JP2013213055A - 癌細胞増殖を阻害するためのウレアーゼの使用 - Google Patents

癌細胞増殖を阻害するためのウレアーゼの使用 Download PDF

Info

Publication number
JP2013213055A
JP2013213055A JP2013147555A JP2013147555A JP2013213055A JP 2013213055 A JP2013213055 A JP 2013213055A JP 2013147555 A JP2013147555 A JP 2013147555A JP 2013147555 A JP2013147555 A JP 2013147555A JP 2013213055 A JP2013213055 A JP 2013213055A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
urease
tumor
cells
cell
active agent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2013147555A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2013213055A5 (ja
Inventor
Heman Chao
チャオ ヘマン
Wah Wong
ウォン ワー
Donald Segal
シーガル ドナルド
Jerry Mcelroy
マックエルロイ ジェリー
John Docherty
ドッチャーティー ジョン
Jodi Dickstein
ディックステイン ジョディ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Helix Biopharma Corp
Original Assignee
Helix Biopharma Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Helix Biopharma Corp filed Critical Helix Biopharma Corp
Publication of JP2013213055A publication Critical patent/JP2013213055A/ja
Publication of JP2013213055A5 publication Critical patent/JP2013213055A5/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/50—Hydrolases (3) acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5), e.g. asparaginase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/66—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid the modifying agent being a pre-targeting system involving a peptide or protein for targeting specific cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6891—Pre-targeting systems involving an antibody for targeting specific cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

【課題】哺乳動物被験体における癌細胞の増殖を阻害するのに用いる薬学的組成物および方法を提供すること。
【解決手段】この組成物は、酵素ウレアーゼおよびそれらの関連物、この組成物が被験体に投与される場合にこの酵素の癌細胞への送達を増強させるのに有効な化学実体を含有する。弱塩基性の抗腫瘍化合物の有効性を増加させる方法、被験体内の固形腫瘍の存在、サイズ、もしくは状態を評価する方法、および被験体内の癌を処置するための遺伝子治療組成物も、また開示される。
【選択図】なし

Description

（関連出願の引用）
本出願は、米国仮特許出願第６０／３９７，２４４号（２００２年７月１８日出願）の優先権を主張し、その開示内容は、あらゆる目的のために、その全体が本明細書中において参考として援用される。
（本発明の分野）
本発明は、ウレアーゼタンパク質および抗ウレアーゼポリペプチドを利用する癌治療法に関する。
（本発明の背景）
癌は、米国の総死亡率の１／５を占め、そして死亡の２番目の主な原因である。癌は代表的に、細胞集団の制御されない分裂によって特徴付けられる。この制御されない分裂は、血液細胞（例えば、種々の型のリンパ腫）、または特定の組織もしくは器官（例えば、固形腫瘍）に凝集するかもしくは、それらを源とする細胞（例えば、胸部、肝臓、食堂、胃、腸、脳、骨、もしくは前立腺の、続発性もしくは原発性腫瘍のような、固形腫瘍）に関する。
種々の処置様式が、癌治療のために提唱されている。これらとしては、一般的には、固形腫瘍の外科的切除、Ｘ線のような放射線による処置、化学療法、免疫治療、および遺伝子治療が挙げられる。所定の癌によって選択される治療の型は、患者の年齢、癌の局在の程度、および癌の型および病期のような因子に依存する。しばしば、この治療は、２つ以上の様式の組み合わせ（例えば、化学療法と組み合わせるＸ線治療、もしくは化学療法と組み合わせる免疫治療）を含む。
多くの化学療法用化合物および化学療法用組成物および戦略が、癌を治療するのに利用されている。多くの抗腫瘍性（ａｎｔｒｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ）の化合物が、迅速に分裂する細胞の複製を妨害するため、もしくは活発に増殖する細胞における重要な代謝の連鎖を阻害するために設計される。このようなアプローチは、ある型の癌、もしくはある病期の癌では成功のレベルに達したが、化学療法は、一般に、消耗性の副作用（例えば、倦怠感、悪心、食欲不振、脱毛、および貧血）という不快に伴われる。さらに、細胞複製のレベルに作用する化合物は、分裂細胞へヌクレオチドアナログを導入することによって、もしくは通常の複製を阻害することによって、被験体の通常細胞へ広範な遺伝子突然変異を導入する効力を有する。加えて、癌細胞は、多くの型の抗腫瘍剤への抵抗性を、細胞へのこの薬剤の取り込みを制限することによってか、もしくは細胞内でのこの薬剤の代謝を変化させることによって、発生し得る。
これらの制限に対して、その副作用を減少させるように化学療法剤を改変する試み、抵抗性の問題を克服する試み、もしくは選択される腫瘍部位へのそれら標的化を改善する試みが、展開されてきた。これらの努力がいくつかの場合で治療結果の改善をもたらした一方で、化学療法用薬剤および方法の改善を提供することへの必要性が依然として残っている。特に、このような薬剤は、癌細胞の増殖を止めるかもしくは阻害するのに有効であるべきであり、処置される被験体の遺伝的統合性に対する副作用および長期作用の両方に関して、比較的無毒性であるべきであり、そして好ましくは、腫瘍内への直接導入を可能にするかもしくは腫瘍に対して選択的に標的化することが可能である形態で、送達可能である。
（発明の要旨）
本発明は、哺乳動物被験体における癌細胞の増殖を阻害するのに用いる薬学的組成物を提供する。この組成物は、酵素ウレアーゼ（例えば、細菌性ウレアーゼおよび植物ウレアーゼ）、およびウレアーゼに関連する、この組成物が被験体に投与される場合にこの酵素の癌細胞への送達を増強する化学実体を含有する。
１つの実施形態において、この化学実体は、血液循環時間を延長するのに、もしくは組成物のネイティブなウレアーゼに対する抗原性を減少させるのに有効な量のウレアーゼと結合体化される親水性ポリマーを含有する。このポリマーは、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｏｘａｚｏｌｉｎｅ）、ポリアスパルタミド、もしくは親水性セルロース誘導体であり得る。このポリマーは、好ましくは、約１，０００〜１０，０００ダルトンの分子量を有する直鎖ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール直鎖）である。
この化学実体は、ウレアーゼに結合される標的化部分（例えば、抗腫瘍抗原抗体、抗ｈＣＧ抗体、および癌細胞表面レセプターに特異的に結合し得るリガンド）であり得る。この標的化部分がポリペプチドである場合、この組成物は、この標的化部分と酵素ウレアーゼとの融合タンパク質であり得る。あるいはここで、このウレアーゼは、そのＣ末端もしくはそのＮ末端に第一のコイル形成ペプチドを含み得、ここで、この第一のコイル形成ペプチドは、選択された電荷によって、および第二の逆に荷電したコイル形成ペプチドと相互作用して安定したαへリックス状コイルドコイルヘテロ二量体を形成する能力によって、特徴付けられ；そしてこの化学実体は、この第二のコイル形成ペプチドを含む標的化部分を含有し得る。
この化学実体は、取り込まれた形態で酵素ウレアーゼを有する小胞を含有し得る。例示的な小胞としては、リポソーム（これは、上記組成物が静脈内に投与される場合、ポリエチレングリコール鎖の外部被覆によって長期循環し続け、かつ腫瘍領域に溢出する大きさである）、および表面結合標的化部分を有するリポソームが挙げられる。この小胞は、さらなる薬剤（例えば、尿素、薬学的に活性な抗腫瘍剤、もしくは画像化剤）を含み得る。
この化学実体は、上記酵素の活性を阻害するのに十分な量の、ウレアーゼインヒビターおよびその関連物質を含有し得る。
別の局面において、本発明は、哺乳動物被験体における癌細胞の増殖を阻害するための方法を含む。この方法は、細胞を、癌細胞の増殖を阻害するのに有効な量のウレアーゼに曝露する工程を包含する。
癌細胞が固形腫瘍を含む場合、ウレアーゼは被験体の腫瘍内に直接注入され得るか、もしくは非経口投与（例えば、直接投与以外の注入）によって注入され得る。薬学的に受容可能なキャリア内のウレアーゼに加えて、上記のウレアーゼを含有する種々の組成物が、本発明における使用に適する。
この方法はまた、癌細胞におけるウレアーゼの活性を、この癌細胞におけるウレアーゼの活性を減少させるのに有効な量のウレアーゼインヒビターを被験体に投与することによって、調節（ｍｏｄｕｌａｔｅ）すること含み得る。ウレアーゼ活性は、ウレアーゼ投与前、投与中、もしくは投与後に、被験体へ尿素を投与することによって、逆方向へ調節（ｍｏｄｕｌａｔｅ）され得る。
ウレアーゼは、二段階：腫瘍標的化部分と、第一の結合部分（第二の結合部分と相互作用する能力を有する）との結合に関与する第一の段階；および、ウレアーゼと結合される第二の結合部分を含む第二の結合に関与する第二の段階、で投与され得る。
さらに別の実施形態において、この方法は、遺伝子治療組成物を被験体に投与する工程を包含する。この遺伝子治療組成物は、その被験体に投与される場合に、癌細胞を選択的にトランスフェクトするのに有効な標的化ベクター、およびこのベクター中に保有された、トランスフェクトされた癌細胞中でウレアーゼｍＲＮＡを生成するのに有効な組み換え核酸配列を含む。例示的なベクターは、アデノウイルスである。例示的な核酸配列は、ウレアーゼ、およびこのトランスフェクトされた癌細胞からのウレアーゼの分泌を促進するのに有効な、分泌性リーダー配列をコードする。
関連する局面において、本発明は、腫瘍処置用の薬剤を受ける被験体において、弱塩基性の抗腫瘍化合物（その有効性は、固形腫瘍における、細胞内でより高く／細胞外でより低いｐＨ勾配によって減少される）の治療効果を増強する方法を提供する。この方法は、固形腫瘍における、細胞内でより高く／細胞外でより低いｐＨ勾配を減少させるか、もしくは逆転させるのに有効な量のウレアーゼを、被験体に投与する工程を包含する。好ましくは、投与されるウレアーゼの量は、腫瘍の細胞外液を、少なくともｐＨ７．２に上昇させるのに有効である。このウレアーゼは、腫瘍に直接注入され得るか、もしくは上記のような、直接投与以外の非経口投与によって注入され得る。
抗腫瘍化合物が、例えば、ドキソルビシンン、ダウノルビシン、ミトキサントロン、エピルビシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチンおよびビンクリスチンのようなビンカアルカロイド、シクロフォスファミドおよび塩酸メクロレタミンのようなアルキル化剤、ならびに抗腫瘍性の（ａｎｔｒｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ）プリン誘導体もしくはピリミジン誘導体であり得る。
さらに別の局面において、本発明は、被験体内の固形腫瘍の存在、サイズ、もしくは状態を評価するのに有用である。ここで、ウレアーゼは、被験体中の固形腫瘍にウレアーゼを局在化させるのに有効な条件下で、固形腫瘍を有するか、もしくは固形腫瘍を有すると疑われる被験体に投与される。被験体は、次いで、ｐＨ感受性のレポーターの存在下もしくは非存在下のいずれかで、細胞外ｐＨの上昇を示す被験体内の組織領域を同定するために、被験体組織中の細胞外ｐＨの変化を検出し得る診断手段（例えば、Ｘ線透視検査、ＭＲＩ、陽電子断層撮影法）にかけられる。
この方法は、上記の処置方法と組み合わせて使用されてウレアーゼの投与もしくは処置の範囲および／または有効性を評価し得る。したがって、例えば、被験体へのウレアーゼの投与において、腫瘍領域におけるｐＨ変化の範囲および程度が追跡されてウレアーゼ投与を指導し得るか、または腫瘍サイズの変化、もしくは処置中の範囲を評価し得る。
哺乳動物被験体における癌細胞の増殖を阻害するのに用いるキットがまた、開示される。このキットは、酵素ウレアーゼを含有する薬学的組成物、および、被験体の癌を処置するために、被験体へのこの組成物の投与を教える使用説明資料を有する。
この使用説明資料は、ウレアーゼ組成物を被験体に、腫瘍のサイズに依存し、かつ以下のような：この組成物が腫瘍に直接注入される場合は、０．１〜１００国際単位（好ましくは０．５〜１０ウレアーゼ活性／ｍｍ３腫瘍）、そしてこの組成物が被験体に非経口的に（腫瘍への直接注入による以外で）投与される場合は、１００〜１００，０００国際単位／ｋｇ（好ましくは５００〜１０，０００国際単位／ｋｇウレアーゼ活性国際単位／ｋｇ被験体体重）、量で投与する方法を教示し得る。
この使用説明資料は、ウレアーゼ組成物を、弱塩基性の抗腫瘍化合物（この有効性は、固形腫瘍における、細胞内でより高く／細胞外でより低いｐＨ勾配によって減少される）を受けている被験体に、以下の量：固形腫瘍における、細胞内でより高く／細胞外でより低いｐＨ勾配を減少させるか、もしくは逆転させるのに有効な量、で投与する方法を教え得る。
この使用説明資料は、ウレアーゼ組成物を、固形腫瘍を有するか、もしくは有すると疑われる被験体に、被験体中の固形腫瘍にウレアーゼを局在化させるのに有効な条件下で投与する方法、この被験体を、被験体組織中の細胞外ｐＨの変化を検出し得る診断手段にかける方法、およびこの投与に続く細胞外ｐＨの上昇を示す、被験体内の組織領域を同定する方法、を教え得る。
哺乳動物被験体における癌細胞の増殖を阻害するのに用いる遺伝子治療組成物がまた、開示される。この組成物は、上記のように、被験体に投与される場合に、癌細胞を選択的にトランスフェクトするのに有効な標的化ベクターを含有し、かつトランスフェクトされた癌細胞中でウレアーゼｍＲＮＡを生成するのに有効な組み換え核酸配列を、このベクター中に保有している。
本発明の、これらのおよび他の目的ならびに特徴は、以下の本発明の詳細な説明が、図と組み合わせて読まれた場合、より十分に明白になる。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
哺乳動物被験体における癌細胞の増殖を阻害するのに用いる、薬学的キャリア中に酵素ウレアーゼを含有する薬学的組成物。
（項目２）
項目１に記載の組成物であって、該組成物が被験体に投与される場合に、前記酵素の癌
細胞への送達を増強させるのに有効な化学実体を含有する、組成物。
（項目３）
項目１に記載の組成物であって、前記化学実体が親水性ポリマーを含有し、該親水性ポ
リマーが、
（ｉ）前記ウレアーゼと結合体化され、
（ｉｉ）ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリアスパルタミド、および親水性セルロース誘導体からなる群から選択され、ならびに、
（ｉｉｉ）血液循環時間を延長させるのに有効な量、もしくは該組成物のネイティブなウレアーゼに対する抗原性を減少させるのに有効な量で存在する、
組成物。
（項目４）
前記親水性ポリマーが、約１，０００〜１０，０００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコールである、項目３に記載の組成物。
（項目５）
前記化学実体が、前記ウレアーゼに結合される標的化部分であり、かつ抗腫瘍抗原抗体、抗ｈＣＧ抗体、および癌細胞表面レセプターに特異的に結合し得るリガンドからなる群から選択される、項目２もしくは３に記載の組成物。
（項目６）
前記標的化部分がポリペプチドであり、かつ前記組成物が該標的化部分と酵素ウレアーゼとの融合タンパク質である、項目５に記載の組成物。
（項目７）
項目５に記載の組成物であって、前記ウレアーゼが、そのＣ末端もしくはそのＮ末端に
第一のコイル形成ペプチドを含み、ここで該第一のコイル形成ペプチドは、選択された電荷によって、および逆に荷電した第二のコイル形成ペプチドと相互作用して安定したαへリックス状コイルドコイルヘテロ二量体を形成する能力によって、特徴付けられ；そして前記化学実体が、該第二のコイル形成ペプチドを含む標的化部分を含有する、組成物。
（項目８）
前記化学実体が、取り込まれた形態で酵素ウレアーゼを有する小胞を含有する、項目２
に記載の組成物。
（項目９）
前記小胞が、前記組成物が静脈内に投与される場合、ポリエチレングリコール鎖の外部被覆によって長期間循環し続けるリポソームであり、かつ腫瘍領域中に溢出する大きさのリポソームである、項目８に記載の組成物。
（項目１０）
前記小胞がリポソームであり、該リポソームが、抗腫瘍抗原抗体、抗ｈＣＧ抗体、および癌細胞表面レセプターに特異的に結合し得るリガンドからなる群から選択される、表面結合標的化部分を有する、項目８に記載の組成物。
（項目１１）
前記化学実体が、前記酵素の活性を阻害するのに十分な量で、ウレアーゼインヒビターおよびその関連物質を含有する、項目２に記載の組成物。
（項目１２）
前記ウレアーゼが、植物ウレアーゼもしくは細菌性ウレアーゼである、項目１に記載の
組成物。
（項目１３）
尿素、治療的に活性な抗腫瘍剤、および画像化剤からなる群から選択される薬剤をさらに含有する、項目１に記載の組成物。
（項目１４）
前記ウレアーゼおよび薬剤を取り込まれた形態で含む小胞を、さらに含有する、項目１
３に記載の組成物。
（項目１５）
項目１に記載の組成物であって、弱塩基性の抗腫瘍化合物をさらに含有し、該弱塩基性
の抗腫瘍化合物の有効性が、固形腫瘍における、細胞内でより高く／細胞外でより低いｐＨ勾配によって減少される、組成物。
（項目１６）
前記抗腫瘍化合物が、ドキソルビシンン、ダウノルビシン、ミトキサントロン、エピルビシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチンおよびビンクリスチンのようなビンカアルカロイド、シクロフォスファミドおよび塩酸メクロレタミンのようなアルキル化剤、ならびに抗腫瘍性のプリン誘導体およびピリミジン誘導体からなる群から選択される、項目１５に記載の組成物。
（項目１７）
哺乳動物被験体中の癌を処置するか、もしくは診断するための薬剤の製造における、酵素ウレアーゼの使用。
（項目１８）
哺乳動物被験体中の固形腫瘍を処置するための薬剤の製造における、項目１７に記載の
使用。
（項目１９）
弱塩基性の抗腫瘍化合物によって処置されている被験体において固形腫瘍を処置するための薬剤であって、該弱塩基性の抗腫瘍化合物の有効性が、固形腫瘍における、細胞内でより高く／細胞外でより低いｐＨ勾配によって減少される、薬剤の製造における、項目１
７に記載の使用。
（項目２０）
被験体中の固形腫瘍領域内のｐＨについての診断情報を作製するのに使用するための薬剤の製造における、項目１７に記載の使用。
（項目２１）
哺乳動物被験体中の癌細胞の増殖を阻害するのに使用するための遺伝子治療組成物であって、該遺伝子治療組成物が、
被験体に投与される場合に、癌細胞を特異的にトランスフェクトするのに有効な標的化ベクターを含有し、かつ
トランスフェクトされた癌細胞中でウレアーゼｍＲＮＡを生成するのに有効な組み換え核酸配列を、該ベクター中に保有した、
遺伝子治療組成物。
（項目２２）
前記ベクターがアデノウイルスである、項目２１に記載の組成物。
（項目２３）
前記配列が、ウレアーゼをコードし、かつ前記トランスフェクトされた癌細胞からのウレアーゼの分泌を促進するのに有効な分泌性リーダー配列をコードする、項目２１に記載
の遺伝子治療組成物。
図１Ａ〜図１Ｄは、ウレアーゼ反応の段階を説明する。尿素は、ウレアーゼによって切断され、１分子のアンモニアおよび１分子のカルバメートを生成する（Ａ）。カルバメートは、アンモニアと炭酸とに自発性に分解する（Ｂ）。炭酸は、水中で平衡化し（Ｃ）、同時にアンモニア２分子も平衡化し、プロトン化してアンモニウムイオンおよび水酸化物イオンを生成する（Ｄ）。この反応は、反応環境のｐＨの上昇をもたらす。 図２は、調製されたウレアーゼを含有する粗製試料の質量分析プロフィールを示す。 図３は、本発明の別の実施形態に従う精製プロセスの種々の段階における、ウレアーゼのアフィニティー精製プロフィールを示す。 図３−２は、図３−１の続である。 図４は、本発明の１つの実施形態に従って調製された、ＧプロテインカラムによるＥコイルαｈＥＧＦＲ ＩｇＧ結合体の精製を示す。 図５は、固定化ＫコイルＥＬＩＳＡによって決定されるような、本発明の１つの実施形態に従って調製された精製ＥコイルαｈＥＧＦＲ ＩｇＧ結合体の抗体力価を示す。
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
他に示されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の分野の当業者に対する意味と同じ意味を有する。実行者らは、当該分野の定義および用語について、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（第３版）；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（１９９３）のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに、特に導かれる。本発明が記載される特定の方法論、プロトコール、および試薬に限定されないことは（これらが変動し得るという理由から）、理解されるべきである。
用語「ウレアーゼ」とは、尿素アミドヒドロラーゼの酵素活性を有する酵素（Ｅ．Ｃ．３．５．１．５）であって、天然に存在するか、または、例えば組換え核酸技術および／もしくは化学合成によって得られるかのいずれかである酵素を指す。ウレアーゼはまた、ウレアーゼ全体、サブユニット、もしくはそれらのフラグメントを含む融合タンパク質、および／または、このポリペプチドの尿素アミドヒドロラーゼ活性を保存するアミノ酸置換、欠失、付加を有するウレアーゼを含む。本明細書中で使用される短縮ウレアーゼ配列は、ウレアーゼのアミノ末端もしくはカルボキシ末端のいずれかで開始するインタクトなウレアーゼ配列の一部を含まない、ウレアーゼフラグメントである。ネイティブなウレアーゼを単離する方法、組み換え体によってウレアーゼを合成する方法、ならびに活性フラグメントおよび改変ウレアーゼポリペプチドを同定する方法は、以下に示される。
用語「癌」とは、異常な細胞、もしくは組織塊を指すことを意味する。これらの細胞もしくは組織の増殖は、正常な細胞もしくは組織の増殖を越え、かつそれと同調せず、そして変化を引き起こす刺激の停止後も、同じ過剰な様式を持続する。これらの新生組織もしくは細胞は、正常な組織もしくは細胞に比べて構造的な組織化、および協調の欠損を示し、結果として良性もしくは悪性のいずれかであり得る組織塊もしくは細胞塊となり得る。本明細書中で使用される場合、癌は、あらゆる新生物を含む。これには、黒色腫、腺癌、悪性神経膠腫、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、膵臓癌、甲状腺癌、肺癌、結腸癌、直腸癌、脳腫瘍、肝臓癌、乳癌、卵巣癌、などが挙げられる（しかし、これに限定されない）。
「腫瘍」もしくは「固形腫瘍」としては、癌細胞の凝集塊を指し、半固形および固形の腫瘍、固形腫瘍転移、血管線維腫、水晶体後線維増殖症、血管腫、およびカポジ肉腫が挙げられる（しかし、これに限定されない）。
本明細書中で使用される場合、用語「標的化部分」とは、決められた細胞集団もしくは選択された細胞の型に結合する分子を指す。この標的化部分は、レセプター、オリゴヌクレオチド、酵素基質、抗原決定基、あるいは、標的細胞もしくは標的細胞集団上または標的細胞もしくは標的細胞集団中に存在する他の結合部位に結合し得る。例示的な標的化部分は、抗体である。発現される抗原を認識し得る抗体フラグメントおよび小さなペプチド配列もまた、意図される標的化部分である。
本明細書中で使用される場合、用語「癌細胞の増殖を阻害する」もしくは「癌細胞の増殖を阻害すること」とは、観察もしくは予測される未処置のコントロール癌細胞の増殖速度と比較して癌細胞増殖の速度が減少されるように、癌細胞の増殖および／もしくは移動の速度のあらゆる緩徐化、癌細胞の増殖および／もしくは移動の停止、または癌細胞を死滅させること、を指す。用語「増殖を阻害する」とはまた、癌細胞もしくは腫瘍のサイズの減少もしくは消滅、およびその転移能力の減少を指し得る。好ましくは、このような細胞レベルでの阻害は、サイズを減少させ得、増殖を抑止し得、攻撃性を減少させ得、または患者における癌の転移を防止もしくは阻害し得る。当業者は、任意の種々の適切な指標（ｉｎｄｉｃｉａ）によって、癌細胞の増殖が阻害されるかどうかを容易に決定し得る。
癌細胞の増殖の阻害は、例えば、細胞周期の特定の期での癌細胞の停止（例えば、細胞周期のＧ２／Ｍ期での停止）、によって証明され得る。癌細胞の増殖の阻害はまた、癌細胞もしくは腫瘍のサイズの直接的もしくは間接的測定によって証明され得る。ヒト癌患者においては、このような測定は、一般的に、周知の造影法（例えば、磁気共鳴映像法、コンピュータ処理された軸位断層撮影法、およびＸ線）を用いて行われる。癌細胞の増殖はまた、例えば癌胎児性抗原、前立腺特異性抗原、もしくは癌細胞の増殖に関連付けられる他の癌特異性抗原の循環レベルを決定することによって、間接的に決定され得る。癌の増殖の阻害はまた、一般的に、被験体の生存の延長、ならびに／または被験体の健康および良好さの増進に関連付けられる。
本明細書中で使用される場合、用語「アポトーシスを誘導する」とは、ＤＮＡの断片化に特徴付けられる、プログラムされた細胞死の形成の促進を指す。アポトーシスは、当該分野で公知の方法によって決定され得る。例えば、インサイチュ免疫組織化学によって断片化したＤＮＡの存在を検出するキット（例えば、Ｉｎｔｅｒｇｅｎ，Ｐｕｒｃｈａｓｅ，Ｎ．Ｙ．から入手可能なＡｐｏｐｔａｇ）が、市販されている。加えて、アポトーシスはまた、ＦＡＣＳ分析（ここでは、アポトーシス細胞がｓｕｂ−Ｇ１ ＤＮＡ含有物を提示し、ＤＮＡ断片化を示す）によって決定され得る。
本明細書中で使用される場合、「抗体」とは、少なくとも１つの免疫グロブリン核酸分子もしくは免疫グロブリン遺伝子、または少なくとも１つの免疫グロブリン核酸分子もしくは免疫グロブリン遺伝子のフラグメントに、実質的もしくは部分的にコードされる１つ以上のペプチド、またはポリペプチドを含むペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質を指す。認識される免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖は、κ、もしくはλのいずれかに分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、もしくはεに分類され、これらはまた、免疫グロブリン分類、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを、それぞれ定義する。代表的な免疫グロブリン（例えば、抗体）構造単位は、４量体を含む。各４量体は、２対の同一のポリペプチド鎖からなり、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識に関与する、約１００〜１１０以上のアミノ酸からなる可変領域を定義する。用語「可変軽鎖」（ＶＬ）および「可変重鎖」（ＶＨ）とは、それぞれこれらの軽鎖および重鎖を指す。抗体は、インタクトな免疫グロブリンとしてか、もしくは、種々のペプチダーゼによる消化によって生成される、多くのよく特徴付けられたフラグメントとして存在する。したがって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域におけるジスルフィド連結の下位で抗体を消化し、Ｆａｂ（これそのものは、ジスルフィド連結によってＶＨ−ＣＨ１に結合する軽鎖である）の２量体である、Ｆ（ａｂ）’２を生成する。Ｆ（ａｂ）’２は、穏やかな条件下において還元されてヒンジ領域におけるジスルフィド連結を分解し得、これによって、２量体（Ｆａｂ）’２を単量体Ｆａｂ’に転換する。Ｆａｂ’単量体は、実質的に、ヒンジ領域の一部を有するＦａｂである（他の抗体フラグメントのより詳細な記載に関しては、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ（編）、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）を参照のこと）。種々の抗体フラグメントが、インタクトな抗体の消化によって定義されるが、当業者は、このようなＦａｂ’フラグメントが、化学的に、もしくは組み換えＤＮＡ方法論を利用することによってのいずれかで、新たに（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成され得ることを理解する。したがって、本明細書中で使用される場合、用語「抗体」はまた、抗体全体の改変によって生成されるか、もしくは組み換えＤＮＡ方法論を用いて新たに（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成されるかのいずれかの抗体フラグメントを含む。抗体は、単鎖抗体を含み、これには、ＶＨおよびＶＬが互いに（直接にもしくはペプチドリンカーを通じて）結合されて連続するポリペプチドを形成する、単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）抗体が挙げられる。
抗体の「抗原結合フラグメント」は、抗原に結合する、その抗体のペプチドもしくはポリペプチドフラグメントである。抗原結合部位は、抗原の結合に寄与するか、関与するか、もしくは影響を与える、この抗体のアミノ酸によって形成される。Ｓｃｏｔｔ，Ｔ．Ａ．およびＭｅｒｃｅｒ，Ｅ．Ｉ．，ＣＯＮＣＩＳＥ ＥＮＣＹＣＬＯＰＥＤＩＡ：ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（ｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ（第３版）１９９７）、およびＷａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら、ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ
ＤＮＡ（第２版、１９９２）を参照のこと。これらはそれぞれ、あらゆる目的のために、その全体が本明細書中において参考として援用される。用語「抗体フラグメント」としてはまた、特定の抗原に結合して複合体を形成することによって抗体のように作用する、任意の合成もしくは遺伝的に改変されたタンパク質が挙げられる。
用語「活性薬剤」、「薬物」、「薬理学的に活性な薬剤」は、被験体に投与される場合に所望の薬理学的効果を誘導し、そして診断剤もしくは治療剤（放射性核種、薬物、抗癌剤、毒物などが挙げられる）を含むことが意図される化学実体もしくは化合物を指すために、本明細書中において可換性に使用される。好ましくは、活性薬剤という用語は、タンパク質、糖タンパク質、天然および合成のペプチド、アルカロイド、多糖類、核酸分子、低分子、などを含む。より好ましくは、活性薬剤という用語はタンパク質を指す。例示的な活性薬剤は、ウレアーゼである。
「ｐＨ感受性」活性薬剤とは、所望の薬理学的効果を誘導するその能力が、少なくとも部分的に、周辺の細胞外環境のｐＨに依存する活性薬剤を指す。
本明細書中で使用される場合、用語「浄化剤」とは、受容者の循環中に存在する投与部分と結合するか、複合するか、もしくは関連し得、それによって、受容者の身体からの循環部分のクリアランス、血液循環からの除去、もしくは循環中におけるそれらの不活性化を促進する薬剤を指す。この浄化剤は、好ましくは、サイズ、電荷、構造もしくはそれらの組み合わせのような、物理特性によって特徴付けられ、そしてこの物理特性は、この浄化剤と同じ処置プロトコールで使用される標的化部分によって認識される標的細胞集団へアクセスする、薬剤の浄化を制限する。
用語「画像化剤」は、検出され得る化合物を指すことを意味する。
用語「アジュバント」とは、処方物もしくは組成物に加えられて主成分の作用を助ける物質もしくは薬剤を指す。
用語「間質」液および「細胞外」液とは、哺乳動物細胞の間にあるか、もしくは哺乳動物細胞を浸している液体を指す。
用語「被験体」、「個体」、および「患者」は、処置の任意の標的を指すために、本明細書中において可換性に使用される。本明細書中によって、腫瘍細胞をインサイチュにおいて、またはそれらの通常の位置もしくは部位（例えば、胸部の新生細胞もしくは前立腺腫瘍）において処置する方法が、また提供される。これらのインサイチュ腫瘍は、広範な種類の宿主（例えば、ヒト宿主、イヌ宿主、ネコ宿主、ウマ宿主、ウシ宿主、ブタ宿主、など）の内部または表面に位置し得る。腫瘍もしくは腫瘍細胞が見られるあらゆる宿主は、本発明を用いて処置され得、そして本発明に従い得る。被験体としては、したがって、脊椎動物が挙げられ、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。
「標的細胞滞留時間」によって、ウレアーゼ分子もしくは他の活性薬剤が標的細胞表面もしくは標的細胞内に残存する時間の量を意味する。
本明細書中で使用される場合、用語「結合体」は、化学的結合体（共有結合もしくは非共有結合）、融合タンパク質などを含む。
本明細書中で使用される場合、用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、もしくは「ペプチド」とは、アミノ酸サブユニットもしくはアミノ酸アナログサブユニットからなる生体高分子を、可換性に指す。この生体高分子は、代表的に、生物学的タンパク質に見られる２０種類の共通Ｌ−アミノ酸のいくつかもしくは全てが、ペプチドのサブユニット間連結もしくは他のサブユニット間連結によって連結される。タンパク質は、そのサブユニット配列によって表される一次構造を有し、そして二次のらせん状もしくは平面状の構造、および全体的な３次元構造を有し得る。「タンパク質」は、一般に比較的大きいポリペプチド（例えば、１００以上のアミノ酸）を指し、そして「ペプチド」はより小さいポリペプチドを指すが、この用語は本明細書中において可換性に使用される。すなわち、用語「タンパク質」は、より大きいポリペプチド、およびより小さいペプチドを参照し得、そしてその逆もそうである。
「ウレアーゼの調節因子」は、ウレアーゼインヒビターもしくはウレアーゼエンハンサーのいずれかである。
「ウレアーゼインヒビター」は、以下：（１）ウレアーゼの発現、改変、調節（ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）、活性化、もしくは分解；または（２）ウレアーゼの１つ以上の通常機能、を干渉する分子もしくは分子群を含む。このウレアーゼの通常機能としては、尿素の加水分解、カルバメートおよびアンモニアの生成をもたらすこと、が挙げられる。インヒビターは、このインヒビターが、静電気的相互作用もしくは化学的相互作用を介してウレアーゼに結合する場合、「ウレアーゼへ直接的に作用する」。このような相互作用は、他の分子に媒介ても、媒介されくてもよい。インヒビターは、その最も速い効果が、ウレアーゼの発現、活性化もしくは機能に影響するウレアーゼ以外の分子に対してである場合、「ウレアーゼへ間接的に」作用する。
「ウレアーゼ（の）エンハンサー」は、以下：（１）ウレアーゼの発現、改変、調節（ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）、もしくは活性化；または（２）ウレアーゼの１つ以上の通常機能、を増強する分子もしくは分子群を含む。エンハンサーは、その最も速い効果が、ウレアーゼの発現、活性化もしくは作用に影響するウレアーゼ以外の分子に対してである場合、「ウレアーゼへ間接的に」作用する。
ウレアーゼ遺伝子の「人工突然変異」は、以下：（１）このような変化がない状態で生成される量に対する、ウレアーゼタンパク質量の増加もしくは減少；または、（２）このような変化がない状態での通常機能に対する、通常機能の増強もしくは障害を有するウレアーゼタンパク質、の生成をもたらす、ウレアーゼ遺伝子のヌクレオチド配列の変化を含む。
用語「薬学的組成物」とは、被験体（動物もしくはヒトが挙げられる）への薬学的な使用に適する組成物を意味する。この薬学的組成物は、一般的に、有効量の活性薬剤およびキャリア（例えば、薬学的に受容可能なキャリアが挙げられる）を含有する。
「薬学的に受容可能な処方物」は、活性薬剤（例えば、ウレアーゼもしくはウレアーゼ調節因子）を、所望の結果を与え、かつ有害な副作用（患者への見込まれる害が、この患者への見込まれる利益を上回ると医師に確信させるに十分な作用）をまた生じない様式で投与するのに適切な処方物を含む。注入可能な処方物としての基本成分は、代表的に水のビヒクルである。有用な水性ビヒクルは、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液、リンゲル溶液、ＮａＣｌ／デキストロース溶液、などを含む。水混和性ビヒクルは、活性薬剤の十分な溶解性をもたらすのに、また有用である。抗菌剤、緩衝液、および抗酸化剤は、必要に応じて有用であり得る。同様に、本明細書中で使用される、化合物の「薬学的に受容可能な」塩、もしくは化合物の「薬学的に受容可能な」誘導体は、生物学的に、もしくはその他に所望されなくはない塩もしくは他の誘導体である。
用語「制御された放出」とは、処方物からの薬物の放出の様式およびプロフィールが制御される、あらゆる薬物含有処方物を指すことを意味する。用語「制御された放出」とは、即時および非即時放出性処方物を指し、ここで、非即時放出性処方物としては、徐放性処方物および遅延放出性処方物が挙げられる（しかしこれに限定されない）。
用語「徐放性」（「拡張放出性」とも呼ばれる）は、その通常の意味において、長期間に渡る薬剤の緩やかな放出のために提供され、そして好ましくは（必須ではないが）実質的に、長期間に渡って一定な薬剤の血液レベルをもたらす薬物処方物を指すために用いられる。用語「遅延放出性」は、その通常の意味において、処方物の投与とそこからの薬剤の放出との間に時間遅れがある薬物処方物を指すために用いられる。「遅延放出性」は、長期間に渡る薬剤の緩やかな放出を含んでも、含まなくてもよく、したがって「徐放性」であっても、「徐放性」でなくともよい。
「治療的処置」とは、病理、疾患、もしくは障害の症状または徴候を示す被験体に施される処置であり、このとき、これらの病理、疾患、もしくは障害の徴候または症状を減少もしくは除去する目的で、処置が被験体に施される。「治療学的活性」は、薬剤（例えば、核酸、ベクター、遺伝子、ポリペプチド、タンパク質、物質、もしくはそれらの組成物）の活性であって、病理、疾患、もしくは障害の徴候または症状を、このような徴候もしくは症状を被る被験体に投与される場合に、除去もしくは減少させる活性である。「治療学的に有用な」薬剤もしくは化合物（例えば、核酸もしくはポリペプチド）とは、病理、疾患、もしくは障害のこのような徴候または症状を、減少、処置、除去するのに有用な薬剤もしくは化合物を表す。
用語「低分子」は、合成、天然由来、もしくは一部合成の化合物もしくは分子複合体を含み、これは、好ましくは５，０００ダルトンより少ない分子量を有する。より好ましくは低分子は、約１００〜１，５００ダルトンの間の分子量を有する。
用語「核酸分子」もしくは「オリゴヌクレオチド」もしくは本明細書中で文法上の等価物は、互いに共有結合された少なくとも２つのヌクレオチドを指し、そして代表的には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、およびｃＤＮＡ分子を指す。本発明の核酸は、好ましくは１本鎖もしくは２本鎖であり、そして一般的には、ホスホジエステル結合を含むが、いくつかの場合においては、例えば、ホスホラミド、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、および／もしくはＯ−メチルホスホラミダイト連結を含む、代替の骨格を有する核酸アナログが含まれる。遺伝暗号の縮重の結果として、所定のペプチド（例えば、ウレアーゼ）をコードする多数のヌクレオチド配列が生成され得ることが、理解される。
「異種」核酸構築物もしくは核酸配列は、それが発現される細胞由来でない配列の一部を有する。制御配列に関する異種とは、現在その発現が調節（ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）されている遺伝子と同じ遺伝子を調節（ｒｅｇｕｌａｔｅ）するように事実上機能しない、制御配列（すなわち、プロモーターもしくはエンハンサー）を指す。一般的に異種核酸配列は、それが存在する細胞もしくはゲノムの一部の内因性ではなく、そして感染、トランスフェクション、微量注入、電気穿孔法、などによって細胞に加えられている。異種核酸構築物は、ネイティブ細胞で見られる制御配列／ＤＮＡをコードする配列の組み合わせと同じか、もしくは異なる制御配列／ＤＮＡをコードする配列の組み合わせ、を含み得る。
本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」は、異なる宿主細胞間での移送のために設計される核酸構築物を指す。「発現ベクター」とは、外来細胞に異種ＤＮＡフラグメントを組み込み、そして発現させる能力を有するベクターを指す。多くの原核生物発現ベクターおよび真核生物発現ベクターが、市販されている。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内である。
本明細書中で使用される場合、「発現カセット」もしくは「発現ベクター」は、組み換え体としてかもしくは合成的に生成され、標的細胞中もしくはインビトロでの特定の核酸の転写を可能にする一連の特定化された核酸要素を有する、核酸構築物である。組み換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ，ウイルス、もしくは核酸フラグメントに組み込まれ得る。代表的に、発現ベクターの組み換え発現カセット部分は、他の配列中に、転写される核酸配列およびプロモーターを含み得る。
本明細書中で使用される場合、用語「プラスミド」とは、クローニングベクターとして使用される環状２本鎖ＤＮＡ構築物を指し、これは、多くの細菌およびいくつかの真核生物において、染色体外の自己複製する遺伝要素を形成する。
本明細書中で使用される場合、「選択マーカーをコードするヌクレオチド配列」とは、宿主細胞中で発現し得るヌクレオチド配列を指し、ここで、選択マーカーの発現は、この発現される遺伝子を含有する細胞に、対応する選択的薬剤の存在下で増殖する能力を与える。
本明細書中で使用される場合、用語「プロモーター」および「転写イニシエーター」とは、下流遺伝子の転写を導くよう機能する核酸配列を指す。プロモーターは一般的に、標的遺伝子が発現されている宿主細胞に適切である。プロモーターは、他の転写調節（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ）核酸配列および他の翻訳調節（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ）核酸配列（「制御配列とも称される」）とともに、所定の遺伝子を発現させるのに必須である。一般に、この転写調節（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ）核酸配列および翻訳調節（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ）核酸配列としては、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および転写停止配列、翻訳開始配列および翻訳停止配列、ならびにエンハンサー配列もしくは活性化配列が挙げられる（しかし、これに限定されない）。
本明細書中で定義される場合、「キメラ遺伝子」もしくは「異種核酸構築物」とは、異なる遺伝子の一部（調節（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ）要素を含む）を含み得る非ネイティブ遺伝子（すなわち、宿主に導入されたもの）を指す。宿主細胞の形質転換のためのキメラ遺伝子構築物は、代表的に、異種タンパク質をコードする配列に操作可能に連結される転写調節（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ）領域（プロモーター）からなるか、または選択マーカーのキメラ遺伝子においては、形質転換される宿主細胞に抗菌剤耐性を与えるタンパク質をコードする選択マーカー遺伝子をコードする配列に操作可能に連結される転写調節（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ）領域（プロモーター）からなる。宿主細胞の形質転換のための本発明の代表的なキメラ遺伝子としては、構成性もしくは誘導性の転写調節（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ）領域、タンパク質をコードする配列、および終止配列が挙げられる。キメラ遺伝子構築物はまた、標的タンパク質の分泌が所望される場合、シグナルペプチドをコードする第二のＤＮＡ配列を含み得る。
核酸は、別の核酸配列と機能的関係におかれる場合、「作動可能に連結される」。例えば、分泌性リーダーをコードするＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドに関するＤＮＡに操作可能に連結される；プロモーターもしくはエンハンサーは、コード配列に、それがこの配列の転写に影響する場合、操作可能に連結される；または、リボソーム結合部位は、翻訳を促進するよう配置される場合、コード配列に操作可能に連結される。一般的に、「操作可能に連結される」とは、連結されるＤＮＡ配列が、接近しており、そして分泌性リーダーの場合は、接近し、かつ読み取り段階にあることを意味する。しかし、エンハンサーは接近している必要はない。連結は、都合の良い制限部位でのライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターもしくはリンカーが、都合の良い実行に合わせて使用される。
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の生成に関与し、コード領域に先立つ領域およびコード領域にに続く領域（例えば、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）もしくは「リーダー」配列、および３’ＵＴＲもしくは「トレイラー」配列、ならびに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン））を含んでも、含まなくともよいＤＮＡのセグメントを意味する。
本明細書中で使用される場合、「組み換え」は、異種核酸配列の導入によって改変された細胞もしくはベクターへの参照を含むか、または細胞がそのような改変された細胞に由来することを含む。したがって、例えば、組み換え細胞は、慎重なヒトの介在の結果として、細胞のネイティブ（非組み換え）形態内では同じ形態が見られない遺伝子を発現するか、または、さもなければ異常に発現されるか、過小発現されるか、もしくは全く発現されないネイティブ遺伝子を発現する。
用語「導入される」とは、細胞への核酸配列の挿入に関する場合、「トランスフェクション」、「形質転換」もしくは「形質導入」を意味し、真核生物細胞もしくは原核生物細胞への核酸配列の組み込みへの参照を含む。このとき、この核酸配列は、細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、もしくはミトコンドリアＤＮＡ）に組み込まれ得るか、自立レプリコンに転換され得るか、または一時的に発現され得る（例えば、トランスフェクトされたｍＲＮＡ）。
本明細書中で使用される場合、用語「発現」とは、遺伝子の核酸配列に基づいてポリペプチドが生成されるプロセスを指す。このプロセスは、転写と翻訳とを含む。
用語「シグナル配列」とは、成熟形態のタンパク質の細胞外への分泌を促進する、タンパク質のＮ末端部分のアミノ酸配列を指す。この細胞外タンパク質の成熟形態は、分泌プロセス中に切断されるシグナル配列を欠いている。
用語「宿主細胞」によって、ベクターを含み、発現構築物の複製、または転写および翻訳（発現）を支持する細胞が意味される。本発明で使用される宿主細胞は、原核生物細胞（例えば、Ｅ．Ｃｏｌｉ）、または真核生物細胞（例えば、酵母、植物、昆虫、両生類、もしくは哺乳動物細胞）であり得る。
本明細書中で使用される場合、活性薬剤の「有効量」もしくは「薬学的に有効な量」とは、標的細胞もしくは被験体の生理学的なパラメータにおける測定可能な変化を誘導するのに十分な量、および／あるいは、１つ以上の薬学的投薬単位の投与を通じて活性薬剤の発現もしくは活性を提供または調節（ｍｏｄｕｌａｔｅ）するのに十分な量を指す。このような有効量は、人によって、彼らの状態、身長、体重、年齢、および／もしくは健康、この活性薬剤（例えば、ウレアーゼもしくはウレアーゼ調節因子）の投与様式、投与される特定の活性薬剤、ならびに他の因子に依存して、変動し得る。結果として、特定の環境下で、特定の患者に対する有効量を実験的に決定することは有用であり得る。
本明細書中で引用される全ての刊行物および特許は、本発明と組み合わせて使用され得る組成物および方法論を記載し、そして開示する目的のため、本明細書中において参考のために特別に援用される。
（ＩＩ． 本発明の組成物）
本発明は、１つの局面において、癌細胞の増殖の阻害に使用する活性薬剤として、ウレアーゼを含有する組成物を含む。以下に記載されるように、この活性成分の癌細胞への送達を増強するように、化学実体がこの活性薬剤と関連する。患者の癌細胞をウレアーゼに曝露することは、本明細書中で記載されるように、患者の癌に効果的な処置となることが発見された。この癌細胞は、腫瘍（例えば固形腫瘍もしくは半固形腫瘍）中に含まれ得る。あるいは、この癌細胞は、被験体の血流中を循環し得る。
癌、腫瘍、および／もしくは新生物は、細胞もしくは組織の新たな増殖を含み、この細胞の増殖は、制御されておらず、かつ進行性である。このような増殖の一部は良性であるが、他は「悪性」と称され、「生体の死をもたらす」。攻撃的な細胞増殖を示すことに加えて、癌細胞が周辺の組織およびを浸潤し、かつ転移する点で、悪性新生物は良性増殖と区別される。さらに悪性新生物は、分化の重大な欠損を示し、またはお互いおよび周辺組織への組織化の重大な欠損を示す点で、特徴付けられる。
以下で検討されるものは、本発明の組成物に含まれる化合物である。
（Ａ．ウレアーゼ）
上記のように、組成物中の活性薬剤はウレアーゼである。このウレアーゼは、あらゆる由来のものであり得る（例えば、細菌、植物、菌類、およびウイルスを含む）。多くの研究が、進化的に多様な細菌、植物、菌類、およびウイルス由来のウレアーゼの遺伝学についての詳細な情報を提供している（Ｍｏｂｌｅｙ、Ｈ．Ｌ．Ｔら（１９９５）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９：４５１−４８０；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７５，１５１−１６５（１９８８）；Ｌａｂｉｇｎｅ，Ａ．（１９９０）国際公開ＷＯ９０／０４０３０；Ｃｌａｙｔｏｎ，Ｃ．Ｌ．ら（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１８，３６２；ならびに米国特許第６，２４８，３３０号および同第５，２９８，３９９号、これらはそれぞれ、本明細書中において参考のため援用される）。特に関心があるのは、植物に見られるウレアーゼである（Ｓｉｒｋｏ，Ａ．およびＢｒｏｄｚｉｋ，Ｒ．（２０００）Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｐｏｌ ４７（４）：１１８９−９５）。１つの例示的な植物ウレアーゼは、タチナタマメウレアーゼであり、これは、実施例２〜３に記載される。例示的なタチナタマメウレアーゼのアミノ酸配列は、配列番号７で示される。
有用なウレアーゼ配列は、公開のデータベース（例えば、Ｅｎｔｒｅｚ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｎｔｒｅｚ／））上で同定され得る。加えて、広範な種類の生物からウレアーゼを増幅するのに有用なプライマーは、Ｂａｋｅｒ，Ｋ．Ｍ．およびＣｏｌｌｉｅｒ，Ｊ．Ｌ．（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅ．ｓｍｉｔｈ．ｅｄｕ／ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｓ／Ｂｉｏｌｏｇｙ／ｌｋａｔｚ／ＮＥＭＥＢ＿ｗｅｂｐａｇｅ／ａｂｓｔｒａｃｔｓ．ｈｔｍｌ）によって記載されるように、または、Ｒｏｓｅら（１９９８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２６：１６２８に記載されるように、ＣＯＤＥＨＯＰ（ＣＯｎｓｅｎｓｕｓ−ＤＥｇｅｎｅｒａｔｅ Ｈｙｂｒｉｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｉｍｅｒ）を用いて、利用され得る。
ウレアーゼは、腫瘍細胞に接触し得るか、細胞外環境もしくは腫瘍細胞周辺の間質液に配置され得るか、または癌細胞内もしくは癌細胞近傍の細胞内で発現され得る。ウレアーゼによる癌細胞の増殖阻害の成功の基礎をなす、いかなる特定の分子機構にも拘束されることを望まないが、被験体の間質液へのウレアーゼの添加によって、このウレアーゼ組成物は、癌細胞が浸されている間質液のｐＨを上昇させ得る。ウレアーゼは、尿素基質をアンモニアおよびカルバメートに転換し得る。この酵素活性は、ｐＨを上昇させ、環境をより塩基性にさせ得る（図１Ａ〜１Ｄ）。癌細胞の周りの環境は、代表的には酸性である（Ｗｅｂｂ，Ｓ．Ｄ．ら（２００１）Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｆｏｕｎｄ Ｓｙｍｐ ２４０：１６９−８１）。したがって、この様式で細胞外環境のｐＨを上昇させることによって、癌細胞の増殖は阻害される。したがって、本発明の所定の実施形態における活性薬剤の添加は、間質液のｐＨを、約０．１ｐＨ単位（例えば、０．１〜０．５ｐＨ単位以上）上昇させる。
したがって、本発明の活性薬剤としては、天然に存在する形態のウレアーゼおよびそれらの機能的に活性な変異体が挙げられる。２つのアミノ酸配列変異体の一般型が予測される。アミノ酸配列変異体は、ウレアーゼ活性を無効化しない特定のアミノ酸における１つ以上の置換を有するものである。これらの変異体としては、実質的に相同であり、かつ機能的にネイティブタンパク質と等価である沈黙変異体および保存的に改変された変異体が挙げられる。ネイティブタンパク質の変異体は、そのアミノ酸配列がネイティブタンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも約８０％同一である場合、より好ましくは少なくとも９０％同一である場合、さらにより好ましくは少なくとも約９５％同一である場合、なおさらにより好ましくは少なくとも９８％同一である場合、そして最も好ましくは少なくとも約９９％同一である場合、ネイティブタンパク質と「実質的に相同」である。変異体は、わずか１〜１０以上のアミノ酸によって異なり得る。
変異体の第二の型は、ウレアーゼの活性フラグメントとして単離させるウレアーゼのサイズ変異体を含む。サイズ変異体は、例えば、ウレアーゼを断片化することによって、化学的改変によって、タンパク質分解酵素消化によって、もしくはそれらの組み合わせによって、形成され得る。加えて、遺伝子工学技術およびアミノ酸残基から直接的にポリペプチドを合成する方法が、サイズ変異体の生成に利用され得る。
「機能的に等価」によって、変異体の配列が、ネイティブウレアーゼと実質的に同じ生物学的活性を有するタンパク質を生成する鎖を定義することが、意図される。実質的な配列変異を含む、このような機能的に等価な変異体もまた、本発明に含まれる。したがって、ネイティブウレアーゼタンパク質の機能的に等価な変異体は、治療学的に有用であるのに十分な生物学的活性を有する。機能的等価性を決定するために、いくつかの方法が当該分野で利用可能である。生物学的活性は、実施例３のように、ネイティブウレアーゼタンパク質の活性を測定するために特別に設計されたアッセイを用いて測定され得る。加えて、生物学的に活性なネイティブタンパク質に対して増加した抗体は、機能的に等価な変異体に結合するその能力を検査され得、ここで、有効な結合は、高次構造がネイティブタンパク質のそれと類似するタンパク質を示している。
遺伝暗号の縮重に起因して、本発明のウレアーゼポリペプチドをコードする多数の核酸配列が生成され得、これらのいくつかは、公知のウレアーゼ核酸配列とわずかな相同性のみを有するということが、当業者によって理解される。このような「沈黙変異体」は、以下で議論されるように、「保存的に改変された変異体」の一種である。本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列（可能な暗号選択に基づく選択の組み合わせによって生成され得る）の、それぞれおよび全ての可能な変異を提供する。これらの組み合わせは、本発明のウレアーゼタンパク質ポリペプチドをコードする核酸配列に適用されるような、標準の３塩基遺伝暗号に従って生成される。
本発明のウレアーゼポリペプチドは、公知のウレアーゼポリペプチド配列の配列の１つ以上の保存的に改変された変異体（もしくは、単純に「保存的変異体」）を含む。このような保存的変異体は、単一のアミノ酸もしくは低いパーセンテージのアミノ酸を変更するか、付加するか、または除去する置換、付加、または欠失を含む。当業者は、代表的に保存的変異を構成する配列において、単一のアミノ酸もしくは低いパーセンテージのアミノ酸（代表的に５％より少ない、より代表的に４％、２％、１％より少ないか、もしくはより少ない）を置換するか、除去するか、または付加し、ここでこのような変化がアミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、もしくは化学的に類似するアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす、個々の置換、欠失、または付加を認識する。
機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当業者に周知である。表１は、互いに保存的置換もしくは保存的変異であるアミノ酸を含む６つの群を示す。
（表１．保存的置換基）
Figure 2013213055
アミノ酸のさらなる群もまた、処方され得る。例えば、アミノ酸は、類似する機能、または化学構造もしくは組成（例えば、酸性、塩基性、脂肪族、芳香族、硫黄含有）によって分類され得る。例えば、脂肪族群としては：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンが挙げられ得る。互いの保存的置換であるアミノ酸を含む他の群としては、以下：（ｉ）芳香族：フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン；（ｉｉ）硫黄含有：メチオニン、システイン；（ｉｉｉ）塩基性：アルギニン、リジン、ヒスチジン；ならびに（ｉｖ）酸性：アスパラギン酸、グルタミン酸アスパラギン、グルタミン、が挙げられる。アミノ酸のさらなる分類に関しては、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙを参照のこと。
本発明のウレアーゼタンパク質配列（保存的に置換された配列を含む）は、タンパク質の精製のための１つ以上のドメイン（例えば、ポリヒス（ｐｏｌｙ ｈｉｓ）セグメント、ＦＬＡＧタグセグメントなど）の付加によって生じるような、より長いポリペプチド配列の一部として存在し得る（例えば、ここで、付加された機能的ドメインは、そのタンパク質のウレアーゼプロテイン部分の活性にほとんどもしくは全く影響を有さない、または付加されたドメインは、プロテアーゼ処理のような合成後のプロセシング工程によって除去され得る）。
本発明の核酸配列分子のコードされる活性を変化させない、１つ以上の核酸もしくは配列の付加（例えば、非機能的配列の付加）は、基本的核酸分子の保存的変異であり、そして、本発明のポリペプチドの活性を変化させない１つ以上のアミノ酸残基の付加は、基本的ポリペプチドの保存的変異である。このような付加の型の両方は、本発明の特徴である。当業者は、開示される核酸構築物の多くの保存的変異が、機能的に同一の構築物を生じることを理解する。
配列の関連性を決定する種々の方法が使用され得、これには、手作業によるアライメント、ならびにコンピュータに補助される配列のアライメントおよび分析が挙げられる。この後者のアプローチは、コンピュータに補助される方法によってもたらされる処理量の増加のため、本発明において好ましいアプローチである。配列アライメントを実行するための種々のコンピュータプログラムが利用可能であるか、もしくは当業者によって作製され得る。
上記のように、本発明で利用される核酸配列およびポリペプチドの配列（ならびにそれらのフラグメント）は、本名発明のウレアーゼポリペプチドもしくはウレアーゼ核酸分子（またはそれらのフラグメント）の配列、もしくは関連分子の配列に対して同一である必要はないが、実質的に同一（もしくは実質的に類似）であり得る。例えば、ポリペプチドは種々の変化（例えば、１つ以上のアミノ酸もしくは核酸の挿入、欠失、および置換、これらは保存的もしくは非保存的のいずれかである）に供され得、このことは、例えば、このような変化が、その使用（例えば、治療的もしくは予防的使用、または投与、または診断的適用）において特定の利点を提供し得る、ということを含む。
比較的短いアミノ酸配列（約３０残基より少ない）のアライメントおよび比較は、代表的に、直接行う。より長い配列の比較は、２つの配列の最適なアライメントを達成するために、より洗練された方法を必要とし得る。比較ウインドウを整列させるための配列の最適なアライメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ Ａｐｐｌ
Ｍａｔｈ ２：４８２の局所的相同性アルゴリズム（ｌｏｃａｌ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）によって；ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ
Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４８：４４３の相同性アライメントアルゴリズム（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）によって；Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：２４４４の類似性探索法（ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｍｅｔｈｏｄ）によって；これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行（ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ． Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．）；ならびに、ＢＬＡＳＴ（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔａｌ． （１９７７） Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５：３３８９− ３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５： ４０３−４１０を参照のこと））によって；または、選択される種々の方法によってもたらされる最も良い整列（すなわち、比較ウインドウ全体で、配列類似性もしくは配列同一性の最高のパーセンテージを結果としてもたらす）を用いた検査によって、導かれる。
パーセント配列同一性（パーセント同一性）および配列類似性を決定するのに適切な、例示的アルゴリズムは、ＦＡＳＴＡアルゴリズムであり、これは、Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：２４４４に記載されている（または、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６：２２７−２５８を参照のこと）。パーセント同一性を計算するための、ＤＮＡ配列のＦＡＳＴＡアライメントに使用される好ましいパラメータは、最適化される（ＢＬ５０ Ｍａｔｒｉｘ １５：−５、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２；ｊｏｉｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ＝４０、ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ＝２８；ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝−１２、ｇａｐ ｌｅｎｇｔｈ ｐｅｎａｌｔｙ＝−２；およびｗｉｄｔｈ＝１６）。
探索およびアライメントのアルゴリズムについての上記の議論が、ヌクレオチド配列を含む照会配列の置換（およびここで、適切な、核酸データベースの選択）を用いて、ポリヌクレオチド配列の同定および評価にもあてはまることは、当業者に理解される。
（Ｂ．関連化学実体）
本発明の組成物は、活性薬剤と関連してこの活性薬剤の癌細胞への送達を増強する化学実体を含有し得る。広範な種類の関連化学実体が、以下に記載されるような使用のために意図される。
（Ｂ１．ポリマー）
この化学実体はポリマー（例えば、親水性ポリマーおよび疎水性ポリマーが挙げられ、親水性ポリマーが好ましい）を含み得る。本明細書中で使用される場合、用語「親水性」とは、一般に水と容易に結合し得る組成物、物質（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）、もしくは材料（ｍａｔｅｒｉａｌ）を指す（例えば、ポリマー）。したがって、本発明に利用され得る親水性ポリマーは、種々の型のドメイン（例えば、より親水性の高いドメイン、およびより疎水性の高いドメイン）を有し得るが、親水性ポリマーの全体の性質は、好ましくは親水性であり、もちろんこの親水性は、相対的に親水性の高い状態から相対的に親水性の低い状態まで、連続的に変化し得ることが理解される。
広範な種類のポリマーが、本発明の組成物および本発明の処方物として利用され得る。一般的に、ポリマーは、本明細書中で記載されるように、所望の親水性および／もしくは疎水性を有し、そして基質および標的リガンドとの共有結合性の付加を形成し得る。ポリマーは、架橋されうるか、もしくは架橋されていない可能性がある。本明細書中で使用される場合、用語「架橋する」、「架橋された」および「架橋」とは、一般に、２つ以上の化合物もしくは材料（例えば、ポリマー）の、１つ以上の橋による連結を指す。この橋は、１つ以上の要素、基もしくは化合物で構成され得、一般に、第一の化合物もしくは材料分子由来の原子と、第二の化合物もしくは材料分子の原子とを結合するよう作用する。架橋は、共有結合性および／もしくは非共有結合性結合を含み得る。任意の種々の要素、基、および／もしくは化合物は、架橋中の橋を形成し得、そして化合物もしくは材料は、天然に、または合成手段を通じて架橋され得る。
特定の実施形態に従って、ポリマー（直鎖状、星状、もしくは分枝状のいずれか）は、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンイミン、ポリアルキレンアミン、ポリアルケンスルフィド、ポリアルキレンスルホネート、ポリアルキレンスルホン、ポリ（アルキレンスルホニルアルキレンイミン）、およびそれらのコポリマーからなる群から選択され得る。
上記のように、利用される特定のポリマーに依存して、ポリマーは相対的により親水性もしくはより疎水性であり得る。適切な、相対的により親水性なポリマーの例としては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、分枝したポリエチレンイミン、ポリビニルピロリドン、ポリラクチド、ポリ（ラクチド−コ−グリコライド）、ポリソルベート、ポリエチレンオキシド、ポリ（エチレンオキシド−コ−ポリプロピレンオキシド）、ポリ（オキシエチル化）グリセロール、ポリ（オキシエチル化）ソルビトール、ポリ（オキシエチル化グルコース）、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリビニルアルコール、ポリ（ヒドロキシアルキルカルボン酸）、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシプロピルメタクリル酸、ポリヒドロキシバレレート、ポリヒドロキシブチレート、ポリオキサゾリジン、ポリアスパルタミド、ポリシアル酸、ならびにそれらの誘導体、混合物、およびコポリマーが挙げられる（しかし、これに限定されない）。
したがって、ポリマー（好ましくは親水性）は、活性薬剤、もしくは本明細書中で開示される他の関連化学実体と結合体化されて、活性薬剤の癌細胞への送達を増強し得る。ポリマー−活性薬剤結合体は、好ましくは、血液循環時間を延長させるのに有効な量、ならびに／またはネイティブな、もしくは非誘導体である活性薬剤に対するこの組成物の抗原性および／もしくは免疫原性を減少させるのに有効な量で投与される。特に好ましい親水性ポリマーとしては、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリアスパルタミド、および／もしくは親水性セルロース誘導体が挙げられる（しかし、これに限定されない）。好ましい親水性ポリマーは、例えば、約１，０００〜１０，０００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコールである。１つに実施形態においては、ポリエチレングリコールは、１，０００〜５，０００ダルトンの分子量を有する。本発明での使用が予想されるさらなるポリマーは、２００２年４月１１日に公表された、米国特許公開公報（Ｕ．Ｓ．Ｐｒｅ−Ｇｒａｎｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ）第２００２００４１８９８号（本明細書中において、参考のため援用される）において、より詳細に議論される。
（Ｂ２．標的化部分）
標的化部分は、本発明の化学実体と意図され、そして定義され、選択された細胞の型もしくは標的細胞集団（例えば、癌細胞）に結合する。この点で有用な標的化部分としては、抗体および抗体フラグメント、ペプチドならびにホルモンが挙げられる。既知の細胞表面レセプターに対応するタンパク質（低密度リポタンパク質、トランスフェリン、およびインシュリンを含む）、線維素溶解性酵素、抗ＨＥＲ２、血小板結合タンパク質（例えば、アネキシン）、ならびに生物学的反応修飾因子（インターロイキン、インターフェロン、エリスロポイエチン、およびコロニー刺激因子）がまた、標的化部分と意図される。オリゴヌクレオチド（例えば、標的細胞核酸の一部と相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、本発明の標的化部分として使用され得る。標的化部分はまた、標的細胞表面に結合するオリゴヌクレオチドであり得る。定義された標的細胞集団に結合する能力を保持する、上記に挙げられる標的化部分のアナログもまた、標的化部分として使用され得る。
上記の標的化部分との機能的等価物もまた、本発明の標的化部分として有用である。例示的な、機能的に等価な標的化部分は、標的化部分の標的細胞への結合のために適切な構造および／もしくは配向性を模倣するように設計される、有機化学的構築物である。別の、機能的に等価な標的化部分は、標的化部分の結合親和性を示す、短いポリペプチドである。
本発明の好ましい標的化部分は、標的細胞の表面にある抗原と応答性のある抗体、ペプチド、オリゴヌクレオチドなどである。市販されているか、または文献に記載されるかのいずれかであるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方が、利用され得る。抗体は、抗体全体もしくはそれらのフラグメントであり得る。モノクローナル抗体およびフラグメントは、従来の技術（例えば、ハイブリドーマ合成、組み換えＤＮＡ技術、およびタンパク質合成）に従って生成され得る。有用なモノクローナル抗体およびフラグメントは、あらゆる種（ヒトを含む）に由来され得るか、または２つ以上の種由来の配列を利用するキメラタンパク質として生成され得る。
本発明の１つの実施形態において、ヒトモノクローナル抗体およびヒト化マウス抗体が、標的化部分として使用される。ヒト化標的化部分が、宿主の受容者における抗体もしくはポリペプチドの免疫反応を減少させ得、半減期の増加および有害な免疫応答の減少を可能にし得る。マウスモノクローナル抗体は、例えば、マウスＦｖ領域またはそれらの相補性決定領域をコードするヌクレオチド配列を、ヒト定常ドメイン領域およびＦｃ領域をコードするヌクレオチド配列に組み換えることによって、ヒト化され得る。マウス残基はまた、ヒト変異領域の枠組みのドメイン内に保持され、適切な標的部位へ結合する特徴を確実にし得る。標的化部分の非制限的な例は、脳のグリア細胞（α−２−糖タンパク質）に対する抗α−２−ＧＰ抗体である（Ｓｌｅｐｎｅｖら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．３：２７３−２７４（１９９２）に記載される）。種々の活性薬剤の癌細胞への送達のために遺伝的に改変された抗体は、Ｂｏｄｅｙ，Ｂ．（２００１）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．１（４）：６０３−１７に概説される。
本発明の別の実施形態において、標的化部分は、標的細胞の表面にあるレセプターと応答性のあるリガンドである。したがって、標的化部分はとしては（制限されることなく）、細胞の結合成分に対して親和性のあるホルモン、細胞の結合成分に認識される炭水化物部分を含有するあらゆる分子、および細胞の結合成分に結合する薬物もしくは低分子が挙げられる。「結合成分」という語句は、レセプターおよび分子アクセプターの両方を含む。好ましくは、結合成分は、細胞表面結合成分である。１つの実施形態において、標的化部分は、標的部位に結合する、天然に存在するタンパク質（例えば、インシュリン）である。サイトカイン（インターロイキンを含む）、ならびに顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のような因子もまた、レセプターを高レベルに発現する特定の細胞に結合することが知られた特異的な標的化部分である（Ｔｅｒｌｉｋｏｗｓｋｉ，ＳＪ（２００２）Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ １７４（３）：１４３−１５２）。
非標的細胞もしくは組織へのウレアーゼ曝露または他の活性薬剤曝露を減少させるため、標的化部分は、最小の非標的応答性を示し、一方で標的特異性および標的応答性を保持している成分を同定するため、スクリーニングされ得る。非標的曝露（ならびに有害な非標的局在および／もしくは有毒性）を減少させることによって、増加された用量のウレアーゼもしくは他の活性薬剤が投与され得る。これによって、標的細胞の曝露を、受容できない非標的毒性の閾値より低く保持しながら最大化するため、ウレアーゼもしくは他の治療薬の最も高い可能濃度での投与が可能になる。
本発明の特定の実施形態において、２つ以上の活性薬剤標的化部分結合体が利用される、ここで、各結合体は、異なる標的化部分（例えば、異なる抗体種）を含む。各利用される標的化部分は、同じもしくは異なる標的部位と関連し得る、異なる標的部位領域に結合する。各投与される結合体の活性薬剤化合物は、同じかもしくは異なる。米国特許第４，８６７，９６２号および同第５，９７６，５３５号（これらはそれぞれ、本明細書中において参考のため援用される）を参照のこと。本発明のこの実施形態の実施において、各標的化部分（例えば、抗体種）が異なる標的部位領域（例えば、標的部位エピトープ）を認識するので、標的部位に結合する活性薬剤の標的部位付着は改善される。この代替の標的部位領域アプローチは、活性薬剤のためのより効力のある標的部位結合点を提供する。結果的に、実際の、もしくは有効的な標的部位飽和（例えば、エピトープ飽和および／もしくは立体障害を介する）は回避され得る。したがって、活性薬剤（例えば、ウレアーゼ）の相加的な蓄積が達成され得る。あるいは、もしくは加えて、付加的なウレアーゼ特異的遺伝子の産物が活性薬剤として（例えば、標的部位で触媒として活性なホロ酵素の生成のため）、使用され得る。例示的なウレアーゼアポ酵素としては、細菌のｕｒｅＡＢＣ遺伝子（Ｂｕｒｎｅ、Ｒ．Ａ．およびＣｈｅｎ，Ｙ．Ｍ．（２０００）Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２：５３３−５４２）によってコードされるγ、β、およびαサブユニットが挙げられる。
特定の標的部位に指向するモノクローナル抗体への交差応答性のパターンは、診断もしくは治療用途での使用において非重複交差応答性を有する、２つ以上の標的特異性モノクローナル抗体の一団を同定するために、分析され得る。「交差応答性の非重複パターン」という語句は、ある抗体種によって結合される非標的組織が、別の抗体種によって結合される非標的組織と実質的に異なることを示す。交差応答性のパターンは、治療用途の活性薬剤の曝露を比例的に減少させるのに必要な程度に異なっている。より少ない抗体の組み合わせ（もしくは、抗体のより大きな一団）の重複が、好ましい。
抗体は種々の方法によってスクリーニングされ得る。標的組織との応答性、および非標的組織との交差応答性を決定するために、免疫組織化学的分析が利用され得る。抗体種が結合する組織は、組織を抗体に曝露し；組織を洗浄して未結合の抗体を除去し；そして結合した抗体の存在を検出することによって、同定され得る。インビトロでの組織化学的手順は、当該分野で公知である。例えば、Ｓａｎｃｈｅｚ−ｌｓｌａｓ，Ｅ．およびＬｅｏｎ−Ｏｌｅａ，Ｍ．（２００１）Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ ５（４）：３０２−１６を参照のこと。
本発明の組成物はまた、ｈＣＧ分泌腫瘍の処置に有用であり得る。胎盤の栄養膜はｈＣＧを通常合成する部位であるため、妊娠性栄養膜腫瘍および非妊娠性栄養膜腫瘍の両方が、ｈＣＧを合成および分泌することが理解され得る。実際、ｈＣＧ測定は、これらの腫瘍の診断、腫瘍の病期の決定、および治療効果のモニタリングに非常に有用であった。加えて、いくつかの非栄養膜性腫瘍は、異所的に（ｅｃｔｏｐｉｃａｌｌｙ）ｈＣＧを生成し得る。ｈＣＧは、いくつかの腫瘍に対して成長因子として作用し得る（Ｍｅｌｍｅｄ Ｓ．およびＢｒａｕｎｓｔｅｉｎ ＧＤ：Ｈｕｍａｎ ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｂ２ ｒａｔ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ ５６：１０６８−１０７０，（１９８３））。例えば、米国特許第６，４４８，０２２号（本明細書中において参考のため援用される）を参照のこと。
したがって、本発明の１つの実施形態によれば、ｈＣＧ分泌腫瘍に対して活性薬剤を標的に向ける抗ｈＣＧ抗体の使用は、ｈＣＧ分泌腫瘍の増殖を抑制する。したがって、特定の実施形態において、本発明の化学実体は、活性薬剤に付加される標的化部分であり、抗腫瘍抗原抗体、抗ｈＣＧ抗体、もしくは癌細胞表面レセプターに特異的に結合し得るリガンドである。標的化部分は、好ましくは、酵素ウレアーゼに連結されて融合タンパク質を形成するポリペプチドである。
上記のように、本発明の１つの実施形態に従って、活性薬剤は、標的化部分に直接的に結合体化される。あるいは、本発明の別の実施形態に従って、二段階もしくは三段階のアプローチが、活性薬剤を癌細胞に送達するのに使用される。したがって、この活性薬剤は、第二の結合パートナーと相互作用し得る第一の結合パートナーを含み得、そしてこの化学実体は、第二の結合パートナーを含む標的化部分を含み得る。これらの実施形態は、以下の第ＩＩＩ章により詳細に記載される。
当業者は、本発明の標的化部分、および活性薬剤が、任意の様式で互いに結合され得ることを理解する。したがって、標的化部分がポリペプチドである場合、活性薬剤は、この標的化分子のアミノ末端もしくはカルボキシ末端のいずれかに結合し得る。付加が分子のそれぞれの活性を干渉しない限り、標的化部分はまた、活性薬剤の内部領域に結合され得、または逆に、活性薬剤は、標的化部分の内部部位に結合され得る。
標的化部分および活性薬剤は、当業者に周知である多くの手段のいずれかによって、付加され得る。代表的に、活性成分は、直接的に、もしくはリンカー（スペーサー）を通して、標的化部分に結合体化される。しかし、標的化部分および活性薬剤の両方がポリペプチドである場合、単鎖融合タンパク質のようなキメラ分子を、組み換え体として発現することは、好ましくあり得る。
１つの実施形態において、標的化部分（例えば、αｈＥＧＦＲ ＩｇＧ Ａｂ）は、活性薬剤もしくは化学実体（例えば、薬物、ウレアーゼ、もしくはリポソーム）に、化学的に結合体化される。分子を化学的に結合する手段は、当業者に周知である。
薬剤を抗体もしくは他のポリペプチド標的化分子に付加する手順は、この薬剤の化学構造に従って変動する。ポリペプチドは、代表的に、種々の官能基（例えば、カルボン酸（ＣＯＯＨ）もしくは遊離アミン（−ＮＨ２）基を含み、これらは、活性薬剤上の適切な官能基と反応しこれらに標的化部分を結合するのに利用可能である。
あるいは、標的化部分および／もしくは活性薬剤は、さらなる反応性の官能基に曝露するか、もしくは反応性の官能基を付加するように誘導され得る。この誘導は、多くのリンカー分子（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＩＩから入手可能なもの）のいずれかの付加を含み得る。
本明細書中で使用される場合、「リンカー」は、標的化部分と活性薬剤とを結合するのに使用される分子である。リンカーは、標的化部分および活性薬剤の両方との共有結合を形成し得る。適切なリンカーは、当業者に周知であり、直鎖もしくは分枝した炭素リンカー、複素環式炭素リンカー、ペプチドリンカーが挙げられる（しかしこれに限定されない）。標的化部分および活性薬剤分子がポリペプチドである場合、リンカーは、構成アミノ酸と、それらの側鎖を通して結合され得る（例えば、システインへのジスルフィド連結を通して）。しかし、好ましい実施形態において、リンカーは、末端アミノ酸のα炭素のアミノ基およびカルボキシル基に結合される。
特定の薬剤の基に反応性がある官能基、および抗体に反応性のある別の官能基を有する二官能性リンカーは、所望の免疫結合体を形成するのに使用され得る。あるいは、誘導体化は、標的化部分の化学処理（例えば、遊離アルデヒド基を生成する、過ヨウ化酸塩による糖タンパク質抗体の糖成分のグリコール切断）を含み得る。抗体上の遊離アルデヒド基は、活性薬剤上の遊離アミノ基もしくはヒドラジン基と反応されて、それらと結合し得る（米国特許第４，６７１，９５８号を参照のこと）。ポリペプチド（例えば、抗体もしくは抗体フラグメント）上での遊離スルフヒドリル基の生成手順もまた、公知である（米国特許第４，６５９，８３９号を参照のこと）。
種々の化合物（放射性核種金属キレート剤、毒物および薬物を含む）のタンパク質（例えば抗体）への付加のための多くの手順およびリンカー分子が公知である（欧州特許出願第１８８，２５６号；米国特許第４，６７１，９５８号、同第４，６５９，８３９号、同第４，４１４，１４８号、同第４，６９９，７８４号、同第４，６８０，３３８号、同第４，５６９，７８９号、および同第４，５８９，０７１号、ならびにＢｏｒｌｉｎｇｈａｕｓら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：４０７１−４０７５を参照のこと）。特に、種々の免疫毒素の生成は、当該分野で周知であり、そして例えば、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ａｉｍｉｎｇ ｔｈｅ Ｍａｇｉｃ Ｂｕｌｌｅｔ」、Ｔｈｏｒｐｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１６８〜１９０ページ（１９８２）；Ｗａｌｄｍａｎｎ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：１６５７；米国特許第４，５４５，９８５号、および同第４，８９４，４４３号に見られ得る。
いくつかの環境において、キメラ分子がその標的部位に達した場合、標的化部分から活性薬剤を遊離させることが分子を望ましい。したがって、エフェクターが標的部位で放出されるべき場合、この標的部位近傍において切断され得る連結を含むキメラ結合体が、使用され得る。標的化部分から薬剤を放出する、この連結の切断は、酵素活性によってか、または標的細胞中もしくは標的部位近傍のいずれかに結合体が供される状態によって、促進され得る。標的部位が腫瘍である場合、腫瘍部位に存在する条件（例えば、腫瘍関連酵素もしくは酸性ｐＨに曝露される場合）下で切断され得るリンカーが、使用され得ることが理解されるべきれある。
多くの異なる切断可能なリンカーは、当業者に公知である（米国特許第４，６１８，４９２号、同第４，５４２，２２５号、および同第４，６２５，０１４号を参照のこと）。これらのリンカー基から活性薬剤を放出する機構としては、例えば、感光性結合への照射および酸に触媒される加水分解が挙げられる。米国特許第４，６７１，９５８号は、例えば、患者の補体系のタンパク質分解酵素によって、インビボにおいて標的部位で切断されるリンカーを含む、免疫結合体についての記載を含む。種々の放射性診断化合物、放射性治療化合物、薬物、毒物、および他の薬剤を標的化部分へ付加する、報告されている多数の方法から見て、当業者は、選択した標的化部分に任意の薬剤を付加するための、適切な方法を決定し得る。
標的化部分および／もしくは活性薬剤が相対的に短い場合、これらは標準的な化学的ペプチド合成技術を用いて合成され得る。両分子が相対的に短い場合、キメラ分子は、単一の連続するポリペプチドとして合成され得る。あるいは、標的化部分および活性薬剤は、別個に合成され得、そして、次いで１つの分子のアミノ末端と他の分子のカルボキシル末端との縮合によって融合され、これによってペプチド結合が形成され得る。あるいは、標的化部分および活性薬剤は、それぞれペプチドスペーサー分子の一方の末端と縮合され、これによって連続的な融合タンパク質を形成し得る。
配列のＣ末端アミノ酸が不溶性の支持体に付加され、配列中の残りのアミノ酸の逐次的な付加がそれに続く固相合成が、本発明のポリペプチドの化学合成方法の１つの実施形態として、意図される。固相合成の技術は、ＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ．第２巻：Ｓｐｅｃｉａｌ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、パートＡ．３〜２８４ページ；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５６（１９６３）；および、Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版）Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＩＩ．（１９８４）によって記載される。
好ましい実施形態において、本発明のキメラ融合タンパク質は、組み換えＤＮＡ方法論を用いて合成される。一般的に、これは、融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を作製すること、発現カセット中のＤＮＡを特定のプロモーターの制御下におくこと、宿主中でタンパク質を発現させること、発現されたタンパク質を単離すること、および、必要な場合、このタンパク質を再生すること、を含む。
本発明における融合タンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、適切な配列のクローニングおよび制限酵素切断、もしくは直接的な化学合成（例えば、Ｎａｒａｎｇら（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６８：９０−９９のリン酸トリエステル法；Ｂｒｏｗｎら（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６８：１０９−１５１のリン酸ジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９−１８６２のジエチルホスホルアミダイト法；および米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持法（ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ ｍｅｔｈｏｄ））を含む、任意の適切な方法によって調製され得る。
化学合成は、一本鎖オリゴヌクレオチドを生成する。これは、相補的な配列とのハイブリダイゼーションによってか、または１本鎖をテンプレートとして用いたＤＮＡポリメラーゼによる重合によって、２本鎖ＤＮＡに転換され得る。当業者は、ＤＮＡの化学合成が約１００塩基の配列までに制限される一方、より長い配列が短い配列のライゲーションによって得られることを認識する。
あるいは、部分配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）がクローン化され得、そして適切な部分配列が、適切な制限酵素を用いて切断され得る。フラグメントは、次いで、連結されて、所望のＤＮＡ配列を生成し得る。
２つの分子が、好ましくは、実質的に直接に、互いに結合する一方で、当業者は、分子が１つ以上のアミノ酸からなるペプチドスペーサーによって分離され得ることを理解する。一般に、スペーサーは、タンパク質を結合する以外に、または、それらの間のある最小の距離もしくは他の空間的関係を保存する以外に、特定の生物学的活性を有さない。しかし、スペーサーの構造アミノ酸は、分子のいくつかの特性（例えば、折りたたみ、正味の電荷、もしくは疎水性）に影響するように選択される。
融合タンパク質をコードする核酸配列は、種々の宿主細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ、他の細菌性宿主、酵母、および種々のより高等な真核生物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞株、ＣＨＯ細胞株およびＨｅＬａ細胞株、ならびにミエローマ細胞株）が挙げられる）において発現され得る。組み換えタンパク質遺伝子は、各宿主の適切な発現制御配列に、操作可能に連結される。Ｅ．ｃｏｌｉの場合、これは、プロモーター（例えば、Ｔ７、ｔｒｐ、もしくはラムダプロモーター）、リボソーム結合部位、および好ましくは、転写停止シグナル含む。真核生物細胞の場合、この制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、サイトメガロウイルス、などに由来するプロモーターおよび好ましくは、エンハンサー、ならびにポリアデニル化配列を含み、そしてスプライシングドナー配列およびアクセプター配列を含み得る。
本発明のプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉに対する塩化カルシウム形質転換、および哺乳動物細胞に対するリン酸カルシウム処理もしくは電気穿孔法のような周知の方法によって、選ばれた宿主細胞中に移送され得る。プラスミドによって形質転換される細胞は、プラスミドに含まれる遺伝子（例えば、ａｍｐ、ｇｐｔ、ｎｅｏ、およびｈｙｇ遺伝子）によって与えられる抗生剤への耐性によって選別され得る。
一旦発現された後、この組み換え融合タンパク質は、当該分野において標準的な手順（硫安沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動など）に従って精製され得る（Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ（１９８２）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。薬学的使用のためには、少なくとも９０〜９５％同質である、実質的に純粋な組成物が好ましく、そして９８〜９９％以上同質であると最も好ましい。一旦（部分的に、もしくは所望の同質性まで）精製された後、このポリペプチドは、次いで治療学的に使用され得る。
当業者は、化学合成、生物学的発現、もしくは精製の後、標的に向けられる融合タンパク質が、構成要素のポリペプチドのネイティブな高次構造より実質的に異なる高次構造を有し得ることを認識する。この場合において、ポリペプチドを変性および還元し、次いでこのポリペプチドを適切な高次構造へと再度折りたたませることが必要であり得る。タンパク質を還元および変性し、そして再折りたたみを誘導する方法は、当業者に周知である（Ｄｅｂｉｎｓｋｉら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：１４０６５−１４０７０；ＫｒｅｉｔｍａｎおよびＰａｓｔａｎ（１９９３）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，４：５８１−５８５；ならびにＢｕｃｈｎｅｒら（１９９２）Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０５：２６３−２７０を参照のこと）。
当業者は、標的に向けられる融合タンパク質に対して、その生物学的活性を減少させることなく改変が行われ得ることを認識する。いくつかの改変は、クローニング、発現、もしくは標的化分子の融合タンパク質への組み込みを、促進させ得る。このような改変は、当業者に周知であり、そして、例えば、開始部位を提供するためのアミノ末端へ付加されるメチオニン、または、都合よく位置付けられた制限酵素切断部位もしくは終止コドンを生成するようにいずれかの末端に配置される付加的なアミノ酸、が挙げられる。
（Ｂ３．取り込まれる活性薬剤）
特定の実施形態において、本発明は、活性薬剤（例えば、ウレアーゼ）の癌細胞への送達のために、小胞（例えば、リポソームおよび／もしくは化学実体としてのナノカプセル）の使用を意図する。このような処方物は、本明細書中で開示されるポリペプチドの薬学的に受容可能な処方物、治療剤、および／もしくは抗体の導入のために、好ましくあり得る。リポソームの処方および使用は、一般的に当業者に公知である。（Ｂａｃｋｅｒ，Ｍ．Ｖ．ら（２００２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ １３（３）：４６２−７を参照のこと）。好ましい実施形態において、開示される組成物は、リポソームに取り込まれ得る。
ナノカプセルは、一般的に、化合物を安定な状態かつ再現性のある方法で、取り込み得る（Ｗｈｅｌａｎ，Ｊ．（２００１）Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ ６（２３）：１１８３−８４）。細胞内の重合体の過負荷に起因する副作用を避けるため、このような超微小な粒子（約０．１μｍ）が、インビボで分解され得るポリマーを用いて設計され得る。これらの要求を満たす、生分解性のポリイソブチルシアノアクリル酸塩のナノ粒子が、本発明における使用のために意図され、そしてそのような粒子は、例えば、Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｇ．ら（２００１）Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ ２１４（１−２）：１３−６に記載されるように、容易に作製され得る。生物学的に活性のある物質を含むポリアルキル−シアノ−アクリル酸塩のナノ粒子の調製、およびそれらの使用の方法は、米国特許第４，３２９，３３２号、同第４，４８９，０５５号、および同第４，９１３，９０８号に記載される。ナノカプセルは、Ｃａｐｓｕｌｕｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．（ｗｗｗ．ｃａｐｓｕｌｕｔｉｏｎ．ｃｏｍ）のような供給源から商業的に入手可能である。
活性薬剤の送達のためのナノカプセルを含有する薬学的組成物は、米国特許第５，５００，２２４号、同第５，６２０，７０８号、および同第６，５１４，４８１号に記載される。米国特許第５，５００，２２４号は、ナノカプセルのコロイド状懸濁液の形態である（この懸濁液は、その中に界面活性剤が溶解され、かつその中に多数の、５００ナノメーターより小さい直径を有するナノカプセルが懸濁される油から本質的になる油相を含む）、薬学的組成物を記載する。米国特許第５，６２０，７０８号は、薬物および他の活性薬剤の投与のための組成物および方法を記載する。この組成物は、哺乳動物の腸細胞の表面に存在する標的分子に特異的に結合する結合成分に付加された、活性薬剤キャリア粒子を含有する。結合成分は、粒子状の活性薬剤キャリアのエンドサイトーシスもしくはファゴサイトーシスを開始させ、それによってこのキャリアが腸細胞に吸収されるのに十分な結合親和性もしくは結合力で、標的分子に結合する。活性薬剤は、次いで、キャリアから宿主の体循環へ放出される。このようにして、腸における、ポリペプチドのような分解感受性薬剤の分解は、タンパク質およびポリペプチドの腸管からの吸収が増進されると同時に、回避され得る。あるいは、本発明は、標的細胞周辺環境での活性薬剤の放出を意図する。例えば、１つの実施形態において、ウレアーゼは、標的細胞への標的化部分の結合に続いて、ナノカプセルから放出され、それによって、ウレアーゼは、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）周辺の微小環境中に放出される。米国特許第６，３７９，６８３号および同第６，３０３，１５０号は、ナノカプセルを作製する方法、およびそれらを使用する方法を記載し、そして本明細書中で参考のため援用される。
したがって、本発明の１つの実施形態において、この接触としては、標的化部分および第一のコイル形成ペプチド（選択された電荷によって、および第二の逆に荷電したコイル形成ペプチドと相互作用して安定したαへリックス状コイルドコイルヘテロ二量体を形成する能力によって、特徴付けられる）を含む結合体の、細胞への添加が挙げられる。続いて、リポソームがこの細胞に添加される。このリポソームは、外部表面および内部区画を含み；このリポソームの内部区画内に局在する活性薬剤（例えば、ウレアーゼ）を含み；そして、多くの二次ペプチドを含み、ここで各二次ペプチドは、このリポソームの外部表面に結合される。
以下に詳細に記載される別の実施形態において、この接触としては、細胞へのリポソームの添加が挙げられ、ここで、このリポソームは、活性薬剤（例えば、ウレアーゼ）を、取り込まれた形態で有し、そしてこのリポソームの外部表面は、標的表面に特異的に結合するのに有効な細胞標的化部分、および標的化部分を標的表面との相互作用から遮蔽するのに有効な親水性ポリマー被覆を含む。この親水性ポリマー被覆は、解放可能な連結を通してリポソームの表面脂質成分に共有結合性に連結されるポリマー鎖から生成され得る。この実施形態において、放出剤が、添加されるリポソームの連結の実質的な部分の解放を引き起こすのに有効な量で腫瘍細胞に添加され、これによって、標的表面に標的化部分を曝露する。この解放可能な連結は、還元可能な化学的連結（例えば、ジスルフィド連結、エステル連結、およびペプチド連結）であり得る。好ましくは、親和性部分は、癌特異抗原へ特異的に結合するのに有効である。
本発明のこの実施形態に従って、哺乳動物被験体に対するリポソームに基づく治療方法が意図される。この方法は、被験体への、表面結合標的化部分および親水性ポリマー被覆を有するリポソームの全身性の投与（例えば、静脈内投与）を含む。親水性ポリマー被覆は、解放可能に付加されたポリマー鎖からなり、標的化部分を、その標的との相互作用から遮蔽するのに有効である。好ましい親水性ポリマーは、上記で議論される。投与されるリポソームは、所望のリポソームの体内分布が達成されるまで、全身性に循環するようにされる。放出される薬剤は、以下に記載されるように、解放可能な連結の実質的な部分（例えば約５０％より多い、好ましくは約７０％より多い、そしてより好ましくは約９０％より多い）の切断を引き起こすのに有効な量で、被験体に投与される。標的化部分は、親水性ポリマー鎖の解放によって、その標的との相互作用のために曝露される。
好ましい実施形態において、リポソームは、固形腫瘍の処置に使用される。リポソームはウレアーゼ、および必要に応じて、付加的な活性薬剤（例えば、抗腫瘍薬物）を取り込まれた形態で含み、そして腫瘍特異的抗原へ特異的に結合するのに有効な標的化部分によって、腫瘍領域に対して標的化される。例示的な方法において、リポソームは、増殖する腫瘍内皮細胞で発現するＦｌｋ−１，２レセプターへの選択的付加のために、リポソーム中にＶＥＧＦリガンドを含むことによって、腫瘍の血管内皮細胞に対して標的化される（Ｎｉｅｄｅｒｍａｎ，Ｔ．Ｍ．ら（２００２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９９（１０）：７００９−１４）。
好ましくは、リポソームは、約３０〜４００ｎｍのサイズを有する。このサイズの範囲のリポソームは、内皮細胞に存在して腫瘍の血管系を内張りしている「ギャップ」を通って腫瘍に入り得ることが示されている（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋら（１９９９）Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ４０（１−２）：８９−１０２）。
リポソームの投与（例えば、静脈内投与）に続いて、そしてリポソームが被験体全体に分布し、そして腫瘍に結合することができるのに十分な時間が経過した後、放出剤が被験体に投与され、親水性表面被覆をリポソームから放出させる。表面被覆の放出は、標的細胞へのリポソームの結合を可能にする標的化部分を曝露するのに有効である。１つの実施形態において、この親水性表面被覆は、ｐＨ感受性の連結によってリポソームに結合される。この連結は、リポソームが腫瘍に結合した後に解放される。
上記に記載される任意の実施形態におけるリポソームは、必要に応じて、１つ以上の取り込まれた抗腫瘍薬物もしくは画像化剤もしくはこの両方を含有する。リポソームは、付加され、かつ分布するようにされ、この後、放出剤が投与され、親水性表面被覆を放出させて付加された標的化部分を曝露し得、そして結合を開始させ得る。したがって、取り込まれた抗腫瘍薬物もしくは画像化剤もしくはこの両方は、特異的かつ局所的に、標的に投与される。例示的な抗癌薬物は、以下の第ＩＩＩ章Ａに記載される。本発明の方法に使用する例示的な画像化剤は、以下の第ＩＩＩ章Ｂに記載される。リポソームは、米国特許第６，０４３，０９４号（本明細書中で参考のため援用される）に記載されるように調製され、そして投与され得る。
米国特許第６，１８０，１１４号（本明細書中で、その全体が参考のため援用される）に記載されるような、さらなる送達剤（例えば、小さな単層の小胞（ｓｍａｌｌ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ；ＳＵＶ））が、本発明において利用され得る。
（Ｂ４．活性薬剤調節因子）
活性薬剤調節因子はまた、本発明によって関連化学実体として意図される。好ましい活性薬剤調節因子は、ウレアーゼ調節因子である。「ウレアーゼ調節因子」は、ウレアーゼのインヒビターであるか、もしくはウレアーゼのエンハンサーであるかのいずれかである。組成物（例えば、薬学的組成物）中の調節因子は、したがって、ウレアーゼポリヌクレオチド配列、ウレアーゼアンチセンス分子、ウレアーゼポリペプチド、タンパク質、ペプチド、またはウレアーゼ生物活性の有機調節因子（例えば、インヒビター、アンタゴニスト（抗体を含む）、もしくはアゴニスト）の全てもしくは一部から選択され得る。好ましくは、この調節因子は、ウレアーゼの発現もしくはウレアーゼの活性によって媒介されるか、または改善される医学的状態を処置する際に、活性である。
「ウレアーゼのインヒビター」は、以下：（１）ウレアーゼの発現、改変、調節（ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）、活性化、もしくは分解：または（２）ウレアーゼの１つ以上の正常機能（カルバミン酸およびアンモニアの生成をもたらす尿素の加水分解を含む）、を妨害する分子もしくは分子群を含む。インヒビターは、このインヒビターが静電気的相互作用もしくは化学的相互作用を介してウレアーゼに結合する場合、「ウレアーゼに直接的に作用する」。このような相互作用は、他の分子によって媒介され得るか、もしくは媒介されない可能性がある。インヒビターは、その最も速い効果が、ウレアーゼの発現、活性化もしくは機能に影響するウレアーゼ以外の分子に対してである場合、「ウレアーゼに間接的に」作用する。
ウレアーゼインヒビターは、尿素のアンモニウムイオンへの転換を遅くさせるように働く。ウレアーゼインヒビターとしては、ヒドロキサム酸誘導体（例えば、アセトヒドロキサム酸）、ホスホラミド誘導体（例えば、フルロファミド）、リン酸塩、チオール（例えば、２−メルカプトエタノールなど）、ホウ酸、ハロゲン化合物（例えば、フッ化物）、および桂皮抽出物、が挙げられる（しかしこれに制限されない）。さらなるウレアーゼインヒビターは、当該分野で公知であり、そして米国特許第４，８２４，７８３号（１９８９年４月２５日）（本明細書中に参考として援用される）に記載される。
ウレアーゼ（の）エンハンサーは、以下：（１）ウレアーゼの発現、改変、調節（ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）、もしくは活性化：または（２）ウレアーゼの１つ以上の正常機能、を増強する分子もしくは分子群を含む。エンハンサーは、このエンハンサーが、静電気的相互作用もしくは化学的相互作用を介してウレアーゼに結合する場合、「ウレアーゼに直接的に作用する」。このような相互作用は、他の分子によって媒介され得るか、もしくは媒介されない可能性がある。エンハンサーは、その最も速い効果が、ウレアーゼの発現、活性化もしくは機能に影響するウレアーゼ以外の分子に対してである場合、「ウレアーゼに間接的に」作用する。
（Ｃ．さらなる活性薬剤）
さらなる活性薬剤もまた、本発明の組成物に含まれる。さらなる活性薬剤（例えば、抗腫瘍剤（増殖する細胞に対して活性のある薬剤））は、細胞が第一の活性薬剤に接触される前に、接触されると同時に、または接触される後に、この組成物において利用され得る。例えば、ウレアーゼが腫瘍細胞に標的化された後、これは腫瘍の外部環境を（例えば、ｐＨの変化を介して）調節（ｍｏｄｕｌａｔｅ）もしくは調節（ｒｅｇｕｌａｔｅ）する能力を有する。塩基性環境を好む活性薬剤（例えば、抗腫瘍剤）は、次いで、より有効になる。
特定の実施形態において、ウレアーゼによって酵素的にプロセスされ得る基質が、活性薬剤としての使用を意図される。好ましくは、この活性薬剤は、ウレアーゼが利用して、アンモニウムイオンを形成する基質（例えば、尿素）である。
例示的な抗腫瘍剤としては、サイトカインおよび他の成分（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２など）、トランスフォーミング成長因子−β、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、インターフェロン（例えば、γ−インターフェロン）、コロニー刺激因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦなど）、血管透過性因子、レクチン炎症反応促進因子（セレクチン；例えば、Ｌ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン）、およびタンパク質性成分（例えば、Ｃ１ｑおよびＮＫレセプタータンパク質））が挙げられる。さらなる適切な抗腫瘍剤としては、血管新生を阻害し、したがって転移を阻害する化合物が挙げられる。このような薬剤の例としては、プロタミンメドロキシプロゲステロン、ペントサンポリサルフェート、スラミン、タキソール、サリドマイド、アンギオスタチン、インターフェロン−α、メタロプロテイナーゼインヒビター、血小板第４因子、ソマトスタチン、トロンボスポンジンが挙げられる。本発明の下で有用な活性薬物の、他の代表的かつ非制限的な例としては、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ブスルファン、クロラムブシル、スピロプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、メトトレキサート、アドリアマイシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、シトシンアラビノシド、アラビノシルアデニン、メルカプトプリン、ミトーテン、プロカルバジン、ダクチノマイシン（アンチノマイシンＤ）、ダウノルビシン、塩化ダウノルビシン、タキソール、プリカマイシン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、フルタミド、ロイプロリド、酢酸メゲストロール、タモキシフェン、テストラクトン、トリロスタン、アムサクリン（ｍ−ＡＭＳＡ）、アスパラギナーゼ（Ｌ−アスパラギナーゼ）、エトポシド、ヘマトポルフィリンのような血液製剤、または上記の誘導体、が挙げられる。活性薬剤の他の例としては、天然もしくは合成由来の核酸、ＲＮＡ、およびＤＮＡのような遺伝物質（組み換えＲＮＡおよび組み換えＤＮＡ）が挙げられる。特定のタンパク質をコードするＤＮＡは、多くの異なる型の疾患の処置に使用され得る。例えば、腫瘍壊死因子遺伝子もしくはインターロイキン−２遺伝子は、進行性の癌を処置するために提供され得る；チミジンキナーゼ遺伝子は、卵巣癌もしくは脳腫瘍を処置するために提供され得る；そして、インターロイキン−２遺伝子は、神経芽細胞腫、悪性黒色腫、もしくは腎臓癌を処置するために提供され得る。本発明における使用を意図されるさらなる活性薬剤は、米国特許第６，２６１，５３７号（その全体が、本明細書中で参考として援用される）に記載される。抗腫瘍剤およびこのような薬剤を検出するためのスクリーニングは、Ｍｏｎｇａ、ＭおよびＳａｕｓｖｉｌｌｅ，Ｅ．Ａ．（２００２）Ｌｅｕｋｅｍｉａ １６（４）：５２０−６に概説される。
特定の実施形態において、この活性製剤は弱塩基性の抗腫瘍化合物であり、その有効性は、固形腫瘍における細胞内でより高く／細胞外でより低いｐＨ勾配によって減少される。例示的な弱塩基性の抗腫瘍化合物としては、ドキソルビシンン、ダウノルビシン、ミトキサントロン、エピルビシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチンおよびビンクリスチンのようなビンカアルカロイド、シクロフォスファミドおよび塩酸メクロレタミンのようなアルキル化剤、ならびに抗腫瘍性のプリン誘導体およびピリミジン誘導体、が挙げられる。
本発明の１つの実施形態において、この組成物は、ウレアーゼを含有し、そして実質的にあらゆるサイトカイン（例えば、腫瘍壊死因子、および／もしくはインターフェロン）を欠く。この実施形態において、ウレアーゼ単独、もしくはサイトカイン以外の活性薬剤を組み合わせたウレアーゼ、好ましくは低分子抗腫瘍剤と組み合わせたウレアーゼは、癌細胞の増殖を阻害するのに有効である。したがって、この実施形態において、この組成物は、処置される被験体に存在する内在性サイトカインもしくはネイティブのサイトカインと協力して作用し得るか、または作用しない可能性があるが、投与されるこの組成物は、さらなる外来性サイトカインを含まない。
（Ｄ．画像化剤）
同様に、画像化剤が、この組成物中もしくは付加的な組成物中に含有され得る。適切な画像化剤としては、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、コンピュータ支援断層撮影（ｃｏｍｐｕｔｅｒ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）（ＣＡＴ）、単一光子放射型コンピュータ断層撮影、Ｘ線、蛍光透視、および磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）に使用される市販の薬剤が挙げられる。
画像化剤としては、金属、放射性同位体、および放射線不透過性薬剤（例えば、ガリウム、テクネチウム、インジウム、ストロンチウム、ヨウ素、バリウム、臭素、およびリン含有化合物）、放射線透過性薬剤、造影剤、色素（例えば、蛍光色素および発色団）、ならびに比色定量反応もしくは蛍光定量反応を触媒する酵素が挙げられる。一般に、このような薬剤は、上記に記載されるような種々の技術を用いて付加されるかもしくは取り込まれ得、かつ任意の配位で存在し得る。米国特許第６，１５９，４４３号および同第６，３９１，２８０号（これらの両方は、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
本発明に基づく造影剤は、イメージング様式に有用である（例えば、Ｘ線画像化剤、光イメージングプローブ、スピン標識、もしくは放射活性単位）。
ＭＲＩにおける造影剤としての使用に適切な物質の例としては、現在入手可能なガドリニウムキレート剤（例えば、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、およびガドペントテートジメグルミン）、ならびに鉄、マグネシウム、マンガン、銅、およびクロムが挙げられる。
ＣＡＴおよびＸ線に有用な物質の例としては、ヨウ素ベースの物質、例えば、ジアトリゾアート、およびヨータラム酸塩、によって代表されるイオン性単量体、イオパミドール、イソヘキソール、およびイオベルソルのような非イオン性単量体、イオトロールおよびイオジキサノールのような非イオン性二量体、ならびにイオン性二量体（例えば、イオキサグレート（ｉｏｘａｇａｌｔｅ））、が挙げられる。
空気および他のガスは、超音波画像診断での使用に組み込まれ得る。これらの薬剤は、当該分野で利用可能な標準的技術、および市販の設備を用いて検出され得る。
本発明の１つの実施形態に従って、癌細胞は、活性薬剤と接触させられる前、もしくは活性薬剤と接触させられた後、もしくは活性薬剤と接触させられる前および後に、画像化剤と接触させられる。例えば、ウレアーゼが腫瘍細胞に標的化された後、これは腫瘍細胞の外部環境を（例えば、ｐＨの変化を介して）調節（ｍｏｄｕｌａｔｅ）もしくは調節（ｒｅｇｕｌａｔｅ）する能力を有し得る。塩基性環境を好む画像化剤は、したがってより効果的である。
発光シクレン（ｃｙｃｌｅｎ）ベースのランタニドキレート剤とそれらの最初に生ずる磁気共鳴信号との両方が、ｐＨの変化に感受性があることが示された。ｐＨの変化を感知するのに使用される発光プローブは、代表的には、ランタニドイオンの蛍光寿命の変化をｐＨの関数として検出する。同様に、ｐＨの変化を介する水素イオンの緩和を調節（ｍｏｄｕｌａｔｅ）する磁気共鳴造影剤が本発明において有用である。どちらの場合においても、所定の系の中でｐＨを変化させることにより、増強されたコントラストによって薬剤を見ることができる。
したがって、ｐＨ感受性造影剤が、癌細胞のある場所で、もしくは癌細胞の近くで利用される。癌細胞（単数または複数）はまた、癌細胞のある場所で、もしくは癌細胞の近くでｐＨの変化を引き起こす酵素ウレアーゼを含有するウレアーゼ組成物に曝露される。このように、ｐＨの変化は、水性媒体中の水プロトンもしくは他の核の核磁気共鳴緩和特性を、ｐＨを反映する様式で変化させる。利用され得るｐＨ感受性造影剤の例としては、ランタニド金属（例えば、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｄｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂなど）、または別の常磁性元素（例えば、Ｆｅ、Ｍｎ、１７Ｏなど）を含有するこれらの薬剤が挙げられる。利用され得る特定の造影剤としては、Ｈ（２）（１７）Ｏ、ＧｄＤＯＴＡ−４ＡｍＰ（５−）（Ｍａｇｎ Ｒｅｓｏｎ Ｍｅｄ．２００３ Ｆｅｂ；４９（２）：２４９−５７に記載される）、ならびにＦｅ（ＩＩＩ）メソ−テトラ（４−スルホネートフェニル）ポルフィン（Ｆｅ−ＴＰＰＳ４）（Ｈｅｌｐｅｒｎら（１９８７）Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５：３０２−３０５、および米国特許第６，３０７，３７２号（これらは本明細書中で参考として援用される）に記載される）、が挙げられる。加えて、ポリイオンベースのＧｄ（Ｍｉｋａｗａら、Ａｃａｄ．Ｒａｄｉｏｌ（２００２）９（ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ１０９−Ｓ１１１１に記載される）が、本発明で使用され得る。
別の代替として、シフト試薬が、癌細胞周囲の水性媒体に提供され得る。このシフト試薬は、ｐＨの変化が、ｐＨを反映する様式で、水プロトンもしくは他の核の化学的シフト特性に影響を与えるように構成される。化学的シフト特性の変化は、次いで、核磁気共鳴を用いて測定され、活性薬剤は生物学的に活性であるかどうかを決定し得る。使用され得る例示的なシフト試薬としては、ランタニド金属（例えば、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｄｂ， Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、もしくはＹｂ）、または別の常磁性元素を含有するものが挙げられる。利用され得る特定のシフト試薬の例としては、Ｔｍ（ＤＯＴＰ）（５−）、１，４，７，１０−テトラアザシロドデカン（ｔｅｔｒａａｚａｃｙｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ）−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ（メチレンホスフェート（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐａｔｅ））のツリウム（ＩＩＩ）錯体、Ｄｙ（ＰＰＰ）（２）（７）−ジスプロシウムトリポリホスフェートなど、が挙げられる。
本発明の１つの実施形態において、２種のガドリニウム剤（例えば、ｐＨ非感受性ＧｄＤＯＴＰ （５−）およびｐＨ感受性ＧｄＤＯＴＡ−４ＡｍＰ （５−））を用いた二重造影剤ストラテジー（ｄｕａｌ−ｃｏｎｔｒａｓｔ−ａｇｅｎｔ ｓｔｒａｔｅｇｙ）は、Ｍａｇｎ Ｒｅｓｏｎ Ｍｅｄ（２００３）Ｆｅｂ；４９（２）：２４９−５７に記載されるように、ＭＲＩによるｐＨ地図を作成するのに利用され得る。
ＰＥＴ走査での使用に好ましい薬剤としては、１３Ｎおよびフルオロデオキシグルコース（ＦＤＧ）が挙げられる。
（Ｅ．組成物の処方物）
上記のように、本発明の組成物は活性薬剤を含有し、そして必要に応じて関連する化学実体を含有する。例えば、ウレアーゼポリペプチドもしくはウレアーゼポリヌクレオチドは、ウレアーゼ発現もしくはウレアーゼ活性の調節因子として活性のある化学的化合物もしくは生物学的化合物を含む。加えて、生体適合性のある薬学的キャリア、アジュバント、もしくはビヒクルもまた、含まれる。
組成物はまた、賦形剤もしくは他の薬学的に受容可能なキャリアに混合された他のヌクレオチド配列、ポリペプチド、薬物、もしくはホルモンを含有し得る。薬学的組成物以外の組成物は、必要に応じて、液体（すなわち、水もしくは水ベースの液体）を含有する。
薬学的組成物に付加される薬学的に受容可能な賦形剤はまた、当業者に公知であり、容易に利用可能である。賦形剤の選択は、本発明に従って生成物を投与するのに使用される特定の方法によって、ある程度決定される。したがって、広範な種類の、本発明に関する使用に適切な処方物がある。
薬学的組成物の処方物と投与の技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１９版）、（第１９版）、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，１９９５で見られ得、かつ当業者に周知である。賦形剤の選択は、本発明に関して生成物を投与するのに使用される特定の方法によって、ある程度決定される。したがって、各種の、本発明に関する使用に適切な処方物がある。以下の方法および賦形剤は、例示的であるのみであり、いかなる限定でもない。
本発明の薬学的組成物は、任意の従来法（例えば、混合プロセス、溶解プロセス、顆粒化プロセス、粉砕プロセス、乳化プロセス、カプセル化プロセス、取り込みプロセス、溶解紡糸プロセス、噴霧乾燥プロセス、もしくは凍結乾燥プロセス）を用いて製造され得る。しかし、最適な薬学的処方物は、投与経路および所望の投与量に依存して、当業者によって決定される。このような処方物は、物理的状態、安定性、インビボでの放出速度、および投与される薬剤のインビボでのクリアランス速度に影響する。処置される状態に依存して、これらの薬学的組成物は、以下の第ＩＩＩ章に記載されるように処方および投与され得る。
薬学的組成物は、適切な薬学的に受容可能なキャリアを含有するように処方され、そして、必要に応じて、医薬品に使用され得る調製物への活性化合物のプロセシングを促進する賦形剤および佐剤（ａｕｘｉｌｉａｒｙ）を含有し得る。投与様式は、一般的に、キャリアの性質を決定する。例えば、非経口投与のための処方物は、水に可溶な形態の活性化合物の水性溶液を含有し得る。非経口投与のためのキャリアは、生理食塩水、緩衝化された生理食塩水、ブドウ糖、水、および他の生理学的に適合性の溶液の中から選択され得る。非経口投与のための好ましいキャリアは、生理学的に適合性の緩衝液（例えば、ハンクス液、リンゲル液、もしくは生理学的に緩衝化された生理食塩水）である。組織もしくは細胞への投与のため、浸透されるべき特定の障壁に対して適切な浸透剤が処方物に使用される。このような浸透剤は、一般的に当該分野で公知である。タンパク質を含有する調製物のために、処方物は、ポリオール（例えば、ショ糖）および／もしくは界面活性剤（例えば、非イオン性界面活性剤）などのような安定化物質を含有し得る。
あるいは、非経口使用のための処方物は、適切な油状注射懸濁液として調製された活性化合物の懸濁液を含有し得る。適切な親油性溶媒もしくは親油性ビヒクルは、脂肪油（例えば、ゴマ油）および合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルもしくはトリグリセリド）、またはリポソームを含む。水性注射懸濁液は、この懸濁液の粘度を増加させる物質（例えば、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストラン）を含有し得る。必要に応じて、この懸濁液はまた、適切な安定剤もしくは化合物の安定性を増加させる薬剤を含有し、調製物を、高度に濃縮された溶液にし得る。乳濁液（例えば、水中油型分散液（ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ）、もしくは油中水型分散液）もまた、使用され得、必要に応じて乳化剤もしくは分散剤（界面活性物質；界面活性剤）によって安定化される。上記に記載されるように活性薬剤を含むリポソームもまた、非経口投与に利用され得る。
あるいは、経口投与に適切な投与量で薬剤を含有する薬学的組成物が、当該分野で公知の薬学的に受容可能なキャリアを用いて処方され得る。経口投与のために処方される調製物は錠剤、丸剤、カプセル、カシェ剤、ロゼンジ、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液、もしくは粉末の形態である。説明のため、経口使用のための薬学的調製物は、活性化合物と固形賦形剤とを組み合わせることによって得られ得、必要に応じて、結果として得られた混合物を粉砕することによって、そして所望される場合、この顆粒混合物を、適切な佐剤を添加した後に加工して錠剤を得ることによって、得られ得る。経口処方物は、非経口使用に関して記載された型と同様の液体キャリア（例えば、緩衝化された水溶液、懸濁液など）を利用し得る。
これらの調製物は、１つ以上の賦形剤を含有し得、この賦形剤としては、以下が挙げられる（限定ではない）：ａ）糖（乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールもしくはソルビトールを含む）のような希釈剤；ｂ）結合剤（例えば、マグネシウムアルミニウムケイ酸塩、デンプン（トウモロコシ（ｃｏｍ）、コムギ、コメ、ポテトなど由来）；ｃ）メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｈｎｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、およびカルボキシルメチルセルロースナトリウムのようなセルロース材料、ポリビニルピロリドン、ゴム（アラビアゴムおよびトラガカントゴム）、およびタンパク質（例えば、ゼラチンおよびコラーゲン）；ｄ）崩壊剤もしくは安定化薬剤（例えば、架橋ポリビニルピロリドン、デンプン、寒天、アルギン酸もしくはそれらの塩（例えば、アルギン酸ナトリウム））、または発砲性組成物；ｅ）滑沢材（例えば、シリカ、滑石、ステアリン酸またはそのマグネシウムもしくはカルシウム塩、およびポリエチレングリコール）；ｆ）香料もしくは甘味料；ｇ）着色料もしくは色素（例えば、製品を識別するため、もしくは活性薬剤の量（投与量）を特徴化するため）；および、ｈ）他の成分（例えば、保存剤、安定剤、膨張剤、乳化剤、溶解促進剤、浸透圧を調節（ｒｅｇｕｌａｔｅ）するための塩、および緩衝液）。
薬学的組成物は、活性薬剤の塩として提供され得る。ここで、この塩は多くの酸とともに生成され得、これには、塩酸塩、硫酸塩、酢酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、コハク酸塩などが挙げられる（しかしこれに限定されない）。塩は、遊離塩基形態に対応する水性溶媒もしくは他のプロトン溶媒に、より可溶性である傾向がある。
上記のように、活性薬剤そのものおよびこの薬剤の処方物の特徴は、物理的状態、安定性、インビボでの放出速度、および投与された薬剤のインビボでのクリアランス速度に影響し得る。このような薬物動態学的および薬力学的な情報は、前臨床インビトロ研究およびインビボ研究を通して収集され得、後に臨床試験の経過中に、ヒトで確認され得る。インビボでの動物データに基づく、ヒト臨床試験を実施するための指針は、多くの情報源（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖを含む）から得られ得る。したがって、本発明の方法に使用されるあらゆる化合物に関して、哺乳動物、特にヒトにおける治療学的に有効な用量は、生化学的アッセイおよび／または細胞ベースのアッセイから最初に推定され得る。次いで、投薬が、活性薬剤の発現もしくは活性を調節（ｍｏｄｕｌａｔｅ）する所望の循環濃度範囲を達成するように、動物モデルに処方され得る。ヒトでの研究が実施される場合、適切な投与量レベルに関して、ならびに種々の疾患および状態の処置期間に関して、さらなる情報が明らかになる。
このような化合物の毒性および治療学的有効性は、細胞培養物もしくは実験動物における標準的な薬学的手順（例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死量）、およびＥＤ５０（集団の５０％における治療学的有効量）を決定するための手順）によって決定され得る。
（ＩＩＩ．本発明の方法）
本発明の別の局面としては、癌細胞を阻害する方法が挙げられる。この方法は、上記のＩＩ章、および／もしくは下記のＩＶ章〜ＶＩＩ章に記載される組成物の、１つ以上の組成物を利用する。この方法は、癌細胞の増殖を阻害するのに有効な量の活性薬剤としてのウレアーゼに、細胞を曝露することを含む。
（Ａ．活性薬剤への癌細胞の曝露）
ウレアーゼ組成物（例えば、ウレアーゼ単独、もしくは癌細胞への酵素の送達を増強するのに有効な化学実体と組み合わせたウレアーゼ）は、当該分野で公知の多くの方法によって癌細胞へ送達され得る。治療用途において、この組成物は、癌細胞を有する患者に、その癌細胞の増殖を阻害するのに十分な量で投与される。本発明の薬学的組成物は、多くの経路（非経口、経腸、経上皮（ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ）、経粘膜、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、および／もしくは外科的経路を含む（限定ではない））による投与によって癌細胞に曝露され得る。
非経口投与様式としては、例えば、静脈内注入、動脈内注入、腹腔内注入、骨髄内注入、筋肉内注入、関節内注入、くも膜下腔内注入、および脳室内注入；皮下、性腺内、もしくは腫瘍内への針によるボーラス注入（ｎｅｅｄｌｅ ｂｏｌｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）；あるいは、適切なポンプ技術を用いた、長期継続する、拍動性もしくは計画的な潅流、または微量注入によって、組成物が投与される様式が挙げられる。腸内投与様式としては、例えば、経口（口腔および舌下を含む）および経直腸投与が挙げられる。経上皮（ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ）投与様式としては、例えば、経粘膜投与、および経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）投与が挙げられる。経粘膜投与としては、例えば、腸内投与が挙げられ、そして鼻腔内、吸入、および肺深部への投与、膣内投与、ならびに直腸投与が挙げられる。経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）投与としては、受動的もしくは能動的な、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌもしくはｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）様式が挙げられ、この様式としては、例えば、パッチ、およびイオン導入装置、ならびにペースト剤、軟膏（ｓａｌｖｅもしくはｏｉｎｔｍｅｎｔ）の局所適用が挙げられる。外科的技術としては、デポー（ｄｅｐｏｔ）（貯蔵）組成物、浸透圧ポンプなどの移植が挙げられる。
活性薬剤の単回投与もしくは複数回投与は、被験体によって要求されかつ許容される投与量および頻度に依存して投与され得る。いずれにしても、組成物は、被験体を有効に処置するのに十分な量の本発明の活性薬剤を提供するべきである。
重篤に血管新生化されないか、あるいは接着結合によって結合される細胞によって、および／または血流中に存在する高分子の侵入を減少させるかもしくは防止する能動輸送機構によって保護される、いくつかの領域があることが、当業者によって理解される。したがって、例えば、神経膠腫もしくは他の脳腫瘍を処置する治療剤の全身性投与は、くも膜下腔内への高分子の侵入に抵抗する血液脳関門によって制約され得る。これらの型の腫瘍において、治療組成物は、好ましくは直接的に、腫瘍部位に投与される。したがって、例えば、脳腫瘍は、治療組成物を腫瘍部位に直接的に（例えば、ボーラス注入、微量注入、もしくは外科的に移植されたカテーテルを通して）投与することによって処置され得る。
曝露は、癌細胞もしくは腫瘍を画像誘導手段を用いて（例えば、ＭＲＩに関しては、Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｖ．Ｍ．Ｒｕｎｇｅ（編）、Ｃ．Ｖ．Ｍｏｓｂｙ Ｃｏ．（１９８９）に記載されるように；例えば、放射線診断学および／もしくは放射線治療に関して、ＥＰ １８８，２５６；Ｋｏｚａｋら、ＴＩＢＴＥＣ Ｏｃｔｏｂｅｒ １９８６，２６２；Ｒａｄｉｏｔｒａｃｅｒｓ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．に記載されるように；ＰＥＴに関して、Ｐｏｓｉｔｒｏｎ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｒａｉｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ １９８３に記載されるように；および、Ｊ．Ｗ．Ｎｏｗｉｃｋｙら、”Ｍａｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ＵＶ−Ｍａｒｋｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ Ａｆｆｉｎｉｔｙ”、Ｊ．Ｔｕｍｏｒ Ｍａｒｋｅｒ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３１，４６３−４６５（１９８８）に記載されるように）可視化させることを含み得る。したがって、あらゆる種類の診断剤が、この組成物に組み込まれ得、これらは、患者への投与に続いて、組み込まれた薬剤を局所的もしくは全身的に送達する。
画像化剤は、上記に記載されるように、患者への組成物の投与に続いて腫瘍の処置をモニタリングできるように、使用され得る。例えば、これらは、代表的には、画像化手順の実施に先立って投与される。所望される場合、投与が画像化と同時であることもまた可能である（例えば、薬物動態学的研究において）。標的部位での局在化に最適な時間および最適な画像増強はまた、活性薬剤および／もしくは結合体および／もしくは組織および／もしくは画像化様式によって変動し、そしてまた、慣用的に決定可能である。代表的に、画像化は、その部位からの活性薬剤の有意なクリアランスに先立って起こり、この時間はまた、当業者によって慣用的に決定され得る。特定の実施形態において、以下でさらに議論されるように、活性薬剤はその標的部位へ迅速に局在化され得、次いで、必要であれば、迅速にそこから浄化されるので、活性薬剤もしくは結合体は、画像化手順の１５分前〜４時間前に投与される。
本発明の１つの実施形態において、曝露は、被験体組織中の細胞外ｐＨの変化を検出し得る診断手段を用いた被験体の調査、および投与の後に細胞外ｐＨの選択的上昇を示す被験体内の組織領域の同定を含む。この同定に基づいて、曝露は、固形腫瘍全体の中での細胞外ｐＨの選択的変化が達成されるまで、繰り返され得る。
本発明の１つの実施形態において、曝露は、直接的注入以外によって、活性薬剤組成物を非経口的に被験体へ投与することを含む。この活性薬剤は、上記ＩＩ章で議論されるように、誘導体化され得る。
先で議論されるように、ウレアーゼは尿素の加水分解を触媒し、カルバメートおよびアンモニアの生成をもたらす。水性環境において、カルバメートは迅速かつ自発的に分解し、第二のアンモニア分子および１つの二酸化炭素を生じる（図１）。ウレアーゼは多様な機能を有する。その主要な環境的役割は、生物に、外部および内部で生成された尿素を窒素源として使用させることである。植物において、ウレアーゼは、全身性の窒素輸送経路に関与し得、そしておそらく、毒性防御タンパク質として作用し得る。
ウレアーゼの基質は尿素であり、これは、肝臓で生成され、血流によって腎臓まで運ばれ、そして尿中に排出される。健康なヒトにおいては、尿素の血清濃度は代表的に１〜１０ｍＭであり、そして尿中の尿素レベルは０．５Ｍを超え得る（Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．， Ｉｎｃ．，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ，１９９９）。尿素はまた、主要なもしくは主要でない外分泌腺の分泌物中に、血清とほぼ同じ濃度で存在し、そのため循環する尿素の大部分は分泌系によって細胞表面上、もしくは組織滲出液中にトランスロケートされる（Ｂｕｒｎｅ，Ｒ．Ａ．およびＣｈｅｎ，Ｙ．Ｍ．，Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，２，２０００；５３３−５４２）。例えば、ヒト成人は、一日に、１〜１０ｍＭの尿素を含むほぼ１Ｌの唾液を分泌し、そして生成される全尿素のおよそ２０〜２５％は、尿中で体外に出ていくよりもむしろ、腸管に入る（Ｖｉｓｅｋ，Ｗ．Ｊ．，Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．３１（１９７２）１１７８−１１９３）。尿素の外分泌のための明白な能動流出機構はなく、そのため、非荷電の尿素分子は、細胞および上皮の接着結合を通して単に水に従うと考えられる。結論として、人体の細胞表面は、尿素を含む流体に浸されている（ＭｃＬｅａｎ Ｒ．Ｊ．Ｃ．ら、ＣＲＣ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６（１９８８）３７−７９）。
（Ｂ．二段階曝露および三段階曝露）
上記のように、本発明の１つの実施形態に従って、活性薬剤は標的化部分に直接的に結合体化される。あるいは、本発明の別の実施形態に従って、二段階アプローチが、腫瘍細胞への活性薬剤の送達に使用される。好ましくは、腫瘍細胞は、被験体に含まれる。二段階アプローチは、標的化部分の薬物動態から活性薬剤の薬物動態を分離するという利点を有する。標的化部分はこの標的部位へ付着することを許容され、一方で第一の結合パートナー（例えば、コイル形成ペプチド）へ結合体化される。標的部位への付着に続いて、実質的に全ての非標的性結合は、被験体の循環から排泄され得る。活性薬剤が、次いで、相補的な結合パートナーのメンバー（例えば、第二のコイル形成ペプチド）との結合体として投与され得る。
当該分野で公知のあらゆる二段階系（例えば、高親和性結合パートナー（例えば、アビジン、特異的抗体など）を有するビオチン、ハプテンなど）が使用され得る。例えば、米国特許第６，１９０，９２３号、同第６，１８７，２８５号、および同第６，１８３，７２１号を参照のこと。
好ましい二段階系としては、コイルドコイル系が挙げられる。したがって、上記に記載されるように二段階アプローチを利用する本発明の特定の実施形態において、標的化部分および第一のコイル形成ペプチド（選択された電荷によって、および第二の逆に荷電したコイル形成ペプチドと相互作用して安定したαへリックス状コイルドコイルヘテロ二量体を形成する能力によって、特徴付けられる）を含む第一の結合体が、腫瘍細胞に添加される。抗体標的化部分をコイル形成ペプチドに結合体化させる例示的な方法は、実施例４に記載される。
続いて、第二のコイル形成ペプチドをおよび活性薬剤を含む第二の結合体が、この細胞に投与される。好ましい活性薬剤は、ウレアーゼである。コイル形成ペプチドへのタチナタマメウレアーゼの結合に関する例示的な方法は、実施例２に記載される。
第一のコイル形成ペプチドおよび第二のコイル形成ペプチドが、αへリックス状コイルドコイルヘテロ二量体を形成するのに好適な状況下で一緒に混合される場合、これらは相互作用して２つのサブユニットのαへリックス状コイルドコイルヘテロ二量体複合体を形成する。αへリックス状コイルドコイル構造のペプチドは、各ペプチドの１次配列によって決定される特徴的な様式で、互いに相互作用する。αへリックスの３次構造は、１次配列上の７アミノ酸残基がαへリックスのおよそ２回転に相当するような構造である。したがって、αへリックス構造を生じる１次アミノ酸配列は、それぞれ７残基の単位（「ヘプタッド（ｈｅｐｔａｄ）」と称される）に分解され得る。ヘテロ二量体サブユニットペプチドは、直列する一連のヘプタッドから構成される。ヘプタッドの配列が特定のヘテロ二量体サブユニットペプチドにおいて繰り返される場合、このヘプタッドは、「ヘプタッド反復（ｈｅｐｔａｄ ｒｅｐｅａｔ）」、もしくは単純に「反復」と呼ばれ得る。
第一のコイル形成ペプチドおよび第二のコイル形成ペプチドは、平行配置もしくは逆平行配置のいずれかで、ヘテロ二量体コイルドコイルへリックス（コイルドコイルヘテロ二量体）へと集合し得る。平行配置においては、２つのヘテロ二量体サブユニットペプチドへリックスは、それらが同じ方向（アミノ末端からカルボキシル末端へ）を有するように並べられる。逆平行配置においては、このへリックスは、１方のへリックスのアミノ末端が、他方のヘリックスのカルボキシル末端と並べられるように配置されるか、もしくはその逆である。このようなヘテロ二量体サブユニットは、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９５／３１４８０「Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ」（１９９５年１１月２３日公開）（その全体が、本明細書中で参考として援用される）に記載される。さらなる例示的なサブユニットは、Ｋコイル（これは、その電荷が主にリジン残基によって提供される、正に電荷したサブユニットを指す）、およびＥコイル（これは、その電荷が主にグルタミン酸残基によって提供される、負に電荷したサブユニットを指す）と本明細書中で呼ばれる。上述の出願からの好ましい例は、配列番号１〜２を含む。
上記に参照される出願に提示される指針に従って設計されるヘテロ二量体サブユニットペプチドは、代表的に、逆平行方向に対して、平行方向で集合することへの優先性を示す。例えば、配列番号３および配列番号４によって同定される例示的なペプチドは、（ＷＯ９５／３１４８０出願で議論されたように）他のペプチド配列と同様に、平行配置のヘテロ二量体からを形成する。さらなる例示的なペプチドは、７アミノ酸（例えば、配列番号５の反復）から作られるＫコイルペプチドを含む。１つの実施形態において、このＫコイルは３５アミノ酸長である；これは正に荷電しており、溶液中で特定の構造を有さない。Ｅコイルは、７アミノ酸（例えば、配列番号６の反復）から作られるぺプチドである。１つの実施形態において、このＥコイルは３５アミノ酸長であり得る；これは負に荷電しており、溶液中で特定の構造を有さない。
記載されるように、ヘテロ二量体の２つのサブユニットペプチドの１つは、標的化部分を含み、他のペプチドは活性薬剤を含む。両方の場合において、このペプチドは、必要な付着機能を提供するように合成され得るか、もしくは合成後に誘導体化され得る。ペプチド合成の例示的な方法は、実施例１に記載される。一般に、ほとんどの結合体化は、いずれのコイル形成ペプチドのコイル形成活性も妨害せず、そのような結合体化は、結合体化された活性薬剤もしくは標的化部分の活性もまた妨害しない。
第一のコイル形成ペプチドの改変を考慮すると、そのペプチドは、そのＮ末端もしくはＣ末端のいずれかで合成され、標的化部分とペプチドのヘリックス形成部分との間のスペーサーとして機能し得るさらなる末端ペプチドを有し得る。標的化部分−コイル形成ペプチドおよび／もしくは活性薬剤−コイル形成ペプチドは、上記のように、固体状態（ｓｏｌｉｄ−ｓｔａｔｅ）、ＰＣＲ、もしくは組み換え法のいずれかによって、インビボもしくはインビトロで合成され得る。
固体状態法を通じて結合体を形成する場合、活性薬剤もしくは標的化部分は、好ましくは、Ｎ末端アミノ酸残基もしくはヘテロ二量体の露出された面に面する残基の１つに、共有結合性に結合される。好ましいカップリング基はシステイン残基のチオール基であり、これは標準的方法によって容易に改変される。他の有用なカップリング基としては、メチオニンのチオエステル、ヒスチジンのイミダゾリル基、アルギニンのグアニジニル基、チロシンのフェノール基、およびトリプトファンのインドリル基、が挙げられる。これらのカップリング基は、当業者に公知の反応条件を用いて誘導体化され得る。
活性薬剤の第二のコイル形成ペプチドを標的化部分の第一のコイル形成ペプチドに結合するため、２つのペプチドは、ヘテロ二量体形成に好適な条件下で接触される。コイルドコイルヘテロ二量体に好適な例示的媒体は、代表的に約６〜約８のｐＨおよび約５０ｍＭ〜約５００ｍＭの塩濃度を有する、生理学的に適合性の水溶液である。好ましくは、この塩濃度は、約１００ｍＭ〜約２００ｍＭである。例示的な媒体は、以下の組成を有する：５０ｍＭリン酸カリウム、１００ｍＭＫＣｌ、ｐＨ７。同様に有効な媒体は、例えば、リン酸ナトリウムでリン酸カリウムを、そしてＮａＣｌでＫＣｌを置き換えることによって作られ得る。ヘテロ二量体は、上記のｐＨおよび塩の範囲である媒体外の条件下で形成し得るが、上記の分子相互作用のうちのいくつか、およびホモ二量体に対するヘテロ二量体の相対的安定性は、上記に詳述される特徴とは異なり得る。例えば、ヘテロ二量体を安定化する傾向にあるイオン基間のイオン相互作用は、酸性ｐＨでの、例えばＧｌｕ側鎖のプロトン化に起因して、もしくは塩基性ｐＨでの、例えばＬｙｓ側鎖の脱プロトン化に起因して、低ｐＨ値もしくは高ｐＨ値において崩壊し得る。しかし、コイルドコイルへテロ二量体形成に対する低ｐＨ値および高ｐＨ値のこのような影響は、塩濃度を増加させることによって克服され得る。
塩濃度の増加は、安定化させるイオン引力を中和し得るか、または不安定化させるイオン反力を抑制し得る。特定の塩は、イオン相互作用を中和させることにおいて、より強力な有効性を有する。例えば、Ｋコイルペプチドの場合、１Ｍもしくはより高濃度のＣｌＯ４−アニオンが最大のαヘリックス構造を誘導するために必要とされ、他方、３Ｍもしくはより高濃度のＣｌ−イオンが同じ効果のために必要とされる。低ｐＨおよび高ｐＨにおけるコイルドコイル形成に対する高濃度塩の効果はまた、ヘリックス内イオン引力はヘリックス形成のために必須ではなく、むしろヘリックス内イオン引力は、コイルドコイルがホモ二量体に対してヘテロ二量体を形成する傾向にあるかどうかを制御するということを示す。第一のコイル形成ペプチド（例えば、Ｅコイルペプチド）および第二のコイル形成ペプチド（例えば、Ｋコイルペプチド）はまた、共有に係る米国特許出願第０９／６５４，１９１号（代理人整理番号＃４８００−００１５．３１）（本明細書中でその全体が参考として援用される）の実施例２に記載されるように、標的化部分および活性薬剤に結合体化され得る。米国特許第６，３００，１４１号（本明細書中でその全体が参考として明示的に援用される）もまた参照のこと。
本発明の１つの実施形態において、活性薬剤−コイルドコイルペプチドは、短い血清半減期を有し、そして腎臓経路を介して排泄される。したがって、この活性薬剤は、標的部位に付着するか、もしくは被験体から迅速に除去されるかのいずれかである。この活性薬剤の体内分布は、レシピエントの正常組織を望しくない曝露から保護するのを促進する。腎排泄を増強するため、腎排泄を促進する体内分布を指向する分子との結合が、利用され得る。必要に応じたのクリアランス工程の代替法は、被験体のネイティブなクリアランス機構が循環中の第一の結合体を実質的に除去することを可能にする、十分な経過時間を可能にすることである。
別の実施形態において、抗体ベースもしくは非抗体ベースの標的化部分は、リガンドもしくは抗リガンドを、調節されていない（ｕｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ）抗原を保有する標的部位に送達するために利用される。好ましくは、このような調節されていない（ｕｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ）抗原に対する天然の結合剤が、この目的で使用される。例えば、肝細胞腫もしくは骨髄腫のような疾患は、調節されていない（ｕｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ）ＩＬ−６レセプター（これに対して、ＩＬ−６が、これらの標的細胞型の急激な増殖に関してオートクライン部分もしくはパラクリン部分として作用する）によって、一般的に特徴付けられる。このような病気の処置に対して、ＩＬ−６は、したがって、標的化部分として利用され得る。例えば、Ｍｉｋｉ，Ｃ．ら（２００２）Ｃａｎｃｅｒ ９４（５）：１５８４−９２を参照のこと。
例えば、ＩＬ−６および第一のコイル形成ペプチドは、化学的手段を介して結合体化され得るか、もしくは組み換え分子として形成され得る。ＩＬ−６−第一コイル形成ペプチド結合体はレシピエントに投与され、そしてその結合体のＩＬ−６成分は、この結合体の局在をＩＬ−６レセプターに向ける。この局在化は、調節されていない（ｕｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ）ＩＬ−６レセプターを保有する部位に、優先的に生じる。標的部位局在化が生じた後、以下に記載されるような浄化剤が必要に応じて投与され、レシピエントのＩＬ−６−第一コイル形成ペプチド結合体の循環を実質的に浄化する。この目的のために適切な浄化剤は、例えば、ＩＬ−６レセプター−ＨＳＡ−ガラクトースもしくは抗ＩＬ−６抗体−ＨＳＡ−ガラクトースである。レシピエントの循環からのＩＬ−６の実質的な（例えば、５０％、７０％、好ましくは９０％の）クリアランスに十分な時間の後、活性薬剤−第二コイル形成ペプチド（例えば、ウレアーゼ−第二コイル形成ペプチド）が投与され、そしてＩＬ−６−第一コイル形成ペプチド結合体を介して標的部位に局在化する。
以下のＶＩＩ章により詳細に記載されるように、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、もしくはワクシニアウイルスに由来するか、または種々の細菌性プラスミドに由来する発現ベクターが、組み換えウレアーゼ分子の標的細胞手段への送達に使用され得る。当業者に公知の方法は、ウレアーゼを含む組み換えベクターを構築するために使用され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、およびＡｕｓｕｂｅｌらに記載される技術を参照のこと。あるいは、活性薬剤は、上記ＩＩ章に記載されるように、リポソームもしくはナノカプセルを利用して標的細胞に送達され得る。１つの実施形態において、本発明の方法は、被験体に組成物（活性薬剤、および細胞に対してこの組成物を標的化するのに有効な標的化部分を含有する）を加える工程を包含する。
（Ｃ．浄化剤）
上記で議論されるように、浄化剤が被験体に投与され得る。この浄化剤は、循環する第一の結合体を肝細胞レセプターに向け得、これによって、第二の結合体の投与に先立って、循環する第一の結合体の量を減少させる。
上記のように、腫瘍細胞が被験体（例えば、ヒト）内に含まれる場合、結合していない標的化部分結合体のインビボでの複合体化のための使用を促し、かつ結合していない標的化部分結合体の血液クリアランスを促進する物理的性質を有するタンパク質組成物もしくは非タンパク質組成物の浄化剤が有用であり得る。浄化剤は、好ましくは以下の特徴の１つ以上を示す：インビボでの標的化部分との迅速で、効率的な複合体化；続いて投与される活性薬剤に結合し得る標的化部分結合体の、血液からの迅速な浄化；大量の標的化部分結合体を浄化するかもしくは失活させる高い能力；および、低い免疫原性。
有用な浄化剤としては、ヘキソースベース部分、および非ヘキソースベース部分が挙げられる。ヘキソースベースの浄化剤は、アシュウェル（Ａｓｈｗｅｌｌ）レセプターもしくは他のレセプター（例えば、内皮細胞および／もしくは肝臓のクップファー細胞に関連するマンノース／Ｎ−アセチルグルコサミンレセプター、またはマンノース６−リン酸レセプター）によって認識される１つ以上のヘキソース（六炭糖部分）を組み込むように誘導体化された分子である。例示的なヘキソースとしては、ガラクトース、マンノース、マンノース６−リン酸、Ｎ−アセチルグルコサミンなどが挙げられる。アシュウェルレセプターによって認識される他の部分（ガラクトース、Ｎ−ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースのチオグリコシド、ならびに、一般に、Ｄ−ガラクトシドおよびグリコシド、が挙げられる）もまた使用され得る。 タンパク質とのガラクトースチオグリコシド結合体化が、例えば、Ｌｅｅら（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１５（１８）：３９５６もしくはＤｒａｎｔｚら（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１５（１８）：３９６３に記載されるように、達成され得る。
タンパク質型のガラクトースベース浄化剤としては、内在性の露出されたガラクトース残基を有するタンパク質か、またはこのようなグルコース残基を露出するかもしくは組み込むように誘導体化されたタンパク質が挙げられる。露出されたガラクトースは、特定のレセプター（アシュウェルレセプター）を通した肝臓内へのエンドサイトーシスによって浄化剤を迅速に浄化させる。これらのレセプターは、浄化剤に結合して肝細胞へのエンドサイトーシスを誘導し、このことは、リソソームとの融合をもたらし、そしてレセプターを細胞表面に戻して再利用させる。このクリアランス機構は、高い効率性、高い能力、および迅速な動態によって特徴付けられる。
タンパク質ベースで／ガラクトースを保有する種類の例示的な浄化剤は、ヒトα−１酸糖タンパク質のアシアロオロソムコイド誘導体である。アシアロオロソムコイドの血液からの迅速なクリアランスは、Ｇａｌｌｉら、Ｊ ｏｆ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ａｌｌｉｅｄ
Ｓｃｉ（１９８８）３２（２）：１１０−１６に記載される。ノイラミニダーゼによるオロソムコイドの処理は、シアル酸残基を除去し、これによって、ガラクトース残基を露出させる。さらなる誘導体化された浄化剤としては、例えば、ガラクトシル化されたアルブミン、ガラクトシル化されたＩｇＭ、ガラクトシル化されたＩｇＧ，アシアロハプトグロビン、アシアロフェチュイン、およびアシアロセルロプラスミンが挙げられる。
さらなる浄化剤は、米国特許第６，３５８，４９０号（２００２年３月１９日発行）、同第６，１７２，０４５号（２００１年１月９日発行）、および同第５，８８６，１４３号（１９９９年３月２３日発行）に記載される（これらは、本明細書中で参考として援用される）。
本発明において有用な浄化剤のさらなる種類としては、低分子（例えば、約５００ダルトン〜約１０，０００ダルトンの範囲）が挙げられる。この低分子は、ガラクトースによって誘導体化され得る。この低分子浄化剤は、好ましくは、（１）関連する結合体、コイル形成ペプチド、活性薬剤、および／もしくは標的化部分と迅速かつ効率的に複合体化し得；そして（２）このような複合体は、例えば肺および脾臓によって取り込まれる複合体へと凝集するのに対して、ガラクトースレセプター（肝臓特異的分解系）を介して血液から浄化され得る。加えて、ガラクトース媒介性の肝臓への取り込みの迅速な動態は、リガンド−抗リガンド相互作用の親和性と相まって、中程度の分子量、もしくは、さらには低い分子量のキャリアの使用を可能にする。
本発明の１つの実施形態において、タンパク質型およびポリマー型の、非ガラクトースベースの浄化剤が使用される。これらの浄化剤は、凝集媒介性機構を通して作用し得る。本発明のこの実施形態において、使用される浄化剤は、浄化剤の接近が除外されるべき標的器官に基づいて選択され得る。例えば、腫瘍細胞標的が含まれる場合、高分子量（例えば、約２００，０００ダルトン〜約１，０００，０００ダルトンの範囲）が有用であり得る。
別の種類の浄化剤としては、循環する活性薬剤／標的化部分結合体を除去しないが、代わりに、その活性薬剤、標的化部分、リポソーム、ウイルスベクター、および／もしくはそれらの他の部分上の関連部位をブロックすることによって、循環する結合体を不活性化させる薬剤が挙げられる。これらの「キャップ型」の浄化剤は、好ましくは小さい（例えば、５００〜１０，０００ダルトン）、高度に荷電した分子である（例えば、誘導体化された６，６’−［（３，３’−ジメチル［１，１’−ビフェニル］−４，４’−ジイル）ビス（アゾ）ビス［４−アミノ−５−ヒドロキシ−１，３−ナフタレンジスルホン酸］四ナトリウム塩）。
（Ｅ．投与量／投与）
本発明の方法において、投与のタイミングおよび順序を調節（ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ）するあらゆる効果的な投与レジメンが使用され得る。ヒト被験体に対する例示的な投与量レベルは、投与様式、腫瘍の範囲（サイズおよび分布）、患者のサイズ、およびウレアーゼ処置に対する癌の応答性に依存する。
ウレアーゼ組成物が腫瘍に直接注入される場合、例示的な用量は、０．１ウレアーゼ活性国際単位／ｍｍ３腫瘍〜１，０００ウレアーゼ活性国際単位／ｍｍ３腫瘍である。例えば、そして腫瘍におけるウレアーゼの比較的均一な分布の仮定が成り立つ場合、０．５国際単位と５国際単位との間の用量が適切であり得る。注入針の配置は、従来の画像指針技術（例えば、蛍光透視）によって導かれ、それによって、医師は、標的腫瘍に対するこの針の位置を見得る。このような指針手段としては、超音波、蛍光透視、ＣＴ、もしくはＭＲＩが挙げられ得る。
本発明の１つの局面によれば、投与されたウレアーゼ用量の有効性もしくは分布は、腫瘍へのウレアーゼの直接注入中もしくは注入後に、被験体の癌組織領域内でのｐＨの変化を検出し得る手段によって腫瘍組織をモニタリングすることによって、モニタリングされ得る。このような手段としては、腫瘍中に直接挿入され得るｐＨプローブか、または可視化手段（例えば、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、もしくは蛍光透視）が挙げられ得る。ＭＲＩによる調査は、付加的な画像化剤の非存在下で、ｐＨの関数としての組織の磁気特性の違いに単純に基づいて、実施され得る。ＣＴもしくは蛍光透視画像化は、その不透明度が組織媒体のｐＨによって影響される付加的なｐＨ感受性画像化剤を必要とし得る。このような画像化剤は、当業者に周知である。
任意のウレアーゼ注入の前に、腫瘍組織は、周囲の正常組織に対してより低いそのｐＨによって、可視化され得る。したがって、正常組織は約７．２の正常なｐＨを有し得、一方腫瘍組織はｐＨ単位で０．１〜０．４以上低くあり得る。つまり、任意のウレアーゼが注入される前に、腫瘍組織の範囲は、より低いそのｐＨによって定義され得る。ウレアーゼ投与に続いて、ウレアーゼを有する腫瘍領域のｐＨは上昇し始め、そして結果として得られた画像と以前の投与前画像とを比較することによって、同定され得る。
この様式で組織を調査することによって、ｐＨの変化の程度および罹患した組織の範囲がモニタリングされ得る。この調査に基づいて、医師は、さらなる組成物をその部位に投与し得、かつ／または腫瘍部位内の付加的な領域に組成物を投与し得る。この手順は、固形腫瘍の領域全体に渡って、所望の程度のｐＨ変化（例えば、０．２〜０．４ｐＨ単位）が達成されるまで繰り返され得る。
直接注入による投薬は、適切な間隔（例えば、毎週もしくは週に２回）によって、所望の終点まで、好ましくは、腫瘍質量の実質的なもしくは完全な後退が観察されるまで、繰り返され得る。処置の効力は、上記のように、処置の経過の間に処置される組織のｐＨの変化を可視化することによって、モニタリングされ得る。したがって、各付加的注入の前に、組織のｐＨは可視化されて現在存在する腫瘍の範囲を決定し得、その後、この組織のｐＨの変化は、新しい用量のウレアーゼ組成物のこの組織への投与をモニタリングするのに使用され得る。
ウレアーゼが、好ましくは直接注入以外の方法で非経口投与される場合、ウレアーゼの例示的用量は、１００国際単位／ｋｇウレアーゼ活性／ｋｇ被験体体重〜１００，０００国際単位／ｋｇウレアーゼ活性／ｋｇ被験体体重である。本明細書中に記載されるように、本発明のウレアーゼ組成物は、好ましくは、ウレアーゼを癌細胞（例えば、固形腫瘍部位）に対して標的化するため、もしくは腫瘍部位において選択的に、ウレアーゼを（例えば、リポソーム形態で）隔離するための標的化剤を含む。
上記のように、組織ｐＨの変化に感受性のある画像化技術は、投与された用量の有効性をモニタリングするために使用され得る。このような標的化には数時間以上かかり得るため、この方法は、上記のように、ウレアーゼ注入の前および投薬に続く数時間（例えば１２〜２４時間）腫瘍ｐＨをモニタリングして、腫瘍領域のｐＨの上昇によって証明されるように、腫瘍部位が適切に投薬されたことを確認することを含み得る。腫瘍領域のｐＨの上昇によって証明されるように、この調査の結果に依存して、この方法は、所望のｐＨの上昇（例えば、０．２〜０．４ｐＨ単位）が観察されるまで、付加的な投薬を指示し得る。一度この用量が確立された場合、患者は、定期的な（例えば、週に１回もしくは２回の）同様の容量のウレアーゼ組成物によって、腫瘍のサイズもしくは状態の変化が達成されるまで処置され得る。
両方の型の投与において、最終投薬レジメンは、良好な医学的診療の観点において、薬物の作用を改変する種々の因子（例えば、薬剤の比活性、疾患状態の重篤度、患者の応答性、患者の年齢、状態、体重、性別、および食事、何らかの感染の重篤度、など）を考慮して、担当医により決定される。考慮され得るさらなる因子としては、時間および投与頻度、薬物の組み合わせ、応答の感受性、および／もしくは治療への許容性／応答性が挙げられる。本明細書中で記述されるあらゆる処方物に関する処置に適切な投薬のさらなる微調整は、特に投薬情報および開示されるアッセイ、ならびに臨床試験で得られる薬物動態学的データを考慮して、当業者によって慣用的に行われる。適切な投薬は、体液中もしくは他の試料中の薬剤の濃度を用量反応データとともに決定するための、確立されたアッセイの使用を通じて確認され得る。
投薬頻度は、薬剤の薬物動態学的パラメータ、および投与経路に依存する。投薬量および投与は調整されて、十分なレベルの活性薬剤を提供し、かつ所望の効果を保つ。したがって薬学的組成物は、この薬剤の所望の最低レベルを保つために必要とされるように、単回投与、複数の別個の投与、継続注入、持続放出デポー、もしくはそれらの組み合わせとして投与され得る。
短時間作用性の薬学的組成物（すなわち、短い半減期）は、１日１回以上（例えば、１日２回、３回、もしくは４回）投与され得る。長時間作用性の薬学的組成物は、３〜４日毎、毎週、もしくは２週間に１回投与され得る。ポンプ（例えば、皮下ポンプ、腹腔内ポンプ、もしくは硬膜下ポンプ）が、継続注入のために好ましくあり得る。
薬学的に受容可能なキャリア中に、上記ＩＩ章に記載されるように処方される本発明の活性薬剤を含有する組成物が調製され得、適切な容器内に収められ得、そして指示される状態の処置のについてラベルされ得る。ラベルに示される状態としては、種々の型の癌の処置および診断が挙げられ得る（しかし、これらに限定されない）。キットもまた、以下に記載されるように意図され得、ここで、このキットは薬学的組成物の投薬形態、および医学的症状の処置におけるこの組成物の使用に関する説明を含む添付文書を含む。
一般的に、本発明に使用される活性薬剤は、有効量で被験体に投与される。一般的に、有効量とは、（１）処置することが求められる疾患の症状を減少させるか；または（２）処置することが求められる疾患を処置することに関する薬理学的変化を誘導するかのいずれかに有効な量である。癌に関しては、有効量とは：腫瘍のサイズを減少させるか；腫瘍の増殖を遅くするか；転移を防止もしくは阻害するか；または罹患した被験体の余命を増加させるのに有効な量を含み得る。この活性薬剤のマウスへの投与の例示的な方法は、以下の実施例６に記載される。
本発明の活性薬剤、浄化剤、および／もしくは画像化剤は、単回投与もしくは複数回投与で投与され得る。あるいは、この薬剤は長期に渡って静脈内に注入され得る。例えば、浄化剤は、継続的な様式で標的化部分を浄化するのに十分な期間、静脈内に投与され得る。
上記に記載される、本発明の、複数の標的化部分を投与する実施形態において、投与される各成分の用量は：担当医により、彼もしくは彼女の経験に従って決定され得る；レシピエントの状態の詳細によって決定され得る（例えば、標的部位（それらと関連する抗原を含む）の性質および位置は、標的化部分の選択および投与経路の決定に影響する）；そして、用いられる標的化部分の組み合わせによって決定され得る（例えば、抗体の性能は、抗原の密度およびこの抗原に対する抗体の親和性に関して変動し得る）。
（ＩＶ．抗癌薬を増強する方法）
上記のように、現在の化学療法における制限の１つは、標的腫瘍が、抗腫瘍化合物の作用に対して次第に抵抗性になることである。この抵抗性は、腫瘍細胞への化合物の取り込みが減少すること、取り込み部位での薬物の利用可能性の減少、もしくは細胞内代謝の増加に起因し得る。
多くの弱塩基性薬物に関して、つまり１つ以上のプロトン化し得るアミンを有する薬物に関して、薬物取り込み機構は、荷電しない形態で細胞膜を通過する受動拡散に関与し得る。したがって、細胞膜を通過する化合物の移動速度は、内部／外部ｐＨ勾配に依存する。細胞外ｐＨが、細胞内ｐＨ（例えば、約ｐＨ７．２）と同じかもしくはそれより大きい場合、化合物は荷電しない形態で、少なくともそれが細胞を出て行く頻度で、細胞内へと入る傾向にある。反対に、固形腫瘍におけるように、細胞外ｐＨが細胞内ｐＨに対して低下した場合、より低い外部ｐＨは、荷電した、プロトン化した形態の化合物を好み、そしてこれは、細胞への薬物の取り込みを阻害する。事実上、腫瘍における、より低い細胞外ｐＨの効果の１つは、腫瘍を弱塩基性の抗腫瘍化合物に対して保護することである。
その活性が、より低い細胞外ｐＨによって悪影響を及ぼされ得る、弱塩基性の抗腫瘍化合物としては、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ミトキサントロン、エピルビシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチンおよびビンクリスチン）、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミドおよび塩酸メクロレタミン）、および抗腫瘍性のプリン誘導体およびピリミジン誘導体が挙げられる。
本方法において、ウレアーゼもしくはウレアーゼ含有組成物は、腫瘍液の細胞外ｐＨを少なくとも０．１ｐＨ単位（例えば、０．１〜０．５ｐＨ単位以上）上昇させるのに有効な量で、固形腫瘍に投与される。特定の実施形態において、この液体の細胞外ｐＨは、少なくともｐＨ７．０、ｐＨ７．２もしくはそれより高くまで上昇する。
ウレアーゼは、上記ＩＩＩ章に記載されるように（例えば、被験体の腫瘍内に直接、もしくは直接注入以外によって非経口的に）投与され得る。また、上記に記載されるように、ウレアーゼの投与によってもたらされるｐＨの変化は、腫瘍ｐＨを可視化する画像化手段を用いて、もしくは腫瘍の直接的なｐＨ測定によって、腫瘍組織におけるｐＨの変化およびこれらの変化の範囲を決定することにより、モニタリングされ得る。
この方法において投与される用量は、注入量が、腫瘍ｐＨの所望の上昇をもたらすのに十分である限り、ウレアーゼが単独の抗腫瘍剤である場合に必要とされるよりも少量であり得る。あるいは、この方法は治療量のウレアーゼの投与、および治療量もしくは治療量以下の抗腫瘍化合物の投与を含み得る。理解され得るように、この方法は、与えられるべき抗腫瘍化合物の通常用量より低い量を可能にし得る、なぜなら、ウレアーゼがこの化合物の治療効果を増強するため、そしてウレアーゼがそれ自身で治療効果に寄与し得るためである。より少ない副作用でより大きな効力が生じる。
１つの実施形態において、化学実体はまた、上記に記載されるように、活性薬剤と関連して活性薬剤の送達を増強し得る。この実施形態において、この活性薬剤は、直接注入以外の任意の方法（例えば、非経口投与）によって投与され得る。
（Ｖ．抗癌処置をモニタリングする方法）
本方法はまた、なお別の局面において、被験体中の固形腫瘍の存在、サイズもしくは状態を評価することによって抗癌処置をモニタリングする方法を提供する。この方法は、上記に記載されるような活性薬剤（例えば、ウレアーゼ）を、固形腫瘍を有するか、もしくは有すると疑われる被験体に投与する工程を包含する。この活性薬剤は、この活性薬剤を被験体の固形腫瘍に局在化させるのに有効な状況下で投与される。
被験体は、上記に記載されるように、被験体組織における細胞外ｐＨの変化を検出し得る診断手段によって調査される。この診断手段は、好ましくは、上記ＩＩ章に記載されるように、活性薬剤の前に、活性薬剤の後に、もしくは活性薬剤と同時に投与され得る、腫瘍に局在化し得るｐＨ感受性診断剤（例えば、画像化剤、造影剤、もしくはシフト試薬）である。組織領域は、この投与に続いて細胞外ｐＨの上昇を示す被験体内で同定される。診断剤を同定し得るあらゆる手段が、この薬剤を検出するのに使用され得る（例えば、上記に記載されるように、ＭＲＩ、ＰＥＴ走査などである）。
１つの実施形態において、この方法は、抗腫瘍治療を行う被験体にウレアーゼを投与する工程を包含し、そして同定が、固形腫瘍におけるウレアーゼの局在化を検出するのに使用される。
この同定は、ウレアーゼ投与に応答する腫瘍のサイズおよび形状の変化をモニタリングするのに使用され得る。
ＰＥＴ走査を利用する１つの実施形態において、被験体は１３Ｎ標識されたアンモニアを投与される。この患者は、次いで、腫瘍部位に到達するのに有効な量のウレアーゼ投与される。ウレアーゼは尿素を加水分解し、非標識アンモニアを生成する。時間が経つと、標識されたアンモニアは希釈されるかもしくは置換され、結果として走査上で徐々に浄化する。
ＰＥＴ走査を利用する別の実施形態において、被験体は、１３Ｎ標識された尿素を投与される。この患者は、次いで、腫瘍部位に到達するのに有効な量のウレアーゼを投与される。ウレアーゼは標識された尿素を加水分解して標識アンモニアを生成し、これは走査で検出され得る。
（ＶＩ．キット）
さらに別の局面において、この発明は、本明細書中で記載される方法を用いて腫瘍細胞の増殖を阻害するためのキットを提供する。このキットは、１つ以上の活性薬剤を含む容器を含む。このキットは、この発明の方法の実行のため、本明細書中で記載される任意の他の成分をさらに含み得る。このような成分としては、薬学的成分、標的化部分、画像化剤、浄化剤、遺伝子治療成分、などが挙げられる（しかしこれらに限定されない）。
このキットは、必要に応じて、腫瘍細胞増殖を阻害するための活性薬剤の使用を開示する指示（すなわち、プロトコール）を含む使用説明資料を含み得る。したがって、１つの実施形態において、このキットは、被験体における癌の処置のため、活性薬剤（好ましくは酵素ウレアーゼ）を含有する薬学的組成物、および被験体へのこの組成物の投与を教示する使用説明資料を含む。１つの実施形態において、この使用説明資料は、この組成物が腫瘍内に直接注入によって投与される場合は、腫瘍のサイズに依存し、かつ０．１〜１００ウレアーゼ活性国際単位／ｍｍ３腫瘍の量で、被験体にウレアーゼ組成物を投与することを教示し、そしてこの組成物が腫瘍への直接注入以外によって被験体に非経口的に投与される場合は、１００〜１００，０００国際単位／ｋｇウレアーゼ活性国際単位／ｋｇ被験体体重の量で、被験体にウレアーゼを投与することを教示する。
別の実施形態において、この使用説明資料は、弱塩基性の抗腫瘍化合物（その有効性は、固形腫瘍における、細胞内でより高く／細胞外でより低いｐＨ勾配によって減少される）をまた受けている被験体に、固形腫瘍における細胞内でより高く／細胞外でより低いｐＨ勾配を減少もしくは逆転させるのに有効なウレアーゼ量で、ウレアーゼ組成物を投与することを教示する。
あるいは、この使用説明資料は、固形腫瘍を有するかもしくは有すると疑われる被験体に、この被験体の固形腫瘍にウレアーゼを局在化させるのに有効な状況下でウレアーゼ組成物を投与すること、被験体組織中の細胞外ｐＨの変化を検出し得る診断手段によっ、この被験体を調査すること、およびその投与に続いて細胞外ｐＨの上昇を示す被験体内の組織領域を同定すること、を教示する。
この使用説明資料は、代表的には、書面のもしくは印刷されている資料であるが、このようなものに限定されない。このような使用説明を保管し得、そしてそれをエンドユーザーに伝達し得る、あらゆる媒体が、本発明によって意図される。このような媒体としては、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ ＲＯＭ）、などが挙げられる（しかし、これに限定されない）。このような媒体は、このような使用説明資料を提供するインターネットサイトのアドレスを含み得る。
（ＶＩＩ．遺伝子／細胞治療）
本発明の別の局面において、哺乳動物被験体における癌細胞の増殖を阻害することにおける使用のため、遺伝子治療組成物もまた意図される。この遺伝子治療組成物は、被験体に投与される場合に、癌細胞を選択的にトランスフェクトするのに有効な標的化ベクターを含み、そしてトランスフェクトされた癌細胞中で活性薬剤（好ましくはウレアーゼ）をコードする核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ）を生成するのに有効な組み換え核酸配列を、このベクター中に保有する。
１つの実施形態において、腫瘍細胞は、活性薬剤をコードする異種核酸分子を発現する、操作された非腫瘍形成性細胞と接触させられる。非腫瘍形成性の操作された細胞としては（これに限定されないが）、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、骨細胞、ケラチノサイト、もしくは、腫瘍細胞に由来する、放射線処理された、操作された非腫瘍形成性細胞であり得る。
別の実施形態において、腫瘍細胞は、細胞標的化部分をコードする遺伝子構築物、ならびにウレアーゼタンパク質配列および分泌性リーダー配列をコードする異種核酸分子を用いてトランスフェクトされる。この遺伝子構築物は、腫瘍細胞内における結合体として、細胞標的化部分、ならびに異種ウレアーゼタンパク質配列および分泌性リーダー配列を発現し得、これによって、この結合体は、分泌性リーダー配列によって、細胞から出て行き、その後、細胞標的化部分によって認識される細胞表面抗原に選択的に局在化するように方向付けられる。
好ましくは、この細胞標的化部分は、細胞表面抗原に選択的に局在化し、そして細胞表面抗原は、少なくとも１種のヒト固形腫瘍に対して特異的である。この遺伝子構築物は、プロモーターとこの遺伝子構築物の発現を制御する遺伝的スイッチを含む制御エレメントとを含む、転写調節配列を含み得る。
本発明の１つの実施形態にしたがって、この遺伝子構築物は、ウイルスベクター中にパッケージングされる。腫瘍に対して標的化するため、種々のウイルスベクターが利用可能である。パルボウイルス（Ｐａｒｖｉｖｉｒｕｓ）は、腫瘍細胞に選択的に感染することが公知である。あるいは、ウイルスは、公開された方法に従って、腫瘍細胞中で選択的に複製するように設計され得る。例えば、Ｐｕｈｌｍａｎｎ Ｍら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，（１９９９）１０（４）：６４９−５７；Ｎｏｇｕｉｅｚ−Ｈｅｌｌｉｎ Ｐら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，（１９９６）９３（９）：４１７５−８０；およびＣｏｏｐｅｒ ＭＪ，Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ（１９９６）２３（１）１７２−８７を参照のこと。例えば、ウイルスは、チミジンキナーゼ酵素もしくはたポリメラーゼ酵素を含む、急激に分裂している細胞でのみウイルス複製を可能にする、変異したチミジンキナーゼ遺伝子もしくは変異したポリメラーゼ遺伝子を含むように改変され得る。あるいは、ウイルスは、応答性で、かつ所望のタンパク質もしくは腫瘍細胞のみでのウイルス複製に必須のタンパク質を発現する、腫瘍特異的制御エレメント（例えば、腫瘍特異的プロモーター領域）を含むように遺伝的に改変され得る。好ましくは、この遺伝子構築物はアデノウイルス内にパッケージングされる。
（Ａ．クローニング、遺伝子の導入および発現のためのベクター）
本発明の特定の実施形態の中では、ウレアーゼポリペプチド産物を発現するために発現ベクターが用いられ、次いでこの産物が精製され得る。他の実施形態において、この発現ベクターは、遺伝子治療に使用される。発現ベクターは、ベクター内に提供されるに適切なシグナル、種々の調節エレメント（例えば、宿主細胞中で目的の遺伝子の発現を推進する、ウイルスおよび／もしくは哺乳動物供給源由来のエンハンサー／プロモーター）を含み得る。宿主細胞中におけるメッセンジャーＲＮＡの安定性および翻訳可能性を最適化するよう設計されるエレメントがまた、定義される。産物を発現する、恒久的で安定な細胞クローンを確立するための多くの優性薬物選択マーカーの使用のための条件がまた（薬物選択マーカーの発現とポリペプチドの発現とを結び付けるエレメントのように）提供される。
（Ｂ．調節エレメント）
用語「発現構築物」とは、遺伝子産物をコードする核酸を含有する（その中で、この核酸がコードする配列の一部もしくは全部が転写され得る）、あらゆる型の遺伝子構築物を含むことを意味する。この転写物は、タンパク質へと翻訳され得るが、その必要はない。特定の実施形態において、発現は、遺伝子の転写とｍＲＮＡの遺伝子産物への翻訳との両方を含む。他の実施形態において、発現は、目的の遺伝子をコードする核酸の転写を含むのみである。
好ましい実施形態において、遺伝子産物をコードする核酸はプロモーターの転写制御下にある。「プロモーター」とは、遺伝子の特異的の転写を開始するのに必要とされる、細胞の合成機構もしくは導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列を指す。語句「転写制御下」は、プロモーターが核酸に対して、ＲＮＡポリメラーゼ開始および遺伝子の発現を制御するのに正しい位置にあり、かつ正しく配向していることを意味する。
用語、プロモーターは本明細書において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに対する開始部位の周りにクラスター形成される転写制御モジュールの群を指すのに使用される。プロモーターは別々の機能モジュールから構成され得、各モジュールは、およそ７ｂｐ〜２０ｂｐのＤＮＡからなり、そして、転写アクチベーターもしくはリプレッサータンパク質のための１つ以上の認識部位を含む。各プロモーターの少なくとも１つのモジュールは、ＲＮＡ合成のための開始部位を配置するように機能する。例示的なモジュールは、ＴＡＴＡボックスであるが、ＴＡＴＡボックスを欠くいくつかのプロモーター（例えば、哺乳動物ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼのプロモーター遺伝子、およびＳＶ４０後期遺伝子のプロモーター）においては、開始部位自体の上にある別のエレメントが開始位置を固定することを助ける。
標的細胞内の核酸の発現に指向し得るのであれば、目的の核酸配列の発現を制御するのに利用される特定のプロモーターが重要であるとは考えられない。したがって、ヒト細胞が標的される場合、ヒト細胞で発現し得るプロモーターの隣およびその制御下に、核酸のコード領域を配置することが好ましい。一般的に、このようなプロモーターは、ヒトもしくはウイルスプロモーターのいずれかを含み得る。
種々の実施形態において、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列、ラットインシュリンプロモーター、およびグリセルアルデヒド３リン酸ジヒドロゲナーゼは、目的のコード配列の高レベルの発現を得るために使用され得る。目的のコード配列を発現させるための、他のウイルスプロモーターもしくは哺乳動物細胞プロモーターもしくは細菌性ファージプロモーター（これらは当該分野で周知である）の使用も、同様に考えられる。
ｃＤＮＡインサートが利用される場合、遺伝子転写物の適切なポリアデニル化をもたらすため、ポリアデニル化シグナルを含むことを所望し得る。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の実行の成功に重要であるとは考えられないため、任意のこのような配列が利用され得る（例えば、ヒト成長ホルモンおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナル）。また、発現カセットの要素としてターミネーターが考えられる。これらの要素は、メッセージレベルを増強し、かつこのカセットから他の配列への読み取りを最小化するように作用し得る。
（Ｃ．選択マーカー）
本発明の特定の実施形態において、本発明の核酸構築物を含む細胞は、発現構築物中にマーカーを含むことによって、インビボもしくはインビトロで同定され得る。このようなマーカーは、細胞に同定可能な変化を与え、発現構築物を含む細胞の容易な同定を可能にする。代表的に、クローニングおよび形質転換体の選択における薬物選択マーカーの助けを含むもの（例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する耐性を与える遺伝子）は、有用な選択マーカーである。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）もしくはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼのような酵素が利用され得る。免疫性マーカーがまた利用され得る。選択マーカーのさらなる例は、当業者に周知である。例えば、Ｂａｕｍａｎｎ，Ｒ．Ｐ．ら（２００２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３２（５）：１０３０−３４を参照のこと。
（Ｄ．発現ベクターの送達）
発現ベクターが細胞に導入され得る多くの方法がある。本発明の特定の実施例において、発現構築物は、ウレアーゼ組成物を標的細胞に送達するために使用される、ウイルスもしくはウイルスゲノム由来の改変された構築物を含む。特定のウイルスの、レセプター媒介性エンドサイトーシスを介して細胞内に入る能力、宿主細胞ゲノムに一体化する能力、およびウイルス遺伝子を安定的かつ効率的に発現する能力は、それらのウイルスを、哺乳動物細胞への外来遺伝子の導入のための魅力的な候補とする。
インビボ送達のための好ましい方法の１つは、アデノウイルス発現ベクターの使用に関する。「アデノウイルス発現ベクター」とは、（ａ）この構築物のパッケージングを補助し、そして（ｂ）それらの中にクローン化されたポリヌクレオチドを発現する、ことに十分なアデノウイルス配列を含む、それらの構築物を含むことを意味する。これに関して、発現は、遺伝子産物が合成されることを必要としない。例えば、Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｂ．Ｇ．ら（２００２）「Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ」Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １５７５（１−３）：１−１４を参照のこと。
本発明の１つの実施形態において、発現ベクターは、アデノウイルスの遺伝的に操作された形態を含み得る。アデノウイルスの遺伝機構についての知識（３６ｋｂ、直鎖、二本鎖ＤＮＡウイルス）は、アデノウイルスＤＮＡの大部分を７ｋｂまでの外来配列で置換することを可能にする。アデノウイルスのＤＮＡは、潜在的遺伝毒性なしにエピソーム様式で複製され得るため、レトロウイルスと対照的に、宿主細胞のアデノウイルス感染は染色体の統合をもたらさない。また、アデノウイルスは構造的に安定で、かつ大量増幅後にゲノムの再構成は検出されない。
アデノウイルスは、その中程度のサイズのゲノムのため、操作が容易であるため、高い力価のため、広範な標的細胞範囲のため、および高い感染性のために、遺伝子導入ベクターとしての使用に特に適している。アデノウイルスベクターの発生および増殖は、ヘルパー細胞株に依存し得る。ヘルパー細胞株は、ヒト細胞（例えば、ヒト胚性腎細胞、筋肉細胞、造血細胞、もしくは他のヒト胚性間葉細胞もしくは上皮細胞）に由来され得る。あるいは、ヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスに寛容な他の哺乳動物種の細胞に由来され得る。このような細胞としては、例えばベロ細胞もしくは他のサル胚性間葉細胞もしくは上皮細胞が挙げられる。例示的なヘルパー細胞株は、２９３細胞株であり、これはヒト胚性腎細胞からＡｄ５ ＤＮＡフラグメントによって形質転換されており、そして恒常的にＥ１タンパク質を発現する。２９３細胞を培養する方法およびアデノウイルスを増殖させる方法は、記載されている。
さらなるウイルスベクターが、発現構築物として本発明において利用され得る。ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、（Ｗａｌｔｈｅｒ，Ｗ．およびＳｔｅｉｎ，Ｕ．（２０００）Ｄｒｕｇｓ ６０（２）：２４９−７１）、アデノ随伴ウイルス（Ｚｈａｏ，Ｎ．ら（２００１）Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９（３）：２２９−３７）およびヘルペスウイルス（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｅ．Ａ．ら（２００１） Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ５３（２）：１５５−７０））由来のベクターが利用され得る。本発明に使用され得るさらなる腫瘍特異性、複製選択性ウイルスは、Ｈａｗｋｉｎｓ，Ｌ．Ｋ．ら（２００２）Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ ３（１）：１７−２６に概説される。
培養された哺乳動物細胞への発現構築物の導入のための、いくつかの非ウイルス法がまた、本発明によって意図される。これらは、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン、電気穿孔法、直接的微量注入、ＤＮＡを取り込んだリポソーム、およびリポフェクタミン−ＤＮＡ複合体、細胞の超音波処理、高速微量発射体（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）を用いた遺伝子銃（ｇｅｎｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、およびレセプター媒介性トランスフェクションである。
一旦発現構築物が細胞内に送達された場合、目的の遺伝子（例えば、ウレアーゼ遺伝子）をコードする核酸は、異なる部位に配置されて発現し得る。特定の実施形態において、活性薬剤をコードする核酸は、細胞のゲノムに安定に組み込まれ得る。この組み込みは、相同組み換えを介した同種の配置および配向（遺伝子置換）であり得るか、またはそれはランダムに、非特異的位置に組み込まれ得る（遺伝子増大）。なおさらなる実施形態において、核酸は、別個のＤＮＡのエピソームセグメントとして、細胞内に安定に維持され得る。このような核酸セグメントもしくは「エピソーム」は、宿主細胞周期と独立しているかもしくは宿主細胞周期と同期した維持および複製を可能にするのに十分な配列をコードする。発現構築物の送達の方法、および核酸がとどまる細胞内におけるその配置の方法は、利用される発現構築物の型に依存する。
本発明のなお別の実施形態において、発現構築物は単純に裸の（ｎａｋｅｄ）組み換えＤＮＡもしくはプラスミドからなり得る。この構築物の導入は、物理的もしくは化学的に細胞膜を透過させる上述の方法のいずれかによって実施され得る。これは、特にインビトロでの導入に適用可能であるが、インビボでの使用にも適用され得る。
裸のＤＮＡ発現構築物を細胞に導入するための、本発明のさらに別の実施形態においては、微粒子銃を含み得る。この方法は、ＤＮＡコーティングされた微量発射体を高速に加速し得、それらを細胞膜に貫通させて、細胞を殺すことなく細胞内に入れることを可能にする。小さな微粒子を加速させるためのいくつかの装置が、これに関して有用である。このような装置の１つは、高電圧の放出によって電流を発生させ、これは次に推進力をもたらす。使用される微量発射体は、生物学的に不活性な物質（例えば、タングステンビーズもしくは金ビーズ）からなり得る。
１つの実施形態において、このような発現構築物はリポソーム、脂質複合体、ナノカプセル、もしくは上記ＩＩ章で開示された方法のうちの１つ以上を用いた他の処方物に取り込まれ得る。リポフェクタミン−ＤＮＡ複合体もまた、企図される。
本発明の特定の実施形態において、リポソームは、血球凝集ウイルス（ＨＶＪ）と複合体化され得る。他の実施形態において、リポソームは、核の非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）と複合体化され得るか、またはそれと組み合わせて利用され得る。なおさらなる実施形態において、リポソームはＨＶＪおよびＨＭＧ−１の両方と複合体化され得るか、またはそれと組み合わせて利用され得る。
特定の遺伝子をコードする核酸を細胞に送達するのに利用され得る、他の発現構築物は、レセプター媒介性送達ビヒクルである。これらは、ほぼ全ての真核生物細胞におけるレセプター媒介性エンドサイトーシスによる、高分子の選択的取り込みを利用する。種々のレセプターの細胞型特異性の分布のため、この送達は高度に特異的であり得る。
レセプター媒介性遺伝子標的化ビヒクルは、一般的に２つの成分からなる：細胞レセプター特異的リガンドおよびＤＮＡ結合剤である。いくつかのリガンドはレセプター媒介性遺伝子導入に使用されている（例えば、アシアロオロソムコイドおよびトランスフェリン）。加えて、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）もまた、扁平上皮癌細胞に遺伝子を送達するのに使用されている（欧州特許出願公開ＥＰ ０３６０２５７、これは、本明細書中で参考として特に援用される）。
他の実施形態において、送達ビヒクルは、リガンドおよびリポソームを含み得る。したがって、特定の遺伝子をコードする核酸もまた、ある細胞型（例えば、肺細胞、上皮細胞、もしくは腫瘍細胞）内へ、任意の数のレセプター−リガンド系によって、リポソームを用いてかもしくは用いずに、特異的に送達され得る可能性がある。例えば、ＥＧＦもしくは他の低分子は、ＥＧＦレセプターのアップレギュレーションを示す多くの腫瘍細胞において、遺伝子をコードする核酸の媒介性送達のために、レセプターとして使用され得る。（Ｂａｓｅｌａ，Ｊ．（２００２）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２０（９）：２２１７−９）。また、ＣＤ５（ＣＬＬ）、ＣＤ２２（リンパ腫）、ＣＤ２５（Ｔ細胞白血病）およびＭＡＡ（黒色腫）に対する抗体が、標的化部分として同様に使用され得る。
特定の実施形態において、遺伝子移入は、エキソビボ条件下でより容易に実施され得る。エキソビボ遺伝子治療とは、動物から細胞の単離、この細胞へのインビトロでの核酸の送達、そしてこの改変した細胞を動物に戻すこと、を指す。これは、動物からの組織／器官の外科的除去、もしくは細胞および組織の初代培養に関し得る。例えば、Ａｈｏｎｅｎ，Ｍ．ら（２００２）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ５（６）：７０５−１５およびＫａｗａｉ，Ｋ．ら（２０００）Ｍｏｌ Ｕｒｏｌ ４（２）：４３−６；米国特許第６，３９５，７１２号、同第６，１４９，９０４号、および同第６，４１０，０２９号を参照のこと（これらはそれぞれ、本明細書中で参考として援用される）。
初代哺乳動物細胞培養は、種々の方法で調製され得る。インビトロおよび発現構築物と接触した状態で細胞が生存可能に保たれるように、この細胞は、代表的に正しい比率の酸素および二酸化炭素、ならびに栄養分との接触を保ち、かつ微生物のコンタミネーションから保護される。細胞培養技術は、当業者に周知である。
有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ベロ細胞およびＨｅｌａ細胞、ならびにチャイニーズハムスター卵巣の細胞株、Ｗ１３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ−７細胞、２９３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＲＩＮ細胞、およびＭＤＣＫ細胞である。加えて、宿主細胞系統は、挿入された配列の発現を調節（ｍｏｄｕｌａｔｅ）するように、もしくは所望の様式で遺伝子産物を改変および処理するように、選択され得る。タンパク質産物のこのような改変（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は、このタンパク質の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳後のプロセシングおよび改変に関して、特徴的および特異的機構を有する。適切な細胞株もしくは宿主系は、発現される外来タンパク質の正しい改変およびプロセシングを保証するように、選択され得る。
多くの選択系が使用され、これらとしては、それぞれｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞、もしくはａｐｒｔ細胞における、ＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が挙げられる（しかし、これに限定されない）。また、抗代謝産物抵抗性が、ｇｐｔ（ミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）に対する抵抗性を与える）；ｎｅｏ（アミノグリコシドＧ４１８に対する抵抗性を与える）；および、ｈｙｇｒｏ（ハイグロマイシンに対する抵抗性を与える）、による選択の基本として使用され得る。
上記から、どのように種々の対象物と本発明の特色とが対応されたかが見られ得る。
（表２）
（本発明の補助として提供される配列）
Figure 2013213055
Figure 2013213055
（ＩＶ．実施例）
以下の実施例は、本明細書中に記載される本発明をさらに説明し、かつ本発明の範囲を限定することを決して意図しない。
（実施例１）
（Ａ１．ペプチド合成）
従来のＮ−ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）化学を用いた固相合成方法論によって、ペプチドを調製した。ペプチドは、１０％アニソールおよび２％の１，２−エタンジチオールを含有するフッ化水素（２０ｍｌ／ｇ樹脂）との４℃、１．５時間の反応によって樹脂から切断した。粗製ペプチドは、冷やしたエーテルによって洗浄し、氷酢酸によって樹脂から抽出し、そして凍結乾燥した。合成ペプチドは、Ｚｏｒｂａｘの半分取用（ｓｅｍｉ−ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）Ｃ−８カラム（２５０×１０ｍｍ Ｉ．Ｄ．、粒子サイズ６．５μｍ、孔径３００Å）上で、線形ＡＢ勾配（０．２％Ｂ／分〜１．０％Ｂ／分の範囲）を用いて、流速２ｍｌ／分で、逆相ＨＰＬＣによって精製した。ここで、溶媒Ａは、水性の０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）であり、溶媒Ｂは、０．０５％ＴＦＡアセトニトリルである。精製されたぺプチドの均質性は、分析用逆相ＨＰＬＣ、アミノ酸分析、およびＭＡＬＤＩ質量分析法によって検証した。
（Ａ２．ウレアーゼのアフィニティー精製）
ヒドロキシ尿素とエポキシで活性化されたＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とを反応させることによって、アフィニティーカラムを調製した。残りの活性基は、１Ｍエタノールアミンを用いてブロックした。
精製は以下のように行った。ＰＥＢ（０．０２Ｍリン酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ β−メルカプトエタノール、ｐＨ７．０）によって、カラムを平衡化した。粗製ウレアーゼ試料（図２）を適用した（ＰＥＢ中に０．５ｍｇ／ｍｌ、全体で８ｍｌ）。１５ｍｌのＰＢ（０．０２Ｍリン酸、１ｍＭ β−メルカプトエタノール、ｐＨ７．０）によって、カラムを洗浄した。次いでそれぞれ８ｍｌの以下によって、カラムを洗浄した：ＰＢ＋０．１Ｍ ＮａＣｌ、ＰＢ＋０．５Ｍ ＮａＣｌ、およびＰＢ＋０．９５Ｍ ＮａＣｌ。ウレアーゼを、８ｍｌのＥＢ（０．２Ｍリン酸、１ｍＭ β−メルカプトエタノール、ｐＨ４．６）によって溶出し、１ｍｌの分画を集めた。分画は、２８０ｎｍでのＯＤを読むこと、およびＨＰＬＣ（Ｃ５カラム）分析によってチェックした。カラムは、０．０１％ ＮａＮ３中に保存した。
（Ｂ．実施例２−ウレアーゼ−コイル結合体の調製）
１０ｍｇのタチナタマメウレアーゼを３００μＬの２ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２に溶解し、ウレアーゼコイル結合体を調製した。次いで、５ｍｇの二官能性架橋剤スルホ−ＭＢＳをこの溶液に加え、そしてこの混合物を、室温で１時間、ゆっくりと攪拌した。この混合物は、次いで２ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に対して透析し、過剰なリンカーを除去した。
Ｃ末端のシス（ｃｙｓ）リンカーを有するＫコイルもしくはＥコイル（１．５ｍｇ）を、リンカーで改変されたウレアーゼ溶液に加え、室温で３時間、ゆっくりと攪拌した。このコイルウレアーゼ結合体を、新しい２ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に対して一晩透析し、結合されていないコイルペプチドを除去した。透析されたウレアーゼ結合体を凍結乾燥し、次いで１ｍＬの２ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解し、そしてさらなる精製のため、ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ７５カラムに適用した。コイルウレアーゼ結合体を含む空隙容量分画を集め、凍結乾燥して４℃で保存した。
標準的手順を用いたアミノ酸分析およびＭＡＬＤＩ質量分析法によって、この結合体の純度および調製物中のコイル対ウレアーゼの比率を決定した。
（Ｃ．実施例３−ウレアーゼおよびウレアーゼ結合体の活性アッセイ）
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）との共役酵素反応において、ウレアーゼまたはウレアーゼ結合体の酵素活性を行った。３４０ｎｍでの吸光度の変化を測定することによって、酸化されたＮＡＤＨの量を決定した（Ｋａｌｔｗａｓｓｅｒ，Ｈ．およびＳｃｈｌｅｇｅｌ，Ｈ．Ｇ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６，１３２，１９６６）。使用した試薬は以下であった：０．１０Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．６）；１．８０Ｍ 尿素（リン酸緩衝液中に調製）；０．０２５Ｍ アデノシン−５’−二リン酸（ＡＤＰ）（１０．７ｍｇ／ｍｌ）（緩衝液中）；０．００８Ｍ ＮＡＤＨ（５ｍｇ／ｍｌ）（リン酸緩衝液中）；０．０２５Ｍ α−ケトグルタレート（３．７ｍｇ／ｍｌ）（リン酸緩衝液中）；グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）溶液（アンモニウムイオンを含まない）；５０Ｕ／ｍｌ リン酸緩衝液（アッセイ前に新たに調製）。リン酸緩衝液に溶解することによってウレアーゼ溶液を調製し、０．１〜０．５Ｕ／ｍｌの濃度を得た。この溶液は、アッセイ前に新たに調製した。
以下の２ｍＬ：リン酸緩衝液２．４０ｍｌ、各０．１０ｍｌの尿素、ＡＤＰ、ＮＡＤＨ、ＧＬＤＨ、およびα−ケトグルタル酸、をキュベットに加えることによって、アッセイを開始した。分光光度計は、３４０ｎｍおよび２５℃に調整した。添加成分を入れたキュベットを、２５℃で５分間分光光度計に配置して、温度平衡に達せさせ、次いで、もし行うとすれば３４０ｎｍで、ブランク比を確立した。
酵素反応を開始するため、０．１ｍｌのウレアーゼ溶液をキュベットに加えた。３４０ｎｍでの吸光度の変化を１５分間記録した。酵素活性と１分当りの３４０ｎｍでの吸光度の減少とを相関させた。
（Ｄ．実施例４−コイル抗体結合体の調製）
材料としては、以下が挙げられる：（１）ラット抗ｈＥＧＦＲ ＩｇＧ２ａ（Ｓｅｒｏｔｅｃ）、２００ｕｇ／０．２ｍｌ（すなわち、１ｍｇ／ｍｌ）；（２）Ｅコイル（Ｎ−リンカー）；（３）ｍ−過ヨウ素酸塩ナトリウム（Ｐｉｅｒｃｅ）；および（４）二官能性架橋剤、ＫＭＵＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）。
以下の工程によって、Ｅコイルの機能改変を行った：
ａ．ＤＭＳＯにＫＭＵＨを溶解し１０ｍｇ／ｍｌ溶液（２５０μｌのＤＭＳＯ中に２．５ｍｇ）を調製した。
ｂ．ＰＢにＥコイルを溶解（３９２μｌの１０ｍＭ ＰＢ（ｐＨ７．４）＋４μｌのＴＣＥＰ（１００ｍＭ保存液）中に約２ｍｇ）。
ｃ．１μｌのＴｒｉｓ（２Ｍ）を加え、Ｅコイル溶液を中和。
ｄ．Ｅコイル溶液をＫＭＵＨ溶液に加え、室温で２時間インキュベート。
ｅ．溶液を４℃で一晩保存。
ｆ．翌朝、１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、不溶性の沈殿を除去。
ｇ．Ｃ８ ＨＰＬＣカラム（０．０５％ＴＦＡを含む０％〜２０％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ）上でＫＭＵＨおよびＤＭＳＯを除去し、全てのペプチド分画を回収（７５％アセトニトリル）。
ｇ．ペプチド分画を凍結乾燥し、ＭＳによってチェック。
抗体を、以下の工程によって酸化した：
ａ．抗体各２ｍｇに対して、アンバーのバイアル中で、２０ｍｇの過ヨウ素酸塩を秤量。
ｂ．バイアルに、２ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．２）および２ｍｌの保存抗体を加え（最終抗体濃度は、０．５ｍｇ／ｍｌ）、過ヨウ素酸塩粉末が溶解するまで緩やかに攪拌。
ｃ．室温で、３０分間インキュベート。
ｄ．１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に対して３回透析し、過ヨウ素酸塩を除去。
以下の工程によって、結合体化を行った：
ａ．Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ Ｆｉｌｔｅｒ ｕｎｉｔｓ（３０ｋ ＭＷｃ／ｏ）を用いて酸化抗体を濃縮（４ｍｌ中に約２ｍｇ）。
ｂ．官能性を与えたＥコイル溶液（４μｇ／μｌ ｄｄＨ２Ｏ）７５μｌを、酸化抗体溶液（酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）中に約０．７５ｍｇの抗体を含有）の半量に加えた。
ｃ．室温で２時間、振とうしながらインキュベート。
ｄ．Ｇプロテインカラムを用いて抗体混合物を精製（図４を参照）。
ｅ．（アフィニティー精製の前後で）試料を比較および分析。
（Ｅ．実施例５−コイルウレアーゼ結合体およびコイル抗体結合体のＢｉａｃｏｒｅ分析）
システイン含有Ｋコイルペプチドもしくはシステイン含有Ｅコイルペプチドを、Ｐｉｏｎｅｅｒ Ｂ１バイオセンサーチップと、製造元が示唆するプロトコールに従って共有結合させた。簡単に言えば、このセンサーチップのデキストラン表面を、初めにＮＨＳ／ＥＤＣ（１５μｌ）で活性化し、続いてＰＤＥＡ（２０μｌ）を加えた。Ｋコイル（もしくはＥコイル）（１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．３）中に５０μｇ／ｍｌ）を注入し、およそ２００〜４００ＲＵの表面密度を与えるように反応させた。次いで、残った活性基は脱活性化溶液（５０ｍＭシステイン、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍフォルメート（ｐＨ４．３））の注入（１０μＬ）によってブロックした。
ＢＩＡｃｏｒｅ３０００機器上で、２５℃で、動態学的実験を実施した。各バイオセンサーの作動は、以下からなる：（１）６００秒の試料注入相（コイルウレアーゼもしくはコイル抗体）、（２）６００秒の解離層、および（３）２×１５秒の再生層（６Ｍ塩酸グアニジン）。このサイクルを通じて５μｌ／分の流速を維持した。ＰＢＳを緩衝液として使用した。ＳＰＲシグナルを、０．５秒毎にサンプリングしながらリアルタイムで記録し、ＲＵ対時間としてプロットした（センサーグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ））。対応するブランク細胞表面への試料注入サイクルを引き算することによって、得られた各センサーグラムを全体的な（ｂｕｌｋ）屈折率の変化について補正した。
（Ｆ．実施例６−動物研究）
ヒト乳腺癌異種移植片を有する胸腺欠損ｎｕ／ｎｕ／雌マウスを試験に使用した。選択された動物は、一般的に大体５〜７週齢で、処置開始時の体重はおよそ１５〜２８ｇの範囲であった。
ＭＣＦ細胞を異種移植片の生成に使用した。この細胞を、５０００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、２００ｍＭのＬ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、ビタミン、および１０％ＦＢＳを補充したＭＥＭ培地中で増殖させた；細胞インキュベーターは、５％ＣＯ２、３７．５℃、および湿度８０％に維持した。この細胞を０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシン−０．０３％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡ溶液を用いて収集した。およそ１×１０６細胞（１００μＬ中）を、各マウスの右腹側に皮下注入した。
約６日間〜８日間腫瘍の増殖を進行させ、腫瘍のサイズが少なくとも直径２〜４ｍｍに達するようにさせた。腫瘍内注入を介して投薬を投与した。各動物への用量は５０μＬであった。各固形腫瘍に、「扇状の様式（ｆａｎｎｉｎｇ ｆａｓｈｉｏｎ）」で、所定用量の試験物を注入した。腫瘍容量を外部カリパー（ｃａｌｉｐｅｒ）測定によって取得した。体重は、試験の開始時および屠殺時に取得した。
結果は、下記の表３に示すように、腫瘍が処置後２４時間で認知不可能であったことを示す。
（表３）
（マウス腫瘍の処置の成功）
Figure 2013213055
本発明は特定の実施形態に関して記載されたが、本発明から逸脱することなく種々の変化および改変がされ得ることは、当業者にとって明白である。
（配列表）
Figure 2013213055
Figure 2013213055
Figure 2013213055
Figure 2013213055

Claims (1)

  1. 明細書に記載の発明。
JP2013147555A 2002-07-18 2013-07-16 癌細胞増殖を阻害するためのウレアーゼの使用 Withdrawn JP2013213055A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US39724402P 2002-07-18 2002-07-18
US60/397,244 2002-07-18

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2011161332A Division JP5850561B2 (ja) 2002-07-18 2011-07-22 癌細胞増殖を阻害するためのウレアーゼの使用

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2015199988A Division JP2016014066A (ja) 2002-07-18 2015-10-08 癌細胞増殖を阻害するためのウレアーゼの使用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2013213055A true JP2013213055A (ja) 2013-10-17
JP2013213055A5 JP2013213055A5 (ja) 2014-05-08

Family

ID=30771022

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2004522053A Withdrawn JP2006501196A (ja) 2002-07-18 2003-07-16 癌細胞増殖を阻害するためのウレアーゼの使用
JP2011161332A Expired - Fee Related JP5850561B2 (ja) 2002-07-18 2011-07-22 癌細胞増殖を阻害するためのウレアーゼの使用
JP2013147555A Withdrawn JP2013213055A (ja) 2002-07-18 2013-07-16 癌細胞増殖を阻害するためのウレアーゼの使用
JP2015199988A Withdrawn JP2016014066A (ja) 2002-07-18 2015-10-08 癌細胞増殖を阻害するためのウレアーゼの使用

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2004522053A Withdrawn JP2006501196A (ja) 2002-07-18 2003-07-16 癌細胞増殖を阻害するためのウレアーゼの使用
JP2011161332A Expired - Fee Related JP5850561B2 (ja) 2002-07-18 2011-07-22 癌細胞増殖を阻害するためのウレアーゼの使用

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2015199988A Withdrawn JP2016014066A (ja) 2002-07-18 2015-10-08 癌細胞増殖を阻害するためのウレアーゼの使用

Country Status (23)

Country Link
US (1) US7211250B2 (ja)
EP (2) EP2324846B1 (ja)
JP (4) JP2006501196A (ja)
KR (2) KR101352826B1 (ja)
CN (1) CN100577203C (ja)
AU (1) AU2003250658B2 (ja)
BR (1) BR0312664A (ja)
CA (1) CA2492472C (ja)
DK (1) DK1530482T3 (ja)
ES (1) ES2443416T3 (ja)
HK (2) HK1076739A1 (ja)
IL (1) IL166249A (ja)
MX (1) MXPA05000778A (ja)
NO (1) NO336811B1 (ja)
NZ (1) NZ538284A (ja)
PL (1) PL217626B1 (ja)
PT (1) PT1530482E (ja)
RU (1) RU2326691C2 (ja)
SI (1) SI1530482T1 (ja)
TR (1) TR200500108T2 (ja)
UA (1) UA81634C2 (ja)
WO (1) WO2004009112A1 (ja)
ZA (1) ZA200500423B (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115666571A (zh) * 2020-05-20 2023-01-31 美德阿利克斯株式会社 含有阿扑吗啡的经皮吸收型制剂

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7264800B2 (en) * 2002-07-18 2007-09-04 Helix Biopharma Corporation Method and composition for inhibiting cancer cell growth
WO2004023981A2 (en) * 2002-09-11 2004-03-25 Duke University Methods and compositions for blood pool identification, drug distribution quantification and drug release verification
US7769423B2 (en) * 2002-09-11 2010-08-03 Duke University MRI imageable liposomes for the evaluation of treatment efficacy, thermal distribution, and demonstration of dose painting
US20070104732A1 (en) * 2003-10-24 2007-05-10 Bernard Massie Ligand-pseudoreceptor system for generation of adenoviral vectors with altered tropism
IL182956A0 (en) * 2007-05-03 2008-01-20 Yeda Res & Dev Glycan modified soluble receptors and binding proteins and their use
US8892184B2 (en) 2010-10-18 2014-11-18 Siemens Medical Solutions Usa, Inc. Systems and methods for reducing interference in a dual modality imaging system
CA2908475C (en) * 2013-04-08 2020-09-08 Helix Biopharma Corp. Use of antibody-urease conjugates for diagnostic and therapeutic purposes
US11931422B2 (en) 2015-01-23 2024-03-19 Helix Biopharma Corporation Antibody-urease conjugates for therapeutic purposes
CA3045327A1 (en) 2016-09-24 2018-03-29 Helix Biopharma Corp. Restoring function of tumour acidified t cells
US20180243437A1 (en) * 2017-01-05 2018-08-30 Heman Lap Man CHAO Anti-vegfr-2 urease conjugates
EP4166147A4 (en) * 2020-06-15 2024-08-07 Kortuc Inc SENSITIZER FOR CANCER TREATMENT
CN113433087A (zh) * 2021-06-22 2021-09-24 中南大学 一种尿素浓度快速检测方法及检测传感器和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH1017492A (ja) * 1996-07-02 1998-01-20 Fuji Yakuhin Kogyo Kk 腫瘍細胞増殖抑制剤
WO2000023476A1 (fr) * 1998-10-16 2000-04-27 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Peptides specifiques pour la neovascularisation
WO2002015925A1 (fr) * 2000-08-22 2002-02-28 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Technique de regulation de l'apoptose et polypeptide de regulation d'apoptose

Family Cites Families (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2965725D1 (en) 1978-07-19 1983-07-28 Patrick Couvreur Biodegradable nanoparticles, pharmaceutical compositions containing them and process for their preparation
US4489055A (en) 1978-07-19 1984-12-18 N.V. Sopar S.A. Process for preparing biodegradable submicroscopic particles containing a biologically active substance and their use
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
FR2504010B1 (fr) 1981-04-15 1985-10-25 Sanofi Sa Medicaments anticancereux contenant la chaine a de la ricine associee a un anticorps antimelanome et procede pour leur preparation
FR2504408B1 (fr) 1981-04-24 1986-02-14 Couvreur Patrick Procede de preparation de particules submicroscopiques, particules ainsi obtenues et compositions pharmaceutiques les contenant
US4671958A (en) 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
US4589071A (en) 1982-04-19 1986-05-13 Nissan Motor Co., Ltd. Method and apparatus for controlling reduction ratio of continuously variable transmission with acceleration compensation
US4824783A (en) 1983-12-20 1989-04-25 Enichem S.P.A. Oxidized sulfur derivatives of diaminophosphinyl compounds as urease inhibitors
US4545985A (en) 1984-01-26 1985-10-08 The United States Of America As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Pseudomonas exotoxin conjugate immunotoxins
US4894443A (en) 1984-02-08 1990-01-16 Cetus Corporation Toxin conjugates
US4625014A (en) 1984-07-10 1986-11-25 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Cell-delivery agent
US4542225A (en) 1984-08-29 1985-09-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Acid-cleavable compound
US4659839A (en) 1984-10-10 1987-04-21 Mallinckrodt, Inc. Coupling agents for radiolabeled antibody fragments
CA1336076C (en) 1985-01-14 1995-06-27 Alan R. Fritzberg Metal radionuclide labeled proteins for diagnosis and therapy
US4837380A (en) * 1985-09-30 1989-06-06 Regents Of University Of California Liposome-calcitonin preparation
US4699784A (en) 1986-02-25 1987-10-13 Center For Molecular Medicine & Immunology Tumoricidal methotrexate-antibody conjugate
US4680333A (en) 1986-04-14 1987-07-14 National Starch And Chemical Corporation Removable hot melt pressure sensitive adhesive
US4867962A (en) 1988-02-26 1989-09-19 Neorx Corporation Functionally specific antibodies
CA1340323C (en) 1988-09-20 1999-01-19 Arnold E. Hampel Rna catalyst for cleaving specific rna sequences
FR2637612B1 (fr) 1988-10-06 1993-09-10 Pasteur Institut Sequences de nucleotides codant pour une proteine a activite ureasique
EP0460607A3 (en) * 1990-06-05 1992-04-01 Bristol-Myers Squibb Company Novel monoclonal antibody to novel antigen associated with human tumors
US5298399A (en) 1990-08-10 1994-03-29 Sapporo Breweries Limited Gene and process for producing a thermostable urease
US5140100A (en) 1990-12-28 1992-08-18 Cedars-Sinai Medical Center Protein that inhibits production of human choriogonadotropin
FR2683159B1 (fr) 1991-10-31 1994-02-25 Coletica Procede de fabrication de nanocapsules a paroi a base de proteines reticulees; nanocapsules ainsi obtenues et compositions cosmetiques, pharmaceutiques et alimentaires en comportant application.
US5573934A (en) * 1992-04-20 1996-11-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Gels for encapsulation of biological materials
WO1993020221A1 (en) * 1992-04-03 1993-10-14 Young Alexander T Gene therapy using targeted viral vectors
US6358490B2 (en) 1992-06-09 2002-03-19 Neorx Corporation Three-step pretargeting methods and compounds
US5976535A (en) 1992-06-09 1999-11-02 Neorx Corporation Pretargeting protocols for the enhanced localization of cytotoxins to target sites and cytotoxic combinations useful therefore
US6290962B1 (en) 1992-11-03 2001-09-18 Oravax, Inc. Urease-based vaccine and treatment for helicobacter infection
GB9300875D0 (en) 1993-01-18 1993-03-10 Ucb Sa Nanocapsule containing pharmaceutical compositions
AU6268894A (en) 1993-02-22 1994-09-14 Alza Corporation Compositions for oral delivery of active agents
WO1995014093A1 (en) 1993-05-19 1995-05-26 Institut Pasteur Immunogenic compositions against helicobacter infection, polypeptides for use in the compositions and nucleic acid sequences encoding said polypeptides
EP0759941B1 (en) 1994-05-18 2000-09-13 S.P.I. Synthetic Peptides Incorporated Heterodimer polypeptideimmunogen carrier composition and method for their use
GB9417873D0 (en) 1994-09-06 1994-10-26 Sandoz Ltd Organic compounds
US6172045B1 (en) 1994-12-07 2001-01-09 Neorx Corporation Cluster clearing agents
US5886143A (en) 1994-12-07 1999-03-23 Neorx Corporation Hepatic-directed compounds and reagents for preparation thereof
FR2732605B1 (fr) * 1995-04-07 1997-05-16 Pasteur Merieux Serums Vacc Composition destinee a l'induction d'une reponse immunitaire mucosale
WO1997009440A1 (en) * 1995-09-06 1997-03-13 Bavarian Nordic Research Institute A/S The use of the wap of mmtv regulatory sequences for targeted expression of linked heterologous genes in human mammary cells, including human mammary carcinoma cells
CA2244791A1 (en) 1996-01-31 1997-08-07 The University Of California Method for inhibiting tumor cell growth
CA2250222A1 (en) 1996-03-20 1997-09-25 Mien-Chie Hung Sensitization of her-2/neu overexpressing cancer cells to chemotherapy
US5958892A (en) 1996-07-30 1999-09-28 Board Of Regents, The University Of Texas System 2-methoxyestradiol-induced apoptosis in cancer cells
US5750496A (en) * 1996-08-12 1998-05-12 Utah State University Method of controlling cryptosporidium infectons using protease inhibitors
EP0824019B1 (en) * 1996-08-13 2002-11-20 Quest International B.V. Inhibition or reduction of oral malodour
WO1998016201A1 (en) 1996-10-11 1998-04-23 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic liposome composition and method
US6261537B1 (en) 1996-10-28 2001-07-17 Nycomed Imaging As Diagnostic/therapeutic agents having microbubbles coupled to one or more vectors
CN1181422A (zh) * 1996-10-31 1998-05-13 上海市肿瘤研究所 与生长因子受体结合的多肽所构建的基因转移载体
US6180114B1 (en) 1996-11-21 2001-01-30 University Of Washington Therapeutic delivery using compounds self-assembled into high axial ratio microstructures
US6045774A (en) 1997-01-10 2000-04-04 Epicyte Pharmaceutical Inc. J chain polypeptide targeting molecule linked to an imaging agent
GB9703633D0 (en) 1997-02-21 1997-04-09 Imp Cancer Res Tech Cancer therapy
US6190923B1 (en) 1997-09-05 2001-02-20 David K. Johnson Diethylenetriamine-N,N′,N″-triacetic acid derivatives
FR2772025B1 (fr) 1997-12-10 2000-03-03 Guerbet Sa Chelates metalliques de macrocycles polyaminocarboxyliques et leur application a l'imagerie par resonance magnetique
US6426086B1 (en) * 1998-02-03 2002-07-30 The Regents Of The University Of California pH-sensitive, serum-stable liposomes
FR2790405B1 (fr) 1999-03-02 2001-04-20 Oreal Nanocapsules a base de polymeres dendritiques
AU5646800A (en) 1999-03-02 2000-09-21 Helix Biopharma Corporation Card-based biosensor device
US6159443A (en) 1999-04-29 2000-12-12 Vanderbilt University X-ray guided drug delivery
IL146954A0 (en) * 1999-06-25 2002-08-14 Genentech Inc HUMANIZED ANTI-ErbB2 ANTIBODIES AND TREATMENT WITH ANTI-ErbB2 ANTIBODIES
US6307372B1 (en) 1999-11-02 2001-10-23 Glaxo Wellcome, Inc. Methods for high throughput chemical screening using magnetic resonance imaging
AU4305101A (en) 1999-11-22 2001-06-04 Research Foundation Of The State University Of New York, The Magnetic nanoparticles for selective therapy
US20020041898A1 (en) 2000-01-05 2002-04-11 Unger Evan C. Novel targeted delivery systems for bioactive agents
ATE524196T1 (de) * 2001-10-16 2011-09-15 Macrogenics West Inc An das krebsassoziierte antigen cd46 bindende antikörper und verwendungsverfahren dafür

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH1017492A (ja) * 1996-07-02 1998-01-20 Fuji Yakuhin Kogyo Kk 腫瘍細胞増殖抑制剤
WO2000023476A1 (fr) * 1998-10-16 2000-04-27 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Peptides specifiques pour la neovascularisation
WO2002015925A1 (fr) * 2000-08-22 2002-02-28 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Technique de regulation de l'apoptose et polypeptide de regulation d'apoptose

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN5005002799; Ｚｉｍｂｅｒ，Ａ．，ｅｔ　ａｌ．: '"Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｕｒｅａｓｅ　Ｉｎｊｅｃｔｏｎｓ　ｏｎ　Ｅｈｒｌｉｃｈ　Ａｓｃｉｔｅｓ　Ｔｕｍｏｒ　Ｇｒｏｗｔｈ　ｉｎ　Ｍｉｃｅ"' Ｐｒｏｃ．　Ｓｏｃ．　Ｅｘｐ．　Ｂｉｏｌ．　Ｍｅｄ． Ｖｏｌ．１３９，Ｎｏ．１, 197201, Ｐ．１４３-１４９ *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115666571A (zh) * 2020-05-20 2023-01-31 美德阿利克斯株式会社 含有阿扑吗啡的经皮吸收型制剂

Also Published As

Publication number Publication date
EP2324846B1 (en) 2014-11-12
JP2016014066A (ja) 2016-01-28
UA81634C2 (ru) 2008-01-25
WO2004009112A8 (en) 2005-09-15
CA2492472C (en) 2014-01-07
JP2006501196A (ja) 2006-01-12
CN100577203C (zh) 2010-01-06
US20040115186A1 (en) 2004-06-17
EP1530482B1 (en) 2013-10-23
JP5850561B2 (ja) 2016-02-03
KR20110123786A (ko) 2011-11-15
KR20050038005A (ko) 2005-04-25
CN1681528A (zh) 2005-10-12
RU2005104113A (ru) 2005-09-10
EP1530482A1 (en) 2005-05-18
ZA200500423B (en) 2006-08-30
MXPA05000778A (es) 2005-08-29
KR101352826B1 (ko) 2014-01-17
PT1530482E (pt) 2014-01-15
EP1530482B9 (en) 2014-04-16
CA2492472A1 (en) 2004-01-29
PL217626B1 (pl) 2014-08-29
EP2324846A1 (en) 2011-05-25
DK1530482T3 (da) 2014-01-20
SI1530482T1 (sl) 2014-03-31
TR200500108T2 (tr) 2005-04-21
HK1158103A1 (en) 2012-07-13
RU2326691C2 (ru) 2008-06-20
NZ538284A (en) 2008-04-30
IL166249A (en) 2011-10-31
IL166249A0 (en) 2006-01-15
WO2004009112A1 (en) 2004-01-29
NO20050793L (no) 2005-04-18
AU2003250658A1 (en) 2004-02-09
JP2011207913A (ja) 2011-10-20
AU2003250658B2 (en) 2009-07-16
NO336811B1 (no) 2015-11-02
BR0312664A (pt) 2005-05-03
PL374675A1 (en) 2005-10-31
HK1076739A1 (en) 2006-01-27
ES2443416T3 (es) 2014-02-19
US7211250B2 (en) 2007-05-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5850561B2 (ja) 癌細胞増殖を阻害するためのウレアーゼの使用
JP6889199B2 (ja) ｐ９７のフラグメントおよびその使用
RU2491085C2 (ru) Sparc-связующие пептиды и их применение
KR102246800B1 (ko) 조건부 활성 생체 단백질
US20240277863A1 (en) Antibody-urease conjugates for therapeutic purposes
US11643662B2 (en) Targeted protease compositions and uses related thereto
JP7539701B2 (ja) 多重特異性抗体構造体
JP7373998B2 (ja) 有効性がより大きくかつ毒性がより少ない腫瘍標的指向方法及び試薬
JP2009543868A (ja) 癌治療に関する方法および組成物
Joshi et al. Transferrin Receptor and Targeting Strategies
US7264800B2 (en) Method and composition for inhibiting cancer cell growth
CN112292393A (zh) 双功能血脑疗法
JP7370598B2 (ja) ペプチド及びその使用
IL301338A (en) A compound for separating unwanted anti-PEG antibodies in a patient

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20130812

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20140319

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20140820

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20141117

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20141121

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20141218

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20141218

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20150611

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20151008

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20151021

A761 Written withdrawal of application

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761

Effective date: 20151023