CN110382551A - 抗vegfr-2脲酶缀合物 - Google Patents

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Abstract

提供了具有治疗效用的抗体‑脲酶缀合物。更具体地，本文描述了用于治疗实体瘤的抗VEGFR‑2抗体‑脲酶缀合物。描述了包含与脲酶部分缀合的抗VEGFR‑2抗体部分的缀合物。还描述了用于治疗VEGFR‑2依赖性肿瘤的组合物和方法，其掺入本文描述的抗体‑脲酶缀合物。

Description

抗VEGFR-2脲酶缀合物
发明领域
本发明涉及具有治疗效用的抗体-脲酶缀合物。更具体地，本文描述了用于治疗实体瘤的抗VEGFR-2脲酶缀合物。
发明背景
血管生成是侵袭性肿瘤生长和转移所必需的，并且构成控制癌症进展的要点。肿瘤血管生成由肿瘤分泌的血管生成生长因子介导，所述生长因子与其在内皮细胞上表达的表面受体相互作用。由于缺乏血液供应，无血管肿瘤的生长潜力受到严重限制。“血管生成开关”允许肿瘤通过扰乱促血管生成和抗血管生成因子的局部平衡而血管化并在大小和转移潜能方面发展。通常，肿瘤过表达促血管生成因子，如血管内皮生长因子，从而允许它们形成这种血管生成开关。
血管内皮生长因子VEGF是内皮细胞特异性有丝分裂原。在生长因子中，它的不同之处在于它通过特异性促进内皮细胞的增殖而起到血管生成诱导剂的作用。VEGF的生物学反应是通过其高亲和力受体介导的，所述受体在胚胎发生期间和肿瘤形成期间在内皮细胞上选择性表达。血管内皮生长因子通过与许多受体结合来调节血管发育、血管生成和淋巴管生成。VEGFR-1是造血干细胞的募集以及单核细胞和巨噬细胞的迁移所必需的，VEGFR-2调节血管内皮功能，VEGFR-3调节淋巴管内皮细胞功能。
除血管生成之外，实体瘤在肿瘤细胞代谢增加所产生的酸性环境中存活。增加的酸度可以降低几种不同类型的免疫细胞的功能，导致改善的肿瘤存活。此外，肿瘤通过表达阻断免疫细胞功能的蛋白质来避免免疫系统的检测。中和酸性环境通过重新激活然后能够靶向肿瘤的T细胞来影响肿瘤生长。
申请人先前已开发出脲酶缀合物，例如，WO2004/009112公开了使用脲酶来降低肿瘤微环境中的pH以抑制癌细胞的生长；WO2014/165985公开了稳定脲酶的抗体-脲酶缀合物；以及WO2016/116907公开了使用抗体-脲酶缀合物，特别是CEACAM6-脲酶缀合物来治疗表达CEACAM6的肿瘤。
需要治疗或预防癌症的组合物和方法，其靶向/解决不同的抗原和/或肿瘤生长的多个方面。
发明概述
本文描述的是对VEGFR-2特异的抗体，其与脲酶缀合，在本文被称为抗VEGFR-2脲酶缀合物，包含此类缀合物的组合物和使用所述缀合物治疗表达VEGFR-2的肿瘤(在多方面中为实体瘤)的方法。以这种方式，靶向VEGFR-2的结合可以通过仅增加表达VEGFR-2的肿瘤微环境的pH而导致肿瘤完整性彻底去稳定化。
在多方面中提供的抗VEGFR-2脲酶缀合物为分离的/纯化的。
根据本发明的一方面为抗VEGFR-2脲酶缀合物。
根据本发明的另一方面为单结构域抗VEGFR-2脲酶缀合物。
根据本发明的另一方面为对VEGFR-2特异的sdAb与脲酶缀合的组合，所述抗体可以包含SEQ ID NO:2-30中的一个或多个，此种可以在组合物中提供用于治疗表达VEGFR-2的实体瘤。
在本发明的多方面中，抗体为对VEGFR-2特异的单结构域抗体。本发明的抗VEGFR-2缀合物可以配制成用于治疗实体瘤的组合物，其中单结构域抗体能结合VEGFR-2以抑制活化，从而减少肿瘤的血管生成，同时脲酶增加肿瘤微环境的pH。总之，缀合物导致肿瘤生长的降低和/或进一步肿瘤生长的预防。
根据本发明的一方面为组合物，其包含在适合于向需要的哺乳动物施用的药学可接受的载体中的治疗有效量的抗VEGFR-2脲酶缀合物。所述组合物可用于实体瘤的治疗，肿瘤生长的消退和/或肿瘤生长的预防。
在多方面中为冻干的抗VEGFR-2脲酶缀合物组合物。
在多方面中为复水的抗VEGFR-2脲酶缀合物组合物。
在上述两个方面中，组合物包含对VEGFR-2特异的单结构域抗体。在多方面中，这些抗体选自SEQ ID NO:2-30。在多方面中，抗体的组合。
在一些方面，所述抗体为人源化抗体或非人抗体。在一些方面，所述抗体的分子量为约5kDa至约200kDa。在一些方面，所述抗体的分子量为约5kDa至约50kDa。在一些方面，所述抗体为单结构域抗体。在一些方面，所述单结构域抗体具有多达约160个氨基酸残基、多达约150个氨基酸残基、多达约140个氨基酸残基、多达约130个氨基酸残基、多达约120个氨基酸残基、不超过110个氨基酸残基、或约90至130个氨基酸残基的大小。在一些方面，所述单结构域抗体的分子量为约10kDa至约50kDa。在一些方面，所述单结构域抗体的分子量为约12kDa至约15kDa。在多方面中，所述抗体对肿瘤/肿瘤细胞上的VEGFR-2具有特异性。
在多方面中，抗体对VEGFR-2的结合亲和力高达约1x 10-6M或高达约1x 10-8M。在一些方面，缀合物对VEGFR-2具有结合亲和力，其中Kd值不超过约1x 10-10M。在一些方面，缀合物对VEGFR-2具有结合亲和力，其中IC50值不超过约5nM。在一些方面，IC50值为约3nM至约5nM。在一些方面，缀合物以约10μg/mL至约30μg/mL的IC50值结合VEGFR-2。
在非限制性实例中，用于制备VEGFGR-2特异性脲酶缀合物的单结构域抗体或其片段可以包含能结合VEGFR-2的SEQ ID NO:2-30的序列中的任一个，或者与其至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％相同的序列，或者与其基本上相同的序列。
适合于本发明的单结构域抗体的接头序列可以选自SEQ ID NO:54-65。在多方面中，接头序列还可以包含C-末端半胱氨酸，例如如SEQ ID NO:66-69中。本文可以使用与这些接头序列相似的序列。
在多方面中，编码用于与脲酶缀合的新型sdAb的核酸序列包含SEQ ID NO:31-53中任一个的序列，或者与其至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％相同的序列，或者与其基本上相同的序列。
在一些方面，脲酶为刀豆脲酶。刀豆脲酶具有SEQ ID NO:78的氨基酸序列。
在一些方面，抗VEGFR-2脲酶缀合物的缀合比可以为每脲酶部分2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个抗体部分。在一些方面，缀合物的缀合比为每脲酶部分约6或更多个抗体部分。在一些方面，缀合物的缀合比为每脲酶部分6、7、8、9、10、11或12个抗体部分。在一些方面，缀合物的缀合比为每脲酶部分8、9、10、11或12个抗体部分。在一些方面，缀合物的平均缀合比为每脲酶部分约6或更多个抗体部分。在一些方面，缀合物的平均缀合比为每脲酶部分约9个抗体部分，约9.1、约9.2、约9.3、约9.4等。在一些方面，脲酶为刀豆脲酶。
本技术提供了治疗有需要的对象中的癌症的方法，其包括向对象施用治疗有效量的本文提供的抗VEGFR-2脲酶缀合物组合物，从而治疗对象中的癌症。
在一些方面，对象为人。
本技术提供了制备包含抗VEGFR-2脲酶缀合物的组合物的方法，所述方法包括将活化的抗体和脲酶在pH为约6.0-7.0，如约6.5的水性缓冲液中组合，将pH调节至8.0-9.0，如约8.3以形成抗体-脲酶缀合物，以及纯化抗体-脲酶缀合物，其中所述方法不包括色谱纯化步骤，如常用的用于蛋白质纯化的色谱方法，包括尺寸排阻色谱(SEC)、离子交换色谱、亲和色谱、固定化金属亲和色谱、免疫亲和色谱、液固吸附色谱、疏水相互作用色谱(HIC)、反相色谱(RPC)和高效液相色谱(HPLC)等。在一些方面，通过超渗滤纯化抗体-脲酶缀合物。
在多方面中，抗VEGFR-2脲酶缀合物的缀合比为每脲酶部分约2至9.2个抗体部分。在一些方面，pH为约6.5的缓冲液是乙酸钠缓冲液。在一些方面，通过包括添加硼酸钠溶液的方法将pH调节至约8.3。
在其它方面，抗体在约室温下用交联剂活化，并超渗滤或进行阳离子交换色谱。然后通过在约室温下在约pH 7.1下与脲酶反应足够长的时间，如约2小时，将活化的抗体与脲酶缀合。通过超渗滤除去未反应的抗体，然后将缓冲液更换为制剂缓冲液，最后冻干。冻干的缀合抗体是冻干的抗VEGFR-2脲酶缀合物，其适合于复水用作治疗表达VEGFR-2的实体瘤的治疗组合物。
本技术提供了对表达VEGFR-2的肿瘤的抗体结合亲和力，其中缀合的抗VEGFR-2-脲酶分子形成抗VEGFR-2-脲酶缀合物，其中缀合物对肿瘤具有基本上有效治疗肿瘤的结合亲和力。
本技术还提供了试剂盒，其包含本文提供的组合物和组合物的使用说明书。
根据本发明的一方面为缀合物，其包含与脲酶部分缀合的抗VEGFR-2抗体部分。
根据本发明的一方面为上述缀合物，其中所述抗体部分经由交联剂与脲酶部分缀合。
在多方面中，交联剂为相对长且柔性的。
在多方面中，交联剂为(PEG)2类交联剂。
在多方面中，交联剂为SM(PEG)2或BM(PEG)2。
在本发明的多方面中，缀合物的缀合比为每脲酶部分约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11或约12个抗体部分。
在多方面中，权利要求6的缀合物，其中所述缀合比高达约3.3，或缀合比为约3.3。
在本发明的多方面中，脲酶部分为刀豆脲酶。
在本发明的多方面中，抗体部分为单结构域抗体或其片段或其变体。
在本发明的多方面中，抗体部分包含至少一个具有选自以下的序列的CDR：SYAMG、AISWSDDSTYYANSVKG、HKSLQRPDEYTY和与它们至少70％相同的能结合VEGFR2的序列。
在本发明的多方面中，单结构域抗体或其片段包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：SEQ ID NO:2-30、其片段及其变体。
在本发明的多方面中，变体与SEQ ID NO:2-30中的任一个具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％或99％的序列同一性，其中所述变体能结合VEGFR-2。
在本发明的多方面中，本发明的缀合物包含另外的缀合部分。
在本发明的多方面中，缀合物被配制成组合物，其任选地包含药学可接受的载体或稀释剂。
在本发明的多方面中，组合物为冻干的。
根据本发明的多方面为药物组合物，其包含适合于静脉内注射的药学可接受的水溶液和基本上不含未缀合的脲酶抗VEGFR-2-脲酶缀合物。
在本发明的多方面中，药物组合物具有小于5％的未缀合的脲酶。
在本发明的多方面中，药物组合物不含非水性HPLC溶剂。
在本发明的多方面中，药物组合物的pH为约6.0至6.8。
在本发明的多方面中，药物组合物包含缀合比为每脲酶部分约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11或约12个抗体部分的缀合物。
在本发明的多方面中，药物组合物包含缀合比为每脲酶部分约6、约7、约8、约9、约10、约11或约12个抗体部分的缀合物。
在本发明的多方面中，药物组合物包含缀合比为每脲酶部分约8、约9、约10、约11或约12个抗体部分的缀合物。
在本发明的多方面中，药物组合物包含平均缀合比为每脲酶部分约6或更多个抗体部分的缀合物。
在本发明的多方面中，药物组合物包含平均缀合比为每脲酶部分约9.2个抗体部分的缀合物。
在本发明的多方面中，药物组合物包含刀豆脲酶。
在本发明的多方面中，药物组合物包含单结构域抗体。
在本发明的多方面中，单结构域抗体为/包含选自SEQ ID NO:2-30的序列，或者与其至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％相同的序列，或者与其基本上相同的序列。
在本发明的多方面中，药物组合物单结构域抗体包含选自SEQ ID NO:54-69的接头。
在本发明的多方面中，药物接头序列还包含C-末端半胱氨酸。
在本发明的多方面中，接头为GSEQKGGGEEDDGC。
在本发明的多方面中，药物组合物为冻干的。
在本发明的多方面中，药物组合物包含对VEGFR-2具有高于约1x 10-6M的数值的结合亲和力的抗体。
根据本发明的多方面为治疗对象中癌症的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的在本文任何方面描述的组合物，从而治疗对象中的癌症。
在本发明的多方面中，癌症为表达VEGFR-2的实体瘤。
在本发明的多方面中，对象为人。
根据本发明的多方面为试剂盒，其包含在本文所有和任何方面描述的组合物和使用说明书。
根据本发明的多方面为缀合物，其包含与脲酶缀合的一种或多种抗VEGFR-2抗体，其中所述一种或多种抗VEGFR-2抗体包含SEQ ID NO:2-30中的一个或多个或其片段和变体。
以下进一步描述本公开内容的这些和其它方面。
附图简述
当结合附图阅读时，将更好地理解本文描述的典型方面的以下详细描述。出于说明本发明的目的，在附图中示出了目前典型的方面。然而，应理解，本发明不限于附图中示出的方面的精确布置和手段。
图1显示AB1(SEQ ID NO:2)、AB2(SEQ ID NO:11)、AB3(SEQ ID NO:19)和AB4(SEQID NO:25)的尺寸排阻柱色谱图。
图2显示AB1(SEQ ID NO:2)、AB2(SEQ ID NO:13)、AB3(SEQ ID NO:21)和AB4(SEQID NO:27)与人VEGFR-2/Fc的结合。
图3显示AB1(SEQ ID NO:7)结合人VEGFR-2/Fc的结合动力学。
图4显示(a)本发明的单结构域抗VEGFR-2抗体与VEGFR-2的表位图谱，以及(b)AB1(SEQ ID NO:2)、AB2(SEQ ID NO:13)、AB3(SEQ ID NO:23)和AB4(SEQ ID NO:27)的重叠表位结合。
图5显示AB1m(SEQ ID NO:9)、AB2(SEQ ID NO:13)、AB3m(SEQ ID NO:23)和AB4(SEQ ID NO:27)与VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3的抗体结合和交叉反应性。所有四种单结构域抗体均用于制备脲酶(“DOS47”)缀合物。通过ELISA测试这些缀合物结合抗原VEGFR-2的能力以及它们与VEGFR-1和VEGFR-3交叉反应的能力。所有四种抗体缀合物与重组VEGFR2/Fc结合，其中美洲驼抗体缀合物观察到最强的结合(与图2中测定的KD值一致)。所有抗体均显示出与VEGFR1/Fc的一些交叉反应性。任何抗体对于VEGFR3/Fc没有可检测的结合。
图6显示AB1(SEQ ID NO:2)、AB2(SEQ ID NO:13)、AB3(SEQ ID NO:23)和AB4(SEQID NO:27)的VEGF竞争测定的结果。这样做是为了评估抗体是否识别VEGF结合口袋附近的区域。将抗体-脲酶缀合物与VEGF以各种不同的摩尔比混合，然后测试其与ELISA板上捕获的VEGFR2/Fc的结合。两种人抗体缀合物(AB2-(SEQ ID NO:13)&AB3-(SEQ ID NO:21)DOS47)与VEGFR2的结合被VEGF抑制，表明这些抗体和VEGF结合重叠位点。AB1-DOS47的结合仅受VEGF的最低程度的影响，表明AB1抗体和VEGF结合不同的位点。有趣的是，通过VEGF的存在增强了AB4-DOS47与VEGFR2的结合，表明AB4抗体与VEGF/VEGFR2复合物的结合好于与单独的VEGFR2的结合。
图7显示AB1(SEQ ID NO:9)-DOS47(A)和AB3(SEQ ID NO:23)-DOS47(B)抗体-脲酶缀合物与四种未连接的抗体(SEQ ID NO:7、13、21和27)(或抗CEACAM6作为阴性对照)中的每一种以多种不同摩尔比混合，然后测试其与ELISA板上包被的VEGFR2/Fc的结合。每种抗体-脲酶缀合物的结合被相应的未连接抗体抑制。此外，AB3-脲酶缀合物被未连接的AB2抗体抑制，表明两种人抗体共有至少部分重叠的表位。未连接的AB3抗体也部分抑制AB1-DOS47的结合，尽管仅在非常高的摩尔比下。
图8显示抗体和抗体-脲酶缀合物与293/KDR细胞的结合，所述细胞为已被转染以稳定表达VEGFR2(KDR)的HEK293细胞。用抗体或抗体-脲酶缀合物对293/KDR细胞进行染色，并通过流式细胞术检测结合。抗体AB1(SEQ ID NO:6)和AB2(SEQ ID NO:18)结合在293/KDR细胞上表达的VEGFR2。
图9显示在通过交联剂活化并与半胱氨酸连接之后V21H1(SEQ ID NO:3)抗体的解卷积质谱，显示未活化抗体、被一个交联剂活化的抗体和被两个交联剂活化的抗体的分布。
图10显示在不同重折叠时间点的V21H4(SEQ ID NO:6)样品的RP-HPLC色谱图。蓝线：在SP合并的级分与重折叠缓冲液混合之后在重折叠时间为0时的样品。红线：混合之后重折叠2小时的时间点。绿线：在加入1.2mM胱胺之后时间为0小时和2小时之后样品重折叠4小时。未折叠的抗体在12.513min洗脱，折叠的抗体在10.958min洗脱。
图11：(A-C)来自BiopharmaLynx的V21H4(SEQ ID NO:6)样品的完整蛋白质质谱的屏幕快照。(A)V21H4(SEQ ID NO:6)的解卷积谱，显示通过在重折叠期间形成二硫键而使半胱胺与C-末端半胱氨酸连接。(B)在用2mM TCEP还原之后的V21H4的解卷积谱，显示C-末端半胱胺的分离。(C)在用碘代乙酰胺烷基化之后还原的V21H4的解卷积谱，显示C末端半胱氨酸能接近巯基活化交联剂。(D)通过交联剂活化并与半胱氨酸连接之后V21H4的解卷积质谱。由BM(PEG)2活化的V21H4抗体产生单一活化物质。
图12：(A)V21H1-(SEQ ID NO:3)DOS47和V21H4-(SEQ ID NO:6)DOS47的SDS-PAGE。标记为红色的1、2或3的条带为簇编号。泳道1：分子量梯。泳道2：HPU。泳道3和4：V21H1-DOS47。泳道5和6：V21H4-DOS47。(B)V21H1、V21H4、高纯度脲酶(HPU)、V21H1-DOS47和V21H4-DOS47的尺寸排阻色谱图。
图13：(A)生物素-V21H4(SEQ ID NO:6)(黑色)、V21H1-DOS47(SEQ ID NO:3)(绿色)和V21H4-(SEQ ID NO:6)DOS47(红色)结合重组VEGFR2/Fc的ELISA。显示的结果代表对每个样品进行的2-5个实验，并且以一式三份测试的样品的平均值和SE呈现。(B)生物素-V21H4(黑色)和V21H4-DOS47(红色)与由293/KDR细胞表达的VEGFR2的结合。通过流式细胞术定量结合。显示的结果代表对每个样品进行的2-3个实验，并且以一式两份测试的样品的平均值和SE呈现。(C)在不同的抗体/脲酶缀合比下，V21H4-DOS47的脲酶活性。虚线表示未缀合的脲酶活性。(D)具有不同抗体-脲酶缀合比的V21H4-DOS47与重组VEGFR2/Fc结合的ELISA。显示的结果代表对每个样品进行的两个实验，并且以一式两份测试的样品的平均值和SE呈现。
图14：V21H4(SEQ ID NO:6)、HPU和V21H4-(SEQ ID NO:6)DOS47的蛋白质印迹。用(A)抗美洲驼抗体或(B)抗脲酶抗体探测印迹。泳道MW：分子量梯。泳道1：V21H4。泳道2：HPU。泳道3和4：V21H4-DOS47。
图15：(A)由BiopharmaLynx软件处理的HP脲酶(上图)和V21H4-(SEQ ID NO:6)DOS47(下图)样品的胰蛋白酶消化物的原始LC-MS(TIC)色谱图的屏幕快照。(B)映射为由UC824-BM(PEG)2修饰的V21H4肽GGGEEDDGC(上图)和由VC136-BM(PEG)2修饰的脲酶肽LLCVSEATTVPLS(下图)的缀合位点UC824-VC136的b/y片段图谱的屏幕快照。
发明详述
定义
除非另外说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。分子生物学中常见术语的定义可以见于BenjaminLewin,Genes V,由Oxford University Press出版,1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等人(编辑),The Encyclopedia of Molecular Biology,由Blackwell Science Ltd.出版,1994(ISBN 0-632-02182-9)；以及Robert A.Meyers(编辑),Molecular Biology andBiotechnology:a Comprehensive Desk Reference,由VCH Publishers,Inc.出版,1995(ISBN 1-56081-569-8)。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料可以用于测试本发明的实践中，但本文描述了典型的材料和方法。在描述和要求保护本发明时，将使用以下术语。
还应理解，本文使用的术语仅出于描述特定方面的目的，而不旨在为限制性的。
在理解本申请的范围时，冠词“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”、“该(the)”和“所述(said)”旨在意指有一个或多个元素。
另外，本文使用的术语“包含(comprising)”及其衍生词旨在是开放式术语，其指定所述特征、元素、组分、群组、整数和/或步骤的存在，但不排除其它未说明的特征、元素、组分、群组、整数和/或步骤的存在。前述内容也适用于具有类似含义的词语，如术语“包括(including)”、“具有(having)”及其衍生词。
应理解，描述为“包含”某些组分的任何方面也可以“由...组成”或“基本上由......组成”，其中“由......组成”具有封闭式或限制性含义，“基本上由......组成”意指包括所述组分，但排除除了作为杂质存在的材料，由于用于提供组分的方法而存在的不可避免的材料，以及出于除了达到本发明的技术效果外的目的而加入的组分之外的其它组分。例如，使用短语“基本上由......组成”限定的组合物涵盖任何已知的药学可接受的加入剂、赋形剂、稀释剂、载体等。通常，基本上由一组组分组成的组合物包含小于5重量％，通常小于3重量％，更通常小于1重量％的未指定组分。
应理解，本文中定义为包括的任何组分可以通过但书或否定限制从要求保护的发明中明确排除。此外，无论是否明确说明，本文给出的所有范围包括范围的端点以及任何中间范围点。
本文使用的诸如“基本上”，“约”和“大约”的程度术语意指所修饰术语的合理量的偏差，使得最终结果不会显著改变。这些术语可以指可测量的值，如量、时距等，意味着涵盖指定值的±20％或±10％的变化，更典型地±5％，甚至更典型地±1％，更典型地，±0.1％的变化，因为这样的变化适合实施所公开的方法。
如本文所用，“活化”是指已被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的免疫细胞，如CIK细胞或T细胞的状态。活化还可与诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关。术语“活化的T细胞”尤其是指经历细胞分裂的T细胞。
还应理解，对于核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小，以及所有分子量或分子质量数值是近似的，并且提供用于描述。虽然与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本公开的实践或测试，但下文描述了合适的方法和材料。缩写“例如(e.g.)”来源于拉丁语exempli gratia，并且在本文中用于表示非限制性实例。因此，缩写“例如(e.g.)”与术语“例如(for example)”同义。除非上下文另有明确说明，否则词语“或”旨在包括“和”。
本文使用的术语“抗体”，在本领域中也被称为“免疫球蛋白”(Ig)，是指由成对的重和轻多肽链构建的蛋白质；存在多种Ig同种型，包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。当抗体正确折叠时，每条链折叠成许多不同的球状结构域，这些结构域通过较为线性的多肽序列连接。例如，免疫球蛋白轻链折叠成可变(VL)和恒定(CL)结构域，而重链折叠成可变(VH)和三个恒定(CH、CH2、CH3)结构域。重链和轻链可变结构域(VH和VL)的相互作用导致抗原结合区(Fv)的形成。每个结构域具有本领域技术人员熟悉的确立的结构。
轻链和重链可变区负责结合靶抗原，因此可以在抗体之间显示出显著的序列多样性。恒定区显示出较少的序列多样性，负责结合许多天然蛋白质以引发重要的免疫学事件。抗体的可变区含有分子的抗原结合决定簇，因此决定抗体对其靶抗原的特异性。大多数序列可变性出现在六个高变区，每个可变重链和轻链各三个；高变区组合形成抗原结合位点，并有助于抗原决定簇的结合和识别。抗体对其抗原的特异性和亲和力由高变区的结构以及它们的大小、形状和它们呈现给抗原的表面的化学性质决定。存在用于鉴定高变区的多种方案，两种最常见的是Kabat及Chothia和Lesk的那些。Kabat等人(1991a；1991b)基于VH和VL结构域的抗原结合区的序列可变性来定义“互补决定区”(CDR)。Chothia和Lesk(1987)基于VH和VL结构域中结构环区的位置定义了“高变环”(H或L)。由于这些单独的方案定义了相邻或重叠的CDR和高变环区，因此抗体领域的技术人员通常可互换地使用术语“CDR”和“高变环”，并且它们可以在本文中这样使用。为此，在包含VH和VL结构域的抗体的情况下，形成抗原结合位点的区域被称为CDR L1、CDR L2、CDR L3、CDR H1、CDR H2、CDR H3；或者在重链或轻链的抗原结合区的情况下，被称为CDR1、CDR2、CDR3。在本文中根据IMGT编号系统(Lefranc等人，2003)在本文中提及CDR/环，其被开发以促进可变结构域的比较。在该系统中，保守氨基酸(如Cys23、Trp41、Cys104、Phe/Trp118和89位的疏水残基)总是具有相同的位置。另外，提供了框架区(FR1：第1位至第26位；FR2：第39位至第55位；FR3：第66位至第104位；和FR4：第118位至第128位)和CDR(CDR1：第27位至第38位，CDR2：第56位至第65位；和CDR3：第105位至第117位)的标准定界。
本文提及的“抗体片段”可以包括本领域已知的任何合适的抗原结合抗体片段。抗体片段可以是天然存在的抗体片段，或者可以通过操纵天然存在的抗体或通过使用重组方法获得。例如，抗体片段可以包括但不限于Fv、单链Fv(scFv；由用肽接头连接的VL和VH组成的分子)、Fab、F(ab')2、单结构域抗体(sdAb；由单个VL或VH组成的片段)，以及这些中任一种的多价呈递。SEQ ID NO：2-30中任一个的抗体片段是本领域技术人员理解的保留结合VEGFR-2的生物学活性的抗体片段。
本文使用的术语“合成抗体”意指使用重组DNA技术产生的抗体，如例如，本文描述的噬菌体表达的抗体。该术语还应被解释为意指通过合成编码抗体的DNA分子并且该DNA分子表达抗体蛋白，或指定抗体的氨基酸序列产生的抗体，其中使用本领域可获得的且众所周知的合成DNA或氨基酸序列技术获得DNA或氨基酸序列。
在非限制性实例中，抗体片段可以是衍生自天然来源的sdAb。骆驼科动物来源的重链抗体(Hamers-Casterman等人,1993)缺乏轻链，因此它们的抗原结合位点由一个结构域(被称为VHH)组成。在鲨鱼中也观察到sdAb，其被称为VNAR(Nuttall等人,2003)。可以基于人Ig重链和轻链序列工程改造其它sdAb(Jespers等人,2004；To等人,2005)。如本文所用，术语“sdAb”包括通过噬菌体展示或其它技术从任何来源的VH、VHH、VL或VNAR储库直接分离的那些sdAb，衍生自上述sdAb的sdAb，重组产生的sdAb，以及通过人源化、亲和力成熟，稳定化、溶解(例如，camelization)或抗体工程化的其它方法进一步修饰此类sdAb而产生的那些sdAb。本发明还涵盖保留sdAb的抗原结合功能和特异性的同源物、衍生物或片段。
SdAb具有高的热稳定性、高的耐洗涤剂性、对蛋白酶相对高的抗性(Dumoulin等人,2002)和高产量(Arbabi-Ghahroudi等人,1997)；通过从免疫文库中分离(Li等人,2009)或通过体外亲和力成熟(Davies&Riechmann,1996)，它们也可以被工程改造成具有非常高的亲和力。
本领域技术人员熟悉单结构域抗体的结构(参见，例如，蛋白质数据库中的3DWT、2P42)。sdAb包含保留免疫球蛋白折叠的单个免疫球蛋白结构域；最值得注意的是，只有三个CDR形成抗原结合位点。然而，如本领域技术人员所理解的，并非所有CDR都可能是结合抗原所必需的。例如，并且不希望是限制性的，CDR中的一个、两个或三个可有助于通过本发明的sdAb结合和识别抗原。sdAb或可变结构域的CDR在本文中被称为CDR1、CDR2和CDR3，并且如Kabat等人(1991b)所定义进行编号。
表位：抗原决定簇。表位是分子上具有抗原性的，即引发特异性免疫应答的特定化学基团或肽序列。抗体特异性结合例如多肽上的特定抗原表位。表位可以由连续氨基酸，或者由蛋白质的三级折叠并列的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丧失。表位通常在独特空间构象中包含至少3个、更通常至少5个、约9个或8至10个氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括例如x射线晶体学和二维核磁共振。参见，例如，Methods in MolecularBiology,Vol.66,Glenn E.Morris,Ed(1996)中的“Epitope Mapping Protocols”。在一个实施方案中，表位结合MHC分子，如HLA分子或DR分子。这些分子结合具有被约8至约10个氨基酸，如9个氨基酸分开的正确的锚定氨基酸的多肽。
本文使用的术语“抗原”或“Ag”被定义为引起免疫应答的分子。该免疫应答可以涉及抗体产生，或特异性免疫活性细胞的活化，或两者。技术人员会理解，任何大分子，包括几乎所有蛋白质或肽，都可以用作抗原。此外，抗原可以衍生自重组或基因组DNA。本领域技术人员会理解，包含编码引发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA因此编码“抗原”(当该术语用在本文中时)。此外，本领域技术人员会理解，抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于使用多于一种基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以引发期望的免疫应答。此外，技术人员会理解抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以被合成或可以来源于生物样品。此类生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。
本文使用的术语“抗肿瘤作用”或“癌症治疗”是指可以通过肿瘤体积减小、肿瘤细胞数量减少、肿瘤生长率降低、转移数量减少、病情稳定、预期寿命增加，或与癌症病况相关的各种生理症状的改善体现的生物学效应。“抗肿瘤作用”也可以通过本文描述的肽、多核苷酸、细胞和抗体首先预防肿瘤发生的能力来体现。
根据本发明，术语“自身抗原”意指被免疫系统错误地识别为外来物的任何自身抗原。自身抗原包括但不限于细胞蛋白、磷蛋白、细胞表面蛋白、细胞脂质、核酸、糖蛋白，包括细胞表面受体。
如本文所用，术语“自体的”意指来源于同一个体的随后被重新引入该个体的任何材料。
“同种异体的”是指来源于相同物种的不同动物的移植物。
“异种的”是指来源于不同物种的移植物。
“同源的”是指来源于同一个体的移植物。
本文使用的术语“共刺激配体”包括抗原呈递细胞(例如，APC、树突细胞、B细胞等)上的分子，其特异性结合T细胞上的同源共刺激分子，从而除了提供由例如TCR/CD3复合物与负载有肽的MHC分子结合提供的初级信号之外，还提供介导T细胞应答，包括但不限于增殖、活化、分化等的信号。共刺激配体可以包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L，诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM，淋巴毒素β受体，3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、能结合Toll配体受体的激动剂或抗体和能特异性结合B7-H3的配体。共刺激配体还尤其涵盖能特异性结合T细胞上存在的共刺激分子的抗体，如但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3以及能特异性结合CD83的配体。
“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合伴侣，其与共刺激配体特异性结合，从而介导T细胞的共刺激反应，如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体。
如本文所用，“共刺激信号”是指与初级信号(如TCR/CD3连接)组合导致T细胞增殖和/或关键分子上调或下调的信号。
本文使用的“有效量”意指提供治疗或预防益处的量。
“编码”是指在具有限定的核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或限定的氨基酸序列的生物学过程中用作合成其它聚合物和大分子的模板的多核苷酸，如基因、cDNA或mRNA中特异性核苷酸序列的固有特性和由此产生的生物学特性。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白质，则该基因编码蛋白质。编码链和非编码链均可以被称为编码基因或cDNA的蛋白质或其它产物，所述编码链的核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常提供在序列表中，所述非编码链用作该基因或cDNA转录的模板。
如本文所用，“内源的”是指来自有机体、细胞、组织或系统内的或在其内产生的任何材料。
如本文所用，术语“外源的”是指从有机体、细胞、组织或系统外引入或产生的任何材料。
本文使用的术语“表达”被定义为由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含用于表达的足够的顺式作用元件；用于表达的其它元件可以由宿主细胞或体外表达系统提供。表达载体包括本领域已知的所有那些，如掺入重组多核苷酸的粘粒，质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)和病毒(如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
“同源的”是指两条多肽之间或两条核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两条比较序列中的两个位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个DNA分子的每一个中的位置被腺嘌呤占据，则分子在该位置是同源的。两条序列之间的同源性百分比为两条序列共有的匹配或同源位置数量除以比较位置的数量×100的函数。例如，如果两条序列的10个位置中的6个匹配或同源，则这两条序列为60％同源的。例如，DNA序列ATTGCC和TATGGC共有50％的同源性。通常，将两条序列比对以产生最大同源性时进行比较。
“分离的”意指从自然状态改变或从自然状态中取出。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存材料部分或完全分开的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯的形式存在，或者可以存在于非天然环境中，如例如宿主细胞中。
在本发明的上下文中，针对常见核酸碱基使用以下缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，“U”是指尿苷。
除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此为简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列也可以包含内含子，其程度为编码蛋白质的核苷酸序列可以在一些形式中含有内含子。
本文使用的“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在能够感染非分裂细胞的逆转录病毒中是独特的；它们可以将大量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体的最有效方法之一。HIV、SIV和FIV均是慢病毒的实例。衍生自慢病毒的载体提供了在体内实现显著水平的基因转移的手段。
“转座子”或“转座元件”为这样的DNA序列，其能够改变其在基因组中的位置，有时产生或逆转突变以及改变细胞的基因组大小。转座经常导致转座子的重复。有两种不同类型的转座子：II类转座子，其由从一个地方直接移动到另一个地方的DNA组成；和I类转座子，其是逆转录转座子，首先将DNA转录成RNA，然后使用逆转录酶制备RNA的DNA拷贝以插入新的位置。转座子通常与转座酶相互作用，所述转座酶介导转座子的移动。转座子/转座酶系统的非限制性实例包括Sleeping Beauty、Piggybac、Frog Prince和Prince Charming。
本文使用的术语“调节”意为与不存在治疗或化合物的对象的应答水平相比，和/或与在其它方面相同但未经治疗的对象的应答水平相比，介导对象的应答水平的可检测的增加或减少。该术语涵盖扰乱和/或影响天然信号或应答，从而在对象(通常是人)中介导有益的治疗应答。
术语“可操作连接的”是指调控序列和异源核酸序列之间的功能性连接，导致后者的表达。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作地连接。通常，可操作连接的DNA序列是连续的，并且在必要时将两个蛋白质编码区连接在同一阅读框中。
术语“过表达的”肿瘤抗原或肿瘤抗原的“过表达”旨在表示相对于来自组织或器官的正常细胞中的表达水平，来自疾病区如患者的特定组织或器官中的实体瘤的细胞中肿瘤抗原的表达水平异常。可以通过本领域已知的标准测定来确定具有以肿瘤抗原过表达为特征的实体瘤或血液恶性肿瘤的患者。
免疫原性组合物的“肠胃外”施用包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)、或胸骨内注射、或输注技术。
本文使用的术语“多核苷酸”被定义为核苷酸链。此外，核酸为核苷酸的聚合物。因此，本文使用的核酸和多核苷酸是可互换的。本领域技术人员通常知道核酸为多核苷酸，其可以被水解成单体“核苷酸”。单体核苷酸可以被水解成核苷。本文使用的多核苷酸包括但不限于通过本领域可获得的任何手段获得的所有核酸序列，包括但不限于重组手段(即使用普通的克隆技术和PCR等从重组文库或细胞基因组克隆核酸序列)以及合成手段。
如本文所用，术语“肽”，“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指包含通过肽键共价连接的氨基酸残基的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可包含蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包含含有通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，该术语既指短链，也指较长的链，所述短链在本领域中通常也被称为例如肽、寡肽和寡聚物，所述较长的链在本领域中通常被称为蛋白质，其中有许多类型的蛋白质。“多肽”包括，例如，生物学活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或它们的组合。
本文使用的术语“启动子”被定义为启动多核苷酸序列的特异性转录所需的被细胞合成机构或引入的合成机构识别的DNA序列。
如本文所用，术语“启动子/调控序列”意指表达与启动子/调控序列可操作连接的基因产物所需的核酸序列。在一些情况下，该序列可以是核心启动子序列，在其它情况下，该序列还可以包含增强子序列和表达基因产物所需的其它调控元件。启动子/调控序列可以是，例如，以组织特异性方式表达基因产物的启动子/调控序列。
“组成型”启动子是这样的核苷酸序列，当其与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，导致在细胞的大多数或所有生理条件下在细胞中产生基因产物。
“诱导型”启动子是这样的核苷酸序列，当其与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，基本上只有当细胞中存在对应于启动子的诱导物时，才能导致在细胞中产生基因产物。
“组织特异性”启动子是这样的核苷酸序列，当其与编码或由基因指定的多核苷酸可操作地连接时，基本上只有当细胞是对应于启动子的组织类型的细胞时，才能导致在细胞中产生基因产物。
本文关于抗体使用的术语“特异性结合”意指识别特异性抗原但基本上不识别或结合样品中其它分子的抗体。例如，特异性结合来自一个物种的抗原的抗体也可以结合来自一个或多个物种的该抗原。但是，此类跨物种反应性本身并不会改变抗体的特异性分类。在另一实例中，特异性结合抗原的抗体也可以结合不同等位基因形式的抗原。然而，这种交叉反应性本身并不会改变抗体的特异性分类。在一些情况下，术语“特异性结合(specificbinding)”或“特异性结合(specifically binding)”可以用于指抗体、蛋白质或肽与第二化学物质的相互作用，意指相互作用取决于化学物质上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体通常识别并结合特异性蛋白质结构而不是蛋白质。如果抗体对表位“A”是特异的，则在含有标记的“A”和抗体的反应中，含有表位A(或游离的、未标记的A)的分子的存在将减少与抗体结合的标记A的量。
术语“表位”意指能够特异性结合抗体的蛋白决定簇。表位通常由分子的化学活性表面基团，如氨基酸或糖侧链，组成，并且通常具有特异性三维结构特征以及特异性电荷特征。构象和非构象表位的区别在于，在变性溶剂的存在下，与前者的结合而非后者的结合丧失。
术语“刺激”意为通过刺激分子(例如，TCR/CD3复合物)与其同源配体的结合诱导的初级应答，从而介导信号转导事件，如但不限于经由TCR/CD3复合物的信号转导。刺激可以介导某些分子的表达改变，如TGF-β的下调和/或细胞骨架结构的重组等。
本文使用的术语“刺激性分子”意指T细胞上与抗原呈递细胞上存在的同源刺激性配体特异性结合的分子。
如本文所用，“刺激性配体”意指这样的配体，当存在于抗原呈递细胞(例如，aAPC、树突细胞、B细胞等)上时，其能够与T细胞上的同源结合伴侣(在本文中被称为“刺激性分子”)特异性结合，从而介导T细胞的初级应答，包括但不限于活化、起始免疫应答，增殖等。刺激性配体是本领域众所周知的，并且尤其涵盖负载有肽的MHC I类分子、抗CD3抗体、超级激动剂抗CD28抗体和超级激动剂抗CD2抗体。
如本文所用，“基本上纯化的”细胞为基本上不含其它细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞也指已经与其天然存在状态下通常结合的其它细胞类型分开的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群是指同质细胞群。在其它情况下，该术语仅指已经与其天然状态下天然结合的细胞分开的细胞。在一些方面，细胞在体外培养。在其它方面，细胞不在体外培养。
如本文所用，“治疗(treatment)”或“疗法(therapy)”为获得有益或期望的临床结果的方法。出于本文描述的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于缓解(alleviation)症状、减轻疾病程度、稳定(即，不恶化)疾病状态、延迟或减慢疾病进展、改善或缓和疾病状态以及缓解(remission)(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”和“疗法”也可以意指与如果不接受治疗或疗法的预期存活相比延长存活。因此，“治疗”或“疗法”是为了改变病症病理的目的而进行的干预。具体地，治疗或疗法可以直接预防、减缓或以其它方式减少疾病或病症(如癌症)的病理学，或者可以使细胞更易于被其它治疗剂治疗(treatment/therapy)。
术语“治疗有效量”、“有效量”或“足够量”意指当施用至对象(包括哺乳动物，例如人)时足以实现期望结果的量，例如有效治疗癌症的量。本文描述的化合物的有效量可以根据诸如对象的疾病状态、年龄、性别和体重的因素而变化。如技术人员所理解的，可以调整剂量或治疗方案以提供最佳治疗反应。例如，在多方面中，治疗有效量的抗VEGFR-2sdAb的施用足以减少、抑制或防止与肿瘤进展或转移相关的血管的形成。
此外，用治疗有效量治疗对象的方案可以由单次施用组成，或者可选地包括一系列应用。治疗期的长度取决于多种因素，如疾病的严重程度、对象的年龄、药剂的浓度、患者对药剂的反应性、或它们的组合。还应理解，用于治疗的药剂的有效剂量可以在特定治疗方案的过程中增加或减少。通过本领域已知的标准诊断测定可以得到剂量的变化并且其变得显而易见。在多方面中，可以在用针对所讨论的疾病或病症(如癌症)的常规疗法治疗之前、期间或之后施用本文描述的抗体。
本文使用的术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞为已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代对象细胞及其后代。
本文使用的短语“在转录控制下”或“可操作连接的”意指启动子相对于多核苷酸处于正确的位置和方向，以控制RNA聚合酶的转录起始和多核苷酸的表达。
“载体”为包含分离的核酸并且可以用于将分离的核酸递送到细胞内部的物质的组合。本领域已知许多载体，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲化合物结合的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应被解释为包括促进核酸转移至细胞中的非质粒和非病毒化合物，如例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。
术语“患者”、“对象”、“个体”等在本文中可互换使用，并且是指适合于本文描述的方法的任何动物或其细胞，无论是体外还是原位。
此外，术语“患者”、“对象”和“个体”包括可以引发免疫应答的活有机体(例如哺乳动物)。在某些非限制性方面，患者、对象或个体为哺乳动物并且包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。本文使用的术语“对象”是指动物界的任何成员，通常是哺乳动物。术语“哺乳动物”是指被分类为哺乳动物的任何动物，包括人，其它高等灵长类动物，家畜和农场动物，以及动物园、运动或宠物动物，如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔等。通常，哺乳动物是人。
与一种或多种其它治疗剂“联合”施用包括以任何顺序同时(simultaneous/concurrent)和连续施用。
术语“药学可接受的”意指化合物或化合物的组合与用于药物用途的制剂的其余成分相容，并且根据建立的政府标准(包括美国食品和药品管理局颁布的标准)施用至人类通常是安全的。
术语“药学可接受的载体”包括但不限于溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂、抗真菌剂、等渗和/或吸收延迟剂等。药学可接受的载体的使用是众所周知的。
分离的：“分离的”生物学组分(如蛋白质)已经基本上从所述组分天然存在的有机体细胞中的其它生物学组分(即染色体及染色体外DNA和RNA，其它蛋白质和细胞器)中分离或纯化。已经“分离的”蛋白质和肽包括通过标准纯化方法纯化的蛋白质和肽。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的蛋白质和肽，以及化学合成的蛋白质和肽。
如本文所用，“肿瘤”是指所有肿瘤细胞生长和增殖(无论是恶性的还是良性的)以及所有癌前细胞和组织及癌细胞和组织。
术语“癌症”和“癌性的”是指或描述哺乳动物中通常以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。如本文所用，癌症或癌性的被定义为以异常细胞的快速和不受控制的生长为特征的疾病。癌细胞可以局部扩散或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其它部位。各种癌症的实例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。
待治疗的癌症可以是任何类型的恶性肿瘤，并且在一方面中，是肺癌，包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌(例如腺癌)，胰腺癌，结肠癌(例如结肠直肠癌，如例如，结肠腺癌和结肠腺瘤)，食管癌，口腔鳞状细胞癌，舌癌，胃癌，肝癌，鼻咽癌，淋巴谱系的造血肿瘤(例如急性淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤)，非霍奇金淋巴瘤(例如套细胞淋巴瘤)，霍奇金病，骨髓性白血病(例如急性髓性白血病(AML)或慢性骨髓性白血病(CML))，急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，甲状腺滤泡癌，骨髓增生异常综合征(MDS)，间充质来源的肿瘤，软组织肉瘤，脂肪肉瘤，胃肠道间质瘤，恶性外周神经鞘瘤(MPNST)，尤文肉瘤，平滑肌肉瘤，间充质软骨肉瘤，淋巴肉瘤，纤维肉瘤，横纹肌肉瘤，黑色素瘤，畸胎癌，神经母细胞瘤，脑肿瘤，成神经管细胞瘤，胶质瘤，皮肤良性肿瘤(例如角化棘皮瘤)，乳腺癌(例如晚期乳腺癌)，肾癌，肾母细胞瘤，卵巢癌，宫颈癌，子宫内膜癌，膀胱癌，前列腺癌，包括晚期疾病和激素难治性前列腺癌，睾丸癌，骨肉瘤，头颈癌，表皮癌，多发性骨髓瘤(例如难治性多发性骨髓瘤)或间皮瘤。在一方面中，癌细胞来源于实体瘤。通常，癌细胞来源于乳腺癌、结肠直肠癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、肺癌或前列腺癌。更典型地，癌细胞来源于前列腺癌、肺癌、乳腺癌或黑色素瘤。
“化疗剂”为可用于治疗癌症的化合物。化疗剂的实例包括烷化剂，如噻替派、CYTOXANTM环磷酰胺；烷基磺酸盐，如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮杂环丙烷类，如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；乙酰精宁(acetogenins)，如布拉它辛和布拉它辛酮(bullatacinone)；喜树碱，如拓扑替康；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065及其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物；念珠藻素，如念珠藻素1和念珠藻素8；尾海兔素；duocarmycins，如合成类似物KW-2189和CB1-TM1；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；sarcodictyins；spongistatin；氮芥，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥、异环磷酰氨、二氯甲基二乙胺、盐酸氧化氮芥、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼氮芥、曲洛磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素，如烯二炔抗生素，例如加利车霉素，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1，dynemicin，包括dynemicin A、双膦酸盐，如氯膦酸盐、esperamicins、新制癌菌素(neocarzinostatin)发色团和相关的色蛋白烯二炔抗生素发色团；阿克拉霉素(aclacinomysins)；放线菌素；氨茴霉素(authramycin)；重氮丝氨酸；博来霉素；放线菌素C(cactinomycin)；carabicin；洋红霉素；嗜癌菌素；色霉素；更生霉素；道诺霉素；地托比星；6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸；ADRIAMYCINTM阿霉素，包括吗啉代-阿霉素、氰基吗啉代-阿霉素、2-吡咯啉并-阿霉素和脱氧阿霉素；表柔比星；依索比星；伊达比星；麻西罗霉素(marcellomycin)；丝裂霉素，如丝裂霉素C、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁和佐柔比星；抗代谢物，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸、甲氨蝶呤、喋罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫脒嘌呤和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨和氟尿苷；雄激素，如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷和睾内酯；抗肾上腺素，如氨鲁米特、米托坦和曲洛斯坦；叶酸补充剂，如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；伊达曲杀(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水酰胺；地吖醌；elformithine；依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；lonidainine；美登素生物碱类(maytansinoids)，如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；mopidanmol；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁；苯来美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；甲苄肼；PSKTM多糖复合物；雷佐生；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素类(trichothecenes)，如T-2毒素、维拉库林A(verracurin A)、杆孢菌素A(roridin A)和anguidine；氨基甲酸乙酯；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷("Ara-C")；紫杉烷类，如TAXOLTM紫杉醇、ABRAXANETM不含氢化蓖麻油(Cremophor-free)、紫杉醇的白蛋白工程化的纳米颗粒制剂、TAXOTERETM和doxetaxel；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；GEMZARTM吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；氨甲蝶呤；铂配合物，如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春花碱；铂；依托泊苷(VP-16)；ifosfamide；长春新碱(vincristine)；NAVELBINETM长春瑞滨；novantrone；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨喋呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；伊立替康，如CPT-11；拓扑异构酶抑制剂，如RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，如视黄酸；卡培他滨；和任何上述药学可接受的盐、酸或衍生物。
该定义还包括用于调节或抑制对肿瘤的激素作用的抗激素剂，如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬(包括NOLVADEXTM他莫昔芬)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和FARESTON托瑞米芬；抑制调节肾上腺中的雌激素产生的芳香酶的芳香酶抑制剂，如例如，4(5)-咪唑类、氨鲁米特、MEGASETM醋酸甲地孕酮、AROMASINTM依西美坦、福美坦(formestane)、法曲唑(fadrozole)、RIVISORTM伏氯唑、FEMARATM来曲唑和ARIMIDEXTM阿那曲唑；和抗雄激素，如氟他胺，尼鲁米特，比卡鲁胺，亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及曲沙他滨(1,3-二噁茂烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制与异常细胞增殖有关的信号传导通路中基因表达的那些寡核苷酸，如例如PKC-α，Ralf和H-Ras；核酶，如VEGF表达抑制剂(如ANGIOZYMETM核酶)和HER2表达抑制剂；抗体，如抗VEGF抗体(例如，AVASTINTM抗体)；疫苗，如基因治疗疫苗，例如，ALLOVECTINTM疫苗、LEUVECTINTM疫苗和VAXIDTM疫苗；PROLEUKINTM rIL-2；LURTOTECANTM拓扑异构酶1抑制剂；ABARELIXTM rmRH；和任何上述的药学可接受的盐、酸或衍生物。
在多方面中，本文描述的抗体与其它常规抗癌治疗以累加或协同方式起作用。
“变体”为由于比较序列内的一个或多个氨基酸残基的插入、缺失、修饰和/或取代具有与抗VEGFR-2sdAb的序列不同的氨基酸序列的生物学活性抗体或其片段，如SEQ IDNO：2-53中示出的那些。变体与比较序列通常具有小于100％的序列同一性。然而，通常，生物学活性变体将具有这样的氨基酸序列，其与比较序列具有至少约70％的氨基酸序列同一性，如至少约71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。变体包括保留VEGFR-2结合能力的至少10个氨基酸的肽片段。变体还包括在比较序列的N-或C-末端或者在比较序列内加入一个或多个氨基酸残基的多肽。例如，N-末端的“MQV”可以被“MKKQV”取代，并且仍然保留对VEGFR-2的结合活性。变体还包括这样的多肽，其中缺失许多氨基酸残基以及许多氨基酸残基任选被一个或多个氨基酸残基取代。也可以共价修饰变体，例如通过用除天然存在的氨基酸以外的部分取代或通过修饰氨基酸残基以产生非天然存在的氨基酸。
“氨基酸序列同一性百分比”在本文中被定义为在将序列进行比对和引入缺口，如果必要的话，以实现最大序列同一性百分比，并且不将任何保守取代考虑为序列同一性的一部分之后，候选序列中的氨基酸残基与目标序列(如本发明的多肽)中的残基相同的百分比。候选序列的N末端、C末端或内部延伸、缺失或插入均不应被解释为影响序列同一性或同源性。用于比对的方法和计算机程序在本领域中是众所周知的，如“BLAST”。
用于本文目的的“活性的(active)”或“活性(activity)”是指本文描述的sdAb的生物学和/或免疫学活性，其中“生物学”活性是指由sdAb引起的生物学功能(抑制性或刺激性)。
因此，当与“抗VEGFR-2sdAb”结合使用时，“生物学活性的(biologicallyactive)”或“生物学活性(biological activity)”意指表现出或共有抗VEGFR-2抗体的效应子功能的抗VEGFR-2sdAb或其片段。此类抗体的一种生物学活性是其至少部分抑制血管形成的能力。
术语“抑制”或“抑制的”意指VEGFR-2的功能或活性降低、受限、阻断或中和。这些术语涵盖VEGFR-2功能或活性的完全或部分抑制。
如本文所用，“抗VEGFR-2单结构域抗体”包括保留对VEGFR-2的特异性的本发明的抗VEGFR-2抗体的修饰。此类修饰包括但不限于与效应分子如化疗剂(例如顺铂、紫杉醇、阿霉素)或细胞毒素(例如蛋白质或非蛋白质有机化疗剂)的缀合。修饰还包括但不限于与可检测的报告分子部分的缀合。还包括延长抗体半衰期的修饰(例如聚乙二醇化)。蛋白质和非蛋白质试剂可以通过本领域已知的方法与抗体缀合。缀合方法包括直接连接、经由共价连接的接头和特异性结合对成员(例如抗生物素蛋白-生物素)的连接。此类方法包括，例如，Greenfield等人,Cancer Research 50,6600-6607(1990)中描述的方法，将其通过引用并入本文(用于阿霉素缀合)，以及Amon等人,Adv.Exp.Med.Biol.303,79-90(1991)和Kiseleva等人,MoI.Biol.(USSR)25,508-514(1991)描述的方法，这两篇文献均通过引用并入本文。
与脲酶缀合的抗体或其片段对VEGFR-2是特异的，所述VEGFR-2的表达在许多实体瘤，如但不限于乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌和结肠癌，中升高。
VEGFR-2(也称为KDR D1-7、sKDR D1-7、激酶插入结构域受体、蛋白质酪氨酸激酶受体Flk-1、CD309、III型受体酪氨酸激酶、FLK1)的序列是已知的，并且可以如显示人和鼠序列的U.S.2009/0247467中所示(其公开内容以其整体并入本文)。在多方面中，VEGFR-2的蛋白质序列可以是，但不限于SEQ ID NO：1的序列：
范围：在整个公开中，本文描述的各个方面可以以范围形式呈现。应理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对本文描述的范围的不可改变的限制。因此，应认为范围的描述已经明确公开了所有可能的子范围以及该范围中的各个数值。例如，应认为对诸如1至6的范围的描述已明确公开了，如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6，3至6等的子范围以及在该范围内的各个数值，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的宽度如何，这都适用。
本文提及许多专利申请、专利和出版物以帮助理解所描述的方面。这些参考文献中的每一篇均通过引用整体并入本文。
本发明还提供了分离的或纯化的单结构域抗体或其片段，其包含互补决定区(CDR)1；CDR2；和CDR3，其中所述抗体或其片段对VEGFR-2是特异的。一个或多个CDR可以结合VEGFR-2。刚才描述的抗体可以识别并结合上述VEGFR-2的氨基酸序列的表位，其中表位可以由VEGFR-2中的线性或非线性序列构成。
如前所述，抗体或其片段可以为sdAb。sdAb可以是任何来源，如人或骆驼科动物来源或者来源于骆驼科动物VHH，因此可以基于骆驼科动物框架区；可选地，上文描述的CDR可以移植到VNAR、VHH或VL框架区上。
本发明的实施方案还涵盖使用本领域已知的任何合适方法“人源化”的抗体片段，例如但不限于CDR移植和镶饰(veneering)。抗体或抗体片段的人源化包括用人类共有序列中发现的人类对应物替换序列中的氨基酸，而不丧失抗原结合能力或特异性；当引入人类对象时，该方法降低了抗体或其片段的免疫原性。在CDR移植的过程中，本文定义的一个或多个重链CDR可以融合或移植到人类可变区(VH或VL)或其它人类抗体片段框架区(Fv、scFv、Fab)。在这种情况下，保留了所述一个或多于一个高变环的构象，并且也保留了sdAb对其靶的亲和力和特异性。
CDR移植为本领域已知的，并且至少描述于以下专利中：美国专利第6,180,370号、美国专利第5,693,761号、美国专利第6,054,297号、美国专利第5,859,205号和欧洲专利第626390号。在本领域中也称为“可变区表面重修”的镶饰涉及人源化抗体或片段的溶剂暴露位置；因此，保留了对CDR构象可能重要的埋藏的非人源化残基，同时使针对溶剂暴露区的免疫反应的潜能最小化。镶饰为本领域已知的，并且至少描述于以下专利中：美国专利第5,869,619号、美国专利第5,766,886号、美国专利第5,821,123号和欧洲专利第519596号。本领域技术人员非常熟悉制备此类人源化抗体片段的方法。
在具体的非限制性实例中，用于制备VEGFR-2特异性脲酶缀合物的抗体或其片段可以包含以下序列中的任一个(注意，除了SEQ ID NO之外，序列也由它们的内部名称定义，例如AB1、V21等。这些名称在本文中可互换使用，然而，如果对于识别哪个序列存在任何疑问，则应将SEQ ID NO视为最重要的定义)。
SEQ ID NO:2–AB1；V21；CDR加下划线
SEQ ID NO:3–V21H1；加粗的残基为用于连接脲酶的推定位置
SEQ ID NO:4–具有接头的AB1；V21H2
SEQ ID NO:5–具有接头的AB1m-2；V21H3
SEQ ID NO:6–AB1C；V21H4
SEQ ID NO:7–具有接头2的AB1；VR2-21
SEQ ID NO:8–AB1m
SEQ ID NO:9–具有接头的AB1m；V21N2K
SEQ ID NO:10–AB1m-2
SEQ ID NO:11–AB2；V18
SEQ ID NO:12–具有接头的AB2
SEQ ID NO:13–具有接头2的AB2；VR2-801-18
SEQ ID NO:14–V18H3
SEQ ID NO:15–AB2m
SEQ ID NO:16–具有接头的AB2m
SEQ ID NO:17–AB2m-2
SEQ ID NO:18–具有接头的AB2m-2；V18H2
SEQ ID NO:19–AB3；V45
SEQ ID NO:20–具有接头的AB3；V45H1
SEQ ID NO:21–具有接头2的AB3；VR2-801-45
SEQ ID NO:22–AB3m
SEQ ID NO:23–具有接头的AB3m；V45N2K
SEQ ID NO:24–V45H2
SEQ ID NO:25–AB4；V38
SEQ ID NO:26–具有接头的AB4
SEQ ID NO:27–具有接头2的AB4；VR2-38
SEQ ID NO:28–AB4m
SEQ ID NO:29–具有接头的AB4m
SEQ ID NO:30–AB4c；V38H3
或者与其至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％相同的序列，或者与其基本相同的序列。
这些序列可以由产生所述氨基酸序列的任何核酸序列编码，由于遗传密码的简并性，这会被理解。可以编码上述氨基酸序列的核酸序列的实例包括但不限于：
SEQ ID NO:31–AB1；V21
SEQ ID NO:32–AB1
SEQ ID NO:33–具有接头的AB1；V21H2
SEQ ID NO:34–具有接头2的AB1；VR2-21
SEQ ID NO:35–AB1c；V21H4
SEQ ID NO:36–AB1m-2
SEQ ID NO:37–具有接头的AB1m-2；V21H3
SEQ ID NO:38–AB2；V18
SEQ ID NO:39–AB2
SEQ ID NO:40–具有接头的AB2
SEQ ID NO:41–具有接头2的AB2；VR2-801-18
SEQ ID NO:42–AB2m-2
SEQ ID NO:43–具有接头的AB2m-2，V18H2
SEQ ID NO:44–AB3，V45
SEQ ID NO:45–AB3
SEQ ID NO:46–具有接头的AB3；V45H1
SEQ ID NO:47–具有接头2的AB3；VR2-801-45
SEQ ID NO:48–V45H2
SEQ ID NO:49–AB4；V38
SEQ ID NO:50–AB4
SEQ ID NO:51–具有接头的AB4
SEQ ID NO:52–具有接头2的AB4；VR2-38
SEQ ID NO:53–AB4c；V38H3
或者与其至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％相同的序列，或者与其基本相同的序列。
适合本发明的单结构域抗体的接头序列可以选自GSEQ(SEQ ID NO:54)、GSDEE(SEQ ID NO:55)、GSEEEDDDG(SEQ ID NO:56)、GSEEEDDDGKK(SEQ ID NO:57)、GSEQKGGGEEDDG(SEQ ID NO:58)、GSEQKLISEEDLNHHHHH(SEQ ID NO:59)、GSEQKLISEEDLNHHHHHH(SEQ ID NO:60)、GSEEDDDEEK(SEQ ID NO:61)、GSEQKGGGEEDDEE(SEQID NO:62)、GSEQKLISEEDLNGGGEDDEEG(SEQ ID NO:63)、GSEQKLISEEDLNGGGEDEG(SEQ IDNO:64)和GSEQKGGGDEDG(SEQ ID NO:65)。在多方面中，接头序列还可以包含C-末端半胱氨酸，例如GSEQKGGGEEDDGC(SEQ ID NO:66)、GSEQKLISEEDLNGGGEDDEEGC(SEQ ID NO:67)、GSEQKLISEEDLNGGGEDEGC(SEQ ID NO:68)和GSEQKGGGDEDGC(SEQ ID NO:69)。本文可以使用与这些接头序列类似的序列。例如，KK为合适的接头序列以及包含SEQ ID NO:54-69的序列中的任一个的那些序列。
基本相同的序列可以包含一个或多个保守氨基酸突变。本领域已知与参考序列相比，对参考序列的一个或多个保守氨基酸突变可以产生在生理、化学或功能特性上没有实质变化的突变肽；在这种情况下，参考序列和突变序列将被认为是“基本相同的”多肽。保守氨基酸突变可以包括氨基酸的加入、缺失或取代；保守氨基酸取代在本文中被定义为用氨基酸残基取代具有类似化学特性(例如大小、电荷或极性)的另一氨基酸残基。
在非限制性实例中，保守突变可以是氨基酸取代。这种保守氨基酸取代可以用碱性、中性、疏水性或酸性氨基酸取代同一组中的另一个氨基酸。术语“碱性氨基酸”意指侧链pK值大于7，在生理pH下通常带正电荷的亲水性氨基酸。碱性氨基酸包括组氨酸(His或H)、精氨酸(Arg或R)和赖氨酸(Lys或K)。术语“中性氨基酸”(也称为“极性氨基酸”)意指具有在生理pH下不带电，但具有至少一个键的侧链的亲水性氨基酸，在所述键中，两个原子共有的电子对更接近原子中的一个。极性氨基酸包括丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、半胱氨酸(Cys或C)、酪氨酸(Tyr或Y)、天冬酰胺(Asn或N)和谷氨酰胺(Gln或Q)。术语“疏水性氨基酸”(也称为“非极性氨基酸”)意指包括根据Eisenberg(1984)的标准化共有疏水性标度表现出大于零的疏水性的氨基酸。疏水性氨基酸包括脯氨酸(Pro或P)、异亮氨酸(Ile或I)、苯丙氨酸(Phe或F)、缬氨酸(Val或V)、亮氨酸(Leu或L)、色氨酸(Trp或W)、蛋氨酸(Met或M)、丙氨酸(Ala或A)和甘氨酸(Gly或G)。
“酸性氨基酸”是指侧链pK值小于7，在生理pH下通常带负电荷的亲水性氨基酸。酸性氨基酸包括谷氨酸(Glu或E)和天冬氨酸(Asp或D)。
序列同一性用于评价两条序列的相似性；其通过计算当两条序列为残基位置之间的最大对应性而进行比对时相同的残基百分比来确定。可以使用任何已知方法来计算序列同一性；例如，计算机软件可用于计算序列同一性。不希望是限制性的，可以通过软件，如由瑞士生物信息学研究所维护的NCBI BLAST2服务(以及在ca.expasy.org/tools/blast/中找到)，BLAST-P、Blast-N或FASTA-N，或者本领域已知的任何其它适当的软件计算序列同一性。
本发明的基本上相同的序列可以是至少85％相同的；在另一实例中，基本上相同的序列可以与本文描述的序列在氨基酸水平至少70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％(或其间的任何百分比)相同。在特定方面，基本上相同的序列保留了参考序列的活性和特异性。在非限制性实施方案中，序列同一性的差异可能是由于保守氨基酸突变。
本发明的单结构域抗体或其片段还可以包含另外的序列以帮助重组抗体或其片段的表达、检测或纯化。可以使用本领域技术人员已知的任何此类序列或标签。例如，并且不希望是限制性的，抗体或其片段可以包含靶向或信号序列(例如但不限于ompA)、检测标签、示例性标签盒(包括Strep标签)或其任何变体；参见，例如，美国专利第7,981,632号，His标签，具有序列基序DYKDDDDK的Flag标签，Xpress标签，Avi标签，钙调蛋白标签，聚谷氨酸盐标签(Polyglutamate tag)，HA标签，Myc标签，Nus标签，S标签，SBP标签，Softag 1，Softag 3，V5标签，CREB结合蛋白(CBP)，谷胱甘肽S-转移酶(GST)，麦芽糖结合蛋白(MBP)，绿色荧光蛋白(GFP)，硫氧还蛋白标签或它们的任何组合；纯化标签(例如，但不限于His5或His6)，或它们的组合。
在另一实例中，另外的序列可以是生物素识别位点，如WO95/04069中Cronan等人或WO/2004/076670中Voges等人描述的位点。也如本领域技术人员所知的，接头序列可以与另外的序列或标签结合使用。
更具体地，标签盒可以包含细胞外组分，其能够以高亲和力或亲合力特异性结合抗体。在单链融合蛋白结构中，标签盒可以位于(a)紧接连接头区域(connector region)的氨基末端，(b)插入接头模块之间并连接接头模块，(c)紧接结合结构域的羧基末端，(d)插入结合结构域(例如scFv)与效应结构域之间并将其连接，(e)插入结合结构域的亚基之间并将其连接，或(f)在单链融合蛋白的氨基末端。在某些实施方案中，一个或多个连接氨基酸可以设置在标签盒与疏水部分之间并将其连接，或者设置在标签盒与连接头区域之间并将其连接，或者设置在标签盒与接头模块之间并将其连接，或者设置在标签盒和连接结构域之间并将其连接。
另外，在多方面中，已知单结构域抗体如SEQ ID NO：2-30的抗体或其片段具有稳定性；它们在抗体工程中显示出色；由于尺寸小，具有优异的组织穿透能力。包含接头序列如SEQ ID NO：54-69或其片段的Fc-融合形式也有利于增加循环中的半衰期。
本发明的单结构域抗VEGFR-2抗体特异性结合VEGFR-2。可以基于亲和力和/或亲合力确定抗体特异性，其是指抗体对抗原的特定表位、抗体对VEGFR-2的选择性识别。由抗原与抗体解离的平衡常数(Kd)表示的亲和力测量抗原决定簇(表位)与抗体结合位点之间的结合强度。亲合力是抗体与其抗原之间结合强度的量度。抗体通常以10-5至10-11升/摩尔的Kd结合。任何大于10-4升/摩尔的Kd通常被认为表示非特异性结合。Kd的值越小，抗原决定簇和抗体结合位点之间的结合强度越强。在多方面中，本文描述的抗体的Kd小于10-4L/mol、10-5L/mol、10-6L/mol、10-7L/mol、10-8L/mol或10-9L/mol。
本发明的抗VEGFR-2抗体特异性结合VEGFR-2的细胞外区域，并且可以通过防止VEGFR-2的配体与受体结合来中和VEGFR-2的活化。在此类实施方案中，抗体至少与VEGFR-2的天然配体(例如，VEGF(A)(E)(C)和(D))一样强地结合VEGFR-2。
VEGFR-2的中和活化包括减少、抑制、失活和/或破坏与信号转导相关的一种或多种活性。此类活性包括受体二聚化、VEGFR-2的自磷酸化、VEGFR-2内部细胞质酪氨酸激酶结构域的活化，以及参与DNA合成(基因活化)和细胞周期进展或分裂的调节的多信号转导和反式激活途径的启动。VEGFR-2中和的一个量度是VEGFR-2的酪氨酸激酶活性的抑制。可以使用众所周知的方法测定酪氨酸激酶抑制，所述方法如磷酸化测定，其测量重组激酶受体的自磷酸化水平和/或天然或合成底物的磷酸化。例如，可以在ELISA测定中或在蛋白质印迹上使用对磷酸酪氨酸特异的抗体检测磷酸化。酪氨酸激酶活性的一些测定描述于Panek等人,J.Pharmacol.Exp.Them.,283:1433-44(1997)和Batley等人,Life ScL,62:143-50(1998)中，两者均通过引用并入。
此外，检测蛋白质表达的方法可以用于确定抗体是否中和VEGFR-2的活化，其中被测量的蛋白质受VEGFR-2酪氨酸激酶活性的调节。这些方法包括用于检测蛋白质表达的免疫组织化学(IHC)、用于检测基因扩增的荧光原位杂交(FISH)、竞争性放射性配体结合测定，固体基质印迹技术，如Northern和Southern印迹，逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)和ELISA。参见，例如Grandis等人,Cancer,78:1284-92.(1996)；Shimizu等人,JapanJ.Cancer Res.,85:567-71(1994)；Sauter等人,Am.J.Path.,148:1047-53(1996)；Collins,Glia,15:289-96(1995)；Radinsky等人,Clin.Cancer Res.,1:19-31(1995)；Petrides等人,Cancer Res.,50:3934-39(1990)；Hoffmann等人,Anticancer Res.,17:4419-26(1997)；Wikstrand等人,Cancer Res.,55:3140-48(1995)，将其全部通过引用并入。
体内测定也可以用于检测VEGFR-2中和。例如，在存在和不存在抑制剂的情况下，可以使用受体配体刺激的细胞系，通过促有丝分裂测定来观察受体酪氨酸激酶抑制。例如，用VEGF(A)或VEGF-B刺激的HUVEC细胞(ATCC)可以用于测定VEGFR-2抑制。另一种方法涉及使用例如注射到小鼠中的人肿瘤细胞测试表达VEGF的肿瘤细胞生长的抑制。参见例如美国专利第6,365,157号(Rockwell等人)，将其通过引用并入。
本发明不受VEGFR-2中和的任何特定机制的限制。本发明的单结构域抗VEGFR-2抗体可以例如外部结合VEGFR-2，阻断和/或竞争配体与VEGFR-2的结合，抑制随后经由受体相关的酪氨酸激酶介导的信号转导，并防止信号转导级联中VEGFR-2和其它下游蛋白质的磷酸化。也可以内化和降解受体-抗体复合物，导致受体细胞表面下调。
编码本发明的抗VEGFR-2抗体的多核苷酸包括具有这样的核酸序列的多核苷酸，所述核酸序列与本发明的多核苷酸的核酸序列基本上相同。“基本上相同的”核酸序列在本文中被定义为当两条序列最佳对比(具有适当的核苷酸插入或缺失)，并比较以确定两条序列之间核苷酸的精确匹配时，与另一核酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％同一性的序列。
编码抗体片段的合适DNA来源包括表达全长抗体的任何细胞，如杂交瘤和脾细胞。如上所述，片段可以本身用作抗体等同物，或者可以重组成等同物。本节中描述的DNA缺失和重组可以通过已知的方法进行，如在上文标题为“抗体的功能等同物”的节中列出的公开专利申请中描述的那些和/或其它标准重组DNA技术，如下文描述的那些。另一种DNA来源为由噬菌体展示文库产生的单链抗体，如本领域已知的。
另外，本发明提供了表达载体，其含有与表达序列、启动子和增强子序列可操作连接的先前所述的多核苷酸序列。已经开发了用于在诸如细菌的原核系统和真核系统(包括但不限于酵母和哺乳动物细胞培养系统)中有效合成抗体多肽的多种表达系统。本发明的载体可以包含染色体、非染色体和合成的DNA序列的区段。
可以使用任何合适的表达载体。例如，原核克隆载体包括来自大肠杆菌的质粒，如colEl、pCRl、pBR322、pMB9、pUC、pKSM和RP4。原核载体还包括噬菌体DNA如M13和其它丝状单链DNA噬菌体的衍生物。可用于酵母的载体的实例是2μ质粒。用于在哺乳动物细胞中表达的合适载体包括以下众所周知的衍生物：SV-40、腺病毒、逆转录病毒衍生的DNA序列以及衍生自功能性哺乳动物载体(如上述那些)和功能性质粒和噬菌体DNA的组合的穿梭载体。
另外的真核表达载体为本领域已知的(例如，P J.Southern&P.Berg,J.Mol.Appl.Genet,1:327-341(1982)；Subramani等人,Mol.Cell.Biol,1:854-864(1981)；Kaufinann&Sharp,"Amplification And Expression of Sequences Cotransfected witha Modular Dihydrofolate Reductase Complementary DNA Gene,"J.Mol.Biol,159:601-621(1982)；Kaufhiann&Sharp,Mol.Cell.Biol,159:601-664(1982)；Scahill等人,"Expression And Characterization Of The Product Of A Human Immune InterferonDNA Gene In Chinese Hamster Ovary Cells,"Proc.Nat'l Acad.Sci USA,80:4654-4659(1983)；Urlaub&Chasin,Proc.Nat'l Acad.Sci USA,77:4216-4220,(1980)，将其全部通过引用并入本文)。
可用于本发明的表达载体含有至少一个表达控制序列，其与待表达的DNA序列或片段可操作连接。将控制序列插入载体中以控制和调节克隆的DNA序列的表达。有用的表达控制序列的实例是lac系统，trp系统，tac系统，trc系统，噬菌体λ的主要操纵子和启动子区，fd外壳蛋白的控制区，酵母的糖酵解启动子，例如3-磷酸甘油酸激酶的启动子，酵母酸性磷酸酶的启动子，例如Pho5，酵母α-交配因子的启动子，以及来源于多瘤病毒、腺病毒、逆转录病毒和猿猴病毒的启动子，例如SV40的早期和晚期启动子和已知控制原核或真核细胞及其病毒或其组合的基因表达的其它序列。
本发明还提供了含有先前所述的表达载体的重组宿主细胞。本发明的单结构域抗VEGFR-2抗体可以在除杂交瘤之外的细胞系中表达。包含编码根据本发明的多肽的序列的核酸可以用于合适的哺乳动物宿主细胞的转化。
基于高水平的表达、目标蛋白的组成型表达和来自宿主蛋白质的最小污染来选择特别优选的细胞系。可用作表达宿主的哺乳动物细胞系是本领域众所周知的，包括许多永生化细胞系，如但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞和许多其它细胞系。合适的另外的真核细胞包括酵母和其它真菌。有用的原核宿主包括，例如，大肠杆菌，如大肠杆菌SG-936、大肠杆菌HB101、大肠杆菌W3110、大肠杆菌X1776、大肠杆菌X2282、大肠杆菌DHI和大肠杆菌MRC1，假单胞菌，芽孢杆菌，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和链霉菌。
这些本发明的重组宿主细胞可以用于通过以下来产生sdAb：在允许抗体表达的条件下培养细胞，并从宿主细胞或宿主细胞周围的培养基中纯化抗体。可以通过在目标抗体编码基因的5’端插入信号或分泌前导肽编码序列来促进重组宿主细胞中的表达抗体靶向分泌(参见,Shokri等人,(2003)Appl Microbiol Biotechnol.60(6):654-664,Nielsen等人,Prot.Eng.,10:1-6(1997)；von Heinje等人,Nucl.Acids Res.,14:4683-4690(1986)，将其全部通过引用并入本文)。这些分泌前导肽元件可以来源于原核或真核序列。因此，使用合适的分泌前导肽(其是与多肽的N-末端连接的氨基酸)以指导多肽从宿主细胞细胞溶质中移出并分泌到培养基中。
本发明的抗VEGFR-2单结构域抗体可以与另外的氨基酸残基融合。此类氨基酸残基可以是例如肽标签以促进分离。还考虑了用于将抗体归巢到特定器官或组织的其它氨基酸残基。
在另一个实施方案中，本发明提供了通过向有需要的哺乳动物施用治疗有效量的根据本发明的单结构域抗VEGFR-2单结构域抗体来治疗癌症的方法。治疗有效的意指产生期望的治疗效果，如减少血管生成和/或降低或减缓肿瘤生长有效的量。
在一方面中，本发明提供了通过向有需要的哺乳动物施用治疗有效量的本发明的单结构域抗VEGFR-2抗体来降低肿瘤生长或抑制血管生成的方法。
关于降低肿瘤生长，此类肿瘤包括原发性肿瘤和转移性肿瘤，以及难治性肿瘤。难治性肿瘤包括对其它形式的治疗，如用单独的化疗剂、单独的抗体、单独的放射或它们的组合的治疗没有反应或具有抗性的肿瘤。难治性肿瘤还涵盖这样的肿瘤，其通过用此类药剂治疗看起来被抑制，但在中断治疗之后长达五年，有时长达十年或更长复发。
本发明的缀合物可用于治疗表达VEGFR-2的肿瘤。此类肿瘤典型地对其环境中存在的VEGF敏感，并且可以在自分泌刺激环中进一步产生VEGF并被其刺激。因此，该方法可以有效治疗未血管化或尚未实质血管化的实体瘤或非实体瘤。
可以相应治疗的实体瘤的实例包括乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胶质瘤和淋巴瘤。此类肿瘤的一些实例包括表皮样肿瘤，鳞状肿瘤，如头颈肿瘤，结肠直肠肿瘤，前列腺肿瘤，乳腺肿瘤，肺肿瘤，包括小细胞和非小细胞肺肿瘤，胰腺肿瘤，甲状腺肿瘤，卵巢肿瘤和肝肿瘤。
关于抑制血管生成，本发明的缀合物可以有效治疗患有血管化肿瘤或赘生物，或以过度血管生成为特征的血管生成疾病的对象。在多方面中，本文描述的抗体也可以有效预防原发性或转移性肿瘤的血管化。此类肿瘤和赘生物包括例如恶性肿瘤和赘生物，如胚细胞瘤、癌或肉瘤，以及高度血管性肿瘤和赘生物。可以通过本发明的方法治疗的癌症包括例如脑癌、泌尿生殖道癌、淋巴系统癌、胃癌、肾癌、结肠癌、喉癌和肺癌及骨癌。非限制性实例还包括表皮样肿瘤，鳞状肿瘤，如头颈肿瘤，结肠直肠肿瘤，前列腺肿瘤，乳腺肿瘤，肺肿瘤，包括肺腺癌及小细胞和非小细胞肺肿瘤，胰腺肿瘤，甲状腺肿瘤，卵巢肿瘤和肝肿瘤。
以过度血管生成为特征的涉及例如炎症和/或血管化的病理性血管生成病况的非限制性实例包括动脉粥样硬化，类风湿性关节炎(RA)，新生血管性青光眼，增殖性视网膜病，包括增殖性糖尿病性视网膜病，黄斑变性，血管瘤，血管纤维瘤和银屑病。非肿瘤性血管生成疾病的其它非限制性实例为早产儿视网膜病(晶状体后纤维形成)，角膜移植物排斥，胰岛素依赖性糖尿病，多发性硬化症，重症肌无力，克罗恩病，自身免疫性肾炎，原发性胆汁性肝硬化，银屑病，急性胰腺炎，异体排斥，过敏性炎症，接触性皮炎和迟发型超敏反应，炎症性肠病，败血性休克，骨质疏松症，骨关节炎，神经元炎症诱导的认知缺陷，Osier-Weber综合征，再狭窄以及真菌、寄生虫和病毒感染，包括巨细胞病毒感染。
可通过本文描述的缀合物可治疗的医学病况的鉴定完全在本领域技术人员的能力和知识范围内。例如，患有临床上显著的肿瘤或血管生成疾病或者处于发展临床显著症状风险的人类个体适合施用本发明的缀合物。如果个体是此类治疗的候选者，则本领域的临床医师可以例如，通过使用临床测试、身体检查和医学/家族史容易地确定。
本文描述的缀合物可以以足以防止、抑制或减少肿瘤或血管生成相关的病理学病况进展的量施用至患有该肿瘤或病理学病况的患者用于治疗性治疗。进展包括例如肿瘤或病理学病况的生长、侵袭、转移和/或复发。对此用途有效的量将取决于疾病的严重程度和患者自身免疫系统的一般状况。给药安排也将随着患者的疾病状况和状态而变化，并且范围通常从每天单次推注剂量或连续输注到多次施用(例如，每4-6小时)，或者由治疗医师和患者的病况指示。然而，应注意，本发明不限于任何特定剂量。
在另一个实施方案中，本发明提供了通过施用与一种或多种其它药剂组合的本文描述的缀合物来治疗期望降低血管生成的病况的方法。例如，本发明的实施方案提供了通过施用本发明的缀合物和抗肿瘤剂或抗血管生成剂来治疗此种病况的方法。缀合物可以与一种或多种抗肿瘤剂或抗血管生成剂化学或生物合成地连接。
可以使用任何合适的抗肿瘤剂，如化疗剂或放射。化疗剂的实例包括但不限于顺铂、卡铂、培美曲塞、阿霉素、环磷酰胺、紫杉醇、伊立替康(CPT-II)、拓扑替康或它们的组合。当抗肿瘤剂是放射时，放射源对于被治疗的患者可以是外部的(外束放射治疗-EBRT)或内部的(近距离放射治疗-BT)。
此外，本发明提供了通过施用与一种或多种合适的佐剂(如例如细胞因子(例如IL-10和IL-13))或其它免疫刺激剂组合的本发明的缀合物来治疗医学病况的方法。
在联合治疗中，缀合物可以在用另一种药剂开始治疗之前、期间、或之后、以及它们的任何组合，即在开始抗肿瘤剂治疗之前和期间、之前和之后、期间和之后、或之前、期间和之后施用。例如，本发明的缀合物可以在开始放射治疗之前的1至30天，在多方面中为3至20天，在其它方面中为5至12天施用。然而，本发明不限于任何特定的施用安排。施用的其它药剂的剂量取决于许多因素，包括例如药剂的类型、所治疗的医学病况的类型和严重程度以及药剂的施用途径。然而，本发明不限于任何特定剂量。
可以使用任何合适的方法或途径来施用本发明的缀合物，并且任选地，共施用抗肿瘤剂和/或其它受体的拮抗剂。施用途径包括例如口服施用、静脉内施用、腹膜内施用、皮下施用或肌肉内施用。然而，应该强调的是，本发明不限于任何特定的方法或施用途径。
应理解，本发明的缀合物(其在哺乳动物中用于预防或治疗目的时)将以另外包含药学可接受的载体的组合物的形式施用。合适的药学可接受的载体包括，例如，一种或多种水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等，以及它们的组合。药学可接受的载体还可以包含少量辅助物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增强结合蛋白的保质期或有效性。如本领域所众所周知的，可以配制注射组合物以在施用至哺乳动物之后提供活性成分的快速、持续或延迟释放。
尽管人抗体特别用于施用至人，但它们也可以施用至其它哺乳动物。本文使用的术语“哺乳动物”旨在包括但不限于人、实验室动物、家养宠物和农场动物。
本发明还包括用于抑制肿瘤生长和/或血管生成的试剂盒，其包含治疗有效量的本发明的缀合物。试剂盒还可以含有，例如，参与肿瘤发生或血管生成的另一种生长因子受体的任何合适的拮抗剂。可选地或此外，本发明的试剂盒还可以包含抗肿瘤剂。本文已经描述了本发明上下文中合适的抗肿瘤剂的实例。本发明的试剂盒还可以包含佐剂，其实例也已在上文中描述。试剂盒可以包含说明书。
抗体-脲酶缀合
本发明涉及抗体-脲酶缀合物，在多方面中，抗体-脲酶缀合物为特异性结合VEGFR-2的单结构域抗VEGFR-2脲酶缀合物。开发的单结构域抗VEGFR-2脲酶缀合物可用于治疗具有表达VEGFR-2的肿瘤的对象。不受理论束缚，脲酶调节肿瘤微环境，将天然存在的脲酶促转化为氨，这有助于使肿瘤缩小。单结构域抗VEGFR-2有助于使脲酶靶向肿瘤微环境并有助于阻止VEGFR-2活化，VEGFR-2活化通常导致血管生成。
本发明提供了药物组合物，其包含适合于静脉内注射的药学可接受的水溶液和基本上不含或不含未缀合的抗体的单结构域抗VEGFR-2脲酶缀合物，并且不含非水性HPLC溶剂。非水性HPLC溶剂包括通常用于制备型HPLC或HPLC纯化的有机溶剂，如甲醇、乙腈、三氟乙酸等。在一些方面，抗体-脲酶缀合物基本上不含来自磷酸盐缓冲液的的磷酸盐。在一些方面，含有10mM磷酸盐、50mM NaCl pH 7.0的磷酸盐缓冲液用于SEC纯化。在一些方面，在抗体-脲酶缀合物的制备生产中不进行HPLC纯化。
在一些方面，缀合物的缀合比为每脲酶部分约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个抗体部分。在一些方面，缀合物的缀合比为每脲酶部分约2至10个抗体部分。在一些方面，缀合物的缀合比为每脲酶部分约2至约9个抗体部分，在方面中为9.2。在一些方面，缀合物的平均缀合比为每脲酶部分约6或更多个抗体部分。在一些方面，缀合物的平均缀合比为每脲酶部分约8、9、10或11个抗体部分。
在一些方面，连接是共价键或直接连接，其中脲酶上的反应性官能团结合抗体上的互补反应性官能团，如例如赖氨酸中的氨基(N3/4)官能团结合例如天冬氨酸或谷氨酸的羧基(COOH)官能团，或半胱氨酸的巯基(SH)。应理解，这种反应可能需要羧基的常规修饰以使其更具反应性。
反应性官能团可以是相同的，如草酸、琥珀酸等，或者可以是正交官能团，如氨基(其在缀合之后变为NH)和羧基(其在缀合之后变为CO或COO)。
可选地，可以将抗体和/或脲酶衍生化以暴露或连接另外的反应性官能团。衍生化可以涉及连接许多接头分子，如可从Pierce Chemical Company,Rockford 111获得的那些中的任一种。
如本文所用，“接头”为用于将靶向部分与活性剂，如抗体与脲酶连接的分子。接头能够与靶向部分和活性剂形成共价键。合适的接头为本领域技术人员众所周知的，并且包括但不限于直链或支链碳接头、杂环碳接头或肽接头。当靶向部分和活性剂分子为多肽时，接头可以通过它们的侧基(例如，通过与半胱氨酸的二硫键连接)与组成氨基酸连接。在一个优选的方面，接头将与末端氨基酸的α碳氨基和羧基连接。在一些方面，连接是通过具有两个或更多个官能团如羧基或氨基的接头，所述官能团允许所述接头与脲酶和抗体均反应。接头为本领域众所周知的，并且通常包含1-20个原子，包括碳、氮、氢、氧、硫等。
具有与脲酶上的基团反应的一个官能团和与抗体反应的另一个基团的双官能接头可以用于形成期望的免疫缀合物。可选地，衍生化可以涉及靶向部分的化学处理，例如用高碘酸盐对糖蛋白抗体的糖部分进行二醇切割以产生游离醛基。抗体上的游离醛基可以与试剂上的游离胺或肼基团反应以使试剂与其结合(参见美国专利第4,671,958号)。在诸如抗体或抗体片段的多肽上产生游离巯基的程序也是已知的(参见美国专利第4,659,839号)。
其它接头分子及其用途包括例如欧洲专利申请第188,256号；美国专利第4,671,958号、第4,659,839号、第4,414,148号、第4,699,784号；第4,680,338号；第4,569,789号；和第4,589,071号；以及Borlinghaus等人.(1987)Cancer Res.47:4071-4075中描述的那些。
在一些方面，连接在靶位点处或其附近是可切割的，并且当缀合物分子已到达其靶位点时，脲酶从靶向部分释放。切割连接以从靶向部分释放脲酶可以通过缀合物在靶细胞内或靶位点附近所经受的酶活性或者条件来促进。在一些方面，可以使用这样的接头，其在肿瘤部位存在的条件下可切割(例如，当暴露于肿瘤相关的酶或酸性pH时)。
可切割接头包括在例如美国专利第4,618,492号；第4,542,225号和第4,625,014号中描述的那些。从这些接头基团释放活性剂的机制包括，例如，对光不稳定性键的照射和酸催化的水解。美国专利第4,671,958号例如包括对包含接头的免疫缀合物的描述，所述接头通过患者补体系统的蛋白水解酶在体内的靶位点处切割。在一些方面，合适的接头是氨基酸的残基或者由两个或更多个氨基酸组成的肽间隔子。
在一些方面，合适的接头为R1-L-R2，其中R1和R2为相同或不同的官能团，其中之一与抗体连接，并且另一个与脲酶连接。R1和R2可以独立地选自但不限于-NH-、-CO-、-COO-、-O-、-S-、-NHNH-、-Ν＝Ν-、＝N-NH-等。L可以为直链或支链烃链，如烷基链，其中一个或多个碳任选地被氧、氮、酰胺、硫、亚砜、砜、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基等替换。在一些方面，接头可以为氨基酸残基或肽。在一些情况下，接头是酶或靶位点处或接近靶位点的pH变化可切割的。适合于制备缀合物的某些接头和程序描述于美国专利第4,414,148号、第4,545,985号、第4,569,789号、第4,671,958号、第4,659,839号、第4,680,338号、第4,699,784号、第4,894,443号和第6,521,431号。
在一些方面，接头为
其中～～～和-------代表抗体或脲酶的连接点。在一些方面，～～～～代表与抗体的氨基的连接点，并且-----代表与脲酶的硫基中的S原子的连接点。该接头为使用连接剂SIAB(N-琥珀酰亚胺基(4-碘代乙酰基)氨基-苯甲酸酯(盐))将抗体和脲酶缀合的残基。在一些方面，超纯化为适用于使用SIAB作为交联剂的缀合方法的分离方法。
在一些方面，接头为使用下式连接剂的残基：
其中X为溴或碘，并且L为本文描述的接头。
在一些方面，连接剂为SBAP(琥珀酰亚胺基3-[溴乙酰胺基]丙酸酯(盐))或SIA(N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(盐))，其可以在与SIAB类似的条件下(例如，不需要HPLC色谱纯化且可能仅需要超滤)用于缀合。在一些方面，SIAB(10.6Anstrong)的连接臂长度比SBAP(6.2A)和SIA(1.5A)的连接臂长度更适合/易反折(reflexable)。在一些方面，连接剂为SPDP(琥珀酰亚胺基3-(吡啶基二硫基)丙酸酯(盐))、SMPT(琥珀酰亚胺基氧基羰基-甲基-(2-吡啶基二硫基)甲苯)或SMCC(琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-羧酸酯(盐))，其可以用于缀合，但可能需要多于一种分离方法，如IEC和乙醇分级分离，以较低的产率从缀合反应溶液中分离未反应的脲酶。
更进一步地，另外的组分，如但不限于治疗剂，如抗癌剂，也可以与抗体结合，以进一步增强治疗效果。
脲酶
许多研究提供了关于来自各种进化上不同的细菌、植物、真菌和病毒的脲酶遗传学的详细信息(Mobley,H.L.T.等人.(1995)Microbiol.Rev.59:451-480；Eur J.Biochem.,175,151-165(1988)；Labigne,A.(1990)，国际公开号WO 90/04030；Clayton,C.L.等人.(1990)Nucleic Acid Res.18,362；和美国专利第6,248,330号和第5,298,399号，将其各自通过引用并入本文)。特别感兴趣的是在植物中发现的脲酶(Sirko,A.and Brodzik,R.(2000)Acta Biochim Pol 47(4):1189-95)。一种示例性植物脲酶为刀豆脲酶。其它有用的脲酶序列可以在公共数据库，例如Entrez(ncbi.nlm.nih.gov/Entrez)中鉴定。
在一些方面，脲酶为刀豆脲酶。刀豆脲酶具有以下示出的SEQ ID NO:78的氨基酸序列：
有用的脲酶序列可以在公共数据库，例如Entrez(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez)中鉴定。另外，可以如Baker,K.M.和Collier,J.L.(http://www.science.smith.edu/departments/Biology/lkatz/NEMEB_webp age/abstracts.html)所述，或者使用Rose等人.(1998)Nucl.Acids Res.26:1628中所述的CODEHOP(COnsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primer)，利用可用于扩增来自多种有机体的脲酶的引物。
脲酶可以将底物脲转化为氨和氨基甲酸酯。这种酶活性可以提高pH值，使环境更加呈碱性。癌细胞周围的环境通常是酸性的(Webb,S.D.,等人.(2001)Novartis FoundSymp 240:169-81)。因此，通过以这种方式提高细胞外环境的pH，抑制癌细胞的生长。因此，在本技术的某些方面添加抗体-脲酶缀合物导致间质液的pH升高约0.1pH单位，例如0.1-0.5pH单位或更高。
本技术的脲酶包括天然存在形式的脲酶及其功能活性变体。考虑了两种一般类型的氨基酸序列变体。氨基酸序列变体是在特定氨基酸中具有不破坏脲酶活性的一个或多个取代的变体。这些变体包括沉默变体和保守修饰的变体，其与天然蛋白质基本上同源且功能上等同。当天然蛋白质变体的氨基酸序列的至少约80％,，更优选至少约90％，甚至更优选至少约95％，甚至更优选98％，且最优选至少约99％与天然蛋白质的氨基酸序列相同时，天然蛋白质的变体与天然蛋白质“基本上同源”。变体可以相差少至1个或多达10个或更多个氨基酸。
第二类的变体包括脲酶的大小变体，其是脲酶的分离的活性片段。大小变体可以通过例如使脲酶片段化、通过化学修饰、通过蛋白水解酶消化或其组合形成。另外，基因工程技术以及直接从氨基酸残基合成多肽的方法可用于产生大小变体。
“功能上等同的”意指变体的序列限定这样的链，其产生具有与天然脲酶基本上相同的生物学活性的蛋白质。包含大量序列变异的这些功能上等同的变体也涵盖在本技术中。因此，天然脲酶蛋白质的功能上等同的变体将具有治疗上有用的足够的生物学活性。本领域中有可用于确定功能等同的方法。可以使用专门设计用于测量天然脲酶蛋白质活性的测定来测量生物学活性。另外，可以测试针对生物学活性天然蛋白质产生的抗体结合功能上等同的变体的能力，其中有效结合指示蛋白质具有与天然蛋白质相似的构象。
本技术的脲酶蛋白质序列，包括保守取代的序列，可以以较大多肽序列的一部分存在，如在添加用于纯化蛋白质的一个或多个结构域时(例如，聚His区段、FLAG标签区段等)出现，其中另外的功能结构域对蛋白质的脲酶蛋白质部分的活性具有很小的影响或没有影响，或者其中另外的结构域可以通过合成后处理步骤，如用蛋白酶处理除去。
添加不改变本技术的核酸分子的编码活性的一个或多个核酸或序列，如添加非功能性序列，是基本核酸分子的保守变异，以及添加不改变本技术的多肽活性的一个或多个氨基酸残基是基本多肽的保守变异。这两种类型的添加均是本技术的特征。本领域普通技术人员会理解，所公开的核酸构建体的许多保守变异产生功能上相同的构建体。
可以使用多种确定序列关系的方法，包括手动比对及计算机辅助的序列比对和分析。由于计算机辅助方法提供的通量增加，后一种方法是本技术中的优选方法。用于进行序列比对的各种计算机程序是可用的，或者可以由技术人员产生。
如上所述，本技术中使用的核酸和多肽(及其片段)的序列不必相同，但可以与本技术的脲酶多肽或核酸分子(或其片段)或相关分子的相应序列基本相同(或基本相似)。例如，多肽可以进行各种变化，如一个或多个氨基酸或核酸插入、缺失和取代(保守或非保守的)，包括其中例如这样的变化可能在其使用，例如，在其治疗或施用应用中提供某些优势。
靶向部分
将靶向部分考虑作为本技术的化学实体，并且该靶向部分结合限定的、选定的细胞类型或靶细胞群，如癌细胞。
本公开的靶向部分为抗体、肽、寡核苷酸等，其与靶细胞表面上的VEGFR-2反应。可以使用多克隆抗体和单克隆抗体。抗体可以是完整抗体或其片段。单克隆抗体和片段可以根据常规技术产生，如杂交瘤合成、重组DNA技术和蛋白质合成。有用的单克隆抗体和片段可以来源于任何物种(包括人)，或者可以形成为使用来自多于一个物种的序列的嵌合蛋白。
在一些方面，靶向部分为人源化人抗体或非人抗体。在一些方面，靶向部分为单结构域抗体。在一些方面，单结构域抗体(sdAb)或“VHH”是指可以在天然缺乏轻链的骆驼科哺乳动物中发现的类型的抗体的单个重链可变结构域。在一些方面，单结构域抗体可以来源于VH区、VHH区或VL区。在一些方面，单结构域抗体为人来源的。
在多方面中，靶向部分(例如，抗体)对由癌、白血病、淋巴瘤和肉瘤表达的VEGFR-2具有特异性。癌可以是肛门癌、胆道癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、口咽癌、下咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、胆囊癌和胆管癌、小肠癌、泌尿道癌、卵巢癌、结肠癌、非小细胞肺癌癌、生殖道癌、内分泌腺癌、甲状腺癌和皮肤癌。在一些方面，VEGFR-2由类癌肿瘤，胃肠道间质瘤，头颈肿瘤，原发性肿瘤，血管瘤，黑色素瘤，恶性间皮瘤，多发性骨髓瘤和脑、神经、眼睛和脑膜的肿瘤表达。在一些方面，靶向部分(例如，抗体)对由癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌和结肠癌表达的VEGFR-2具有特异性。在一些方面，靶向部分(例如，抗体)对由非小细胞肺癌表达的VEGFR-2具有特异性。
在一些方面，单结构域抗体对在肿瘤细胞上具有增加的表达的VEGFR-2具有特异性。在一些方面，抗体对VEGFR-2具有高于约1x 10-6M的数值的结合亲和力。在一些方面，缀合物对VEGFR-2具有不超过约1x 10-8M、1x 10-9M、1x 10-10M或1x 10-20M的Kd数值的结合亲和力。
在多方面中，抗体为单结构域骆驼科动物抗体(包含本文描述的SEQ ID No:2-30中的任一个)，其识别癌细胞上的VEGFR-2。在一些方面，抗体包含多肽，其包含至少对SEQID NO.2-30中任一个氨基酸序列的至少一个修饰。
在多方面中，缀合物对VEGFR-2具有结合亲和力，其中IC50值不超过约10nM。在一些方面，缀合物对VEGFR-2具有结合亲和力，其中IC50值不超过约5nM。在一些方面，缀合物对VEGFR-2具有结合亲和力，其中IC50值不超过约4nM。在一些方面，IC50值为约3.22nM。在一些方面，缀合物以约10-30μg/mL的IC50值结合VEGFR-2。在一些方面，缀合物以约20μg/mL的IC50值结合VEGFR-2。可以根据本文描述或本领域已知的方法确定抗体或缀合物与靶抗原的结合亲和力。在一些方面，本技术描述了该抗VEGFR-2-脲酶缀合物(VDOS47)。
人源化靶向部分能够降低宿主受体中抗体或多肽的免疫反应性，允许半衰期增加和不利免疫反应减少。鼠单克隆抗体可以通过以下人源化：例如将编码鼠Fv区或其互补决定区的核苷酸序列与编码人恒定结构域区和Fc区的核苷酸序列进行遗传重组。鼠残基也可以保留在人可变区框架结构域内，以确保适当的靶位点结合特征。用于将各种活性剂递送至癌细胞的基因工程化抗体参见Bodey,B.(2001)Expert Opin Biol.Ther.1(4):603-17中。
编码本文示出的抗体或脲酶的DNA可以通过任何合适的方法制备，包括例如适当序列的克隆和限制，或通过诸如以下方法的直接化学合成：Narang等人.(1979)Meth.Enzymol.68:90-99的磷酸三酯方法；Brown等人.(1979)Meth.Enzymol.68:109-151的磷酸二酯方法；Beaucage等人.(1981)Tetra.Lett.,22:1859-1862的二乙基亚磷酰胺方法；和美国专利第4,458,066号的固体支持方法。
化学合成产生单链寡核苷酸。这可以通过与互补序列杂交或通过使用单链作为模板用DNA聚合酶聚合而转化为双链DNA。技术人员会认识到，尽管DNA的化学合成限于约100个碱基的序列，但通过连接较短的序列可以获得较长的序列。
可选地，可以克隆子序列，并使用适当的限制酶切割适当的子序列。然后可以连接片段以产生期望的DNA序列。
制备抗体-脲酶缀合物的方法
本技术提供了制备组合物的方法，所述组合物包含抗体-脲酶缀合物并且基本上不含未缀合的脲酶，如基于抗体-脲酶缀合物的重量不超过约5％、4％、3％、2％或1％的脲酶，所述方法包括(1)在活化的抗体和脲酶基本上不反应(如每小时不超过10％、5％或1％的反应)的溶剂中将活化的抗体和脲酶组合，以形成反应混合物，其中活化的抗体和脲酶在溶剂中的分布是均匀的，以及(2)改变(1)的混合物的特性，使得活化的抗体容易与脲酶反应以形成抗体-脲酶缀合物。在一些方面，(1)的混合物的特性是pH值。在一些方面，改变(1)的混合物的特性包括将pH增加至活化的抗体容易与脲酶反应以形成抗体-脲酶缀合物的值。在一些方面，活化的抗体，例如，至少90％或至少95％的活化的抗体，容易与(2)中的脲酶以这样的速率反应：在改变混合物的特性之后，混合物基本上不含未缀合的脲酶约6小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、或约1小时。
在一些方面，所述方法包括在pH为约6.0-7.0，如约6.5的酸性水性缓冲液中将活化的抗体和脲酶组合，将pH调节至约8.0-9.0，如约8.3的碱性pH，以形成抗体-脲酶缀合物，以及通过超渗滤纯化抗体-脲酶缀合物，其中所述方法不包括色谱纯化步骤。在一些方面，水性缓冲液的pH为约5至8。在一些方面，在酸性水性缓冲液中将活化的抗体和脲酶组合。在一些方面，活化的抗体和脲酶的比例为约3至约12。在一些方面，抗体-脲酶缀合物的缀合比为每脲酶部分6-15个抗体部分。在一些方面，抗体-脲酶缀合物的缀合比为每脲酶部分8-11个抗体部分。在一些方面，pH调节剂为缓冲剂或缓冲溶液。在一些方面，pH调节剂包括以下的一种或多种：盐酸、硫酸、硝酸、硼酸、碳酸、重碳酸(bicarbonic acid)、葡萄糖酸、氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、柠檬酸、单乙醇胺、乳酸、乙酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、磷酸、甲磺酸、苹果酸、丙酸、三氟乙酸、它们的盐或它们的组合。在一些方面，缓冲剂包括以下的一种或多种：甘氨酸、乙酸、柠檬酸、硼酸、邻苯二甲酸、磷酸、琥珀酸、乳酸、酒石酸、碳酸、盐酸、氢氧化钠、它们的盐或它们的组合。在一些方面，缓冲溶液包括以下的一种或多种：甘氨酸盐酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、磷酸盐-乙酸盐-硼酸盐缓冲液、邻苯二甲酸盐缓冲液或它们的组合。在一些方面，缓冲液不是磷酸盐缓冲液。在一些方面，酸性缓冲液为乙酸钠缓冲液。在一些方面，通过包括添加碱水溶液如硼酸钠溶液(例如，0.1-5M，或1M)的方法将pH调节至碱性pH。不希望受理论束缚，乙酸钠缓冲液具有低缓冲能力，并且适合于通过pH 8.5，1M硼酸盐缓冲液将pH调节至8.3。在一些方面，Tris-HCl缓冲液(例如，1M Tris-HCl)用于将混合物调节至pH 8-9，例如8.3。
在一些方面，反应时间和抗体/脲酶比保持为常数。在一些方面，反应混合物中抗体/脲酶的摩尔比为约25或约21、或约1.8至12个抗体/脲酶。在一些方面，将抗体/脲酶摩尔比从4调节至25。在一些方面，抗体/脲酶摩尔比为至少2。
在一些方面，在诸如超渗滤的纯化之后混合物中存在不超过1％或2％的未反应抗体。在一些方面，可以使用其它非HPLC纯化方法。例如，乙醇结晶/分级分离可以用于纯化，产率较低。在一些方面，抗体的分子量不超过50kDa，如约10-20kDa、或约13kDa，并且纯化是超渗滤。在一些方面，所述方法以总蛋白质的至少约60重量％、总蛋白质的约70重量％、总蛋白质的约80重量％、或总蛋白质的至少约90重量％的产率提供抗体-脲酶缀合物。总蛋白质意为脲酶和sd抗VEGFR-2抗体的组合量(在重量上)。在一些方面，在纯化之前，不超过10-20％(以总蛋白质重量计)的未缀合的抗体保留在反应混合物中。
本技术提供了稳定的组合物，其包含在酸性水性溶剂中的活化的抗体和脲酶(如上所述)并且基本上不含抗体-脲酶缀合物，如基于脲酶的重量不超过约5％、4％、3％、2％或1％的抗体-脲酶缀合物。本技术还提供了这样的组合物，其包含抗体-脲酶缀合物并且基本上不含未缀合的脲酶，如基于水性溶剂中抗体-脲酶缀合物的重量不超过约5％、4％、3％、2％或1％的脲酶，其中水性溶剂的pH为约8-9，例如8.3(如上所述)。在一些方面，包含抗体-脲酶缀合物的组合物还包含不超过总抗体(活化的抗体和未反应的抗体)的约40至60％的未缀合抗体。在一些方面，包含抗体-脲酶缀合物的组合物还包含不超过总蛋白质约10至20％的未缀合抗体。
由于脲酶在体内导致氨(其具有全身毒性并且本身不靶向肿瘤)的释放，因此未缀合的脲酶的存在增加了脲酶存在于正常组织并对其产生毒性的风险。然而，由于脲酶的大小和其它特性，抗体与脲酶的缀合不会产生足够的大小或其它差异，以允许通过色谱纯化方法使抗体-脲酶缀合物与未缀合的脲酶容易分离，尤其是在大规模中。
本技术令人惊讶地提供了脲酶与抗体的基本上完全的缀合，使得所得产物基本上不含未缀合的脲酶而无需任何色谱纯化。通过基本上不含脲酶，本文描述的组合物通过全身施用将组合物中基本上所有的脲酶部分递送至靶位点。将脲酶靶向递送至靶位点减少或消除了由脲酶产生的氨的全身毒性，并减少了为了产生治疗效果而需要施用的脲酶的量。本技术尤其适合于大规模制备，如至少约1g、10g、100g或1kg基本上不含脲酶的抗体-脲酶缀合物，以用于临床用途，特别是用于治疗通过局部施用脲酶难以或无法治疗的转移性肿瘤。
本技术还提供了将脲酶靶向肿瘤抗原VEGFR-2的新方法，其包括将多个包含SEQID NO:2-30及其片段或变体中的任一个或多个的单结构域抗体分子与脲酶分子缀合以形成抗体-脲酶缀合物，其中所述缀合物对肿瘤抗原具有结合亲和力。在一些方面，竞争性结合测定可以用于显示抗体-脲酶缀合物的结合亲和力与天然单结构域抗体的结合亲和力相当或由于增加的亲合力，比天然单结构域抗体强约100倍、约200倍、约300倍、约400倍和约500倍。在一些方面，缀合物的缀合比为每脲酶部分3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个抗体部分。在一些方面，缀合物的缀合比为每脲酶部分约6或更多个抗体部分。在一些方面，缀合物的缀合比为每脲酶部分6、7、8、9、10、11或12个抗体部分。在一些方面，缀合物的缀合比为每脲酶部分8、9、10或11个抗体部分。在一些方面，缀合物的平均缀合比为每脲酶部分约8、9、10或11个抗体部分。在一些方面，脲酶为刀豆脲酶。在一些方面，抗体为人源化抗体或非人抗体。在一些方面，抗体为对VEGFR-2具有特异性的单结构域抗体。在一些方面，抗体对VEGFR-2具有结合亲和力，其中Kd值高于约1x 10-6M。在一些方面，缀合物以不超过约1x 10-8M的Kd值结合VEGFR-2。在一些方面，缀合物以不超过约1x 10-10M的Kd值结合VEGFR-2。在一些方面，缀合物以不超过约5nM的IC50值结合VEGFR-2。在一些方面，IC50值为约3.22nM。在一些方面，缀合物以约20μg/mL的IC50值结合VEGFR-2。
组合物制剂
本技术的组合物包含抗VEGFR-2脲酶缀合物，任选不含非水性HPLC溶剂。在一些方面，组合物为药学可接受的组合物。组合物还可以包含生物相容的药物载体、佐剂、或媒介物。在一些方面，组合物为固体形式。在一些方面，组合物为水溶液，其包含约0.1-10mg/mL、约0.5-5mg/mL、约1-5mg/mL、或约1.5-2.0mg/mL缀合物。在一些方面，水溶液还包含赋形剂，如组氨酸、蔗糖和EDTA中的一种或多种。在一些方面，水溶液包含约1-20mM，如10mM组氨酸，约0.1-5w/v％，如1w/v％的蔗糖，约0.1-0.5mM，如0.2mM EDTA。在一些方面，水溶液的pH为约6.5至7，如约6.8。在一些方面，水溶液不含磷酸盐。在一些方面，组合物是通过冻干水溶液获得的固体形式。在某些方面，固体形式不含磷酸盐。
组合物还可以包含与赋形剂或其它药学可接受的载体混合的其它核苷酸序列、多肽、药物或激素。
除药物组合物之外的组合物任选地包含液体，即水或水基液体。
待添加到药物组合物中的药学可接受的赋形剂也是本领域技术人员众所周知的并且容易获得。赋形剂的选择将部分地由用于施用产品的特定方法来决定。因此，存在多种用于本技术背景中的合适制剂。
用于配制和施用药物组合物的技术可以见于Remington's PharmaceuticalSciences,第19版,Williams&Wilkins,1995，并且是本领域技术人员众所周知的。赋形剂的选择将部分地由用于施用根据本技术的产品的特定方法来决定。因此，存在多种用于本技术背景中的合适制剂。以下方法和赋形剂仅是示例性的，并且决不是限制性的。
本技术的药物组合物可以使用任何常规方法制备，例如混合、溶解、制粒、研磨、乳化、包封、包埋、熔融纺丝、喷雾干燥或冻干方法。然而，本领域技术人员将取决于施用途径和期望剂量来确定最佳药物制剂。此类制剂可影响所施用药剂的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。
配制药物组合物以含有合适的药学可接受的载体，并且可以任选地包含促进活性化合物加工成可以药学使用的制剂的赋形剂和助剂。施用方式通常将决定载体的性质。例如，用于肠胃外施用的制剂可以包含水溶形式的活性化合物的水溶液。适用于肠胃外施用的载体可以选自盐水、缓冲盐水、右旋糖、水和其它生理学相容的溶液。用于肠胃外施用的优选载体为生理学相容的缓冲液，如Hank's溶液、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理缓冲盐水。对于组织或细胞施用，在制剂中使用适合于待渗透的特定屏障的渗透剂。这种渗透剂通常是本领域已知的。对于包含蛋白质的制剂，制剂可以包含稳定材料，如多元醇(例如蔗糖)和/或表面活性剂(例如非离子表面活性剂)等。
可选地，用于肠胃外使用的制剂可以包含作为适当的油性注射悬浮液制备的活性化合物的悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油，如芝麻油，和合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。水性注射悬浮液可以含有增加悬浮液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可以含有合适的稳定剂或增加化合物溶解度以允许制备高浓度溶液的试剂。也可以使用乳液，例如水包油和油包水分散体，任选地通过乳化剂或分散剂(表面活性材料；表面活性剂)稳定。含有活性剂的如上所述的脂质体也可以用于肠胃外施用。
缀合物本身和缀合物制剂的特征可以影响所施用的缀合物的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。这种药代动力学和药效学信息可以通过临床前体外和体内研究收集，稍后在临床试验过程中在人体中确认。可以从许多来源获得基于体内动物数据进行人临床试验的指导，所述来源包括例如http://www.clinicaltrials.gov。因此，对于本技术的方法中使用的任何化合物，哺乳动物，特别是人的治疗有效剂量最初可以从生物化学和/或基于细胞的测定估计。然后，可以在动物模型中配制剂量以达到调节缀合物活性的期望循环浓度范围。随着人体研究的进行，将出现关于各种疾病和病况的适当剂量水平和治疗持续时间的进一步信息。
缀合物的毒性和治疗功效可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药物程序确定，例如，用于确定LD50(50％群体致死的剂量)和ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)标准药物程序。
另外的活性剂也可以包含在本技术的组合物中。在细胞与第一活性剂接触之前，同时或之后，可以在组合物中利用另外的活性剂，例如抗肿瘤剂(对增殖细胞有活性的试剂)。例如，在脲酶靶向肿瘤细胞之后，它可以具有，例如通过pH变化调节或调控肿瘤外部环境的能力。然后，有利于碱性环境的活性剂(如抗肿瘤剂)将更有效。
在某些方面，考虑能够被脲酶酶促加工的底物用作活性剂。在一些方面，活性剂为脲酶可用于形成铵离子(例如脲)的底物。
示例性抗肿瘤剂包括细胞因子和其它部分，如白细胞介素(例如，IL-2、IL-4、IL-6、IL-12等)，转化生长因子-β，淋巴毒素，肿瘤坏死因子，干扰素(例如，γ-干扰素)，集落刺激因子(例如，GM-CSF，M-CSF等)，血管通透因子，凝集素炎症性反应启动子(选择蛋白)，如L-选择蛋白、E-选择蛋白、P-选择蛋白和蛋白质部分，如Clq和NK受体蛋白。另外合适的抗肿瘤剂包括抑制血管生成且因此抑制转移的化合物。
这些药剂的实例包括鱼精蛋白甲羟孕酮、戊聚糖多硫酸盐、苏拉明、紫杉醇、沙利度胺、血管抑素、干扰素-α、金属蛋白酶抑制剂、血小板因子4、生长抑素、血小板反应蛋白(thromobospondin)。可根据本技术使用的活性剂的其它代表性和非限制性实例包括长春新碱、长春花碱、长春地辛、白消安、苯丁酸氮芥、螺铂、顺铂、卡铂、甲氨蝶呤、阿霉素、丝裂霉素、博来霉素、阿糖胞苷、阿拉伯糖基腺嘌呤、巯嘌呤、米托坦、丙卡巴肼、更生霉素(放线菌素D(antinomycin D))、道诺霉素、盐酸阿霉素、紫杉醇、普卡霉素、氨鲁米特、雌莫司汀、氟他胺、亮丙瑞林、醋酸甲地孕酮、它莫昔芬、睾内酯、曲洛司坦、安吖啶(m-AMSA)、天冬酰胺酶(L-天冬酰胺酶)、依托泊苷、血液制品如血卟啉或前述衍生物。活性剂的其它实例包括遗传物质，如核酸，天然或合成来源的RNA和DNA，包括重组RNA和DNA。编码某些蛋白质的DNA可以用于治疗许多不同类型的疾病。例如，可以提供肿瘤坏死因子或白细胞介素-2基因来治疗晚期癌症；可以提供胸苷激酶基因来治疗卵巢癌或脑肿瘤；以及可以提供白细胞介素-2基因来治疗神经母细胞瘤、恶性黑色素瘤或肾癌。考虑用于本技术的其它活性剂描述于美国专利第6,261,537号中，将其通过引用整体并入本文。抗肿瘤剂和用于检测这些药剂的筛选参见Monga,M.和Sausville,E.A.(2002)Leukemia 16(4):520-6。
在一些方面，活性剂是弱碱性抗肿瘤化合物，其有效性被实体瘤中较高的细胞内pH/较低的细胞外pH梯度降低。示例性弱碱性抗肿瘤化合物包括阿霉素，道诺霉素，米托蒽醌，表柔比星，丝裂霉素，博来霉素，长春花生物碱，如长春花碱和长春新碱，烷化剂，如环磷酰胺和盐酸氮芥，及抗肿瘤嘌呤和嘧啶衍生物。
递送和施用方法
可以通过本领域已知的许多方法将抗VEGFR-2-脲酶缀合物组合物递送至癌细胞中。在治疗应用中，将组合物以足以抑制癌细胞生长的量施用至具有癌细胞的患者中。可以通过许多施用途径，包括但不限于肠胃外，肠内，经上皮，透粘膜，透皮和/或外科手术将药物组合物暴露于癌细胞。
肠胃外施用方式包括通过以下方式，其中通过例如静脉内、动脉内、腹膜内、髓内、肌肉内、关节内、鞘内和心室内注射，皮下、性腺内(intragonadal)或瘤内针弹丸注射，或使用适当的泵技术进行延长连续的、脉冲的或计划的灌注或微输注来施用组合物。肠内施用方式包括例如口服(包括口腔和舌下)和直肠施用。经上皮施用方式包括例如经粘膜施用和透皮施用。经粘膜施用包括例如肠内施用以及鼻腔施用、吸入施用和深肺施用、阴道施用和直肠施用。透皮施用包括被动或主动透皮或经皮方式，包括例如贴剂和离子电渗疗法装置，以及糊剂，药膏或软膏的局部施加。手术技术包括植入储库(depot/reservoir)组合物、渗透泵等。
可以根据对象需要和耐受的剂量和频率施用活性剂的单次或多次施用。在任何情况下，组合物应提供有效治疗对象的足够量的活性剂。
使用的药物组合物以有效量施用至对象。通常，有效量是有效(1)减轻寻求治疗的疾病的症状；或(2)诱导与治疗寻求治疗的疾病有关的药理学变化的量。对于癌症，有效量可以包括有效减少肿瘤大小；减缓肿瘤生长；预防或抑制转移；或者增加受累对象的预期寿命的量。接触包括向细胞中添加包含靶向部分和第一螺旋形成肽的缀合物，所述第一螺旋形成肽的特征在于选定的电荷和与第二相反电荷的螺旋形成肽相互作用以形成稳定的α-螺旋卷曲螺旋异二聚体的能力。
剂量
对于本技术的方法，可以使用调节剂量的时间和顺序的任何有效的施用方案。人对象的示例性剂量水平将取决于施用模式、肿瘤的程度(大小和分布)、患者的个头和癌症对脲酶治疗的反应性。
当施用抗VEGFR-2-脲酶缀合物组合物时，如直接注射到肿瘤中，示例性剂量为约0.1至1,00010μg/kg体重，如约0.2至5μ/kg、约0.5至2μ/kg、约5.0至约14.0μ/kg。注射针的布置可以通过常规的图像引导技术(例如荧光镜检查)来引导，使得医师能够查看针相对于靶组织的位置。这种引导工具可以包括超声、荧光镜检查、CT或MRI。
在一些方面，可以在将抗VEGFR-2-脲酶缀合物施用至肿瘤期间或之后，通过用能够检测对象癌组织区域内pH变化的工具监测肿瘤组织，监测抗VEGFR-2-脲酶缀合物的施用剂量的有效性或分布。这样的工具可以包括可以直接插入肿瘤的pH探针，或可视化工具，如磁共振成像(MRI)，计算机断层扫描(CT)或荧光镜检查。MRI查询可以仅基于组织的磁性特性作为pH的函数的差异，在没有另外成像剂的情况下进行。CT或荧光镜成像可需要另外的pH敏感成像剂，其不透明度受组织培养基的pH影响。这些试剂是本领域技术人员众所周知的。
在任何抗VEGFR-2-脲酶缀合物施用之前，肿瘤组织可以通过其相对于周围正常组织的较低pH可视化。因此，正常组织可以具有约7.2的正常pH，而肿瘤组织可能低0.1至0.4或更多个pH单位。即，在注射任何抗体-脲酶缀合物之前，肿瘤组织的程度可以通过其较低的pH来限定。在脲酶施用之后，具有脲酶的肿瘤区域的pH将开始上升，并且可以通过将所得的图像与早期的给药前的图像进行比较来鉴定。
通过以这种方式查询组织，可以监测pH变化的程度和组织受累的程度。基于该查询，医师可以向该部位施用另外的组合物，和/或可以在肿瘤部位内另外的区域处施用组合物。可以重复该程序，直至在实体瘤的全部区域内达到期望程度的pH变化，例如0.2至0.4个pH单位。
可以通过合适的间隔例如每周或每周两次重复给药，如通过直接注射，直至观察到期望的终点，优选肿瘤团块的显著或完全消退。如上，可以通过在治疗过程中可视化治疗组织的pH变化来监测治疗功效。因此，在每次另外的注射之前，可以可视化组织的pH以确定肿瘤目前存在的程度，之后组织的pH的变化可以用于监测新剂量的抗VEGFR-2-脲酶缀合物组合物向组织的施用。
对组织pH变化敏感的成像技术可以用于监测所施用剂量的有效性。由于这种靶向可能需要数小时或更长时间，因此该方法可涉及在注射抗VEGFR-2-脲酶缀合物组合物之前和在给药之后数小时，例如12-24小时，监测肿瘤pH(如上所述)，以确认肿瘤部位已被充分给药，如通过肿瘤区域的pH升高所证明的。取决于该查询的结果，该方法可以规定另外的给药直至观察到期望的pH升高，例如0.2-0.4个pH单位。一旦确定该剂量，可以定期用相似剂量的脲酶组合物治疗患者，例如每周一次或两次，直至达到肿瘤大小或状况的变化。
最终剂量方案将由主治医师考虑到改变药物作用的各种因素，例如药剂的比活性，疾病状态的严重程度，患者的反应性，患者的年龄、状况、体重、性别和饮食，任何感染的严重程度等鉴于良好的医疗实践确定。可以考虑的另外因素包括施用的时间和频率、药物组合、反应灵敏性和对治疗的耐受性/反应。适合于涉及本文提及的任何制剂的治疗的剂量的进一步改进由本领域技术人员常规进行，尤其是根据所公开的剂量信息和测定，以及在临床试验中观察到的药代动力学数据。通过使用用于确定体液或其它样品中药剂浓度以及剂量反应数据的已建立的测定法，可以确定适当的剂量。
给药频率将取决于药剂的药代动力学参数和施用途径。调整剂量和施用以提供足够水平的活性剂或以维持期望效果。因此，药物组合物可以，根据需要，以单剂量、多个离散剂量、连续输注、持续释放储库或它们的组合施用，以维持药剂的期望最低水平。
短效药物组合物(即，半衰期短)可以每天施用一次或每天施用多于一次(例如，一天两次、三次或四次)。可以每3至4天、每周或每两周一次施用长效药物组合物。泵(诸如皮下、腹膜内或硬膜下泵)用于连续输注。
可以制备包含在药学可接受的载体中的抗VEGFR-2-脲酶缀合物的组合物，将其置于适当的容器中，并标记成用于治疗指示的病况。标签上指示的病况可以包括但不限于各种癌症类型的治疗。还考虑了如下所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含药物组合物的剂型和包装插页，其含有使用该组合物治疗医学病况的说明书。
通常，将抗VEGFR-2-脲酶缀合物组合物以有效量施用至对象。通常，有效量是有效(1)减轻寻求治疗的疾病的症状；或(2)诱导与治疗寻求治疗的疾病有关的药理学变化的量。对于癌症，有效量可以包括有效减少肿瘤大小；减缓肿瘤生长；预防或抑制转移；或者增加受累对象的预期寿命的量。
治疗方法
本发明的抗VEGFR-2-脲酶缀合物提供了治疗对象中癌症的方法，其包括向对象施用治疗有效量的本文提供的抗VEGFR-2-脲酶缀合物组合物，从而治疗对象中的癌症。适合于通过本文方法治疗的癌症通常包括任何表达VEGFR-2的癌症。
在一些方面，待治疗的癌症形成实体瘤，如癌、肉瘤、黑色素瘤和淋巴瘤。在一些方面，癌症是以下的一种或多种：非小细胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌或它们的组合。在一些方面，癌症是非小细胞肺癌。在一些方面，对象是人。
可以通过本领域众所周知的方法估计治疗有效剂量。癌症动物模型，如具有鼠肿瘤的免疫活性小鼠或具有人肿瘤异种移植物的免疫受损小鼠(例如裸鼠)是本领域众所周知的，并且在并入本文用于参考的许多参考文献中进行了广泛描述。这些信息与大鼠、狗和/或非人灵长类动物的安全性研究组合使用，以确定人的安全和可能有用的初始剂量。用于估计有机体剂量的另外的信息可以来自临床试验报告的实际人癌症的研究。
在一些方面，治疗癌症的方法旨在涵盖治愈以及改善癌症的至少一种症状。如果患者的癌症被治愈，癌症得到缓解，生存期以统计学显著的方式延长，肿瘤进展时间以统计学显著的方式增加，实体瘤负荷如实体瘤反应评价标准(RECIST 1.0或RECIST 1.1,Therasse等人.J Natl.Cancer Inst.92(3):205-216,2000和Eisenhauer等人.Eur.J.Cancer 45:228-247,2009)所定义的减少，则癌症患者被治疗。如本文所用，“缓解”是指先前具有癌症迹象的患者中不存在癌细胞生长。因此，缓解的癌症患者是他们的癌症被治愈，或者存在癌症但不容易检测到。因此，当肿瘤不能扩大或转移时，癌症可能处于缓解中。本文使用的完全缓解是没有疾病，如通过诊断方法，如成像，如X射线、MRI、CT和PET，或活组织检查所指示的。当癌症患者得到缓解时，随后可能会复发，此时癌症再次出现。
试剂盒
在一些方面，本技术提供了使用本文描述的方法抑制肿瘤细胞生长的试剂盒。试剂盒包含含有抗VEGFR-2-脲酶缀合物的容器。试剂盒可以另外包含用于实施本技术的方法的本文描述的任何其它组分。试剂盒可以任选地包含含有公开了将活性剂用于抑制肿瘤细胞生长的指导(即方案)的说明材料。因此，在一个方面，试剂盒包含含有抗VEGFR-2-脲酶缀合物组合物的药物组合物，以及教导将该组合物施用至对象用于治疗对象中的癌症的说明材料。在一个方面，说明材料教导了将脲酶组合物以这样的量施用至对象：该量取决于肿瘤的大小，并且当通过直接注入肿瘤施用组合物时，该量为每mm3肿瘤0.1至100国际单位脲酶活性，并且当通过除直接注入肿瘤之外肠胃外施用组合物至对象时，该量为100-100,000国际单位/kg国际单位脲酶活性/kg对象体重。
在另一个方面，说明材料教导了将脲酶组合物以有效减少或逆转实体瘤中较高的细胞内pH/较低的细胞外pH梯度的量，施用至也接受弱碱性抗肿瘤化合物的对象，所述弱碱性抗肿瘤化合物的有效性被实体瘤中较高的细胞内pH/较低的细胞外pH梯度降低。
可选地，说明材料教导了在将脲酶有效地定位于对象实体瘤的条件下将脲酶组合物施用至含有或疑似含有实体瘤的对象，用能够检测对象组织中细胞外pH变化的诊断工具查询对象，以及在所述施用之后鉴定对象中显示细胞外pH升高的组织区域。
虽然说明材料通常包括书面或印刷材料，但它们不限于此。本技术考虑了能够存储这些说明并将它们传送给最终用户的任何介质。此类介质包括但不限于电子存储介质(例如，磁盘、磁带、盒式磁带、芯片)、光学介质(例如CD ROM)等。此类介质可以包括提供这种说明材料的互联网网站的地址。
实验实施例
通过参考以下实验实施例进一步详细描述本发明。提供这些实施例仅出于说明的目的，并且不旨在是限制性的，除非另有说明。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为涵盖由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变型。
以下实施例不包括常规方法，如用于构建载体和质粒，将编码多肽的基因插入此类载体和质粒，或将质粒引入宿主细胞的方法的详细描述。此类方法是本领域普通技术人员众所周知的，并且描述于许多出版物中，包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.(1989),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring HarborLaboratory Press，将其通过引用并入本文中。
无需进一步描述，认为本领域普通技术人员可以使用前述说明和以下说明性实施例制备和利用本发明化合物并实施所要求保护的方法。因此，以下工作实施例具体指出了本发明的典型方面，并且不应被解释为以任何方式限制本公开的其余部分。
实施例1：抗VEGFR-2抗体的产生
为了产生靶向VEGFR-2的细胞外结构域的骆驼科动物单结构域抗体，用重组VEGFR-2/Fc免疫美洲驼。产生噬菌体展示文库并筛选以鉴定对VEGFR-2具有高结合亲和力的单结构域抗体。
为了产生靶向VEGFR-2的细胞外结构域的人单结构域抗体，对人VH文库进行筛选以鉴定对VEGFR-2具有高结合亲和力的单结构域抗体。
将融合伴侣序列MKAIFVLKGSLDRDPEFDDE(SEQ ID NO:71)加入至SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:11(AB1和AB2)序列的N-末端通过在包涵体中积累表达的蛋白质，并有效地简化蛋白质纯化和重折叠过程来提高抗体的产量。
制备了四种抗体，并对其进行进一步研究。将选择的抗体在大肠杆菌BL21(DE3)pT7系统中表达。这些抗体中的两种(AB2(SEQ ID NO:13)和AB3(SEQ ID NO:21))基于人抗体支架，并且两种SEQ ID NO:7和27(AB1和AB4)为美洲驼来源。这些抗体展示出足够质量的结合动力学而被认为是特异性VEGFR-2结合的潜在候选物(表1)。
表1.抗体的表征
实施例2：人VEGFR-2/Fc结合剂
使用Biacore 3000系统通过SPR测定人SEQ ID NO:13(AB2)和SEQ ID NO:21(AB3)以及美洲驼SEQ ID NO:7(AB1)和SEQ ID NO:27(AB4)与固定化的人和小鼠VEGFR-2/Fc相互作用的结合动力学。将12,000RU的人VEGFR2/Fc(R&D Systems)、14,000RU的小鼠VEGFR-2/Fc(R&D Systems)或作为参考蛋白的7500RU的BSA(Sigma)分别固定在研究级CM5-传感器芯片(Biacore)上。使用制造商提供的胺连接试剂盒，在pH4.5的10mM乙酸盐中以50μg/ml的蛋白质浓度进行固定。使所有抗体样品通过Superdex 75柱(GE Healthcare)以分离用于进行Biacore分析的单体形式。
在所有情况下，在25℃下，在含有150mM NaCl，3mM EDTA和0.005％表面活性剂P20的10mM HEPES，pH 7.4中以40μl/min的流速进行分析。用3-8sec的10mM HCl接触时间再生表面。用BIAevaluation 4.1软件分析数据。所有四种抗体大体上显示出单体峰(图1，尺寸排阻柱色谱图)。尺寸排阻柱色谱的条件：机器：FPLC(GE healthcare)；Superdex75HR 10/30柱(Amersham,目录号17-1047-01,Id No.9937116)；运行缓冲液：HBS-EP(10mMHEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,pH7.4,0.005％P20)；将4x HBS-E稀释4倍，加入10％的P20表面活性剂，使最终浓度为0.005％。样品体积：200μl。泵速：0.5ml/min。
在150～200nM的浓度下，没有一种抗体显示与固定化的小鼠VEGFR-2/Fc结合，而所有抗体均显示与固定化的人VEGFR-2/Fc结合(表1和图2)。这些数据表明抗体是物种特异性的。SEQ ID NO:7(AB1)在SPR表面上解离很差，并且使传感图数据(图2)与标准动力学模型的直接拟合复杂化。因此，从图3中示出的转化数据估计SEQ ID NO:7(AB1)动力学常数。
实施例3：人&美洲驼抗体与人VEGFR-2/Fc的结合
显示分别在(a)0.1、0.2、0.3、0.5、1&2μM，(b)0.2、0.3、0.5、0.75、1、1.5、2&3μM，(c)0.15、0.25、0.5、1、2&4μM，(d)75、150、225、300、375、525&750nM的浓度下的(a)SEQ IDNO:13(AB2)、(b)SEQ ID NO:21(AB3)、(c)SEQ ID NO:7(AB1)、(d)SEQ ID NO:27(AB4)与固定化的人VEGFR-2/Fc的结合的传感图覆盖图显示在图2中。
实施例4：AB1与人VEGFR-2/Fc结合的动力学常数分析
在0.1、0.15、0.25、0.5、0.75、1、2&4μM浓度下的AB1的衍生化数据显示在图3中。浓度vs–ks的图(显示浓度低于1μM的截距)。
实施例5：表位图谱
将两种不同的抗体以>4x KD的浓度相继共注射。结果显示在图4A和图4B中。用SEQID NO:13(AB2)、SEQ ID NO:21(AB3)和SEQ ID NO:27(AB4)观察到明显的重叠。用SEQ IDNO:7(AB1)观察到一些重叠。
在竞争性ELISA实验中也提供了表位信息(图7)。AB3(SEQ ID NO:23)-脲酶缀合物被未连接的AB2(SEQ ID NO:13)抗体抑制，表明两种人抗体共有至少部分重叠的表位。未连接的AB3(SEQ ID NO:21)抗体也部分抑制AB1(SEQ ID NO:9)-DOS47的结合，尽管仅在非常高的摩尔比下。
实施例6：VEGFR-2结合以及与VEGFR-1和VEGFR-3的交叉反应性
所有四种单结构域抗体均用于制备脲酶(“DOS47”)缀合物。测试这些缀合物结合抗原VEGFR-2的能力以及它们与VEGFR-1和VEGFR-3交叉反应的能力(图5)。所有四种缀合物均能够靶向VEGFR-2，以及与VEGFR-1具有一些交叉反应性，但是没有观察到与VEGFR-3的可检测的结合。显示了针对SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:27(分别为包含接头的AB1、AB2、AB3和AB4)的结果。
实施例7：VEGF竞争测定
还测试了脲酶缀合物与VEGF竞争性结合的能力。这样做是为了评估抗体是否识别VEGF结合口袋附近的区域。该分析的实例提供在图6中。由此可以看出，两种人抗体-脲酶缀合物(AB2-(SEQ ID NO:13)&AB3-(SEQ ID NO:23)DOS47)与VEGFR-2的结合被VEGF竞争性抑制。然而，发现对于AB2-(SEQ ID NO:13)DOS47的最大抑制稳定在～40％；对于AB3-(SEQ IDNO:23)DOS47为～60％。这表明AB2和AB3仅在VEGF结合口袋附近结合。VEGF对AB1-(SEQ IDNO:9)DOS47复合物与VEGFR2的结合具有最小的影响。因此，看起来AB1结合远离VEGF结合口袋的位点。通过VEGF的存在增强了AB4-(SEQ ID NO:27)DOS47与VEGFR2的结合，表明AB4抗体与VEGF/VEGFR2复合物的结合好于与单独的VEGFR2的结合。
实施例8：抗体与在293/KDR细胞上表达的VEGFR2的结合
进行流式细胞术实验以测试抗体和/或抗体-脲酶缀合物与293/KDR细胞的结合。293/KDR细胞是已经被稳定转染以表达人VEGFR2的293细胞(也称为KDR)。图8A显示生物素化的AB1抗体(SEQ ID NO:6)与293/KDR细胞的结合。这种结合被摩尔过量的游离AB1抗体抑制，但不被不相干抗体抑制。图8B显示AB1-(SEQ ID NO:6)脲酶缀合物和AB2–(SEQ ID NO:18)脲酶缀合物与293/KDR细胞的结合。图8中显示的结果确认，本文描述的AB1和AB2抗体结合293/KDR细胞上表达的VEGFR2。
实施例9
V21-DOS47由骆驼科动物单结构域抗VEGFR2抗体(V21)和脲酶(DOS47)组成。缀合物特异性结合VEGFR2，脲酶将内源性脲转化为氨，氨对肿瘤细胞是有毒的。先前，我们开发了一种类似的抗体-脲酶缀合物L-DOS47，其目前正在进行针对非小细胞肺癌的临床试验。虽然V21 DOS47是从L DOS47生成借鉴的参数设计的，但需要另外的工作来产生V21 DOS47。在本研究中，我们描述了两种形式的V21抗体的表达和纯化：V21H1(SEQ ID NO:3)和V21H4(SEQ ID NO:6)。使用不同的化学交联剂将每种与脲酶缀合。通过一组分析技术表征缀合物，所述技术包括SDS-PAGE、SEC、蛋白质印迹和LC-MSE肽图谱。通过ELISA和流式细胞术测定确定结合特征。
为了改善缀合物在生理pH的稳定性，通过向C末端加入几个氨基酸残基来调节V21抗体的pI。对于V21H4，还加入末端半胱氨酸用于缀合化学反应。修饰的V21抗体在大肠杆菌BL21(DE3)pT7系统中表达。使用异型双功能交联剂琥珀酰亚胺基-[(N-马来酰亚胺基丙酰胺基)-二乙二醇]酯(SM(PEG)2)将V21H1与脲酶缀合，所述交联剂靶向抗体中的赖氨酸残基。使用同型双功能交联剂1,8-双(马来酰亚胺基)二乙二醇(BM(PEG)2)将V21H4与脲酶缀合，所述交联剂靶向加入至抗体C-末端的半胱氨酸。V21H4-DOS47被确定为优良的缀合物，因为抗体易于以高水平产生和纯化，并且可以使用易于转移用于cGMP生产的方法有效地产生和纯化缀合物。此外，V21H4-DOS47保留了比V21H1-DOS47更高的结合活性，这是因为天然赖氨酸残基未被修饰。
我们已经开发了抗体-药物缀合物(ADC)方法来阻抑血管生成。与通过阻断VEGFR2的二聚化或通过抑制激酶活性来中断激酶信号传导级联的大多数抗血管生成剂不同，我们的抗体-药物缀合物V21-DOS47通过在靶细胞中诱导细胞毒性活性杀死表达VEGFR2的细胞。与我们先前的抗肿瘤免疫缀合物L-DOS47(Tian等人,2015)类似，V21-DOS47由骆驼科动物抗体和脲酶(来源于刀豆(Canavalia ensiformis))组成：V21抗体与VEGFR2结合，从而使复合物靶向表达VEGFR2的细胞，而脲酶将内源性脲原位转化为氨以诱导细胞毒性。由于VEGFR2不仅在肿瘤血管系统中表达，而且还在多种肿瘤的表面上被鉴定出(Itakura等人,2000；Tanno等人,2004；Guo等人,2010)，V21 DOS47同时靶向VEGFR2+血管内皮细胞和VEGFR2+肿瘤细胞。氨的升高的局部浓度也中和了肿瘤微血管周围的酸性环境，否则其有利于癌细胞的生长(Wong等人,2005)。由于脲酶是一种没有已知哺乳动物同源物的植物产物，它很可能具有免疫原性，尽管预期不会发生自身免疫反应。L-DOS47目前正在临床试验中进行测试，结果显示形成抗脲酶抗体，但没有观察到已知的严重免疫毒性。脲酶免疫原性的全部影响仍在研究中。
与常规免疫球蛋白(大约150kDa)相比，骆驼科动物抗体的一个优点是其相对小的尺寸(约15kDa)。当将抗体与脲酶连接时，这特别重要，因为脲酶是分子量为544kDa的大蛋白质。通过使用美洲驼抗体，可以将多个抗体与每个脲酶分子连接，其中总分子量增加相对较小。这允许产生保留可接受的生物分布概况的高亲合力治疗试剂。骆驼科动物抗体的其它益处(De Genst等人,2006；Maass等人,2007；Harmsen和De Haard,2007)是它们易于克隆和重组表达(Arbabi Ghahroudi等人,1997；Frenken等人,2000)，通常比常规IgG更具热稳定性和化学稳定性(van der Linden等人,1999；Dumoulin等人,2002)，并且它们与常规抗体无法识别的表位结合(Lauwereys等人,1998)。此外，它们不具有特别的免疫原性，这是因为人VH和骆驼科动物VHH结构域共有大约80％的序列同一性(Muyldermans等人,2001)，并且肾清除率高(Cortez-Retamozo等人,2002)。
抗体-脲酶缀合物是复杂且大的蛋白质：每个脲酶具有多个抗体，缀合物的分子量可以达到680kDa。这对大规模生产提出了挑战。在我们先前的报告中，我们描述了被设计以应对这些挑战的缀合化学反应和分离程序(Tian等人,2015)。在本研究中，我们评价了另外的抗体产生和缀合化学方法以产生新型抗体-脲酶缀合物V21-DOS47。
为了产生针对VEGFR2的高亲和力抗体，用重组VEGFR2免疫美洲驼，并产生VHH噬菌体展示文库。通过用重组VEGFR2淘选该文库来分离V21抗体。将另外的氨基酸残基加入至V21抗体的C末端以实现多个目的：优化抗体pI，使抗体表达靶向细菌包涵体，并为交联化学反应提供独特的靶标。在本报告中，我们描述了两种形式的V21抗体(命名为V21H1和V21H4)，以及用于将每种抗体与脲酶缀合的不同方法。两种抗体-脲酶缀合物均采用多种分析技术进行表征，包括尺寸排阻色谱(以评价蛋白质纯度)，SDS-PAGE(以确定每个脲酶缀合的抗体的平均数)和ESI质谱(以确定抗体和脲酶上的缀合位点)。检查缀合比的影响，并比较具有相同缀合比的两种缀合物的结合。通过流式细胞术确认与细胞表面表达的VEGFR2的结合。
材料和方法
高纯度脲酶(HPU)的纯化
粗脲酶(Cat#U-80,236U/mg)购自BioVectra Inc.(Charlottetown,PE Canada)。在用于缀合之前，纯化粗脲酶以除去刀豆基质蛋白污染物，如刀豆球蛋白和伴刀豆球蛋白A。在室温下将100万单位的粗脲酶溶解在430ml高纯度(HP)水中。用10％(v/v)的乙酸将溶液调至pH 5.15，然后在9000rcf和4℃下离心40分钟。将含脲酶的上清液冷却至4℃并通过加入冷乙醇至终浓度为25％(v/v)进行分级分离，同时将温度保持在0-8℃。将混合物搅拌过夜，然后在9000rcf和4℃下离心40分钟。将沉淀重悬于150ml乙酸盐-EDTA缓冲液(10mM乙酸钠，1mM EDTA，1mM TCEP，pH6.5)中，然后在4℃和9000rcf下离心40分钟。使用MinimateTFF系统(具有Minimate TFF胶囊的Masterflex Model 7518-00，MWCO 100kDa)将上清液浓缩至75ml，用200ml乙酸盐-EDTA缓冲液渗滤3次，然后浓缩至100ml。收集渗滤的脲酶溶液，用50ml乙酸盐-EDTA缓冲液将胶囊和管连接中的滤过溶液从系统中排出，并加入至收集的溶液中(总体积～150ml)。使用Bio-Rad Biologic LP系统通过阴离子交换色谱进一步纯化乙醇分级分离的脲酶溶液。将脲酶溶液以3.5ml/min的流速上样到35ml DEAE柱(DEAESepharose Fast Flow,GE Healthcare,Cat#17-0709-01)上，该柱用150ml IEC缓冲液A(20mM咪唑，1mM TCEP,pH 6.5)预平衡。用100ml IEC缓冲液A，然后用80ml 40％缓冲液B(含有0.180M NaCl的缓冲液A)洗涤柱子。用100％的缓冲液B以3.5ml/min的流速洗脱脲酶，合并A280>0.1的级分。使用具有100kDa MWCO膜的Minimate胶囊将合并的级分浓缩至目标蛋白质浓度为6-8mg/ml，然后针对乙酸盐-EDTA缓冲液(20mM乙酸钠，1mM EDTA，pH6.5)渗滤。将高纯度脲酶(HPU)储存在-80℃。来自该纯化方案的产率通常>起始活性的55％。
V21H1和V21H4的表达
两种抗体均在大肠杆菌BL21(DE3)pT7系统中表达，其中卡那霉素作为选择抗生素。根据制造商的说明书，转化BL21(DE3)感受态大肠杆菌细胞(Sigma,B2935-10x50μl)。将来自转化平板的一个菌落无菌接种到补充有50mg/L卡那霉素的200ml LB肉汤(LB mediaEZ mix.Sigma Cat#L76581,20g/L)中。将培养物在200rpm和37℃温育。一旦培养物达到OD600大于0.6，将50ml培养物转移至4个2L烧瓶中，每个烧瓶含有1L含有50mg/L卡那霉素的LB肉汤。将烧瓶在振荡培养箱中以200rpm和37℃温育。一旦培养物达到OD600为0.9-1.0，通过加入1mM IPTG并在200rpm和37℃下温育过夜来诱导抗体表达。通过离心收获细胞至等分试样中，每2L培养物一个等分试样。
V21H1的纯化
大多数V21H1蛋白质在大肠杆菌细胞溶质溶液中表达，而不是在包涵体中表达。通过在冰水浴中超声处理10分钟(Misonix 3000超声波仪，尖端部分#4406；每个超声处理循环：超声处理30秒，冷却4分钟，功率8)，将等份的细胞沉淀在100ml裂解缓冲液(50mM Tris，25mM NaCl，pH 6.5)中裂解。将裂解物在9000rcf和4℃下离心30分钟。为了除去最丰富的细菌基质蛋白质，将上清液与冰冷的乙醇混合至终浓度为10％(v/v)，并在冰水浴中温育30分钟，然后在9000rcf和4℃离心30分钟。将上清液与冰冷的乙醇混合至终浓度为45％(v/v)，并在冰水浴中搅拌60分钟，然后在9000rcf和4℃下离心30分钟。将沉淀重悬于200ml洗涤缓冲液(50mM乙酸盐，0.1％Triton X-100，1mM DTT，25mM NaCl，pH 5.0)中。在9000rcf和4℃下离心30分钟之后，将沉淀重悬于补充有2mM DTT的100ml SP缓冲液A(50mM乙酸盐，8M脲，pH4.0)中，并通过0.45μm过滤器过滤。用2ml/分钟的蠕动泵将过滤的溶液上样到1ml SP FF柱(GE Healthcare，目录#17-5054-01)上，然后将柱连接到ACTA FPLC系统(AmershamBioscience,UPC-920)。用1ml/min的10ml SP缓冲液A洗涤柱之后，历经30分钟通过1ml/min流速的0-50％SP缓冲液B(具有0.7M NaCl的SP缓冲液A)的梯度洗脱V21H1抗体。测定峰级分的OD280，并以1.967/mg/ml的消光系数计算浓度。将DTT加入至SP柱峰级分至终浓度为1mM，并用2M Tris碱将溶液的pH调节至8-8.5。通过将pH调节的SP峰级分逐滴加入至重折叠缓冲液(100mM Tris，10μM CuSO4，pH8.8)中并在4℃连续搅拌直至重折叠完成来进行抗体的重折叠。通过完整蛋白质LC-MS监测重折叠过程。在重折叠之后，将溶液在9000rcf和4℃下离心30分钟，然后上样到1ml QHP柱上。将柱连接至FPLC系统，并以1ml/min的流速用10ml Q缓冲液A(50mM HEPES，pH 7.0)洗涤。在40分钟内通过1ml/min流速的0-40％Q缓冲液B(具有0.7M NaCl的Q缓冲液A)的梯度流速洗脱抗体。合并来自8L细胞培养物的峰级分，将其浓缩至2-4mg/ml，并在4℃下用20mM HEPES，pH7.1透析过夜(MWCO 5-8kDa，体积比1:50)。通过0.22μm注射器过滤器过滤最终的V21H1抗体溶液并将其储存在4℃。
V21H4的纯化
与V21H1相反，大多数V21H4蛋白质在大肠杆菌包涵体中表达。将来自每个2L培养物的细胞沉淀重悬于100ml裂解缓冲液(50mM Tris，25mM NaCl，pH6.5)中，并与溶菌酶混合至终浓度为0.2mg/ml。将细胞悬浮液在室温下温育30分钟，然后通过在冰水浴中超声处理来裂解10分钟(Misonix 3000超声波仪，尖端部分#4406；每个超声处理循环：超声处理30秒，冷却4分钟，功率8)。将裂解物在9000rcf和4℃下离心30分钟。用400ml沉淀洗涤缓冲液(Pellet Wash Buffer)(50mM Tris，25mM NaCl，pH 6.5，1％Triton X-100，2mM DTT)洗涤沉淀两次，并用50mM含有2mM DTT的乙酸洗涤一次。将沉淀重悬于补充有2mM DTT的100mlSP缓冲液A(50mM乙酸盐，8M脲，pH4.0)中，并在9000rcf和4℃下离心30分钟。将所得的上清液通过0.45μm过滤器过滤，并以5ml/min的流速上样到5ml SP-XL柱(GE Healthcare，目录#17-1152-01)上。用50ml SP缓冲液A洗涤柱之后，历经30分钟通过5ml/min流速的0-50％SP缓冲液B(具有0.7M NaCl的SP缓冲液A)的梯度洗脱蛋白质。当A280>700mU时收集峰级分。将DTT加入至合并的SP峰级分中至终浓度为1.0mM，并用饱和的Tris碱将pH调节至pH 8.6-8.7。通过将SP峰级分与重折叠缓冲液(50mM Tris，2M脲，1.0mM DTT pH 8.6-8.7)混合来引发重折叠。在室温下搅拌2小时之后，向重折叠混合物中加入1.2mM胱胺。在室温下继续重折叠，并通过RP-HPLC(Agilent 1100系统；ZORBAX-C3柱，PN883750-909；溶剂A：0.025％(v/v)TFA的水溶液；溶剂B：0.025％TFA的乙腈溶液；梯度：历经30分钟0.25ml/min流速的20-60％B。在不同时间点收集100μl样品，并立即加入1.0μl纯甲酸酸化。将30μl各样品注射至柱中以记录色谱图)监测。将所得的重折叠混合物在9000rcf和4℃下离心30分钟，然后以5ml/min的流速上样到5ml QHP柱(GE Healthcare，17-1154-01)中。在用50ml Q缓冲液A(50mMHEPES，pH8.7)洗涤柱之后，用0-70％Q缓冲液B(具有0.7M NaCl的Q缓冲液A)的梯度洗脱蛋白质。合并A280>700mU的峰级分。合并Q峰级分，浓缩至6-10mg/ml，并用10mM HEPES，pH7.1交换缓冲液。通过0.22μm过滤器过滤最终的V21H4抗体溶液，并将其储存在4℃。
V21H1与脲酶的缀合
通过在涡旋下将70.4μl SM(PEG)2(10.0mg/ml于DMF中)储备溶液加入至V21H1抗体中，以1：2.4的抗体：交联剂摩尔比，用交联剂活化10mg V21H1抗体。将反应溶液在室温下温育90分钟。通过加入300mM Tris缓冲液(pH 7.6)至终浓度为10mM，并在室温下温育10分钟来淬灭反应。用含有50mM NaCl和1mM EDTA，pH7.1的50mM Tris缓冲液预平衡的20ml G25脱盐柱除去未缀合的、水解的和淬灭的交联剂。除去过量的交联剂之后，合并脱盐柱级分，收集100μl样品用于完整蛋白质质谱分析和肽图谱分析，以评价V21H1抗体上的活化位点。将剩余的合并级分在冰水浴中冷却5分钟。将20mg高纯度脲酶(HPU)解冻并在另一冰水浴中温育5分钟。在搅拌下将冷却的HPU溶液倒入活化的V21H1抗体溶液中。在冰水浴中继续搅拌5分钟，然后将反应溶液在室温下移至工作台上。将缀合反应溶液在室温下温育90分钟之后，加入半胱氨酸溶液(200mM于300mM Tris，pH7-7.5中)至终浓度为5mM以淬灭反应。通过在15ml离心过滤器(MWCO 100kDa)中在4℃和2000rcf下离心将反应溶液浓缩至大约4ml。在SEC分离之前，将所得的浓缩反应溶液分成三等份。通过将每份反应溶液上样到与AKATAFPLC系统连接的Superose 6 100/300GL柱(GE)进行分离。用SEC缓冲液(50mM NaCl，0.2mMEDTA，pH7.2)以0.5ml/min的等度流动洗脱蛋白质，并合并A280>200mU的主要峰级分。合并来自所有三次SEC分离的峰级分，并用1L配制缓冲液(10mM组氨酸，1％(w/v)蔗糖，0.2mMEDTA，pH7.0)透析。将所得的缀合物溶液通过0.22μm过滤器过滤，并分成0.8ml等分试样。将等分试样储存在80℃。
V21H4与脲酶的缀合
将20mg V21H4与TCEP(100mM于300mM Tris缓冲液，pH7-7.5中)混合至终浓度为1.5mM，并在室温下温育60分钟。使用Tris-EDTA缓冲液(50mM Tris，1mM EDTA，pH7.1)，通过25ml G25脱盐柱除去过量的TCEP和所得的半胱胺。将所得的脱盐级分合并在40ml烧杯中，并用Tris-EDTA缓冲液稀释至总体积为30ml。通过在搅拌下将0.420ml BM(PEG)2储备溶液(10mg/ml于DMF中)快速分配至烧杯中的V21H4抗体溶液中来进行活化反应。在室温下温育10分钟之后，将反应溶液转移至带有滤膜(MWCO 5kD)的200ml Amicon渗滤浓缩器中，并与Tris-EDTA缓冲液混合至100ml。通过将渗滤浓缩器连接至70psi氮源除去过量的交联剂，并在搅拌下浓缩至20ml。在5次稀释和浓缩的循环之后，将渗滤浓缩器从氮源上分离，并收集100μl样品以确定抗体活化位点(使用完整蛋白质质谱分析和肽图谱分析)。将Tris-EDTA缓冲液加入至浓缩器中以将溶液稀释至50ml标志物。将具有活化的V21H4抗体的浓缩器在冰水浴中冷却10分钟，同时搅拌。在4℃完全解冻之后，将80mg HPU在另一个冰水浴中温育5分钟，然后倒入浓缩器中的活化V21H4抗体溶液中，同时在其冰水浴中搅拌。在冰水浴中搅拌5分钟之后，将含有反应溶液的浓缩器移至实验台并在室温下温育90分钟。通过加入半胱氨酸(100mM于300mM Tris，pH7-7.5中)至终浓度为5mM淬灭缀合反应。在室温下淬灭反应5分钟之后，将反应溶液转移至另一个容器中，清洁浓缩器并用新的滤膜(MWCO 100kDa)重新安装。将反应溶液转移回至浓缩器中，并将配制缓冲液(10mM组氨酸，1％(w/v)蔗糖和0.2mMEDTA，pH7.0)加入至160ml标志物中。将浓缩器连接至10psi氮源，并在搅拌下浓缩至20ml。在重复4次稀释-浓缩循环之后，将渗滤浓缩器从氮源上分离，将V21H4-DOS47缀合物溶液转移至新容器中，并稀释至40ml。将缀合物溶液通过0.22μm过滤器过滤并分成0.8ml等分试样。将等分试样储存在-80℃。
尺寸排阻色谱(SEC)
使用带有996PAD的Waters 2695HPLC系统和Empower 2软件进行数据采集和处理。在210-400±4nm记录色谱图，提取280nm处的信号用于处理。在Superose 6 100/300GL柱(GE)上进行分离。将蛋白质在10mM磷酸盐，50mM NaCl，0.2mM EDTA，pH7.2中洗脱。在注入一定体积的纯样品之后，以0.5ml/min的等度流动进行分离。将柱温保持在室温，同时样品温度控制在5±2℃。
SDS-PAGE
使用Bio-Rad微型凝胶蛋白质电泳试剂盒和Bio-RAD Molecular Imager Gel DocXR+以及ImageLab软件来分析V21-DOS47缀合比。将10μg蛋白质样品与60μl蛋白质凝胶上样缓冲液混合，并将混合物加热至70℃，保持10分钟。将变性的样品上样(10uL/孔)至4-20％Tris-甘氨酸凝胶(Invitrogen,REF#XP04200)中，并在150V的恒定电压和<40mA的电流下进行电泳，直至电泳前沿到达凝胶底部。在洗涤、染色和脱色之后，用Gel Doc XR+成像仪扫描凝胶图像用于分析。SDS-PAGE也用于计算每个脲酶分子缀合的抗体的平均数。这是通过查询主要群集(cluster)中五个条带的强度来确定的(更多细节参见Tian等人,2015)。报告的所有缀合比均为平均值。
ELISA测定
在室温下用100μL/孔的山羊抗人IgG-Fc(Sigma，5μg/mL于PBS中)包被96孔板6小时，然后用200μL/孔的3％BSA/PBS在2-8℃封闭过夜。在用T-TBS(50mM Tris，0.15M NaCl，pH 7.6，含有0.05％吐温-20)洗涤2次之后，加入100μL/孔的VEGFR1/Fc、VEGFR2/Fc或VEGFR3/Fc(R&D Systems,0.25μg/mL于TB-TBS(0.1％BSA/T TBS)中)，并将板在室温下温育1小时，同时轻轻摇动。在用T-TBS洗涤3次之后，加入100μL/孔的抗体-脲酶缀合物或生物素化的抗体稀释液(在TB-TBS中)，并将板在室温下温育2小时，同时轻轻摇动。对于抗体-脲酶缀合物，将板用T-TBS洗涤3次，加入100μL/孔的兔抗脲酶(1/6,000或1/10,000倍稀释于TB-TBS中，Rockland)，并将板室温温育1小时，同时轻轻摇动。对于所有样品，将板用T-TBS洗涤3次，加入100μL/孔的山羊抗兔-AP(1/8,000倍稀释于TB-TBS中，Sigma)以检测抗体-脲酶缀合物或加入链霉亲和素碱性磷酸酶(0.5μg/mL于TB-TBS中，Sigma)以检测生物素化的抗体，并将板在室温下温育1小时，同时轻轻摇动。在用T-TBS洗涤3次之后，向各孔中加入100μL/孔的底物(4-硝基苯基磷酸二钠盐六水合物，Fluka，1mg/mL于二乙醇胺底物缓冲液中，Pierce)，并在室温下温育5-15分钟，同时轻轻摇动。通过用UV-Vis分光光度计对板进行扫描获取每个孔在405nm(A405)处的吸光度。
脲酶活性测定
脲酶催化脲水解成氨。一个单位的脲酶活性被定义为在pH7.3，在25°下每分钟释放一微摩尔氨的酶量。将V21H4-DOS47样品在样品稀释缓冲液(0.02M磷酸钾，其含有1mMEDTA和0.1％(w/v)BSA，pH7.3)中稀释。将100μl稀释的样品与2.00ml的0.25M脲(在含有0.3M磷酸钠和0.5mM EDTA的磷酸盐缓冲液中，pH7.3)混合，并在25±0.1℃下温育5分钟，然后通过加入1.00ml的1.0N HCl淬灭反应。为了测定酶反应溶液中产生的铵离子浓度，将100μl猝灭的反应溶液与2.00ml苯酚溶液(含有0.25mM亚硝基铁氰化钠的0.133M苯酚)在15ml试管中混合。在30秒之后，将2.50ml NaOH-NaOCL溶液(含有0.04％次氯酸钠的0.14N NaOH)添加至试管中，混合，并在37℃下温育15分钟。用试剂反应溶液(无样品)作为空白，在638nm处测定溶液的吸光度。根据下式计算脲酶的酶活性：U/ml＝D x(A x Tc x Te)/(5x E x Scx Se)，其中A＝638nm处的吸光度，Tc＝显色反应的总体积(4.60ml)，Te＝酶反应的总体积(3.10ml)，E＝每次测定条件下靛酚蓝的摩尔消光系数(20.10mM-1.cm-1)，Sc＝显色反应的样品体积(0.10ml)，Se＝酶反应的样品体积(0.10ml)，D＝稀释时间。按照制造商的说明，用Sigma总蛋白试剂盒(TP0200)测定每个样品的蛋白质浓度。通过将脲酶活性(U/ml)除以测试的蛋白质的量(mg/ml)来计算脲酶活性/mg缀合物。通过将活性/mg缀合物除以由脲酶组成的缀合物质量的比例来计算脲酶比活性。
蛋白质印迹
通过SDS-PAGE凝胶电泳解析V21H4-DOS47测试样品和对照，然后使用Bio-Rad印迹试剂盒将其转移至硝酸纤维素膜上。将1.2μg HPU和4.0μg V21H4作为对照，并将2.0μgV21H4-DOS47样品与60.0μl的蛋白质凝胶上样缓冲液混合。通过加热至60℃保持10分钟使所得的样品混合物变性，并且每个泳道上样10μl各样品。从平行运行的凝胶制备重复印迹用于脲酶和V21H4抗体探测。对于脲酶检测，使用兔抗脲酶IgG(Rockland)。为了检测V21H4抗体，使用兔抗美洲驼IgG(ImmunoReagents Inc.)。将与AP(Sigma)缀合的山羊抗兔IgG用作第二可视化抗体。用含有NBT/BCIP的AP缓冲液进行蛋白质印迹的最终显影。
质谱
对于所有质谱分析，使用Waters Xevo G2 QTOF质谱仪和Acquity UPLC系统H类。785.8426Da的锁定质量应用于实时点对点质量校准。LC-MS数据采集由Masslynx V4.1软件控制。
完整蛋白质质谱分析
将交联剂活化的抗体样品与5mM半胱氨酸在室温反应30分钟，在水中稀释至0.5-1mg/ml，并通过加入纯甲酸至终浓度为1％(v/v)进行酸化。使用BEH300 C4(1.7μm，2.1x50mm)柱。将柱温设定在60℃，将溶剂A(0.025％v/v TFA水溶液)和溶剂B(0.025％TFA的乙腈溶液)用于UPLC分离。UPLC以0.15ml/min的流速进行，梯度为20至60％的溶剂B，历时30分钟。LC-MS TIC(总离子计数)数据采集在分辨率模式下在500-3500Da的M/Z范围内进行，其中扫描速率为0.3/s，毛细管电压为3.0kV，样品锥孔电压为40V，萃取锥孔电压为4.0kV。离子源温度设定为100℃，并且去溶剂化温度设定为350℃。去溶剂化气体流速为600L/小时。用100fmole/μl Glu-Fib B以6.0μl/min的流速获取实时锁定质量TIC原始数据组(扫描/20s)。用BioPharmalynx软件(v1.2)以分辨率为10000的完整蛋白质模式处理质谱原始数据。质量匹配耐受性设定为30ppm，并且输入含有一个二硫键的每种抗体的蛋白质序列作为匹配蛋白质用于蛋白质匹配搜索。
V21H1-SM(PEG)2-Cys和V21H4-BM(PEG)2-Cys的胰蛋白酶消化
将交联剂活化的抗体样品与10mM半胱氨酸在室温下反应30分钟，然后用100mM碳酸氢铵稀释至0.5mg/ml。将纯乙腈加入稀释的样品溶液中至终浓度为20％(v/v)。以20：1的蛋白质：蛋白酶比加入胰蛋白酶/Lys-C混合物(Promega,Ref#V507A)，并在37℃下消化16-20小时。将DTT加入到消化的样品中至终浓度为10mM，并将样品在37℃下温育30分钟以减少核心二硫键。在质谱分析之前通过加入至1％(v/v)的纯甲酸来终止消化。
V21H4-DOS47的胰蛋白酶消化
将100μg V21H4-DOS47与DTT混合至终浓度为10mM，并加入纯乙腈至终浓度为20％(v/v)。为了减少二硫键并使缀合的蛋白质变性，将样品混合物在60℃加热30分钟。通过在室温下以16000rcf离心5分钟使变性的蛋白质沉淀物沉淀。向沉淀中加入5.0μl 0.20M碘乙酰胺和100μl水，然后通过涡旋混合。将悬浮液在室温下以16000rcf离心5分钟，弃去上清液。将所得的沉淀溶解在100μl Tris-胍缓冲液(4M盐酸胍，50mM Tris,10mM CaCl2和10mM碘乙酰胺，pH8.0)中。在室温下于黑暗中进行该烷基化反应30分钟之后，用5mM DTT淬灭反应。用Tris缓冲液(50mM Tris,10mM CaCl2 pH 8.0)将所得的溶液稀释4倍。将胰蛋白酶/LysC混合物以25：1的蛋白质：蛋白酶比加入到稀释的样品溶液中。在37℃下进行16-20小时消化之后，通过加入终浓度为1％(v/v)的纯甲酸终止反应。
V21H1-SM(PEG)2-Cys、V21H4-BM(PEG)2-Cys和V21H4-DOS47胰蛋白酶消化物的LC-MSE肽图谱
将BEH300 C18(1.7μm,2.1x 150mm)柱用于UPLC分离。将柱温设定在60℃。将溶剂A(0.075％v/v甲酸水溶液)和溶剂B(0.075％甲酸于乙腈中)用于肽洗脱。以0.15mL/min的流速进行UPLC。将在50分钟内0至30％溶剂B的梯度用于分离V21H1-SM(PEG)2-Cys和V21H4-BM(PEG)2-Cys样品的胰蛋白酶消化物。对于V21H4-DOS47的胰蛋白酶消化物，使用在150分钟内0至45％溶剂B的梯度。LC-MSETIC(总离子计数)数据采集在分辨率模式下在50-2000Da的M/Z范围内进行，其中扫描速率为0.3/s，毛细管电压为3.0kV，样品锥孔电压为25V，并且萃取锥孔电压为4.0kV。将离子源温度设定为100℃，并且去溶剂化温度设定为350℃。去溶剂化气体流速为600L/小时。用100fmole/μL Glu-Fib B以3.0μL/min的流速获取实时锁定质量TIC原始数据组(扫描/20s)。通过仪器设置，将两个交错扫描功能用于数据采集。第一扫描功能获取样品中完整肽离子的MS谱，同时不向碰撞池施加能量。第二扫描功能获取相同质量范围的数据；然而，碰撞能量从20升到60eV。该扫描相当于非选择性串联质谱(MS/MS)扫描，并允许从前述扫描的离子中收集MSE片段光谱。高能碰撞诱导的碎片随机切割肽骨架键。对于切割的每个C-N肽骨架键，产生的氨基末端离子被称为“b”离子，产生的C末端离子被称为“y”离子。在表1-3中，标题为“MS/MS b/y可能值”的列表示如果蛋白质中的所有肽键等可能被破坏，则将针对每种肽产生的b和y离子的理论最大数量。标题为“MS/MS b/y实测值”的列表示针对每种肽鉴定的b和y离子的实际数量。b/y离子的鉴定提供了肽身份的明确确认。用BiopharmaLynx软件(v 1.2)以分辨率为20000的肽图模式处理质谱原始数据。将785.8426Da的锁定质量应用于实时点对点质量校准。低能量MS离子强度阈值设定为3000个计数，MSE高能离子强度阈值设定为300个计数。对于MS，质量匹配公差设定为10ppm，对于MSE数据组，为20ppm。具有1个错过的切割位点的肽包括在质量匹配搜索中。将V21H1、V21H4和脲酶(Uniprot P07374)蛋白质序列分别输入序列文库中用于肽匹配/鉴定。将包括脱酰胺N、脱酰胺琥珀酰亚胺N、氧化M、+K、+Na和脲甲基化C(对于烷基化的半胱氨酸)在内的可变修饰物应用于肽图分析。将SM(PEG)2-Cys(429.1206Da)设定为可变修饰物以鉴定V21H1缀合的活化位点，而将BM(PEG)2-Cys(431.1362Da)作为可变修饰物输入以鉴定V21H4缀合的活化位点。对于V21H4-DOS47胰蛋白酶消化物，将GGGEEDDGC-BM(PEG)2(SEQ ID NO:72)(1145.3453Da)设定为可变修饰物以鉴定脲酶上的缀合位点。
流式细胞术
使用非酶促细胞解离缓冲液(Sigma)从烧瓶中分离293或293/KDR细胞。将细胞以300×g离心5分钟，然后以106个细胞/mL重悬于染色缓冲液(含有Ca2+和Mg2+，0.02％NaN3，2％FBS的PBS)中。将100μL细胞加入96孔板的孔中。将板以350×g离心4分钟，除去缓冲液，然后将细胞重悬于50μL抗体-脲酶缀合物或生物素化的抗体(在染色缓冲液中稀释)中，然后在2-8℃温育1小时。对于用抗体-脲酶缀合物染色的细胞，用染色缓冲液洗涤细胞3次，然后重悬于5.8μg/mL(在染色缓冲液中稀释)小鼠抗脲酶(Sigma，目录#U-4879)中，在2-8℃下温育30分钟。对于所有样品，用染色缓冲液洗涤细胞3次，然后将细胞重悬于3μg/mL(在染色缓冲液中稀释)AF488-抗小鼠IgG(Jackson，目录#115-545-164)中(对于抗体-脲酶样品)或用133ng/mL(在染色缓冲液中稀释)PE-SA(Biolegend，目录#405204)(对于生物素化的抗体)。将所有细胞在2-8℃下于黑暗中温育30分钟，用染色缓冲液洗涤3次，然后重悬于1％多聚甲醛(在PBS中稀释)中。将板在室温下温育15分钟，用锡箔覆盖。然后如上所述离心板，除去多聚甲醛，并将细胞重悬于染色缓冲液中。将板用锡箔覆盖并储存在2-8℃直至使用Guava流式细胞仪和guavaSoft软件(Millipore)进行分析。S/N值是结合293/KDR细胞的V21H4-DOS47对比结合293细胞的V21H4-DOS47的比值或结合293/KDR细胞的生物素-V21H4对比生物素同种型对照抗体(抗CEACAM6)的比值。
结果
V21H1的产生和纯化
当产生用于免疫缀合物药物的单结构域抗体时，必须以高产量和可控过程，包括表达、蛋白质重折叠和纯化，产生高纯度抗体。其它考虑因素包括以下：抗体的pI应使得抗体-缀合物在生理pH下是稳定且可溶的，抗体的特性应适合于缀合化学反应，并且在缀合反应期间抗体残基的修饰不应损害抗体与其抗原结合的亲和力。
V21骆驼科动物抗体具有122个氨基酸(SEQ ID NO:2)。将11个氨基酸加入V21抗体的C末端以产生V21H1(SEQ ID NO:3)。通过加入这些氨基酸，抗体的pI从8.75变为5.44，这是缀合物稳定性和溶解性所需的。异双功能化学交联剂SM(PEG)2与胺和巯基反应，并被选择用于将V21H1与脲酶缀合：
步骤1
步骤2
步骤1为使用SM(PEG)2活化抗体。步骤2将活化的抗体与脲酶缀合。
核心V21序列中有五个赖氨酸残基，其中两个(Lys66和Lys101)分别位于CDR2和CDR3序列中。由于这些氨基酸可以通过SM(PEG)2使用的胺缀合化学修饰(可能改变抗体活性)，因此将两个额外的赖氨酸残基加入抗体C末端以使这种可能性最小化。
V21H1主要在BL21(DE3)细菌的细胞溶质溶液中表达，在包涵体中几乎不表达。因此，在细胞裂解之后，通过乙醇结晶和阳离子交换色谱将抗体与细菌蛋白质分离。在抗体重折叠之后，通过阴离子交换色谱进一步纯化天然抗体。为了确认纯化的抗体的分子量与设计的蛋白质序列相匹配，进行了LC-MS完整蛋白质分析。从LC-MS TIC色谱图中未检测到杂质蛋白质，并且检测到的V21H1的分子量与从其蛋白质序列计算的理论值在30ppm质量匹配误差内相匹配(数据未显示)。然而，纯化的V21H1的产量非常低(培养物为4-6mg/L)，并且所用的纯化方法不适合大规模cGMP生产。
V21H1的交联剂活化
使用先前发现的对于在抗体-脲酶缀合物L-DOS47的产生中用SIAB活化AFAIKL2抗体为最佳的条件，在pH7.0下用SM(PEG)2活化V21H1。由于SIAB和SM(PEG)2的NHS-酯反应相同，并且AFAIKL2和V21H1反应产物的LC-MS谱相似(数据未显示)，这些条件对用SM(PEG)2活化V21H1也应该是最佳的。
只有SM(PEG)2的NHS-酯基团可以与V21H1反应。V21H1抗体中的两个半胱氨酸残基形成二硫键，因此不能与交联剂的马来酰亚胺基末端反应。来自抗体N末端的伯胺和来自蛋白质序列的赖氨酸残基都可能与交联剂的NHS-酯反应。然后携带抗体的交联剂的马来酰亚胺基末端与脲酶分子表面上的半胱氨酸反应。由于周围的天然结构，每种胺被活化的可能性取决于其可接近性。为了避免在第二反应步骤中形成脲酶二聚体和聚合物，理想地，每个抗体仅一个胺将被NHS-酯活化。然而，由于每个抗体中存在多个伯胺，因此统计学上不可避免的是一些V21H1抗体将被多于一个的交联剂分子活化。选择最佳活化条件，其使由多于一个交联剂活化的抗体的百分比最小化，同时使活化抗体的总量最大化。为了评估活化分布，使SM(PEG)2活化的V21H1与过量的半胱氨酸反应，并通过完整的质谱分析进行评价。质谱显示在图9中。大约50％的V21H1被SM(PEG)2活化，并且活化的抗体中，大约30％被两个交联剂活化。因此，只有35％的V21H1抗体被最佳活化以与脲酶交联。
为了确定V21H1的哪个赖氨酸被SM(PEG)2靶向，对V21H1-SM(PEG)2-Cys进行胰蛋白酶消化，然后进行LC-MSE分析。胰蛋白酶切割精氨酸和赖氨酸残基的C-末端侧的肽骨架键(除非脯氨酸直接在K或R的C-末端)。如果赖氨酸被SM(PEG)2活化，则赖氨酸的极性和侧链结构被改变并在空间上被阻断。因此，蛋白酶不再可接近该胰蛋白酶位点。例如，如果V21H1的K66被SM(PEG)2活化，则其与-SM(PEG)2-Cys连接，并且不再可供胰蛋白酶消化利用；因此，应观察到分子量为2862.3018(2431.1656+431.1362)Da的峰，其代表–SM(PEG)2-Cys连接的赖氨酸位于中间的肽，(ELVAAISWSDDSTYYANSVK66GR)-SM(PEG)2-Cys。在LC-MSE肽图谱分析中，可以通过用-SM(PEG)2-Cys(431.1362Da)作为可变修饰物搜索所有携带赖氨酸的肽和N-末端肽来鉴定所有可能的活化位点。检测到的胰蛋白酶肽以及缀合位点列于表2中。
表2：V21H1-(PEG)2-Cys的鉴定的肽和活化位点的列表。围绕胰蛋白酶肽组的粗框(也为蓝色阴影)表示用于计算每个活化位点的活化％的相关肽组。nd＝未检测到。
以小于5ppm的质量匹配误差检测到所有胰蛋白酶肽，并且氨基酸序列回收率为100％。假设ESI灵敏度不受修饰物连接的影响，通过比较交联剂修饰肽的强度与所有相关肽的总强度来评估活化百分比。在所用的活化条件下，CDR2中的赖氨酸残基K66基本上(全部活化的V21H1抗体的～约25％)被交联剂活化；然而，CDR3中的K101在交联剂活化期间未被修饰。令人惊讶的是，出于缀合化学目的有意加入的两个C-末端赖氨酸残基未被交联剂修饰。
V21H4的生产和纯化
设计抗体V21H4以改善V21H1的生产、纯化和交联剂活化期间确认的问题。V21H4抗体的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：6中。对于V21H1，将许多氨基酸残基加入V21抗体C-末端(G123-C136)，并将抗体的pI从8.75调整到5.43。对于V21H1，抗体CDR2区域中SM(PEG)2交联剂活化的K66的存在是一个问题，这是因为这可能损害抗体结合亲和力。因此，使用不同的交联剂BM(PEG)2将半胱氨酸残基(C136)加入到V21H4中以进行巯基-至-巯基交联：
步骤-1
步骤-2
步骤1为使用BM(PEG)2活化抗体。步骤2将活化的抗体与脲酶缀合。
包含C-末端半胱氨酸也允许抗体在细菌包涵体中表达。由于V21抗体的两个核心半胱氨酸残基形成二硫键并且不能用于化学缀合，因此另外的C-末端半胱氨酸残基为靶向缀合提供了独特的活化位点。
V21H4在包涵体中以高水平表达。在细胞裂解之后，通过离心将抗体与细菌基质蛋白分离。通过阳离子交换色谱纯化变性抗体以除去核酸和其它蛋白质。V21H4抗体的重折叠以易于控制的方式进行，并通过HPLC监测(图10)。
通过将阳离子交换柱的峰级分与重折叠缓冲液混合来引发重折叠过程。虽然在没有胱胺的情况下折叠过程非常缓慢，但在加入胱胺至终浓度为1.2mM之后，在室温下在两小时内完成折叠。阴离子交换色谱用于分离正确折叠的蛋白质，并且通常观察到大于80％的产率。纯化的V21H4的典型产量为20-40mg/L培养物，其远高于V21H1的产量。此外，用于生产和纯化V21H4的方法适合扩大规模和cGMP程序。
V21H4的交联剂活化
V21H4的C-末端半胱氨酸是与脲酶缀合所必需的。然而，由于胱胺包含在V21H4重折叠缓冲液中，通过与半胱胺(半胱胺-H)形成二硫键来修饰C-末端半胱氨酸。这通过LC-MS完整蛋白质分析确认(图11A)。因此，必须除去半胱胺，随后半胱氨酸必须可供通过交联剂活化利用。此外，这种除去必须在用于缀合目的天然条件下使用可控的温和还原来进行，并且它不能减少抗体的内部二硫键。如图11B所示，在室温下用pH7.1的2mM TCEP将V21H4还原1小时之后，检测到的抗体分子量为14667.94Da，表明已除去保护性半胱胺。为了确认去保护的半胱氨酸残基对交联剂具有活性，将10mM碘乙酰胺加入去保护的V21H4抗体中。在室温下在pH 7.5-8.0下30分钟之后，所得的检测分子量增加至14724.83Da(图11C)，表明羧甲基(57.05Da)被烷基化为半胱氨酸残基。总之，可以除去C-末端半胱胺，并且所得的去保护的半胱氨酸可用于化学缀合。还用胰蛋白酶消化烷基化抗体，并通过LC-MSE肽图谱对其进行评价。LC-MSE肽图(数据未显示)覆盖了100％的氨基酸序列，并且C-末端半胱氨酸被特异且有效地烷基化，确认了在靶向巯基交联化学反应中去保护还原反应的特异性和C-末端半胱氨酸的适应性。
通过交联剂BM(PEG)2活化V21H4抗体。由于BM(PEG)2为同型双功能交联剂，可能的是BM(PEG)2的两个马来酰亚胺基团都能够与两个V21H4分子反应并与其连接，导致产生不能与脲酶缀合的抗体二聚体。产生的抗体二聚体的频率取决于反应物的摩尔比、半胱氨酸残基的天然疏水性环境和反应溶液中分子的相对迁移率。用10：1的交联剂与抗体的摩尔比进行该反应。此外，交联剂的分子量为308.29Da，其比抗体的分子量小大约50倍。为了评价活化的V21H4抗体，将100μl活化的抗体溶液与过量的半胱氨酸反应，并通过完整的质谱分析进行评价(图11D)。在所用的实验条件下，超过99％的V21H4与单个交联剂连接，留下交联剂的其它马来酰亚胺基团可供随后的脲酶反应利用。
为了确认C-末端半胱氨酸为BM(PEG)2的唯一靶标，对V21H4-BM(PEG)2-Cys进行胰蛋白酶消化，然后进行LC-MSE分析。如果C末端半胱氨酸被交联剂活化，则应检测质量为1266.3652Da的峰，其代表交联剂活化的肽GGGEEDDGC136-BM(PEG)2-Cys(SEQ ID NO:73)。如果在交联剂活化之前通过TCEP还原核心二硫键，则应鉴定两个峰-一个代表肽LSC23AASGR-BM(PEG)2-Cys(SEQ ID NO:74)(1192.4852Da)，另一个代表SAVYLQMNSLKPEDTAVYYC97AAHK-BM(PEG)2-Cys(SEQ ID NO:75)(3130.4087Da)。检测到的胰蛋白酶肽以及交联剂活化位点列于表3中。
表3：V21H4-(PEG)2-Cys的鉴定的肽和活化位点的列表。围绕胰蛋白酶肽组的粗框(也为蓝色阴影)表示用于计算每个活化位点的活化％的相关肽组。nd＝未检测到。
以小于5ppm的质量匹配误差检测到所有胰蛋白酶肽，并且氨基酸序列回收率为100％。如所预期的，超过90％的C-末端半胱氨酸被交联剂活化，并且仅检测到痕量的交联剂活化的核心半胱氨酸残基(Cys23和Cys97)。这比用V21H1和SM(PEG)2观察到的情况更加可取，在V21H1和SM(PEG)2中的多个赖氨酸被靶向，包括CDR2中的一个赖氨酸。
V21H1和V21H4与脲酶的缀合以及最初表征
刀豆脲酶为每个亚基大约91kDa的同型六聚体酶。在每个亚基的15个未结合的半胱氨酸残基中，5个位于天然结构的表面上，并且可供通过马来酰亚胺基交联剂连接到单结构域抗体利用(Takishima等人,1998)。不同的缀合化学反应广泛用于蛋白质缀合。无铜点击化学反应优先用于蛋白质标记和蛋白质-药物缀合(Thirumurugan等人,2013)，并且是我们的抗体与脲酶缀合的潜在选择。然而，在进行点击化学反应之前，需要NHS-酯或马来酰亚胺基活化步骤。因此，传统的交联化学反应更简单并且适合于这种特定情况。
在V21H1和V21H4交联之后，然后使它们与脲酶缀合以分别产生V21H1-DOS47和V21H4-DOS47。在两种情况下，巯基化学反应用于将抗体-接头与脲酶缀合。进行SDS-PAGE以评价两种缀合物(图12A)。
在缀合期间，六个单体脲酶亚基中的每一个都可能与多达五个抗体分子交联；因此，在变性SDS-PAGE条件下，预期V21H1-DOS47和V21H4-DOS47均会产生范围为～90-180kDa的六个不连续条带的图案。然而，看起来每个脲酶缀合最多四个抗体，这是因为仅观察到五个不连续的条带(图12A，簇1)。这表明脲酶表面上的五个半胱氨酸残基之一几乎没有或没有与马来酰亚胺反应的能力。
除了预期的五个不连续条带之外，还观察到V21H1-DOS47和V21H4-DOS47的另外的条带簇。对于V21H1 DOS47，两个另外的簇是明显的。簇2(有效MW为～200至250Da)和簇3(有效MW>300Da)可能是由携带多个SM(PEG)2交联剂的V21H1物质产生的脲酶二聚体和聚合物。虽然这些较高分子量的物质可以由多种天然脲酶分子组成，但通过尺寸排阻色谱观察到的低水平(小于5％)的二聚体和聚合物峰(图12B)表明，这些物质中的大多数由单一天然脲酶分子的亚基间连接组成，而不是分子间连接组成。
对于V21H4-DOS47，由于BM(PEG)2仅活化C-末端半胱氨酸，理论上应仅存在一个条带簇。然而，如在泳道5和6中所证明的，在V21H4-DOS47泳道中观察到另外的簇(MW≥150kDa)。第二簇可能由非共价二聚体组成，所述非共价二聚体在缀合的亚基在凝胶中迁移时形成。这通过SDS-PAGE毛细管电泳(未显示)确认，其中未观察到二聚体簇。因此，V21H4-DOS47不含交联脲酶二聚体或聚合物。
SDS-PAGE也用于测定每种天然脲酶六聚体-抗体缀合物的抗体：脲酶缀合比。簇1中的条带强度(图12A)取决于与不同数量的抗体分子连接的脲酶单体的相对丰度。ImageLab软件用于生成对应于条带强度的直方图，并对每个直方图的峰面积求积分。如下计算天然脲酶六聚体的缀合比(CR)：
CR＝6*(PK1*0+PK2*1+PK3*2+PK4*3+PK5*4)/(PK1+PK2+PK3+PK4+PK5)
其中PKi(i＝1-5)为与i-1个抗体分子连接的脲酶单体的峰面积。
虽然存在与每个脲酶单体缀合的可变数量的抗体，但可以预测每个脲酶六聚体的抗体数量变化较小，这是因为单体随机聚集形成六聚体。这通过天然V21H4-DOS47的SEC确认，其中观察到缀合物作为紧密峰迁移(图12B)。V21H4-DOS47缀合方法可重复地产生每个脲酶具有8.7-9.2个抗体的缀合物(基于三批)。
在天然条件下通过尺寸排阻色谱(SEC)评估抗体、HP脲酶和缀合物的纯度和有效分子量(图12B)。
V21H1和V21H4抗体在相当的时间(35.9分钟)洗脱。游离HP脲酶在26分钟洗脱。对于V21H1-DOS47和V21H4-DOS47，由于抗体分子与脲酶分子相连，使得缀合物比游离脲酶更大，所以缀合物比游离脲酶更早洗脱。然而，有趣的是V21H1-DOS47在V21H4-DOS47之前一分钟洗脱(22.80分钟对比23.80分钟)。两种缀合物具有几乎相同的缀合比(对于V21H1-DOS47为8.8个抗体/脲酶，对于V21H4-DOS47为8.7个抗体/脲酶)。V21H4抗体比V21H1多三个氨基酸(159.20Da)；然而，理论上较大的V21H4-DOS47缀合物比其对应物V21H1-DOS47在SEC中的有效分子尺寸看起来更小。这意味着V21H4-DOS47在天然条件下比V21H1-DOS47更紧凑。
每种物质的大多数是单体形式，其中在每个单体峰的前面出现小的二聚体峰。值得注意的是，V21H1-DOS47缀合程序需要SEC步骤才能获得高纯度(96％)。SEC步骤除去由两个交联剂活化的V21H1抗体产生的脲酶聚合物。然而，SEC步骤对于产生V21H4-DOS47不是必要的，因为V21H4抗体仅由一个交联剂活化。对于V21H4-DOS47，通常仅使用渗滤除去未结合的V21H4抗体获得大于97％的纯度。由于SEC方法不易转移到大规模GMP过程，因此生产V21H1-DOS47用于临床应用在技术上更加困难和昂贵。
V21H1-DOS47和V21H4-DOS47的活性
进行ELISA测定以评价V21H1-DOS47(9.2个抗体/脲酶)、V21H4-DOS47(8.8个抗体/脲酶)和生物素-V21H4与重组VEGFR2/Fc的结合(图13A)。V21H4-DOS47(EC50＝44pM)以比V21H1-DOS47(EC50＝226pM)高大约5倍的亲和力结合VEGFR2/Fc。由于大量的V21H1经由CDR2中存在的赖氨酸与脲酶缀合，因此这并不令人惊讶。V21H4-DOS47还以比单独的V21H4抗体(EC50＝1.8nM)高大约40倍的亲和力结合VEGFR2/Fc。这很可能是由于缀合物的多价性质。由于V21H4-DOS47是优良的缀合物，因此仅对V21H4-DOS47进行随后表征。
通过流式细胞术评价V21H4抗体和V21H4-DOS47缀合物结合表达VEGFR2的细胞(293/KDR)的能力(图13B)。生物素-V21H4(EC50＝1.6nM)以与重组VEGFR/Fc(EC50＝1.8nM,图13A)相似的亲和力结合293/KDR细胞。这表明VEGFR2抗体表位在ELISA测定的重组VEGFR2/Fc中以及293/KDR细胞的细胞表面上是可同等接近的。有趣的是，V21H4-DOS47(EC50＝1.2nM)与293/KDR细胞的结合非常类似于生物素-V21H4抗体与这些细胞的结合(EC50＝1.6nM)。虽然在用VEGFR2/Fc的ELISA测定中，与V21H4抗体相比，观察到V21H4-DOS47的亲和力提高，但是未观察到细胞结合。这表明在293/KDR细胞表面上表达的VEGFR2的密度低于ELISA板的孔中的密度。
几个因素有助于确定理想的抗体/脲酶结合比。在缀合反应期间，脲酶分子通过与V21抗体连接而改变；因此，根据缀合比，脲酶活性可能受到影响。另一方面，随着更多抗体与脲酶连接，抗体-脲酶复合物的亲合力增加。为了评价缀合比对脲酶活性和结合活性的影响，通过调节V21H4/HPU摩尔比产生具有不同缀合比(1.4至9.4个V21H4/脲酶)的V21H4-DOS47缀合物。
未修饰的脲酶的活性为大约4500U/mg。当抗体与脲酶缀合时，大约40％的活性丧失(图13C)。然而，脲酶活性与缀合的抗体的数量无关，这是因为在测试的所有缀合比下活性保持一致。使用重组VEGFR2/Fc进行ELISA测定以评价具有不同数量的抗体/脲酶的缀合物的结合(图13D)。当从1.4个抗体/脲酶增加至2.3个抗体/脲酶时，缀合物与VEGFR2/Fc的结合提高，如EC50值从226pM降低至93pM所示。增加一个抗体(3.3个抗体/脲酶)使EC50进一步降低至58pM。然而，增加后续的抗体/脲酶具有有限的益处：9.4个抗体/脲酶，EC50为31pM。因此，当存在大于3.3个抗体/脲酶时，亲和力仅略微改善。因此，3.3个抗体/脲酶的缀合比对于最佳的脲酶活性和缀合物结合是足够的。
V21H4-DOS47的另外表征
进行V21H4-DOS47的双组蛋白质印迹(图14)以确认SDS-PAGE所见的条带图案。在蛋白质印迹中，凝胶中形成的二聚体和聚合物簇比它们在SDS-PAGE中出现的更显著(图12A)。当用抗脲酶抗体探测时，在分子量～85kDa处可视化脲酶条带，并且与1至4个抗体结合的脲酶亚基的条带与通过SDS-PAGE所见的图案相匹配。当用抗美洲驼抗体探测时，未观察到游离脲酶亚基条带，并且看到抗体-脲酶缀合物条带与用抗脲酶抗体探测时为相同的模式。通过抗美洲驼和抗脲酶抗体可视化V21H4-DOS47的能力证明缀合物中存在两种物质。
ESI-LC-MSE肽图谱分析用于确认V21H4和脲酶的身份以及鉴定V21H4-DOS47的缀合位点。V21H4-DOS47和HPU的LC-MS(TIC)色谱图显示在图15A中。
鉴定的肽以小于4ppm的质量匹配误差覆盖100％的V21H4和脲酶蛋白质序列。通过升高的能量MS/MS确认所有鉴定的具有多于3个残基的肽，鉴定出至少一半的b/y离子。由于只有V21H4的C末端GGGEEDDGC(SEQ ID NO:76)(837.2446Da)与不同的携带半胱氨酸的脲酶肽连接，缀合位点(表示为UCx-VC136，其中x是脲酶蛋白质序列中的氨基酸)是由GGGEEDDGC-BM(PEG)2(SEQ ID NO:72)(1145.3453Da)修饰的那些脲酶肽。为了鉴定那些共价缀合位点，来自V21H4-DOS47样品的胰蛋白酶消化物的ESI LC-MSE原始数据由BiopharmaLynx处理，并针对脲酶蛋白质序列进行搜索，其中1145.3453Da的可变修饰物应用于所有15个脲酶半胱氨酸残基。为了评估每个缀合位点的相对频率，将缀合的肽UCx-VC136的肽强度与所有与UCx相关的肽的总强度进行比较，以产生缀合％(表4)。
表4：ESI LC-MSE肽图谱分析。由V21H4-(PEG)2-Cys修饰的脲酶半胱氨酸残基的鉴定。na＝不适用。
在每个脲酶亚基的15个半胱氨酸残基中，仅4个是缀合的(与通过SDS-PAGE观察到的条带一致，图12A)。最易接近的半胱氨酸是C824(26.7％)，随后依序是C663(4.2％)、C59(2.6％)和C207(0.6％)。没有检测到与半胱氨酸残基C592的缀合，这对于脲酶活性是必需的。这与在所有缀合比下脲酶活性相当的观察结果一致(图13B)。
缀合位点也被鉴定为由-UCx修饰的V21H4肽(UCx+308.1008Da)。这是通过针对-UCx作为V21H4的C-末端半胱氨酸的可变修饰物搜索V21H4抗体蛋白质序列来完成的(表3)。在鉴定的胰蛋白酶肽中，0.4％的胰蛋白酶肽未经修饰(T：012)。该痕量的肽可能是由交联剂通过核心序列的C23和C97活化的V21H4部分。可选地，该肽可以是连接于C末端半胱胺的痕量V21H4，所述半胱胺在TCEP还原步骤中未去保护。这些结果与用-VC136修饰的脲酶肽观察到的结果一致。大多数V21H4 C-末端半胱氨酸经由C824(59％)与脲酶缀合，在C663(27％)、C59(12％)和C207(1.2％)具有较少的缀合。
用脲酶和V21H4肽的b/y离子图谱确认缀合位点的身份。在16个可能的V21H4 b/y离子中，从三个主要的脲酶缀合位点仅鉴定了一些(4-7)。这可能是GGGEEDDGC(SEQ ID NO:76)残基的ESI电离特性的结果，其导致电离环境中缺乏正电荷中心。然而，可以通过观察V21H4和脲酶蛋白质来评估MS/MS b/y片段谱(图15B)。例如，通过搜索LLCVSEATTVPLSR(SEQID NO:77)(用来自V21H4侧的(GGGEEDDGC)-连接(1145.3453Da)作为修饰物进行修饰的脲酶肽)，以2.1ppm的质量匹配误差鉴定序列为(LLCVSEATTVPLSR)-连接-(GGGEEDDGC)且肽质量为2633.1472的缀合肽UC663-VC133。通过搜索GGGEEDDGC(用来自脲酶侧的(LLCVSEATTVPLSR)-连接(1795.9026Da)作为修饰物进行修饰的V21H4 C-末端肽)，也以2.1ppm的质量匹配误差鉴定了相同的肽。通过搜索用来自V21H4侧的修饰物进行修饰的脲酶肽，用来自脲酶侧的13个b/y碎片离子映射该缀合肽的MSE碰撞诱导的MS/MS谱。通过搜索用来自脲酶侧的修饰物进行修饰的V21H4肽，用来自V21H4侧的7个b/y离子也映射了相同的光谱。
讨论
抗体药物缀合物正在成为一类有前景的抗癌药物。通过将药物直接递送至靶部位，减少了非特异性副作用。我们先前已经描述了L-DOS47的产生和表征，L-DOS47是由脲酶和抗CEACAM6抗体组成的ADC(Tian等人,2015)。L-DOS47目前正处于治疗非小细胞肺癌的I/II期试验阶段。目前，产生并表征包括靶向VEGFR2的缀合物V21H4-DOS47的缀合物。虽然L-DOS47和V21H4-DOS47都是通过将脲酶与美洲驼抗体缀合而产生的，但需要相当多的研究来产生成功的V21H4-DOS47缀合物。例如，使用与L-DOS47中相同的接头SIAB(SIAB是短且刚性的接头)产生的最初V21-DOS47缀合物不如使用PEG2类接头(其相对较长且灵活)那样成功，现在本文证明了缀合物的结合活性得到显著改善。
在本研究中，我们开发了缀合和纯化适合于大规模cGMP生产的V21-DOS47免疫缀合物的程序。单结构域骆驼科动物抗体非常适合用于产生抗体-酶缀合物。它们的小分子尺寸允许它们大量经济实惠的生产。重要的是，它们目前通过在C-末端加入短的氨基酸标签进行修饰。标签用于若干目的，包括修饰抗体pI，促进靶向抗体表达和添加特异性反应位点。由于脲酶的pI在4.8至5.1范围内，用未修饰的核心抗体产生的抗体-脲酶缀合物将产生pI为大约7的缀合物。在该pI下，缀合物不稳定，并且在缀合期间和之后形成沉淀物。添加短的C-末端肽标签将抗体的pI从8.75调节至5.43，产生pI在4.8至5.5的缀合物，其在缀合和纯化期间是稳定的。C末端标签还通过靶向细菌包涵体的表达来提高抗体产生的产量。这允许仅使用离子交换色谱进行抗体纯化。由于V21序列分别在CDR2和CDR3序列中含有两个赖氨酸残基，赖氨酸-至-巯基交联化学反应可以修饰这些赖氨酸残基，损害缀合物与其靶抗原的结合亲和力。为此，C末端半胱氨酸残基包括在V21H4的C末端标签中，用于巯基-至-巯基交联化学反应。LC-MSE表征确认了通过赖氨酸-至-巯基交联化学反应修饰CDR2赖氨酸残基，并且ELISA结合测定确认了通过巯基-至-巯基交联化学反应产生的V21H4-DOS47的亲和力比通过赖氨酸-至-巯基交联化学反应产生的V21H1-DOS47缀合物强大约6倍。
虽然添加C-末端半胱氨酸残基证明在V21H4-DOS47的缀合中非常有用，但是应理解，当与其它美洲驼抗体一起起作用时，在确定是否可以使用该策略之前，可能有必要评价任何核心半胱氨酸残基的状态。这是因为巯基-至-巯基化学反应仅独特地靶向C-末端半胱氨酸，因为核心半胱氨酸残基以二硫键连接，因此不能用于修饰。
蛋白质重折叠可为缓慢且不可重复的过程。通常，通过稀释或透析进行重折叠，并且该过程可能需要数天。此外，产量通常较低(Yamaguchi和Miyazaki,2014)。DTT/胱胺氧化还原对的引入导致短的和可再现的重折叠过程，该过程产生高产量的活性V21H4抗体，其可用于大规模生产。
将抗体与脲酶缀合的一个益处是与单独的抗体相比，缀合物的亲和力明显增加以为肿瘤提供脲酶。通过每个脲酶聚集多个抗体，亲合力由于复合物的相对解离速率慢于游离抗体而增加。然而，抗体亲合力的改善必须通过加入抗体对脲酶的潜在不利作用来平衡，包括脲酶活性的损害和缀合物的免疫原性增加。此外，高缀合比会增加生产成本和复杂性。每种抗体-脲酶缀合物可以具有不同的理想缀合比，这是因为靶抗原的可得性不同，并且脲酶表面上呈递的抗体的取向和活性随着不同的缀合化学反应而变化。在本研究中，我们观察到在缀合比大于3.3时抗原结合几乎没有改善。这与L-DOS47形成对比，在L-DOS47中结合增加直至每个脲酶缀合8个抗体。与L-DOS47相比，使用更柔韧的接头产生V21H4-DOS47可以部分解释这种差异，这是因为抗体可能更易接近靶抗原。然而，两种缀合物之间的差异很可能是由于以下事实：AFAIKL2(L-DOS47的抗体组分)对其靶抗原的亲和力比V21对VEGFR2(数据未显示)低得多。因此，抗体多聚化对AFAIKL2的作用比对V21的作用更显著。
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示出前述描述和实施例仅用于说明本发明，而非旨在是限制性的。本发明的每个公开的方面和实施方案可以单独考虑或与本发明的其它方面、实施方案和变型组合考虑。此外，除非另有说明，否则本发明方法的任何步骤都不限于任何特定的实施顺序。
本领域技术人员可以想到掺入本发明的精神和实质的公开实施方案的修改，并且这些修改在本发明的范围内。此外，本文引用的所有参考文献均通过引用整体并入。

Claims (39)

1.缀合物，其包含与脲酶部分缀合的抗VEGFR-2抗体部分。
2.如权利要求1所述的缀合物，其中所述抗体部分经由交联剂与所述脲酶部分缀合。
3.如权利要求2所述的缀合物，其中所述交联剂相对长且柔韧。
4.如权利要求2或3所述的缀合物，其中所述交联剂为(PEG)2类交联剂。
5.如权利要求4所述的缀合物，其中所述交联剂为SM(PEG)2或BM(PEG)2。
6.如权利要求1至5中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物的缀合比为每脲酶部分约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11或约12个抗体部分。
7.如权利要求6所述的缀合物，其中所述缀合比最高达约3.3。
8.如权利要求7所述的缀合物，其中所述缀合比为约3.3。
9.如权利要求1至8中任一项所述的缀合物，其中所述脲酶部分为刀豆脲酶。
10.如权利要求1至9中任一项所述的缀合物，其中所述抗体部分为单结构域抗体或其片段或其部分。
11.如权利要求10所述的缀合物，其中所述抗体包含至少一个具有选自以下的序列的CDR：SYAMG、AISWSDDSTYYANSVKG、HKSLQRPDEYTY和与它们至少70％相同的能结合VEGFR2的序列。
12.如权利要求10所述的缀合物，其中所述单结构域抗体或其片段包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：SEQ ID NO:2-30、其片段及其变体。
13.如权利要求12所述的缀合物，其中所述变体与SEQ ID NO:2-30中的任一个具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、或99％的序列同一性，其中所述变体能结合VEGFR-2。
14.如权利要求1至13中任一项所述的缀合物，其还包含另外的缀合部分。
15.如权利要求1至14中任一项所述的缀合物，其被配制为组合物。
16.如权利要求15所述的缀合物，其还包含药学可接受的载体或稀释剂。
17.如权利要求15或16所述的缀合物，其中所述组合物为冻干的。
18.药物组合物，其包含适合于静脉内注射的药学可接受的水溶液和基本上不含未缀合的脲酶的抗VEGFR-2-脲酶缀合物。
19.如权利要求18所述的药物组合物，其中所述未缀合的脲酶小于5％。
20.如权利要求18或19所述的药物组合物，其不含非水性HPLC溶剂。
21.如权利要求18至20中任一项所述的药物组合物，其中所述pH为约6.0至6.8。
22.如权利要求18至21中任一项所述的药物组合物，其中所述缀合物的缀合比为每脲酶部分约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11或约12个抗体部分。
23.如权利要求22所述的药物组合物，其中所述缀合物的缀合比为每脲酶部分约6、约7、约8、约9、约10、约11或约12个抗体部分。
24.如权利要求23所述的药物组合物，其中所述缀合物的缀合比为每脲酶部分约8、约9、约10、约11或约12个抗体部分。
25.如权利要求22所述的药物组合物，其中所述缀合物的平均缀合比为每脲酶部分约6或更多个抗体部分。
26.如权利要求22所述的药物组合物，其中所述缀合物的平均缀合比为每脲酶部分约9.2个抗体部分。
27.如权利要求18至26中任一项所述的药物组合物，其中所述脲酶为刀豆脲酶。
28.如权利要求18至27中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体为单结构域抗体。
29.如权利要求10所述的药物组合物，其中所述单结构域抗体为/包含选自以下的序列：SEQ ID NO:2-30或者与其至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％相同的序列，或者与其基本上相同的序列。
30.如权利要求29所述的药物组合物，其中所述单结构域抗体包含选自SEQ ID NO:54-69的接头。
31.如权利要求30所述的药物组合物，其中所述接头序列还包含C-末端半胱氨酸。
32.如权利要求31所述的药物组合物，其中所述接头为GSEQKGGGEEDDGC。
33.如权利要求18至32中任一项所述的药物组合物，其为冻干的。
34.如权利要求18至33中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体对VEGFR-2具有高于约1 x 10-6M的数值的结合亲和力。
35.治疗对象中癌症的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的权利要求18-34中任一项所述的组合物，从而治疗所述对象中的癌症。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述癌症为表达VEGFR-2的实体瘤。
37.如权利要求35或36所述的方法，其中所述对象为人。
38.试剂盒，其包含权利要求18至34中任一项所述的组合物和使用说明书。
39.缀合物，其包含与脲酶缀合的一种或多种抗VEGFR-2抗体，其中所述一种或多种抗VEGFR-2抗体包含SEQ ID NO:2-30中的一个或多个或其片段及变体。
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