciwciała, peptydy, oligonukleotydy i tym podobne, które reagują z antygenem na powierzchni docelowej komórki. Mogą być zastosowane przeciwciała poliklonalne, jak i monoklonalne, które są bądź dostępne komercyjnie, bądź opisane w literaturze. Przeciwciała mogą być całymi przeciwciałami lub tylko ich fragmentami. Monoklonalne przeciwciała i ich fragmenty mogą być wytwarzane zgodnie z tradycyjnymi technikami, takimi jak synteza w hybrydomie, techniki rekombinacji DNA i synteza białek. Użyteczne monoklonalne przeciwciała i ich fragmenty mogą pochodzić z dowolnego gatunku (obejmującego ludzi) lub mogą być utworzone jako chimeryczne białka, które wykorzystują sekwencje z więcej niż jednego gatunku.
W jednym rozwiązaniu wynalazku, jako ugrupowania naprowadzające stosowane są ludzkie monoklonalne przeciwciała lub humanizowane mysie przeciwciała. Humanizowane ugrupowania naprowadzające są zdolne do obniżania immunoreaktywności przeciwciała lub polipeptydu w organiźmie otrzymującego je gospodarza, pozwalając na zwiększenie półokresu życia i zmniejszenie niekorzystnych reakcji immunologicznych. Mysie monoklonalne przeciwciała mogą być humanizowane stosując, np., genetyczną rekombinację sekwencji nukleotydowej kodującej mysi region Fv lub ich regiony determinujące komplementarność z sekwencją nukleotydową kodującą ludzką domenę stałego regionu i region Fc. Mysie reszty mogą również być zachowane w obrębie ludzkiego szkieletu domeny zmiennego regionu, aby zapewnić właściwą charakterystykę wiązania z miejscem docelowym. Nieograniczający przykład ugrupowania naprowadzającego stanowi przeciwciało anty-a-2-GP przeciwko glejowym komórkom mózgu (alfa-2-glikoproteina) które opisali Slepnev i wsp., Bioconjugate Chem. 3: 273-274 (1992). Przeciwciała uzyskane metodami inżynierii genetycznej w celu dostarczania różnych środków aktywnych do komórek raka przedstawiono w formie przeglądowej w pracy Bodey'a, B. (2001) Expert Opin. Biol. Ther. 1 (4): 603-17.
W innym rozwiązaniu wynalazku, ugrupowanie naprowadzające jest ligandem, który reaguje z receptorem na powierzchni docelowej komórki. Zatem, ugrupowanie naprowadzające może obejmować, nie ograniczając zakresu, hormony o powinowactwie do komórkowego składnika wiążącego, dowolnej cząsteczki zawierającej węglowodanową część cząsteczki rozpoznawaną przez komórkowy składnik wiążący i leki lub małe cząsteczki, które wiążą się z komórkowym składnikiem wiążącym. Określenie składnik wiążący obejmuje zarówno cząsteczkę receptora i jak cząsteczkę akceptora. Korzystnie, składnik wiążący jest składnikiem wiążącym na powierzchni komórek. W jednym rozwiązaniu, ugrupowanie naprowadzające jest naturalnie występującym białkiem, takim jak insulina, które wiąże się z docelowym miejscem. Cytokiny, obejmujące interleukiny i czynniki takie jak czynnik stymulujący wzrost kolonii granulocytów/makrofagów (GM-CSF) i czynnik martwicy guza (TNF) również stanowią specyficzne ugrupowania naprowadzające, które jak wiadomo wiążą się ze specyficznymi komórkami prowadzącymi ekspresję na wysokim poziomie ich receptorów (Terlikowski, SJ (2002) Toxicology 174 (3): 143-152).
PL 217 626 B1
W celu obniżenia narażenia działania ureazy lub innego środka aktywnego na komórki lub tkanki nie będące celem działania, ugrupowania naprowadzające mogą być przeszukiwane tak, aby zidentyfikować te, które wykazują minimalną reaktywność z komórkami/tkankami nie będącymi celem działania, jednocześnie zachowując specyficzność i reaktywność wobec komórek/tkanek docelowych. W wyniku obniżenia działania niespecyficznego (brak wpływu na komórki nie będące celem działania) (i niekorzystnej lokalizacji i/lub toksyczności poza celem działania), mogą być podawane zwiększone dawki ureazy lub innego środka aktywnego. To umożliwia podawanie najwyższych możliwych stężeń ureazy lub innego środka terapeutycznego w celu maksymalnego działania na komórki docelowe, podczas gdy toksyczność względem komórki nie będącej celem działania pozostaje poniżej niedopuszczalnego progu toksyczności.
W pewnych rozwiązaniach wynalazku, wykorzystane są koniugat dwóch lub więcej środków aktywnych z ugrupowaniem naprowadzającym, gdzie każdy koniugat obejmuje różne ugrupowania naprowadzające np. różne rodzaje przeciwciał. Każde z zastosowanych ugrupowań naprowadzających wiąże się z różnym miejscem regionu docelowego, które może być związane z takim samym lub różnym miejscem docelowym. Składnik środka aktywnego każdego podawanego koniugatu może być takie same lub różne. Patrz np. patenty U.S. nr 4,867,962 i 5,976,535, z których każdy jest włączony tutaj jako odnośnik. W praktyce tego rozwiązania wynalazku, połączenie miejsca docelowego koniugatu środka aktywnego z miejscem docelowym jest poprawione, ponieważ każde ugrupowanie naprowadzające, np. cząsteczki przeciwciała, rozpoznaje inny region miejsca docelowego np. epitop miejsca docelowego. To alternatywne podejście do regionu miejsca docelowego dostarcza więcej punktów wiążących, możliwych w obrębie miejsca docelowego dla środka aktywnego.
Wskutek tego, można uniknąć rzeczywistego lub skutecznego wysycenia miejsc docelowych, np. przez wysycenie epitopu i/lub zawadę steryczną. Zatem, addycyjna akumulacja środka aktywnego, np. ureazy, może być uzyskana. W innym rozwiązaniu, lub łącznie, dodatkowe specyficzne względem ureazy produkty genowe mogą być zastosowane jako środki aktywne, np. w celu utworzenia katalitycznie aktywnego holoenzymu w miejscu docelowym. Przykładowy apoenzym ureazy obejmuje podjednostki gamma, beta i alfa kodowane przez bakteryjne geny ureABC (Burne, R. A. i Chen, Y. M. (2000) Microbes and Infection 2: 533-542). Wzory reaktywności krzyżowej monoklonalnych przeciwciał skierowanych przeciwko poszczególnym miejscom docelowym mogą być analizowane w celu zidentyfikowania zbioru dwóch lub więcej monoklonalnych przeciwciał specyficznych dla miejsca docelowego z nie nachodzącą na siebie reaktywnością krzyżową stosowaną w zastosowaniach diagnostycznych lub terapeutycznych. Określenie nie nachodząca na siebie reaktywność krzyżowa oznacza, że tkanki nie będące celem działania związane przez cząsteczki jednego przeciwciała różnią się zasadniczo od tkanek nie będących celem działania związanych przez inne cząsteczki przeciwciała. Wzory reaktywności krzyżowej różnią się w zakresie koniecznym, aby stosunkowo obniżyć poddanie działaniu środka aktywnego w zastosowaniach terapeutycznych. Korzystne jest mniejsze nakładanie się par przeciwciał (lub większych grup przeciwciał).
Przeciwciała mogą być przeszukiwane różnymi metodami. Analizy immunohistochemiczne mogą być zastosowane do określenia reaktywności z tkanką docelową i reaktywności krzyżowej z tkanką nie będącą celem działania. Tkanki, z którymi cząsteczki przeciwciała się wiążą mogą być zidentyfikowane przez narażenie tkanek na działanie przeciwciała; przemycie tkanki w celu usunięcia wszelkiego niezwiązanego przeciwciała i wykrywanie obecności związanego przeciwciała. Procedury histochemiczne in vitro są znane w tej dziedzinie. Patrz np. Sanchez-Islas, E. i Leon-Olea, M. (2001) Nitric Oxide 5 (4): 302-16.
Kompozycja według niniejszego wynalazku może również być wykorzystana w leczeniu guzów wydzielających hCG. Ponieważ trofoblast łożyskowy jest typowym miejscem syntezy hCG, jest zrozumiałe, że zarówno ciążowe jak i nieciążowe guzy trofoblastyczne syntetyzują i wydzielają hCG. Faktycznie, pomiary hCG są użyteczne w diagnostyce tych guzów, klasyfikacji według stadiów zaawansowania guzów i do monitorowania efektu leczenia. Ponadto, pewne nietrofoblastyczne guzy mogą produkować hCG ekotopowo. hCG może działać jako czynnik wzrostu w pewnych typach guzów (Melmed S. i Braunstein GD: Human chorionic gonadotropin stimulates proliferation of Nb 2 rat lymphoma cell. J. Clin. Endocrinol. Metab 56: 1068-1070, (1983)). Patrz np. Patent U. S. Nr 6,448,022, który jest włączony tutaj jako odnośnik.
Dlatego, zgodnie z jednym wariantem wynalazku, zastosowanie przeciwciała anty-hCG, aby naprowadzić środek aktywny przeciwko guzom wydzielającym hCG powstrzymuje wzrost guza wydzielającego hCG. Zatem, w pewnych rozwiązaniach, cząstka chemiczna według wynalazku jest
PL 217 626 B1 ugrupowaniem naprowadzającym połączonym ze środkiem aktywnym i stanowi przeciwnowotworowe przeciwciało przeciwko antygenowi, przeciwciało anty-hCG lub Iigand zdolny do wiązania specyficznie z receptorami powierzchniowymi komórek raka. Ugrupowanie naprowadzające jest korzystnie, polipeptydem związanym z enzymem ureazy aby utworzyć białko fuzyjne.
Jak zauważono powyżej, zgodnie z jednym wariantem według wynalazku, środek aktywny jest bezpośrednio sprzężony z ugrupowaniem naprowadzającym. W innym zastosowaniu wynalazku, dwulub trzy-etapowe rozwiązanie zastosowano, aby dostarczyć środek aktywny do komórek rakowych. Zatem, środek aktywny może obejmować pierwszą wiążącą substancję biorącą udział w wiązaniu, która jest zdolna do oddziaływania z drugą substancją wiążącą biorącą udział w wiązaniu, a cząstka chemiczna może obejmować ugrupowanie naprowadzające, które obejmuje drugą wiążącą substancję biorącą udział w wiązaniu. Te zastosowania opisano bardziej szczegółowo w części III, poniżej.
Znawca doceni, że zgodnie z wynalazkiem ugrupowania naprowadzające i środki aktywne mogą być połączone razem w dowolnym porządku. Zatem, gdy ugrupowanie naprowadzające jest polipeptydem, środek aktywny może być połączony zarówno z końcem aminowym, jak i karboksylowym ugrupowania naprowadzającego. Ugrupowanie naprowadzające może również być połączona z wewnętrznym regionem środka aktywnego, lub odwrotnie, środek aktywny może być połączony z wewnętrznym miejscem ugrupowania naprowadzającego, dopóki przyłączony element nie wpływa niekorzystnie na odpowiednie aktywności cząsteczki.
Ugrupowanie naprowadzające i środek aktywny mogą być łączone dowolnym z wielu środków dobrze znanych specjalistom w tej dziedzinie. Typowo, środek aktywny jest sprzężony, bądź bezpośrednio bądź poprzez linker (łącznik), z ugrupowaniem naprowadzającym. Jednakże, gdy zarówno ugrupowanie naprowadzające jak i środek aktywny są polipeptydami, może być korzystnie, aby prowadzić ekspresję zrekombinowanej chimerycznej cząsteczki jako białka fuzyjnego o jednym łańcuchu.
W jednym rozwiązaniu, ugrupowanie naprowadzające (np. ahEGFR IgG Ab) jest chemicznie sprzężone z środkiem aktywnym (ureazą). Środki chemicznie sprzęgające cząsteczki są dobrze znane specjalistom.
Procedura łączenia środka aktywnego z przeciwciałem lub inną polipeptydowym ugrupowaniem naprowadzającym będzie różna w zależności od chemicznej struktury środka. Polipeptydy typowo zawierają wiele różnych grup funkcyjnych; np. grupy kwasu karboksylowego (COOH) lub wolnej aminy (NH2), które są dostępne w reakcji z odpowiednią grupą funkcyjną w obrębie środka aktywnego, aby związać z nią ugrupowanie naprowadzające.
W innym rozwiązaniu, ugrupowanie naprowadzające i/lub środek aktywny mogą być przeprowadzone w pochodne, aby uzyskać na powierzchni lub przyłączyć dodatkowe reaktywne grupy funkcyjne. Tworzenie pochodnych może wymagać przyłączenia dowolnego z wielu różnych cząsteczek Iinkerowych takich jak te dostępne z Pierce Chemical Company, Rockford III.
Linker (łącznik), jak stosowano tutaj, oznacza cząsteczkę, którą zastosowano, aby połączyć ugrupowanie naprowadzające ze środkiem aktywnym. Linker jest zdolny do tworzenia wiązań kowalencyjnych zarówno z ugrupowaniem naprowadzającym jak i z ureazą. Odpowiednie Iinkery są dobrze znane znawcom i obejmują, nie ograniczając zakresu, węglowe Iinkery o prostych lub rozgałęzionych łańcuchach, heterocykliczne węglowe linkery, lub Iinkery peptydowe. Gdy ugrupowanie naprowadzające i cząsteczka środka aktywnego są polipeptydami, linkery mogą być połączone ze składowymi aminokwasami przez grupy boczne (np. przez wiązanie dwusiarczkowe z cysteiną). Jednakże, w korzystnym rozwiązaniu, linkery będą połączone z węglem alfa grup aminowej i karboksylowej końcowych aminokwasów.
W celu utworzenia żądanego immunokoniugatu może być stosowany dwufunkcyjny linker mający jedną grupę funkcyjną reaktywną z grupą znajdującą się na danym środku, a drugą grupę oddziałującą z przeciwciałem. W innym rozwiązaniu, tworzenie pochodnych może wymagać chemicznego działania na ugrupowania naprowadzające, np. cięcie glikolu cukrowej części cząsteczki glikoproteinowego przeciwciała nadjodanem, aby utworzyć wolne grupy aldehydowe. Wolne grupy aldehydowe w obrębie przeciwciała mogą być poddane reakcji z wolnymi grupami aminowymi lub hydrazynowymi na środku aktywnym, aby związać się ze środkiem, (patrz Patent US nr 4,671,958). Znane są również procedury wytwarzania wolnych grup suIfhydrylowych w obrębie polipeptydu, takiego jak przeciwciała lub fragmenty przeciwciał, (patrz Patent US nr 4,659,839).
Znanych jest wiele procedur i cząsteczek Iinkera do połączenia z białkami, takimi jak przeciwciała, różnych związków obejmujących chelaty metalu radionuklidów, toksyny i leki (patrz np. europejskie zgłoszenie patentowe nr 188,256; patenty US nr 4,671,958,4, 659,839, 4,414,148,4, 699,784;
PL 217 626 B1
4,680,338; 4,569,789; i 4,589,071 oraz praca Borlinghausa i wsp. (1987) Cancer Res. 47: 4071-4075). Zwłaszcza, wytwarzanie różnych immunotoksyn jest dobrze znane w tej dziedzinie i może być znalezione, na przykład w Monoclonal Antibody-Toxin Conjugates: Aiming the Magic Bullet, Thorpe i wsp., Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, Academic Press, str. 168-190 (1982), Waldmann (1991) Science, 252: 1657, patenty US nr 4,545,985 i 4,894,443.
W pewnych warunkach pożądane jest aby uwolnić cząsteczkę środka aktywnego z ugrupowania naprowadzającego, po osiągnięciu przez chimeryczną cząsteczkę swojego miejsca docelowego. Dlatego, chimeryczne koniugaty zawierające linkery, które mogą być odcinane w pobliżu miejsca docelowego mogą być stosowane, gdy efektor ma być uwolniony w miejscu docelowym. Odcinanie linkera, aby uwolnić środek aktywny od ugrupowania naprowadzającego, może być przeprowadzone w wyniku działania enzymatycznego lub w warunkach, którym koniugat jest poddany bądź wewnątrz docelowej komórki lub w pobliżu miejsca docelowego. Powinno być docenione, że gdy miejscem docelowym jest guz, może być stosowany linker, który może być odcięty w warunkach obecnych w miejscu guza (np. gdy jest narażony na działanie enzymów związanych z guzem lub kwasowemu pH).
Wiele różnych odcinanych linkerów jest znanych znawcom (patrz Patenty US nr 4,618,492; 4,542,225, i 4,625,014). Mechanizmy uwalniania środka aktywnego od tych grup Iinkerowych obejmują na przykład, naświetlanie nietrwałego w wyniku napromieniowania wiązania i hydrolizę katalizowaną kwasem. Patent US nr 4,671,958, na przykład, przedstawia opis immunokoniugatów zawierających linkery, które są odcinane w miejscu docelowym in vivo przez proteolityczne enzymy układu komplementarnego obecnego w organizmie pacjenta. Rozpatrując wiele różnych metod, które opisywano w odniesieniu do połączenia różnych radiodiagnostycznych związków, radioterapeutycznych związków, leków, toksyn i innych środków z ugrupowaniami naprowadzającymi, osoba biegła w tej dziedzinie będzie w stanie określić odpowiedni sposób przyłączenia danego środka do wybranego ugrupowania naprowadzającego. Gdy ugrupowanie naprowadzające i/lub środek aktywny jest stosunkowo krótki, mogą one być zsyntetyzowane stosując standardowe chemiczne techniki syntezy peptydów. Gdy obie cząsteczki są stosunkowo krótkie, chimeryczna cząsteczka może być zsyntetyzowana jako pojedyńczy ciągły polipeptyd. W innym rozwiązaniu, ugrupowanie naprowadzające i środek aktywny mogą być zsyntetyzowane oddzielnie, a następnie połączone przez kondensację aminowego końca jednej cząsteczki z karboksylowym końcem drugiej cząsteczki, w wyniku czego tworzy się wiązanie peptydowe.
W innym rozwiązaniu, ugrupowanie naprowadzające i cząsteczka środka aktywnego mogą zostać skondensowane z jednym końcem peptydowej cząsteczki łącznika, przez co tworzy się ciągłe białko fuzyjne.
Synteza w stałej fazie, w której C-końcowy aminokwas sekwencji jest przyłączony do nierozpuszczalnego podłoża, a następnie kolejno następuje dodanie pozostałych aminokwasów w sekwencji jest uważane za jedno z możliwych rozwiązań sposobu chemicznej syntezy polipeptydów według wynalazku. Techniki syntezy w stałej fazie opisano w pracy Barany'a i Merrifielda, Solid Phase Peptide Synthesis; str. 3-284 w Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Tom 2: Special Metods in Peptide Synthesis, część A., Merrifielda, i wsp.. J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156 (1963) i Stewarta i wsp., Solid Phase Peptide Synthesis, 2. wyd. Pierce Chem. Co., Rockford, III. (1984).
W korzystnym rozwiązaniu, chimeryczne białka fuzyjne według niniejszego wynalazku są zsyntetyzowane stosując technikę rekombinacji DNA. Ogólnie, obejmuje to stworzenie sekwencji DNA, która koduje białko fuzyjne, umieszczenie tego DNA w kasecie ekspresyjnej pod kontrolą odpowiedniego promotora, prowadzenie ekspresji białka w gospodarzu, wyodrębnienie uzyskanego w wyniku ekspresji białka i jeśli jest to wymagane, odzyskania naturalnej struktury białka.
DNA kodujący białka fuzyjne według wynalazku może być wytworzony w dowolny, odpowiedni sposób, obejmujący na przykład, klonowanie i cięcie odpowiednich sekwencji lub bezpośrednią chemiczną syntezę sposobami takimi jak metoda fosfotriestrowa według Naranga i wsp. (1979) Meth. Enzymol. 68: 90-99; metoda fosfodiestrowa według Browna i wsp. (1979) Meth. Enzymol. 68: 109-51; metoda dietylofosforamidynowa według Beaucage'a i wsp. (1981) Tetra. Lett., 22: 1859-1862; i metodą z zastosowaniem stałego podłoża według patentu US nr 4,458,066.
W wyniku chemicznej syntezy wytwarza się jednoniciowy oligonukleotyd. Może on być przekształcany w dwuniciowy DNA metodą hybrydyzacji z sekwencją komplementarną, lub przez polimeryzację z polimerazą DNA stosując jedną nić jako matrycę. Osoba biegła w dziedzinie rozpozna, że podczas gdy chemiczna synteza DNA jest ograniczona do sekwencji o długości około 100 zasad, dłuższe sekwencje mogą być otrzymywane w wyniku Iigacji krótszych sekwencji.
PL 217 626 B1
W innym rozwiązaniu, podsekwencje mogą być klonowane i odpowiednie podsekwencje mogą być cięte stosując odpowiednie enzymy restrykcyjne. Fragmenty te mogą następnie być Iigowane aby uzyskać żądaną sekwencję DNA.
Podczas gdy dwie cząsteczki są korzystnie zasadniczo bezpośrednio połączone razem, osoba biegła w dziedzinie doceni, że cząsteczki mogą być rozdzielone łącznikiem peptydowym składającym się z jednego lub więcej niż jednego aminokwasu. Ogólnie łącznik nie będzie miał żadnej specyficznej biologicznej aktywności innej niż połączenie białek lub zachowanie pewnej minimalnej odległości lub innego przestrzennego oddziaływania pomiędzy nimi. Jednakże, składowe aminokwasy łącznika mogą być tak dobrane, aby wpływały na pewne właściwości cząsteczki, takie jak składanie, wypadkowy ładunek, lub hydrofobowość.
Sekwencje kwasu nukleinowego kodujące białka fuzyjne mogą ulegać ekspresji w wielu różnych typach komórek gospodarza, obejmujących E. coli, innych bakteryjnych gospodarzy, drożdże, i różne komórki wyższych eukariontów, takie jak linie komórkowe COS, CHO i HeLa oraz linie komórkowe szpiczaka. Zrekombinowany gen kodujący białko będzie funkcjonalnie związany z odpowiednią sekwencją kontrolującą ekspresję dla każdego każdego gospodarza. W przypadku E. coli konstrukt obejmuje promotor taki jak promotory T7, trp, lub lambda, miejsce wiązania rybosomu i korzystnie sygnał zakończenia transkrypcji. W przypadku komórek eukariotycznych, sekwencje kontrolne będą obejmować promotor i korzystnie środek zwiększający aktywność pochodzący z genów kodujących immunoglobuliny, SV40, cytomegalowirus, itp. i sekwencję poliadenylacji, i mogą być obecne sekwencje donora i akceptora zespalania.
Plazmidy według wynalazku mogą być przenoszone do wybranej komórki gospodarza dobrze znanymi metodami takimi jak transformacja E. coli, z zastosowaniem chlorku wapnia i traktowanie fosforanem wapnia lub elektroporacja komórek ssaczych. Komórki transformowane plazmidami mogą być wybrane przez zastosowanie genów nadających oporność na antybiotyki niesionych na plazmidach, takich jak geny amp, gpt, neo i hyg.
Po uzyskaniu ekspresji, zrekombinowane białka fuzyjne mogą być oczyszczane zgodnie ze standardowymi procedurami znanymi w stanie techniki, obejmującymi wytrącenie siarczanem amonu, kolumny powinowactwa, chromatografię kolumnową, elektroforezę w żelu i tym podobne (patrz - R. Scopes (1982) Protein Purification, Springer-Verlag, N. Y.; Deutscher (1990) Methods in Enzymology Tom 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N. Y.). W celach farmaceutycznych korzystne są zasadniczo czyste kompozycje mające przynajmniej około 90 do 95% homogenności, a najbardziej korzystne są kompozycje o 98 do 99% homogenności. Po zakończeniu oczyszczania, częściowo lub do homogenności w zależności co jest pożądane, polipeptydy mogą być stosowane terapeutycznie.
Osoba biegła w dziedzinie rozpozna, że w wyniku syntezy chemicznej, ekspresji biologicznej, lub oczyszczania, naprowadzające białko fuzyjne może mieć konformację zasadniczo różną niż występujące w naturze konformacje części składowych polipeptydów. W tym przypadku, może być konieczna denaturacja i redukcja polipeptydu, a następnie umożliwienie ponownego składania polipeptydu do korzystnej konformacji. Metody redukcji i denaturacji białka, i indukowanie ponownego składania są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie (patrz Dębiński i wsp. (1993) J. Biol. Chem., 268: 14065-14070; Kreitman i Pastan (1993) Bioconjug. Chem. 4: 581-585; i Buchner, i wsp. (1992) Anal. Biochem. 205: 263-270).
Osoba biegła w dziedzinie rozpozna, że modyfikacje mogą być dokonane w naprowadząjącym białku fuzyjnym bez obniżania ich biologicznej aktywności. Pewne modyfikacje mogą być wykonane w celu ułatwiania klonowania, ekspresji, lub wbudowania ugrupowania naprowadzającego do białka fuzyjnego. Takie modyfikacje są dobrze znane znawcom i obejmują, na przykład, metioninę dodaną na końcu aminowym, aby zapewnić miejsce inicjacji, lub dodatkowe aminokwasy umieszczone na każdym końcu aby utworzyć dogodnie zlokalizowane miejsca restrykcyjne lub kodony terminacji.
B 2. Zamknięte (schwytane) środki aktywne
W pewnych rozwiązaniach, wynalazek może być zastosowany w postaci pęcherzyków takich jak liposomy i/lub nanokapsułki jako chemiczne cząstki do dostarczania środka aktywnego lub środków aktywnych, np. ureazy do komórek raka. Takie preparaty mogą być korzystne do wprowadzania farmaceutycznie dopuszczalnych preparatów polipeptydów, środków farmaceutycznych i/lub przeciwciał ujawnionych tutaj. Tworzenie i zastosowania liposomów jest ogólnie znane specjalistom w tej dziedzinie. (Patrz np. Backer, M. V., i wsp. (2002) Bioconjug Chem 13 (3): 462-7). W korzystnym rozwiązaniu, ujawniona kompozycja może być zamknięta w liposomie.
PL 217 626 B1
Nanokapsułki mogą ogólnie zamykać związki w stabilny i powtarzalny sposób (Whelan, (2001) Drug Discov. Today 6 (23): 1183-84). Aby unikać działań ubocznych ze względu na wewnątrzkomórkowe polimerowe przeciążanie, takie ultradrobne cząsteczki (o takiej wielkości około 0,1 μm ) mogą być zaprojektowane stosując polimery zdolne do ulegania degradacji in vivo. Ulegające biodegradacji poliizobutylocyjanoacrylanowe nanocząsteczki, które spełniają te wymagania są rozważane do stosowania w niniejszym wynalazku, i takie cząsteczki mogą być z łatwością wykonane, jak opisano np. w Lambert G., i wsp. (2001) Int J Pharm 214 (1-2): 13-6. Metody wytwarzania polialkilocyjanoakrylanowych nanocząsteczek zawierających biologicznie aktywnych substancji i ich zastosowanie są opisane w patentach US nr 4,329,332,4, 489,055 i 4,913,908. Nanokapsułki są dostępne komercyjnie ze źródeł takich jak Capsulution, Inc. (www.capsulution.com).
Farmaceutyczne kompozycje zawierające nanokapsułki do dostarczania środków aktywnych opisano w patentach U.S. nr 5,500,224,5, 620,708 i 6,514,481. W patencie US nr 5,500,224 opisano kompozycję farmaceutyczną w postaci koloidalnej zawiesiny nanokapsułek zawierających fazę olejową złożoną zasadniczo z oleju zawierającego rozpuszczony w nim środek powierzchniowoczynny i zawieszone w nim wiele różnych nanokapsułek mających średnicę poniżej 500 nanometrów. W US nr 5,620,708 opisano kompozycje i metody podawania leków i innych środków aktywnych. Kompozycje obejmują cząsteczki nośnika środka aktywnego połączone z wiążącą częścią cząsteczki, która wiąże się specyficznie z ugrupowaniem naprowadzającym obecnym na powierzchni ssaczego enterocytu. Wiążąca część cząsteczki wiąże się z ugrupowaniem naprowadzającym z powinowactwem wiązania lub zachłannością dostateczną, aby zapoczątkować endocytozę lub fagocytozę danego nośnika środka aktywnego tak aby nośnik został zaabsorbowany przez enterocyt. Środek aktywny zostanie następnie uwalniany z nośnika do krążenia dużego organizmu gospodarza. W ten sposób, można uniknąć degradacji leków łatwo degradujących, takich jak polipeptydy, w jelitach podczas, gdy absorpcja białek i polipeptydów z przewodu pokarmowego jest zwiększona. W innym rozwiązaniu, wynalazek rozważa uwalnianie środka aktywnego w środowisku otaczającym docelowe komórki. Na przykład, w jednym rozwiązaniu, ureaza jest uwalniana z nanokapsułek po związaniu ugrupowania naprowadzającego z docelowymi komórkami, tak że ureaza jest uwalniana do mikrośrodowiska otaczającego komórki docelowe, np. komórki guza. W patentach US nr 6,379,683 i 6,303,150 opisano metody wytwarzania nanokapsułek i ich zastosowania, i dokumenty te są włączone tutaj jako odnośniki.
Kontaktowanie obejmuje dodanie do komórki koniugatu zawierającego ugrupowanie naprowadzające i jeden peptyd tworzący zwój charakteryzujący się wybranym ładunkiem i zdolnością do oddziaływania z drugim, przeciwnie naładowanym peptydem tworzącym zwój, aby utworzyć stabilny heterodimer o α-helisowym solenoidzie. Następnie, Iiposom jest podany do komórki. Liposom obejm uje zewnętrzną powierzchnię i wewnętrzną przestrzeń; środek aktywny np. ureaza, zlokalizowana jest w wewnętrznej przestrzeni Iiposomu i wiele innych peptydów, gdzie każdy inny peptyd jest połączony z zewnętrzną powierzchnią liposomu.
W innym rozwiązaniu, opisanym szczegółowo poniżej, kontaktowanie obejmuje podawanie liposomów do komórki, przy czym liposomy zawierają środek aktywny, np. ureazę, w postaci zamkniętej i zewnętrzne powierzchnie liposomu zawierają ugrupowanie naprowadzające na komórkę skutecznie wiążące się specyficznie z docelową powierzchnią i polimer hydrofilowy powlekający skutecznie, aby ochraniać ugrupowanie naprowadzające przed oddziaływaniem z docelową powierzchnią. Polimer hydrofilowy powlekający może być wykonany z polimerowych łańcuchów, które są kowalencyjnie połączone z powierzchniowymi składnikami lipidowymi w Iiposomach wiązaniami, które mogą być zniesione. W tym rozwiązaniu, środek uwalniający jest dodany do komórek guza w ilości skutecznej aby spowodować uwalnianie zasadniczej części wiązań w dodanych liposomach, przez co wystawia się docelową powierzchnię na działanie ugrupowania naprowadzającego. Wiązania, które mogą być zniesione mogą być wiązaniami usuwanymi chemicznie takimi jak wiązania dwusiarczkowe, estrowe i peptydowe. Korzystnie, część cząsteczki mająca powinowactwo skutecznie specyficznie wiąże się z antygenem specyficznym dla raka.
Rozważany jest sposób terapii osobnika będącego ssakiem, oparty na liposomach. Sposób obejmuje układowe podawanie osobnikowi, np. podawanie dożylne, liposomów mających związane powierzchniowo ugrupowania naprowadzające i polimerową hydrofilową powłokę. Polimerowa hydrofilowa powłoka, obejmująca uwalniane połączone polimerowe łańcuchy, jest skuteczna aby osłaniać ugrupowanie naprowadzające przed oddziaływaniem z jej miejscem docelowym. Korzystne polimery hydrofilowe są przedyskutowane powyżej. Podawane liposomy mogą krążyć w krążeniu dużym aż osiągną żądane rozmieszczenie biologiczne. Środek uwalniający, jak opisano poniżej, jest podawany
PL 217 626 B1 osobnikowi w ilości skutecznej, aby spowodować cięcie zasadniczej części np. powyżej około 50%, korzystnie powyżej około 70%, i korzystniej powyżej około 90% uwalnianych wiązań w podanych liposomach. Ugrupowania naprowadzające zostają odsłonięte w wyniku uwalniania wiązań polimerowych hydrofilowych łańcuchów i mogą oddziaływać z miejscem docelowym.
Liposomy są stosowane do leczenia guzów litych. Liposomy obejmują ureazę i ewentualnie, dodatkowy środek aktywny, np. Iek przeciwnowotworowy, w postaci schwytanej i są skierowane do regionu guza w wyniku skutecznego, specyficznego wiązania ugrupowania naprowadzającego z antygenem specyficznym guza. W przykładowej metodzie, liposomy są ukierunkowane na komórki guzów śródbłonka naczyń przez włączenie Iigandu VEGF do liposomów, przez selektywne połączenie z receptorami Flk-1,2 ulegającymi ekspresji na proliferujących komórkach guza śródbłonka (Niederman, T. M., i wsp. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. 99 (10): 7009-14).
Korzystnie, liposomy mają wielkości od około 30 do 400 nm. Wykazano, że liposomy w tym zakresie wielkości mogą dostawać się do guzów przez przerwy obecne w wyściółce komórek śródbłonka naczyń guza (Maruyama, K. i wsp. (1999) Adv. Drug. Deliv. Rev. 40 (1-2): 89-102).
Po podaniu liposomów, np. przez podawanie dożylne i po dostatecznym okresie czasu pozostawionym, aby umożliwić odpowiednie rozmieszczenie liposomów w organizmie osobnika i związanie się z guzem, środek uwalniający jest podawany osobnikowi, aby uwolnić hydrofilową powłokę na powierzchni liposomów. Uwolnienie powłoki na powierzchni liposomów skutecznie odkrywa ugrupowanie naprowadzające i umożliwia wiązanie liposomów z docelowymi komórkami. W jednym rozwiązaniu, hydrofitowa powłoka na powierzchni jest połączona z Iiposomami przez wiązania wrażliwe na pH. Wiązania te są znoszone po tym, gdy liposomy zwiążą się z guzem.
Liposomy w dowolnym z rozwiązań opisanych powyżej mogą, ewentualnie, obejmować jeden lub więcej zamkniętych przeciwnowotworowych leków lub środków obrazujących lub obie te substancje. Liposomy mogą być podane i pozostawione do odpowiedniego rozmieszczenia, po czym środek uwalniający może być podawany, aby uwolnić hydrofitową powłokę na powierzchni i odkryć przyłączone ugrupowanie naprowadzające, i zapoczątkować wiązanie. Zatem, zamknięty lek przeciwnowotworowy lub środek obrazujący lub obie te substancje są specyficznie i miejscowo podawane w miejscu docelowym. Przykładowe leki przeciwnowotworowe opisano w części III. A, poniżej. Przykładowe środki obrazujące stosowane w sposobie według wynalazku opisano w części III. B, poniżej. Liposomy mogą być wytworzone i podawane jak opisano w patencie US Nr 6,043,094, który jest włączony tutaj jako odnośnik.
W niniejszym wynalazku mogą być zastosowane dodatkowe środki do podawania, takie jak w małe jednowarstwowe pęcherzyki (SUV's), jak opisano w patencie US Nr 6,180,114, który jest włączony tutaj jako odnośnik w całości.
B3. Modulatory środka aktywnego
Modulatory środka aktywnego są również rozważane jako związane chemiczne cząstki. Korzystny modulator środka aktywnego jest modulatorem ureazy. Określenie modulator ureazy oznacza bądź inhibitor ureazy bądź środek zwiększający aktywność ureazy. Modulator w kompozycjach (np. kompozycjach farmaceutycznych) zgodnie z powyższym może być wybrany ze wszystkich lub z części sekwencji polinukleotydu ureazy, antysensowych cząsteczek ureazy, polipeptydów ureazy, białka, peptydu, lub organicznych modulatorów aktywności biologicznej ureazy, takich jak inhibitory, związki antagonistyczne (obejmujących przeciwciała) lub agonistyczne. Korzystnie, modulator jest aktywny w leczeniu stanu, w którym pośredniczy, lub który jest łagodzony przez ekspresję ureazy lub aktywność ureazy.
Inhibitor ureazy obejmuje cząsteczkę lub grupę cząsteczek, które wpływają na: (1) ekspresję, modyfikację, regulację, aktywację lub degradację ureazy: lub (2) jedną lub więcej z normalnych funkcji ureazy, obejmujących hydrolizę mocznika prowadzącą do utworzenia H karbaminianu i amoniaku. Inhibitor działa bezpośrednio na ureazę, gdy inhibitor wiąże się z ureazą przez elektrostatyczne lub chemiczne oddziaływania. W takich oddziaływaniach mogą lub nie pośredniczyć inne cząsteczki. Inhibitor działa pośrednio na ureazę, gdy jego najbardziej bezpośredni wpływ jest działaniem na cząsteczki inne niż ureaza, które wpływają na ekspresję, aktywację lub funkcjonowanie ureazy.
Inhibitory ureazy służą do spowolniania przekształcenia mocznika w jony amonowe. Inhibitory ureazy obejmują nie ograniczając zakresu pochodne kwasu hydroksamowego (np. kwasu acetohydroksamowego), pochodne fosforamidowe (np. flurofamid), fosforany, tiole (np. 2-merkaptoetanol itp.), kwas borny, związki halogenowe (np. fluorki itp.), i ekstrakt z kory cynamonowca chińskiego. Dalsze
PL 217 626 B1 inhibitory ureazy są znane specjalistom w tej dziedzinie i opisane w patencie US Nr 4,824,783 (25.04.1989), który jest włączony tutaj jako odnośnik.
Środek zwiększający aktywność ureazy obejmuje cząsteczkę lub grupę cząsteczek, które zwiększają: (1) ekspresję, modyfikację, regulację, aktywację lub degradację ureazy: lub (2) jedną lub więcej z normalnych funkcji ureazy. Środek zwiększający aktywność działa bezpośrednio na ureazę, gdy środek zwiększający aktywność wiąże się z ureazą przez elektrostatyczne lub chemiczne oddziaływania. W takich oddziaływaniach mogą lub nie pośredniczyć inne cząsteczki. Środek zwiększający aktywność działa pośrednio na ureazę gdy jego najbardziej bezpośredni wpływ jest działaniem na cząsteczki inne niż ureaza, które wpływają na ekspresję, aktywację lub funkcjonowanie ureazy.
C. Dodatkowe środki aktywne
Dodatkowe środki aktywne mogą również włączone do kompozycji według wynalazku. Dodatkowe środki aktywne, np. środek przeciwnowotworowy (środek aktywny przeciwko komórkom proliferującym), mogą być wykorzystane w kompozycjach, podawane przed, równocześnie z, lub kolejno komórkom poddanym działaniu pierwszego środka aktywnego. Na przykład, po skierowaniu ureazy do komórek guza, może ona mieć zdolności modulowania lub regulacji zewnętrznego środowiska guza, np. zmiany pH. Środki aktywne, np. środki przeciwnowotworowe, które preferują zasadowe środowisko będą w wyniku tego bardziej skuteczne.
W pewnych rozwiązaniach, substraty, które będą ulegały obróbce enzymatycznej ureazy są rozważane do stosowania jako środki aktywne. Korzystnie, środek aktywny jest substratem, który ureaza może wykorzystywać, aby utworzyć jony amonowe np. mocznik.
Przykładowe przeciwnowotworowe środki obejmują cytokiny i inne cząsteczki, takie jak interleukiny (np. IL-2, IL-4, IL-6, IL-12 i tym podobne), transformujący czynnik wzrostu -beta, lymfotoksyna, czynnik martwicy nowotworu, interferony (np. interferon-gamma), czynniki stymulujące wzrost kolonii (np. GM-CSF, M-CSF i tym podobne), czynnik przepuszczalności naczyniowej, promotory Iektynowej odpowiedzi zapalnej (selektyny), takie jak selektyna L, selektyna E, selektyna P i reszty białkowe, takie jak białka receptorowe C1q i NK. Dodatkowe odpowiednie środki przeciwnowotworowe obejmują związki, które hamują angiogenzę i dlatego hamują przerzuty. Przykłady takich środków obejmują medroksyprogesteron protaminowy, polisiarczan pentosanu, suramin, taksol, talidomid, angiostatynę, interferon-alfa, inhibitory metaIoproteinazy, czynnik płytkowy 4, somatostatynę, tromobospondynę. Inne reprezentatywne i nieograniczające przykłady środków aktywnych użytecznych zgodnie z wynalazkiem obejmują winkrystynę, winblastynę, windezynę, busulfan, chlorambucil, spiroplatynę, cisplatynę, karboplatynę, metotreksan, adriamycynę, mitomycynę, bleomycynę, cytozyno arabinozyd, arabinozylo adeninę, merkaptopurynę, mitotan, prokarbazynę, daktynomycynę (antynomycynę D), daunorubicynę, chlorowodorek doksorubicyny, taksol, plilamycynę, aminoglutetimid, estramustynę, flutamid, leuprolid, octan megestrolu, tamoksyfen, testolakton, trilostan, amsacrynę (m -AMSA) , asparaginazę (L-asparaginazę), etopozyd, produkty krwiopochodne takie jak hematoporfiryny lub ich pochodne. Inne przykłady środków aktywnych obejmują materiał genetyczny taki jak kwasy nukleinowe, RNA i DNA, pochodzenia naturalnego lub syntetycznego, obejmujące zrekombinowany RNA i DNA. DNA kodujący pewne białka może być stosowany w leczeniu wielu różnych typów chorób. Na przykład, gen kodujący czynnik martwicy nowotworu lub interleukinę-2 może być dostarczony do leczenia zaawansowanych postaci raka; geny kodujące kinazę tymidyny mogą być dostarczone do leczenia raka jajników lub guzów mózgu i geny kodujące interleukinę-2 mogą być dostarczone do leczenia nerwiaka niedojrzałego, czerniaka złośliwego lub raka nerek. Dodatkowe środki aktywne rozważane do stosowana w niniejszym wynalazku opisano w Patencie US nr 6,261,537, który jest włączony tutaj jako odnośnik w całości. Przeciwnowotworowe środki i metody poszukiwania w celu wykrycia takich środków przedstawiono w pracy przeglądowej Monga, M. i Sausville, E. A. (2002) Leukemia 16 (4): 520-6. W pewnych rozwiązaniach, środek aktywny jest słabo zasadowym przeciwnowotworowym związkiem, którego skuteczność jest obniżona przez wyższy wewnątrzkomórkowy/niższy zewnątrzkomórkowy gradient pH w guzie litym. Przykładowe słabo zasadowe przeciwnowotworowe związki obejmują doksorubicynę, daunorubicynę, mitoksantron, epirubicynę, mitomycynę, bleomycynę, alkaloidy z Vinca, takie jak winblastyna i winkrystyna, środki alkilujące, takie jak cyklofosfamid andchlorowodorek mechloroetaminy, i przeciwnowotworowe pochodne puryny i pyrymidyny. Korzystnie, kompozycja może zawierać ureazę i być pozbawiona zasadniczo wszelkich cytokin, czynnik martwicy nowotworu/lub interferony. W tym rozwiązaniu, sama ureaza, lub ze środkami aktywnymi innymi niż cytokiny, korzystnie w połączeniu z nisko cząsteczkowymi przeciwnowotworowymi środkami, jest skuteczna aby hamować wzrost komórek raka. Zatem, w tym rozwiązaniu, kompozycja może lub nie działać w połączeniu
PL 217 626 B1 z endogennymi lub natywnymi cytokinami obecnymi u pacjenta poddanego leczeniu, lecz kompozycja podawana nie zawiera dodatkowych, egzogennych cytokin.
D. Środki obrazujące
Podobnie, środki obrazujące mogą być włączane do kompozycji lub do dodatkowych kompozycji. Odpowiednie środki obrazujące obejmują komercyjnie dostępne środki stosowane w komputerowej tomografii emisyjnej (PET), komputerowej tomografii skanującej (CAT), jednofotonowej komputerowej tomografii emisyjnej, naświetleniach promieniami X, fluoroskopii i obrazowaniu metodą rezonansu magnetycznego (MRI).
Środki obrazujące obejmują metale, izotopy radioaktywne i środki nie przepuszczające promieniowania (np. związki zawierające gal, technet, ind, stront, jod, bar, brom i fosfor), środki przepuszczalne dla promieniowania, środki kontrastowe, barwniki (np. barwniki fluorescencyjne i chromofory) i enzymy, które katalizują reakcje kolorymetryczne lub fluorometryczne. Ogólnie, takie środki mogą być przyłączane lub zamykane stosując różne techniki jak opisano powyżej i mogą być obecne w dowolnej konfiguracji. Patrz np. US nr 6,159,443 i 6,391,280, z których oba są włączone tutaj jako odnośnik.
Środki kontrastowe zgodnie z niniejszym wynalazkiem są użyteczne w obrazowaniu wyników sposobów wykonania, takie jak środki kontrastowe w promieniowaniu X, sondy do obrazowania wizualnego, znaczniki spinu lub jednostki radioaktywne.
Przykłady odpowiednich materiałów stosowanych jako środki kontrastowe w MRI obejmują obecnie dostępne chelaty gadolinu, takie jak kwas dietylenotriaminopentaoctowy (DTPA) i gadopentonian dimegluminy, jak i żelaza, magnezu, manganu, miedzi i chromu.
Przykłady materiałów użytecznych do CAT i naświetlania promieniami X obejmują materiały oparte na jodzie, takie jak jonowe monomery, których przykłady stanowią diatrizoat i jotalamat, niejonowe monomery takie jak jopamidol, izoheksol, i jowersol, niejonowe dimery, takie jak jotrol i jodyksanol, i jonowe dimery, na przykład, joksagalt.
Powietrze i inne gazy mogą być włączone do stosowana w obrazowaniu ultrasonograficznym. Środki te mogą być wykrywane stosując standardowe techniki dostępne w tej dziedzinie i komercyjnie dostępne wyposażenie.
Zgodnie z jednym rozwiązaniem wynalazku, komórki rakowe kontaktuje się ze środkiem obrazującym przed lub po, lub zarówno przed i po kontaktowaniu ze środkiem aktywnym. Na przykład, po naprowadzeniu ureazy na komórki guza, może ona mieć zdolności do modulowania lub regulowania zewnętrznego środowiska guza, np. przez zmiany pH. Środki obrazujące, które preferują środowisko zasadowe w wyniku tego są bardziej skuteczne.
Zarówno Iuminescencyjne chelaty lantanowców oparte na cyklenie jak i te głównie dające obrazy w rezonansie magnetycznym zostały przedstawione jako wrażliwe na zmiany pH. Sondy Iuminescencyjne stosowane do wykrywania zmian pH typowo wykrywają zmiany w okresie trwania fluorescencji jonu Iantanowca jako funkcji pH. Analogicznie, środki kontrastowe w rezonansie magnetycznym, które zmieniają relaksacyjność protonu z wody przez zmiany pH są użyteczne według niniejszego wynalazku. W obu przypadkach, poprzez wykrywanie zmiany pH w danym układzie, możliwe jest obserwowanie środków ze zwiększonym kontrastem.
Zgodnie z powyższym, środek kontrastowy wrażliwy na pH jest wykorzystywany przy lub w pobliżu komórek raka. Komórka lub komórki rakowe są również poddawane działaniu ureazowej kompozycji zawierającej enzym ureazy, aby spowodować zmiany pH przy lub w pobliżu komórek raka. W ten sposób, zmiany pH powodują relaksacyjne właściwości protonów wody w jądrowym rezonansie magnetycznym lub innych jąder w środowisku wodnego roztworu, aby były zmienione w sposób, który odzwierciedla zmiany pH. Przykłady środków kontrastowych wrażliwych na pH, które mogą być wykorzystane obejmują te środki, które zawierają metal lantanowca, taki jak Ce, Pr, Nd, Sm, Eu, Gd, Db, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, i tym podobne, lub inny paramagnetyczny pierwiastek, taki jak Fe, Mn,170 i tym podobne. Specyficzne środki kontrastowe, które mogą być zastosowane obejmują H (2)(17)0, GdD0TA-4AmP (5-) które opisano w Magn. Reson. Med. 2003 Feb; 49 (2): 249-57, i Fe(III) mezo-tetra (4-sulfonatofenylo) porfino (Fe-TPPS4) jak opisano w Helpem i wsp. (1987) Magnetic Resonance in Medicine 5: 302-305 i Patent US Nr 6,307,372, które są włączone tutaj jako odnośniki. Ponadto według wynalazku może być stosowany oparty na Gd z polijonem, jak opisano w Mikawa i wsp. Acad. Radiol (2002) 9 (suppl 1): S109-S1111.
Jako inne rozwiązanie, odczynnik przesunięcia może być dostarczony do wodnego roztworu ośrodka otaczającego komórki raka. Odczynnik przesunięcia jest tak skonfigurowany, aby zmiany pH
PL 217 626 B1 wpływały na przesunięcie chemiczne właściwości protonów wody lub innych jąder, w sposób, który odzwierciedla wartość pH. Zmiana przesunięcia chemicznych właściwości może następnie być zmierzona stosując jądrowy rezonans magenetyczny, aby określić czy środek aktywny jest biologicznie aktywny. Przykładowe odczynniki przesunięcia, które mogą być stosowane obejmują te zawierające metal lantanowców, taki jak Ce, Pr, Nd, Sm, Eu, Gd, Db, Dy, Ho, Er, Tm, lub Yb, lub inny paramagn etyczny pierwiastek. Przykłady poszczególnych odczynników przesunięcia, które mogą być wykorzystane, obejmują Tm (DOTP) (5-), kompleks 1,4,7,10-tetraazacylododekano-N,N',N,N'-tetra(metylenofosforanu) tulu (III). Dy(PPP) (2)(7)-tripolifosforan dysprozu i tym podobne.
W jednym wariancie wynalazku zastosowano strategię środka podwójnie kontrastującego z dwoma środkami opartymi na gadolinie, takimi jak niewrażliwy na pH GdDOTP (5-) i wrażliwy na pH GdD0TA-4AmP (5-), które mogą być wykorzystane do wytworzenia map pH stosując MRI, jak opisano w Magn Reson Med (2003) Feb; 49 (2): 249-57.
Korzystne środki stosowane z PET skan obejmują 13N i fluorodeoksyglukozę (FDG).
E. Kompozyche
Jak zauważono powyżej, kompozycje według wynalazku zawierają środek aktywny i, ewentualnie, związaną cząstkę chemiczną. Na przykład, zawierają polipeptyd - ureazę lub polinukleotyd kodujący ureazę, i/lub chemicznie lub biologicznie aktywny związek będący modulatorem ekspresji ureazy lub aktywności ureazy - ugrupowanie naprowadzające. Ponadto, dopuszczalny biologicznie nośnik farmaceutyczny, adiuwant, lub zaróbka również może być włączone do kompozycji.
Kompozycja może również obejmować inne sekwencje nukleotydowe, polipeptydy, leki, lub hormony zmieszane z zaróbką(ami) lub innymi farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami. Kompozycje inne niż farmaceutyczne kompozycje ewentualnie obejmują płyn, to jest wodę lub płyn oparty na wodzie.
Farmaceutycznie dopuszczalne zaróbki, które będą dodane do farmaceutycznych kompozycji również są dobrze znane dla specjalisty biegłego w tej dziedzinie i są z łatwością dostępne. Wybór zaróbki będzie wyznaczony w części przez daną metodę stosowaną do podawania produktu zgodnie z wynalazkiem. Zgodnie z powyższym, istnieje szeroki wybór odpowiednich preparatów stosowanych w kontekście niniejszego wynalazku.
Techniki uzyskiwania preparatu i podawania kompozycji farmaceutycznych można znaleźć w Remington's Pharmaceutical Sciences, wyd. 19, Williams &Wilkins, 1995 i są dobrze znane osobie biegłej w tej dziedzinie. Wybór zaróbki będzie zależał częściowo od danej metody stosowanej do podawania produktu zgodnie z wynalazkiem. Zgodnie z powyższym, istnieje szeroki wybór odpowiednich preparatów stosowanych w kontekście niniejszego wynalazku. Przedstawione poniżej metody i zaróbki są jedynie przykładowe i nie mają ograniczać zakresu wynalazku.
Farmaceutyczne kompozycje według niniejszego wynalazku mogą być wytwarzane stosując dowolną tradycyjną metodę, np. mieszanie, rozpuszczanie, granulowanie, mielenie na mokro i frakcjonowanie sedymentacyjne, tworzenie emulsji, zamykanie w otoczce, zamykanie, przędzenie ze stopu, suszenie rozpryskowe lub liofilizacja. Jednakże, optymalny farmaceutyczny preparat będzie określony przez znawcę w zależności od trybu podawania i żądanego dawkowania. Takie preparaty mogą wpływać na stan fizyczny, stabilność, szybkość uwalniania in vivo i szybkość klirensu in vivo podawanego środka. W zależności od stanu, który jest poddawany leczeniu, te kompozycje farmaceutyczne mogą być tworzone i podawane jak opisano w części III, poniżej.
Farmaceutyczne kompozycje są otrzymywane tak aby zawierały odpowiednie farmaceutycznie dopuszczalne nośniki i mogą ewentualnie zawierać zaróbki i środki pomocnicze, dopuszczalne farmaceutycznie, które ułatwiają obróbkę związków aktywnych przy otrzymywaniu. Tryb podawania będzie zasadniczo określał charakter nośnika.
Na przykład, preparaty do pozajelitowego podawania mogą zawierać roztwory wodne związków aktywnych w postaci rozpuszczalnej w wodzie. Nośniki odpowiednie do pozajelitowego podawania mogą być wybrane z grupy obejmującej solankę, zbuforowaną solankę, dekstrozę, wodę i inne fizjologicznie odpowiednie roztwory. Korzystne nośniki do pozajelitowego podawania obejmują fizjologicznie odpowiednie bufory takie jak roztwór Hanka, roztwory Ringera, lub fizjologicznie zbuforowany roztwór soli. Do podawania do tkanek lub komórek, w preparacie stosowane są odpowiednie środki zwiększające przenikanie, odpowiednie do przenikania przez poszczególne bariery. Takie środki zwiększające przenikanie są ogólnie znane w tej dziedzinie. W przypadku preparatów zawierających białka, preparat może zawierać środki stabilizujące, takie jak poliole (np. sacharozę) i/lub środki powierzchniowoczynne (np. niejonowe środki powierzchniowo czynne) i tym podobne.
PL 217 626 B1
W innym rozwiązaniu, preparaty do zastosowania pozajelitowego mogą zawierać zawiesiny związków aktywnych wytworzone jako odpowiednie zawiesiny w oleju do iniekcji. Odpowiednie Iipofilowe rozpuszczalniki lub nośniki obejmują oleje tłuszczowe, takie jak olej sezamowy i syntetyczne estry kwasów tłuszczowych, takie jak oleinian etylu lub triglyceridy, lub liposomy. Wodne zawiesiny do iniekcji mogą zawierać substancje, które zwiększają lepkość zawiesiny, takie jak karboksymetyloceluloza sodowa, sorbitol, lub dekstran. Ewentualnie, zawiesina może również zawierać odpowiednie środki stabilizujące lub środki, które zwiększają rozpuszczalność związków, aby pozwolić na otrzymywanie bardzo zatężonych roztworów. Mogą być również stosowane emulsje, np. zawiesiny olej w wodzie i woda w oleju, ewentualnie stabilizowane przez środek emulgujący lub zwiększający rozproszenie (materiały aktywne powierzchniowo; środki powierzchniowo czynne). Liposomy, jak opisano powyżej, zawierające środek aktywny również mogą być stosowane do pozajelitowego podawania.
W innym rozwiązaniu, farmaceutyczne kompozycje zawierające środek w dawkach odpowiednich do podawania doustnego mogą być utworzone w postaci preparatu, stosując farmaceutycznie dopuszczalne nośniki dobrze znane w tej dziedzinie. Otrzymywane preparaty do podawania doustnego mogą mieć postaci tabletek, pigułek, kapsułek, saszetek, pastylek, płynów, żeli, syropów, rzadkiej zawiesiny, zawiesiny, lub proszku. W celach ilustracyjnych, farmaceutyczne preparaty do podawania doustnego mogą być otrzymywane przez połączenie związków aktywnych ze stałą zaróbką, ewentualnie mielenie otrzymanej mieszaniny i obróbkę mieszaniny do postaci granul, po dodaniu odpowiednich środków pomocniczych, jeśli jest to pożądane, aby otrzymać tabletki. W doustnych preparatach mogą być wykorzystane płynne nośniki podobne do typów tych opisanych do zastosowania pozajelitowego, np. buforowane roztwory wodne, zawiesiny, i tym podobne.
Te preparaty mogą zawierać jedną lub więcej zaróbkę, które obejmują, nie ograniczając zakresu: a) rozcieńczalniki takie jak cukry, obejmujące laktozę, dekstrozę, sacharozę, mannitol, lub sorbitol; b) środki wiążące takie jak krzemian magnezoglinu, skrobia z kukurydzy, pszenicy, ryżu, ziemniaków, itp.; c) materiały celulozowe takie jak metyloceluloza, hydroksypropyhnetylo celuloza i karboksymetylo celuloza sodowa, poliwinylo pirolidon, gumy takie jak guma arabska i guma tragakantowa, i białka takie jak żelatyna i kolagen; d) środki rozsadzające lub środki zwiększające rozpuszczalność takie jak usieciowany poliwinylopirolidon, skrobie, agar, kwas alginowy lub jego sól taka jak alginian sodu; lub kompozycje musujące; e) środki smarne takie jak krzemionka, talk, kwas stearynowy lub jego sól magnezowa lub wapniowa i poli(glikol etylenowy); środki zapachowe i środki słodzące; g) barwniki lub pigmenty, np. aby zidentyfikować produkt lub scharakteryzować ilość (dawkę) środka aktywnego h) inne składniki takie jak środki konserwujące, środki stabilizujące, środki spulchniające, środki emulgujące, środki zwiększające rozpuszczanie, sole do regulacji ciśnienia osmotycznego i bufory.
Kompozycje farmaceutyczne mogą zawierać sól środka aktywnego, które mogą być utworzone z wieloma kwasami, obejmującymi lecz nie ograniczając zakresu kwas chlorowodorowy, siarkowy, octowy, mlekowy, winowy, jabłkowy, bursztynowy, itp. Sole mają większą tendencje do wykazywania lepszej rozpuszczalności w wodnych roztworach lub innych protonowych rozpuszczalnikach, które są odpowiadającymi formami wolnych zasad.
Jak zauważono powyżej, charakterystyka samego środka i preparatu środka może wpływać na stan fizyczny, stabilność, szybkość uwalniania in vivo, i szybkość klirensu in vivo podawanego środka. Takie farmakokinetyczne i farmakodynamiczne informacje mogą być zebrane w czasie przedklinicznych badań in vitro i in vivo, później potwierdzone u ludzi w czasie badań klinicznych. Wskazówki jak należy przeprowadzić badania kliniczne u ludzi oparto na danych uzyskanych z badań in vivo na zwierzętach, które mogą być otrzymywane z wielu źródeł, obejmujących, np. http://www.clinicaltrials.gov. Zatem, dla dowolnego związku stosowanego według sposobu według wynalazku, terapeutycznie skuteczna dawka u ssaków, szczególnie u ludzi, może być oszacowana wstępnie na podstawie testów biochemicznych i/lub opartych na komórkach. Następnie, dawkowanie może być określone na modelach zwierzęcych, aby osiągnąć żądane zakresy stężeń w obiegu, które zmieniają ekspresję środka aktywnego lub jego aktywność. Jako że przeprowadzi się badania na ludziach, dalsze informacje będą uzyskiwane w odniesieniu do odpowiednich poziomów dawkowania i czasu trwania leczenia dla różnych chorób i stanów.
Toksyczność i skuteczność terapeutyczna takich związków może być wyznaczona standardowymi farmaceutycznymi procedurami w hodowlach komórkowych lub doświadczeniach na zwierzęPL 217 626 B1 tach, np. w celu oznaczenia LD50 (dawka śmiertelna dla 50% populacji) i ED50 (dawka skuteczna terapeutycznie u 50% populacji).
III. Sposób w których znajduje zastosowanie wynalazek
Niniejszy wynalazek znajduje zastosowanie w sposobie hamowania wzrostu komórek rakowych. Sposób wykorzystuje jeden lub więcej ze składników kompozycji opisanych w części II, powyżej, i/lub w częściach IV-VII, poniżej. Sposób obejmuje poddanie komórek działaniu ureazy jako środka aktywnego w ilości skutecznej, aby hamować wzrost komórek rakowych.
A. Poddanie komórek rakowych działaniu środka aktywnego
Kompozycja zawierająca ureazę, np. samą ureazę lub ureazę w połączeniu z cząstką chemiczną skuteczną we wzmacnianiu dostarczania enzymu do komórek raka, może być dostarczana do komórek rakowych wieloma różnymi metodami znanymi w tej dziedzinie. W zastosowaniach terapeutycznych, kompozycja jest podawana pacjentowi mającemu komórki rakowe w ilości dostatecznej, aby hamować wzrost komórek raka. Farmaceutyczne kompozycje według wynalazku mogą być dostarczone do komórek rakowych przez podawanie wieloma trybami, obejmującymi, nie ograniczając zakresu, pozajelitowe, dojelitowe, przeznabłonkowe, przezśluzówkowe, przezskórne, i/lub chirurgiczne.
Pozajelitowe tryby podawania obejmują te, w których kompozycja jest podawana przez, na przykład, iniekcje dożylne, dotętnicze, śródotrzewnowe, do jamy szpikowej, domięśniowe, dostawowe, dooponowe, i do komór mózgu, iniekcje igłą do dawki uderzeniowej podskórne, śródgonadowe lub śródguzowe, lub przedłużone stałe, pulsacyjne lub planowane wlewy lub mikroinfuzje stosując odpowiednie technologie pompowania. Dojelitowe tryby podawania obejmują, na przykład, podawanie doustne (obejmujące dopoliczkowe i podjęzykowe) i Przeznabłonkowe tryby podawania obejmują, na przykład, przezśluzówkowe podawanie i podawanie przezskórne. Podawanie przezśluzówkowe obejmuje, na przykład, podawanie dojelitowe jak i donosowe, inhalacje i podawanie głęboko do płuc, podawanie dopochwowe i podawanie doodbytnicze. Podawanie przezskórne obejmuje bierne lub aktywne tryby podawania przezskórnego lub poprzez skórę, obejmujące, na przykład, plastry i urządzenia jontoforetyczne, jak i pasty, balsamy lub maści do podawania miejscowego. Techniki operacyjne obejmują wszczepienie porcji leku o przedłużonym uwalnianiu - depot (zbiornik), pompy osmotyczne i tym podobne.
Pojedyńcze lub wielokrotne tryby podawania środka aktywnego mogą być prowadzone w zależności od wymaganego dawkowania i częstości, i od tego jak jest tolerowany przez osobnika. W każdym przypadku, kompozycja powinna zapewniać dostateczną ilość środka aktywnego według wynalazku, aby skutecznie leczyć osobnika.
Znawca doceni, że występują pewne regiony, które nie są dobrze unaczynione lub które są zabezpieczone przez komórki połączone szczelnie połączeniami i/lub mechanizmami transportu aktywnego, które obniżają lub zapobiegają przejściu makrocząsteczek obecnych w krwioobiegu. Zatem, na przykład, układowe podawanie środków leczniczych do leczenia glejaka, lub innych rodzajów raka mózgu, może być ograniczone występowaniem bariery krew-mózg, która zapobiega przejściu makrocząsteczek do przestrzeni podpajęczynówkowej. W tych typach guzów, kompozycja terapeutycznie może być korzystnie podawana bezpośrednio do miejsca występowania guza. Zatem, na przykład, guzy mózgu mogą być leczone przez podawanie kompozycji terapeutycznej bezpośrednio do miejsca występowania guza, np. przez iniekcje dawki uderzeniowej, mikroinfuzje, lub chirurgiczne wszczepienie cewnika.
Poddanie działaniu może obejmować uwidocznienie komórek raka lub guza przy pomocy narzędzi do sterowania obrazem, np. jak opisano w Enhanced Magnetic Resonance Imaging, V. Μ.
Runge, ed., C. V. Mosby Co. (1989) w MRI; np. w EP 188,256; Kozak i wsp., TIBTEC Październik 1986, 262; Radiotracers for Medical Applications, CRC Press, Boca Raton, Fla., w radiodiagnostyce i/lub w radioterapii; w Positron Emission Tomography of the Brain, Springer Verlag 1983, w PET; i w J. W. Nowicky i wsp., Macroscopic UV-Marking Through Affinity, J. Tumor Marker Oncology 31, 463465 (1988). Zatem, dowolny z wielu różnych środków diagnostycznych może być włączony do kompozycji, która następnie w wyniku podania jej pacjentowi może dostarczyć miejscowo lub układowo środki, które zawiera.
Środki obrazujące, jak opisano powyżej, mogą być stosowane aby umożliwić monitorowanie leczenia guza po podaniu pacjentowi kompozycji. Na przykład, typowo są one podawane przed przeprowadzeniem procedury zobrazowania. Jest również możliwe, aby podawanie prowadzone były jednocześnie z obrazowaniem, gdzie jest to żądane, np. w badaniach farmakokinetycznych. Optymalny
PL 217 626 B1 czas konieczny do zlokalizowania w miejscu docelowym i optymalne wzmocnienie obrazów będzie również zależeć od środka aktywnego i/lub koniugatu i/lub tkanki i/lub modalności obrazowania, i będzie mogło być również rutynowo określone. Typowo, obrazowanie będzie występować przed znaczącym klirensem (usunięciem) środka aktywnego z miejsca, który to okres czasu może być również rutynowo wyznaczony przez biegłych w tej dziedzinie. W pewnych rozwiązaniach, środki aktywne lub koniugaty będą podawane 15 minut do 4 godzin przez wykonaniem procedury obrazowania, ponieważ środki aktywne mogą być zlokalizowane szybko w ich miejscach docelowych, a następnie, ewentualnie, usunięte szybko z tych miejsc, jak przedyskutowano obszernie poniżej.
W jednym wariancie zastosowania wynalazku, poddanie działaniu obejmuje przebadanie osobnika z użyciem narzędzi diagnostycznych zdolnych do wykrywania zmian w zewnątrzkomórkowym pH w tkance osobnika i zidentyfikowania regionu tkanki u pacjenta, który po podaniu wykazuje wybrane zwiększenie zewnątrzkomórkowego pH. W oparciu o identyfikację, poddanie działaniu może być powtórzone do uzyskania żądanej, wybranej zmiany zewnątrzkomórkowego pH w obrębie całego guza litego.
W jednym wariancie zastosowania wynalazku, poddanie działaniu obejmuje pozajelitowe podawanie osobnikowi środka aktywnego w kompozycji, inne niż przez iniekcję bezpośrednią.
Środek aktywny może być przeprowadzony w pochodne jak przedyskutowano w części II, powyżej.
Jak przedyskutowano powyżej, ureaza katalizuje hydrolizę mocznika, prowadząc do utworzenia karbaminianu i amoniaku. W wodnym środowisku, karbaminian gwałtownie i spontanicznie rozkłada się z wytworzeniem drugiej cząsteczki amoniaku i jednej dwutlenku węgla (Fig. 1). Ureaza wykazuje szereg funkcji. Jej główną rolą w środowisku jest umożliwienie organizmowi wykorzystanie, wytworzonego zewnętrznie i wewnętrznie, mocznika jako źródła azotu. U roślin ureaza może brać udział w układowych drogach transportu azotu i może działać jako białko obrony toksycznej.
Substratem ureazy jest mocznik, który jest produkowany w wątrobie, przenoszony w krwioobiegu do nerek i wydalany w moczu. Stężenia mocznika w surowicy u zdrowych ludzi są typowo w zakresie od 1 do 10 mM, lecz poziomy mocznika w moczu mogą przekraczać 0,5 M (Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Merck i Co Inc., Rahway, NJ, 1999). Mocznik jest również obecny w wydzielinach głównych i mniejszych gruczołach zewnątrzwydzielniczych w stężeniach w przybliżeniu równoważnych z poziomami w surowicy, tak więc duża część mocznika obecnego w krwioobiegu jest przenoszona na powierzchnie komórek przez układy wydzielnicze, lub w wysiękach tkanek (Burne, R. A i Chen, Y. M., Microbes and Infection, 2, 2000; 533-542). Na przykład, dorosły człowiek wydziela niemal 1 litr śliny dziennie, zawierającej 1-10 mM mocznika w przybliżeniu 20-25% całego mocznika wytwarzanego przechodzi do przewodu pokarmowego, a nie jest usuwany z organizmu w moczu (Visek, W. J., Fed. Proc. 31 (1972) 1178-1193). Nie ma wyraźnego mechanizmu czynnego wypływu dla zewnątrzwydzielniczego wydzielania mocznika, tak że uważa się, że nie naładowana cząsteczka mocznika po prostu podąża za wodą do komórek i przechodzi przez obwódkę dezmosomalną w nabłonku. W konsekwencji, powierzchnie komórek w organizmie człowieka są zanurzone w płynie, który zawiera mocznik (McLean R. J. C., i wsp. CRC, Crit. Rev. Microbiol. 16 (1988) 37-79).
B. Poddanie działaniu w dwóch i trzech etapach
Jak zauważono powyżej, środek aktywny jest bezpośrednio sprzężony z ugrupowaniem naprowadzającym. Jednakże możliwe jest także dwuetapowe podejście, aby dostarczyć środek aktywny do komórek guza. Korzystnie, komórki guza są obecne w organizmie osobnika. Dwuetapowe podejście ma przewagę rozdzielenia farmakokinetyki środka aktywnego od farmakokinetyki ugrupowania naprowadzającego ugrupowanie naprowadzające może powodować przyłączenie się do miejsc docelowych, jednocześnie będąc sprzężoną z pierwszym związkiem wiążącym, np. peptydem tworzącym zwój. Po przyłączeniu się ugrupowania naprowadzającego, zasadniczo całość nienaprowadzonego koniugatu może być usunięta z krwioobiegu osobnika. Środek aktywny może następnie być podawany jako koniugat z komplementarnym elementem związku wiążącego, np. drugim peptydem tworzącym zwój.
Dowolny dwuetapowy układ znany w tej dziedzinie może być stosowany, taki jak biotyna, hapteny, itp. mający wysokie powinowactwo wiązania ze związkiem wiążącym, np. awidyna, specyficzne przeciwciała, itp. Patrz np. US 6,190,923,6,187,285 i 6,183,721.
Korzystny dwuetapowy układ obejmuje układ zwiniętego zwoju. Zatem, w zastosowaniu dwuetapowego podejścia jak opisano powyżej, pierwszy koniugat zawiera ugrupowanie naprowadzające i pierwszy peptyd tworzący zwój charakteryzujący się wybranym ładunkiem i zdolnością do oddziałyPL 217 626 B1 wania z drugim, przeciwnie naładowanym peptydem tworzący zwój, aby utworzyć stabilny α-helisowy solenoidowy heterodimer, który jest dodany do komórki guza. Przykładowy sposób sprzęgania stanowiącego przeciwciało ugrupowania naprowadzającego z peptydem tworzącym zwój opisano w przykładzie 4.
Następnie do komórki podany jest drugi koniugat zawierający drugi peptyd tworzący zwój i środek aktywny. Korzystnym środkiem aktywnym jest ureaza. Przykładowy sposób sprzęgania ureazy z kanawalii mieczokształtnej z peptydem tworzącym zwój opisano w przykładzie 2.
Gdy jeden peptyd tworzący zwój i drugi peptyd tworzący zwój są zmieszane razem w warunkach sprzyjających tworzeniu heterodimerów o konfiguracji α-helisowy solenoidzie, oddziałują one, aby utworzyć dwupodjednostkowy kompleks heterodimerowy o α-helisowym solenoidzie. Peptydy o konformacji α-heliksowego solenoidu oddziałują ze sobą w charakterystyczny sposób, który jest wyznaczony przez pierwszorzędowa sekwencję każdego peptydu. Trzeciorzędowa struktura α-helisy jest taka, że siedem aminokwasowych reszt w pierwotnej sekwencji odpowiada około dwóm obrotom w α-helisie. Zgodnie z powyższym, pierwszorzędowa sekwencja aminokwasowa dająca początek aheliksowej konformacji może zostać podzielona na jednostki po siedem reszt każdy, określonych heptady. Heterodimerowe podjednostki peptydów są złożone z serii heptad w tandemie. Gdy sekwencja heptady jest powtarzana w szczególnym heterodimerze-podjednostce peptydowej, heptada może być określana jako powtórzenie heptad, lub po prostu powtórzenie.
Jeden peptyd tworzący zwój i drugi peptyd tworzący zwój może składać się na heterodimer o helisie solenoidu (heterodimer o konformacji solenoidu) zarówno w konfiguracji równoległej jak i przeciwrównoległej. W konfiguracji równoległej, dwie helisy heterodimer podjednostka peptydowa są przypisane tak, aby miały taką samą orientację (koniec aminowy do końca karboksylowego). W konfiguracji przeciwrównoległej, helisy są tak ułożone, że koniec aminowy jednej helisy jest przypisany do końca karboksylowego drugiej helisy i vice versa. Takie heterodimerowe podjednostki są opisane w zgłoszeniu PCT opublikowanym za nr WO95/31480 Heterodimer Polypeptide Immunogen Carrier Composition and Metod, data publikacji, 23 listopada 1995, która to publikacja jest włączona tutaj jako odnośnik w całości. Przykładowe podjednostki są określane tutaj jako K-zwoje, odnosząc się do dodatnio naładowanych podjednostek, których ładunek jest głównie zapewniony przez resztę lizynową i E-zwoje, odnoszące się do ujemnie naładowanych podjednostek, których ładunek jest zapewniony głównie przez reszty kwasu glutaminowego. Korzystne przykłady z powyżej wymienionych rozwiązań obejmują SEQ ID NO: 1-2.
Podjednostki peptydów w heterodimerze, zaprojektowane zgodnie ze wskazówkami przedstawionymi w powyżej cytowanym zgłoszeniu, typowo wykazują preferencje dla składania się w orientacji równoległej względem orientacji przeciwrównoległej. Na przykład, typowe peptydy zidentyfikowane przez SEQ ID NO: 3 i SEQ ID NO: 4 tworzą heterodimery w orientacji równoległej, jak w przypadku innych peptydowych sekwencji (jak przedyskutowano w zgłoszeniu WO 95/31480). Dodatkowy przykładowy peptyd obejmuje peptyd o K-zwoju złożony z 7-aminokwasowych powtórzeń, np. SEQ ID NO: 5. W jednym rozwiązaniu, K-zwój ma 35 aminokwasy długości; jest dodatnio naładowany, bez specyficznej struktury w roztworze. E-zwój może być peptydem złożonym z 7-aminokwasowych, np. SEQ ID NO: 6 powtórzeń. W jednym rozwiązaniu, E-zwój ma 35 aminokwasów długości; jest on ujemnie naładowany i nie ma specyficznej struktury w roztworze.
Jak zauważono, jedna z dwóch podjednostek peptydów w heterodimerze zawiera ugrupowanie naprowadzające, a drugi peptyd obejmuje środek aktywny. W obu przypadkach, peptyd może być zsyntetyzowany lub utworzony jako pochodna po syntezie, aby dostarczyć wymaganą aktywność przyłączania. Przykładowy sposób syntezy peptydu opisano w przykładzie 1. Ogólnie, większość metod sprzęgania nie znosi aktywności tworzenia zwoju obu peptydów tworzących zwój, ani takie sprzęganie nie znosi aktywności sprzężonego środka aktywnego lub ugrupowania naprowadzającego.
Biorąc pod uwagę modyfikację pierwszego peptydu tworzącego zwój, peptyd może być zsyntetyzowany zarówno od jego końca N- lub C-, aby zawierać dodatkowe końcowe peptydy, które mogą funkcjonować jako łącznik pomiędzy ugrupowaniem naprowadzającym i częścią heliksową peptydu. Ugrupowania naprowadzające - peptyd tworzący zwój i/lub środek aktywny - peptyd tworzący zwój może być zsyntetyzowany, jak zauważono powyżej, zarówno z wykorzystaniem stałej fazy, PCR, lub metod rekombinacji, in vivo lub in vitro.
W tworzeniu koniugatu przez metody w stałej fazie, środek aktywny lub ugrupowanie naprowadzające jest korzystnie kowalencyjnie przyłączona do N-końcowej reszty aminokwasowej, lub z jedną z reszt skierowaną do odkrytej powierzchni heterodimeru. Korzystne grupy do sprzęgania obejmują
PL 217 626 B1 tiolowe grupy reszt cysterinowych, które są łatwo modyfikowane standardowymi metodami. Inne użyteczne sprzęgające grupy obejmują tioester metioniny, imidazolilową grupę histidyny, guanidynylową grupę argininy, fenolową grupę tyrozyny i indolilową grupę tryptofanu. Te sprzęgające grupy mogą być przeprowadzane w pochodne stosując warunki reakcji znane osobom biegłym w tej dziedzinie.
Aby związać środek aktywny drugiego peptydu tworzącego zwój z ugrupowaniem naprowadzającym - pierwszym peptydem tworzącym zwój, dwa peptydy są kontaktowane w warunkach które sprzyjają tworzeniu heterodimeru. Przykładowe środowisko sprzyjające tworzeniu heterodimeru o zwiniętym zwoju jest fizjologicznie kompatybilnym roztworem wodnym typowo mającym pH od około 6 do około 8, stężenie soli od około 50 mM do około 500 mM. Korzystnie, stężenie soli wynosi od około 100 mM do około 200 mM. Przykładowe środowisko ma poniższy skład: 50 mM fosforan potasu, 100 mM KCI, pH 7. Równie skuteczne środowisko można uzyskać zastępując, na przykład, fosforan sodu w miejsce fosforanu potasu i/lub NaCI zamiast KCI. Heterodimery mogą się tworzyć w warunkach poza powyższym pH i zakresie stężeń soli, środowiska, lecz pewne cząsteczkowe oddziaływania i względy stabilności heterodimerów względem homodimerów mogą być różne od scharakteryzowanych szczegółowo powyżej. Na przykład, jonowe oddziaływania pomiędzy grupami jonowymi, które mają skłonność do stabilizacji heterodimerów mogą rozpadać się w niskim lub wysokim pH ze względu na protonację, na przykład, bocznych łańcuchów Glu w kwasowym pH, lub deprotonację, na przykład, bocznych łańcuchów Lys w zasadowym pH. Takie działanie niskiego i wysokiego pH na tworzenie heterodimeru o zwiniętym zwoju mogą być jednakże przezwyciężone, przez zwiększanie stężenia soli.
Zwiększanie stężenia soli może neutralizować stabilizujące jonowe przyciągania lub hamować destabilizujące jonowe odpychanie. Pewne sole mają większą skuteczność w neutralizowaniu oddziaływań jonowych. Na przykład, w przypadku peptydu K-zwoju, 1 M lub wyższe stężenie anionów CIO4jest wymagane do indukowania maksymalnej α-heliksowej struktury, podczas gdy 3 M lub wyższe stężenie jonów Cl- jest wymagane do osiągnięcia tego samego działania. Działanie wysokiej ilości soli na tworzenie zwiniętego zwoju przy niskim i wysokim pH również wykazuje, że jonowe przyciągania pomiędzy helisami nie są krytyczne dla tworzenia helisy, lecz raczej kontrolują czy zwinięty zwój ma skłonność do tworzenia w postaci heterodimeru względem homodimeru. Pierwszy peptyd tworzący zwój, np. peptyd E-zwoju, i drugi peptyd tworzący zwój, np. peptyd K-zwoju może być również sprzężony z ugrupowaniem naprowadzającym i środkami aktywnymi jak opisano w przykładzie 2 zgłoszenia U. S. należącego do tego samego zgłaszającego, zgłoszonego za numerem 09/654,191 (numer sprawy rzecznika: 4800-0015,31), który jest włączony tutaj jako odnośnik w całości. Patrz również, patent US nr 6,300,141, który jest włączony tutaj jako odnośnik w całości.
Środek aktywny - peptyd tworzący zwój może mieć krótki półokres trwania w surowicy i może być wydalany poprzez nerki. Zatem, środek aktywny bądź gromadzi się w miejscu docelowym bądź jest gwałtownie usuwany z organizmu osobnika. Takie rozmieszczenie w organizmie środka aktywnego ułatwia ochronę normalnych tkanek pacjenta otrzymującego środek przed niepożądanym narażeniem na działanie środka. Aby zwiększyć wydalanie przez nerki, może być zastosowane sprzęganie z cząsteczkami zwiększającymi wydalanie przez nerki, ukierunkowującymi rozmieszczenie w organizmie. Odmiennie niż w ewentualnym etapie klirensu, możliwe jest pozostawienie dostatecznej ilości czasu, co umożliwi działanie naturalnych mechanizmów klirensu u osobnika, aby zasadniczo usunęły pierwszy koniugat z krwioobiegu.
W innym rozwiązaniu, oparte na przeciwciałach lub nieoparte na przeciwciałach ugrupowania naprowadzające są wykorzystywane aby dostarczyć ligand lub anty - ligand do miejsca docelowego niosącego nieregulowany antygen. Korzystnie, naturalny środek wiążący takiego nieregulowanego antygenu jest stosowany w tym celu.
Na przykład, choroby takie jak wątrobiak lub szpiczak są ogólnie charakteryzowane przez nieregulowane receptory IL-6 dla których IL-6 działa jako autowydzielnicza lub pozawydzielnicza część cząsteczki w odniesieniu do szybkiej proliferacji tych docelowych typów komórek. Dlatego do leczenia takich schorzeń, może być zastosowana IL-6 jako ugrupowanie naprowadzające. Patrz np. Miki, C.
i wsp. (2002) Cancer 94 (5): 1584-92.
Na przykład, IL-6 i jeden peptyd tworzący zwój mogą być sprzężone chemicznymi środkami lub być utworzone w postaci zrekombinowanej cząsteczki. Koniugat IL-6 - pierwszy peptyd tworzący zwój jest podawany pacjentowi i IL-6 składnik koniugatu kieruje lokalizacją koniugatu do receptorów IL-6. Lokalizacja ta będzie występować korzystnie w miejscach nieregulowanych receptorów IL-6. Po lokalizacji w miejscu docelowym, środek oczyszczający, jak opisano poniżej, może być podany aby zasadPL 217 626 B1 niczo usunąć koniugat IL-6-pierwszy peptyd tworzący zwój z krwioobiegu pacjenta. Odpowiednie środki oczyszczające w tym celu są to, np., receptor IL-6-HSA- galaktoza lub przeciwciało-anty-IL-6HSA-galaktoza. Po okresie czasu dostatecznym do zasadniczego np. 50%, 70%, lub korzystnie 90%, klirensu IL-6 z krwioobiegu pacjenta, środek aktywny - drugi peptyd tworzący zwój, np. ureaza-drugi peptyd tworzący zwój, jest podawany i lokalizuje się w miejscach docelowych poprzez koniugat IL-6- piewszy peptyd tworzący zwój.
Jak opisano bardziej szczegółowo w Części VII poniżej, wektory ekspresyjne pochodzące z retrowirusów, adenowirusów, wirusa herpes, lub wirusów ospy, lub z różnych bakteryjnych plazmidów, mogą być stosowane do podawania zrekombinowanej cząsteczki ureazy do docelowej populacji komórek. Do konstrukcji zrekombinowanych wektorów zawierających gen kodujący ureazę mogą być stosowane metody, które są dobrze znane osobie biegłej w tej dziedzinie. Patrz na przykład, techniki opisane w Sambrook i wsp., i Ausubeli wsp.
W innym rozwiązaniu środki aktywne mogą być podawane do komórek docelowych z wykorzystaniem lipsomów lub nanokapsułek jak opisano w Części II powyżej. W jednym rozwiązaniu, sposób według wynalazku obejmuje podanie osobnikowi kompozycji zawierającej środek aktywny i ugrupowanie naprowadzające skuteczne w naprowadzaniu kompozycji na komórki.
C. Środki oczyszczające
Jak przedyskutowano powyżej, środek oczyszczający może być podawany osobnikowi. Środek oczyszczający jest zdolny do ukierunkowania krążenia pierwszego koniugatu na receptory hepatocytu, dzięki czemu obniżana jest ilość krążącego pierwszego koniugatu przed podaniem drugiego koniugatu.
Jak zauważono powyżej, środki oczyszczające białkowych lub niebiałkowych kompozycji mających fizyczne właściwości ułatwiające zastosowanie do kompleksacji in vivo i klirensu z krwi niezwiązanego koniugatu ugrupowania naprowadzającego mogą być użyteczne gdy komórki guza są obecne w organizmie osobnika, np. człowieka. Środki oczyszczające korzystnie wykazują jedną lub więcej z poniższych cech: szybka, skuteczna kompleksacja z ugrupowaniem naprowadzającym in vivo; szybki klirens z krwi koniugatów ugrupowań naprowadzajacych zdolnych do wiązania z następnie podawanym środkiem aktywnym; duża zdolność do usuwania lub dezaktywacja dużych ilości koniugatów ugrupowań naprowadzajacych i niska immunogeniczność.
Użyteczne środki oczyszczające obejmują części cząsteczek oparte na heksozie i części cząsteczek nieoparte na heksozie. Środki oczyszczające oparte na heksozie obejmują cząsteczki, które utworzyły pochodne z wbudowaniem jednej lub więcej heksoz (sześć reszt węglowych cukru) rozpoznawanych przez receptory Ashwell lub inne receptory takie jak receptor mannozy/N-acetyloglukozoaminy, które są związane z komórkami śródbłonka i/lub komórkami Kupffera wątroby, lub receptor mannozo 6-fosforanu. Przykładowe heksozy obejmują galaktozę, mannozę, mannozo 6fosforan, N-acetyloglukozoaminę i tym podobne. Inne reszty cząsteczek rozpoznawane przez receptory Ashwella, obejmujące glukozę, N-galaktozoaminę, N-acetylogalaktozoaminę, tioglikozydy galaktozy i, ogólnie, D-galaktozydy i glukozydy mogą również być stosowane. Sprzęganie galaktozotioglikozdydu z białkiem może być uzyskane np. jak opisano w Lee i wsp., (1976) Biochemistry, 15 (18): 3956 lub Drantz i wps. (1976) Biochemistry, 15 (18): 3963.
Środki oczyszczające, typu białkowego, oparte na galaktozie obejmują białka mające endogennie eksponowane reszty galaktozy lub które zostały przeprowadzone w pochodne, aby eksponować lub zawierać takie reszty galaktozy. Eksponowane reszty galaktozy kierują środek oczyszczający do szybkiego klirensu w wyniku endocytozy do wątroby poprzez specyficzne receptory (receptory Ashwella). Receptory te wiążą się ze środkiem oczyszczającym i indukują endocytozę do hepatocytu, prowadzącą do fuzji z Iizosomem i powrót receptora na powierzchnię komórki. Ten mechanizm oczyszczania (klirensu) charakteryzuje dużą wydajnością, dużą pojemnością i szybką kinetyką.
Przykładowym środkiem oczyszczającym typu białkowego, niosącym galaktozę jest sialoorosomukoidowa pochodna ludzkiej alfa-1 kwasu glikoproteiny. Szybki klirens z krwi asialoorosomukoidu opisano w Galli, i wsp., J. of Nucl Med Allied Sci (1988) 32 (2): 110-16. Traktowanie orosomukoidu neuraminidazą usuwa reszty kwasu sialowego, w wyniku czego następuje ekspozycja reszt galaktozy. Dodatkowe derywatyzowane środki oczyszczające obejmują, np. galaktosylowaną albuminę, galaktosylowaną-IgM, galaktosylowaną-IgG, asialohaptoglobinę, asialofetuinę, i asialoceruloplazminę.
Dodatkowe środki oczyszczające opisano w US nr 6,358,490, przyznanym 19 marca 2002; US nr 6,172,045, przyznanym 9 stycznia 2001 i US nr 5,886,143, przyznanym 23 marca 1999, z których każdy jest włączony tutaj jako odnośnik.
PL 217 626 B1
Kolejna klasa środków oczyszczających użyteczna w niniejszym wynalazku obejmuje małe cząsteczki, np. w zakresie masy cząsteczkowej od około 500 do około 10,000. Małe cząsteczki mogą być przeprowadzane w pochodne z galaktozą. Niskocząsteczkowe środki oczyszczające są korzystnie zdolne do (1) szybkiego i skutecznego kompleksowania z odpowiednim koniugatem, peptydem tworzącym zwój, środkiem aktywnym, i/lub ugrupowaniem naprowadzającym, i (2) usuwania takich kompleksów z krwi poprzez galaktozowy receptor, układ specyficznego rozkładu w wątrobie, w przeciwieństwie do agregujących w kompleksy, które pobierane są np. przez płuca i śledzionę. Dodatkowo szybka kinetyka pobierania przez wątrobę z pośrednictwem galaktozy, sprzężona z powinowactwem oddziaływania ligand-anty-ligand, umożliwia zastosowanie związków pośrednich lub nawet niskocząsteczkowych nośników.
Zgodnie z wynalazkiem, stosowane są środki oczyszczające typu białka i typu polimeru, nie oparte na galaktozie. Te środki oczyszczające mogą działać poprzez mechanizm pośredniczenia w agregacji. W tym rozwiązaniu wynalazku, zastosowany środek oczyszczający może być wybrany w oparciu o docelowy organ do którego dostęp środka oczyszczającego ma być wykluczony. Na przykład, wysokocząsteczkowe (o dużej masie cząsteczkowej), np. w zakresie masy cząsteczkowej od około 200000 do około 1000000 mogą być użyteczne gdy docelowe komórki guza są rozważane.
Inna klasa środków oczyszczających obejmuje środki, które nie usuwają krążących koniugatów środka aktywnego/ugrupowania naprowadzającego, zamiast tego dezaktywują krążące koniugaty przez blokowanie odpowiednich miejsc w obrębie środka aktywnego, ugrupowania naprowadzającego, liposomu, wektora wirusowego i/lub każdej ich innej części. Te środki oczyszczające typu nakrywki są korzystnie małe, np. o masie cząsteczkowej 500 do 10000, silnie naładowane cząsteczki, np. pochodne soli tetrasodowej kwasu 6,6-[(3,3-dimetylo[1,1'-bifenylo]-4,4'-diylo)bis(azo)bis[4-amino-5-hydroksy-1,3-naftalenodisulfonowego].
E. Dawkowanie/Podawanie
W sposobie według wynalazku, każdy skuteczny tryb podawania regulujący czas i kolejność dawek może być stosowany. Przykładowe poziomy dawkowania dla człowieka będą zależeć od trybu podawania, zakresu (wielkości i rozmieszczenia) guza, wielkości pacjenta i odpowiedzi raka na leczenia ureazą.
Gdy kompozycja zawierająca ureazę jest podana przez wstrzykiwanie bezpośrednio do guza, 3 przykładowa dawka wynosi 0,1 do 1,000 jednostek międzynarodowych aktywności ureazy na mm3 guza. Na przykład, i przyjmując, że stosunkowo jednorodne rozmieszczenie ureazy w obrębie guza jest osiągane, dawka od 0,5 do 5 jednostek międzynarodowych może być odpowiednia. Umieszczenie igły do iniekcji może być określane tradycyjnymi technikami kontroli wizualnej, np. metodą fluoroskopii, tak aby lekarz miał wgląd w pozycję igły w odniesieniu do tkanki docelowej. Takie narzędzia do kontroli wizualnej mogą obejmować ultrasonografię, fluoroskopię, CT lub MRI.
Zgodnie z jednym aspektem wynalazku, skuteczność lub rozmieszczenie podawanej dawki ureazy może być monitorowane, w czasie lub bezpośrednio po iniekcji ureazy do guza, przez monitorowanie tkanki guza przyrządem, przy pomocy którego można wykrywać zmiany pH w obrębie regionu zrakowaciałej tkanki w organizmie osobnika. Takie przyrządy mogą obejmować sondę pH, która może być wprowadzona bezpośrednio do guza, lub narzędzia obrazujące, takie jak obrazowanie rezonansem magnetycznym (MRI), tomografia komputerowa (CT) lub fluoroskopia. Badanie techniką MRI może być przeprowadzone bez dodatkowych środków obrazujących, w oparciu po prostu na różnicach we właściwościach magnetycznych tkanki jako funkcji pH. Metoda CT lub fluoroskopowe obrazowanie może wymagać dodatkowego, czułego na zmiany pH środka obrazującego , którego przepuszczalność dla promieniowania zależy od pH środowiska tkanek. Takie środki są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie.
Przed jakąkolwiek iniekcją ureazy, tkanka guza może być obrazowana poprzez jej niższe pH względem otaczającej normalnej tkanki. Zatem, normalna tkanka może mieć normalne pH wynoszące około 7,2, podczas gdy tkanka guza może mieć do 0,1 do 0,4 lub więcej jednostek pH mniej. To jest zanim jakakolwiek ureaza jest podana przez wstrzykiwanie, zakres tkanki guza może być zdefiniowany przez jego niższe pH. Po podaniu ureazy, pH regionu guza zawierającego ureazę będzie wzrastać i może być zidentyfikowane przez porównywanie otrzymanych obrazów z wcześniejszym obrazami przed podaniem ureazy.
W wyniku przebadania w ten sposób tkanki, stopień zmiany pH i obszar dotkniętej tkanki mogą być monitorowane. W oparciu o te badania, lekarz może zalecić podanie dodatkowej kompozycji w miejsce, i/lub może zalecić podanie kompozycji w dodatkowe obszary w obrębie guza. Procedura ta
PL 217 626 B1 może być powtórzona aż żądany stopień zmiany pH, np. z 0,2 do 0,4 pH jednostki, został osiągnięty w całym obszarze występowania guza litego.
Dawkowanie przez iniekcję bezpośrednią może być powtórzone w odpowiednich przedziałach czasowych, np. co tydzień lub dwa razy w tygodniu, aż do pewnego punktu końcowego, korzystnie gdy zasadnicze lub pełne cofnięcie się masy guza jest obserwowane. Skuteczność leczenia może być monitorowana, jak powyżej, przez wizualizację zmian pH traktowanej tkanki w czasie trwania leczenia. Zatem, przed każdą dodatkową iniekcją, pH tkanki może być obserwowane, aby określić istniejący zakres guza, po czym zmiany pH tkanki mogą być stosowane do monitorowania podawania nowej dawki kompozycji ureazy do tkanki.
Gdy ureaza jest podawana pozajelitowo sposobem innym niż bezpośrednia iniekcja, przykładowe dawki ureazy wynoszą 100-100000 jednostek międzynarodowych/kg aktywności ureazy/kg masy ciała osobnika. Jak zauważono tutaj, kompozycja zawierająca ureazę w tym sposobie korzystnie obejmuje kierunkujący środek aby naprowadzić ureazę do komórek rakowych, np. miejsca guza litego, lub do maskowania ureazy, np. w postaci liposomów, selektywnie w miejscu guza.
Jak opisano powyżej, techniki obrazowania, które są czułe na zmiany pH w tkance, mogą być stosowane do monitorowania skuteczności podawanej dawki. Ponieważ takie naprowadzanie może zajmować kilka godzin lub więcej, sposób może wymagać monitorowania pH guza, jak opisano powyżej, przed iniekcją ureazy i kilka godzin, np. 12-24 godzin po dawkowaniu, aby potwierdzić, że do miejsca guza podano odpowiednią dawkę, jak wykazano przez podniesienie się pH w obrębie guza. W zależności od wyników tego badania, sposób może wymagać dodatkowego dawkowania, aż zaobserwuje się żądane podniesienie wartości pH, np. 0,2-0,4 pH jednostki. Gdy ta dawka została ustalona, pacjent może być traktowany podobną dawką kompozycji ureazy na zasadzie regularnej, np. raz w tygodniu lub dwa razy w tygodniu aż uzyskane zostaną zmiany w wielkości guza lub stanu.
Przy obu typach podawania, ostateczny tryb dawkowania będzie wyznaczony przez lekarza prowadzącego z uwzględnieniem dobrej praktyki medycznej, biorąc pod uwagę różne czynniki, które modyfikują działanie leków, np. specyficzna aktywność środka, dotkliwość stanu chorobowego, odpowiedź pacjenta na leczenie, wiek, stan, masa ciała, płeć i dieta pacjenta, dotkliwości wszelkich infekcji i tym podobne. Dodatkowe czynniki, które mogą być wzięte pod uwagę obejmują czas i częstość podawania, połączenie(a) leków, wrażliwość na reakcje i tolerancja/odpowiedź na leczenie. Dalsze udoskonalenie dawkowania odpowiedniego do leczenia, obejmującego dowolne z preparatów wymienionych tutaj, przeprowadzone jest rutynowo przez lekarza biegłego w dziedzinie, zwłaszcza w świetle ujawnionych informacji i testów dotyczących dawkowania, jak i farmakokinetycznych danych uzyskanych w próbach kliniczych. Odpowiednie rodzaje dawkowania mogą być potwierdzone przez zastosowanie ustalonych testów do oznaczania stężenia środka w płynach ciała lub innych próbkach razem z danymi odpowiedzi na dawkę.
Częstość dawkowania będzie zależała od farmakokinetycznych parametrów środka i drogi podawania. Dawkowanie i podawanie jest tak dostosowane, aby zapewnić dostateczne poziomy środka aktywnego lub aby utrzymać żądane działanie. Zgodnie z powyższym, farmaceutyczne kompozycje mogą być podawane w jednej dawce, wielu poszczególnych dawkach, stałej infuzji, porcji leku o przedłużonym uwalnianiu, umieszczonej w tkankach, lub ich połączeń, jak wymagano do utrzymania żądanego minimalnego poziomu środka.
Krótko działające farmaceutyczne kompozycje (to jest o krótkim okresie trwania) mogą być podawane raz dziennie lub częściej niż raz dziennie (np. dwa, trzy lub cztery razy dziennie). Długo działające farmaceutyczne kompozycje mogą być podawane co 3 do 4 dni, co tydzień, lub raz na dwa tygodnie. Pompy, takie jak pompy podskórne, śródotrzewnowe, lub podtwardówkowe, mogą być korzystne do stałych infuzji.
Kompozycje zawierające środek aktywny według wynalazku utworzone jak opisano w Części II, powyżej, w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku mogą być wytworzone, umieszczone w odpowiednim zbiorniku i oznakowanych do leczenia wskazanych stanów. Warunki wskazane do zastosowania na ulotce mogą obejmować, nie ograniczając zakresu, leczenie i diagnostykę różnych typów raka. Zestawy, jak opisano poniżej, są również rozważane, gdzie zestaw obejmuje postać dawkowania kompozycji farmaceutycznej i wkładkę do opakowania zawierającą instrukcje stosowania kompozycji w leczeniu stanu medycznego.
Ogólnie, środki aktywne stosowane według wynalazku są podawane osobnikowi w skutecznej ilości. Ogólnie, skuteczna ilość jest ilością skuteczną zarówno do (1) zmniejszenia objawów chorób, które mają być leczone; lub do (2) indukcji farmakologicznej zmiany związanej z leczeniem choroby,
PL 217 626 B1 która ma być leczona. W przypadku raka, skuteczna ilość może obejmować ilość skuteczną do: zmniejszenia wielkości guza; spowolnienie wzrostu guza; zapobieganie lub hamowane przerzutów; lub przedłużenie przewidywanej długości życia u osobnika cierpiącego na raka. Przykładowy sposób podawania środka aktywnego myszy opisano w przykładzie 6, poniżej.
Zgodnie z niniejszy wynalazkiem, środki aktywne, środki oczyszczające, i/lub środki obrazujące według być podawane w jednej lub w wielu dawkach. W innym rozwiązaniu, środki mogą być podawane przez wlew dożylny przez dłuższy okres czasu. Na przykład, środek oczyszczający może być podawany dożylne przez okres czasu dostateczny do oczyszczania organizmu z ugrupowania naprowadzającego w stały sposób.
W wariantach wynalazku obejmujących podawanie ugrupowania wielonaprowadzającego, opisanych powyżej, dawki każdego składnika podawanego mogą być wyznaczone przez lekarza prowadzącego zgodnie z jego lub jej doświadczeniem; szczegóły stanu pacjenta, np. właściwości i umiejscowienie miejsca docelowego, obejmujące antygeny z nimi związane, będą miały wpływ na wybór ugrupowania naprowadzającego i decyzje dotyczące trybu podawania; i połączenia ugrupowania naprowadzającego, które ma być zastosowane, np., działanie przeciwciała może być różne w odniesieniu do gęstości antygenu i powinowactwa przeciwciała z antygenem.
IV. Sposób wzmagania działania leków przeciwrakowych
Jak zauważono powyżej, jednym z ograniczeń obecnej równoległej chemoterapii jest to, że docelowy guz staje się coraz bardziej odporny na działanie związku przeciwnowotworowego. Ta oporność może być spowodowana przez zmniejszony pobór związku do komórki guza, obniżona dostępność leku w miejscu pobierania, lub zwiększony wewnątrzkomórkowy metabolizm.
W przypadku wielu słabo zasadowych leków, to jest, leków mających jeden lub więcej protonowanych amin, mechanizm pobierania leku może wymagać dyfuzji biernej nienaładowanej postaci przez błonę komórkową. Zgodnie z powyższym, szybkość przemieszczania się związku w poprzek błony komórkowej będzie zależeć od gradientu pH na zewnątrz błony/wewnątrz komórki. Jeśli zewnątrzkomórkowe pH jest równe lub większe niż wewnątrzkomórkowe pH, np. pH około 7,2, związek będzie dążył do przejścia do komórki w nienaładowanej postaci przynajmniej tak często jak będzie opuszczał komórkę. Odwrotnie, gdy zewnątrzkomórkowe pH obniża się w odniesieniu do wewnątrzkomórkowego pH, jak to ma miejsce w stałych guzach, niższe pH na zewnątrz komórki będzie sprzyjać naładowanej, protonowanej postaci związku i to będzie hamowało pobieranie leku do komórki. W wyniku tego, jednym ze skutków niższego zewnątrzkomórkowego pH w guzach jest zabezpieczenie guza przeciwko słabo zasadowym związkom przeciwnowotworowym.
Słabozasadowe przeciwnowotworowe związki, na których aktywność może niekorzystnie działać niższe zewnątrzkomórkowe pH obejmują doksorubicynę, daunorubicynę, mitoksantron, epirubicynę, mitomycynę, bleomycynę, alkaloidy Vinca takie jak winblastyna i winkrystyna, środki alkilujące takie jak cyklofosfamid i chlorowodorek mechloroetaminy i przeciwnowotworowe pochodne puryny i pirymidyny.
W obecnym sposobie, ureaza lub kompozycja zawierająca ureazę jest podawana do guza litego w ilości skutecznej aby podnieść zewnątrzkomórkowe pH płynu guza przynajmniej 0,1 pH jednostki, np. 0,1 do 0,5 pH jednostki lub więcej. W pewnych rozwiązaniach, zewnątrzkomórkowe pH płynu jest podniesione przynajmniej do pH 7,0; 7,2, lub więcej.
Ureaza może być podawana jak opisano w Części III powyżej, np. bezpośrednio do guza osobnika lub pozajelitowo innym sposobem niż przez bezpośrednią iniekcję. Również jak opisano powyżej, zmiana pH wytworzona przez podawanie ureazy może być monitorowana przez oznaczanie zmiany pH w tkance guza i zakres tych zmian, stosując narzędzia do obrazowania do wizualizacji pH guza, lub przez bezpośrednie pomiary pH guza.
Dawka podawana w sposób ten może być mniejsza niż ta potrzebna, gdy ureaza jest jedynym środkiem przeciwnowotworowym, dopóki ilość podana przez wstrzykiwanie jest wystarczająca do wytwarzania żądanego podniesienia pH guza. W innym wariancie, sposób może wymagać podawania terapeutycznej ilości ureazy i terapeutycznej lub subterapeutycznej ilości przeciwnowotworowego związku. Jak można docenić, sposób może umożliwić niższą niż normalnie dawkę przeciwnowotworowego związku, który ma być podawany, zarówno ponieważ ureaza zwiększa terapeutyczne działanie związku i ponieważ ureaza sama bierze udział w działaniu terapeutycznym. Uzyskuje się większą skuteczność przy mniejszych niekorzystnych działaniach ubocznych.
PL 217 626 B1
Cząstka chemiczna, jak opisano powyżej, może również być związana ze środkiem aktywnym, i aby zwiększać dostarczanie środka aktywnego. W tym wariancie, środek aktywny może być podawany dowolną metodą, np. pozajelitowo, inaczej niż przez bezpośredną iniekcję.
V. Sposób monitorowania terapii przeciwrakowej
Wynalazek może również znaleźć zastosowanie w sposobie monitorowania terapii przeciwrakowej przez określanie obecności, wielkości lub stanu guza litego u osobnika. Sposób obejmuje podawanie środka aktywnego jak opisano powyżej, np. ureazy, osobnikowi, który cierpi na, lub podejrzewa się, że cierpi na guz lity. Środek aktywny jest podawany w warunkach skutecznych do zlokalizowania środka aktywnego w guzie litym u pacjenta.
Osobnik jest badany narzędziami diagnostycznymi zdolnymi do wykrywania zmian w zewnątrzkomórkowym pH w tkance osobnika, jak opisano powyżej. Narzędzie diagnostyczne jest korzystnie wrażliwym na pH środkiem diagnostycznym, takim jak odczynnik do obrazowania, kontrastu lub przesunięcia, jak opisano w Części II, powyżej, zdolnym do zlokalizowania guza, który może być podawane przed, po lub równolegle ze środkiem aktywnym. Region tkanki jest zidentyfikowany u pacjenta, który wykazuje podniesione zewnątrzkomórkowe pH po podawaniu. Dowolne narzędzie odpowiednie do zidentyfikowania środka diagnostycznego może być stosowany do wykrywania środka, takiego jak MRI, skanu PET i tym podobne, jak opisano powyżej.
W jednym rozwiązaniu, sposób obejmuje podawanie ureazy osobnikowi zastosowane w przeciwnowotworowej terapii i identyfikacja jest stosowana do wykrywania umiejscowienia ureazy w guzie litym.
Identyfikowanie może być stosowane do monitorowania zmian wielkości i kształtu guza w odpowiedzi na podawanie ureazy.
W jednym rozwiązaniu z wykorzystaniem skanu PET, osobnikowi jest podawany znakowany 13N amoniak. Pacjentowi następnie podawana jest ureaza w ilości skutecznej do osiągnięcia wielkości guza. Ureaza hydrolizuje mocznik do wytwarzania nie znakowanego amoniaku. Znakowany amoniak jest rozcieńczany lub zastępowany w czasie, powodując stopniowe usuwanie na skanie.
W innym rozwiązaniu z wykorzystaniem skan PET, osobnikowi jest podawany znakowany 13N mocznik. Pacjentowi następnie podawana jest ureaza w ilości skutecznej do osiągnięcia wielkości guza. Ureaza hydrolizuje mocznik do wytwarzania znakowanego amoniaku, który może być wykrywany na skanie.
VI. Zestawy
W jeszcze innym aspekcie, niniejszy wynalazek dostarcza zestawy do hamowania wzrostu komórek guza stosując sposoby tutaj opisane. Zestawy obejmują zbiornik zawierający jeden lub więcej środki aktywne. Zestawy mogą dodatkowo obejmować dowolny z innych składników opisanych tutaj w celu przeprowadzenia sposobów według wynalazku. Takie składniki obejmują, nie ograniczając zakresu składników farmaceutycznych, ugrupowania naprowadzające, środki obrazujące, środki oczyszczające, składniki do terapii genowej i tym podobne.
Zestawy mogą ewentualnie obejmować materiały instruktażowe zawierające wskazania (to jest, protokoły) ujawniające zastosowania środków aktywnych do hamowania wzrostu komórek guza. Zatem, w jednym rozwiązaniu, zestaw obejmuje kompozycję farmaceutyczną zawierającą środek aktywny, korzystnie enzym ureazy i materiały instruktażowe przedstawiające podawanie kompozycji osobnikowi, do leczenia raka u pacjenta. W jednym rozwiązaniu, materiały instruktażowe przedstawiające podawanie kompozycji zawierającej ureazę osobnikowi w ilości, która zależy od wielkości guza i od 3
0,1 do 100 jednostek międzynarodowych aktywności ureazy na mm3 guza, gdy kompozycja jest podawana przez iniekcję bezpośrednią do guza, i w ilości od 100 do 100000 jednostek międzynarodowych/kg jednostek międzynarodowych aktywność ureazy/kg masy ciała osobnika, gdy kompozycja jest podawana pozajelitowo osobnikowi inaczej niż przez iniekcję bezpośrednią do guza.
W innym rozwiązaniu, materiały instruktażowe przedstawiają podawanie kompozycji zawierającej ureazę osobnikowi, który również otrzymuje słabo zasadowy przeciwnowotworowy związek, którego skuteczność jest obniżona przez wyższe wewnątrzkomórkowy/niższy zewnątrzkomórkowy gradient pH w guzie litym, w ilości ureazy skutecznej do obniżenia lub odwrócenia wyższego wewnątrzkomórkowego/niższego zewnątrzkomórkowego gradientu pH w guzie litym.
W innym rozwiązaniu, materiały instruktażowe przedstawiają podawanie kompozycji zawierającej ureazę osobnikowi, który cierpi na, lub u którego podejrzewa się guzie lity, w warunkach skutecznych do zlokalizowania a ureazy w guzie litym u pacjenta, przebadanie osobnika narzędziem diagnostycznym odpowiednim do wykrywania zmian w zewnątrzkomórkowym pH w tkance osobnika i ziden34
PL 217 626 B1 tyfikowanie region tkanki u pacjenta, która wykazuje podniesione zewnątrzkomórkowe pH po takim podawaniu.
Podczas gdy materiały instruktażowe typowo obejmują pisemne lub drukowane materiały, nie są ograniczone do takich materiałów. Dowolny środek zdolny do przechowywania takich instrukcji i przekazania ich do końcowego użytkowania są rozważane w niniejszym wynalazku. Takie środki obejmują, nie ograniczając zakresu elektroniczne środki do przechowywania danych (np. dyski magnetyczne, taśmy, kartridże, chipy), nośniki optyczne (np. CD ROM), i tym podobne. Takie środki mogą obejmować adresy do miejsc internetowych, które dostarczają takie materiały instruktażowe.
VII. Terapia genowa/komórkowa
Kompozycja do terapii genowej jest również rozważana, w innym aspekcie wynalazku, stosowana do hamowania wzrostu komórek rakowych u ssaka. Kompozycja do terapii genowej obejmuje naprowadzający wektor skuteczny, gdy jest podawana osobnikowi, do selektywnej transfekcji komórek rakowych i przenoszoną przez ten wektor, zrekombinowaną sekwencję kwasu nukleinowego skuteczną do wytwarzania cząsteczki kwasu nukleinowego; np. mRNA, która koduje środek aktywny, korzystnie ureazę, w transfekowanych komórkach rakowych.
W jednym rozwiązaniu, komórki guza są kontaktowane z zaprojektowanymi nieonkogennymi komórkami, w których następuje ekspresja cząsteczki heterologicznego kwasu nukleinowego, która koduje środek aktywny. Zaprojektowane nie onkogenne komórki mogą obejmować, nie ograniczając zakresu, fibroblasty, komórki nabłonka, komórki śródbłonka, komórki kości, keratinocyty, lub naświetlane, zaprojektowane nie onkogenne komórki pochodzące z guza.
W innym rozwiązaniu, komórki guza transfekowano konstruktem genu kodującym ugrupowanie naprowadzające na komórki i heterologiczną cząsteczkę kwasu nukleinowego, która koduje białko ureazy i wydzielniczą sekwencję liderową. Konstrukt genowy jest zdolny do prowadzenia ekspresji ugrupowania naprowadzającego na komórki i heterologicznego białka ureazy i wydzielnicza sekwencja Iiderowa jako koniugatu w obrębie komórki guza i gdzie koniugat jest kierowany przez wydzielniczą sekwencję liderową, aby następnie pozostawić komórkę do selektywnej lokalizacji z antygenem zlokalizowanym na powierzchni komórki rozpoznawany przez ugrupowanie naprowadzające na komórkę.
Korzystnie, ugrupowanie naprowadzające na komórkę jest selektywnie zlokalizowana na antygen powierzchniowy komórki i antygen powierzchniowy komórki jest specyficzny dla przynajmniej jednego ludzkiego guza litego. Konstrukt genowy może obejmować transkrypcyjną regulatorową sekwencję zawierajacą promotor i kontrolny element, który obejmuje przełącznik genetyczny do kontroli ekspresji konstruktu genowego.
Zgodnie z jednym rozwiązaniem według wynalazku, konstrukt genowy jest wprowadzony do wektora wirusowego. Wiele różnych wektorów wirusowych są dostępne dla ukierunkowania na guz. Parviwirusy są znane do selektywnej infekcji komórek guza. W innym rozwiązaniu, wirus może być zaprojektowany tak, aby ulegał replikacji selektywnej w komórkach guza, zgodnie z opublikowanymi metodami. Patrz na przykład, Puhlmann M; i wsp., Hum Gen Ther, (1999) 10 (4): 649-57; Noguiez-Hellin P; i wsp. Proc. Natl. Acad. Sci USA, (1996) 93 (9): 4175-80; i Cooper MJ, Semin Oncol (1996) 23(1) 172-87. Na przykład, wirus może być tak zmieniony, aby zawierał zmutowaną kinazę tymidynową lub gen kodujący polimerazę, co umożliwia repilkację wirusa tylko w szybko dzielących się komórkach zawierających te enzymy. W innym rozwiązaniu, wirus może być uzyskany metodami inżynierii genetycznej aby zawierał kontrolne elementy specyficzne dla guza, np. regiony promotora specyficzne dla guza, które odpowiadają na działanie i prowadzą ekspresję żądanego białka lub białka koniecznego do replikacji wirusowej tylko w komórkach guza. Korzystnie, konstrukt genowy jest wprowadzony do adenowirusa.
A. Wektory do klonowania, przenoszenia i ekspresji genów
W obrębie pewnych rozwiązań wynalazku, wektory ekspresyjne są wykorzystywane do prowadzenia ureazowego polipeptydowego produktu, które mogą następnie być usuwane. W innych wariantach, wektory ekspresyjne są stosowane w terapii genowej. Wektory ekspresyjne mogą obejmować odpowiednie sygnały dostarczane w wektorze i różne elementy regulatorowe, takie jak środki zwiększające aktywność/promotory z wirusowych i/lub ssaczych źródeł, aby kierować ekspresją genów w komórkach gospodarza będącego przedmiotem zainteresowania. Elementy zaprojektowane do optymalizacji stabilności matrycowego RNA i stabilności w komórkach gospodarza również są zdefiniowane. Warunki zastosowania wielu dominujących markerów do selekcji leków, aby wybrać stałe, stabilne klony komórkowe prowadzące ekspresję produktów są również dostarczone, tak jak i element, który łączy ekspresję markerów do selekcji leków z ekspresją polipeptydu.
PL 217 626 B1
B. Elementy regulatorowe
Określenie konstrukt ekspresyjny ma oznaczać, że obejmuje dowolny typ konstruktu genetycznego zawierający kwas nukleinowy kodujący produkt genu, w którym część lub cała sekwencja kwasu nukleinowego kodującego jest zdolna do transkrypcji. Transkrypt może ulegać translacji do białka, lecz nie musi. W pewnych rozwiązaniach, ekspresja obejmuje zarówno transkrypcję genu jak i translację mRNA do produktu genu. W innych rozwiązaniach, ekspresja obejmuje tylko transkrypcję kwasu nukleinowego kodującego gen przedmiotem zainteresowania.
W korzystnych rozwiązaniach, kwas nukleinowy kodujący produkt genowy jest pod kontrolą transkrypcji promotora. Termin promotor odnosi się do sekwencji DNA rozpoznawane przez układy syntezy białek komórek, lub wprowadzonego układu syntezy, wymagane do zapoczątkowania specyficznej transkrypcji genu. Określenie pod kontrolą transkrypcji oznacza, że promotor jest właściwie umiejscowiony i jego układ względem kwasu nukleinowego do kontroli inicjacji polimerazy RNA i ekspresji genu.
Określenie promotor będzie stosowane tutaj, odnośnie do grupy cząsteczek modułów kontroli transkrypcji, które są zgrupowane wokół miejsca inicjacji polimerazy II RNA. Promotory mogą być złożone z poszczególnych modułów funkcjonalnych, z których każdy składa się z, w przybliżeniu 7-20 par zasad DNA, i zawiera jedno lub więcej miejsc rozpoznawanych przez aktywator lub represor transkrypcji białka. Przynajmniej jeden moduł dla każdej funkcji promotora dla lokalizacji miejsca startu syntezy RNA. Przykładowym modułem jest boks TATA, lecz w pewnych promotorach pozbawionych boksów TATA, takich jak promotor dla ssaczego genu terminalnego transferazy deoksynukleotydylowej i późnego promotora genów SV40, poszczególny element nakładający się na miejsce startu sam pomaga zlokalizować miejsce inicjacji.
Dany promotor zastosowany do kontroli ekspresji sekwencji kwasu nukleinowego będącego przedmiotem zainteresowania nie jest uważany za istotny, jeśli jest zdolny do ukierunkowania ekspresji kwasu nukleinowego w docelowej komórce. Zatem, gdy docelową komórką jest komórka człowieka, korzystne jest umieszczenie regionu kodującego kwasu nukleinowego w sąsiedztwie i pod kontrolą promotora, który jest zdolny do prowadzenia ekspresji w komórce człowieka. Ogólnie, taki promotor może obejmować zarówno ludzki jak i wirusowy promotor.
W różnych wariantach, ludzki cytomegalowirus (CMV) natychmiast po wczesnym promotorze genu, wczesny promotor SV40, wirusowe długie powtórzenie terminalne mięsaka Rousa, promotor insuliny szczura i dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanu może być stosowany, aby otrzymać ekspresję na wysokim poziomie sekwencji kodującej będącej przedmiotem zainteresowania. Zastosowanie innych wirusowych lub ssaczych komórkowych lub fagów bakteryjnych promotorów, które są dobrze znane w tej dziedzinie, aby osiągnąć ekspresję kodującą sekwencję będącą przedmiotem zainteresowania, jest również rozważany.
Gdy zastosowany jest insert cDNA, może być wymagane aby obejmował sygnał poliadenylacji aby uzyskać właściwą poliadenylację transkryptu genu. Właściwości sygnału poliadenylacji nie są uważane za krytyczne dla uzyskania przeprowadzenia wynalazku i każda dowolna sekwencja może być zastosowana, taka jak ludzki hormon wzrostu i sygnały poliadenylacji SV40. Również rozważany jako element kasety ekspresyjnej jest terminator. Elementy te mogą służyć do zwiększenia poziomów informacji i aby zminimalizować odczyt z kasety innych sekwencji.
C. Markery do selekcji
W pewnych wariantach według wynalazku, komórki zawierające konstrukty kwasów nukleinowych według niniejszego wynalazku mogą być zidentyfikowane in vitro lub in vivo dzięki temu, że zawierają marker w konstrukcje ekspresyjnym. Takie markery nadają komórce zmienną cechę, która może być zidentyfikowana, umożliwiającą łatwe określenie czy komórka zawiera konstrukt ekspresyjny. Typowo, wprowadzenie markera selekcyjnego względem leku ułatwia klonowanie i selekcję transformantów, na przykład użyteczne jako markery do selekcji są geny, które nadają oporność na neomycynę, puromycynę, hygromycynę, DHFR, GPT, zeocynę i histydynol. W innym rozwiązaniu mogą być zastosowane enzymy takie jak kinaza tymidynowa z wirusa herpes simplex (tk) lub acetylotransferaza chloramfenikolu. Mogą być zastosowane również markery immunologiczne. Ponadto przykłady markerów do selekcji są dobrze znane osobie biegłej w tej dziedzinie. Patrz np. Baumann, R. P. i wsp. (2002) Biotechniki 32 (5): 1030-34.
PL 217 626 B1
D. Dostarczenie wektorów ekspresyjnych
Istnieje wiele sposobów, w jakie wektory ekspresyjne mogą być wprowadzone do komórki. W pewnych rozwiązaniach wynalazku, konstrukt ekspresyjny obejmujący wirus lub zaprojektowany konstrukt pochodzący z genomu wirusowego, który zastosowano aby dostarczyć kompozycję zawierającą ureazę do docelowej komórki. Zdolności pewnych wirusów do dostawania się do wnętrza komórki poprzez endocytozę, w której pośredniczy receptor, aby wbudować się w genom komórki gospodarza i uzyskać stabilną i skuteczną ekspresję genów wirusowych, spowodowały, że są stanowią one atrakcyjne środki do przenoszenia obcych genów do komórek ssaków.
Jedną z korzystnych metod do dostarczania in vivo obejmuje zastosowanie adenowirusowego wektora ekspresyjnego. Adenowirusowe wektory ekspresyjne oznaczają, że obejmują te konstrukty, które zawierają adenowirusowe sekwencje dostateczne, aby (a) zapewnić opakowanie konstruktu i (b) uzyskać ekspresję polinukleotydu, który został do konstruktu wklonowany. W odniesieniu do powyższego, ekspresja nie wymaga, aby produkt genu został zsyntetyzowany. Patrz np. Barnett, B. G., i wsp. (2002) Targeted Adenowirus Vectors” Biochim. Biophys. Acta 1575 (1-3): 1-14.
W jednym rozwiązaniu wynalazku, wektor ekspresyjny może obejmować uzyskane metodami inżynierii genetycznej formy adenowirusa. Znajomość genetycznej organizacji adenowirusa, wirus zawierający liniowy, dwuniciowy DNA, o wielkości 36 kilo zasad, umożliwia substytucję dużej części adenowirusowego DNA obcą sekwencją o wielkości do 7 kilozasad. W przeciwieństwie do retrowirusów, zakażenie adenowirusem komórki gospodarza nie daje w wyniku integracji chromosomowej, ponieważ adenowirusowy DNA może replikować w sposób episomalny bez ewentualnej toksyczności dla genomu. Ponadto adenowirusy są strukturalnie stabilne i nie wykryto żadnego przearanżowania genomu nawet po znaczącej amplifikacji.
Adenowirus jest szczególnie odpowiedni do stosowania jako wektor przenoszący gen, ze względu na jego średniej wielkości genom, łatwość w posługiwaniu się tym wirusem, wysokie miano, szeroki zakres docelowych komórek, w których może być stosowany i wysoką zakaźność. Wytworzenie i powielenie adenowirusowych wektorów może zależeć od pomocniczej linii komórkowej. Pomocnicze linie komórkowe mogą pochodzić z ludzkich komórek, takich jak ludzkie zarodkowe komórki nerki, komórki mięśni, komórki hematopoetyczne lub inne ludzkie zarodkowe komórki mezenchymalne lub nabłonkowe. W innym rozwiązaniu, pomocnicze komórki mogą pochodzić z komórek z innych gatunków ssaków, które są tolerancyjne względem ludzkich adenowirusów. Takie komórki obejmują, np. komórki Vero lub inne małpie zarodkowe komórki mezenchymalne lub nabłonkowe. Przykładową pomocniczą linią komórkową jest linia komórkowa 293, która została przekształcona z ludzkich zarodkowych komórek nerki przez fragmenty DNA Ad5 i konstytutywnie prowadzi ekspresję białka E1 Metody hodowli komórek 293 i propagacji adenowirusa są opisane w literaturze.
Dodatkowe wektory wirusowe mogą być zastosowane jako konstrukty ekspresyjne według niniejszego wynalazku. Mogą być zastosowane wektory pochodzące z wirusów takich jak wirus ospy krowiej (Walther, W. i Stein, U. (2000) Drugs 60 (2): 249-71), wirusy związane z adenowirusami (Zhao, N. i wsp. (2001) Mol Biotechnol 19 (3): 229-37) i wirusy opryszczki (Burton, E. A. i wsp., (2001) Adv Drug Deliv Rev 53 (2): 155-70). Dodatkowe specyficzne dla guzów, selektywne pod kątem replikacji wirusy, które mogą być stosowane w niniejszym wynalazku opisano w pracy przeglądowej Hawkinsa, L. K. i wsp. (2002) w Lancet Oncol. 3 (1): 17-26.
Kilka niewirusowych metod przenoszenia konstruktów ekspresyjnych do hodowli ssaczych komórki również jest rozważanych w niniejszym wynalazku. Metody te obejmują strącenie fosforanem wapnia, DEAE-dekstran, elektroporacja, bezpośrednia mikroiniekcja, liposomy z wprowadzonym DNA i kompleksy lipofektamina-DNA, sonikacja komórek, bombardowanie genem stosując mikropociski o dużej szybkości i transfekcję za pośrednictwem receptora.
Gdy konstrukt ekspresyjny został dostarczony do komórki, kwas nukleinowy kodujący gen będący przedmiotem zainteresowania, np. gen kodujący ureazę, może być umiejscowiony i będzie następowała ekspresja w różnych miejscach. W pewnych rozwiązaniach, kwas nukleinowy kodujący środek aktywny może być stabilnie zintegrowany z genomem komórki. Taka integracja może być w pokrewnym umiejscowieniu i orientacji, poprzez homologiczną rekombinację (zastąpienie genu) lub może być zintegrowana w losowym, niespecyficznym miejscu (powiększenie genu). W jeszcze innych rozwiązaniach, kwas nukleinowy może być stabilnie utrzymywany w komórce jako oddzielny, episomalny segment DNA. Takie segmenty kwasu nukleinowego lub episomy kodują sekwencje dostateczne, aby umożliwić utrzymanie i replikację niezależnie lub zsynchronizowaną z cyklem komórki
PL 217 626 B1 gospodarza. Sposób dostarczania konstruktu ekspresyjnego i umiejscowienie w komórce, gdzie kwas nukleinowy pozostaje zależy od typu zastosowanego konstruktu ekspresyjnego.
W jeszcze innym rozwiązaniu wynalazku, konstrukt ekspresyjny może po prostu składać się z samej zrekombinowanej cząsteczki DNA lub plazmidów. Przeniesienie konstruktu może być wykonywane dowolnym ze sposobów wymienionych powyżej z fizycznym lub chemicznym u przepuszczalnieniem błony komórkowej. Jest to szczególnie wykorzystywane w przeniesieniu in vitro, lecz może być stosowane również in vivo.
W jeszcze innym rozwiązaniu według wynalazku do przenoszenia samego konstruktu ekspresyjnego DNA do komórki może być konieczne bombardowanie cząsteczkami. Sposób ten zależy od zdolności do przyśpieszania mikropocisków powlekanych DNA - do dużej szybkości, co umożliwia im przejście przez błonę komórkową i dostanie się do wnętrza komórki nie zabijając jej. Kilka urządzeń stosowanych do przyśpieszania małych cząstek może być użytecznych w tym względzie. Jedno z takich urządzeń polega na wysokim wyładowaniu potencjału, aby wytworzyć duże natężenie prądu eklektrycznego, które z kolej dostarcza siłę do przemieszczenia. Mikropociski stosowane mogą zawierać biologicznie obojętne substancje takie jak wolframowe lub złote kulki.
W jednym rozwiązaniu, takie konstrukty ekspresyjne mogą być zamknięte w liposomie, kompleksie lipidowym, nanokapsułce, lub innym preparacie stosując jeden lub więcej ze sposobów ujawnionych w Części II, powyżej. Również rozważane są kompleksy Iipofektamina - DNA.
W pewnych rozwiązaniach wynalazku, Iiposom może być skompleksowany z wirusem powodującym aglutynację krwinek (HVJ). W innych rozwiązaniach, Iiposom może być skompleksowany lub zastosowany w połączeniu z jądrowymi niehistonowymi chromosomalnymi białkami (HMG-1). W kolejnych rozwiązaniach, Iiposom może być skompleksowany lub zastosowany w połączeniu z HVJ i HMG-1.
Inne konstrukty ekspresyjne, które mogą być zastosowane aby dostarczyć kwas nukleinowy kodujący dany gen do komórki obejmują nośniki do dostarczania w których pośredniczy receptor. Proces ten wykorzystuje selektywnie pobieranie makrocząsteczek w wyniku endocytozy zachodzącej za pośrednictwem receptora w prawie wszystkich eukariotycznych komórkach. Ze względu na specyficzne dla typu komórki rozmieszczenie różnych receptorów, taki sposób dostarczania może być bardzo specyficzny.
Nośniki ukierunkowane na gen, z pośrednictwem receptora ogólnie składają się z dwóch składników: Iigand specyficzny dla receptora komórki i środek wiążący DNA. Stosowano kilka ligandów do przeniesienia genu za pośrednictwem receptora, np. azialoorosomukoidu i transferyny. Ponadto, czynnik wzrostu nabłonka (EGF) był również stosowany, aby dostarczyć geny do komórek raka nabłonka płaskiego (Europejskie zgłoszenie patentowe, nr publikacji EP 0360257, specyficznie włączone tutaj jako odnośnik).
W innych rozwiązaniach, nośnik do dostarczania może obejmować Iigand i liposom. Zatem, jest wykonalne, aby kwas nukleinowy kodujący dany gen również mógł być specyficznie dostarczany do komórki takiego rodzaju jak komórki płuc, naskórka lub komórki guza, stosując dowolną ilość układów receptor-ligand z lub bez liposomów. Na przykład, EGF lub inne małe cząsteczki mogą być stosowane jako receptor dla dostarczenia z pośrednictwem, kwasu nukleinowego kodującego gen w wielu komórkach guza, które wykazują regulację w górę receptora EGF (Basela, J. (2002) J Clin Oncol 20 (9): 2217-9). Również przeciwciała przeciwko CD5 (CLL), CD22 (chłoniak), CD25 (leukemia limfocytów T) i MAA (czerniak) może podobnie być stosowane jak ugrupowania naprowadzające.
W pewnych wariantach, przeniesienie genu może być z łatwością wykonane w warunkach ex vivo. Terapia genowa ex vivo odnosi się wyodrębnienia komórek ze zwierzęcia, dostarczenia kwasu nukleinowego do komórek in vitro, a następnie z powrotem wprowadzenie zmodyfikowanych komórek do organizmu zwierzęcia. Może to wymagać chirurgicznego usunięcia tkanek/organów z ciała zwierzęcia lub założenie pierwotnej hodowli komórki i tkanek. Patrz np. Ahonen, M. i wsp. (2002) Mol. Ther. 5 (6): 705-15 i Kawai, K. i wsp. (2000) Mol Urol. 4 (2): 43-6; patenty US nr 6,395,712,6,149,904, i 6,410,029, z których każdy jest włączony tutaj jako odnośnik.
Pierwotne ssacze hodowle linii komórkowych mogą być wytworzone różnymi sposobami. W celu utrzymania komórek żywotnymi, gdy jednocześnie in vitro i w kontakcie z konstruktem ekspresyjnym, komórki typowo będą utrzymywać kontakt z odpowiednim stosunkiem tlenu i dwutlenku węglai środkami odżywczymi i będą zabezpieczone przez zakażeniem bakteryjnym. Techniki hodowli komórkowych są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie.
Przykłady użytecznych ssaczych linii komórkowych gospodarza obejmują komórki Vero i HeLa i linie komórkowe z jajnika chomika syryjskiego, komórki W138, BHK, COS-7,293, HepG2, NIH3T3, RIN
PL 217 626 B1 i MDCK. Ponadto, szczep komórki gospodarza może zostać wybrany tak, aby wpływał na ekspresję wprowadzonych sekwencji, lub modyfikował i zapewniał obróbkę produktu genu w żądany sposób. Takie modyfikacje (np. glikozylacja) i obróbka (np. cięcie) białkowych produktów może być ważne dla funkcjonowania białka. Różne komórki gospodarza mają charakterystyczne i specyficzne mechanizmy obróbki potrąnslacyjnej i modyfikacji białka. Odpowiednie linie komórkowe lub układy gospodarza mogą być wybrane, aby zapewnić właściwą modyfikację i obróbkę obcego białka, ulegającego ekspresji.
Wiele układów do selekcji może być stosowanych, obejmujących, lecz nie ograniczając się do, genów kodujących kinazę tyrozynową HSV, hypoksantyno-guaninofosforybozylotransferazę i adeninofosforybozylotransferazę, w komórkach tk-, hgprt- lub aprt-, odpowiednio. Również oporność przeciwko metabolitom może być stosowana jako podstawa dla wyboru gpt, który nadaje oporność komórkom na kwas mykofenolowy; neo, który nadaje oporność na aminoglikozyd G418; i hygro, który nadaje oporność na higromycynę.
Na podstawie poniższych danych, można zauważyć jak różne przedmioty i właściwości wynalazku są spełnione.
T a b e l a 2 Sekwencje dostarczone dla poparcia wynalazku.
Opis SEQ. ID NO,
E- zwój; Glu Vat Ser Ala Leu Giu Lys Glu Val Ser Ała Leu Glu Lys Glu Val Ser Ala Leu Glu Lys Giu Va1 Ser Ala Leu Glu Lys Glu Val Ser Ala Leu Glu Lys 1
K- zwój: Lys Vai Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu 2
Glu Val Glu Ala Leu Gin Lys Giu Va1 Ser Ala Leu Giu Lys Glu Vai Ser Ala Leu 3
Giu Cys Glu Val Ser Ala Leu Glu Lys Glu Val Glu Ala Leu Gin Lys
Lys Vaf Glu Ala Leu Lys Lys Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val Ser Ala Leu Lys Cys Lys Val Ser Ala Leu Lys Giu Lys Val Glu A3a Leu Lys Lys 4
K- zwój: KVSALKE 5
E- zwój: EVSALEK Ureaza z kanawalii mieczokszfcałtnej 6
MKLSPREVEKLGl.HNAGYLAQKRLARGVRLNYTEAVALIASQIMEYARDGE KrVAQLMCLGQHU,GRRQVLPAVPHLLNAVQVEATFPDGTKLVTVFtDPISR ENGELQEALFGSLŁPVPSLDKFAETKEDNRIPGEILCEDECL-n-NIGRKAVILK VTSKGDRP1QVGSHYHFIEYNPYLTFDRRKAYGMRLNIAAGTAVRFEPGDC KSVTLVSIEGNKV1RGGNAIADGPVNETNLEAAMHAVRSKGFGHEEEKDAS EGFTKEDPNCPFNTFIHRKEYANKYGPTTGDKtRLGOTOLLAEIEKDYALYG DECVFGGGKVIRDGMGQSCGHPPAXSLDTVrTNAVIIDYTGnKADIGIKDGLIA SIGKAGNPDIMNGVFSNMIIGANTEVIAGEGLIVTAGAIDCHVHYICPQLVYEA ISSGrTTLVGGGTGPAAGTRATTCTPSPTQMRLMLQSTDDLPLAIFGFTGKG SSSKPDELHEnKAGAMGLKLHEDWGSTPAAmNCLTIAEUHDIOINIHTDTLN eAGFVEHSIAAFKGR-nHTYHSEGAGGGHAPDnKVCGIKNVLPSS™PTRPL TSNTEDEHLDMLMVCHHLDREIPEDLAFAHSRIRKKTIAAEDVLNDIGA1SIISS DSQAMGRVGEVISRTWQTADKMKAQTGPLKCDSSŁ>NDNFRIRRYIAKYTIN RAiANGFSQYVGSVEVGKLADLVMWKRSFFGTT<PEMVIKGGMVAWADIGD PNASIPTPEPVKMRPMYGTŁGKAGGALSIAFVSKAALOQRVNVLYGLNKRV EAVSNVRKŁTKLDMKLNDALPEITVDPESYTVKADGKLLCVSEATTVPLSRN YFLF 7
PL 217 626 B1
IV. Przykłady
Poniższe przykłady dalej ilustrują opisany tutaj wynalazek i w żaden sposób nie stanowią ograniczenia dla zakresu wynalazku.
A. P r z y k ł a d 1
A1. Synteza peptydów
Peptydy wytwarzano z wykorzystaniem metodyki syntezy w fazie stałej, stosując tradycyjną chemię N-t-butyloksykarbonylu (t-Boc). Peptydy odcinano od żywicy w wyniku reakcji z fluorowodorem (20 ml/g żywicy) zawierającym 10% anizol i 2% 1,2-etanoditiol przez 1,5 godziny w temp. 4°C. Nieoczyszczone peptydy przemywano zimnym eterem i ekstrahowano z żywicy lodowatym kwasem octowym i suszono sublimacyjnie. Syntetyczny peptyd oczyszczano stosując HPLC w układzie odwróconych faz w pół-preparacyjnej kolumnie C-8 Zorbax (250 x 10 mm I. D., wielkość cząsteczek 6,5-μτη, wielkość poru 300 A) liniowym gradientem AB (w zakresie od 0,2 do 1,0%B/min) przy szybkości przepływu 2 ml/min, gdzie rozpuszczalnik A jest wodnym roztworem 0,05% kwasu trifluorooctowego (TFA) a rozpuszczalnik B jest 0,05% TFA w acetonitrylu. Homogenność oczyszczanych peptydów sprawdzano stosując analityczną HPLC o odwróconej fazie, analizę aminokwasów i spektrometrię mas z MALDI.
A2. Oczyszczanie ureazy z wykorzystaniem powinowactwa.
Kolumnę powinowactwa wytwarzano przez prowadzenie reakcji hydroksymocznika z aktywowaną epoksy sefarozą 6B (Amersham Biosciences). Pozostałe grupy aktywne blokowano stosując 1 M etanolaminę.
Oczyszczanie wykonywano następująco. Kolumnę równoważono PEB (0,02 M fosforan, 1 mM EDTA, 1 mM β-merkaptoetanol, pH 7,0). Nanoszono surową próbkę ureazy (Fig. 2) (0,5 mg/ml w PEB, całkowita ilość 8 ml). Kolumnę przemyto 15 ml PB (0,02 M fosforan, 1 mM β-merkaptoetanol, pH 7,0). Kolumnę następnie przemywano 8 ml każdego z następujących roztworów: PB + 0,1 M NaCI, PB + 0,5 M NaCI, i PB + 0,95 M NaCI. Ureazę wymywano 8 ml EB (0,2 M fosforan, 1 mM β-merkaptoetanol, pH 4,6), zbierając frakcje 1 ml. Frakcje sprawdzono przez odczyt OD przy 280 nm (Fig. 3) i analizę HPLC (kolumna C5). Kolumnę przechowywano w 0,01% NaN3
B. P r z y k ł a d 2 - Otrzymywanie koniugatu ureaza-zwój
Koniugat ureaza-zwój wytworzono przez rozpuszczenie 10 mg ureazy z kanawalii mieczokształtnej w 300 μΙ 2 mM buforu fosforanowego przy pH 7,2. Następnie 5 mg dwufunkcyjnego środka sieciującego SuIfo-MBS dodano do roztworu i mieszaninę powoli mieszano przez godzinę w temperaturze pokojowej. Mieszaninę następnie dializowano w 2 mM buforze fosforanowym przy pH 7,2 aby usunąć nadmiar środka wiążącego.
K-zwój lub E-zwój z Iinkerem cysterinowym na końcu C (1,5 mg) dodano do roztworu środka wiążącego ze zmodyfikowaną ureazą i powoli mieszano przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. Koniugat ureaza-zwój dializowano w obecności 2 mM buforu fosforanowego przy pH 7,2 przez noc, aby usunąć niesprzężony peptyd zwoju.
Dializowany koniugat ureazy liofilizowano, następnie rozpuszczono w 1 ml 2 mM buforu fosforanowego przy pH 7,2 i nanoszono na kolumnę sephadex G75 do dalszego oczyszczania. Frakcje z objętości swobodnej, które zawierały koniugat ureaza-zwój, zebrano, wysuszono sublimacyjnie i przechowywano w temp. 4°C.
Czystość koniugatu i stosunek zwoju do ureazy w preparacie wyznaczono przez analizę aminokwasów i spektrometrię mas z MALDI, stosując standardowe procedury.
C. P r z y k ł a d 3 - Oznaczenie aktywności ureazy i koniugatu ureazy
Enzymatyczna aktywność ureazy lub koniugatu ureazy przeprowadzono w reakcji sprzężonej z enzymem z dehydrogenazą glutaminianową (GLDH). Ilość NADH utlenionej wyznaczono przez pomiar zmiany absorbancji przy 340 nm (Kaltwasser, H. i Schlegel, H. G., Anal. Biochem., 16,132, 1966). Jako odczynniki stosowano: 0,10 M bufor fosforanu potasu, pH 7,6; 1,80 M mocznik, wytworzony w buforze fosforanowym; 0,025 M Adenozyno-5'-difosforan (ADP) (10,7mg/ml) w buforze; 0,008 M NADH (5 mg/ml) w buforze fosforanowym; 0,025 M α-ketoglutaran (3,7 mg/ml) w buforze fosforanowym; roztwór dehydrogenazy glutaminianowej (GLDH), pozbawiony jonów amonowych; 50 U/ml buforu fosforanowego wytworzono tuż przed testem. Roztwór ureazy wytworzono przez rozpuszczenie w buforze fosforanowym, aby uzyskać stężenie 0,1-0,5 U/ml. Roztwór ten wytworzono tuż przed testem.
Test rozpoczynano dodając po 2,0 ml buforu fosforanowego, 2,40 ml, 0,10 ml każdego z mocznika, ADP, NADH, GLDH i α-ketoglutaranu w kuwecie. Spektrofotometr dostosowano do 340 nm
PL 217 626 B1 i 25°C. Kuwetę z dodanymi składnikami umieszczano w spektrofotometrze w temp. 25°C przez 5 minut, aby uzyskać zrównoważenie temperatury, a następnie ustalano wartość odniesienia, jeśli to było konieczne przy 340 nm.
Aby zapoczątkować reakcję enzymatyczną dodano do kuwety 0,1 ml roztworu ureazy. Zmiany absorbancji przy 340 nm rejestrowano przez 15 min. Aktywność enzymu była dobrze skorelowana z obniżeniem absorbancji przy 340 nm na min.
D. Przykład 4 - Otrzymywanie Koniugatu Przeciwciało-zwój
Materiały obejmują: (1) szczurzą Anty-hEGFR IgG2a (Serotec), 200 μg/0,2 ml (to jest 1 mg/ml); (2) E-zwoju (N-linker); (3) m-nadjodan sodu (Pierce); i (4) Dwufunkcyjny środek sieciujący, KMUH (Pierce).
Funkcjonalną modyfikację E-zwoju wykonywano przeprowadzając poniższe etapy:
a. Rozpuścić KMUH w DMSO, aby wytworzyć 10 mg/ml roztwór (2,5 mg w 250 μΙ DMSO).
b. Rozpuścić E-zwój w PB (~2 mg w 392 μΙ 10 mM PB, pH 7,4 + 4 μΙ TCEP, 100 mM roztwór wyjściowy).
c. Dodać 1 μΙ Tris (2 M), aby zobojętnić roztwór E-zwoju.
d. Dodać roztwór E-zwoju do roztworu KMUH i inkubować w temp. pokojowej przez 2 godziny.
e. Utrzymywać roztwór w temp. 4°C przez noc.
f. Następnego ranka, zwirować przy 12000 rpm przez 5 min, aby usunąć nierozpuszczony osad.
g. Usunąć KMUH i DMSO w kolumnie C8 techniką HPLC (0-20%acetonitryl/H2O z 0,05% TFA) i zebrać wszystkie frakcje peptydowe (75% acetonitryl).
g. Zliofilizować frakcje peptydowe i zanalizować techniką MS.
Przeciwciało zostało utlenione w poniższych etapach:
a. Do każdego 2 mg przeciwciała, masę 20 mg nadjodanu w bursztynowej fiolce.
b. Dodać 2 ml PBS, pH 7,2 i 2 ml roztworu wyjściowego przeciwciała do fiolki (końcowa ilość [przeciwciała] wynosiła 0,5 mg/ml) i łagodnie mieszać do rozpuszczenia proszku nadjodanu.
c. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min.
d. Usunąć nadjodan przez dializę 3 krotnie w 100 mM buforze octanowym, pH 5,5.
Sprzęganie wykonywano według poniższych etapów:
a. Zatężyć utlenione przeciwciało (~2 mg w 4 ml) stosując jednostki Millipore Ultrafree Filter (30k MWc/o).
b. Dodać 75 μΙ roztworu sfunkcjonalizowanego E-zwoju (4 μg/μl ddH2O) do połowy roztworu utlenionego przeciwciała (zawierającego ~0,75 mg przeciwciała w buforze octanowym, pH 5,5).
c. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny z wytrząsaniem.
d. Oczyścić mieszaninę przeciwciała stosując kolumnę z białkiem G (Patrz Fig. 4).
e. Porównać i analizować próbkę (przez i po oczyszczaniu z wykorzystaniem powinowactwa).
E. Przykład 5-Analiza Biacore koniugatu ureaza - zwój i koniugatu przeciwciało zwój
Zawierający cysteinę peptyd K-zwoju lub peptyd E-zwoju był kowalencyjnie sprzęgany z chipem biosensorycznym Pioneer B1 zgodnie z protokołem sugerowanym przez producenta. Pokrótce, powierzchnia dekstranowa chipa pomiarowego była wstępnie aktywowana stosując NHS/EDC (15 μΙ), po czym dodawano PDEA (20 μΙ). K-zwój (lub E-zwój (50 μg/ml) w 10 mM buforze octanu sodu, pH 4,3 podawano przez wstrzykiwanie i pozostawiono do przereagowania, aby otrzymać gęstość powierzchniową o około 200-400 RU. Pozostałe aktywowane grupy następnie blokowano przez iniekcję roztworu do dezaktywacji (10 μΙ) 50 mM cysteiny, 1 M NaCI, 0,1 M mrówczanu, pH 4,3.
Doświadczenia dotyczące kinetyki wykonywano stosując urządzenie BIAcore3000 w temp. 25°C. Każdy przebieg biosensora składał się z (1) 600s fazę iniekcji próbki (ureaza zwój lub przeciwciało zwój), (2) 600s fazę dysocjacji, i (3) 2x 15s fazę regeneracji (6M guanidyna HQ). Szybkość przepływu 5 μΙ/min utrzymywano w całym czasie trwania cyklu. PBS stosowano jako bufor. Sygnał SPR rejestrowano w czasie rzeczywistym z pobieraniem próbek co 0,5 s i wykreślano jako RU w czasie (sensorogram). Każdy sensorogram otrzymywany poddano korekcje pod względem zmian objętościowych współczynnika załamania światła przez odjęcie od odpowiedniego cyklu iniekcji próbki pustej powierzchni komórkowej
F. Przykład 6 - Badania na zwierzętach
Samice myszy nu/nu bez grasicy z międzygatunkowym przeszczepem ludzkiego gruczalakoraka gruczołu sutkowego zastosowano do badania. Zwierzęta wybrane miały zasadniczo 5 do 7 tygodni i ich masy ciała w momencie rozpoczęcia leczenia były w zakresie od około 15 do 28 gram.
PL 217 626 B1
Komórki MCF zastosowano, aby wytworzyć przeszczepy międzygatunkowe. Komórki hodowano w pożywce MEM uzupełnionym Penicyliną/Streptomycyną 5000 U/ml, L-glutaminą 200 mM, Pirogronianem sodu, niezasadniczymi aminokwasami, witaminami i 10% FBS; w inkubatorze komórkowym utrzymywano 5% CO2, 37,5°C, i 80% wilgotność. Komórki zbierano stosując 0,25% (masa/objętość) trypsynę -0,03% (masa/objętość) roztwór EDTA. Około 1x106 komórek w 100 μΙ podano przez wstrzykiwanie podskórne do prawego boku każdej myszy. Pozwolono na swobodny wzrost guza przez około 6-8 dni, umożliwiając, aby guz osiągnął wielkość przynajmniej 2-4 mm średnicy. Dawki podawano przez iniekcje do guza. Objętość dawki dla każdego zwierzęcia wynosiła 50 μΙ. Do każdego guza litego podano przez wstrzykiwanie daną dawkę badanego środka w sposób wachlarzowy.
Objętości guza mierzono stosując pomiary zewnętrznym przyrządem do pomiaru średnicy. Masy ciała zwierząt mierzono na początku próby i w momencie uśmiercenia.
Wyniki, jak przedstawiono w tabeli 3 poniżej, wykazały, że guzy nie były wyczuwalne 24 godziny po leczeniu.
T a b e l a 3
Skuteczne leczenie guzów u myszy
Mysz 1 2 3 4 5 6
Komórka MCF podana przez wstrzykiwanie 0,8 x 106 0,8 x 106 0,8 x 106 0,8 x 106 1,3 x 106 0,8 x 106
Wielkość guza przed leczeniem 22,5 mm3 33,5 mm3 15,6 mm3 31,1 mm3 32,5 mm3 8,2 mm3
Ilość ureazy podana przez wstrzykiwanie 50υ/50μ1 50υ/50μ1 50υ/50μ1 50υ/50μ1 50υ/50μ1 50υ/50μ1
Wielkość guza po leczeniu (24 godziny) niewyczu- walny niewyczu- walny niewyczu- walny niewyczu- walny niewyczu- walny niewyczu- walny
Pomimo, że wynalazek został opisany w odniesieniu do poszczególnych rozwiązań, będzie zrozumiałe dla biegłego w tej dziedzinie, że różne zmiany i modyfikacje mogą być przeprowadzone bez oddalania się od wynalazku.
PL 217 626 B1
Lista sekwencji <110> Helix BioRtiarma Corporation <12 0 Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu raka <130> 548O08023W00 <140> Nie przypisany <141> W załączeniu <150> US 60/397,244 <151> 2002 0718 <160> 7 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 35 <212:
;213> Sekwe
ΤΠ f' ł τη c? h? ł”· ί ϊ rz ϊπ iiL· J o, Ja Z* V Lik_, Xi X i d <220>
<223 > peptyd tworzący E~zwój
Glu Val Ser Ala Leu Glu Lys Glu Val Ser Ala Leu Gin Lys Glu Val
Ser Ala Leu Glu Lys Glu Val Ser Ala Leu Glu Lys Glu Val Ser Ala
Leu Glu Lys 35 <210> 2 <211> 35 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<22 3 > Peptyd tworzący K-zwój <400> 2
Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu By £3 37 a 1 Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val
1 5 10 ej
Ser Ala Be u Ly s G1 u Lys Val S o r Ala Leu Lys Glu Lys val Ser A.1 ci.
20 25 30
Leu Lys Olu.
3 5
<210> 3 <211> 35 <212> PRT ' <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Peptyd tworzący zwój
PL 217 626 B1 <4 00> 3
Glu VeŁl Glu Ala Leu Gin Lys Glu Val Ser Ala Leu Glu Lys Glu ^/3-1
1 5 10 15
Ser Α.Χ o. Kult ^5? U Glu cys Glu Val Ser Ala Leu Glu Lys Glu Val Glu Ala
20 5 3 0
Leu Gin Lys 35 <210> 4 <211> 35 < 212 > PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> eptyd tworzący swój <400 > 4
Lys val Glu Ala LCU Lys Lys Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val
1 5 10 15
Se r Al a Lsu Lys Cys Lys Val Ser Al a Leu Lys Glu Ly^ 53 Val Glu 7\.l et.
2 0 25 3 0
Leu Lys Lys 35 <21O> 5 <211> 7 <212 > PET <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223 > Peptyd tworzący K- zwój <4OO> 5
Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu 1 5 <21O> 6 c 211 > 7 <212> PRT <213=- Sekwencja sztuczna <22O>
<2 2 3=- Peptyd tworzący E- zwój <400> £>
Glu Val Ser Ala Leu Glu Lys 1 5 <210> 7 <211> 840 <212> PRT .:7.1. i? Cnnaval.ia ensiformis <400> 7
Met Lyg Leu Ser Pro Arg Glu Val 1 5
Gly Tyr Leu Ala Gin Lys Arg Leu
0
Tłir Glu Ala Val Ala Leu Ile Ala
Glu Lys Leu Gly Leu His Asn Ala
Ala
5
Ser
Arg Gly Val Arg Leu Asn Tyr
Gin Ile Met Glu Tyr Ala Arg
PL 217 626 B1
40 45
Asp Gly 50 Glu Lys Thr Val Al a 55 Gin Leu Met Cys Leu SO Gly Gin Hi s Leu
ί Gly Arg Arg Gin Val Leu Pro Al a Val Pro Hi s Leu Leu Asn Al a
65 70 75 80
Val Gin Val Glu Ala Thr Phe Pro Asp Gly Thr Lys Leu val Thr Val
85 90 95
His As p Pro Ile Ser Arg Glu Asn Gly Glu Leu Gin Glu Ala Leu Phe
100 105 110
Gly Ser Leu. Leu Pro Val Pro Ser Leu Asp Lys Phe Al a Glu Thr Lys
1.1 5 120 12 5
Glu Asp As n Arg Ile Pro Gly Glu Ile Leu cys Glu Asp Glu Cys Leu
130 135 140
Thr Leu As n Tle Gly Arg Lys Ala Val Ile Leu Lys V a 1 Thr Ser Lys
145 150 155 |«V ± O V
Gly Asp Arg Pro Ile Gin Val Gly Ser His Tyr His Phe Ile Glu Val
165 170 175
Αεη Pro Tyr Le u Thr Phe Asp Arg Arg Lys Ala Tyr Gly Met Arg Leu
180 185 19 0
Asn Ile A i a Ala Gly Thr Ala Val Arg Phe Glu Pro Gly Asp Cys Lys
195 SCO 2 05 -
Ser Val Thr Leu Val Ser Tle Glu Gly Asn Lys Val Tle Arg Gly Gly
210 2 15 220
Asn Ala Tle Al a Asp Gly Pro Val Asn. Glu Thr Asn Leu Glu. Ala Al a
2 2 5 230 2 35 24 0
Met His Ala Val Arg Ser iiys Gly Phe Gly His Glu Glu Glu Lys Asp
24 5 250 255
Al a Ser Glu Gly Phe Ttir Lys Glu Asp Pro Asn Cys Pro Phe Asn Thr
260 265 2 7 0
Phe Ile His Arg Lys Glu Tyr Ala Asn Ly s Tyr Gly Pro Thr Thr Gly
275 2 8 0 2 65
Asp Lys Tle Arg Leu οχ·γ· Asp Thr Asn T ίΑΊ 1 Leu Ala Glu Ile Glu Lys
290 295 300
Asp Tyr Ala Leu Tyr Gly Asp GI u Cys Val Phe Gly Gly Gly Lys V3 i
305 3 10 3X5 320
Ile Arg Asp Gly Met Gly Gin. Ser Cys Gly Hi s Pro PrO Ala Ile łCj /*— Tz— 4*.
3 2 5 33 0 335
Leu Asp Thr. Val Ile Thr Asn Ala Val ile Ile Asp Tyr Thr Gly ile
34 0 345 350
Ile Lys Ala Αήρ· .i. 1. Gly I le Ly es Asp Gly Leu Tle Ala Ser Σίβ Gly
355 360 3 65
Łys Ala Gly Asn Pro .Ą.iSJP1 Ile Met Asn G ly Val Phe Ser Asn Met Ile
PL 217 626 B1
7 0
Ile Jiy Ala. Asn Thr 3 8 5
Ala Gly Ala Ile Asp 405
Tyr Glu Ala Ile Ser 420
Gly Pro Ala Ala Gly 435
Gin Met Arg Leu Met
50
Gly Phe Thr Gly Lys 465
Ile Ile Lys Ala Gly 4 85
Ser Thr Pro Ala Ala
0 0
Asp Ile Gin Ile Asn 515
Val Glu His Ser Ile 530
His Ser Glu Gly Ala 5 4 5
Cys Gly Ile Lys Asn 565
Leu Thr Ser Asn Thr © O
His His Leu Asp Arg 595
Arg ile Arg Lys Łys 610
Gly Ala Ile Ser Ile 62 5
Gly Glu Val Ile Ser 6 4 5
Gin Thr Gly Pro Leu 660
Ile Arg Arg Tyr Ile 675
Gly Phe Ser Gin Tyr 690
Len Val Met Trp Lys
375
Glu Val Ile Ala Gly 390
Cys His Val His Tyr 410
Ser Gly Ile Thr Thr 425
Thr Arg Ala Thr Thr 440
Leu Gin Ser Thr Asp
4r et o c>
Gly Ser Ser Ser Lys 4 7 0
Ala Met Gly Leu Lys 4 90
Ile Asp Asn Cys Leu 505
Ile His Thr Asp Thr 520
Ala Ala Phe Lys Gly 53 5
Gly Gly Gly His Ala 550
Val Leu Pro Ser Ser
0
Ile Asp Glu His Leu 535
Glu Ile Pro Glu Asp 600
Thr Ile Ala Ala Glu
615
Ile Ser Ser Asp Ser 63 0
Arg Thr Trp Gin. Thr 6 5 0
Lys Cys Asp Ser Ser ggg
Ala Lys Tyr Thr Ile 680
Val Gly Ser Vai Si. 695
Pro Ser Phe Phe Gly
Glu
95
Ile
Leu
Cys
Asp
Pro
75
Leu.
Thr
Leu
Arg
Pro
5 5
Thr
Asp
Asp
Gin
63S
Ala
Asp
Asn
Val
Thr
380
Gly
Cys val
Leu
460
Asp
Hi s
Tle
Asn
Thr
0
Asp
Asn
Met
Ala
Va 1
Ala
Asp
Asn
Pro
Gly
700
Lys
Leu
Pro
Gly
4 S
Pro
Glu
G1, u
Al a
Glu
Ile
Ile
Pro
Leu
Phe
0 5
Leu
Met
Lys
Asp
Al a
6S5
Lys
Pro
Ile
Gin
Gly
430
Ser
T if·1^ Ί
Leu
Asp
Glu
510
Ala
Hi s
Ile
Thr
Met
9 0
Ala
Asn
Gly
Met
670
Ile
Leu
Glu.
Val
Leu
15 Gly
Pro
Asn
His
Trp
495
His
Gly
Thr
Lys
Arg
575
Val
His
Asp
Arg
Lys 6 5 5
Al a
Ala
Met
Thr
400
Val
Thr
Τ’ łnxr
Phe
Glu
8 0 Gly
His
Phe
Tyr
Va 1 fc> u
Pro
Cys e r
Ile
Val
0
Ala
Arg
Asn
Asp
Val
PL 217 626 B1
705 710 715 720
Ile Lys Gly Gly Met Val Al a Trp Ala Asp Ile Gly Asp Pro Asn Ala
725 730 735
Ser Ile Pro Thr Pro Glu Pro Val Lys Met Arg Pro Met Tyr Gly Thr
740 745 750
Leu Gly Lys Ala Gly Gly Ala Leu Ser Ile Ala Phe val Ser Lys Ala
755 760 765
Ala Leu Asp Gin Arg Val Asn Val Leu Tyr Gly Leu Asn Lys Arg Val
770 775 780
Glu Ala Val Ser Asn Val Arg Lys Leu Thr Lys Leu Asp Met Lys Leu
785 790 795 800
Asn Asp Ala Leu. Pro Glu Ile Thr Val Asp Pro Glu Ser Tyr Thr Val
805 810 815
Lys Ala Asp Gly Lys Leu Leu Cys Val Ser Glu Al a Thr Thr Val Pro
820 825 830
Ser Arg Asn Tyr Phe Leu Phe
835 84 0
PL 217 626 B1

Claims (7)

1. Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu raka znamienna tym, że zawiera ureazę ugrupowanie naprowadzające, sprzężone z ureazą, wybrane z grupy składającej się z przeciwciała przeciwko antygenowi przed wrakowemu, przeciwciała anty-hCG i Iigandu zdolnego do specyficznego wiązania z receptorami powierzchniowymi komórek raka, przy czym to ugrupowanie naprowadzające poprawia dostarczanie enzymu do komórki rakowej po podaniu kompozycji pacjentowi; oraz nośnik farmaceutyczny.
2. Kompozycja do zastosowania według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera białko fuzyjne ugrupowania naprowadzającego i ureazy.
3. Kompozycja do zastosowania według zastrz. 1, znamienna tym, że ureaza jest ureazą roślinną lub bakteryjną.
4. Kompozycja do zastosowania według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera również słabo zasadowy środek przeciwnowotworowy, którego skuteczność jest obniżona przez wyższy wewnątrzkomórkowy/niższy zewnątrzkomórkowy gradient pH w guzie litym.
5. Kompozycja do zastosowania według zastrz. 4, znamienna tym, że środek przeciwnowotworowy jest wybrany z grupy złożonej z doksorubicyny, daunorubicyny, mitoksantronu, epirubicyny, mitomycyny, bleomycyny, alkaloidów Vinca takich, jak winblastyna i winkrystyna, środków alkilujących takich jak cyklofosfamid i chlorowodorek mechloroetaminy i przeciwnowotworowych pochodnych puryny i pirymidyny.
6. Kompozycja do zastosowania według zastrz. 1, znamienna tym, że przeznaczona jest do leczenia guza litego u ssaka leczonego przeciwnowotworowym związkiem słabo zasadowym, którego efektywność jest obniżona przez niższy wewnątrzkomórkowy/ wyższy zewnątrzkomórkowy gradient pH w guzie litym.
7. Kompozycja do zastosowania według zastrz. 6, znamienna tym, że przeciwnowotworowy związek jest wybrany z grupy złożonej z doksorubicyny, daunorubicyny, mitoksantronu, epirubicyny, mitomycyny, bleomicyny, alkaloidów Vinca takich jak winblastyna i winkrystyna, środków alkilujących takich jak cyklofosfamid i chlorowodorek mechloroetaminy oraz przeciwnowotworowych pochodnych puryny i pirymidyny.
PL374675A 2002-07-18 2003-07-16 Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu raka PL217626B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US39724402P 2002-07-18 2002-07-18

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL374675A1 PL374675A1 (pl) 2005-10-31
PL217626B1 true PL217626B1 (pl) 2014-08-29

Family

ID=30771022

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL374675A PL217626B1 (pl) 2002-07-18 2003-07-16 Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu raka

Country Status (23)

Country Link
US (1) US7211250B2 (pl)
EP (2) EP2324846B1 (pl)
JP (4) JP2006501196A (pl)
KR (2) KR20050038005A (pl)
CN (1) CN100577203C (pl)
AU (1) AU2003250658B2 (pl)
BR (1) BR0312664A (pl)
CA (1) CA2492472C (pl)
DK (1) DK1530482T3 (pl)
ES (1) ES2443416T3 (pl)
HK (2) HK1076739A1 (pl)
IL (1) IL166249A (pl)
MX (1) MXPA05000778A (pl)
NO (1) NO336811B1 (pl)
NZ (1) NZ538284A (pl)
PL (1) PL217626B1 (pl)
PT (1) PT1530482E (pl)
RU (1) RU2326691C2 (pl)
SI (1) SI1530482T1 (pl)
TR (1) TR200500108T2 (pl)
UA (1) UA81634C2 (pl)
WO (1) WO2004009112A1 (pl)
ZA (1) ZA200500423B (pl)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7264800B2 (en) * 2002-07-18 2007-09-04 Helix Biopharma Corporation Method and composition for inhibiting cancer cell growth
WO2004023981A2 (en) * 2002-09-11 2004-03-25 Duke University Methods and compositions for blood pool identification, drug distribution quantification and drug release verification
US7769423B2 (en) * 2002-09-11 2010-08-03 Duke University MRI imageable liposomes for the evaluation of treatment efficacy, thermal distribution, and demonstration of dose painting
US20070104732A1 (en) * 2003-10-24 2007-05-10 Bernard Massie Ligand-pseudoreceptor system for generation of adenoviral vectors with altered tropism
IL182956A0 (en) * 2007-05-03 2008-01-20 Yeda Res & Dev Glycan modified soluble receptors and binding proteins and their use
US8892184B2 (en) 2010-10-18 2014-11-18 Siemens Medical Solutions Usa, Inc. Systems and methods for reducing interference in a dual modality imaging system
EP2984170A4 (en) * 2013-04-08 2016-11-30 Helix Biopharma Corp USE OF ANTIBODY UREASE CONJUGATES FOR DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC PURPOSES
KR102318994B1 (ko) * 2015-01-23 2021-10-29 헬릭스 바이오파마 코포레이션 치료학적 목적을 위한 항체-우레아제 접합체
CN110022891A (zh) 2016-09-24 2019-07-16 赫利克斯生物药品公司 恢复肿瘤酸化t细胞的功能
CN110382551A (zh) * 2017-01-05 2019-10-25 赫利克斯生物药品公司 抗vegfr-2脲酶缀合物
WO2021235436A1 (ja) * 2020-05-20 2021-11-25 株式会社メドレックス アポモルヒネ含有経皮吸収型製剤
MX2022015897A (es) * 2020-06-15 2023-01-24 Kortuc Inc Sensibilizador para el tratamiento del cancer.
CN113433087A (zh) * 2021-06-22 2021-09-24 中南大学 一种尿素浓度快速检测方法及检测传感器和应用

Family Cites Families (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4329332A (en) 1978-07-19 1982-05-11 Patrick Couvreur Biodegradable submicroscopic particles containing a biologically active substance and compositions containing them
US4489055A (en) 1978-07-19 1984-12-18 N.V. Sopar S.A. Process for preparing biodegradable submicroscopic particles containing a biologically active substance and their use
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
FR2504010B1 (fr) 1981-04-15 1985-10-25 Sanofi Sa Medicaments anticancereux contenant la chaine a de la ricine associee a un anticorps antimelanome et procede pour leur preparation
FR2504408B1 (fr) 1981-04-24 1986-02-14 Couvreur Patrick Procede de preparation de particules submicroscopiques, particules ainsi obtenues et compositions pharmaceutiques les contenant
US4671958A (en) 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
EP0092227B1 (en) 1982-04-19 1988-07-27 Nissan Motor Co., Ltd. Method for controlling reduction ratio of continuously variable transmission with acceleration compensation
US4824783A (en) 1983-12-20 1989-04-25 Enichem S.P.A. Oxidized sulfur derivatives of diaminophosphinyl compounds as urease inhibitors
US4545985A (en) 1984-01-26 1985-10-08 The United States Of America As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Pseudomonas exotoxin conjugate immunotoxins
US4894443A (en) 1984-02-08 1990-01-16 Cetus Corporation Toxin conjugates
US4625014A (en) 1984-07-10 1986-11-25 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Cell-delivery agent
US4542225A (en) 1984-08-29 1985-09-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Acid-cleavable compound
US4659839A (en) 1984-10-10 1987-04-21 Mallinckrodt, Inc. Coupling agents for radiolabeled antibody fragments
ATE66469T1 (de) 1985-01-14 1991-09-15 Neorx Corp Metall-radionuklid markiertes protein fuer diagnose und therapie.
US4837380A (en) * 1985-09-30 1989-06-06 Regents Of University Of California Liposome-calcitonin preparation
US4699784A (en) 1986-02-25 1987-10-13 Center For Molecular Medicine & Immunology Tumoricidal methotrexate-antibody conjugate
US4680333A (en) 1986-04-14 1987-07-14 National Starch And Chemical Corporation Removable hot melt pressure sensitive adhesive
US4867962A (en) 1988-02-26 1989-09-19 Neorx Corporation Functionally specific antibodies
CA1340323C (en) 1988-09-20 1999-01-19 Arnold E. Hampel Rna catalyst for cleaving specific rna sequences
FR2637612B1 (fr) 1988-10-06 1993-09-10 Pasteur Institut Sequences de nucleotides codant pour une proteine a activite ureasique
EP0460607A3 (en) * 1990-06-05 1992-04-01 Bristol-Myers Squibb Company Novel monoclonal antibody to novel antigen associated with human tumors
US5298399A (en) 1990-08-10 1994-03-29 Sapporo Breweries Limited Gene and process for producing a thermostable urease
US5140100A (en) 1990-12-28 1992-08-18 Cedars-Sinai Medical Center Protein that inhibits production of human choriogonadotropin
FR2683159B1 (fr) 1991-10-31 1994-02-25 Coletica Procede de fabrication de nanocapsules a paroi a base de proteines reticulees; nanocapsules ainsi obtenues et compositions cosmetiques, pharmaceutiques et alimentaires en comportant application.
US5573934A (en) * 1992-04-20 1996-11-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Gels for encapsulation of biological materials
AU3940293A (en) * 1992-04-03 1993-11-08 Alexander T. YOUNG Gene therapy using targeted viral vectors
US5976535A (en) 1992-06-09 1999-11-02 Neorx Corporation Pretargeting protocols for the enhanced localization of cytotoxins to target sites and cytotoxic combinations useful therefore
US6358490B2 (en) 1992-06-09 2002-03-19 Neorx Corporation Three-step pretargeting methods and compounds
US6290962B1 (en) * 1992-11-03 2001-09-18 Oravax, Inc. Urease-based vaccine and treatment for helicobacter infection
GB9300875D0 (en) 1993-01-18 1993-03-10 Ucb Sa Nanocapsule containing pharmaceutical compositions
CA2151742C (en) 1993-02-22 1999-05-25 Alfred A. Amkraut Compositions for oral delivery of active agents
JPH08509873A (ja) * 1993-05-19 1996-10-22 アンスティテュ・パストゥール ヘリコバクター感染に対する免疫組成物、該組成物に用いられるポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードする核酸配列
WO1995031480A1 (en) * 1994-05-18 1995-11-23 S.P.I. Synthetic Peptides Incorporated Heterodimer polypeptide immunogen carrier composition and method
GB9417873D0 (en) 1994-09-06 1994-10-26 Sandoz Ltd Organic compounds
US6172045B1 (en) 1994-12-07 2001-01-09 Neorx Corporation Cluster clearing agents
US5886143A (en) 1994-12-07 1999-03-23 Neorx Corporation Hepatic-directed compounds and reagents for preparation thereof
FR2732605B1 (fr) * 1995-04-07 1997-05-16 Pasteur Merieux Serums Vacc Composition destinee a l'induction d'une reponse immunitaire mucosale
JPH11511979A (ja) * 1995-09-06 1999-10-19 ババリアン・ノルディック・リサーチ・インスティテュート・アクティーゼルスカブ ヒト乳癌細胞を含むヒト乳腺細胞を標的として、連結された異種性遺伝子を発現させるためのｗａｐまたはｍｍｔｖ制御配列の使用
US6149904A (en) 1996-01-31 2000-11-21 The Regents Of The University Of California Method for inhibiting tumor cell growth by administering to tumor cells expressing a nucleic acid encoding a connexin and a pro-drug
CA2250222A1 (en) 1996-03-20 1997-09-25 Mien-Chie Hung Sensitization of her-2/neu overexpressing cancer cells to chemotherapy
JPH1017492A (ja) * 1996-07-02 1998-01-20 Fuji Yakuhin Kogyo Kk 腫瘍細胞増殖抑制剤
US5958892A (en) 1996-07-30 1999-09-28 Board Of Regents, The University Of Texas System 2-methoxyestradiol-induced apoptosis in cancer cells
US5750496A (en) * 1996-08-12 1998-05-12 Utah State University Method of controlling cryptosporidium infectons using protease inhibitors
EP0824019B1 (en) * 1996-08-13 2002-11-20 Quest International B.V. Inhibition or reduction of oral malodour
EP0932390A1 (en) 1996-10-11 1999-08-04 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic liposome composition and method
US6261537B1 (en) 1996-10-28 2001-07-17 Nycomed Imaging As Diagnostic/therapeutic agents having microbubbles coupled to one or more vectors
CN1181422A (zh) * 1996-10-31 1998-05-13 上海市肿瘤研究所 与生长因子受体结合的多肽所构建的基因转移载体
US6180114B1 (en) 1996-11-21 2001-01-30 University Of Washington Therapeutic delivery using compounds self-assembled into high axial ratio microstructures
US6045774A (en) 1997-01-10 2000-04-04 Epicyte Pharmaceutical Inc. J chain polypeptide targeting molecule linked to an imaging agent
GB9703633D0 (en) 1997-02-21 1997-04-09 Imp Cancer Res Tech Cancer therapy
US6190923B1 (en) 1997-09-05 2001-02-20 David K. Johnson Diethylenetriamine-N,N′,N″-triacetic acid derivatives
FR2772025B1 (fr) 1997-12-10 2000-03-03 Guerbet Sa Chelates metalliques de macrocycles polyaminocarboxyliques et leur application a l'imagerie par resonance magnetique
US6426086B1 (en) * 1998-02-03 2002-07-30 The Regents Of The University Of California pH-sensitive, serum-stable liposomes
EP1122262B1 (en) * 1998-10-16 2009-12-30 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Neovascular-specific peptides
FR2790405B1 (fr) 1999-03-02 2001-04-20 Oreal Nanocapsules a base de polymeres dendritiques
US6300141B1 (en) 1999-03-02 2001-10-09 Helix Biopharma Corporation Card-based biosensor device
US6159443A (en) 1999-04-29 2000-12-12 Vanderbilt University X-ray guided drug delivery
CH694589A5 (de) 1999-06-25 2005-04-15 Genentech Inc Humanisierte Anti-ErbB2-Antikörper und Behandlung mit Anti-ErbB2-Antikörpern.
US6307372B1 (en) 1999-11-02 2001-10-23 Glaxo Wellcome, Inc. Methods for high throughput chemical screening using magnetic resonance imaging
WO2001037721A2 (en) 1999-11-22 2001-05-31 The Research Foundation Of State University Of New York Magnetic nanoparticles for selective therapy
US20020041898A1 (en) 2000-01-05 2002-04-11 Unger Evan C. Novel targeted delivery systems for bioactive agents
WO2002015925A1 (fr) * 2000-08-22 2002-02-28 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Technique de regulation de l'apoptose et polypeptide de regulation d'apoptose
US7148038B2 (en) * 2001-10-16 2006-12-12 Raven Biotechnologies, Inc. Antibodies that bind to cancer-associated antigen CD46 and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
EP2324846B1 (en) 2014-11-12
AU2003250658A1 (en) 2004-02-09
US7211250B2 (en) 2007-05-01
KR20050038005A (ko) 2005-04-25
EP2324846A1 (en) 2011-05-25
HK1158103A1 (en) 2012-07-13
IL166249A (en) 2011-10-31
NZ538284A (en) 2008-04-30
KR20110123786A (ko) 2011-11-15
JP2011207913A (ja) 2011-10-20
BR0312664A (pt) 2005-05-03
EP1530482B9 (en) 2014-04-16
CA2492472A1 (en) 2004-01-29
EP1530482B1 (en) 2013-10-23
WO2004009112A8 (en) 2005-09-15
SI1530482T1 (sl) 2014-03-31
RU2326691C2 (ru) 2008-06-20
PL374675A1 (pl) 2005-10-31
ES2443416T3 (es) 2014-02-19
RU2005104113A (ru) 2005-09-10
NO336811B1 (no) 2015-11-02
IL166249A0 (en) 2006-01-15
TR200500108T2 (tr) 2005-04-21
NO20050793L (no) 2005-04-18
JP2006501196A (ja) 2006-01-12
MXPA05000778A (es) 2005-08-29
PT1530482E (pt) 2014-01-15
EP1530482A1 (en) 2005-05-18
HK1076739A1 (en) 2006-01-27
KR101352826B1 (ko) 2014-01-17
DK1530482T3 (da) 2014-01-20
JP2013213055A (ja) 2013-10-17
JP5850561B2 (ja) 2016-02-03
JP2016014066A (ja) 2016-01-28
WO2004009112A1 (en) 2004-01-29
ZA200500423B (en) 2006-08-30
CN100577203C (zh) 2010-01-06
US20040115186A1 (en) 2004-06-17
AU2003250658B2 (en) 2009-07-16
CA2492472C (en) 2014-01-07
UA81634C2 (ru) 2008-01-25
CN1681528A (zh) 2005-10-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5850561B2 (ja) 癌細胞増殖を阻害するためのウレアーゼの使用
Kuthati et al. Functionalization of mesoporous silica nanoparticles for targeting, biocompatibility, combined cancer therapies and theragnosis
US11931422B2 (en) Antibody-urease conjugates for therapeutic purposes
US11643662B2 (en) Targeted protease compositions and uses related thereto
US6638508B2 (en) Modified avidin-type molecules as targeting agents for the liver and cells of the reticuloendothelial system
Huang et al. Tumor protease-activated theranostic nanoparticles for MRI-guided glioblastoma therapy
US7264800B2 (en) Method and composition for inhibiting cancer cell growth
Joshi et al. Transferrin Receptor and Targeting Strategies
CA2493282A1 (en) Method and composition for inhibiting cancer cell growth using urease and weakly basic anti-cancer compounds