KR20110123786A - 암세포 성장의 저해를 위한 우레아제의 사용 - Google Patents

암세포 성장의 저해를 위한 우레아제의 사용 Download PDF

Info

Publication number
KR20110123786A
KR20110123786A KR1020117022947A KR20117022947A KR20110123786A KR 20110123786 A KR20110123786 A KR 20110123786A KR 1020117022947 A KR1020117022947 A KR 1020117022947A KR 20117022947 A KR20117022947 A KR 20117022947A KR 20110123786 A KR20110123786 A KR 20110123786A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
urease
tumor
cancer
target
cells
Prior art date
Application number
KR1020117022947A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101352826B1 (ko
Inventor
헤만 카오
와하 웡
도날드 세갈
제리 맥엘로이
존 도체르티
조디 딕스테인
Original Assignee
헬릭스 바이오파마 코포레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 헬릭스 바이오파마 코포레이션 filed Critical 헬릭스 바이오파마 코포레이션
Publication of KR20110123786A publication Critical patent/KR20110123786A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101352826B1 publication Critical patent/KR101352826B1/ko

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/50—Hydrolases (3) acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5), e.g. asparaginase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/66—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid the modifying agent being a pre-targeting system involving a peptide or protein for targeting specific cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6891—Pre-targeting systems involving an antibody for targeting specific cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

포유동물 개체에서 암세포의 성장을 저해하는데 사용하기 위한 약학적 조성물 및 방법이 공개된다. 조성물은 우레아제 효소, 및 그것과 관련되어, 조성물이 개체에 투여되었을 때, 효소를 암세포로 전달하는 것을 향상시키는데 효과적인 화학적 물질을 포함한다. 또한 약한 기초 종양 화합물의 효과를 향상시키는 방법, 개체 내의 고형암의 존재, 크기 또는 상태를 평가하는 방법, 및 개체 내의 암을 치료하기 위한 유전자 치료 조성물이 공개된다.

Description

암세포 성장의 저해를 위한 우레아제의 사용{USE OF UREASE FOR INHIBITING CANCER CELL GROWTH}
관련 출원의 상호- 참증
본 출원은 2002 년 8 월 18 일 자 미국 가특허출원 번호 60/397,244에 대한 우선권 및 이점을 주장하고, 그것의 공개는 모든 목적을 위하여 그것의 전체로 참고 문헌에 의하여 본원에 수록된다.
기술 분야
본 발명은 우레아제 단백질 및 폴리펩티드를 적용한 항암 치료 방법에 관련된다.
암은 미국에서 전체 사망의 1/5에 해당하며, 사망의 두번째로 높은 사망 원인이다. 암은 전형적으로 세포 군집의 통제되지 않은 분열에 의하여 특징된다. 이러한 통제되지 않은 분열은 다양한 타입의 림프종과 같은 혈액세포, 또는 예를 들어, 유방, 간, 식도, 위, 췌장, 위, 소장, 뇌, 골, 또는 전립선의 제 2 또는 제 1 종양과 같은 고형암인 특별한 조직 또는 기관으로 모이거나 또는 기원인 세포에 관련될 수 있다.
암치료를 위한 다양한 치료방식이 제안되어왔다. 이러한 것들은 고형암의 외과적 제거, x-선과 같은 방사선으로 치료, 화학요법, 면역요법, 및 유전자치료를 포함한다. 특정한 암에 대한 치료의 형태(들)은 환자의 나이, 암 국부화의 정도, 및 암의 형태 및 단계와 같은 인자에 의존할 것이다. 종종 치료는 화학요법과 조합으로 x-선 치료 또는 화학요법과의 조합으로 면역요법과 같은 2 또는 그 이상의 방식의 조합이 될 것이다.
수많은 화학요법 화합물 및 조성물 및 전략들이 암을 치료하는데 적용되어왔다. 많은 항암 화합물은 빠르게 분열하는 세포 내의 복제를 방해 또는 활발하게 증식 중인 세포 내의 중심 대사 연결을 저해하는 것으로 디자인된다. 그러한 접근이 특정 타입의 암 또는 어떠한 단계의 암에서 성공적인 수준을 보이더라도, 화학요법은 무기력, 메스꺼움, 식욕 감소, 탈모, 빈혈과 같은 바람직하지 않은 부작용과 일반적으로 연관된다. 더 나아가, 분열하는 세포 내로 뉴클레오티드 유사체를 도입하거나, 또는 정상 복제를 방해하는 것에 의한 세포 복제의 수준에 작용하는 화합물은 환자의 정상세포 내의 광범위한 유전적 변이의 도입에 대한 잠재성을 가진다. 추가적으로, 암세포는 세포 내로 약물을 받아들이는 것을 제한하거나, 또는 세포 내에서 약물의 대사를 변화함에 의하여 다양한 항암제에 대한 저항성을 가질 수 있다.
이러한 제한요인에 대한 대책에 있어서, 그들의 부작용을 감소, 저항의 문제를 극복, 또는 선택된 종양 위치에 그들의 표적화를 증가하기 위한 시도가 개발되어왔다. 이러한 노력은 어떤 경우에 있어서 향상된 치료적 결과물을 얻었지만, 진보된 화학요법제 및 방법을 제공할 필요성이 남아있다. 특히, 그러한 약물은 암세포를 죽이거나 증식을 저해하는데 효과적이어야 하며, 부작용 및 치료된 환자의 유전적 완전성의 장기 효과라는 점에서 비교적 비-독성이어야만 하고, 바람직하게 형태에 있어서 전달 가능하여 종양 내로 직접 도입 또는 종양으로 선택적 표적화가 가능하여야 한다.
발명의 개요
본 발명은 포유류에서 암세포의 성장을 제해하는데 사용하기 위한 약학적 조성물을 제공한다. 조성물은 세균성 또는 식물성 우레아제와 같은 우레아제 효소, 및 본 조성물이 개체에 투여되었을 때, 암세포로 효소의 전달을 향상시키기 위하여 우레아제와 연관된 화학적인 물질을 포함한다.
하나의 구체예에 있어서, 화학적인 물질은 원 (native) 우레아제와 비교하여 혈액 순환 시간을 연장하거나 상기 화합물의 항원성을 감소하는데 효과적인 양으로 우레아제에 콘주게이트되는 친수성 폴리머를 포함한다. 예를 들어 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐 메틸 에테르, 폴리히드록시프로필 메트아크릴아미드, 폴리히드록시프로필 메트아크릴레이트, 폴리히드록시에틸 아크릴레이트, 폴리메트아크릴아미드, 폴리디메틸아크릴아미드, 폴리메틸옥사졸린, 폴리에틸옥사졸린, 폴리히드록시에틸옥사졸리온, 폴리히드록시프로피옥사졸린, 폴리아스파르타미드, 또는 친수성 셀룰로오스 유도체일 수 있다. 폴리머는 바람직하게 약 1,000 내지 10,000 달톤의 분자량을 가지는 폴리에틸렌 글리콜 선형 사슬과 같은 선형 사슬 폴리머이다.
화학적 물질은 항-암 항원 항체, 항-hCG 항체, 또는 암-세포 표면 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드와 같은 우레아제에 부착된 표적 부분일 수 있다. 이 경우 표적 부분이 폴리펩티드이면, 조성물은 표적 부분과 우레아제 효소의 융합 단백질일 수 있다. 택일적으로, 이때 우레아제는 그것의 C- 또는 N-말단에 제 1 코일-형성 펩티드를 포함할 수 있는데, 이것은 선택된 전하 및 반대로 하전된 제 2 코일-형성 펩티드와 상호작용하여 안정한 나선 코일된-코일 이종이량체를 형성하는 능력에 의하여 특징되며; 화학적 물질은 제 2 코일-형태 펩티드를 포함하는 표적 부분을 포함할 수 있다.
화학적인 물질은 싸는 형태로 우레아제 효소를 가지는 소낭 (vesicle)을 포함할 수 있다. 예시적인 소낭은 리포좀을 포함하며, 이것은 폴리에틸렌 글리콜의 외부 코팅에 의하여 장시간-순환하고, 조성물이 정맥 내로 투여될 때 종양 지역으로 스며나오는 크기이고, 표적 부분이 결합된 표면을 가진다. 소낭은 우레아와 같은 추가적인 약물, 치료적 활성 항암제 또는 조영약물을 포함할 수 있다.
화학적인 물질은 상기 효소의 활성을 저해하는데 충분한 양으로 그것과 연관된 우레아제 저해제를 포함할 수 있다.
다른 관점에 있어서, 본 발명은 포유류에서 암세포의 성장을 저해하기 위한 방법을 포함한다. 본 방법은 세포를 암세포의 성장을 저해하는데 효과적인 양으로 우레아제에 노출시키는 것을 포함한다.
여기에서 암세포는 고형암을 포함하며, 우레아제는 직접적으로 환자의 종양 내로 주사되거나 또는 직접적 투여와는 다른 예를 들어 비경구적 투여에 의한 주사일 수 있다. 약학적으로 허용되는 캐리어 내의 우레아제에 추가하여, 상기 언급된 우레아제를 함유하는 다야한 조성물이 본 발명의 사용을 위하여 적합할 수 있다.
본 방법은 상기 암세포 상의 우레아제의 활성을 감소시키는데 효과적인 양의 우레아제 저해제를 개체에 투여함에 의하여 암세포 상의 우레아제의 활성을 조절하는 것을 포함할 수 있다. 우레아제 활성은 우레아제 투여 전, 동안, 또는 후에 환자에게 우레아를 투여함으로서 반대 방향으로 조절될 수 있다.
우레아제는 종양 표적 부분과 제 2 결합 부분과 상호작용하는 능력을 가지는 제 1 결합 부분의 콘주게이트와 관련되는 제 1 단계; 및 우레아제와 콘주게이트된 제 2 결합 부분을 포함하는 제 2 콘주게이트와 관련되는 제 2 단계의 두 단계로 투여될 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 본 방법은 환자에게 투여되어질 때, 암세포를 선택적으로 트랜스펙팅하는데 효과적인 표적 벡터 및 트랜스펙트된 암세포 내에서 우레아제 mRNA를 생산하는데 효과적인 상기 벡터 내에서 운반되는 재조합 핵산 서열로 구성되는 유전자 치료 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 예시적인 벡터는 아데노바이러스이다. 예시적인 핵산 서열은 우레아제 및 트랜스펙트된 세포로부터 우레아제의 분비를 촉진하는데 효과적인 분비성 선도 서열을 코드한다.
관련된 관점에 있어서, 본 발명은 암치료를 위한 약물을 받는 환자에서 고형암 내의 높은 세포내/낮은 세포외 pH 구배에 의하여 효과가 감소되는 약한 기초적인 항암 화합물의 치료적 효능을 향상시키는 방법을 제공한다. 본 방법은 고형암 내의 높은 세포내/낮은 세포외 pH 구배를 감소 또는 역전하는데 효과적인 양의 우레아제를 환자에게 투여하는 것과 연관된다. 바람직하게, 투여되는 우레아제의 양은 종양의 세포외 체액을 적어도 pH 7.2로 증가시키는데 효과적인 양이다. 우레아제는 상기 설명한 바와 같이, 종양 내로 직접적으로 또는 직접 투여와는 다른 비경구적 투여에 의하여 주사될 수 있다.
예를 들어, 항암 화합물은 독소루비신, 다우노루비신, 미톡산트론, 에피루비신, 마이토마이신, 블레오마이신, 빈블라스틴 및 빈크라스틴과 같은 빈카 알카로이드, 시클로포스파미드 및 메클로레타미드 하이드로클로라이드와 같은 알킬화 약물, 및 항신생적 푸린 또는 피리미딘 유도체일 수 있다.
또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 환자의 고형암의 존재, 크기 또는 상태를 평가하는데 유용하다. 여기에서, 우레아제는 환자의 고형암 내에 우레아제를 위치시키는데 효과적인 조건하에서 고형암을 가지거나 또는 가지는 것으로 의심되는 환자에게 투여하는 것이다. 다음으로 환자는 pH-민감성 리포터의 존재 또는 부재에서 세포외 pH의 증가를 보여주는 환자의 조직 지역을 확인하기 위하여 환자의 조직 내의 세포외 pH의 변화를 검출할 수 있는 투시촬영 (fluoroscopy), MRI, 또는 양전자방출단층촬영법 (positron emission tomography)와 같은 진단 도구로 조사된다.
이 방법은 우레아제 투여량 또는 치료의 정도 및/또는 효과를 평가하기 위하여 상기 치료 방법과 함께 사용될 수 있다. 그러므로 예를 들어, 환자에 우레아제를 투여하는데 있어서, 종양 지역 내의 pH 변화의 범위 및 정도는 우레아제 투여를 가이드하거나 또는 치료 동안 종양 크기 또는 범위에서의 변화를 측정하기 위하여 수행될 수 있다.
또한 포유류에서 암세포의 성장을 저해하는데 사용되기 위한 키트가 공개된다. 본 키트는 환자의 암의 치료를 위한 우레아제 효소를 함유하는 약학적 조성물, 및 환자에 조성물의 투여를 교시하는 설명서를 가진다.
설명서는 종양의 크기에 의존하며, 조성물이 종양 내로 직접적 주사에 의하여 투여될 때, mm3 종양 당 0.1 내지 100 국제 단위, 바람직하게는 0.5 내지 10 국제 단위, 조성물이 종양 내로 직접적으로 투여되는 것과는 달리 경구적으로 투여될 때, 환자 체중 당 100 - 100,000 국제 단위, 바람직하게는 500 - 10,000 국제 단위의 양으로 환자에게 우레아제 조성물을 투여하는 것을 교시한다.
설명서는 고형암 내의 높은 세포내/낮은 세포외 pH 구배를 감소 또는 역전하는데 효과적인 양의 우레아제의 양으로 고형암 내의 높은 세포내/낮은 세포외 pH 구배에 의하여 효과가 감소되는 약한 기초적인 항암 화합물을 받는 환자에게 우레아제를 투여하는 것을 교시할 수 있다.
설명서는 환자의 고형암 내에 우레아제를 위치시키는데 효과적인 조건하에서 고형암을 가지거나 또는 가지는 것으로 의심되는 환자에게 우레아제를 투여, 환자의 조직 내의 세포외 pH의 변화를 검출할 수 있는 진단 도구로 환자를 조사, 그리고 상기 투여 후 세포외 pH의 증가를 보여주는 환자의 조직 지역을 확인하는 것을 교시한다.
또한 포유류에서 암세포의 성장을 제해하는데 사용하는 유전자 치료 조성물이 제공된다. 이 조성물은 상기 언급한 바와 같이, 환자에게 투여되어질 때, 암세포를 선택적으로 트랜스펙팅하는데 효과적인 표적 벡터 및 트랜스펙트된 암세포 내에서 우레아제 mRNA를 생산하는데 효과적인 본 벡터 내에서 운반되는 재조합 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 이러한 그리고 다른 목적 및 특징은 다음의 본 발명의 상세한 설명이 동반된 도면과 함께 해석될 때 더욱 완전하게 명백하게 될 것이다.
I. 정 의
다른 지적이 없다면, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학적 용어는 당업자에게 인식되는 것과 동일한 의미를 가진다. 실시자는 기술의 정의와 용어를 위하여 Sambrook 등 (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Press, 3rd Ed.; 및 Ausubel, F. M. 등 (1993) in Current Protocols in Molecular Biology로 안내된다. 본 발명은 다양한 것으로 될 수 있다고 설명된 특정 방법학, 프로토콜, 및 작용제에 한정되는 것은 아니라는 것이 이해되어야 한다.
용어 "우레아제"는 자연적으로 발생하거나 또는 예를 들어, 재조합 핵산 기술 및/또는 화학적 합성에 의하여 획득된 우레아 아미도하이드롤라아제 (E.C. 3.5.1.5)의 효소적 활성을 가지는 효소를 언급한다. 또한 우레아제는 완전한 우레아제, 소단위체, 또는 그들의 단편, 및/또는 폴리펩티드의 우레아 아미도하이드롤라아제 활성을 보존하는 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 가진 우레아제를 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 본원에서 사용되는 것으로 절단된 우레아제 서열은 우레아제의 아미노 또는 카르복시 말단의 시작에서 완전한 우레아제 서열의 한 부분이 없는 우레아제의 단편이다. 원 우레아제를 분리, 재조합 우레아제를 합성, 그리고 활성 단편 및 수식된 우레아제 폴리펩티드를 확인하기 위한 방법이 다음에서 제공된다.
용어 "암"은 비정상 세포 또는 세포들, 또는 조직 덩어리 (mass)를 언급하는 것을 의미한다. 이러한 세포 또는 조직의 성장은 초과되고, 정상 조직 또는 세포의 그것과 비협동적이고, 그리고 변화를 유발하는 자극의 정지 후에도 동일한 초과 방식으로 유지된다. 이러한 신생물 조직 또는 세포는 구조적 조직화 및 정상 조직 또는 세포와 관계되는 협동의 결핍을 나타내고 양성 또는 악성이 될 수 있다. 본원에서 사용되는 것으로, 암은 어떠한 네오플라즘을 포함한다. 이것은 흑색종, 선종 (adenocarcinoma), 악성 신경교종 (glioma), 전립선암, 신장암, 방광암, 췌장암, 갑상선암, 폐암, 직장암, 결장암, 뇌암, 간암, 유방암, 난소암, 및 이와 유사한 것을 포함하지만 여기에 한정되는 것은 아니다.
"종양" 또는 "고형암"은 반-고형 및 고형암, 고형암 전이, 혈관섬유종, 미숙아망막증, 혈관종, 및 카포시육종을 포함하지만 여기에 한정되느 것은 아닌 암세포의 응집성 매스를 나타낸다.
본원에서 사용되는 것으로, 용어 "표적 부분"은 세포의 한정된 군집 또는 선택된 세포 타입에 결합하는 분자를 나타낸다. 표적 부분은 수용체, 올리고뉴클레오티드, 효소적 기질, 항원결정기, 또는 표적 세포 또는 세포 군집 상에 또는 내에 존재하는 다른 결합 위치에 결합할 수 있다. 예시적인 표적 부분은 항체이다. 발현된 항원을 인식할 수 있는 항체 및 작은 다백질 펩티드가 또한 표적 부분으로 고려된다.
본원에서 사용되는 것으로, 용어 "암세포의 성장을 저해한다" 또는 "암세포의 성장을 저해하는"은 암세포의 증식 및/또는 이동의 속도의 저하, 암세포 증식 및/또는 이동의 정지 또는 암세포의 죽음의 어떠한 것을 나타내며, 암세포 성장의 속도는 치료되지 않은 대조군 암세포의 성장의 속도를 관찰 또는 예상된 비교에 있어서 감소되었다. 용어 "성장을 저해한다"는 암세포 또는 종양의 크기 또는 외관의 감소 뿐만 아니라 그것의 전이적 잠재력의 감소를 또한 나타낸다. 바람직하게, 세포성 수준의 그러한 저해는 환자에서 암의 크기를 감소, 성장을 멈춤, 진행성의 감소, 또는 전이를 방지 또는 저해가 가능할 수 있다. 당업자라면 암세포 성장이 제해되는지 어떤지에 대한 다양한 적합한 징후의 어떠한 것에 의하여 쉽게 결정될 수 있다.
암세포 성장의 저해는 예를 들어, 세포 주기의 특정 기간에 의한 암세포의 정지, 예를 들어 세포 주기의 G2/M 기에서 정지에 의하여 증명될 수 있다. 암세포의 성장의 제해는 또한 암세포 또는 종양 크기의 직접 또는 간접적인 측정에 의하여 증명될 수 있다. 인간 암 환자에 있어서, 그러한 측정은 일반적으로 자기 공명 조영 (magnetic resonance imaging), 컴퓨터 체축 단층 촬영 (computerized axial tomography) 및 X-선과 같은 공지된 조영 기법을 사용하여 얻어진다. 암세포 성장은 또한 암세포 성장과 상관관계가 있는 순회하는 카르시노엠브리온 항원 (circulating carcinoembryonic antigen), 전립선 특이적 항원 또는 다른 암-특이적 항원의 수준을 결정함에 의한 것과 같은 것으로 간접적으로 결정될 수 있다. 암 성장의 저해는 또한 일반적으로 연장된 생존 및/또는 나아진 건강 및 환자의 웰빙 (well-being)과 상관관계가 있다.
본원에서 사용되는 것으로, 용어 "아폽토시스 (apoptosis)를 유도한다"는 DNA 단편화에 의하여 예정된 세포 자살의 형성을 촉진하는 것을 나타낸다. 아폽토시스는 공지된 방법에 의하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 조직내 면역 조직 화학법 (in situ immunohistochemistry)에 의한 단편화된 DNA의 존재를 결정하는 것이 가능한 키트가 있다 (예를 들어, Apoptag, Intergen, N. Y.으로부터 구입가능). 추가적으로, 아폽토시스는 또한 FACS 분석에 의하여 결정될 수 있으며, 그것에서 아폽토시스 세포는 DNA 단편화를 지시하는 G1 DNA 함량 이하를 나타낸다.
본원에서 사용되는 것으로, "항체"는 펩티드, 폴리펩티드, 또는 적어도 하나의 면역글로불린 핵산 분자 또는 면역글로불린 유전자 또는 적어도 하나의 면역글로불린 분자 또는 면역글로불린 유전자의 단편에 의하여 실질적으로 또는 부분적으로 코드되는 1 또는 그 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 단백질을 나타낸다. 인식된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변 영역 유전자 뿐만 아니라 수 많은 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로서 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론으로서 분류되고, 그것은 다음으로 각각 면역글로불린 클래스 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 정의한다. 전형적인 면역글로불린 (예를 들어, 항체) 구조적 단위는 테트라머를 포함한다. 각 테트라머는 2 동등한 쌍의 폴리펩티드 사슬로 구성되며, 각 쌍은 1 "경"쇄 (약 25 kD) 및 1 "중"쇄 (약 50-70 kD)를 가진다. 각 사슬의 N-말단은 항원 인식에 대하여 우선적인 책임이 있는 약 100 내지 110 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 특정한다. 용어 "가변 경쇄" (VL) 및 "가변 중쇄" (VH)는 각각 이러한 경 및 중쇄를 언급한다. 항체는 완전한 면역글로불린으로서 또는 여러가지 펩티다아제로 절단되어 생산된 잘 특징되어진 단편으로서 존재한다. 그러므로, 예를 들어, 펩신은 힌지 (hinge) 지역에서 이황화 결합 아래 항체를 절단하여 F(ab)'2를 생산하는데, Fab의 이량체는 그것 자체가 이황화 결합에 의하여 VH-CH1에 결합된 단단한 사슬이다. F(ab)'2는 힌지 지역에서 이황화 결합을 파괴할 수 있는 온화한 조건하에서 환원될 수 있으므로, (Fab')2 이량체는 Fab' 단량체로 전환된다. Fab' 단량체는 필수적으로 힌지 지역의 부분을 가진 Fab이다 (다른 항체 단편의 더 자세한 설명을 위하여 Fundamental Immunology, W. E. Paul 등, Raven Press, N. Y. (1993) 참고). 여러가지 항체 단편이 완전한 항체의 절단에 의하여 특정되는 반면에, 당업자는 그러한 Fab' 단편은 화학적으로 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 새로이 합성될 수 있다. 그러므로, 본원에서 사용되는 것으로 용어 "항체"는 또한 전체 항체의 수식 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 새로이 합성되는 것에 의하여 생산될 수 있다. 항체는 VH 및 VL이 (직접적으로 또는 펩티드 링커를 통하여) 함께 연결되어 연속적인 폴리펩티드를 형성하는 단일 사슬 Fv (sFv) 항체를 포함하는 단일 사슬 항체를 포함한다.
항체의 "항원-결합 단편"은 항원에 결합하는 항체의 펩티드 또는 폴리펩티드 단편이다. 항원-결합 위치는 항원의 결합에 공헌하고, 관련되고, 또는 영향을 주는 항체의 이러한 아미노산에 의하여 형성된다. 모든 목적을 위하여 그것의 전체로서 참고문헌에 의하여 본원에 수록된 Scott, T. A. 및 Mercer, E. I., CONCISE ENCYCLOPEDIA : BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY (de Gruyter, 3d ed. 1997) 및 Watson, J. D. 등, RECOMBINANT DNA (2d ed. 1992) 참고. 용어 "항체 단편"은 또한 특이적인 항원과 결합하여 복합체를 형성하는 항체와 같이 작용하는 어떠한 합성 또는 유전적으로 조작된 단백질을 포함한다.
용어 "활성 작용제", "드러그" 및 "약학적으로 활성인 작용제"는 환자에 투여될 때, 희망하는 약리적 효과를 유도하는 화학적 물질 또는 화합물을 나타내기 위하여 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 방사성핵종, 드러그, 항암제, 톡신 및 이와 유사한 것을 포함하는 진단 또는 치료제를 포함하는 것으로 의도된다. 바람직하게, 용어 활성 작용제는 단백질, 당단백질, 천연 및 합성 펩티드, 알카로이드, 다당, 핵산 분자, 작은 분자 및 이와 유사한 것을 포함한다. 더욱 바람직하게, 용어 활성 작용제는 단백질을 나타낸다. 예시적인 활성 작용제는 우레아제이다.
"pH-민감성" 활성 작용제는 적어도 부분적으로 세포외 환경 주변의 pH 상에 의존하여 희망하는 약학적 효과를 유도하는 능력의 활성 작용제를 나타낸다.
본원에서 사용되는 것으로 용어 "작용제를 제거하는"은 환자의 순환으로 존재하는 투여된 부분, 예를 들어, 표적 부분-리간드, 표적 부분-항-리간드 또는 항-리간드 단독과 결합, 복합체 또는 다른 관련이 될 수 있는 작용제를 나타내며, 순환하는 부분을 환자의 몸으로부터 제거, 혈액 순환으로부터 제거, 또는 순환에서 그들의 불활성화를 촉진한다. 제거 작용제는 제거 작용제와 동일한 치료 프로토콜로 사용된 표적 부분에 의하여 인식된 표적 세포의 군집에 제거 작용제 접근을 제한하는 바람직하게 크기, 전하, 배열 또는 그들의 조합과 같은 물리적인 특징에 의하여 특징된다.
용어 "조영제"는 검출될 수 있는 화합물을 나타낸다.
용어 "애주번트 (adjuvant)"는 주성분의 작동을 보조하기 위하여 제형 또는 조성물에 첨가되는 물질 또는 작용제를 나타낸다.
용어 "세포간" 및 "세포외" 체액은 포유동물 세포 사이에 놓여지거나 움직이는 체액을 나타낸다.
용어 "개체", "개인" 및 "환자"는 치료의 어떠한 대상을 나타내기 위하여 본원에서 상호교환하면서 사용된다. 예를 들어, 유방 또는 전립선 암의 신생세포와 같은 원위치 (in situ), 또는 그들의 정상 위치 또는 부위에서 암세포를 치료하는 방법이 또한 본 발명에 의하여 제공된다. 이러한 원위치 종양은 숙주 내 또는 예를 들어, 인간, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 및 이와 유사한 것의 다양한 숙주에 위치 될 수 있다. 종양 또는 종양세포가 발견될 수 있는 어떠한 숙주는 치료될 수 있고, 본 발명과 조화될 수 있다. 그러므로 개체는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간을 포함한다.
우레아제 분자 또는 다른 활성 성분이 표적 세포 표면 또는 표적 세포 내에 남아 있는 시간은 "표적 세포 보유 시간"으로 의도된다.
본원에서 사용되는 것으로, 용어 "콘주게이트"는 화학적 콘주게이트 (공유적 또는 비-공유적으로 결합), 융합 단백질 및 이와 유사한 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 것으로 용어 "단백질", "폴리펩티드" 또는 "펩티드"는 전형적으로 생물학적 단백질에서 발견되는 20 일반적인 L-아미노산의 약간 또는 전체인 아미노산 또는 아미노산 유사체 서브유니트로 구성되는 펩티드 서브유니트간 연결 또는 다른 서브유니트간 연결에 의하여 연결된 생폴리머를 상호교환하면서 나타낸다. 단백질은 그것의 서브유니트 서열에 의하여 대표되는 1차 구조를 가지고, 2차 나선 또는 플릿 (pleat) 구조를 가질 뿐만 아니라 전체적으로 3차 구조를 가질 수 있다. "단백질"은 일반적으로 비교적 거대한 폴리펩티드, 예를 들어, 100 또는 그 이상의 아미노산을 나타내고, "더 작은 폴리펩티드에 대하여 "펩티드"의 용어가 본원에서 상호교환되면서 사용된다. 즉, 용어 "단백질"은 거대한 폴리펩티드 뿐만 아니라 작은 펩티드를 나타낼 수 있고 반대일 수도 있다.
"우레아제의 모듈레이터"는 우레아제의 저해제 또는 우레아제의 인핸서 (enhancer)이다.
"우레아제의 저해제"는 (1) 우레아제의 발현, 수식, 조절, 활성 또는 분해 또는 (2) 우레아제의 1 또는 그 이상의 정상 기능을 간섭할 수 있는 분자 또는 분자의 군을 포함한다. 우레아제의 정상 기능은 카르바메이트 및 암모니아의 생성을 이끄는 우레아제의 가수분해를 포함한다. 저해제가 정전기적 또는 화학적 상호작용을 통하여 우레아제에 결합할 때 저해제는 "우레아제에 직접적으로 작용한다". 그러한 상호작용은 다른 분자에 의하여 매개되거나 또는 매개되지 않을 수 있다. 저해제는 그것의 가장 즉시 효과가 우레아제의 발현, 활성 또는 작용에 영향을 주는 우레아제와는 다른 분자 상에서 일어날 때, "우레아제 상에서 간접적으로" 작용한다.
"우레아제의 인핸서"는 (1) 우레아제의 발현, 수식, 조절, 활성 또는 (2) 우레아제의 1 또는 그 이상의 정상 기능을 향상시키는 분자 또는 분자의 군을 포함한다. 인핸서는 그것의 가장 즉시 효과가 우레아제의 발현, 활성 또는 작용에 영향을 주는 우레아제와는 다른 분자 상에서 일어날 때, "우레아제 상에서 간접적으로" 작용한다.
우레아제 유전자의 "조작된 변이"는 우레아제 유전자의 핵산 서열에 있어서의 변화를 포함하며, (1) 그러한 변화의 부재에서 생성된 양과 비교된 우레아제 단백질의 증가 또는 감소된 양 또는 (2) 그러한 변화의 부재에서 그러한 기능에 비교하여 증가 또는 손상된 정상 기능을 가지는 우레아제 단백질의 생산으로 결과된다.
용어 "약학적 조성물"은 동물 또는 인간을 포함하는 개체에서 약학적 사용에 적합한 조성물을 의미한다. 약학적 조성물은 일반적으로 효과적인 양의 활성 작용제 및 예를 들어, 약학적으로 허용되는 캐리어 (carrier)를 포함하는 캐리어를 포함한다.
"약학적으로 허용되는 제형"은 희망하는 결과를 제공하고, 의사에게 환자에 대한 잠재적인 해로움이 그 환자에 대한 잠재적인 이점보다 더 큰다는 확신을 주기에 충분한 부작용을 나타내지 않는 방식으로 활성 작용제 (예를 들어, 우레아제 또는 우레아제 모듈레이터)를 투여하기에 적합한 제형을 포함한다. 주사 제형에 대한 기초 성분은 전형적으로 물 운반체 (vehicle)이다. 유용한 수성 운반체는 NaCl 용액, 링거액, NaCl/덱스트로오스 용액, 및 이와 유사한 것을 포함한다. 물과 섞일 수 있는 운반체는 활성 작용제의 완전한 용해성에 영향을 주는데 또한 효과적이다. 필요에 따라서, 항미생물제, 버퍼 및 항산화제가 유용할 수 있다. 유사하게, 본원에서 제공되는 것과 같은 "약학적으로 허용되는" 염 또는 "약학적으로 허용되는" 화합물의 유도체는 생물학적으로 또는 다른 점에서 바람직한 염 또는 다른 유도체이다.
용어 "조절된 방출"은 어떠한 드러그-함유 제형에 있어서 제형으로부터 드러그 방출의 방식 및 프로파일이 조절되는 것을 나타내기 위한 의도이다. 용어 "조절된 방출"은 즉시 뿐만 아니라 유지되는 방출 및 지연된 방출 제형을 포함하지만 여기에 한정되는 것은 아닌 비-즉시 방출 제형을 가지는 비-즉시 방출 제형을 나타낸다.
용어 "유지된 방출" (또한 "확장된 방출"로 언급됨)은 확장된 시간의 기간을 넘는 약물의 점차적인 방출을 제공하고, 필수적이지는 않지만 바람직하게는 확장된 시간 기간을 넘는 실질적인 드러그의 일정한 혈액 수준으로 결과되는 드러그 제형을 나타내기 위한 그것의 종래의 의미로 사용된다. 용어 "지연된 방출"은 제형의 투여와 그것으로부터 드러그의 방출 사이의 시간 지연이 있는 드러그 제형을 나타내기 위한 그것의 종래의 의미로 사용된다. "지연된 방출"은 확장된 기간의 시간 을 넘는 약물의 점차적인 방출과 관계될 수도 있고, 않을 수도 있으며, 그러므로 "유지된 방출"이 될 수도 있고 아닐 수도 있다.
"치료적인 처리"는 병리학, 질병 또는 이상의 증상 또는 표시를 나타내는 환자에게 투여되는 치료이며, 그것에 있어서, 치료는 병리학, 질병 또는 이상의 이러한 표시 또는 증상을 약화 또는 제거하기 위한 목적으로 환자에게 투여된다. "치료적 활성"은 핵산, 벡터, 유전자, 폴리펩티드, 단백질, 물질, 또는 그들의 조성물과 같은 작용제의 활성이며, 그것은 그러한 표시 또는 증상으로부터 고통받는 환자에게 투여될 때, 병리학, 질병 또는 이상의 표시 또는 증상을 제거 또는 감소하는 것이다. "치료적으로 유용한" 작용제 또는 화합물 (예를 들어, 핵산 또는 폴리펩티드)은 작용제 또는 화합물이 병리학, 질병 또는 이상의 그러한 표시 또는 증상을 감소, 치료 또는 제거하는데 유용한 것을 나타낸다.
용어 "작은 분자"는 합성적, 자연적으로 유도된, 또는 부분적으로 합성된 화합물 또는 분자 복합체를 나타내며, 그것은 바람직하게 5,000 달톤보다 적은 분자량을 가진다. 보다 바람직하게, 작은 분자는 100 내지 1,500 달톤 사이의 분자량을 가진다.
용어 "핵산 분자" 또는 "올리고뉴클레오티드" 또는 본원에서 문법적으로 동등한 것은 적어도 2 뉴클레오티드가 공유적으로 함께 연결된 것을 나타내고, 전형적으로 RNA, DNA 및 cDNA 분자를 나타낸다. 본 발명의 핵산은 바람직하게 단일-사슬 또는 이중-사슬이고, 어떠한 경우에 핵산 유사체는 예를 들어, 포스포라미드 (phosphoramide), 포스포로티오에이트 (phosphorothioate), 포스포로디티오에이트 (phosphorodithioate), 및/또는 O-메틸포스포로아미다이트 (O-methylphosphoroamidite) 연결을 포함하는 교대로된 골격을 가질 수 있는 것을 포함라더라도 일반적으로 인산이에스테르 결합을 함유한다. 유전암호의 축퇴 (degeneracy)의 결과로서 우레아제와 같은 주어진 펩티드를 코딩하는 다중 핵산 서열이 형성될 수 있다는 것은 당연하게 될 것이다.
"이종" 핵산 구조물 또는 서열은 그것이 발현되는 세포에 기원이 아닌 서열의 부분을 가진다. 조절 서열에 관하여, 이종은 그것이 현재 발현을 조절하는 동일한 유전자를 조절하는데 자연적으로는 발생하지 않는 조절 서열 (즉, 프로모터 또는 인핸서)을 나타낸다. 일반적으로, 이종 핵산 서열은 세포 또는 그들이 존재하는 게놈의 부분에 내재적이지 않고, 감염, 트랜스펙션, 미세주입, 전기천공 또는 이와 유사한 것에 의하여 세포로 첨가되어진다. 이종 핵산 구조물은 조절 서열/DNA 코딩 서열 조합을 함유할 수 있고, 그것은 원 (native) 세포에서 발견되는 조절 서열/DNA 코딩 서열 조합과 동일 또는 다를 수 있다.
본원에서 사용되는 것으로, 용어 "벡터"는 다른 숙주 세포 사이에서 전달을 위하여 디자인된 핵산 구조물을 나타낸다. "발현 벡터"는 외래 세포 내에서 이종 DNA 단편을 통합하고 발현하는 능력을 가지는 벡터를 나타낸다. 많은 원핵 및 진핵 발현 벡터가 상업적으로 이용가능하다. 적합한 발현 벡터의 선택은 당업자의 지식의 범위 내이다.
본원에서 사용되는 것으로, "발현 카세트" 또는 "발현 벡터"는 표적 세포 또는 시험관 내에서 특별한 핵산 의 전사를 허용하는 일련의 특정화된 핵산 요소를 가진 재조합적으로 또는 합성적으로 생성되는 핵산 구조물이다. 재조합 발현 카세트는 플라스미드, 염색체, 미토콘드리아 DNA, 플라스미드 DNA, 바이러스, 또는 핵산 단편 내로 통합될 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터의 재조합 발현 카세트 부분은 다른 서열 중에 전사되는 핵산 서열 및 프로모터를 포함한다.
본원에서 사용되는 것으로, 용어 "플라스미드"는 클로닝 벡터로서 사용된 환상 이중-사슬 DNA 구조물을 나타내며, 그것은 많은 세균 및 약간의 진핵생물에서 염색체외성 자가 복제 유전 요소를 형성한다.
본원에서 사용되는 것으로, 용어 "선택가능한 마커 (marker)-코딩 핵산 서열"은 숙주 세포에서 발현할 수 있는 핵산 서열을 나타내고, 여기에서 선택가능한 마커의 발현은 발현 유전자를 함유한 세포에 상응하는 선택적 작용제의 존재에서도 성장하는 능력을 부여한다.
본원에서 사용되는 것으로, 용어 "프로모터" 및 "전사 개시자"는 하류 유전자의 전사를 지시하는 것으로 작용하는 핵산 서열을 나타낸다. 프로모터는 일반적으로 표적 유전자가 발현되는 숙주 세포에서 적합할 것이다. 다른 전사 또는 번역 조절 핵산 서열과 함께 프로모터 (또한 "조절 서열"로 명명)는 주어진 유전자를 발현하는데 필수적이다. 일반적으로, 전사 및 번역 조절 서열은 프로모터 서열, 리보좀성 결합 위치 (ribosomal binding site), 전사 개시 및 종결 서열, 번역 개시 및 종결 서열, 및 인핸서 또는 활성인자 서열을 포함하지만 여기에 한정되는 것은 아니다.
본원에서 정의되는 것으로, "키메릭 유전자" 또는 "이종 핵산 구조물"은 조절 요소를 포함하는 다른 유전자의 부분으로 구성될 수 있는 비-원 (non-native) 유전자 (즉, 하나가 숙주세포내로 도입되어진다)를 나타낸다. 숙주 세포의 형질 전환을 위한 케메릭 유전자 구조물은 전형적으로 이종 단백질 코딩 서열 또는 선택가능한 마커 키메릭 유전자 내에 형질 전환된 숙주 세포로 항생제 저항성을 부여하는 단백질을 코딩하는 선택가능한 마커 유전자와 작동 가능하게 연결된 전사 조절 지역 (프로모터)으로 구성된다. 숙주 세포 내로 형질 전환을 위하여 본 발명의 전형적인 키메릭 유전자는 구성적 또는 유도적인 전사 조절 지역, 단백질 코딩 서열, 및 종결 서열을 포함한다. 키메릭 유전자 구조물은 또한 표적 단백질의 분비를 희망한다면 신호 펩티드를 코딩하는 제 2 DNA 서열을 포함할 수 있다.
핵산은 그것이 다른 핵산 서열과 작용적인 관계 내에 놓여졌을 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 만약 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프렙단백질 (prepprotein)로 발현된다면 분비 선도를 코딩하는 DNA는 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고, 만약 서열의 전사에 영향을 준다면, 프로모터 또는 인핸서가 작동가능하게 연결되고, 또는 만약 번역을 촉진하기 위하여 위치되어진다면 리보좀성 결합 위칫가 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 연속적이고, 분비 선도의 경우에 있어서, 해독 상에서 연속적인 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 연속적이지 않다. 연결은 종래의 제한 위치에서 라이게이션 (ligation)에 의하여 성취된다. 만약 그러한 위치가 존재하지 않는다면, 합성 올리고뉴클레오티드 어뎁터 (adaptor) 또는 링커 (linker)가 종래의 방식에 따라 사용된다.
본원에서 사용되는 것으로, 용어 "유전자"는 폴리펩티드 사슬을 생성하는데 연관된 DNA 단편을 의미하며, 그것은 코딩 지역의 전위 또는 후위 지역, 예를 들어, 5' 비번역 (5'UTR) 또는 "선도" 서열 및 3' UTR 또는 "트레일러 (trailer)" 서열 뿐만 아니라 개별적인 코딩 단편 (엑손) 사이의 중간 (intervening) 서열 (인트론)을 포함할 수 있거나 아닐 수 있다.
본원에서 사용되는 것으로, "재조합체"는 이종 핵산 서열의 도입에 의하여 수식된 벡터 또는 그러한 수식된 세포로부터 유래된 세포를 포함한다. 그러므로 예를 들어, 제조합 세포는 세포의 원 (비-재조합) 형태 내에서와 동일한 형태로 발견되지 않는 유전자를 발현하거나 또는 인위적인 개입의 결과로서 적게 발현되거나 또는 전혀 발현되지 않는 비정상적으로 발현되는 원 유전자를 발현한다.
세포 내로 핵산 서열을 삽입하는 내용에 있어서, 용어 "도입된"은 "트랜스펙션", "형질 전환" 또는 "형질 도입"을 의미하며, 핵산 서열을 진핵 또는 원핵세포 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기에서 핵산 서열은 세포의 게놈으로 통합되고 (예를 들어, 염색체, 플라스미드, 플라스티드, 또는 미토콘드리아성 DNA), 자가 레플리콘 (replicon)으로 전환되거나, 또는 일시적으로 발현될 수 있다 (예를들어, 트랜스펙션된 mRNA).
본원에서 사용되는 것으로, 용어 "발현"은 폴리펩티드가 유전자의 핵산 서열에 기초하여 생산되는 과정을 나타낸다. 과정은 전사 및 번역을 포함한다.
용어 "신호 서열"은 단백질의 N-말단 부분에 아미노산 서열을 나타내며, 그것은 세포 외부로 성숙한 형태의 단백질의 분비를 촉진한다. 성숙한 형태의 세포외성 단백질은 분비 과정 동안 절단되어 신호 서열이 제거된다.
벡터를 함유하고 발현 구조물의 복제, 또는 전사 및 번역 (발현)을 지지하는 세포는 용어 "숙주 세포"에 의하여 의미된다. 본 발명에서 사용되는 숙주세포는 대장균과 같은 원핵세포 또는 효모, 식물, 곤충, 양서류, 또는 포유류 세포일 수 있다.
본원에서 사용되는 것으로, 활성 작용제의 "효과적인 양" 또는 "약학적으로 효과적인 양"은 표적 세포 또는 개체의 생리학적 변수에 있어서의 측정가능한 변화를 유도 및/또는 1 또는 그 이상의 약학적 투여량 단위의 투여를 통하여 활성 작용제 발현 또는 활성을 제공 또는 조절하기에 충분한 양을 나타낸다. 그러한 효과적인 양은 그들의 조건, 신장, 체중, 나이, 및/또는 건강, 활성 작용제 (예를 들어, 우레아제 또는 우레아제 모듈레이터)를 투여하는 방식, 투여되는 특별한 활성 작용제, 및 다른 인자에 의존하여 개인마다 다양할 수 있다. 결과적으로, 특별한 환경에서 특정 환자를 위한 효과적인 양은 경험상 결정하는 것이 유용할 수 있다.
본원에서 인용된 모든 문헌 및 특허는 본 발명과 연관되어 사용될 수 있는 조성물 및 방법을 설명 및 공개하기 위한 목적으로 참고문헌에 의하여 본원에 수록된다.
II . 발명의 구성
하나의 관점에 있어서, 본 발명은 암세포의 성장을 저해하는데 사용하기 위한 활성 작용제로서 우레아제를 함유하는 조성물을 포함한다. 다음에 설명되는 바와 같이, 화학적 물질 (chemical entity)은 암세포로 활성 작용제의 전달을 향상시키기 위하여 활성 작용제와 연관될 수 있다. 본원에서 설명되는 바와 같이, 환자의 암세포를 우레아제에 노출시키는 것은 환자의 암에 대한 효과적인 치료를 제공한다. 암세포는 종양, 예를 들어, 고형암, 반-고형암내에 함유될 수 있다. 택일적으로, 암세포는 환자의 혈류에서 순환할 수 있다.
암, 종양 및/또는 네오플라즘 (neoplasm)은 세포의 증식이 조절되지 않고 진행성인 세포 또는 조직의 새로운 성장을 포함한다. 어떠한 그러한 성장은 양성이지만, 다른 것은 "악성"으로 명명되며, 생명체의 죽을을 이끈다. 악성 네오플라즘은 공격적인 세포성 증식을 나타내는데 추가하여, 암이 주위 조직을 침입하고 전이된다는 점에서 양성 성장과는 구별된다. 더구나, 악성 종양은 그들은 분화, 및 서로간 및 그들의 주위 조직과 관계된 그들의 조직화의 커다란 손실을 나타낸다는 점으로 특징된다.
본 발명의 조성물에 포함된 구성요소는 아래에서 고려된다.
A. 우레아제
상기 언급된 바와 같이, 조성물 내의 활성 작용제는 우레아제이다. 우레아제는 예를 들어, 세균, 식물, 곰팡이 및 바이러스를 포함하는 어떠한 기원일 수도 있다. 수 많은 연구는 진화적으로 분화된 다양한 세균, 식물, 곰팡이 및 바이러스로부터의 우레아제의 유전학에 대한 상세한 정보를 제공하였다 (Mobley, H. L. T. 등 (1995) Microbiol. Rev. 59: 451-480; Eur. J. Biochem., 175, 151-165 (1988); Labigne, A. (1990) International publication No. WO 90/04030; Clayon, C. L. 등 (1990) NucleicAcid Res. 18, 362; 및 U. S. Patent Nos. 6,248,330 및 5,298,399, 각각은 참고문헌으로 본원에 수록). 우레아제가 식물에서 발견된다는 것은 특히 흥미로운 것이다 (Sirko, A. 및 Brodzik, R. (2000) Acta Biochim Pol 47 (4): 1189-95). 하나의 예시적인 식물 우레아제는 작두콩 (jack bean) 우레아제이며, 실시예 2-3에서 설명된다. 작두콩의 예시적인 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 7에서 나타난다.
유용한 우레아제 서열은 공공 데이터베이스, 예를 들어, Entrez (http://www.ncbi.nim.nih.gov/Entrez/)에서 확인될 수 있다. 추가적으로, 다양한 생명체로부터 우레아제를 증폭하기 위하여 유용한 프라이머는 Baker, K. M. 및 Collier, J. L. (http://www.science.smith.edu/departments/Biology/lkatz/NEMED_ webpage/abstracts.html)에 의하여 설명된 바와 같이 사용될 수 있거나, 또는 Rose 등, (1998) Nucl. Acids Res. 26: 1628에서 설명된 바와 같이 CODEHOP (COnsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primer)를 사용할 수 있다.
우레아제는 종양세포와 접촉할 수 있거나, 종양세포 주변의 세포외 환경 또는 세포간 체액에 위치되거나, 또는 암세포 또는 암세포 근처 세포 내에서 발현될 수 있다. 개체 내의 세포간 체액으로 우레아제의 첨가함으로서 우레아제에 의한 암세포의 성공적인 저해에 잠재되어 있는 어떠한 특이적 분자 메카니즘에 의하여 결합되는 것을 원하지 않는다면, 우레아제 화합물은 암세포가 움직이는 세포간 체액의 pH로 증가될 수 있다. 이러한 효소적 활성은 pH를 증가시켜 보다 염기성 환경을 만든다 (도 1A-1D). 암세포 주변의 환경은 전형적으로 산성이다 (Webb, S. D. 등 (2001) Novartis Found Symp 240: 169-81).
그러므로, 이러한 방식으로 세포외 환경의 pH 증가에 의하여, 암세포의 성장이 저해된다. 따라서, 본 발명의 특정 구체예에서 활성 작용제의 첨가는 세포간 체액의 pH를 약 0.1 pH 단위, 예를 들어, 0.1-0.5 pH 단위 또는 그 이상으로 증가시킨다.
그러므로, 본 발명의 활성 작용제는 천연에서 생성되는 우레아제 뿐만 아니라, 기능적으로 활성인 그들의 변형체를 포함한다. 2가지의 일반적인 형태의 아미노산 서열 변형체가 고려된다. 아미노산 서열 변형체는 우레아제 활성을 파괴하지 않는 특이적 아미노산에서 1 또는 그 이상의 치환을 가지는 것이다. 이러한 변형체는 잠재성 변형체 및 실질적으로 동종이고 기능적으로 천연 단백질과 동등한 보존적으로 수식된 변형체를 포함한다. 천연 단백질의 변형체는 천연 단백질에 "실질적으로 동종"이며, 이때 적어도 약 80 %, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90 %, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 95 %, 더더욱 바람직하게는 98 %, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 약 99 %의 아미노산 서열이 천연 단백질의 아미노산 서열과 동등하다. 변형체는 1 만큼 적게 또는 최대 10, 또는 그 이상의 아미노산에 의하여 다를 수 있다.
두번째 형태의 변형체는 우레아제의 활성 단편으로 분리되는 우레아제의 크기 변형체를 포함한다. 크기 변형체는 예를 들어, 우레아제를 단편화, 화학적 수식, 단백질분해효소적 절단, 또는 그들의 조합에 의하여 형성될 수 있다. 추가적으로, 유전공학 기술 뿐만 아니라 아미노산 잔기로부터 직접적으로 폴리펩티드를 합성하는 방법이 크기 변형체를 생산하기 위하여 적용될 수 있다.
천연 우레아제와 실질적으로 동등한 생물학적 활성을 가지는 단백질을 생산하는 하나의 사슬로 정의되는 변형체의 서열은 "기능적으로 등가"를 의미한다. 중요한 서열 변형을 포함하는 그러한 기능적으로 등가인 변형체는 또한 본 발명에 의하여 포함된다. 그러므로, 천연 우레아제 단백질의 기능적인 등가 변형체는 치료적으로 유용한 충분한 생물학적 활성을 가질 것이다. 기능 등가를 결정하기 위한 방법은 종래 기술을 이용할 수 있다. 생물학적 활성은 실시예 3에서와 같이 천연 우레아제 단백질의 측정을 위하여 특별히 디자인된 분석법을 사용하여 측정될 수 있다. 추가적으로, 생물학적으로 활성인 천연 단백질에 대한 항체는 기능적으로 등가인 변형체에 결합하는 그들의 능력을 위하여 검사될 수 있는데, 여기에서 효과적인 결합은 천연 단백질의 구조와 유사한 구조를 가지는 단백질을 지시한다.
유전자 코드의 축퇴성에 기인하여, 본 발명의 우레아제 폴리펩티드를 코드하는 다중의 핵산 서열이 생산될 수 있고, 그것의 일부는 알려진 우레아제 핵산 서열에 최소한의 서열 유사성을 가질 수 있다는 것은 당업자에 의하여 이해될 것이다. 그러한 "잠재성 변형"은 다음에 토론되는 "보존적으로 수식된 변형"의 하나의 종이다. 본 발명은 가능한 코돈 선택에 기초한 조합을 선택함으로서 만들어 질 수 있는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 각 및 모든 가능한 핵산 서열의 변형체를 제공한다. 이러한 조합은 본 발명의 우레아제 단백질 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 적용되는 바와 같은 표준 트리플렛 유전자 코드에 따라 만들어진다.
본 발명의 우레아제 폴리펩티드는 알려진 우레아제 폴리펩티드 서열의 1 또는 그 이상의 보존적으로 수식된 변형체 (또는 간단히 "보존적 변형체")를 포함한다. 그러한 보존적 변형체는 단일 아미노산 또는 작은 페센트의 아미노산을 변화, 첨가 또는 결실하는 치환, 첨가 또는 결실을 포함한다. 당업자라면, 서열에 있어서 단일 아미노산 또는 작은 페센트의 아미노산을 치환, 결실, 또는 첨가하는 개별적인 치환, 결실, 또는 첨가 (전형적으로 5 % 미만, 보다 전형적으로 4 %, 2 %, 1 %, 또는 그 이하보다 적음)는 전형적으로 보존적 변형체를 구성하며, 이때 그러한 변화는 아미노산의 결실, 아미노산의 첨가, 또는 화학적으로 유사한 아미노산으로 아미노산의 치환으로 결과된다는 것을 이해할 것이다.
기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업자에게 잘알려진다. 표 1은 서로 서로에 대하여 보존적 치환 또는 보존적 변형인 아미노산을 함유하는 6군으로 나타난다.
Figure pat00001
아미노산의 추가적인 군이 또한 공식화 될 수 있다. 예를 들어, 아미노산은 유사한 기능 또는 화학적 구조 또는 구성 (예를 들어, 산성, 염기성, 지방족, 방향족, 황-함유)에 의하여 군으로 될 수 있다. 예를 들어, 지방족군은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신을 포함할 수 있다. 서로 서로에 대하여 보존적 치환인 아미노산을 함유하는 다른 군은 다음을 포함한다: (i) 방향족: 페닐알라닌, 티로신, 트립토판; (ii) 황-함유: 메티오닌, 시스테인; (iii) 염기성: 아르기닌, 리신, 히스티딘; 및 (iv) 산성: 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민. 아미노산의 추가적인 군에 대하여는 Creighton (1984) Proteins, W. H. Freeman and Company를 참고.
보존적으로 치환된 서열을 포함하는 본 발명의 우레아제 단백질 서열은 단백질의 정제를 위하여 1 또는 그 이상의 도메인의 첨가할 때 (예를 들어, 폴리 히스티딘 단편, FLAG 태그 단편 등) 발생하는 것과 같이 거대한 폴리펩티드 서열의 부분으로서 존재할 수 있으며, 예를 들어, 여기에서 추가적인 기능 도메인은 단백질의 우레아제 단백질 부분의 활성이 적거나 거의 없거나, 또는 여기에서 추가적인 도메인은 단백질분해효소로 처리에 의하는 것과 같은 후기 합성 공정 단계에 의하여 제거될 수 있다.
비-기능적 서열의 추가와 같은 본 발명의 핵산 분자의 코딩된 활성을 변화시키지 않는 1 또는 그 이상의 핵산의 첨가는 염기성 핵산 분자의 보존적 변형체이고, 본 발명의 폴리펩티드의 활성을 변화시키지 않는 1 또는 그 이상의 아미노산의 첨가는 염기성 폴리펩티드의 보존적 변형이다. 양자의 그러한 형태의 첨가는 본 발명의 특징이다. 공개된 핵산 구조물의 많은 보존적 변형이 기능적으로 동등한 구조물을 수득한다는 것은 당업자라면 이해할 것이다.
서열 관계를 결정하는 많은 방법이 사용될 수 있으며, 메뉴얼 얼라인먼트 (manual alignment), 및 컴퓨터로 보조된 서열 얼라인먼트 및 분석을 포함한다. 후자의 접근은 컴퓨터-보조된 방법에 의하여 수행되는 증가된 작업 처리량 때문에 본 발명의 바람직한 접근이다. 서열 얼라인먼트를 수행하기 위한 다양한 컴퓨터 프로그램이 이용가능하고 기술자에 의하여 생산될 수 있다.
상기 서술된 바와 같이, 본 발명의 개체에 적용되는 핵산 및 폴리펩티드 (및 그들의 단편)의 서열은 동일할 필요는 없지만, 실질적으로 본 발명의 우레아제 폴리펩티드 또는 핵산 분자 (또는 그들의 단편) 또는 관련된 분자의 서열에 상응하게 동등 (또는 실질적으로 유사)하게 될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 보존적 또는 비-보존적이든 1 또는 그 이상의 아미노산 또는 핵산 삽입, 결실 및 치환과 같은 다양한 변화에 적용될 수 있으며, 여기에서, 예를 들어, 그러한 변화는 그들의 사용, 예를 들어, 그들의 치료적 또는 예방적 사용 또는 투여 또는 진단적 응용에 있어서 어떠한 이점을 제공할 수 있다.
비교적 짧은 아미노산 서열 (약 30 잔기보다 적은)의 얼라인먼트 및 비교는 전형적으로 진행된다. 더 긴 서열의 비교는 두 서열의 최적의 얼라인먼트를 달성하기 위하여 더 복잡한 방법이 요구될 수 있다. 비교 창을 얼라인하기 위한 최적의 얼라인먼트는 Smith 및 Waterman (1981) Adv Appl Math 2: 482의 국부적 상동성 알고리즘에 의하여, Needleman 및 Wunsch (1970) J Mol Biol 48의 상동성 얼라인먼트 알고리즘에 의하여, Pearson 및 Lipman (1988) Proc Nat'l Acad Sci USA 85: 2444의 유사성 방법의 조사에 의하여, 이러한 알고리즘 의 컴퓨터화된 보충 (Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA; 및 BLAST, 예를 들어, Altschul 등 (1977) Nuc Acids Res 25: 3389- 3402 및 Altschul 등 (1990) J Mol Biol 215: 403-410 참고)에 의하여, 또는 선택되어진 다양한 방법에 의하여 생성되어진 최상의 얼라인먼트 (즉, 비교창에 대한 서열 유사성 또는 서열 동일성의 최고의 백분율로 결과되는)로 검사함에 의하여 도출될 수 있다.
페센트 서열 동일성 (퍼센트 동일성) 및 서열 유사성에 적합한 예시적인 알고리즘은 Pearson, W. R. & Lipman, D. J. (1988) Proc Nat'l Acad Sci USA 85: 2444에서 설명된 FASTA 알고리즘이다. 또한 W. R. Pearson (1996) Methods Enzymology 266: 227-258를 참고. 퍼센트 동일성을 계산하기 위한 DNA 서열의 FASTA 얼라인먼트에서 사용된 바람직한 변수는 BL50 Matrix 15:-5, k-tuple=2; joining penalty=40, optimization=28; gap penalty=-12, gap length penalty=-2; 및 width=16로 최적화된다.
상기 토론된 검사 및 얼라인먼트 알고리즘은 또한 핵산 서열을 비교하는 요구 서열의 치환을 가진 폴리뉴클레오티드 서열의 동정 및 평가를 위하여 적용되며, 여기에서 바람직한 핵산 데이터베이스의 선택은 당업자에게는 당연한 것이 될 것이다.
B. 관련된 화학적 물질
본 발명의 조성물은 암세포로 활성 작용제의 전달을 향상시키기 위하여 활성 작용제와 관련된 화학적 물질을 포함할 수 있다. 다양한 관련된 화학적 물질이 다음 설명되는 바와 같이 사용을 위하여 고려된다.
B1. 폴리머
화학적 물질은 예를 들어, 친수성 폴리머 및 소수성 폴리머를 포함하는 폴리머를 포함할 수 있으며, 친수성 폴리머가 바람직하다. 본원에서 사용되는 것으로 용어 "친수성"은 예를 들어, 일반적으로 물과 쉽게 연관될 수 있는 폴리머인 조성물, 물질 또는 재료를 나타낸다. 그러므로, 본 발명에서 적용될 수 있는 친수성 폴리머는 다양한 형태의 도메인, 예를 들어, 보다 친수성인 도메인 및 보다 소수성인 도메인을 가질 수 있을 지라도, 친수성 폴리머의 전체적인 특징은 바람직하게 친수성이며, 이 친수성은 비교적 더 친수성 내지 비교적 덜 친수성의 연속을 따라 다양하게 될 수 있다.
다양한 범위의 폴리머가 본 조성물 및 제형으로 적용될 수 있다. 일반적으로, 폴리머는 원하는 친수성 및/또는 소수성을 가지는 것이며, 그것은 매트릭스 뿐만 아니라 본원에서 설명된 것과 같은 표적 리간드와 공유적으로 부착하는 형태일 수 있다. 폴리머는 교차연결 또는 비-교차연결일 수 있다. 본원에서 사용되는 것으로 용어 "교차연결", "교차연결된" 및 "교차연결하는"은 일반적으로 1 또는 그 이상의 다리에 의하여 예를 들어 폴리머인 2 또는 그 이상의 화합물 또는 물질의 연결을 나타낸다. 1 또는 그 이상의 요소, 군 또는 화합물로 구성될 수 있는 다리는 일반적으로 제 1 화합물 또는 물질 분자를 제 2 화합물 또는 물질 분자의 원자에 연결하는데 작용한다. 교차연결 다리는 공유 및/또는 비-공유적 연관과 관련될 수 있다. 다양한 요소, 군 및/또는 화합물의 어떠한 것은 교차연결 상의 다리를 형성할 수 있고, 화합물 또는 물질은 천연적으로 또는 합성적 수단에 의하여 교차연결될 수 있다.
어떠한 구체예에 관하여, 선상, 별모양 또는 분지된 것이든 폴리머는 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리알킬렌 이민, 폴리알킬렌 아민, 폴리알킬렌 설피드, 폴리알킬렌 설포네이트, 폴리알킬렌 설폰, 폴리(알킬렌설포닐알킬렌이민) 및 그들의 코폴리머로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 지적된 바와 같이, 적용된 특정 폴리머에 의존하여, 폴리머는 비교적 더 친수성 또는 비교적 더 소수성일 수 있다. 적합한, 비교적 보다 친수성 폴리머의 예는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 분지된 폴리에틸렌 이민, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리락티드, 폴리(락티드-코-글리콜라이드), 폴리소르베이트, 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리(에틸렌 옥사이드-코-프로필렌 옥사이드), 폴리(옥시에틸레이트화된) 글리세롤, 폴리 (옥시에틸레이트화된) 솔비톨, 폴리 (옥시에틸레이트화된 글루코오스), 폴리메틸옥사졸린, 폴리에틸옥사졸린, 폴리히드록시에틸옥사졸린, 폴리히드록시프로필옥사졸린, 폴리비닐 알코올, 폴리 (히드록시알킬카르복실산), 폴리히드록시에틸 아크릴산, 폴리히드록시프로필 메트아크릴산, 폴리히드록시발레레이트, 폴리히드록시부티레이트, 폴리옥사졸리딘, 폴리아스파르타미드, 폴리시알산, 및 그들의 유도체, 혼합물 및 코폴리머를 포함하지만 여기에 한정되는 것은 아니다.
따라서, 폴리머, 바람직하게는 친수성은 활성 작용제 또는 다른 연관된 화학적 물질과 콘주게이트되어 암세포로 활성 작용제의 전달을 향상시킬 수 있다. 폴리머 활성 작용제 콘주게이트는 바람직하게 혈액 순환 시간을 연장 및/또는 항원성 및/또는 천연, 또는 비-유도된, 활성 작용제와 비교하여 상기 조성물으 면역원성이 감소되는 효과적인 양으로 투여된다. 특히 바람직한 친수성 폴리머는 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐메틸에테르, 폴리히드록시프로필 메트아크릴아미드, 폴리히드록시프로필 메트아크릴레이트, 폴리히드록시에틸 아크릴레이트, 폴리메트아크릴아미드, 폴리디메틸아크릴아미드, 폴리메틸옥사졸린, 폴리에틸옥사졸린, 폴리히드록시에틸옥사졸리온, 폴리히드록시프로피옥사졸린, 폴리아스파르타미드, 및/또는 친수성 셀룰로오스 유도체를 포함하지만 여기에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 친수성 폴리머는 예를 들어, 분자량 1,000 내지 10,000 달톤을 가지는 폴리에틸렌 글리콜이다. 하나의 구체예에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜은 분자량 1,000 내지 5,000 달톤이다. 본 발명에서 사용되기 위하여 고려되는 추가적인 폴리머는 본원에서 참고문헌으로 수록된 2002년 4월 11일 공개된 U. S. Pre-Grant Published No. 20020041898에서 보다 상세히 설명된다.
B2. 표적 부분
표적 부분은 본 발명의 화학적 물질로 고려되고, 암세포와 같은 한정되고, 선택된 세포 형태 또는 표적 세포 군집에 결합된다. 이러한 고려에 있어서, 유용한 표적 부분은 항체 및 항체 단편, 펩티드, 및 호르몬을 포함한다. 공지된 세포 표면 수용체 (저밀도지단백질, 트랜스페린 및 인슐린을 포함), 피브린분해 효소, 항-HER2, 아넥신과 같은 혈소판 결합 단백질, 및 생물학적 응답 모듈레이터 (인터류킨, 인터페론, 에리트로포이에틴 및 콜로니-자극 인자를 포함)에 해당하는 단백질이 또한 표적 부분으로 고려된다.
올리고뉴클레오티드, 예를 들어, 표적세포 핵산 부분에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드가 본 발명의 표적 부분으로 사용될 수 있다. 표적 부분은 또한 표적 세포 부분에 결합하는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 한정된 표적 세포 군집에 결합하는 능력을 보유하는 상기-열거된 표적 부분이 또한 표적 부분으로 사용된다.
앞서 언급된 표적 부분의 작용 등가물이 또한 본 발명의 표적 부분으로 사용된다. 예시적인 표적 부분 작용 등가물은 표적 부분 표적세포 결합을 위하여 적합하게 구조 및/또는 방향을 흉내내어 디자인된 유기화학적 구조물이다. 또 다른 표적 부분 작용 등가물은 표적 부분의 결합 친화도를 나타내는 짧은 폴리펩티드이다.
본 발명의 바람직한 표적 부분은 항체, 펩티드, 올리고뉴클레오티드 또는 이와 유사한 것이며, 그것들은 표적 세포의 표면 상의 항원과 반응한다. 상업적으로 이용가능 또는 문헌에서 설명된 다클론성 및 단일클론성 항체가 적용될 수 있다. 항체는 전체 항체 또는 그들의 단편이 될 수 있다. 단일클론항체 및 단편은 하이브리도마 합성, 재조합 DNA 기술 및 단백질 합성과 같은 종래 기술에 따라 생산될 수 있다. 유용한 단일콜론항체 및 단편은 어떠한 종 (인간을 포함)으로부터 유래될 수 있거나, 또는 1 종 이상의 서열이 적용된 키메릭 단백질로서 형성될 수 있다.
본 발명의 하나의 구체예에 있어서, 인간 단일클론항체 또는 인간화된 뮤린항체가 표적 부분으로서 사용된다. 인간화된 표적 부분은 숙주 수용체 내의 항체 또는 폴리펩티드의 면역반응을 감소, 반감기의 증가를 허용, 역면역반응을 감소하게 할 수 있다. 뮤린 단일클론항체는 예를 들어, 뮤린 Fv 영역 또는 그들의 상보성결정영역을 코딩하는 핵산서열과 인간 불변 도메인 영역 및 Fc 영역을 코딩하는 핵산서열을 유전적으로 재조합함에 의하여 인간화될 수 있다. 뮤린 잔기는 또한 인간 가변 영역 프레임워크 도메인내에 보유되어, 적합한 표적 위치 결합 특징을 보장할 수 있다. 표적 부분의 비-제한 예는 Slepnev 등, Bioconjugate Chem. 3: 273-274 (1992)에 의하여 설명되는 뇌신경교세포 (알파-2-당단백질)에 대한 항-알파-2-GP이다. 암세포로 다양한 할성 작용제의 전달을 위하여 유전적으로 조작된 항체는 Bodey, B. (2001) Expert Opin Biol. Ther. 1 (4): 603-17에서 확인된다.
*본 발명의 다른 구체예에 있어서, 표적 부분은 표적 세포의 표면상의 수용체와 반응하는 리간드이다. 그러므로, 표적 부분은 세포성 결합 구성요소, 세포성 결합 구성요소에 의하여 인식된 탄수화물 부분을 함유한 어떠한 분자 및 세포성 결합 구성요소에 결합하는 드러그 또는 작은 분자에 대한 친화성을 가진 호르몬을 제한 없이 포함할 수 있다. 어구 "결합 구성요소"는 수용체 및 억셉터 (acceptor) 분자 양자를 포함한다. 바람직하게, 결합 구성요소는 세포-표면 결합 구성요소이다. 하나의 구체예에 있어서, 표적 부분은 표적 위치에 결합하는 인슐린과 같은 자연적으로 생성되는 단백질이다. 인터류킨 및 그래뉼로사이트/마크로파아지 콜로니 자극 인자 (granulocyte/macrophage colony stimulating factor) (GM-CSF) 및 종양괴사인자 (tumor necrosis factor) (TNF)를 포함하는 시토카인은 또한 높은 수준의 그들의 수용체를 발현하는 특이적 세포에 결합하는 것으로 알려진 특이적 표적 부분이다 (Terlikowski, SJ (2002) Toxicology 174 (3): 143-152).
비-표적 세포 또는 조직에 우레아제 또는 다른 활성 작용제 노출을 감소시키기 위하여, 표적 부분은 표적 특이성 및 반응성을 보유하는 반면, 최소한의 비-표적 반응성을 나타내는 것을 동정하기 위하여 검색될 수 있다. 비-표적 노출 (및 역 비-표적 위치화 및/또는 독성)을 감소함에 의하여, 우레아제 또는 다른 활성 작용제의 증가된 투여량이 투여될 수 있다. 이것은 수용할 수 없는 비-표적 독성의 역가 (threshold) 아래에 남아 있는 동안, 표적세포의 노출을 최대화하기 위한 우레아제 또는 다른 치료적 작용제의 최대 가능 농도의 투여를 허용한다.
본 발명의 어떠한 구체예에 있어서, 2 또는 그 이상의 활성 작용제 표적 부분 콘주게이트가 적용되고, 상기 각 콘주게이트는 다른 표적 부분, 예를 들어, 다른 항체 종을 포함한다. 사용된 표적 부분의 각각은 다른 표적 동일 또는 다른 표적 위치와 관련될 수 있는 다른 표적 위치 영역과 결합된다. 각 투여된 콘주게이트의 활성 작용제 성분은 동일 또는 다를 수 있다. 예를 들어, U. S. Patent Nos. 4,867,962 및 5,976,535를 참고, 그것의 각각은 본원의 참고 문헌에 의하여 수록된다. 본 발명의 본 구체예의 실시에 있어서, 각 표적 부분, 예를 들어, 항체 종은 다른 표적 위치 지역, 예를 들어, 표적 위치 에피토프를 인식하기 때문에 표적 위치로 활성 작용제 콘주게이트의 표적 위치 첨가가 개선된다. 이러한 택일적인 표적 위치 영역 접근은 활성 작용제에 대한 보다 잠재성인 표적 위치 결합 점을 제공한다. 결과적으로, 예를 들어, 에피토프 포화 및/또는 입체 장애를 통한 실질적 또는 효과적인 표적 위치 포화는 피해질 수 있다. 그러므로, 활성 작용제, 예를 들어, 우레아제의 추가적인 축적이 성취될 수 있다. 택일적으로, 또는 조합으로, 예를 들어, 표적 위치에서 촉매적으로 활성인 전효소 (holoenzyme)의 생산을 위한 추가적인 우레아제 특이적 유전자 산물이 활성 작용제로서 적용될 수 있다. 예시적인 우레아제 아포효소는 세균성 ureABC 유전자에 의하여 코드되는 감마, 베타 및 알파 서브유니트를 포함한다 (Burne, R. A. 및 Chen, Y. M. (2000) Microbes and Infection 2 : 533-542).
특별한 표적 위치에 대하여 제시된 단일클론항체를 위한 교차-반응성의 양상은 진단 또는 치료적 적용에서 사용되기 위한 비-중첩 교차 반응성을 가진 2 또는 그 이상의 표적 특이적 단일클론 항체의 세트를 동정하기 위하여 분석될 수 있다. 어구 "교차 반응성의 비-중첩 양상"은 하나의 항체 종에 의하여 결합된 비-표적 조직은 실질적으로 다른 항체 종에 의하여 결합된 비-표적 조직과는 다르다는 것을 지적한다. 교차-반응성의 양상은 치료적 적용을 위한 활성 작용제의 노출을 비율적으로 감소시키는데 필요한 정도로 다르다. 적은 항체 쌍 (또는 더 큰 세트의 항체) 중첩이 바람직하다.
항체는 다양한 방법에 의하여 검색될 수 있다. 면역혈청화학적 분석이 표적 조직과의 반응성 및 비-표적 조직과의 교차-반응성을 결정하기 위하여 적용될 수 있다. 항체 종이 결합하는 조직은 항체를 조직에 노출, 어떠한 결합되지 않은 항체를 제거하기 위하여 조직을 세척, 그리고 결합된 항체의 존재를 검출함에 의하여 확인될 수 있다. 시험관 내 혈청화학 과정은 당해 기술 분야에서 공지된다. 예를 들어, Sanchez-lslas, E. 및 Leon-Olea, M. (2001) Nitric Oxide 5 (4): 302-16 참고.
본 발명의 조성물은 또한 hCG-분비 종양의 치료에 유용할 수 있다. 태반 영양포 (placenta trophoblast)는 hCG의 합성의 정상 위치이므로, 임신 또는 비임신 영양포성 종양은 hCG를 합성하고 분비한다. 더구나 hCG 측정은 이러한 종양, 종양 단계, 및 치료의 효과를 관찰하기 위하여 상당히 유용하다. 더하여, 어떠한 비영양포성 종양은 정규 장소 밖으로 hCG를 생산할 수 있다. hCG는 어떠한 종양에 대하여 성장 인자로서 작용할 수 있다 (Melmed S. 및 Braunstein GD: Human chorionic gonadotropin stimulates proliferation of Nb 2 rat lymphom cells. J. Clin. Endocrinol. Metab 56: 1068-1070, (1983)). 예를 들어, 본원에서 참고 문헌에 의하여 수록된 U. S. Patent No. 6,448,022을 참고.
그러므로, 본 발명의 하나의 구체예에 있어서, 활성 작용제를 hCG-분비 종양에 표적시키기 위한 항-hCG 항체의 사용은 hCG-분비 종양의 성장을 억제한다. 그러므로, 특정 구체예에 있어서, 본 발명의 화학적 물질은 활성 작용제에 부착된 표적 부분, 항-종양 항원 항체, 항-hCG 항체 또는 암-세포 표면 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드이다. 바람직하게, 표적 부분은 융합 단백질을 형성하기 위하여 우레아제 효소에 연결된 폴리펩티드이다.
상기 지적된 바와 같이, 본 발명의 하나의 구체예에 따라, 활성 작용제는 표적 부분과 직접적으로 콘주게이트된다. 택일적으로, 본 발명의 다른 구체예에 있어서, 2 또는 3 단계 접근이 활성 작용제를 암세포에 전달하기 위하여 사용된다. 그러므로, 활성 작용제는 제2 결합 파트너와 상호작용할 수 있는 제1 결합 파트너 및 제 2 결합 파트너를 포함하는 표적 부분을 포함할 수 있는 화학적 물질을 포함할 수 있다. 이러한 구체예는 다음의 섹션 Ⅲ에서 보다 상세하게 설명된다.
당업자라면 본 발명의 표적 부분 및 활성 작용제는 어떠한 순서로도 연결될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 그러므로, 여기에서 표적 부분은 폴리펩티드이고, 활성 작용제는 표적 분자의 아미노 또는 카르복시 말단에 연결될 수 있다. 표적 부분은 또한 활성 작용제의 내부 영역에 연결될 수 있거나 또는 역으로 활성 작용제는 부착이 분자의 각각의 특성을 방해하지 않는 한 표적 부분의 내부 위치에 연결될 수 있다.
*표적 부분 및 활성 작용제는 당업자에 의하여 잘 알려진 많은 수단 중 어떠한 것에 의하여 부착된다. 전형적으로, 활성 작용제는 직접 또는 링커 (스페이서)를 통하여 표적 부분으로 콘주게이트된다. 그러나, 여기에서 표적 부분 및 활성 작용제가 폴리펩티드이고, 그것은 단일-사슬 융합 단백질과 같은 키메릭 분자를 재조합적으로 발현하는 것이 바람직할 수 있다.
하나의 구체예에 있어서, 표적 부분 (예를 들어, ahEGFR IgG Ab)는 활성 작용제 또는 화학적 물질 (예를 들어, 드러그, 우레아제 또는 리포좀)에 화학적으로 콘주게이트된다. 분자를 화학적으로 콘주게이트 하는 바업은 당업자에 잘 알려진다.
하나의 작용제를 항체 또는 다른 폴리펩티드 표적 분자에 부착하기 위한 과정은 작용제의 화학적 구조에 따라 다양하게 될 것이다. 폴리펩티드는 전형적으로 다양한 작응기를 함유하며, 예를 들어, 카르복실산 (COOH) 또는 자유 아민 (-NH2)기가 표적 부분을 그것에 결합하기 위하여 활성 작용제 상의 적합한 작용기와 반응하는데 이용가능하다.
택일적으로, 표적 부분 및/또는 활성 작용제는 추가적인 반응성 작용기를 노출 또는 부착하기 위하여 유도될 수 있다. 유도화는 Pierce Chemical Company, Rockford Ⅲ로부터 이용가능한 것과 같은 많은 링커분자의 어떤 것의 부착과 관련된다.
본원에서 사용되는 것으로, "링커"는 표적 부분을 활성 작용제에 연결하는데 사용되는 분자이다. 링커는 표적 부분 및 활성 작용제 양자의 공유결합을 형성할 수 있다. 적합한 링커는 당업자에 공지되며, 곧은 또는 분지된 사슬 탄소 링커, 헤테로고리 탄소 링커, 또는 펩티드 링커를 포함하지만 여기에 한정되는 것은 아니다. 이때 표적 부분 및 활성 작용제 분자는 폴리펩티드이고, 링커는 그들의 곁 잔기를 통하여 (예를 들어, 시스테인에 이황화 연결을 통하여) 구성체 아미노산에 연결될 수 있다. 그러나, 바람직한 구체예에 있어서, 링커는 알파 탄소 원자 및 말단 아미노산의 카르복시기에 연결될 것이다.
특별한 작용제상의 하나의 기와 반응하는 하나의 작용기 및 항체와 반응하는 다른 기를 가지는 이중작용성 링커가 희망하는 면역콘주게이트를 형성하기 위하여 사용되어진다. 택일적으로, 유도화는 표적 부분의 화학적 처리, 예를 들어, 자유알데히드기를 생성하기 위하여 페리오데이트로 당단백질 항체의 당부분의 글리콜 절단과 관련될 수 있다. 항체 상의 자유 알데히드기는 작용제가 그곳에 결합하기 위하여 작용제 상의 자유 아민 또는 히드라진기와 반응할 수 있다 (U. S. Pat. No. 4,671,958 참고). 항체 또는 항체 단편과 같은 폴리펩티드 상의 자유 설프히드릴기의 생성을 위한 과정은 또한 공지이다 (U. S. Pat. No. 4,659,839 참고).
방사성핵종 금속 킬레이트, 톡신 및 드러그를 포함하는 여러가지 화합물을 항체와 같은 단백질에 부착하기 위한 많은 과정 및 링커 분자는 공지이다 (예를 들어, European Patent Application No. 188,256; U. S. Pat. Nos. 4,671,958, 4, 659,839, 4,414,148, 4,699,784; 4,680,338; 4,569,789; 및 4,589,071; 및 Borlinghaus 등, (1987) CancerRes 47: 4071-4075). 특히, 다양한 면역독소의 생산은 기술 분야에서 공지이고, 예를 들어, "Monoclonal Antibody-Toxin Conjugates: Aiming the Magic Bullet", Thorpe 등, Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, Academic Press, pp. 168-190 (1982), Waldmann (1991) Science, 252: 1657, U. S. Pat. Nos. 4,545,985 및 4,894,443에서 발견될 수 있다.
어떠한 환경에 있어서, 키메릭 분자가 그것의 표적 위치에 도달했을 때, 표적 부분으로부터 활성 작용제 분자가 자유로이 되는 것이 바람직하다. 그러므로, 표적 위치의 공간에서 절단 가능한 연결을 포함하는 키메릭 콘주게이트는 효과자 (effector)가 표적 위치에 방출되어질 때, 사용되어질 수 있다. 표적 부분으로부터 작용제를 방출하기 위한 연결의 절단은 효소적 활성 또는 콘주게이트가 표적 세포의 내부 또는 표적 위치의 공간에 위치되는 조건에 의하여 촉진된다. 표적 위치가 종양일 때, 종양 위치에서 존재하는 조건 하에서 (예를 들어, 종양 관련 효소 또는 산성 pH에 노출될 때) 절단 가능한 링커가 사용될 수 있다는 것이 이해되어야한다.
많은 다른 절단가능한 링커가 당업자에게 공지된다 (U. S. Pat. Nos. 4,618,492; 4,542,225, 및 4,625,014 참고). 이러한 링커 기로부터 활성 작용제의 방출을 위한 메카니즘은 예를 들어, 광분해성 결합의 조사 및 산-촉매 가수분해를 포함한다. 예를 들어, U. S. Pat. No. 4,671,958는 생체 내에서 환자의 보체 시스템의 단백질 분해성 효소에 의하여 표적 위치에서 절단되는 링커를 포함하는 면역콘주게이트의 설명을 포함한다. 다양한 방사성진단 화합물, 방사성치료 화합물, 드러그, 톡신, 및 다른 작용제를 표적 부분에 부착하기 위한 보고된 많은 방법의 관점에서, 당업자라면 주어진 작용제를 선택된 표적 부분에 부착하기 위한 적합한 방법을 결정할 수 있을 것이다.
여기에서 표적 부분 및/또는 활성 작용제는 비교적 짧고, 그들은 표준 화학적 펩티드 합성 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 여기에서 양 분자는 비교적 짧고, 키메릭 분자는 단일 연속 폴리펩티드로서 합성될 수 있다. 택일적으로, 표벅 부분 및 활성 작용제는 분리되어 합성되어질 수 있고, 다음으로 한 분자의 아미노산 말단과 다른 분자의 카르복시 말단의 축합에 의하여 융합되어지고, 그것에 의하여 펩티드 결합이 형성된다. 택일적으로, 표적 부분 및 활성 작용제 분자는 펩티드 스페이서 분자의 한쪽 말단으로 각각 축합되며, 그것에 의하여 연속적인 융합 단백질이 형성된다.
서열의 C-말단 아미노산은 불용성 지지체에 부착되고, 서열 내의 나머지 아미노산의 순차적인 첨가가 뒤따르는 고상 합성이 본 발명의 폴리펩티드의 화학적 합성을 위한 방법에 대한 하나의 구체예로 고려된다. 고상 합성에 대한 기술은 Barany 및 Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis; pp. 3-284 in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Parf A., Merrifield 등, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156 (1963), 및 Stewart 등, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed. Pierce Chem. Co., Rockford, III. (1984)에 의하여 설명된다.
바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 키메릭 융합 단백질은 재조합 DNA 기술에 의하여 합성된다. 일반적으로, 이것은 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 만들고, 그 DNA를 특별한 프로모터의 통제하의 발현 카세트에 두고, 숙주에서 그 단백질을 발현하고, 발현된 잔백질을 분리하며, 만약 요구되어진다면, 단백질을 재생하는 것과 관련된다.
본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 DNA는 예를 들어, 적절한 서열의 클로닝 및 제한 또는 Narang et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 90-99의 인산삼에스테르 방법; Brown et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 109-151의 인산이에스테르 방법; Beaucage 등 (1981) Tetra. Lett., 22: 1859- 1862의 디에틸인산라미다이트 방법; 및 U. S. Pat. No. 4,458,066의 고상 지지체 방법과 같은 방법에 의한 직접적인 화학적 합성을 포함하는 어떠한 적합한 방법에 의하여 제조될 수 있다.
화학적 합성은 단일 사슬 올리고뉴클레오티드를 생산한다. 이것은 상보적인 서열과 혼성화에 의하여, 또는 주형으로서 단일 사슬을 사용한 DNA 합성효소로 폴리머화에 의하여 이중 사슬 DNA로 전환될 수 있다. 당업자는 DNA의 화학적 합성은 약 100 염기의 서열로 제한되며, 더 긴 서열은 짧은 서열의 연결 (ligation)에 의하여 획득될 수 있다는 것을 인식할 수 있다.
택일적으로, 서열들은 클로닝될 수 있고, 적합한 서열들은 적합한 제한효소를 사용하여 절단된다. 단편은 다음으로 원하는 DNA서열을 생산하기 위하여 연결될 수 있다.
두 분자는 바람직하게 필수적으로 직접적으로 함께 연결되는 경우, 당업자라면 분자들은 1 또는 그 이상의 아미노산으로 구성되는 펩티드 스페이서에 의하여 분리될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일반적으로 스페이서는 단백질을 연결하거나, 또는 어떠한 최소한 거리 또는 그들 사이의 다른 공간적인 관계를 보존하는 것과 다른 특이적인 생물학적 활성을 가지지 않을 것이다. 그러나, 스페이서를 구성하는 아미노산은 폴딩, 총전하, 또는 소수성과 같은 분자의 어떠한 특성에 영향을 주기 위하여 선택될 수 있다.
융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 대장균, 다른 세균성 숙주, 효모, 및 COS, CHO 및 HeLa 세포주 및 마이엘로마 (myeloma) 세포주와 같은 고등 진핵 세포를 포함하는 다양한 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 재조합 단백질 유전자는 각 숙주에 대한 바람직한 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결될 것이다. 대장균에 대하여, 이것은 T7, trp, 또는 람다 프로모터, 리보좀 결합 위치 및 바람직하게 전사 종결 서열과 같은 프로모터를 포함한다. 진핵 세포에 대하여, 조절 서열은 프로모터 및 면역글로불린 유전자, SV40, 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus) 등으로부터 유래된 인핸서, 및 폴리아데닐레이트 서열을 포함할 것이고, 스플라이싱 도너 및 억셉터 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 플라스미드는 대장균에 대한 염화칼슘 형질 전환 및 포유동물에 대한 인산칼슘 처리 또는 전기천공과 같은 잘 알려진 방법에 의하여 선택된 숙주 세포내로 전달될 수 있다. 플라스미드에 의하여 형질전환된 세포는 amp, gpt, neo 및 hyg 유전자와 같은 플라스미드 상에 함유된 유전자에 의하여 부여되는 항생물질에 댜한 저항성에 의하여 선택될 수 있다.
한번 발현되면, 재조합체 융합 단백질은 암모늄 설페이트 침전, 친화성 컬럼, 컬럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 및 이와 유사한 것 (R. Scopes (1982) Protein Purification, Springer-Verlag, N. Y.; Deutscher (1990) Methods in Enzymology Vol 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N. Y. 참고)을 포함하는 기술 분야의 표준 과정에 따라 정제될 수 있다. 적어도 약 90 % 내지 95 % 균질성의 실질적으로 순수한 조성물이 바람직하고, 98 내지 99 % 또는 그 이상의 균질성이 약학적 사용을 위하여 가장 바람직하다. 부분적으로 또는 원하는 바와 같이 균질성으로 일단 정제되면, 폴리펩티드는 다음으로 치료적으로 사용되어진다.
당업자라면, 화학적 합성, 생물학적 발현, 또는 정제 후에, 표적 융합 단백질이 구성 폴리펩티드의 천연 구조와 실질적으로 다른 구조를 소유할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 이러한 경우에 있어서, 폴리펩티드를 변성 및 환원시키고, 다음으로 폴리펩티드가 바람직한 구조로 재-폴딩을 야기하는 것이 필요하다. 단백질의 환원 및 변성 및 재-폴딩을 유도하는 방법은 당업자에게 장 알려진다 (Debinski 등 (1993) J. Biol. Chem., 268: 14065-14070; Kreitman 및 Pastan (1993) Bioconjug. Chem, 4: 581-585; 및 Buchner 등 (1992) Anal Biochem, 205: 263-270 참고).
당업자라면, 수식이 그들의 생물학적 활성의 감소 없이 표적 융합 단백질에 만들어질 수 있다. 어떠한 수식이 클로닝, 발현, 또는 표적 분자의 융합 단백질 내로의 통합을 촉진하기 위하여 만들어질 수 있다. 그러한 수식은 당업자에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 개시 위치를 제공하기 위하여 아미노 말단에 첨가된 메티오닌, 또는 종래 위치된 제한 위치 또는 종결 코돈을 생성하기 위하여 양 말단에 놓여지는 추가적인 아미노산을 포함한다.
B3. 포획된 활성 작용제
어떠한 구체예에 있어서, 본 발명은 활성 작용제 또는 활성 작용제들, 예를 들어, 우레아제를 암세포로 전달하기 위한 화학적 물질로서 리포좀 및/또는 나노캡슐과 같은 운반체의 사용이 고려된다. 그러한 제형은 본원에서 공개된 폴리펩티드, 약물, 및/또는 항체의 약학적으로 허용되는 제형의 도입을 위하여 바람직하게 될 수 있다. 리포좀의 형성 및 사용은 당업자에 일반적으로 공지된다 (예를 들어, Backer, M. V. 등 (2002) Bioconjug Chem 13 (3): 462-7 참고). 하나의 바람직한 구체예에 있어서, 공개된 조성물은 리포좀으로 포집될 수 있다.
나노캡슐은 일반적으로 안정하고 재생가능한 방식으로 화합물을 포집할 수 있다 (Whelan, J. (2001) Drug Discov Today 6 (23): 1183-84). 세포간 폴리머 오버로딩에 기인한 부작용을 피하기 위하여, 그러한 울트라파인 (ultrafine) 입자 (대략 0. 1 ㎛ 크기)가 생체 내에서 분해될 수 있는 폴리머를 사용하여 디자인될 수 있다. 이러한 요구에 부합하는 생분해성 폴리이소부틸시아노아크릴레이트 나노입자가 본 발명에서 사용되기 위하여 고려되고, 그러한 입자는 예를 들어, Lambert, G. 등 (2001) Int J Pharm 214 (1-2): 13-6에서 설명되는 바와 같이 쉽게 만들어질 수 있다. 생물학적으로 활성인 물질을 함유하는 폴리알킬-시아노-아크릴레이트 나노입자를 제조하는 방법 및 그들의 사용은 U. S. Pat. Nos. 4,329,332, 4,489,055 및 4,913,908에서 설명된다. 나노캡슐은 Capsulution, Inc.(www.capsulution.com)와 같은 공급원으로부터 상업적으로 이용가능하다.
활성 작용제의 전달을 위한 마노캡슐을 함유하는 약학적 조성물은 U. S. Pat. Nos. 5,500,224, 5,620,708 및 6,514,481에서 설명된다. U. S. Pat. No. 5,500,224는 표면 활성제가 용해되고, 500 나노미터 보다 작은 직경을 가지는 다수의 나노캡슐이 현탁된 것을 함유하는 오일로 필수적으로 구성되는 오일상을 포함하는 나노캡슐의 콜로이드성 현탁의 형태로의 약학적 조성물을 설명한다. U. S. Pat. No. 5,620,708은 드러그 및 다른 활성 작용제의 투여를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 조성물은 포유류 엔테로사이트 (enterocyte)의 표면상에 존재하는 표적 분자에 특이적으로 결합하는 결합 부분에 부착된 활성 작용제 캐리어 입자를 포함한다. 결합 부분은 입자 활성 작용제 캐리어의 엔도시토시스 또는 파고시토시스를 개시하기에 충분한 결합 친화성 또는 결합력을 가지는 표적 분자에 결합하여, 캐리어는 엔테로사이트에 의하여 흡수될 것이다. 활성 작용제는 다음으로 캐리어로부터 숙주의 전신 순환으로 방출될 것이다. 이러한 방식에 있어서, 장에서 폴리펩티드와 같은 분해-민감성 드러그의 분해는 장관으로부터 단백질 및 폴리펩티드의 흡수가 증가되는 동안 피해질 수 있다. 택일적으로, 본 발명은 표적 세포 주변 환경에서 활성 작용제의 방출이 고려된다. 예를 들어, 하나의 구체예에 있어서, 우레아제는 표적 부분이 표적 세포에 결합한 다음 나노캡슐로부터 방출되고, 우레아제는 표적 세포, 예를 들어, 암세포 주변 미세환경 내로 방출된다. U. S. Pat. Nos. 6,379,683 및 6,303,150는 나노캡슐을 제조하는 방법 및 그들의 사용 방법을 설명하며, 참고 문헌으로 본원에 수록된다.
그러므로, 본 발명의 하나의 구체예에 있어서, 접촉은 표적 부분 및 선택된 전하 및 안정한 α-나선 코일된 코일 이종이량체를 형성하기 위한 제 2의 반대로 하전된 코일-형성 펩티드와 상호작용하는 능력에 의하여 특징되는 제 1 코일-형성 펩티드를 포함하는 콘주게이트를 세포에 첨가하는 것을 포함한다. 순차적으로, 리포좀이 세포에 첨가된다. 리포좀은 외부 표면 및 내부 구획; 예를 들어, 리포좀의 내부 구획에 위치된 우레아제와 같은 할성 작용제; 및 다수의 제 2 펩티드를 포함하며, 여기에서 각 제 2 펩티드는 리포좀의 외부 표면에 연결된다.
다른 구체예에 있어서, 아래에서 상세히 설명되는 바와 같이, 접촉은 리포좀을 세포로 첨가하는 것을 포함하는데, 상기 리포좀은 예를 들어, 우레아제와 같은 포집된 형태로된 활성 작용제를 가지고, 리포좀의 외표면은 표적 표면에 특이적으로 결합하는데 효과적인 세포 표적 부분 및 표적 표면과의 상호작용으로부터 쵸적 부분을 방어하는데 효과적인 친수성 폴리머 코팅을 포함한다. 친수성 폴리머 코딩은 방출가능한 연결을 통하여 리포좀 내의 표면 지질 구성성분에 공유적으로 연결된 폴리머 사슬로 구성될 수 있다. 이 구체예에 있어서, 방출 작용제는 첨가된 리포좀 내의 연결의 중요한 부분의 방출을 일으키기에 충분한 양으로 암세포에 첨가되며, 그것에 의하여, 표적 부분이 표적 표면에 노출된다. 방출가능한 연결은 이황화, 에스테르 및 펩티드 연결과 같은 환원가능한 화학적 연결일 수 있다. 바람직하게, 친화성 부분은 암-특이적 항원에 특이적으로 결합하느데 효과적이다.
본 발명의 이러한 구체예에 따라서, 포유류 개체에 대한 리포좀 기초 치료의 방법이 고려된다. 방법은 개체에 표면 결합 표적 부분 및 친수성 폴리머 코팅을 가지는 리포좀을 예를 들어, 정맥 내 투여와 같은 전신적으로 투여하는 것을 포함한다. 방출가능한 부착된 폴리머 사슬을 포함하는 친수성 폴리머 코팅은 그것의 표적과의 상호작용으로부터 표적 부분을 방어하는데 효과적이다. 바람직한 친수성 폴리머는 상기에서 토론되었다. 투여된 리포좀은 리포좀의 희망하는 생분포 (biodistribution)가 성취될 때까지 전신적으로 순한되는 것이 허용된다. 다음에 설명디는 바와 같이, 방출 작용제는 중요한 부분, 예를 들어, 투여되는 리포좀 네의 방출 가능한 연결의 약 50 % 보다 크게, 바람직하게는 약 70 % 보다 크게, 그리고 더욱 바람직하게는 약 90 % 보다 크게 절단을 일으키는데 효과적인 양으로 개체에 투여된다. 표적 부분은 그것의 표적과의 상호작용을 위한 친수성 폴리머의 방출 시에 노출된다.
바람직한 구체예에 있어서, 리포좀은 고형암의 치료에 사용된다. 리포좀은 우레아제, 및 선택적으로, 추가적인 활성 작용제, 예를 들어, 항암제를 포집된 형태로 포함하며, 종양 특이적 항원에 특이적으로 결합하는데 효과적인 표적 부분에 의하여 종양 지역으로 표적된다. 예시적인 방법에 있어서, 리포좀은 증식하는 종양 내피 세포상에서 발현 Flk-1, 2 수용체에 선택적인 부착을 위하여, 리포좀 내에 VEGF 리간드를 포함함에 의하여 혈관 내피 세포의 종양으로 표적된다 (Niederman, T. M. 등 (2002) Proc Natl Acad Sci 99 (10): 7009-14).
바람직하게, 리포좀은 약 30-400 nm 크기를 가진다. 이 크기 범위의 리포좀은 종양 맥관구조의 내피 세포 열 (lining)에 존재gksms "갭"을 통하여 종양으로 들어올 수 있다는 것을 보여준다 (Maruyama, K, 등 (1999) Adv Drug Deliv Rev 40 (1-2): 89-102).
예를 들어, 정맥 내 투여와 같은 리포좀의 투여 후, 리포좀이 개체를 통하여 분포하고 종양에 결합하는 것이 허용된 후, 방출 작용제가 리포좀으로부터 친수성 표면 코팅을 방출하기 위하여 환자에게 투여된다. 표면 코팅의 방출은 표적 세포로 리포좀의 결합을 허용하기 위하여 표적 부분을 노출하는데 효과적이다. 하나의 구체예에 있어서, 친수성 표면 코팅은 pH 민감성 연결에 의하여 리포좀에 부착된다. 연결은 리포좀이 종양에 결합한 후에 방출된다.
상기 설명된 어떠한 구체예에 있어서, 리포좀은 1 또는 그 이상의 포집된 항-종양 드러그 또는 조영 작용제 또는 양자를 선택적으로 포함할 수 있다. 리포좀은 첨가되고, 분포되는 것이 허용되고, 그 다음에 방출 작용제는 부착된 표적 부분을 노출하여 결합을 개시하기 위한 친수성 표면 코팅의 방출을 위하여 투여될 수 있다. 그러므로, 포집된 항-종양 드러그 또는 조영제 또는 양자는 표적에 특이적이고 국부적으로 투여된다. 예시적인 항암 드러그는 아래 섹션 III.A에서 설명된다. 본 발명의 방법에 있어서 사용을 위한 예시적인 조영 작용제는 아래 섹션 III.B에서 설명된다. 리포좀은 참고 문헌에 의하여 본원에 수록된 U. S. Patent No. 6,043,094에서 설명된 것으로 제조되고 투여된다.
참고문헌으로 본원에 수록된 U. S. Patent No. 6,180,114에서 설명된 것과 같은 작은 단일층 낭 (unilamellar vesicle) (SUV's)이 본 발명에서 적용될 수 있다.
B4. 활성 작용제 모듈레이터
활성 작용제 모듈레이터가 본 발명에 의한 연관된 화학적 물질로서 또한 고려된다. 바람직한 활성 작용제 모듈레이터는 우레아제 모듈레이터이다. "우레아제 모듈레이터"는 우레아제의 저해제 또는 우레아제의 인핸서이다. 조성물 (예를 들어, 약학적 조성물)내의 모듈레이터는 따라서 저해제, 길항제 (항생물질을 포함) 또는 작용물질과 같은 우레아제 폴리뉴클레오티드 서열, 우레아제 안티센스 분자, 우레아제 폴리펩티드, 단백질, 펩티드, 또는 우레아제 생활성의 유기 모듈레이터의 전체 또는 부분 중으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게, 모듈레이터는 우레아제 발현 또는 우레아제 활성에 의하여 매개되거나 또는 개선되는 의학적 조건으로 처리하여 활성이된다.
"우레아제의 제해제"는 (1) 우레아제의 발현, 수식, 조절, 활성 또는 분해, 또는 (2) 우레아제의 가수분해를 포함하고 카르바메이트 및 아모니아의 생성을 이끄는 1 또는 그 이상의 우레아제의 정상 기능을 간섭하는 분자 또는 분자의 군을 포함한다. 저해제는 저해제가 정전기적 또는 화학적 상호작용을 통하여 우레아제에 결합할 때, "우레아제 상에서 직접적으로 작용한다". 그러한 상호작용은 다른 분자에 의하여 매개되거나 또는 매개되지 않을 수 있다. 제해제는 그것의 가장 즉시의 효과가 우레아제의 발현, 활성 또는 기능에 영향을 주는 우레아제와는 다른 분자 상에서 있을 때, "우레아제 상에 간접적으로" 작용한다.
우레아제 저해제는 우레아가 암모늄 이온으로 전환되는 것을 느리게 하는데 작용한다. 우레아제 저해제는 히드록삼산 유도체 (예를 들어, 아세토히그록삼산), 포스포라미드 유도체 (예를 들어, 플루로파미드), 포스페이트, 티올 (예를 들어, 2-메르캅토에탄올 등), 붕산, 할로겐 화합물 (예를 들어, 불소 등), 및 계피 추출물을 포함하지만 여기에 한정되는 것은 아니다. 추가적인 우레아제 저해제는 당업자에 의하여 공지되고, 본원에서 참고문헌에 의하여 수록된 U. S. Pat. No. 4,824,783 (1989. 4. 25)에서 설명된다.
"우레아제의 인핸서"는 (1) 우레아제의 발현, 수식, 조절 또는 활성, 또는 (2) 1 또는 그 이상의 우레아제의 정상 기능을 향상시키는 분자 또는 분자의 군을 포함한다. 인핸서는 인핸서가 정전기적 또는 화학적 상호작용을 통하여 우레아제에 결합할 때, "우레아제 상에서 직접적으로 작용한다". 그러한 상호작용은 다른 분자에 의하여 매개되거나 또는 매개되지 않을 수 있다. 인핸서는 그것의 가장 즉시의 효과가 우레아제의 발현, 활성 또는 기능에 영향을 주는 우레아제와는 다른 분자 상에서 있을 때, "우레아제 상에 간접적으로" 작용한다.
C. 추가적인 활성 작용제
추가적인 활성 작용제는 본 발명의 조성물에 또한 포함되어질 수 있다. 추가적인 활성 작용제, 예를 들어, 항-종양 작용제 (증식하는 세포에 대항하는 활성인 작용제)는 세포가 제 1 활성 작용제와 접촉하기 이전, 동시 또는 나중에 조성물로 사용될 수 있다. 예를 들어, 우레아제가 종양 세포에 표적된 후, 그것은 예를 들어, pH 변화를 통하여 종양 외부 환경을 수식 또는 조절할 수 있는 능력을 가질 수 있다. 활성 작용제, 예를 들어, 염기성 환경에 적합한 항-종양 작용제가 그러면 더 효과적일 것이다.
어떠한 구체예에 있어서, 우레아제에 의하여 효소적으로 프로세스될 수 있는 기질이 활성 작용제의 사용을 위하여 고려된다. 바람직하게, 활성 작용제는 우레아제가 암모늄 이온을 형성하기 위하여 사용되는 기질, 예를 들어, 우레아이다.
예시적인 항-종양 작용제는 인트루킨 (예를 들어, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12 및 이와 유사한 것)과 같은 시토카인 및 다른 부분, 형질전환 성장인자-베타 (transforming growth factor-beta), 림포톡신 (lymphotoxin), 종양 괴사 인자 (tumor necrosis factor), 인터페론 (interferon) (예를 들어, 감마-인터페론), 콜로니 자극 인자 (colony stimulating factor) (예를 들어, GM-CSF, M-CSF 및 이와 유사한 것), 혈관 투과성 인자 (vascular permeability factor), L-셀렉틴 (L-selectin), E-셀렉틴, P-셀렉틴과 같은 렉틴 염증 반응 프로모터 (lectin inflammatory response promoter) (셀렉틴), 및 C1q 및 NK 수용체 단백질과 같은 단백질성 부분을 포함한다. 추가적인 적합한 항-종양 작용제는 혈관신생을 저해하여 결과적으로 전이를 저해하는 화합물을 포함한다. 그러한 작용제의 예는 프로타민 메드록시프로게스테론 (protamine medroxyprogesteron), 펜토산 폴리설페이트 (pentosan polysulphate), 수라민 (suramin), 탁솔 (taxol), 탈리도미드 (thalidomide), 앤지오스타틴 (angiostatin), 인터페론-알파 (interferon-alpha), 메탈로프로테이나제 저해제 (metalloproteinase-inhibitor), 혈소판 인자 4 (platelet factor 4), 소마토스타틴 (somatostatin), 트로모보스폰딘 (thromobospondin)을 포함한다. 본 발명에 관하여 유용한 활성 작용제의 다른 대표적이고 비제한적 예는 빈크라스틴 (vincristine), 빈블라스틴 (vinblastine), 빈데신 (vindesine), 부술판 (busulfan), 클로람부실 (chlorambucil), 스피로플라틴 (spiroplatin), 시스플라틴 (cisplatin), 카르보플라틴 (carboplatin), 메토트레사이트 (methotrexate), 아드리아마이신 (adriamycin), 마이토마이신 (mitomycin), 블레오마이신 (bleomycin), 시토신 아라비노사이드 (cytosine arabinoside), 아라비노실 아데닌 (arabinosyl adenine), 메르캅토푸린 (mercaptopurine), 미토탄 (mitotane), 프로카르바진 (procarbazine), 닥티노마이신 (dactinomycin) (안티노마이신 D (antinomycin D)), 다우노루비신 (daunorubicin), 독소루비신 하이드로클로라이드 (doxorubicin hydrochloride), 탁솔 (taxol), 플리카마이신 (plicamycin), 아미노글루테티미드 (aminoglutethimide), 에스트라무스틴 (estramustine), 플루타미드 (flutamide), 류프롤라이드 (leuprolide), 메제스트롤 아세테이트 (megestrol acetate), 타목시펜 (tamoxifen), 테스토락톤 (testolactone), 트리로스탄 (trilostane), 암사크린 (amsacrine) (m-AMSA), 아스파라기나아제 (L-아스파라기나아제), 엑토포사이드 (etoposide), 헤마토포르피린 (hematoporphyrin)과 같은 혈액 산물 또는 앞선 것들의 유도체를 포함한다. 활성 작용제의 다른 예는 재조합 RNA 및 DNA를 포함하는 핵산, RNA, 및 천연 또는 합성 기원의 DNA와 같은 유전 물질을 포함한다. 특정 단백질을 코딩하는 DNA는 많은 다른 형태의 질병의 치료에 사용될 수 있다. 예를 들어, 종양 괴사 인자 또는 인트루킨-2 유전자는 발전된 암을 치료하는데 제공될 수 있고, 티미딘 키나아제 유전자는 난소암 또는 뇌 종양을 치료하는데 제공될 수 있고, 인트루킨-2 유전자는 신경아종 (neuroblastoma), 악성 흑색종 (malignant melanoma) 또는 신장암을 치료하는데 제공될 수 있다. 본 발명에 사용을 위하여 고려되는 추가적인 활성 작용제는 U. S. Patent No. 6,261,537에서 설명디며, 이것은 그것의 전체로서 본원에 참고문헌으로 수록된다. 항-종양 작용제 및 그러한 작용제를 검출하기 위한 검색은 Monga, M. 및 Sausville, E. A. (2002) Leukemia 16 (4): 520-6에서 리뷰된다.
어떠한 구체예에 있어서, 활성 작용제는 약한 염기성 항-종양 화합물이며 그것의 효과는 고형암에서 높은 세포내/ 낮은 세포외 pH 구배에 의하여 감소된다. 예시적인 약한 염기성 항-종양 화합물은 독소루비신, 다우노루비신, 미토산트론, 에피루비신, 미토마이신, 블레오마이신, 빈블라스틴 및 빈크라스틴과 같은 빈카 알카로이드, 시클로포스파미드 및 메클로레타민 히드로클로라이드와 같은 알킬화 작용제, 및 안트리네오플라스틱 푸린 (antrineoplastic purine) 및 피리미딘 유도체를 포함한다.
본 발명의 하나의 구체예에 있어서, 조성물은 우레아제를 포함하고, 중요하게 어떠한 시토카인, 예를 들어, 종양 괴사 인자 및/또는 인터페론을 결핍한다. 이 구체예에 있어서, 단독 또는 시토카인과는 다른 활성 작용제, 바람직하게는 작은 분자 항종양 작용제와 함께 우레아제는 암세포 성장을 저해하는데 효과적이다. 그러므로, 이 구체예에 있어서, 조성물은 치료되는 개체에 존재하는 내재성 또는 천연 시토카인과 협동하여 작용할 수 있거나 또는 아닐 수 있지만, 투여되는 조성물은 추가적인, 외재성 시토카인을 함유하지 않는다.
D. 조영제
또한, 조영 작용제가 본 조성물 또는 추가적인 조성물로 포함될 수 있다. 적합한 조영제는 양전자방출단층촬영기 (positron emission tomography) (PET), 전산화조력단층촬영술 (computer assisted tomography) (CAT), 단일광자방출전산화조력단층촬영술 (single photon emission computerized tomography), X-선, 형광조영술 (fuoroscopy), 및 핵자기공명조영 (magnetic resonance imaging) (MRI)에서 사용되는 상업적으로 이용가능한 작용제를 포함한다.
조영제는 금속, 방사성 동위원소 및 방사선비투과성 작용제 (예를 들어, 갈륨, 테크네튬, 인듐, 스트론튬, 요오드, 바륨, 브로민 및 인-함유 화합물), 방사선투과성 작용제, 콘트라스트 (contrast) 작용제, 다이 (dye) (예를 들어, 형광 다이 및 크로모포어 (chromophore)) 및 발색 또는 형광 반응을 촉매하는 효소를 포함한다. 일반적으로, 그러한 작용제는 상기 설명한 바와 같이 다양한 기술을 사용하여 부착 또는 포집되어질 수 있고 어떠한 방향성으로 존재할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 참고 문헌으로 수록된 U. S. Patent Nos. 6,159,443 및 6,391,280 참고.
본 발명에 관한 콘트라스트 작용제는 X-선 콘트라스트 작용제, 광 조영 프로브, 스핀 표지 또는 방사성 유니트와 같은 조영 양식 (modality)에서 사용된다.
MRI 내의 콘트라스트 작용제로 사용하기 위한 적합한 물질의 예는 디에틸렌 트리아민 펜타아세트산 (DTPA)와 같은 현재 이용가능한 가돌리늄 (gadolinium) 킬레이트 및 가도펜토테이트 디메글루민 (gadopentotate dimeglumine) 뿐만 아니라 철, 마그네슘, 망간, 구리, 및 크롬을 포함한다.
CAT 및 X-선에 유용한 물질의 예는 디아트리조에이트 (diatrizoate) 및 이오탈라메이트 (iothalamate)에 의하여 전형화된 이온성 단량체, 이오파미돌 (iopamidol), 이소헥솔 (isohexol), 및 이오버솔 (ioversol)과 같은 비이온성 단량체, 이오트롤 (iotrol) 및 이오디사놀 (iodixanol)과 같은 비이온성 이량체, 및 예를 들어, 이옥사갈트 (ioxagalte)와 같은 이온성 이량체를 포함한다.
공기 및 다른 기체는 초음파 조영에 사용하기 위하여 통합될 수 있다. 이러한 작용제는 당해 기술 분야에서 이용가능한 표준 기술 및 상업적으로 이용가능한 장비를 사용하여 검출될 수 있다.
본 발명의 하나의 구체예에 있어서, 암세포는 활성 작용제와 접촉되어진 전 또는 후, 또는 전 및 후 양자에서 조영제와 접촉된다. 에를 들어, 우레아제가 종양세포에 표적된 후, 그것은 암세포 외부 환경, 예를 들어, pH 변화를 수식 또는 조절하는 능력을 가질 수 있다. 염기성 환경에 우호적인 조영 작용제는 그 다음에 보다 효율적이 될 것이다.
발광 시클렌-기초 란타나이드 (luminescent cyclen-based lanthanide) 킬레이트 및 이러한 초기 수득 자기 공명 신호 (magnetic resonance signature) 양자는 pH의 변화에 민감하게 되는 것을 나타낸다. pH 변화를 감작하기 위하여 사용된 발광 프로브는 전형적으로 pH의 기능으로서 란타나이드 이온의 형광 유지기간에 있어서의 변화를 검출한다. 유사하게, pH에서의 변화를 통하여 워터 프로톤 릭렉시비티 (water proton relaxivity)를 수식하는 자기 공명 콘트라스트 작용제가 본 발명에 유용하다. 양자의 경우에 있어서, 주어진 시스템에서의 pH의 변화에 의하여 향상된 콘트라스트를 가진 작용제를 볼 수 있다.
따라서, pH 민감성 콘트라스트 작용제는 암세포에 또는 암세포 가까이에서 사용될 수 있다. 우레아제 효소를 함유한 우레아제 조성물에 노출되는 암세포 또는 세포는 암세포에 또는 가까이에서 pH의 변화를 야기할 수 있다. 이러한 방식에 있어서, pH의 변화는 pH를 반영하는 방식에 있어서 변화되는 수성 매질 내의 워터 프로톤 또는 다른 핵의 핵 자기 공명 릴렉세이션 특성을 야기한다. 사용되어질 수 있는 pH 민감성 콘트라스트 작용제의 예는 Ce, Pr, Nd, Sm, Eu, Gd, Db, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, 및 이와 유사한 것과 같은 란타나이드 금속, 또는 Fe, Mn, 170, 또는 이와 유사한 것과 같은 다른 파라마그네틱 요소를 함유하는 이러한 작용제를 포함한다. 사용될 수 있는 특이적 콘트라스트 작용제는 H(2)(17)0, Magn Reson Med. 2003 Feb; 49 (2): 249-57에서 설명되어진 GdDOTA-4AmP(5-), 및 Helpern 등 (1987) Magnetic Resonance in Medicine 5: 302-305 및 참고문헌에 의하여 본원에 수록된 U. S. Patent No. 6,307, 372에서 설명되어지는 것으로 Fe(III)메소-테트라(4-설포나토페닐)포르핀 (Fe-TPPS4)을 포함한다. 추가적으로, Mikawa 등, Acad. Radiol (2002) 9 (suppl 1): S109-S1111에서 설명된 것으로 폴리이온으로 기초된 Gd가 본 발명에서 사용될 수 있다.
또 다른 택일적인 것으로, 쉬프트 시약 (shift reagent)이 암세포 주변의 수성 매질 내에 제공될 수 있다. 쉬프트 시약이 배열되고, pH의 변화는 워터 프로톤 또는 다른 핵의 화학적 쉬프트 특성에 pH를 반영하는 방식으로 영향을 준다. 화학적 쉬프트 특성의 변화는 다음으로 활성 작용제가 생물학적으로 활성인지 여부를 결정하기 위하여 핵 자기 공명을 사용하여 측정된다. 사용되어질 수 있는 예시적인 쉬프트 시약은 Ce, Pr, Nd, Sm, Eu, Gd, Db, Dy, Ho, Er, Tm, 또는 Yb와 같은 란타나이드 금속, 또는 다른 파라마그네틱 요소를 함유하는 것들을 포함한다. 사용되어질 수 있는 특이적 쉬프트 시약의 예는 Tm(DOTP) (5-), 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N',N",N"'-테트라(메틸렌포스페이트), Dy(PPP) (2)(7)-디스프로슘 트리폴리포스페이트 및 이와 유사한 것의 툴륨 (III) 복합체를 포함한다.
본 발명의 하나의 구체예에 있어서, pH-비민감성 GdDOTP(5-) 및 pH-민감성 GdDOTA-4AmP(5-)와 같은 2 가돌리늄 작용제를 사용한 이중-콘트라스트-작용제는 Magn Reson Med (2003) Feb; 49 (2): 249-57에서 설명되는 것으로 MRI에 의하여 pH 맵 (map)을 생성하는데 사용되어질 수 있다.
PET 스캔으로 사용하기 위한 바람직한 작용제는 13N 및 플루오로데옥시글루코오스 (FDG)를 포함한다.
E. 조성물 제형
상기 지적된 바와 같이, 본 발명의 조성물은 활성 작용제 및 선택적으로 연관된 화학적 물질을 포함한다. 예를 들어, 우레아제 폴리펩티드 또는 우레아제 폴리뉴클레오티드는 우레아제 발현 또는 우레아제 활성의 모듈레이터로서 활성이 있는 화학적 또는 생물학적 화합물을 포함한다. 추가적으로, 생적합적 약학적 캐리어, 애주번트 (adjuvant), 또는 운반체가 또한 포함될 수 있다.
조성물은 또한 다른 핵산 서열, 폴리펩티드, 드러그, 또는 첨가제(들)와 혼합된 호르몬 또는 다른 약학적으로 허용되는 캐리어를 포함할 수 있다. 약학적 조성물과는 다른 조성물은 선택적으로 액체, 즉, 물 또는 물-기초 액체를 포함한다.
약학적 조성물에 첨가되는 약학적으로 허용되는 첨가제는 또한 당업자에게 공지이며, 쉽게 이용가능하다. 첨가제의 선택은 본 발명에 따른 생산물을 투여하는데 사용된 특별한 방법에 의한 부분으로 결정되어질 것이다. 따라서, 본 발명의 내용으로 사용되기 위한 광범위한 적합한 제형이 있다.
약학적 조성물의 제형 및 투여를 위한 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Ed., 19th Ed., Williams & Wilkins, 1995에서 발견되고, 당업자에게 공지이다. 첨가제의 선택은 본 발명에 따른 생산물을 투여하는데 사용된 특별한 방법에 의한 부분으로 결정되어질 것이다. 따라서, 본 발명의 내용으로 사용되기 위한 광범위한 적합한 제형이 있다. 아래의 방법 및 첨가제는 단지 예시적인 것이며, 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 어떠한 종래의 방법, 예를 들어, 혼합, 용해, 그래뉼, 가루, 에멀젼, 캡슐, 포집, 용융-반사 (melt-spinning), 스프레이-건조 (spray-drying), 또는 동결건조 공정을 사용하여 제조될 수 있다. 그러나, 최적의 약학적 제형은 투여의 경로 및 원하는 투여량에 의존하여 당업자에 의하여 결정될 것이다. 그러한 제형은 물리적 상태, 안정성, 생체 내 방출 속도, 및 투여된 작용제의 생체 내 제거의 속도에 영향을 줄 것이다. 치료되는 조건에 의존하여, 이러한 약학적 조성물은 아래 섹션 III에서 설명되는 바와 같이 제제되어지고 투여될 있다.
약학적 조성물은 적합한 약학적으로 허용되는 캐리어를 함유하는 것으로 제제될 수 있고, 약학적으로 사용될 수 있는 제제 내로 활성 화합물의 프로세싱을 촉진하는 첨가제 및 보조제를 선택적으로 포함할 수 있다. 투여 양상은 일반적으로 캐리어의 특성을 결정할 것이다. 예를 들어, 비경구투여를 위한 제형은 수용성 형태로 활성 화합물의 수용액을 포함할 수 있다. 비경구투여에 적합한 캐리어는 식염, 완충된 식염, 덱스트로오스, 물, 및 다른 생리학적으로 적합한 용액 중으로부터 선택될 수 있다. 비경구투여를 위한 바람직한 캐리어는 행크스액 (Hank's-solution), 링거액 (Ringer's solution), 또는 생리적으로 완충된 식염과 같은 생리학적으로 적합한 버퍼이다. 조직 또는 세포성 투여를 위하여, 투과되는 특별한 장벽에 적합한 투과제가 제형에 사용되어진다. 그러한 투과제는 일반적으로 당해 기술분야에서 공지이다. 단백질을 포함하는 제제에 대하여, 제형은 폴리올 (예를 들어, 수크로오스) 및/또는 표면활성제 (예를 들어, 비이온 표면활성제), 및 이와 유사한 것과 같은 안정화 물질을 포함할 수 있다.
택일적으로, 비경구용에 대한 제형은 적합한 오일성 주사 현탁액으로 제조되는 활성 화합물의 현탁액을 포함할 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 운반체는 참깨유와 같은 지방유, 및 에틸 올레에이트 또는 트리글리세리드와 같은 합성 지방산 에스테르, 또는 리포좀을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨, 또는 덱스트란과 같은 현탁액의 점성을 증가시키는 물질을 함유할 수 있다. 선택적으로, 현탁액은 또한 적합한 안정제 또는 고농도 용액의 제조를 가능하게 하는 화합물의 용해성을 증가시키는 작용제를 함유할 수 있다. 에멀젼, 예를 들어, 물 내의 오일 (oil-in-water) 및 오일 내의 물 (water-in-oil) 분산이 에멀젼화 작용제 또는 분산제 (표면 활성 물질; 표면활성제)에 의하여 선택적으로 안정화되어 사용될 수 있다. 아래에 설명되는 바와 같이, 활성 작용제를 함유하는 리포좀은 또한 비경구투여를 위하여 적용될 수 있다.
택일적으로, 경구 투여를 위하여 적합한 투여량의 작용제를 포함하는 약학적 조성물은 당해 기술분야에서 공지된 약학적으로 허용되는 캐리어를 사용하여 제형될 수 있다. 경구투여를 위하여 제형이된 제제는 정제, 알약, 캡슐, 카쉐 (cachet), 로젠지 (lozenge), 액체, 젤, 시럽, 슬러리, 현탁액, 또는 분말의 형태일 수 있다. 설명을 위하여, 경구용을 위한 약학적 제제는 활성 화합물을 고체 첨가제와 결합하고, 선택적으로 결과의 혼합물을 가루화하고, 입자의 혼합물을 프로세싱하고, 만약 희망한다면, 적합한 보조제를 첨가한 후에 정제를 획득할 수 있다. 경구적 제형은 비경구적 사용, 예를 들어, 완충된 수용액, 현탁, 및 그와 유사한 것에 대하여 설명된 것에 대한 형태와 유사한 액체 캐리어를 적용할 수 있다.
이러한 제제는 1 또는 그 이상의 첨가제를 함유할 수 있으며, 그것은 a) 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 만니톨, 또는 소르비톨을 포함하는 당과 같은 희석제; b) 마그네슘 알루미늄 실리캐이트, 옥수수, 밀, 쌀, 감자, 등으로부터 녹말; c) 메틸 셀룰로오스, 히드록시프로피네틸 셀룰로오스, 및 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈과 같은 셀룰로오스 물질, 아라비아고무, 트라가칸트고무와 같은 고무, 및 젤라틴 및 콜라겐과 같은 단백질; d) 교차-연결된 폴리비닐 피롤리돈, 녹말, 아가, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트와 같은 그들의 염과 같은 분해 또는 용해 작용제; 또는 비등성 조성물; e) 실리카, 활석, 스테아르산 또는 그것의 마그네슘 또는 칼슘 염, 및 폴리에틸렌글리콜과 같은 윤활제; f) 향료 및 감미료; g) 예를 들어, 생산물을 동정 또는 활성 작용제의 정량 (투여량)을 특정하기 위한 발색제 또는 피그먼트 (pigment); 및 h) 보존제, 안정제, 팽창 작용제, 에멀젼화 작용제, 용액 프로모터, 삼투압을 조절하기 위한 염, 및 완충액과 같은 다른 성분을 제한 없이 포함한다.
약학적 조성물은 활성 작용제의 염으로서 제공될 수 있으며, 그것은 염산, 황산, 아세트산, 락트산, 타르타르산, 말산, 숙신산 등을 포함하지만 여기에 한정되는 것은 아닌 많은 산으로 형성될 수 있다. 염은 자유 염기 형태에 상응하는 수성 또는 다른 프로톤성 용매에서 보다 용해가능성이다.
상기 언급된 바와 같이, 작용제 그것 자체의 특성 및 작용제의 제형은 물리적 상태, 안정성, 생체 내 방출의 속도, 및 투여된 작용제의 생체 내 제거의 속도에 영향을 줄 수 있다. 그러한 약물동력학적 및 약물역학적 정보는 전-임상 시험관 내 및 생체 내 연구를 통하여 수집될 수 있으며, 후자는 임상시험의 단계 동안 인간에서 확인된다. 생체 내 동물 데이터에 기초한 인간 임상시험을 수행하게 위한 안내는 예를 들어 http://www.clinicaltrials.gov를 포함한 수 많은 기원으로부터 획득될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 방법에서 사용된 어떠한 화합물에 대하여, 포유류, 특히 인간에 치료적으로 효과적인 투여량은 생화학적 및/또는 세포-기초 분석으로부터 우선적으로 추정될 수 있다. 다음으로, 투여량은 활성 작용제 발현 또는 활성을 수식하는 희망하는 순환 농도 범위를 달성하기 위한 동물 모델에서 공식화될 수 있다. 인간 연구가 도입되어졌을 때, 더 많은 정보가 적합한 투여량 수준 및 다양한 질병 및 조건에 대한 치료의 기간이 도출될 것이다.
그러한 화합물의 독성 및 치료적 효능은 세포 배양 또는 실험 동물, 예를 들어, LD50 (군집의 50 %에 치사적 투여량) 및 ED50 (군집의 50 %에 치료적으로 효과적인 투여량)의 표준 약학적 과정에 의하여 결정될 수 있다.
III . 본 발명의 방법
본 발명의 또 다른 관점은 암세포의 성장을 저해하는 방법을 포함한다. 본 방법은 상기 섹션 II, 및/또는 하기 섹션 IV-VII에서 설명된 조성물의 1 또는 그 이상의 구성요소가 적용된다. 본 방법은 암세포의 성장을 저해하기 위하여 요과적인 양으로 세포에 우레아제를 노출하는 것을 포함한다.
A. 암세포를 활성 작용제로 노출
우레아제 조성물, 예를 들어, 우레아제 단독 또는 암세포로 효소의 전달을 향상시키는데 효과적인 화학적 물질과의 조합으로 우레아제는 당해 기술 분야에서 공지된 많은 방법에 의하여 암세포로 전달될 수 있다. 치료적인 적용에 있어서, 조성물은 암세포(들)의 성장을 제해하는데 충분한 양으로 암세포를 가지는 환자에게 투여된다. 본 발명의 약학적 조성물은 비경구적, 장관의, 상피통과적, 점액통과적, 경피적, 및/또는 외과적인 것을 제한 없이 포함하는 많은 경로에 의한 투여에 의하여 암세포에 노출될 수 있다.
비경구적 투여 양식은 조성물이 예를 들어, 정맥내, 동맥내, 복막내, 골수내, 근육내, 관절내, 포막내, 및 심실내 주사, 피하, 생식선내 또는 종양내 바늘 볼루스 (bolus) 주사, 또는 직합한 펨프 기술을 사용한 지속된 연속, 주기적 또는 계획된 관류 또는 미소주입에 의하여 투여된다. 장관 투여 양식은 예를 들어, 경구 (구강 또는 설하를 포함) 및 직장 투여를 포함한다. 상피투과 투여 양식은 예를 들어, 점액투과 투여 및 경피적 투여를 포함한다. 점액투과 투여는 예를 들어, 장관 투여 뿐만 아니라 비강, 흡입, 및 심폐 투여, 질 투여, 및 직장 투여를 포함한다. 경피적 투여는 예를 들어, 패치 및 전리용법 장치 뿐만 아니라 페이스트, 설브 (salve), 또는 연고의 국부적 적용을 포함하는 수동 또는 능동적 피부통과 또는 경피 양식을 포함한다. 외과적 기술은 데포트 (depot) (저장소) 조성물, 삼투 펌프, 및 이와 유사한 것의 이식을 포함한다.
활성 작용제의 단일 또는 다중 투여는 개체에 의하여 요구되고 관용되는 투여량 및 빈도에 의존하여 투여될 수 있다. 어떠한 상황에 있어서, 조성물은 개체를 효과적으로 치료하기 위하여 본 발명의 활성 화합물의 충분한 양을 제공하여야 한다.
혈액 흐름에 존재하는 거대 분자의 유입을 감소 또는 차단하는 타이트 정션 (tight junction) 및/또는 능동 수송 메카니즘에 의하여 연결된 세포에 의하여 혈관이 생성되지 않거나 차단되는 어떠한 영역이 있다는 것은 당업자에게는 당연한 것이 될 것이다. 그러므로, 예를 들어, 신경교종, 또는 다른 뇌암을 치료하기 위한 치료제의 전신적 투여는 서브아라크노이드 공간 (subarachnoid space) 내로 거대분자의 유입에 저항하는 혈액-뇌 장벽에 의하여 억제된다. 이러한 형태의 종양에서, 치료적 조성물은 바람직하게 종양로 직접적으로 투여될수 있다. 그러므로 예를 들어, 뇌종양은 치료적 조성물을 종양 위치, 예를 들어, 볼루스 주사, 미세주입, 또는 외과적인 삽입 카테터를 통하여 직접적인 투여에 의하여 치료될 수 있다.
노출은 암세포 또는 종양을 예를 들어, MRI에 대하여 Enhanced Magnetic Resonance Imaging, V. M. Runge, ed., C. V. Mosby Co. (1989); 예를 들어 EP 188,256에서; Kozak 등, TIBTEC October 1986,262; Radiotracers for Medical Applications, CRC Press, Boca Raton, Fla., for radiodiagnostics and/or for radiotherapy; in Positron Emission Tomography of the Brain, Springer Verlag 1983, for PET; 및 J. W. Nowicky 등,"Macroscopic UV-Marking through Affinity, "J. Tumor Marker Oncology 31,463-465 (1988)에서 설명된 바와 같은 조영 안내 도구로 시각화하는 것을 포함할 수 있다. 그러므로, 어떠한 다양한 진단 작용제는 조성물 내에 통합될 수 있으며, 환자에게 투여된 후에 통합된 작용제는 국부적으로 또는 전신적으로 전달될 수 있다.
상기 설명된 바와 같은 조영 작용제는 환자에 조성물의 투여 후, 종양 치료를 관찰하는 것을 가능하게 하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 그들은 전형적으로 조영 과정의 수행 이전에 투여될 수 있다. 또한 예를 들어, 약물동력학 연구를 원하는 경우에 투여가 조영과 동시에 되는 것이 가능하다. 표적 위치에 위치화를 위하여 요구되는 최적 시간 기간 및 최적 조영 향상은 활성 작용제 및/또는 콘주게이트 및/또는 조직 및/또는 조영 양식으로 또한 다양하게 되며, 또한 일반적으로 결정될 것이다. 전형적으로, 조영은 위치로부터 활성 작용제의 중요한 제거 후에 발생할 것이며, 이 기간은 또한 당업자에 의하여 일반적으로 결정될 수 있다. 어떠한 경우에 있어서, 아래 설명되는 바와 같이, 활성 작용제는 그들의 표적 위치에 쉽게 위치될 수 있고, 다음으로, 선택적으로 그것으로부터 빨리 제거되기 때문에, 활성 작용제 또는 콘주게이트는 조영 과정의 수행하기 이전 15 분 내지 4 시간에 투여되어질 것이다.
본 발명의 하나의 구체예에 있어서, 노출은 개체의 조직에 세포외성 pH의 변화를 결정할 수 있는 진단 도구로 개체를 검사하고, 투여 후 세포외성 pH의 선택된 증가를 보이는 개체 내의 조직 영역을 확인하는 것을 포함한다. 확인에 기초하여, 노출은 전체 고형암 내의 세포외성 pH의 선택된 변화가 달성될 때까지 반복될 수 있다.
본 발명의 하나의 구체예에 있어서, 노출은 직접 주사에 의한 것과는 다르게 개체에 비경구적으로 활성 작용제 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 활성 작용제는 상기 섹션 II에서 설명된 바와 같이 유도될 수 있다.
상기 설명된 바와 같이, 우레아제는 카르바메이트 및 암모니아의 생성을 이끄는 우레아의 가수분해를 촉매한다. 수성 환경에 있어서, 카르바메이트는 쉽고 자발적으로 분해되어, 2 분자의 암모니아 및 1 분자의 이산화탄소를 얻는다 (도 1). 우레아제는 다양한 기능을 가진다. 그것의 초기 환경적 역할은 생명체가 질소원으로서 외부적 및 내부적으로 생성된 우레아를 사용하는 것을 가능하게 한다. 식물에 있어서, 우레아제는 식물체 전체의 질소 수송 경로에 참여하며, 독소 방어 단백질로서 작용한다.
*우레아제에 대한 기질은 우레아이며, 이것은 간에서 생성되어 신장으로 혈류를 통하여 이동하여 소변으로 배출된다. 건강한 인간의 우레아의 혈청 농도는 전형적으로 1 내지 10 mM 이지만, 소변의 우레아의 수준은 0.5 M을 초과한다 (Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Merck and Co., Inc., Rahway, NJ, 1999). 우레아는 또한 혈청에 근사적으로 등등한 농도로 주 및 종 외분비선의 방출에서 존재하며, 순환하는 많은 부분의 우레아는 분비 시스템에 의한 세포 표면 상 또는 조직 삼출액에 위치된다 (Burne, R. A., 및 Chen, Y. M., Microbes and Infection, 2,2000; 533-542). 예를 들어, 성인은 1-10 mM 우레아를 함유하는 하루에 거의 1 리터의 타액을 분비하고, 생성된 모든 우레아의 근사적으로 20-25 %가 소변으로 배출되는 것보다 장관으로 들어간다 (Visek, W. J., Fed. Proc. 31 (1972) 1178-1193). 우레아의 외분비 배출에 대한 명백한 활성-유출 메카니즘이 없으므로, 비하전된 우레아 분자가 세포 및 상피의 타이트 정션을 통하여 단순히 물을 따른다고 생각된다. 결과적으로, 인체의 세포 표면은 우레아를 함유하는 체액에서 유영한다 (McLean R. J. C., 등 CRC, Crit. Rev. Microbiol. 16 (1988) 37-79).
B. 2 및 3 단계 누출
상기 지적된 바와 같이, 본 발명의 하나의 구체예에 있어서, 활성 작용제는 표적 부분과 직접적으로 콘주게이트된다. 택일적으로, 본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 2 단계 접근이 활성 작용제를 종양 세포에 전달하는데 사용된다. 바람직하게, 종양 세포는 개체 내에 함유된다. 2 단계 접근은 표적 부분의 약물동력학으로부터 활성 작용제의 약물동력학을 커플링하는 이점을 가진다. 표적 부분은 제 1 결합 상대, 예를 들어, 코일 형성 펩티드에 결합되는 동안 표적 위치에 부착하는 것을 허용한다. 표적 부분의 부착 후, 순차적으로 모든 비표적된 콘주게이트는 환자의 순황으로부터 제거될 수 있다. 활성 작용제는 다음으로 상보적인 결합 상대 구성원, 예를 들어, 제 2 코일 형성 펩티드에 콘주게이트될 수 있다.
당해 깃루 분야에서 공지인 2 단계 시스템은 비오틴, 헵텐 등 고친화성 결합 상대, 예를 들어, 아비딘, 특이적 항체 등을 가지는 것으로 사용될 수 있다. 예를 들어, U. S. Pat. Nos: 6,190,923, 6,187,285, 및 6,183,721 참고.
바람직한 2 단계 시스템은 코일된 코일 시스템을 포함한다. 그러므로, 상기 설명된 2 단계 접근을 적용한 본 발명의 어떠한 구체예에 있어서, 표적 부분 및 안정한 나선의 코일된 코일 이종이량체를 형성하기 위하여 선택된 전하 및 제 2의 반대로 하전된 코일 형성 펩티드에 의하여 특징되는 제 1 코일 형성 펩티드를 포함하는 제 1 콘주게이트가 암세포에 첨가된다. 항체 표적 부분을 코일 형성 펩티드로 콘주게이트하는 예시적인 방법은 실시예 4에서 설명된다.
순차적으로 제 2 코일 형성 펩티드 및 활성 작용제를 포함하는 제 2 콘주게이트가 세포로 첨가된다. 바람직한 활성 작용제는 우레아제이다. 작두콩 우레아제를 코일 형성 펩티드와 콘주게이트하는 예시적인 방법은 실시예 2에서 설명된다.
제 1 코일 형성 펩티드 및 제 2 코일 형성 펩티드는 알파-나선 코일된 코일 이종이량체를 형성하기에 좋은 조건 하에서 함께 혼합되고, 그들은 2 서브유니트알파-나선 코일된 코일 이종이량체 복합체를 형성하기 위하여 상호작용한다. 알파-나선 코일된 코일 구조는 각 펩티드의 1 차 서열에 의하여 결정되는 특징적인 방법으로 서로 상호작용한다. 알파-나선의 3 차 구조는 그러므로 1 차 서열의 7 아미노산 잔기가 근사적으로 알파-나선의 2 회전에 상응하게 된다. 따라서, 알파-나선 구조에 증가를 제공하는 1 차 아미노산 서열은 각 7 잔기, 용어 "헵타드 (heptad)"의 단위로 나누어질 수 있다. 이종이량체-서브유니트 펩티드는 텐덤 (tandem)으로 일련의 헵타드를 구성한다. 헵타드의 서열이 특별한 이종이량체-서브유니트 펩티드로 반복될 때, 헵타드는 "헵타드 반복", 또는 간단히 "반복"으로 나타날 수 있다.
제 1 코일 형성 펩티드 및 제 2 코일 형성 펩티드는 평행 또는 역평행 입체 구조로 이종이량체 코일된 코일 나선 (코일된 코일 이종이량체)로 조립될 수 있다. 평행적 입체구조에 있어서, 2 이종이량체-서브유니트 펩티드 나선이 얼라인되고, 그들은 동일한 방향성 (아미노-말단에서 카르복시 말단으로)을 가진다. 역평행 입체구조에 있어서, 나선은 한쪽 나선의 아미노 말단 끝이 다른 나선의 카르복시 말단 끝과 얼라인되고, 역으로되는 배열을 가진다. 그러한 이종이량체 서브유니트는 1995년 11월 23일 자로 공개된 PCT patent application WO 95/31480 "Heterodimer polypeptide Immunogen Carrier Composition and Method"에서 설명되는데, 그것의 전체로서 본원에 수록된다. 예시적인 서브유니트는 리신 잔기에 의하여 지배적으로 제공되는 양전하 서브유니트를 나타내는 K-코일, 및 글루탐산에 의하여 지배적으로 제공되는 음전하 서브유니트로 나타나는 E-코일로서 본원에서 나타난다. 상기 언급된 적용으로부터의 바람직한 예는 SEQ ID NOS: 1-2를 포함한다.
상기 언급된 적용에서 나타난 안내에 따라 디자인된 이종이량체-서브유니트 펩티드는 전형적으로 평행 배열 대 역평행 배열에서의 조립에 대한 바람직한 것을 보여준다. 예를 들어, 다른 펩티드 서열이 하는 것과 같이 (WO 95/31480 출원에서 설명되는 것), For example, the exemplary peptides identified by SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 4에 의하여 확인되는 예시적인 펩티드는 평행 입체구조 이종이량체를 형성한다. 추가적인 예시적인 펩티드는 7 아미노산, 예를 들어, SEQ ID NO: 5 반복으로 구성된 K-코일 펩티드를 포함한다. 하나의 구체예에 있어서, K-코일은 35 아미노산 길이이고, 용액에서 특별한 구조를 가지지 않는 양전하이다. E-코일은 7-아미노산, 예를 들어, SEQ ID NO: 6 반복으로 구성된 펩티드일 수 있다. 하나의 구체예에 있어서, E-코일은 35 아미노산 길이이고, 용액에서 특별한 구조를 가지지 않는 음전하이다.
언급된 바와 같이, 이종이량체 내의 두개의 서브유니트 중 하나는 표적 부분을 함유하고, 다른 펩티드는 활성 작용제를 함유한다. 양자의 경우에 있어서, 펩티드는 합성되고, 요구되는 부착 기능을 제공하기 위하여 합성 후에 유도화될 수 있다. 펩티드 합성의 예시적인 방법은 실시예 1에 설명된다. 일반적으로, 최고의 콘주게이트 방법은 코일 형성 펩티드 중 어느 쪽의 코일 형성 활성을 방해하지 않고, 그러한 콘주게이션은 콘주게이트된 활성 작용제 또는 표적 부분의 활성을 방해하지 않는다.
제 1 코일 형성 펩티드의 수식을 고려하면, 펩티드는 펩티드의 표적 부분과 나선 형성 부분 사이의 공간으로서 작용할 수 있는 추가적인 말단 펩티드를 가지기 위하여 그것의 N-말단 또는 C-말단에서 합성된다. 표적 부분-코일 형성 펩티드 및/또는 활성 작용제-코일 형성 펩티드는 상기 지적된 바와 같이 생체 내 또는 시험관 내에서 고체-상태, PCR, 또는 재조합 방법에 의하여 합성될 수 있다.
고체-상태 방법을 통하여 콘주게이트를 형성하는데 있어서, 활성 작용제 또는 표적 부분은 바람직하게는 N-말단 아미노산 잔기, 또는 이형이량체의 노출된 표면에 면하는 잔기들 중 하나에 공유적으로 부착된다. 바람직한 커플링 기는 시스테인 잔기의 티올기이며, 이것은 표준 방법에 의하여 쉽게 수식된다. 다른 유용한 커플링 기는 메티오닌의 티오에스테르, 히스티딘의 이미다졸릴기, 아르기닌의 구아니디닐기, 티오신의 페놀기 및 트립토판의 인돌릴기를 포함한다. 이러한 커플링기는 당업자에 공지된 반응 조건을 사용하여 유도될 수 있다.
활성 작용제 제 2 코일 형성 펩티드를 표적 부분 제 1 코일 형성 펩티드에 결합하기 위하여, 두 펩티드가 이종이량체 형성에 적합한 조건하에서 접촉된다. 코일된-코일 이종이량체 형성에 적합한 예시적인 매질은 약 6 내지 약 8의 pH 및 약 50 mM 내지 약 500 mM의 염농도를 전형적으로 가지는 생리학적으로 양립가능한 수용액이다. 바람직하게, 염농도는 약 100 mM 내지 약 200 mM이다. 에시적인 매질은 다음의 조성을 가진다: 50 mM 인산 칼륨, 100 mM KCI, pH 7. 동일하게 효과적인 매질은 예를 들어, 인산칼륨을 인산나트륨 및/또는 KCI를 NaCl로 치환함에 의하여 만들어질 수 있다. 이종이량체는 높은 pH 및 염 범위, 매질의 외부 조건하에서 형설될 수 있지만, 이종이량체와 동종이량체의 어떠한 분자 상호작용 및 비교의 안정성은 상기 설명된 특성으로부터 다를 수 있다. 예를 들어, 이종이량체를 안정화하는 경향의 이온기 사이의 이온 상호작용은 예를 들어, 산성 pH에서 Glu 잔기 사슬의 수소화 또는 예를 들어, 염기성 pH에서 Lys 잔기 사슬의 탈수소화에 기인한 낮은 또는 높은 pH 값을 파괴할 수 있다. 그러나, 코일된-코일 이종이량체상의 저 및 고 pH 값의 효과는 염농도를 증가함에 의하여 극복될 수 있다.
염농도를 증가하는 것은 안정화 이온 친화 (stabilizing ionic attraction)를 중화 또는 탈안정화 이온 반발 (destabilizing ionic repulsion)을 억제할 수 있다. 어떠한 염은 이온 상호작용을 중화하는데 더 큰 효능을 가진다. 예를 들어, K-코일 펩티드의 경우에 있어서, ClO4 - 음이온의 1 M 또는 그 이상의 농도가 최대 알파-나선 구조를 유도하기 위하여 요구되고, 반면에 Cl- 이온의 3 M 또는 그 이상의 농도가 동일한 효과를 위하여 요구된다. 저 및 고 pH에서 코일된 코일 형성상의 고 염의 효과는 또한 나선상호간 이온 친화가 나선 형성에 필수적이지 않고, 오히려, 코일된 코일이 이종이량체 대 동종이량체로 형성되는 경향 여부를 조절한다. 제 1 코일 형성 펩티드, 예를 들어, E-코일 펩티드, 및 제 2 코일-형성 펩티드, 예를 들어, K-코일 펩티드는 또한 실시예 2의 그것의 전체로서 본원의 참고문헌으로 수록된 공동소유 U. S. 출원번호 09/654,191에서 설명된 바와 같이 표적 부분 및 활성 작용제에 콘주게이트될 수 있다. 또한 그것의 전체로서 본원의 참고문헌으로 수록된 U. S. Patent No. 6,300,141을 참고.
본 발명의 하나의 구체예에 있어서, 활성 작용제-코일-형성 펩티드는 짧은 혈청 반감기를 가지고 신장 경로를 통하여 배출된다. 그러므로, 활성 작용제는 표적 위치에 부착하거나 또는 그것은 개체로부터 빠르게 제거된다. 활성 작용제의 이러한 생분포는 원하지 않는 노출으로부터 수용체의 정상 조직의 보호를 촉진한다. 신장 배출을 향상시키기 위하여, 신장 배출 촉진 생분포 지시 분자 (renal excretion promoting biodistribution directing molecule)에 콘주게이션이 적용될 수 있다. 택일적인 선택적 제거 단계는 순환하는 제 1 콘주게이트를 순차적으로 제거하기 위한 개체의 원 제거 메카니즘을 허용하는 통과에 대한 충분한 양의 시간을 허용할 것이다.
또 다른 구체예에 있어서, 항체-기초된 또는 비-항체-기초된 표적 부분은 리간드 또는 항-리간드를 비조절된 항원을 보유하는 표적 위치로 전달하기 위하여 적용된다. 바람직하게, 그러한 비조절된 항원에 대한 천연 결합 작용제는 본 목적을 위하여 사용된다. 예를 들어, 간암 또는 골수종과 같은 질병은 일반적으로 이러한 표적 세포 형태의 빠른 증식에 관한 자가분비 (autocrine) 또는 외분비 (paracrine) 부분으로서 작용하는 IL-6에 대한 비조절된 IL-6 수용체에 의하여 특징된다. 그러한 병의 치료를 위하여, IL-6는 표적 부분으로서 적용된다. 예를 들어, Miki, C. 등 (2002) Cancer 94 (5): 1584-92 참고.
예를 들어, IL-6 및 제 1 코일-형성 펩티드는 화학적 수단을 통하여 콘주게이트되거나, 재조합 분자로서 형성될 수 있다. IL-6-제 1 코일 형성 펩티드 콘주게이트는 수용체로 투여되고, 콘주게이트의 IL-6 구성요소는 콘주게이트를 IL-6 수용체에 위치화를 지정한다. 이 위치화는 바람직하게 비조절된 IL-6 수용체를 보유하는 위치에서 발생할 것이다. 표적자리 위치화가 발생한 후에, 아래 설명되는 바와 같은 제거 작용제는 IL-6-제 1 코일-형성 펩티드 콘주게이트의 수용체의 순환을 실질적으로 제거하기 위하여 선택적으로 투여된다. 이 목적을 위한 적합한 제거 작용제는 예를 들어, IL-6 수용체-HSA-갈락토오스 또는 항-IL-6-항체-HSA-갈락토오스이다. 실질적으로, 예를 들어, 50 %, 70 %, 또는 바람직하게 90 %의 수용체의 순환으로부터 IL-6의 제거를 위한 충분한 시간 후에, 활성 작용제-제 2-형성 펩티드, 예를 들어, 우레아제-제 2 코일-형성 펩티드가 투여되고, IL-6-제 1 코일 형성 펩티드 콘주게이트를 통하여 표적자리로 위치된다.
아래 섹션 Ⅶ에서 보다 상세하게 설명된 바와 같이, 발현 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스, 또는 벡시니아 바이러스로부터, 또는 다양한 세균성 플라스미드로부터 유도된 발현 벡터가 재조합 우레아제 분자를 표적 세포 군집으로 전달하기 위하여 사용된다. 당업자에게 공지인 방법이 우레아제를 함유한 재조합 벡터를 구성하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, Sambrook 등, 및 Ausubel 등에서 설명된 방법을 참고. 택일적으로, 활성 작용제는 상기 섹션 Ⅱ에서 설명된 바와 같이 리포좀 또는 나노캡슐을 사용하여 표적 세포로 전달될 수 있다. 하나의 구체예에 있어서, 본 발명의 방법은 환자에게 활성 작용제 및 세포로 조성물을 표적시키는데 효과적인 표적 부분을 함유하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
C. 제거 작용제
상기 토론된 바와 같이, 제거 작용제가 개체에 투여될 수 있다. 제거 작용제는 순환하는 제 1 콘주게이트를 간세포 수용체로 지정할 수 있으며, 이것에 의하여 제 2 콘주게이트를 투여하기 이전에 순환하는 제 1 콘주게이트의 양을 감소시킬 수 있다.
상기 지적된 바와 같이, 생체 내 복합체화 및 비결합된 표적 부분 콘주게이트의 혈액 제거를 위한 물리적 특성을 촉진하는 용도를 가지는 단백질 또는 비단백질 조성물의 제거 작용제가 종양이 개체, 예를 들어, 인간 내에 함유될 때 사용될 수 있다. 제거 작용제는 바람직하게 1 또는 그 이상의 다음의 특성을 나타낸다: 생체 내에서 표적 부분을 가진 빠르고 효율적인 복합체화; 순차적으로 투여된 활성 작용제와 결합할 수 있는 표적 부분 콘주게이트의 혈액으로부터의 빠른 제거; 다량의 표적 부분 콘주게이트를 제거 또는 불활성화하기 위한 높은 능력; 및 낮은 면역원성.
유용한 제거 작용제는 헥소오스-기초된 및 비-헥소오스 기초된 부분을 포함한다. 헥소오스-기초된 제거 작용제는 애시웰 (Ashwell) 수용체 또는 상피 세포 및/또는 간의 쿠퍼 (kupffer) 세포와 관련되는 만노오스/N-아세틸글루코사민 수용체 또는 만노오스 6-인산 수용체에 의하여 인식되는 1 또는 그 이상의 헥소오스 (6탄당 부분)을 통합하기 위하여 유도되는 분자이다. 예시적인 헥소오스는 갈락토오스, 만노오스, 만노오스 6-인산, N-아세틸글루코사민 및 이와 유사한 것을 포함한다. 애시웰 수용체에 의하여 인식되는 다른 부분은 글루코오스, N-갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, 갈락토오스의 티오글리코사이드 및 일반적으로, D-갈락토사이드 및 글루코사이드가 또한 사용될 수 있다. 단백질에 갈락토오스 티오글리코사이드 콘주게이트는 예를 들어, Lee 등 (1976) Biochemistry, 15 (18): 3956 또는 Drantz 등 (1976) Biochemistry, 15 (18): 3963에서 설명된 것으로 달성될 수 있다.
단백질 형태 갈락토오스 기초 제거 작용제는 내재적으로 노출된 갈락토오스를 가지는 단백질을 포함하거나, 또는 그것은 그러한 갈락토오스 잔기를 노출 또는 통합하기 위하여 유도되어진다. 노출된 갈락토오스 잔기는 특이적인 수용체 (애시웰 수용체)를 통하여 간에서 엔도시토시스에 의한 빠른 제거를 위하여 제거 작용제로 지정된다. 이러한 수용체는 제거 작용제와 결합하고, 간세포에서 엔도시토시스를 유도하여, 리소좀과 융합하고 수용체는 세포 표면으로 되돌아가 재활용된다. 이 제거 메카니즘은 고 효율, 고 능력 및 빠른 역학에 의하여 특징된다.
단백질-기초된/갈락토오스-보유 다양성의 예시적인 제거 작용제는 인간 알파-1 산 당단백질의 아시알로오로소무코이드 (asialoorosomucoid) 유도체이다. 아시알로오로소무코이드의 혈액으로부터 빠른 제거는 Galli, 등, J of Nucl Med Allied Sci (1988) 32 (2): 110-16에서 설명된다. 뉴라미니다아제로 오로소무코이드 (orosomucoid)의 처리는 시알산 잔기를 제거하며, 그것에 의하여 갈락토오스 잔기가 노출된다. 추가적인 유도된 제거 작용제는 예를 들어, 갈락토실화된 알부민, 갈락토실화된 IgM, 갈락토실화된 IgG, 아시알로헵토글로빈, 아시알로페투인, 및 아시알로세룰로플라스민을 포함한다.
추가적인 제거 작용제는 2002년 3월 19일 공개된 U. S. Patent No. 6,358,490; 2001년 1월 9일 공개된 U. S. Patent No. 6,172,045; 및 1999년 3월 23일 공개된 U. S. Patent No. 5, 886,143에서 설명되며, 그것의 전체는 본원에서 참고 문헌으로 수록된다.
본 발명에서 유용한 제거 작용제의 더 나아간 종류는 작은 분자, 예를 들어, 약 500 내지 약 10,000 달톤 범위를 포함한다. 작은 분자는 갈락토오스로 유도되어질 수 있다. 작은 분자 제거 작용제는 바람직하게 (1) 관련된 콘주게이트, 코일 형성 펩티드, 활성 작용제, 및/또는 표적 부분을 빠르고 효율적으로 복합체화; 및 (2) 예를 들어, 폐 및 췌장에 의하여 받아들여지는 복합체로 축적되는 것을 반대하는 것으로 간 특이적 분해 시스템인 갈락토오스 수용체를 통하여 혈액으로부터 그러한 복합체를 제거할 수 있다. 추가적으로, 리간드-항-리간드 상호작용의 친화도로 커플된 갈락토오스-매개된 간 흡수의 빠른 동역학은 중간체 또는 심지어 더 작은 분자량 캐리어의 사용을 허용한다.
본 발명의 하나의 구체예에 있어서, 단백질 타입 및 폴리머 타입 비 갈락토오스 기초된 제거 작용제가 사용된다. 이러한 제거 작용제는 응집 매개된 메카니즘을 통하여 작용할 수 있다. 본 발명의 이러한 구체에에 있어서, 사용된 제거 작용제는 제거 작용제의 접근이 배제되는 표적 조직에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 예를 들어, 고 분자량, 예를 들어, 약 200,000 내지 약 1,000,000 달톤의 범위가 종양 세포 표적이 관련될 때 유용할 수 있다.
다른 종류의 제거 작용제는 순환하는 활성 작용제/표적 부분 콘주게이트를 제거하지 않지만, 대신에 활성 작용제, 표적 부분, 리포좀, 바이러스성 벡터, 및/또는 그들의 다른 부분상의 관련된 부위를 차단함에 의하여 순환하는 콘주게이트를 불활성화시킨다. 이러한 "캡 (cap)-형태" 제거 작용제는 바람직하게 작은, 예를 들어, 500 내지 10,000 달톤, 높은 전하의 분자, 예를 들어, 유도된 6,6'-[(3,3'-디메틸[1,1'-비페닐]-4,4'-디일)비스(아조)비스[4-아미노-5-히드록시-1,3-나프탈렌 디설폰산]테트라나트륨염이다.
E. 투여량/투여
본 발명의 방법에 대하여, 투여의 시간과 순서를 조절하는 어떠한 효과적인 투여 처방이 사용될 수 있다. 인간 개체에 대한 예시적인 투여량 수준은 투여의 방식, 종양의 범위 (크기 및 분포), 및 우레아제 처리에 대한 암의 반응에 의존할 것이다.
여기에서 우레아제 조성물은 직접적으로 종양내로 주사되며, 예시적인 투여량은 mm3 종양 당 0.1 내지 1,000 국제 단위 우레아제 활성이다. 예를 들어, 종양에서 우레아제의 비교적 균일한 분포가 성취되는 가정에 있어서, 0.5 내지 5 국제 단위의 투여량이 적합할 수 있다. 주사바늘의 위치화는 종래의 조영 안내 기술, 형광 투시법에 의하여 안내되며, 의사는 표적 조직에 따른 바늘의 위치를 볼 수 있다. 그러한 안내 도구는 초음파, 형광 투시법, CT 또는 MRI를 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 관점에 관하여, 종양 내로 우레아제의 직접적인 주사 동안 또는 후에, 개체의 암조직 영역 내의 pH 변화를 검출할 수 있는 도구에 의하여 종양 조직을 관찰함에 의하여 투여된 우레아제의 효과 또는 분포가 관찰될 수 있다. 그러한 도구는 종양 내로 직접적으로 삽입될 수 있는 pH 프로브, 또는 자기 공명 조영 (MRI), 컴퓨터화된 단층 촬영법 (CT), 또는 형광투시법과 같은 시각화 도구를 포함한다. MRI 검사는 pH의 기능으로서 조직의 자기적 특성 내의 차이 상에 간단히 기초된 추가적인 조영 작용제의 부재에서 수행될 수 있다. CT 또는 형광 조영법은 불투명도가 조직 매질의 pH에 의하여 영향을 받는 추가적인 pH-민감성 조영 작용제를 요구할 수 있다. 그러한 작용제는 당업자에 의하여 공지된다.
어떠한 우레아제의 주사 전에, 종양 조직은 정상 조직 주변의 비교적 낮은 pH에 의하여 시각화 될 수 있다. 그러므로, 정상 조직은 약 7.2의 정상 pH를 가지지만, 반면에 종양 조직은 0.1 내지 0.4 또는 그 이상의 더 낮은 pH 단위일 수 있다. 어떠한 우레아제가 주사되기 전에 종양 조직의 범위는 그것의 더 낮은 pH에 의하여 한정될 수 있다. 우레아제 투여 후, 우레아제를 가지는 종양의 pH는 증가하기 시작하고, 이전의 전-투여 (pre-dosing) 조영과 결과의 조영을 비교하여 확인될 수 있다.
본 방식으로 조직을 검사함에 의하여, pH의 변화의 정도 및 영향을 받은 조직의 범위가 관찰될 수 있다. 조사에 기초하여, 의사는 추가적인 조성물을 위치에 투여 및/또는 종양 위치 내의 추가적인 지역에 조성물을 투여할 수 있다. 이 과정은 희망하는 정도의 pH 변화, 예를 들어, 0.2 내지 0.4 pH 단위까지 반복되며, 고형암의 완전한 영역을 넘어 성취된다.
직접적인 주사에 의한 투여는 적합한 간격, 예를 들어, 매주 또는 주당 2회로 희망하는 종착점, 바람직하게 실질적으로 또는 완전한 종양 덩어리가 없어진 것이 관찰될 때까지 반복될 수 있다. 상기에서와 같이 치료 효율성은 치료과정동안 처리된 조직의 pH의 변화를 시각화함에 의하여 관찰될 수 있다. 그러므로, 각 추가적인 주사 전에, 조직의 pH는 현재 존재하는 종양의 정도를 결정하기 위하여시각화될 수 있고, 그 후 조직의 pH의 변화가 조직으로 새로운 투여량의 우레아제 조성물의 투여를 관찰하는데 사용될 수 있다.
여기에서 우레아제는 직접주사와는 다른 방법에 의하여 비경구적으로 투여될 수 있으며, 우레아제의 예시적인 투여량은 100-100,000 국제단위/kg 우레아제 활성/kg 개체 체중이다. 본원에서 지적된 바와 같이, 본 방법의 우레아제 조성물은 바람직하게 암세포, 예를 들어, 고형암의 부위로 표적 우레아제에 대한, 또는 포집 우레아제, 예를 들어 종양 위치에서 선택적으로 리포좀 형태로 표적 작용제를 포함한다.
상기 언급된 바와 같이, 조직 pH의 변화에 민감한 조영 기술은 투여된 효과적인 투여량을 관찰하기 위하여 사용될 수 있다. 그러한 표적화는 명 시간 또는 더 이상 유지될 수 있기 때문에, 본 방법은 상기에서와 같이 종양 영역의 pH에서의 증가에 의하여 증거되는 것으로 종양 위치가 적절하게 투여되었는지 확인 하기 우하여, 우레아제 주사 전, 및 명 시간, 예를 들어, 투여 후 12-24 시간의 종양 pH를 관찰하는데 연관될 수 있다. 이러한 검사의 결과에 의존하여, 본 방법은 pH에 있어서 희망하는 증가, 예를 들어, 0.2-0.4 pH 단위가 관찰될 때까지 추가적인 투여를 지시할 수 있다. 한번 이러한 투여량이 결정되면, 환자는 일반적인 기초, 예를 들어, 주당 1 또느 2회로 종양 크기 또는 상태의 변화가 성취될 때까지 유사한 범위의 우레아제 투여량으로 처리될 것이다.
양 형태의 투여에 있어서, 최종 투여량 처방은 드러그의 작용을 수식하는 여러가지 인자, 예를 들어, 작용제의 특이적 활성, 질병 상태의 심각성, 환자의 반응, 나이, 상태, 체중, 성별, 및 환자의 식사, 어떠한 감염의 심각성, 및 이와 유사한 것을 고려하여 우수한 임상 경험을 가진 주치의에 의하여 결정되어지다. 설명되어지는 추가적인 인자는 투여 시간 및 빈도, 드러그 조합(들), 반응 민감성, 및 치료에 대한 관용/응답을 포함한다. 본원에서 언급된 관련된 어떠한 제형으로 치료하기 위한 적합한 투여량의 더 나아간 세밀화는 당업자, 특히 공개된 투여량 정보 및 분석 뿐만 아니라 임사 시험에서 관찰된 약물동력학적 데이터에 의하여 일상적으로 행하여진다. 적합한 투여량은 투여 응답 데이터와 함께 체액 내의 작용제 또는 다른 샘플의 농도를 결정하기 위하여 확립된 분석을 사용하여 확실하게 될 수 있다.
투여량의 빈도는 작용제 및 투여 경로의 약물동력학적 변수에 의존할 것이다. 투여량 및 투여는 충분한 수준의 활성 작용제를 제공하거나 희망하는 효과를 유지하기 위하여 조절된다. 따라서, 약학적 조성물은 작용제의 원하는 최소한의 수준을 유지하기 위하여 요구되는 것으로서, 단일 툴여, 다중 분리 투여, 연속 주입, 유지된 방출 데포트, 또는 그들의 조합으로 투여될 수 있다.
단기 작용 약학적 조성물 (즉, 짧은 반감기)은 하루에 1회 또는 하루에 1 회 이상 (예를 들어, 하루에 2, 3, 또는 4회) 투여될 수 있다. 장기 작용 약학적 조성물은 매 3 내지 4일, 매주, 또는 2 주에 1 회 투여될 수 있다. 피하, 복강내, 또는 경막하 펌프와 같은 펌프가 연속적 주입을 위하여 바람직하다.
약학적으로 허용되는 캐리어 내의 상기 섹션 Ⅱ에서 설명딘 바와 같이 제형된 본 발명의 활성 작용제를 포함하는 조성물이 제조되어 적합한 콘테이너에 두어지고, 지시된 상태의 치료를 위하여 표지된다. 표지 상에 지시된 상태는 여러가지 암 형태의 처리 및 진단을 포함하지만 여기에 한정되는 것은 아니다. 아래에 설명되는 바와 같이, 키트가 또한 고려될 수 있으며, 여기에서 키트는 약학적 조성물의 투여량 형태 및 의학적 상태의 치료에서 조성물의 사용을 위한 지시를 포함한 포장 삽입물을 포함한다.
일반적으로, 본 발명에서 사용된 활성 작용제는 효과적인 양으로 개체에 투여된다. 일반적으로, 효과적인 양은 (1) 치료되어져 보이는 질병의 증상의 감소; 또는 (2) 치료되어져 보여지는 질병을 처리하는데 관련된 약학적 변화의 유도이다. 종양에 대하여, 효과적인 양은 종양의 크기의 감소; 종양의 성장의 느림; 전이의 예방 또는저해; 또는 영향을 받은 개체의 기대 수명의 증가에 효과적인 양을 포함할 수 있다. 쥐에 활성 작용제를 투여하는 예시적인 방법은 아래 실시예 6에 설명된다.
본 발명의 활성 작용제, 제거 작용제, 및/또는 조영 작용제는 단일 또는 다중 투여량으로 투여된다. 택일적으로, 작용제는 확장된 시간의 기간 이상 정맥내로 주입될 수 있다. 예를 들어, 제거 작용제는 연속적인 방법으로 표적 부분을 제거하는데 충분한 시간 기간 동안 정맥 내로 투여될 수 있다.
본 발명의 다중 표적 부분 투여 구체예에 있어서, 상기 설명한 바와 같이, 각 투여된 구성요소의 투여량은 경험에 따라 주치의에 의하여; 수용체 상태의 특이성, 예를 들어, 표적 부분 선택 및 투여 경로의 결정에 영향을 주는 관련된 항원을 포함하는 표적 위치의 특성 및 위치에 의하여; 및 적용된 표적 부분, 예를 들어, 항원 밀도 및 알원에 대한 항체의 친화성에 따라 다양하게 되는 항체 수행에 의하여 결정된다.
IV . 항암 작용제를 강화하는 방법
상기 언급된 바와 같이, 현재 화학요법의 제한의 하나는 표적 종양이 항-종양 화합물의 효과에 점차적으로 저항하게되는 것이다. 이러한 저항은 종양 세포 내로 화합물의 유입이 감소되고 유입의 부위에서 드러그의 이용가능성이 감소되거나 또는 세포내 대사가 증가되는 것에 기인하게 된다.
수 많은 약한 기초 드러그에 대하여, 그것은 1 또는 그 이상의 수소화 할 수 있는 아민을 가지는 드러그이며, 드러그 유입의 메카니즘은 비하전된 형태로 세포막을 가로지르는 수동 확산에 연관된다. 따라서, 세포막을 가로지르는 화합물의 이동의 속도는 내부/외부 pH 구배에 의존할 것이다. 만약 세포외 pH가 세포 내 pH와 동일하거나 조금 높다면, 예를 들어, 약 pH 7.2, 화합물은 적어도 그것이 세포에 존재하는 것과 같은 정도로 비하전된 형태로 세포로 통과되는 경향일 것이다. 역으로, 그것이 고형 종양에서 처럼, 세포외 pH가 세포내 pH보다 떨어지면, 낮은 외부 pH는 하전되고, 수소화된 형태의 화합물을 선호할 것이며, 이것은 드러그를 세포 내로 유입하느 것을 저해할 것이다. 효과적으로, 종양에서의 낮은 세포외성 pH의 효과의 하나는 약한 기초 항-종양 화합물에 대항하는 종양을 차단하는 것이다.
낮은 세포외 pH에 의하여 활성이 역으로 작용할 수 있는 약한 기초 항-종양 화합물은 독소루비신, 다우노루비신, 미토산트론, 에피루비신, 미토마이신, 블레오마이신, 빈블라스틴 및 빈크라스틴과 같은 빈카 알카로이드, 시클로포스파미드 및 메클로레타미드 염산과 같은 알킬화제, 및 안트리네오플라스틱 푸린 및 피리미딘 유도체를 포함한다.
본 방법에 있어서, 우레아제 또는 우레아제 함유 조성물은 종양 체액으 세포외 pH를 적어도 0.1 pH 단위, 예를 들어, 0.1 내지 0.5 pH 단위 또느 그 이상으로 증가시키는데 효과적인 양으로 고형암으로 투여된다. 어떠한 구체예에 있어서, 체액의 세포외 pH는 적어도 pH 7.0, 7.2, 또는 그 이상으로 증가된다.
우레아제는 상기 섹션 III에서 설명된 바와 같이, 예를 들어, 직접적으로 환자의 종양 또는 직접적인 주사와는 다른 비경구적으로 투여될 수 있다. 또한 아래에 설명되는 바와 같이, 우레아제의 투여에 의하여 형성된 pH의 변화는 종양 pH를 시각화하기 위한 조영 도구 또는 종양의 직접적인 pH 측정에 의하여 종양 조직의 pH의 변화 및 이러한 변화의 정도를 결정함에 의하여 관찰될 수 있다.
이러한 방법에 의하여 투여된 투여량은 필요되는 것 보다 적을 수 있으며, 이때 우레아제는 주사되는 양이 종양 pH에 있어서 언하는 증가를 생성하기에 충분한 것인 한 단독 항-종양 작용제이다. 택일적으로, 본 방법은 치료적인 양의 우레아제 및 치료적 또는 아치료적 (subtherapeutic) 양의 항암 화합물을 투여하는 것과 관련될 수 있다. 이해되는 바와 같이, 본 방법은 우레아제가 화합물의 치료적인 효과를 향상기키고, 우레아제가 그것 자체로 치료적 효과를 나타내기 때문에, 주어진 항종양 화합물의 정상적인 투여량 보다 낮은 것이 가능할 수 있다. 더 작은 부작용을 가지면서 더 큰 효능이 결과된다.
하나의 구체예에 있어서, 아래 설명된 바와 같이, 화학적 물질은 또한 활성 작용제의 전달을 향상시키기 위하여 활성 작용제와 연관될 수 있다. 이러한 구체예에 있어서, 활성 작용제는 어떠한 방법, 예를 들어, 직접적인 주사와는 다른 비경구적으로 투여될 수 있을 것이다.
V. 항암 치료를 관찰하는 방법
또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 또한 환자 내의 고형암의 존재, 크기 또는 상태를 평가함에 의하여 항암 치료의 방법을 제공한다. 본 방법은 상기 설명한 바와 같은 활성 작용제, 예를 들어, 우레아제를 고형암을 함유하거나 함유하는 것으로 의심되는 환자에 투여하는 것을 포함한다. 활성 작용제는 환자의 고형암에 활성 작용제를 위치시키는데 효과적인 조건하에서 투여된다.
환자는 아래에 설명되는 바와 같이, 환자의 조직에 세포외성 pH에 변화를 검출할 수 있는 진단 도구로 검사된다. 진단 도구는 바람직하게 종양에 위치될 수 있는 상기 섹션 Ⅱ에서 설명된 것과 같은 조영, 대조 또는 이동 작용제와 같은 pH-민감성 진단 작용제이며, 활성 작용제가 투여되기 전, 후 또는 동시에 투여될 수 있다. 조직 지역은 투여 후 세포외 pH의 증가를 나타내는 개체네서 확인된다. 진단 작용제를 확인할 수 있는 어떠한 도구가 상기 설명한 바와 같이, MRI, PET 스캔, 및 이와 유사한 것과 같은 작용제를 검출하기 위하여 사용될 수 있다.
하나의 구체예에 있어서, 본 방법은 우레아제를 항종양 치료가 적용된 개체에 투여하는 것을 포함하며, 확인은 고형 종양내에 우레아제의 위치를 검출하기 위하여 사용된다.
확인은 우레아제 투여에 응답으로 종양의 크기 및 형태의 변화를 관찰하기 위하여 사용될 수 있다.
PET 스캔을 적용한 하나의 구체예에 있어서, 환자에게 13N-표지된 암모니아가 투여된다. 환자는 다음으로 종양 위치에 도달하기에 효과적인 양으로 우레아제가 투여된다. 우레아제는 우레아를 가수분해하여 비-표지된 암모니아를 생성한다. 시간이 지나면서, 표지된 암모니아는 희석 또는 옮겨져서 스캔상에 점차적인 제거의 원인이 된다.
PET 스캔을 적용한 또다른 구체예에 있어서, 개체에 13N-표지된 우레아가 투여된다. 환자는 다음으로 종양 위치에 도달하는데 효과적인 양으로 우레아제가 투여되었다. 우레아제는 표지된 우레아를 가수분해하여 표지된 암모니아를 생성하고 이것은 스캔상에서 검출될 수 있다.
VI . 키트
또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 본원에서 설명된 방법을 사용하여 종양 세포의 성장을 저해하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 1 또는 그 이상의 활성 작용제를 함유하는 컨테이너를 포함한다. 키트는 추가적으로 본 발명의 방법의 실시를 위하여 본원에서 설명된 어떠한 다른 구성 요소를 포함할 수 있다. 그러한 구성요소는 약학적 구성요소, 표적 부분, 조영제, 유전자 치료 구성요소, 및 이와 유사한 것을 포함하지만 여기에 한정되는 것은 아니다.
키트는 선택적으로 종양 세포 성장을 저해하기 위한 활성 작용제의 사용을 공개하는 안내서 (즉, 프로토콜)을 함유하는 지시물을 포함할 수 있다. 그러므로, 하나의 구체예에 있어서, 키트는 활성 작용제, 바람직하게는 우레아제 효소를 함유하는 약학적 조성물, 및 환자의 암의 치료를 위한 개체에 조성물을 투여하는 것을 교시하는 지시물을 포함한다. 하나의 구체예에 있어서, 지시물은 종양의 크기에 의존하여, 조성물이 종양에 직접 주사되어 투여될 때, mm3 종양 당 0.1 내지 100 국제 단위 우레아제 활성, 및 조성물이 종양으로 직접 주사와는 다른게 한자에게 비경구적으로 투여될 때, 100-100,000 국제 단위/kg 국제 단위 우레아제 활성/kg 개체 체중의 양으로 환자에게 우레아제 조성물을 투여하는 것을 교시한다.
또 다른 구체예에 있어서, 지시물은 또한 고형암에서 높은 세포내/낮은 세포외 pH 구배에 의하여 감소되는 효과의 약한 기초 항 종양 화합물을 받고 있는 개체에 고형암에서 높은 세포내/낮은 세포외 pH 구배를 감소 또는 역으로 하기 위한 효과적인 우레아제의 양으로 우레아제 조성물을 투여하는 것을 교시한다.
택일적으로, 지시물은 개체의 고형암에서 우레아제를 위치시키는데 효과적인 조건하에서 고형암을 함유하거나 또는 함유하는 것으로 의심되는 개체에 우레아제 조성물을 투여하고, 개체의 조직에서 세포외 pH의 변화를 검출할 수 있는 진단 도구로 환자를 조사하고, 상기 투여 후 세포 외 pH의 증가를 나타내는 개체가 가지는 조직 지역을 확인하는 것을 교시한다.
지시물은 전형적으로 쓰여지거나 프린트된 물질을 포함하는 반면, 그들은 그러한 것에 제한되지 않는다. 그러한 지시를 저장하고 최종 사용자와 의사소통할 수 있는 어떠한 매체가 본 발명에 의하여 고려된다. 그러한 매체는 전자적 저장 매체 (예를 들어, 자기 디스크, 테이프, 카트리지, 칩), 광학적 매체 (예를 들어, CD ROM) 및 이와 유사한 것을 포함하지만 여기에 한정되는 것은 아니다. 그러한 매체는 그러한 지시물을 제공하는 인터넷 사이트에 주소되는 것을 포함할 수 있다.
VII . 유전자/세포 치료
본 발명의 다른 관점에 있어서, 유전자 치료 조성물이 또한 포유동물 환자 내의 암세포의 성장을 저해하는데 사용하기 위하여 고려된다. 유전자 치료 조성물은 환자에 투여되었을 때, 암세포를 선택적으로 트랜스펙션하는데 효과적인 표적 벡터, 및 상기 벡터 내에서 운반되는 핵산 분자, 예를 들어, 트랜스펙션된 암세포 내에서 활성 작용제, 바람직하게는 우레아제를 코드하는 mRNA를 생성하는데 효과적인 재조합 핵산 서열을 포함한다.
하나의 구체예에 있어서, 종양세포는 활성 작용제를 코드하는 이종 핵산 분자를 발현하는 조작된 비-종양성 세포와 접촉된다. 비-종양성 조작된 세포는 제한 없이, 섬유아세포, 표피세포, 내피세포, 골 세포, 각질세포, 또는 종양으로부터 유래된 조사되고 조작된 비-종양성 세포이다.
다른 구체예에 있어서, 종양 세포는 세포 표적 부분 및 우레아제 단백질을 코드하는 이종 핵산 분자 및 분비성 선도 서열을 코딩하는 유전자 구조물로 트랜스펙션된다. 유전자 구조물은 종양세포와의 콘주게이트로서 세포 표적 부분 및 이종 우레아제 단백질 및 분비 선도 서열을 발현할 수 있고, 이것에 의하여 콘주게이트는 세포 표적 부분에 의하여 인식된 세포 표면 항원에서 선택적인 위치화를 위하여 그 후에 세포를 떠나는 분비성 선도 서열에 의하여 지시되어진다.
바람직하게, 세포 표적 부분은 세포 표면 항원에 선택적으로 위치되고, 세포 표면 항원은 적어도 하나의 인간 고형암에 특이적이다. 유전자 구조물은 프로모터 및 유전자 구조물의 발현을 조절하기 위한 유전적 스위치를 포함하는 조절 요소를 포함하는 전사 조절 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 구체예에 관하여, 유전자 구조물은 바이러스 벡터로 포장될 수 있다. 다양한 바이러스 벡터가 종양 표적을 위하여 이용가능하다. 파보바이러스는 선택적으로 종양세포에 감염하는 것으로 알려진다. 택일적으로, 바이러스는 공개된 방법에 따라 종양 세포 내에서 선택적으로 복제하기 위하여 디자인될 수 있다. 예를 들어, Puhlmann M 등, Hum Gene Ther, (1999) 10 (4): 649-57; Noguiez-Hellin P 등 Proc Natl Acad Sci U S A, (1996) 93 (9): 4175-80; 및 Cooper MJ, Semin Oncol (1996) 23 (1) 172-87를 참고. 예를 들어, 바이러스는 돌연변이된 티미딘 키나아제 또는 폴리머라아제 유전자를 함류하는 것으로 변화될 수 있으며, 이러한 효소를 함유하는 빠르게 분열하는 세포에서 단지 바이러스 복제가 가능하게 된다. 택일적으로, 바이러스는 종양 특이적 조절 요소, 예를 들어, 종양 특이적 프로모터 지역을 함유하는 것으로 유전적으로 조작될 수 있고, 이것은 응답적이고 단지 종양세포에서 바이러스 복제를 위하여 필요한 원하는 단백질 또는 단백질을 발현한다. 바람직하게, 유전자 구조물은 아데노바이러스내로 포장된다.
A. 클로닝 , 유전자 전달 및 발현을 위한 벡터
본 발명의 어떠한 구체예 내에서, 발현 벡터는 우레아제 폴리펩티드 생선물을 발현하기 위하여 적용되며, 그것은 다음으로 정제된다. 다른 구체예에 있어서, 발현 벡터는 유전자 치료에 사용된다. 발현 벡터는 벡터내에 제공된 적합한 신호, 및 숙주 세포에서 흥미호운 유전자의 발현을 유도하는 바이러스 및/또는 포유류 기원으로부터의 인핸서/프로모터와 같은 다양한 조절 요소를 포함할 수 있다. 숙주 세포 내에서 mRNA 안정성 및 번역가능성을 최적화하기 위하여 디자인된 요소가 또한 정의되어진다. 폴리펩티드의 발현에 드러그 선택 마커의 발현이 연결된 요소로서, 생성물을 발현하는 영구적으로 안정한 세포 클론을 위한 수 많은 우성 드러그 선택 마커의 사용을 위한 조건이 또한 제공된다.
B. 조절 요소
용어 "발현 구조물"은 전사될 수 있는 서열을 코딩하는 핵산의 부분 또는 전체의 유전자 산물을 코딩하는 핵산을 함유하는 어떠한 타입의 유전적 구조물을 포함하는 것을 의미한다. 전사체는 단백질로 번역되지만, 그것은 번역될 필요가 없을 수 있다. 어떠한 구체예에 있어서, 발현은 유전자의 전사 및 mRNA의 유전자 산물로의 번역을 포함한다. 다른 구체예에 있어서, 발현은 단지 흥미로운 유전자를 코딩하는 핵산의 전사를 포함한다.
바람직한 구체예에 있어서, 유전자 산물을 코딩하는 핵산은 프로모터의 전사 조절하에 있다. "프로모터"는 유전자의 특이적 전사를 개시하기 위하여 요구되는 세포의 합성 기구 또는 도입된 합성 기구에 의하여 인식되는 DNA서열을 나타낸다. 어구 "전사 조절 하"는 프로모터가 RNA 폴리머라아제 개시 및 유전자 발현을 조절하기 위하여 핵산과의 관계에서 정확한 위치 및 방향성으로 있는 것을 의미한다.
용어 프로모터는 RNA 폴리머라아제 II에 대한 개시 위치 주변에 군집을 이룬 전사 조절 모듈의 군을 나타내기 위하여 본원에서 사용되어질 것이다. 프로모터는 각각 근사적으로 7-20 bp의 DNA로 구성되며, 전사 활성 또는 억제 인자 단백질에 대한 1 또는 그 이상의 인식 위치를 함유하는 분리된 작용 모듈로 구성될 수 있다. 각 프로모터 내의 적어도 하나의 모듈은 RNA 합성에 대한 개시 위치를 위치시키는데 작용한다. 예시적인 모듈은 TATA 박스이지만, 어떤 프로모터에 있어서는 포유류 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스페라아제 유전자에 대한 프로모터 및 개시의 장소를 고정하는데 도움을 주는 시작 위치와 중첩된 분리된 요소인 SV40 후기 유전자에 대한 프로모터와 같이 TATA 박스를 결핍한다.
흥미로운 핵산 서열의 발현을 조절하기 위하여 적용된 특별한 프로모터는 그것이 표적된 세포 내에서 핵산의 발현을 지시할 수 있는 한 중요하게 된다고 생각도지 않는다. 그러므로, 이때 인간 세포가 표적되면, 그것은 인간세포에서 발현될 수 있는 프로모터에 인접하고 통제 하에 있는 핵산 코딩 영역에 위치되는 것이 바람직하다. 일반적으로, 그러한 프로모터는 인간 또는 바이러스 프로모터를 포함할 수 있다.
여러가지 구체에에 있어서, 인간 사이토메갈로바이러스 (CMV) 즉시 초기 유전자 프로모터, SV40 초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 긴 말단 반복, 쥐 인슐린 프로모터 및 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소가 흥미로운 서열을 코딩하는 고수준 발현을 획득하기 위하여 사용되어질 수 있다. 흥미로운 코딩 서열의 발현을 달성하기 위하여 당어자에게 잘 알려진 포유동물 세포성 또는 세균성 파아지 프로모터가 또한 고려된다.
여기에서 cDNA 삽입물이 적용되며, 유전자 전사체의 적합한 폴리아데닐레이션에 영향을 주는 폴리아데닐레이션 신호를 포함하는 것이 요구될 수 있다. 폴리아데닐레이션 신호의 특성은 본 발명의 성공적인 수행을 위하여 중요하지는 않고, 인간 성장 호르몬 및 SV40 폴리아데닐레이션 신호와 같은 어떠한 그러한 서열이 적용될 수 있다. 발현 카세트의 요소로서 종결자가 또한 고려될 수 있다. 이러한 요소는 메시지 수준을 향상하고 카세트로부터 다른 서열로 통하여 읽는 것을 최소화하는데 작용할 수 있다.
C. 선별가능한 마커
본 발명의 어떠한 구체예에 있어서, 본 발명의 핵산 구조물을 함유하는 세포는 발현구조물 내에 마커를 포함함에 의하여 시험관 내 또는 생체 내에서 확인될 수 있다. 그러한 마커는 발현 구조물을 함유하는 세포의 확인을 쉽게 하는 세포에 확인가능한 변화를 부여한다. 전형적으로, 클로닝 및 형질 전환체의 선별을 돕기 위한 드러그 선별 마커, 예를 들어, 네오마이신, 푸로마이신, DHER, GPT, 제오신 및 히스티디놀에 저항성을 부여하는 유전자의 포함이 유용한 선별가능한 마커이다. 택일적으로, 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나아제 (tk) 또는 크로람페니콜 아세틸트랜스페라아제와 같은 효소가 적용될 수 있다. 면역학적 마커가 또한 적용될 수 있다. 선별가능한 마커의 더 나아간 예는 당업자에 공지된다. 예를 들어, Baumann, R. P. 등 (2002) Biotechniques 32 (5): 1030-34를 참고.
D. 발현 벡터의 전달
발현 벡터가 세포 내로 도입될 수 있는 수 많은 방법이 있다. 본 발명의 어떠한 구체예에 있어서, 발현 구조물은 바이러스 또는 바이러스 게놈으로부터 유래된 조작된 구조물을 포함하며, 이것은 우레아제 조성물을 표적 세포로 전달하는데 사용된다. 숙주 세포 게놈내로 통합되고 바이러스 유전자를 안정하고 효율적으로 발현하기 위하여, 수용체-매개된 엔도시토시스를 통하여 숙주로 들어오는 어떠한 바이러스의 능력은 그들을 포유 동물 세포로 외래 유전자의 전달을 위한 매력적인 후보로 만든다.
생체 내 전달을 위한 바람직한 방법의 하나는 아데노바이러스 발현 벡터의 사용과 관련된다. "아데노바이러스 발현 벡터"는 (a) 구조물의 포장을 지탱하고, (b) 그 내에 클로닝되어진 폴리뉴클레오티드를 발현하기에 충분한 아데노바이러스 서열을 함유하는 구조물을 포함하는 것을 의미한다. 본 내용에 있어서, 발현은 유전자 산물이 합성되는 것을 요구하지 않는다. 예를 들어, Barnett, B. G. 등 (2002) "Targeted Adenovirus Vectors" Biochim Biophys Acta 1575 (1-3): 1-14을 참고.
본 발명의 하나의 구체예에 있어서, 발현 벡터는 아데노바이러스의 유전적으로 조작된 형태를 포함할 수 있다. 36 kb, 선상, 이중가닥 DNA 바이러스인 아데노바이러스의 유전적 조직의 지식은 거대한 부분의 아데노바이러스 DNA를 최대 7 kb까지 외래 DNA로 치환하는 것을 가능하게 한다. 레트로바이러스와 다르게, 숙주 세포의 아데노바이러스 감염은 아데노바이러스 DNA는 잠재적인 유전독성이 없이 에피좀 방식으로 복제될 수 있기 때문에, 염색체 통합으로 결과되지 않는다. 또한, 아데노바이러스는 구조적으로 안정하고, 확장된 증폭 후에 검출되는 게놈 재배열이 없다.
아데노바이러스는 그것의 중간 크기의 게놈, 조작의 편의, 높은 타이터 (titer), 광범위한 표적 세포 범위 및 높은 감염성 때문에, 유전자 전달 벡터로서 사용되기에 특히 적합하다. 아데노바이러스 벡터의 생성 및 전파는 헬퍼 세포주에 의존할 수 있다. 헬퍼 세포주는 인간 배아 신장 세포, 근육 세포, 조혈 세포 또는 다른 인간 배아 중배엽 또는 상피 세포와 같은 인간 세포로부터 유래될 수 있다. 택일적으로, 헬퍼 세포는 인간 아데노바이러스에 대한 증식허용인 다른 포유류 종의 세포로부터 유래될 수 있다. 그러한 세포는 예를 들어, 베로 (Vero) 세포 또는 다른 원숭이 배아 중매엽 또는 상피 세포를 포함한다. 예시적인 헬퍼 세포주는 293 세포주이고, 그것은 Ad5 DNA 단편에 의하여 인간 배아 신장 세포로부터 형질전환되며 구성적으로 E1 단백질을 발현한다. 293 세포를 배양 및 아데노바이러스를 전파하는 방법은 설명되어진다.
추가적인 바이러스 벡터는 본 발명의 발현 구조물로서 적용될 수 있다. 벡시니아 바이러스 (Walther, W. 및 Stein, U. (2000) Drugs 60 (2): 249-71), 아데노-관련 바이러스 (Zhao, N. 등 (2001) Mol Biotechnol 19 (3): 229-37) 및 헤르페스바이러스 (Burton, E. A. 등 (2001) Adv Drug Deliv Rev 53 (2): 155-70)와 같은 바이러스로부터 유래된 벡터가 적용될 수 있다. 본 발명에 상용될 수 있는 추가적인 종양 특이적, 복제 선택적 바이러스는 Hawkins, L. K. 등 (2002) Lancet Oncol3 (1): 17-26에서 리뷰된다.
발현 구조물을 배양된 포유류세포로 전달하기 위한 비바이러스성 방법이 또한 본 발명에 의하여 고려된다. 이러한 것은 칼슘 인산 침전, DEAE-덱스트란, 전기천공, 직접 미세주입, DNA-로딩된 리포좀 및 리포펙타민-DNA 복합체, 세포 소니캐이션, 고속 유전자총을 사용한 유전자 봄바드먼트 (bombardment), 및 수용체-매개된 트랜스펙션을 포함한다.
일단 발현 구조물이 세포 내로 전달되면, 흥미로운 유전자를 코딩하는 핵산, 예를 들어, 우레아제 유전자는 다른 위치에 위치되고 발현될 수 있다. 어떠한 구체예에 있어서, 활성 작용제를 코딩하는 핵산은 안정하게 세포의 게놈 내로 통합될 수 있다. 이러한 통합은 상동성 재조합 (유전자 재배치)를 통하여 동일한 위치 및 방향으로 될 수 있거나, 그것은 무작위, 비-특이적 위치 (유전자 증가)로 통합되어질 수 있다. 더 나아간 구체예에 있어서, 핵산은 세포 내에서 분리된 DNA의 에피좀 단편으로 안정하게 유지될 수 있다. 그러한 핵산 단편 또는 "에피좀"은 숙주 세포 주기와 독립적으로 또는 동조하여 유지 및 복제되는데 충분한 크기의 서열을 코드한다. 발현 구조물의 전달을 위한 방법 및 세포에서의 위치, 여기에서 남아 있는 핵산은 적용된 발현 구조물으 형태에 의존한다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 발현 구조물은 간단하게 네이키드 (naked) 재조합 DNA 또는 플라스미드드로 구성될 수 있다. 구조물의 전달은 상기 언급한 어떠한 방법에 의하여 수행되며, 그것은 물리적으로 또는 화학적으로 세포막을 투과성이다. 이것은 특히 시험관 내에서 전달가능하지만, 그것은 또한 생체 내 사용에서도 적용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 네이키드 DNA 발현 구조물을 세포로 전달하는 것은 입자 봄바드먼트와 연관될 수 있다. 이 방법은 세포막에 구멍을 뚫어 세포로 들어오게 하는 고속으로 DNA-코딩된 유전자총을 가속하는 능력에 의존한다. 작은 입자를 가속하는 몇가지 장비가 이러한 고려에서 유용하다. 그러한 하나의 장비는 구동력을 제공하는 전류를 생성하기 위한 고압 방전에 의존한다. 사용된 유전자총은 텅스텐 또는 금 비드 (bead)와 같은 생물학적으로 비활성 물질로 구성될 수 있다.
하나의 구체예에 있어서, 그러한 발현 구조물은 리포좀, 지질 복합체, 나노캡슐, 또는 상기 섹션 II에서 설명된 1 또는 그 이상의 방법을 사용한 다른 제형에 포집된다. 또한 리포펙타민-DNA 복합체가 고려된다.
본 발명의 어떠한 구체예에 있어서, 리포좀은 헤마글루티네이팅 바이러스 (HVJ)와 복합체를 형성할 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 리포좀은 복합체화될 수 있고, 핵산 비-히스톤 염색체 단백질 (HMG-1)과 연결로 적용될 수 있다. 더 나아간 구체예에 있어서, 리포좀은 복합체화될 수 있고, HVJ 및 HMG-1과의 연결로 적용될 수 있다.
특별한 유전자를 코딩하는 핵산을 세포로 전달하기 위하여 적용될 수 있는 다른 발현 구조물은 수용체 매개된 전달 운반체이다. 이러한 것은 거의 모든 진핵 새포에서 수용체 매개된 엔도시토시스에 의한 거대분자의 선택적 유입에 이점을 가진다. 여러가지 수용체의 세포 형태 특이적 분포 때문에, 전달은 고도로 특이적이 될 수 있다.
수용체 매개된 유전자 표적 운반체는 일반적으로 2 구성요소로 구성된다: 세포 수용체 특이적 리간드 및 DNA 결합 작용제. 몇몇 리간드사 수용체 매개된 유전자 전달을 위하여 사용되었다: 예를 들어, 아시알로오로소무코이드 및 트랜스페린. 추가적으로, 표피 성장 인자 (EGF)가 비늘세포암 (squamous carcinoma) 세포로 유전자를 전달하기 위하여 또한 사용되어진다 (Eur. Pat. Appl. Publ. No. EP 0360257, 참고문헌에 의하여 본원에 수록).
다른 구체예에 있어서, 전달 운반체는 리간드 및 리포좀을 포함할 수 있다. 그러므로, 특별한 유전자를 코딩하는 핵산은 또한 폐, 상피 또는 종양 세포와 같은 세포 형태로 리포좀으로 또는 리포좀 없이 많은 수용체-리간드 시스템에 의하여 특이적으로 전달될 수 있다는 것이 가능하다. 예를 들어, EGF 또는 다른 작은 분자는 EGF 수용체의 업레귤레이션 (upregulation)을 나타내는 많은 종양 세포에서 유전자를 코딩하는 핵산의 매개된 전달을 위한 수용체로서 사용될 수 있다 (Basela, J. (2002) J Clin Oncol 20 (9): 2217- 9). 또한, CD5 (CLL), CD22 (임파종), CD25 (T-세포 백혈병) 및 MAA (흑색종)이 표적 부분으로서 유사하게 사용될 수 있다.
어떠한 구체예에 있어서, 유전자 전달은 생체 외 조건하에서 보다 쉽게 수행될 수 있다. 생체 외에서 유전자 치료는 동물로부터 세포의 분리, 시험관 내에서 세포 내로 핵산의 전달, 다음으로, 수식된 세포를 동물로 디돌리는 것을 나타낸다. 이것은 동물 또는 세포 및 조직의 초기 배양으로부터 조직/기관의 외과적 제거와 관련될 수 있다. 예를 들어, Ahonen, M. 등 (2002) Mol Ther 5 (6): 705-15 및 Kawai, K. 등 (2000) Mol Urol4 (2): 43-6; U. S. Patent Nos. 6,395,712, 6,149,904, 및 6,410,029을 참고하고, 각각은 참고 문헌에 의하여 본원에 수록된다.
초기 포유동물 세포 배양은 여러가지 방법으로 준비될 수 있다. 시험관 내에서 및 발현 구조물과의 접촉에서 세포가 살아 있게 유지되기 위하여, 세포는 전형적으로 정확한 비의 산소 및 이산화탄소 및 영양과 접촉이 유지되어야하고, 미생물성 오염으로부터 보호되어야한다. 세포 배양 기술은 당업자에게 공지된다.
유용한 포유동물 숙주 세포의 예는 베로 및 헬라 (HeLa) 세포 및 cell lines of 차이니즈 햄스터 난소 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7,293, HepG2, NIH3T3, RIN 및 MDCK 세포의 세포주이다. 추가적으로, 숙주 세포종은 삽입된 서열의 발현을 수식하거나 또는 원하는 방식으로 유전자 산물을 수식 및 프로세스하는 것으로 선택될 수 있다. 단백질 생성물의 그러한 수식 (예를 들어, 당화) 및 프로세싱 (예를 들어, 절단)은 단백질의 기능에 중요하다. 다른 숙주 세포는 단백질의 번역후 프로세싱 및 수식에 대한 특징적 및 특이적 메카니즘을 가진다. 적합한 세포주 또는 숙주 시스템은 발현된 외래 단백질의 정확한 수식 및 프로세싱을 보증하기 위하여 선택될 수 있다.
tk-, hgprt- 또는 aprt-세포에서 각각 HSV 티미딘 키나아제, 하이포산틴-구아닌 포스포리보실트랜스페라이제 및 아데닌 포스포리보실트랜스페라아제 유전자를 포함하지만 여기에 한정되는 것은 아닌 다양한 선별 시스템이 사용될 수 있다. 또한, 항-대사물 저항이 미코페놀산에 대한 저항성을 부여하는 gpt, 아미노글리코사이드 G418에 대한 저항성을 부여하는 neo, 및 히그로마이신에 대한 저항성을 부여하는 hygro에 대한 선별의 기초로서 사용될 수 있다.
앞서 설명한 것으로부터, 본 발명의 다양한 목적 및 특징이 보여질 수 있다.
Figure pat00002
도 1A - 1D는 우레아제 반응의 단계를 도식한다. 우레아는 우레아제에 의하여 분열되어 한 분자의 암모니아 및 한 분자의 카르바메이트를 생성한다 (A). 카르바메이트는 암모니아와 탄산으로 자발적으로 분해된다 (B). 탄산은 물에서 평형이되고 (C), 두 분자의 암모니아는 수소화되어 암모늄과 수산화 이온을 수득한다 (D). 본 반응은 반응 환경의 pH의 증가로 결과되어진다.
도 2는 본 발명의 하나의 구체예에 따라 제조된 우레아제를 함유한 크루드 (crude) 샘플의 질량분석법 프로파일 (mass spectrometry profile)을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 다른 구체예에 따라, 정제 과정의 여러 단계 동안 우레아제의 친화성 정제 프로파일 (affinity purification profile)을 도식한다.
도 4는 본 발명의 하나의 구체예에 따라 제조된 단백질-G에 의한 E-coil-αhEGFR IgG 콘주게이트의 정제를 도식한다.
도 5는 고정화된 K-coil ELISA에 의하여 결정된 것으로, 본 발명의 하나의 구체예에 따라 제조된 정제된 E-coil-αhEGFR IgG 콘주게이트의 항체 타이터 (titer)를 보여준다.
하기의 실시예는 여기서 설명된 본 발명을 더욱 예시하고 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아니다.
A. 실시예 1
A1. 펩티드 합성
펩티드는 종래의 N-t-부틸옥시카르보닐 (t-Boc) 화학을 사용하여 고상 합성 방법론에 의해 제조되었다. 펩티드는 1.5시간동안 4°C에서, 10% ANISOLE 및 2% 1, 2-에탄디티올을 함유하는 플루오르화수소(20 ML/G 수지)와 반응시킴으로써 수지로부터 분열되었다. 조 펩티드는 냉각 에테르로 세척하고, 수지로부터 빙 아세트산으로 추출되고 냉동건조되었다. 합성 펩티드는 역상 HPLC에 의해 2 ml/min의 유속에서 선형 AB 기울기 (0.2 내지 1.0% B/MIN의 범위)를 갖는 Zorbax 반-예비 C-8 칼럼 (250 x 10 MM L. D., 6.5-㎛ 입자 크기, 300-A 기공 크기)에서 정제되었고, 이때 용매 A는 수성 0.05% TRIFLUORO아세트산 (TFA)이고 용매 B는 아세토니트릴중의 0.05% TFA이다. 정제된 펩티드의 균질성은 분석 역상-HPLC, 아미노산 분석 및 MALDI 질량 분광법에 의해 확인되었다.
A2. 요소분해효소의 친화력 정제
친화력 칼럼은 히드록시우레아를 에폭시-활성화된 Sepharose 6B (Amersham Biosciences)에 반응시킴으로써 제조되었다. 남아있는 활성 기는 1 M 에탄올아민을 사용하여 차단되었다.
정제는 하기와 같이 수행되었다. 칼럼은 PEB (0.02 M 포스페이트, 1 mM EDTA, 1 mM-메르캅토에탄올, pH 7.0)으로 평형유지되었다. 조 요소분해효소 샘플(도 2)을 도포하였다(PEB중의 0.5 mg/ml, 총 8 ML). 칼럼을 15 ml 의 PB (0.02 M 포스페이트, 1 mM ß- 메르캅토에탄올, pH 7.0)으로 세척하였다. 칼럼은 그후 8 ml의 각각의 다음 : PB + 0.1 M NACI, PB + 0.5 M NaCI, 및 PB + 0.95 M NACI으로 세척하였다. 요소분해효소는 8 ml의 EB (0.2 M 포스페이트, 1 mM-메르캅토에탄올, pH 4.6)으로 용출시키고, 1 ML 분율을 수집한다. 분율은 280nm (도 3)에서 OD를 판독하고 HPLC (C5 칼럼) 분석에 의해서 체크되었다. 칼럼은 0.01 % NAN3 중에 저장되었다.
B. 실시예 2-요소분해효소-코일 접합체의 제조
요소분해효소 코일 접합체는 300 ul의 2mM 포스페이트 완충액 pH 7.2중에서 10 mg의 작두콩 요소분해효소를 용해함으로써 제조되었다. 그후 5 mg의 2기능 크로스-링커 SULFO-MBS를 용액에 첨가하고 혼합물을 천천히 1시간동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 그후 pH 7.2에서 2mM 포스페이트 완충액에 대해 투석하여 과잉의 링커를 제거하였다.
C-종말 cys 링커 (1.5 mg)와 함께 K-코일 또는 E-코일을 링커-변형된 요소분해효소 용액에 첨가하고 천천히 3시간동안 실온에서 혼합하였다. 코일 요소분해효소 접합체는 신선한 2mM 포스페이트 완충액에 대해서 pH 7.2에서 밤새 투석하여 접합되지 않은 코일 펩티드를 제거하였다. 투석된 요소분해효소 접합체를 동결건조시키고, 그후 1 mL의 2mM 포스페이트 완충액 pH 7.2에 용해시키고 더 정제하기 위해 세파덱스 G75 칼럼으로 적용하였다. 코일 요소분해효소 접합체를 함유한, 공극 부피 분율을 모으고, 냉동건조시키고 4°C에서 저장하였다.
접합체의 순도와 제제 중의 코일 대 요소분해효소의 비는 표준 과정을 사용하여, 아미노산 분석 및 MALDI 질량 분광법에 의해 결정되었다.
C. 실시예 3- 요소분해효소 및 요소분해효소 접합체의 활성도 분석
요소분해효소 또는 요소분해효소 접합체의 효소 활성도는 글루타메이트 디히드로게나아제 (GLDH)와 연결된 효소 반응에서 수행되었다. 산화된 NADH의 양은340 nm에서의 흡광도에서의 변화를 측정함으로써 결정되었다(Kaltwasser, H. and Schlegel, H. G., Anal. Biochem., 16,132, 1966). 사용된 시약은 :0.10 M 칼륨 포스페이트 완충액, pH 7.6 ; 포스페이트 완충액에서 제조된 1.80 M 우레아; 완충액중의 0.025 M 아데노신-5'-디포스페이트 (ADP) (10.7 MG/ML) ; 포스페이트 완충액중의 0.008 M NADH (5 mg/ml); 포스페이트 완충액중의 0.025 M α- 케토글루타레이트 (3.7 mg/ml); 암모늄 이온이 없는, 글루타메이트 디히드로게나아제 (GLDH) 용액, ; 분석 전에 제조된 50 U/MI 포스페이트 완충액이었다. 요소분해효소 용액은 포스페이트 완충액 중에서 용해함으로써 제조되었고, 0.1-0.5 U/ml의 농도를 산출하였다. 이 용액은 분석 하기 전에 신선하게 제조되었다.
분석은 큐벳에서 하기의 2.0 mL의 포스페이트 완충액 2.40 ML, 0.10 ml 각각의 우레아, ADP, NADH, GLDH 및 α-케토글루타레이트를 첨가함으로써 시작되었다. 스펙트로포토미터는 340 nm 및 25°C로 조절되었다. 첨가된 성분과 함께 큐벳을 25°C에서 5분동안 스펙트로포토미터에 놓고 온도 평형을 얻고 그후 블랭크율을 성립하고, 만일 있다면, 340 nm에서였다.
효소 반응을 개시하기 위해서 0.1 ml의 요소분해효소 용액을 큐벳에 첨가하였다. 340 nm에서 흡광도에서의 변화는 15분동안 기록되었다. 효소 활성도는 분당 340nm에서 흡광도에서의 감소와 상호관련이 있었다.
D. 실시예 4--코일 항체 접합체의 제조
재료는 : (1) 토끼 항-hEGFR IgG2a (Serotec), 200 UG/0. 2 ml (즉 1 mg/ml) ; (2) E-코일 (N-링커) ; (3) 나트륨 m-페리오데이트 (Pierce); 및 (4) 2기능 크로스링커, KMUH (Pierce)를 포함한다.
E-코일의 기능 변경은 다음의 단계를 수행함으로써 수행되었다:
a. DMSO 중에 KMUH를 용해시켜 10 mg/ml 용액 (250 ㎕의 DMSO중에 2.5 mg)을 제조하는 단계
b. PB 에 E-코일을 용해시키는 단계(392 ㎕의 10 MM PB중의 ~2 mg, PH 7. 4 + 4 ㎕의 TCEP, 100 mM 스톡)
c. 1 ㎕의 Tris (2 M)을 첨가하여 E-코일 용액을 중화하는 단계
d. E-코일 용액을 KMUH 용액에 첨가하여 실온에서 2 시간동안 배양하는 단계
e. 용액을 4°C에서 오버나이트로 유지하는 단계
f. 다음날 아침, 5분동안 12000 rpm에서 원심분리하여 불용성 침전물을 제거하는 단계.
g. C8 HPLC 칼럼 (0.05% TFA와 함께 0-20% 아세토니트릴/H20)위에서 KMUH 및 DMSO를 제거하고 모든 펩티드 분율 (75% 아세토니트릴)을 수집하는 단계.
g. 펩티드 분율을 동결건조하고 MS에 의해 체크하는 단계.
항체를 다음 단계에 의해 산화하였다:
a. 각각 2 mg의 항체에 대해, 호박색 유리병에서 20 mg의 페리오데이트를 무게를 재는 단계.
b. 2 ml의 PBS, pH 7.2 및 2 ml의 스톡 항체를 유리병 (최종 [항체]는 0.5 MG/ML)에 첨가하고 페리오데이트 분말이 용해될 때까지 부드럽게 소용돌이를 만드는 단계.
C. 실온에서 30분 동안 배양하는 단계
d. 100 mM 아세테이트 완충액, pH 5.5에 대해서 3회 투석함으로써 페리오데이트를 제거하는 단계.
접합을 하기 단계에 의해 수행하였다:
a. Millipore Ultrafree Filter 유니트 (30k MWc/o)를 사용하여 산화된 항체 (4 ml중의 ~2 mg)를 농축시키는 단계.
b. 75 μl의 기능화 E-코일 용액 (4 ㎍/㎕ ddH20)을 산화된 항체 용액 (아세테이트 완충액중의 ~0.75 mg의 항체를 함유, pH 5.5)의 절반에 첨가하는 단계.
c. 실온에서 2시간동안 교반하면서 배양하는 단계.
d. 단백질 G 칼럼 도 4 참조)을 사용하여 항체 혼합물을 정제하는 단계.
e. 샘플의 분석을 비교하는 단계(친화력 정제 전과 후).
E. 실시예 5--코일 요소분해효소 접합체 및 코일 항체 접합체의 Biacore 분 석
K-코일 펩티드 또는 E-코일 펩티드를 함유하는시스테인은 제조업자가 제안한 프로토콜에 따라서 Pioneer B1 바이오센서 칩에 공유 연결되었다. 간략하게는, 센서 칩의 덱스트란 표면은 먼저 HS/EDC (15 ul) 이어서 PDEA (20 UL)의 첨가로 활성화되었다. 10 mM 나트륨 아세테이트 완충액 pH 4.3중의 K-코일 (또는 E- 코일 (50 LIG/ML)을 주입하고 반응시켜 대략 200-400 RU의 표면 밀도를 제공하였다. 남아있는 활성화된 기는 그후 50 mM 시스테인, 1 M NACl, 0.1 M 포르메이트, pH 4.3 비활성화 용액을 주입(10 ul)함으로써 차단되었다.
Kinetic 실험을 25°C에서 BLACORE3000 장치에서 수행하였다. 운전된 각각의 바이오센서는 (1) 600s 샘플주입 상 (코일 요소분해효소 또는 코일 항체), (2) 600s 해리 상, 및 (3) 2x 15 재생 상 (6M 구아니딘 HCI)으로 구성되었다. 5 UL/MIN 의 유속을 싸이클 내내 유지하였다. PBS는 완충액으로서 사용되었다. The SPR 신호는 매 0.5 초에서 샘플링하면서 실시간으로 기록되었고 RU 대 시간 (센서그램)으로 플롯팅되었다. 얻어진 각각의 센서그램은 대응하는 샘플주입 싸이클을 블랭크 세포 표면위에서 뺌으로써, 벌크 굴절 지수 변화에 대해 교정되었다.
F. 실시예 6--동물 연구
인간 젖샘 샘암종 이종이식을 갖는 Athymic nu/nu 암컷 마우스를 테스트에 사용하였다. 선택된 동물은 일반적으로 5 내지 7 주령이었고, 처리 개시에서의 그들의 체중은 대략 15 내지 28 그램의 범위이다.
MCF-세포를 사용하여 이종이식을 발생시켰다. 세포를 페니실린/스트렙토마이신 5000U/ML, L-GLUTAMINE 200mM, 나트륨 피루베이트, 비필수 아미노산, 비타민, 및 10% FBS로 보충된 MEM 배지에서 성장시켰다. 세포 배양기는 5% C02, 37.5℃, 및 80% 습도로 유지하였다. 세포를 0.25% (w/v) 트립신-0.03% (w/v) EDTA 용액으로 수확하였다. 대략 100 uL 중의 1 X 106 세포를 각각의 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다.
종양 성장을 약 6-8일동안 진행시켜서 종양의 크기를 적어도 2-4 mm 직경에 도달하도록 하였다. 용량은 종양내부 주입을 통해 투여하였다. 각각의 동물에 대한 용량 부피는 50 ㎕이었다. 각각의 고체 종양은 주어진 용량의 테스트 물품으로 "패닝 형태"로 주입되었다.
종양 부피는 외부 캘리퍼스 측정에 의해 취해졌다. 체중은 실험의 시작과 희생시에 취해졌다.
*결과는, 아래 표 3에 나타낸 바와 같이, 종양은 처리 24시간 후에는 인지할 수 없었다는 것을 보여준다.
Figure pat00003
본 발명이 특정 구체예에 관하여 기술되었지만, 본 발명으로부터 벗어나지 않고 다양한 변화와 변형이 만들어질 수 있다는 것이 당업자들에게 분명할 것이다.
<110> Helix BioPharma Corporation <120> Method and Composition for Inhibiting Cancer Cell Growth <130> 08-898277WO <140> n/a <141> 2003-07-16 <150> US 60/397,244 <151> 2002-07-18 <160> 7 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E-coil forming peptide <400> 1 Glu Val Ser Ala Leu Glu Lys Glu Val Ser Ala Leu Glu Lys Glu Val 1 5 10 15 Ser Ala Leu Glu Lys Glu Val Ser Ala Leu Glu Lys Glu Val Ser Ala 20 25 30 Leu Glu Lys 35 <210> 2 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K-coil forming peptide <400> 2 Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val 1 5 10 15 Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val Ser Ala 20 25 30 Leu Lys Glu 35 <210> 3 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> coil forming peptide <400> 3 Glu Val Glu Ala Leu Gln Lys Glu Val Ser Ala Leu Glu Lys Glu Val 1 5 10 15 Ser Ala Leu Glu Cys Glu Val Ser Ala Leu Glu Lys Glu Val Glu Ala 20 25 30 Leu Gln Lys 35 <210> 4 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> coil forming peptide <400> 4 Lys Val Glu Ala Leu Lys Lys Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val 1 5 10 15 Ser Ala Leu Lys Cys Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val Glu Ala 20 25 30 Leu Lys Lys 35 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K-coil forming peptide <400> 5 Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E-coil forming peptide <400> 6 Glu Val Ser Ala Leu Glu Lys 1 5 <210> 7 <211> 840 <212> PRT <213> Canavalia ensiformis <400> 7 Met Lys Leu Ser Pro Arg Glu Val Glu Lys Leu Gly Leu His Asn Ala 1 5 10 15 Gly Tyr Leu Ala Gln Lys Arg Leu Ala Arg Gly Val Arg Leu Asn Tyr 20 25 30 Thr Glu Ala Val Ala Leu Ile Ala Ser Gln Ile Met Glu Tyr Ala Arg 35 40 45 Asp Gly Glu Lys Thr Val Ala Gln Leu Met Cys Leu Gly Gln His Leu 50 55 60 Leu Gly Arg Arg Gln Val Leu Pro Ala Val Pro His Leu Leu Asn Ala 65 70 75 80 Val Gln Val Glu Ala Thr Phe Pro Asp Gly Thr Lys Leu Val Thr Val 85 90 95 His Asp Pro Ile Ser Arg Glu Asn Gly Glu Leu Gln Glu Ala Leu Phe 100 105 110 Gly Ser Leu Leu Pro Val Pro Ser Leu Asp Lys Phe Ala Glu Thr Lys 115 120 125 Glu Asp Asn Arg Ile Pro Gly Glu Ile Leu Cys Glu Asp Glu Cys Leu 130 135 140 Thr Leu Asn Ile Gly Arg Lys Ala Val Ile Leu Lys Val Thr Ser Lys 145 150 155 160 Gly Asp Arg Pro Ile Gln Val Gly Ser His Tyr His Phe Ile Glu Val 165 170 175 Asn Pro Tyr Leu Thr Phe Asp Arg Arg Lys Ala Tyr Gly Met Arg Leu 180 185 190 Asn Ile Ala Ala Gly Thr Ala Val Arg Phe Glu Pro Gly Asp Cys Lys 195 200 205 Ser Val Thr Leu Val Ser Ile Glu Gly Asn Lys Val Ile Arg Gly Gly 210 215 220 Asn Ala Ile Ala Asp Gly Pro Val Asn Glu Thr Asn Leu Glu Ala Ala 225 230 235 240 Met His Ala Val Arg Ser Lys Gly Phe Gly His Glu Glu Glu Lys Asp 245 250 255 Ala Ser Glu Gly Phe Thr Lys Glu Asp Pro Asn Cys Pro Phe Asn Thr 260 265 270 Phe Ile His Arg Lys Glu Tyr Ala Asn Lys Tyr Gly Pro Thr Thr Gly 275 280 285 Asp Lys Ile Arg Leu Gly Asp Thr Asn Leu Leu Ala Glu Ile Glu Lys 290 295 300 Asp Tyr Ala Leu Tyr Gly Asp Glu Cys Val Phe Gly Gly Gly Lys Val 305 310 315 320 Ile Arg Asp Gly Met Gly Gln Ser Cys Gly His Pro Pro Ala Ile Ser 325 330 335 Leu Asp Thr Val Ile Thr Asn Ala Val Ile Ile Asp Tyr Thr Gly Ile 340 345 350 Ile Lys Ala Asp Ile Gly Ile Lys Asp Gly Leu Ile Ala Ser Ile Gly 355 360 365 Lys Ala Gly Asn Pro Asp Ile Met Asn Gly Val Phe Ser Asn Met Ile 370 375 380 Ile Gly Ala Asn Thr Glu Val Ile Ala Gly Glu Gly Leu Ile Val Thr 385 390 395 400 Ala Gly Ala Ile Asp Cys His Val His Tyr Ile Cys Pro Gln Leu Val 405 410 415 Tyr Glu Ala Ile Ser Ser Gly Ile Thr Thr Leu Val Gly Gly Gly Thr 420 425 430 Gly Pro Ala Ala Gly Thr Arg Ala Thr Thr Cys Thr Pro Ser Pro Thr 435 440 445 Gln Met Arg Leu Met Leu Gln Ser Thr Asp Asp Leu Pro Leu Asn Phe 450 455 460 Gly Phe Thr Gly Lys Gly Ser Ser Ser Lys Pro Asp Glu Leu His Glu 465 470 475 480 Ile Ile Lys Ala Gly Ala Met Gly Leu Lys Leu His Glu Asp Trp Gly 485 490 495 Ser Thr Pro Ala Ala Ile Asp Asn Cys Leu Thr Ile Ala Glu His His 500 505 510 Asp Ile Gln Ile Asn Ile His Thr Asp Thr Leu Asn Glu Ala Gly Phe 515 520 525 Val Glu His Ser Ile Ala Ala Phe Lys Gly Arg Thr Ile His Thr Tyr 530 535 540 His Ser Glu Gly Ala Gly Gly Gly His Ala Pro Asp Ile Ile Lys Val 545 550 555 560 Cys Gly Ile Lys Asn Val Leu Pro Ser Ser Thr Asn Pro Thr Arg Pro 565 570 575 Leu Thr Ser Asn Thr Ile Asp Glu His Leu Asp Met Leu Met Val Cys 580 585 590 His His Leu Asp Arg Glu Ile Pro Glu Asp Leu Ala Phe Ala His Ser 595 600 605 Arg Ile Arg Lys Lys Thr Ile Ala Ala Glu Asp Val Leu Asn Asp Ile 610 615 620 Gly Ala Ile Ser Ile Ile Ser Ser Asp Ser Gln Ala Met Gly Arg Val 625 630 635 640 Gly Glu Val Ile Ser Arg Thr Trp Gln Thr Ala Asp Lys Met Lys Ala 645 650 655 Gln Thr Gly Pro Leu Lys Cys Asp Ser Ser Asp Asn Asp Asn Phe Arg 660 665 670 Ile Arg Arg Tyr Ile Ala Lys Tyr Thr Ile Asn Pro Ala Ile Ala Asn 675 680 685 Gly Phe Ser Gln Tyr Val Gly Ser Val Glu Val Gly Lys Leu Ala Asp 690 695 700 Leu Val Met Trp Lys Pro Ser Phe Phe Gly Thr Lys Pro Glu Met Val 705 710 715 720 Ile Lys Gly Gly Met Val Ala Trp Ala Asp Ile Gly Asp Pro Asn Ala 725 730 735 Ser Ile Pro Thr Pro Glu Pro Val Lys Met Arg Pro Met Tyr Gly Thr 740 745 750 Leu Gly Lys Ala Gly Gly Ala Leu Ser Ile Ala Phe Val Ser Lys Ala 755 760 765 Ala Leu Asp Gln Arg Val Asn Val Leu Tyr Gly Leu Asn Lys Arg Val 770 775 780 Glu Ala Val Ser Asn Val Arg Lys Leu Thr Lys Leu Asp Met Lys Leu 785 790 795 800 Asn Asp Ala Leu Pro Glu Ile Thr Val Asp Pro Glu Ser Tyr Thr Val 805 810 815 Lys Ala Asp Gly Lys Leu Leu Cys Val Ser Glu Ala Thr Thr Val Pro 820 825 830 Leu Ser Arg Asn Tyr Phe Leu Phe 835 840

Claims (7)

  1. 우레아제 효소;
    상기 우레아제 효소에 콘쥬게이트되어 있고, 항-종양 항원의 항체, 항-hCG (Human Chorionic Gonadotropin)항체 및 암세포 표면 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드로 구성되는 군으로부터 선택되며, 조성물이 개체에 투여될 때 효소를 암세포로 전달하는 것을 향상시키는데 효과적인 것인 표적 부분; 및
    약학적 캐리어를
    포함하는 암을 치료하기 위한 약학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 표적 부분과 우레아제 효소의 융합 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 우레아제는 식물 또는 박테리아의 우레아제인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 고형암에서의 높은 세포내/낮은 세포외 pH 구배에 의해서 효능이 감소되는 약염기성 항-종양 화합물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 항-종양 화합물은 독소루비신, 다우노루비신, 미토산트론, 에피루비신, 미토마이신, 블레오마이신, 빈블라스틴 또는 빈크라스틴의 빈카 알카로이드, 시클로포스파미드 또는 메클로레타민 염산의 알킬화제, 및 항신생물성 퓨린 및 피리미딘으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 고형암에서의 높은 세포내/낮은 세포외 pH 구배에 의해서 효능이 감소되는 약염기성 항-종양 화합물로 치료 중인 포유 동물 개체에서 고형암을 치료하기 위한 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 항-종양 화합물은 독소루비신, 다우노루비신, 미토산트론, 에피루비신, 미토마이신, 블레오마이신, 빈블라스틴 또는 빈크라스틴의 빈카 알카로이드, 시클로포스파미드 또는 메클로레타민 염산의 알킬화제, 및 항신생물성 퓨린 및 피리미딘으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
KR1020117022947A 2002-07-18 2003-07-16 암세포 성장의 저해를 위한 우레아제의 사용 KR101352826B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US39724402P 2002-07-18 2002-07-18
US60/397,244 2002-07-18
PCT/CA2003/001061 WO2004009112A1 (en) 2002-07-18 2003-07-16 Use of urease for inhibiting cancer cell growth

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020057000961A Division KR20050038005A (ko) 2002-07-18 2003-07-16 암세포 성장의 저해를 위한 우레아제의 사용

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20110123786A true KR20110123786A (ko) 2011-11-15
KR101352826B1 KR101352826B1 (ko) 2014-01-17

Family

ID=30771022

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020057000961A KR20050038005A (ko) 2002-07-18 2003-07-16 암세포 성장의 저해를 위한 우레아제의 사용
KR1020117022947A KR101352826B1 (ko) 2002-07-18 2003-07-16 암세포 성장의 저해를 위한 우레아제의 사용

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020057000961A KR20050038005A (ko) 2002-07-18 2003-07-16 암세포 성장의 저해를 위한 우레아제의 사용

Country Status (23)

Country Link
US (1) US7211250B2 (ko)
EP (2) EP2324846B1 (ko)
JP (4) JP2006501196A (ko)
KR (2) KR20050038005A (ko)
CN (1) CN100577203C (ko)
AU (1) AU2003250658B2 (ko)
BR (1) BR0312664A (ko)
CA (1) CA2492472C (ko)
DK (1) DK1530482T3 (ko)
ES (1) ES2443416T3 (ko)
HK (2) HK1076739A1 (ko)
IL (1) IL166249A (ko)
MX (1) MXPA05000778A (ko)
NO (1) NO336811B1 (ko)
NZ (1) NZ538284A (ko)
PL (1) PL217626B1 (ko)
PT (1) PT1530482E (ko)
RU (1) RU2326691C2 (ko)
SI (1) SI1530482T1 (ko)
TR (1) TR200500108T2 (ko)
UA (1) UA81634C2 (ko)
WO (1) WO2004009112A1 (ko)
ZA (1) ZA200500423B (ko)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7264800B2 (en) * 2002-07-18 2007-09-04 Helix Biopharma Corporation Method and composition for inhibiting cancer cell growth
WO2004023981A2 (en) * 2002-09-11 2004-03-25 Duke University Methods and compositions for blood pool identification, drug distribution quantification and drug release verification
US7769423B2 (en) * 2002-09-11 2010-08-03 Duke University MRI imageable liposomes for the evaluation of treatment efficacy, thermal distribution, and demonstration of dose painting
US20070104732A1 (en) * 2003-10-24 2007-05-10 Bernard Massie Ligand-pseudoreceptor system for generation of adenoviral vectors with altered tropism
IL182956A0 (en) * 2007-05-03 2008-01-20 Yeda Res & Dev Glycan modified soluble receptors and binding proteins and their use
US8892184B2 (en) 2010-10-18 2014-11-18 Siemens Medical Solutions Usa, Inc. Systems and methods for reducing interference in a dual modality imaging system
EP2984170A4 (en) * 2013-04-08 2016-11-30 Helix Biopharma Corp USE OF ANTIBODY UREASE CONJUGATES FOR DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC PURPOSES
KR102318994B1 (ko) * 2015-01-23 2021-10-29 헬릭스 바이오파마 코포레이션 치료학적 목적을 위한 항체-우레아제 접합체
CN110022891A (zh) 2016-09-24 2019-07-16 赫利克斯生物药品公司 恢复肿瘤酸化t细胞的功能
CN110382551A (zh) * 2017-01-05 2019-10-25 赫利克斯生物药品公司 抗vegfr-2脲酶缀合物
WO2021235436A1 (ja) * 2020-05-20 2021-11-25 株式会社メドレックス アポモルヒネ含有経皮吸収型製剤
MX2022015897A (es) * 2020-06-15 2023-01-24 Kortuc Inc Sensibilizador para el tratamiento del cancer.
CN113433087A (zh) * 2021-06-22 2021-09-24 中南大学 一种尿素浓度快速检测方法及检测传感器和应用

Family Cites Families (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4329332A (en) 1978-07-19 1982-05-11 Patrick Couvreur Biodegradable submicroscopic particles containing a biologically active substance and compositions containing them
US4489055A (en) 1978-07-19 1984-12-18 N.V. Sopar S.A. Process for preparing biodegradable submicroscopic particles containing a biologically active substance and their use
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
FR2504010B1 (fr) 1981-04-15 1985-10-25 Sanofi Sa Medicaments anticancereux contenant la chaine a de la ricine associee a un anticorps antimelanome et procede pour leur preparation
FR2504408B1 (fr) 1981-04-24 1986-02-14 Couvreur Patrick Procede de preparation de particules submicroscopiques, particules ainsi obtenues et compositions pharmaceutiques les contenant
US4671958A (en) 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
EP0092227B1 (en) 1982-04-19 1988-07-27 Nissan Motor Co., Ltd. Method for controlling reduction ratio of continuously variable transmission with acceleration compensation
US4824783A (en) 1983-12-20 1989-04-25 Enichem S.P.A. Oxidized sulfur derivatives of diaminophosphinyl compounds as urease inhibitors
US4545985A (en) 1984-01-26 1985-10-08 The United States Of America As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Pseudomonas exotoxin conjugate immunotoxins
US4894443A (en) 1984-02-08 1990-01-16 Cetus Corporation Toxin conjugates
US4625014A (en) 1984-07-10 1986-11-25 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Cell-delivery agent
US4542225A (en) 1984-08-29 1985-09-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Acid-cleavable compound
US4659839A (en) 1984-10-10 1987-04-21 Mallinckrodt, Inc. Coupling agents for radiolabeled antibody fragments
ATE66469T1 (de) 1985-01-14 1991-09-15 Neorx Corp Metall-radionuklid markiertes protein fuer diagnose und therapie.
US4837380A (en) * 1985-09-30 1989-06-06 Regents Of University Of California Liposome-calcitonin preparation
US4699784A (en) 1986-02-25 1987-10-13 Center For Molecular Medicine & Immunology Tumoricidal methotrexate-antibody conjugate
US4680333A (en) 1986-04-14 1987-07-14 National Starch And Chemical Corporation Removable hot melt pressure sensitive adhesive
US4867962A (en) 1988-02-26 1989-09-19 Neorx Corporation Functionally specific antibodies
CA1340323C (en) 1988-09-20 1999-01-19 Arnold E. Hampel Rna catalyst for cleaving specific rna sequences
FR2637612B1 (fr) 1988-10-06 1993-09-10 Pasteur Institut Sequences de nucleotides codant pour une proteine a activite ureasique
EP0460607A3 (en) * 1990-06-05 1992-04-01 Bristol-Myers Squibb Company Novel monoclonal antibody to novel antigen associated with human tumors
US5298399A (en) 1990-08-10 1994-03-29 Sapporo Breweries Limited Gene and process for producing a thermostable urease
US5140100A (en) 1990-12-28 1992-08-18 Cedars-Sinai Medical Center Protein that inhibits production of human choriogonadotropin
FR2683159B1 (fr) 1991-10-31 1994-02-25 Coletica Procede de fabrication de nanocapsules a paroi a base de proteines reticulees; nanocapsules ainsi obtenues et compositions cosmetiques, pharmaceutiques et alimentaires en comportant application.
US5573934A (en) * 1992-04-20 1996-11-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Gels for encapsulation of biological materials
AU3940293A (en) * 1992-04-03 1993-11-08 Alexander T. YOUNG Gene therapy using targeted viral vectors
US5976535A (en) 1992-06-09 1999-11-02 Neorx Corporation Pretargeting protocols for the enhanced localization of cytotoxins to target sites and cytotoxic combinations useful therefore
US6358490B2 (en) 1992-06-09 2002-03-19 Neorx Corporation Three-step pretargeting methods and compounds
US6290962B1 (en) * 1992-11-03 2001-09-18 Oravax, Inc. Urease-based vaccine and treatment for helicobacter infection
GB9300875D0 (en) 1993-01-18 1993-03-10 Ucb Sa Nanocapsule containing pharmaceutical compositions
CA2151742C (en) 1993-02-22 1999-05-25 Alfred A. Amkraut Compositions for oral delivery of active agents
JPH08509873A (ja) * 1993-05-19 1996-10-22 アンスティテュ・パストゥール ヘリコバクター感染に対する免疫組成物、該組成物に用いられるポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードする核酸配列
WO1995031480A1 (en) * 1994-05-18 1995-11-23 S.P.I. Synthetic Peptides Incorporated Heterodimer polypeptide immunogen carrier composition and method
GB9417873D0 (en) 1994-09-06 1994-10-26 Sandoz Ltd Organic compounds
US6172045B1 (en) 1994-12-07 2001-01-09 Neorx Corporation Cluster clearing agents
US5886143A (en) 1994-12-07 1999-03-23 Neorx Corporation Hepatic-directed compounds and reagents for preparation thereof
FR2732605B1 (fr) * 1995-04-07 1997-05-16 Pasteur Merieux Serums Vacc Composition destinee a l'induction d'une reponse immunitaire mucosale
JPH11511979A (ja) * 1995-09-06 1999-10-19 ババリアン・ノルディック・リサーチ・インスティテュート・アクティーゼルスカブ ヒト乳癌細胞を含むヒト乳腺細胞を標的として、連結された異種性遺伝子を発現させるためのｗａｐまたはｍｍｔｖ制御配列の使用
US6149904A (en) 1996-01-31 2000-11-21 The Regents Of The University Of California Method for inhibiting tumor cell growth by administering to tumor cells expressing a nucleic acid encoding a connexin and a pro-drug
CA2250222A1 (en) 1996-03-20 1997-09-25 Mien-Chie Hung Sensitization of her-2/neu overexpressing cancer cells to chemotherapy
JPH1017492A (ja) * 1996-07-02 1998-01-20 Fuji Yakuhin Kogyo Kk 腫瘍細胞増殖抑制剤
US5958892A (en) 1996-07-30 1999-09-28 Board Of Regents, The University Of Texas System 2-methoxyestradiol-induced apoptosis in cancer cells
US5750496A (en) * 1996-08-12 1998-05-12 Utah State University Method of controlling cryptosporidium infectons using protease inhibitors
EP0824019B1 (en) * 1996-08-13 2002-11-20 Quest International B.V. Inhibition or reduction of oral malodour
EP0932390A1 (en) 1996-10-11 1999-08-04 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic liposome composition and method
US6261537B1 (en) 1996-10-28 2001-07-17 Nycomed Imaging As Diagnostic/therapeutic agents having microbubbles coupled to one or more vectors
CN1181422A (zh) * 1996-10-31 1998-05-13 上海市肿瘤研究所 与生长因子受体结合的多肽所构建的基因转移载体
US6180114B1 (en) 1996-11-21 2001-01-30 University Of Washington Therapeutic delivery using compounds self-assembled into high axial ratio microstructures
US6045774A (en) 1997-01-10 2000-04-04 Epicyte Pharmaceutical Inc. J chain polypeptide targeting molecule linked to an imaging agent
GB9703633D0 (en) 1997-02-21 1997-04-09 Imp Cancer Res Tech Cancer therapy
US6190923B1 (en) 1997-09-05 2001-02-20 David K. Johnson Diethylenetriamine-N,N′,N″-triacetic acid derivatives
FR2772025B1 (fr) 1997-12-10 2000-03-03 Guerbet Sa Chelates metalliques de macrocycles polyaminocarboxyliques et leur application a l'imagerie par resonance magnetique
US6426086B1 (en) * 1998-02-03 2002-07-30 The Regents Of The University Of California pH-sensitive, serum-stable liposomes
EP1122262B1 (en) * 1998-10-16 2009-12-30 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Neovascular-specific peptides
FR2790405B1 (fr) 1999-03-02 2001-04-20 Oreal Nanocapsules a base de polymeres dendritiques
US6300141B1 (en) 1999-03-02 2001-10-09 Helix Biopharma Corporation Card-based biosensor device
US6159443A (en) 1999-04-29 2000-12-12 Vanderbilt University X-ray guided drug delivery
CH694589A5 (de) 1999-06-25 2005-04-15 Genentech Inc Humanisierte Anti-ErbB2-Antikörper und Behandlung mit Anti-ErbB2-Antikörpern.
US6307372B1 (en) 1999-11-02 2001-10-23 Glaxo Wellcome, Inc. Methods for high throughput chemical screening using magnetic resonance imaging
WO2001037721A2 (en) 1999-11-22 2001-05-31 The Research Foundation Of State University Of New York Magnetic nanoparticles for selective therapy
US20020041898A1 (en) 2000-01-05 2002-04-11 Unger Evan C. Novel targeted delivery systems for bioactive agents
WO2002015925A1 (fr) * 2000-08-22 2002-02-28 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Technique de regulation de l'apoptose et polypeptide de regulation d'apoptose
US7148038B2 (en) * 2001-10-16 2006-12-12 Raven Biotechnologies, Inc. Antibodies that bind to cancer-associated antigen CD46 and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
EP2324846B1 (en) 2014-11-12
AU2003250658A1 (en) 2004-02-09
US7211250B2 (en) 2007-05-01
KR20050038005A (ko) 2005-04-25
EP2324846A1 (en) 2011-05-25
HK1158103A1 (en) 2012-07-13
IL166249A (en) 2011-10-31
NZ538284A (en) 2008-04-30
JP2011207913A (ja) 2011-10-20
BR0312664A (pt) 2005-05-03
EP1530482B9 (en) 2014-04-16
CA2492472A1 (en) 2004-01-29
EP1530482B1 (en) 2013-10-23
WO2004009112A8 (en) 2005-09-15
SI1530482T1 (sl) 2014-03-31
RU2326691C2 (ru) 2008-06-20
PL374675A1 (en) 2005-10-31
ES2443416T3 (es) 2014-02-19
RU2005104113A (ru) 2005-09-10
NO336811B1 (no) 2015-11-02
PL217626B1 (pl) 2014-08-29
IL166249A0 (en) 2006-01-15
TR200500108T2 (tr) 2005-04-21
NO20050793L (no) 2005-04-18
JP2006501196A (ja) 2006-01-12
MXPA05000778A (es) 2005-08-29
PT1530482E (pt) 2014-01-15
EP1530482A1 (en) 2005-05-18
HK1076739A1 (en) 2006-01-27
KR101352826B1 (ko) 2014-01-17
DK1530482T3 (da) 2014-01-20
JP2013213055A (ja) 2013-10-17
JP5850561B2 (ja) 2016-02-03
JP2016014066A (ja) 2016-01-28
WO2004009112A1 (en) 2004-01-29
ZA200500423B (en) 2006-08-30
CN100577203C (zh) 2010-01-06
US20040115186A1 (en) 2004-06-17
AU2003250658B2 (en) 2009-07-16
CA2492472C (en) 2014-01-07
UA81634C2 (ru) 2008-01-25
CN1681528A (zh) 2005-10-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5850561B2 (ja) 癌細胞増殖を阻害するためのウレアーゼの使用
US20210177929A1 (en) New stable antibody-drug conjugate, preparation method therefor, and use thereof
Ding et al. HER2-positive breast cancer targeting and treatment by a peptide-conjugated mini nanodrug
US20230416761A1 (en) Targeted Protease Compositions and Uses Related Thereto
JP6876618B2 (ja) 治療目的のための抗体−ウレアーゼコンジュゲート
US20150231077A1 (en) Amine passivated nanoparticles for cancer treatment and imaging
JP2002322093A (ja) 化合物
US8202544B2 (en) High capacity non-viral vectors
Fan et al. Bioengineered ferritin nanoprobes for cancer theranostics
US7264800B2 (en) Method and composition for inhibiting cancer cell growth
Shipunova et al. Two-Step Targeted Drug Delivery via Proteinaceous Barnase-Barstar Interface and PLGA-Based Nano-Carrier
CA2493282A1 (en) Method and composition for inhibiting cancer cell growth using urease and weakly basic anti-cancer compounds
WO2024083921A1 (en) Anti-gpc1 monoclonal antibody, therapeutic and diagnostic uses thereof
CN116217664A (zh) 靶向mHSP90的多肽、分子探针及应用
US20170354744A1 (en) Method of synthesizing of antibody conjugates using affinity resins

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
J201 Request for trial against refusal decision
E902 Notification of reason for refusal
B701 Decision to grant
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20161223

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190110

Year of fee payment: 6