NO336811B1 - Farmasøytisk sammensetning for bruk ved inhibering av vekst av en fast tumor - Google Patents

Farmasøytisk sammensetning for bruk ved inhibering av vekst av en fast tumor Download PDF

Info

Publication number
NO336811B1
NO336811B1 NO20050793A NO20050793A NO336811B1 NO 336811 B1 NO336811 B1 NO 336811B1 NO 20050793 A NO20050793 A NO 20050793A NO 20050793 A NO20050793 A NO 20050793A NO 336811 B1 NO336811 B1 NO 336811B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
urease
cells
tumor
cell
individual
Prior art date
Application number
NO20050793A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20050793L (no
Inventor
Heman Chao
Original Assignee
Helix Biopharma Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Helix Biopharma Corp filed Critical Helix Biopharma Corp
Publication of NO20050793L publication Critical patent/NO20050793L/no
Publication of NO336811B1 publication Critical patent/NO336811B1/no

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/50—Hydrolases (3) acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5), e.g. asparaginase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/66—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid the modifying agent being a pre-targeting system involving a peptide or protein for targeting specific cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6891—Pre-targeting systems involving an antibody for targeting specific cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

2005-04-18 Sammendrag O. nr. E39220 Det tilveiebringes farmasøytiske preparater og en metode for anvendelse ved inhibering av vekst av cancerceller i pattedyr. Preparatet inkluderer et urease enzym og assosiert med dette, en kjemisk del effektiv til å forbedre avlevering av enzymet til cancercellen når preparatet administreres til individet. Det beskrives videre en fremgangsmåte for å forbedre effektiviteten av svakt basiske antitumor forbindelser, en metode som bedømmer nærværet, størrelsen eller tilstanden av en fast tumor i et individ. Det beskrives videre et genterapi preparat for behandling av cancer i et individ. FIG. 1

Description

Foreliggende oppfinnelse angår farmasøytiske sammensetninger, som omfatter et urease enzym konjugert til et anti-tumor antigen antistoff, for bruk ved inhibering av vekst av en fast tumor. Videre vedrører også oppfinnelsen anvendelse av et urease enzym, som er konjugert til et anti-tumor antigen antistoff, sammen med en svakt basisk antitumor forbindelse for fremstilling av et medikament for behandling eller diagnostisering av cancer.
Cancer står for en femtedel av den totale mortalitet i de Forente Stater og er nummer to når det gjelder å føre til død. Cancer karakteriseres typisk ved den ukontrollerte deling av en populasjon av celler. Denne ukontrollerte deling kan involvere blodceller som forskjellige typer lymfomer, eller celler som aggregerer i eller er native til et spesielt vev eller organ, for eksempel faste tumorer eller primære tumorer i bryst, lever, øsofagus, mage, innvoller, hjerne, ben og prostata.
Et antall behandlings modaliteter har vært foreslått for cancerterapi. Disse inkluderer generelt kirurgisk reseksjon av faste tumorer, behandling med stråling som røntgen, kjemoterapi, immunterapi og genterapi. De forskjellige terapityper som velges for en gitt cancer vil avhenge av slike faktorer som pasientenes alder, lokaliseringsgraden for canceren og typen og utviklingen av canceren. Ofte vil terapien involvere en kombinasjon av to eller flere modaliteter som røntgenterapi i kombinasjon med kjemoterapi, eller med immunoterapi i kombinasjon med kjemoterapi.
Et stort antall kjemoterapeutiske forbindelser og preparater og strategier har vært benyttet ved behandling av cancere. Mange anti-neoplastiske forbindelser er tilveiebrakt for å avbryte replikering av hurtigdelende celler eller for å inhibere en metabolisk nøkkelsammenheng i aktivt prolifererende celler. Selv om slike veier har hatt en viss suksess for visse typer cancere eller cancere i visse trinn, er kjemoterapi som regel assosiert med ubehagelige til skadelige bivirkninger som kvalme, hodepine, apetittgap, alopeki og anemi. Forbindelser som virker på nivået for celle replikering, enten ved å innføre nukleotid analoger i celler under deling eller ved å avbryte normal replikering, har videre potensiale for å innføre utstrakte genetiske mutasjoner i normale celler hos individet. I tillegg kan cancerceller utvikle resistens mot mange typer antitumor midler, enten ved å begrense opptaket av middelet i cellen, eller ved å endre metabolismen for middelet i cellen.
Som respons på disse begrensninger er det utviklet forsøk på å modifisere kjemoterapeutiske midler for å redusere deres bivirkninger, overvinne resistensproblemene eller å forbedre deres innsikt i mot valgte tumor seter. Mens disse forsøk har gitt forbedrede, terapeutiske resultater i enkelte tilfelle forblir det et behov for å tilveiebringe et forbedret, kjemoterapeutisk middel og en fremgangsmåte. Særlig bør slike midler være effektive med henblikk på å avlive eller å inhibere veksten av cancerceller, må imidlertid være relativt ikke-toksisk både uttrykt ved bivirkninger og langtidseffekter på den genetiske integritet for det behandlede individ, og fortrinnsvis avleverbar i en form som tillater direkte innføring i en tumor eller selektiv innsikting mot tumorene.
W095/22987 og US6126938 beskriver en metode for behandling av gastroduodenal sykdom ved administrering av en immunogen effektiv mengde av en sammensetning som omfatter Helicobacter urease enzymer. Den beskrevne metode er designet for å indusere dannelsen av urease antistoffer for å nøytralisere urease toksistet i et individ infisert med urease produserende mikroorganismer, slik som Helicobacter, eller som en behandling for urease induserte sykdomstilstander som magekreft.
Br. J. Cancer, vol. 58, 1988, s. 700-703, ISSN 0007-0920 foreslår å målrette toksiske forbindelser mot kreftceller i den hensikt å forbedre spesifisiteten til den toksiske forbindelse overfor kreftceller.
British J. of Cancer, vol. 80, nr. 7, 1999, s. 1005-1011, ISSN 0007-0920 viser in vitro at MCF-7 humane brystkreftceller er mer mottakelig for doxorubicin toksisitet ved pH 7.4 enn ved pH 6.8. Videre vises det in vitro at økning av ekstracellulær pH, ved tilsats av bikarbonat, resulterer i forbedret terapeutisk effekt ved bruk av doxorubicin.
Et første aspekt ved oppfinnelsen vedrører et farmasøytisk preparat for anvendelse ved inhibering av veksten av faste tumorer i et pattedyr individ. Preparatet inkluderer et urease enzym, for eksempel en bakteriell eller plante urease, hvor et anti-tumor antigen antistoff er konjugert til nevnte urease enzym for å øke avlevering av enzymet til cancerceller når sammensetningen administreres til et individ.
Et andre aspekt ved oppfinnelsen vedrører anvendelse av et urease enzym, som er konjugert til et anti-tumor antigen antistoff, sammen med en svakt basisk antitumor forbindelse, for fremstilling av et medikament for behandling eller diagnostisering av cancer i et pattedyr individ.
Der cancercellene omfatter en fast tumor kan ureasen injiseres direkte i tumoren hos individet eller ved parenteral administrering, for eksempel injisering, annet enn ved direkte administrering.
Den terapeutiske effektivitet for en svakt basisk antitumor forbindelse, hvis effektivitet er redusert av en høyere intracellulær/lavere ekstracellulær pH gradient i en fast tumor, kan økes ved å administrere en mengde av urease som er effektiv til å redusere eller å reversere den høyere intracellulære/lavere ekstracellulære pH gradient i en fast tumor. Fortrinnsvis er mengden urease som administreres effektiv til å heve det ekstracellulære fluid i tumoren til minst pH 7.2. Ureasen kan injiseres direkte i tumoren eller ved parenteral administrering annen enn direkte administrering, som nevnt ovenfor.
Antitumor forbindelsen kan for eksempel være doksorubicin, daunorubicin, mitoksantron, epirubicin, mitomycin, bleomycin, vinka alkaloider som vinblastin og vinkristin, alkyleringsmidler som cyklofosfamid og mekloretamin hydroklorid, og antineoplastiske purin- eller pyrimidin derivater.
Nærværet, størrelsen og tilstanden av en fast tumor i et individ kan bedømmes ved å administrere ureasen til individet som har, eller mistenkes for å ha, en fast tumor, under betingelser som er effektive for å lokalisere ureasen i en fast tumor hos individet. Individet interrogeres så med et diagnostisk verktøy som fluorskopi, MRI, eller positron emisjons tomografi, i stand til å detektere endringer i ekstracellulær pH verdi i et individs vev, enten i nærvær eller fravær av en pH sensitiv rapportør, for å identifisere et vev område i individet som viser en øket ekstracellulær pH verdi.
Denne metode kan benyttes i forbindelse med den ovenfor angitte behandling for å bedømme graden og/eller effektiviteten av urease dosering og -behandling. Således kan for eksempel, ved administrering av urease til et individ, utstrekningen og graden av pH forandring i tumor området følges for å styre urease administreringen, eller å bedømme forandringer i tumor størrelse og -utstrekning under behandling.
Det beskrives videre et sett for anvendelse ved inhibering av veksten av cancerceller i et pattedyr individ. Settet har en farmasøytisk sammensetning inneholdende urease enzym samt instruksjonsmateriell som lærer administrering av preparatet til et individ for behandling av cancer hos individet.
Instruksjonsmateriellet kan lære administrering av urease preparatet til et individ på en måte som er avhengig av størrelsen av tumoren og mellom 0.1 og 100 internasjonale enheter, fortrinnsvis 0.5 til 10, urease aktivitet per mm<3>tumor når preparatet administreres ved direkte injeksjon i tumoren, og i en mengde mellom 100 og 100,000 internasjonale enheter per kilo, fortrinnsvis 500 til 10,000 internasjonale enheter per kilo av internasjonale urease enhetsaktivitet per kilo individ kroppsvekt, når preparatet administreres parenteralt til individet annet enn ved direkte injeksjon i tumoren.
Instruksjonsmateriellet kan beskrive administrering av urease til et individ som også mottar en svakt basisk antitumor forbindelse hvis effektivitet er redusert ved en høyere intracellulær/lavere ekstracellulær pH gradient i en fast tumor, i en mengde av urease som er effektiv til å redusere eller reversere den høyere intracellulære/lavere ekstracellulære pH gradient i en fast tumor.
Instruksjonsmateriellet kan lære administrering av urease til et individ som bærer, eller mistenkes for å bære en fast tumor under betingelser som er effektive for å lokalisere ureasen i en fast tumor i individet, interrogere individet med et diagnostisk verktøy i stand til å detektere forandringene i ekstracellulær pH i et individs vev, og identifisering av et vev område i et individ som viser en forhøyelse i ekstracellulær pH verdi etter nevnte administrering.
Kort beskrivelse av figurene
Figurene 1A-1D viser trinnene i urease reaksjonen. Urea spaltes av urease for å produsere et molekyl ammoniakk og et molekyl karbamat (A). Karbamatet dekomponeres spontant til ammoniakk og karbonsyre
(B). Karbonsyre (B) ekvilibrerer i vann (C) på samme måte som de to molekyler ammoniakk, som blir protonert og gir ammonium- og hydroksyd ioner (D). Reaksjonen resulterer i en økning av pH verdien i
reaksj onsbetingelsene; Fig. 2 viser massespektrometri profilen for uren å prøve inneholdende urease; Fig. 3 viser affinitets rensingsprofilen for urease under forskjellige trinn av renseprosessen;
Fig. 4 viser rensingen av E-vikling-cchEGFR IgG konjugat med en protein-G kolonne; og
Fig. 5 viser antistoff titeren av renset E-vikling-ahEGFR IgG konjugatet bestemt ved immobilisert K-vikling
ELISA.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
I. Definisjoner
Hvis ikke annet er sagt har alle tekniske og vitenskapelige uttrykk som her benyttes den samme betydning som de vil ha for fagmannen på området for foreliggende oppfinnelse. Praktikere vises spesielt til Sambrook et al. (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, 3. utg.; og F.M. Ausubel et al. (1993) i "Current Protocols in Molecular Biology", for definisjoner og uttrykk i denne teknikk.
Uttrykket "urease" henviser til et enzym som har den enzymatiske aktiviteten til en urea amidohydrolase (E.C. 3.5.1.5), enten naturlig forekommende eller oppnådd ved for eksempel rekombinante nukleinsyre teknikker og/eller kjemisk syntese. Urease inkluderer også fusjonsproteiner omfattende den totale urease, subenheter eller fragmenter derav, og/eller urease med aminosyre substitusjoner, delesjoner eller addisjoner som bevarer urea aminohydrolase aktiviteten for polypeptidet. En trunkert urease sekvens som benyttet her er et fragment av urease som er fri for en andel av den intakte urease sekvens som begynner enten ved amino- eller karboksy terminus av ureasen. Metoder for å isolere nativ urease, for å syntetisere urease rekombinant og for å identifisere aktive fragmenter og modifiserte urease polypeptider, er gitt nedenfor.
Uttrykket "cancer" er ment å henvise til en unormal celle eller celler eller en vev masse. Veksten av disse celler eller vev overskrider og er ukoordinert med det for normale vev eller celler og forblir på samme eksessive måte etter at den stimuli har gitt seg som evokerte forandringen. Disse neoplastiske vev eller celler viser en mangel på strukturell organisering og koordinering i forhold til normal vev eller celler som kan resultere i en masse av vev eller celler som kan være enten benign eller malignant. Som benyttet her inkluderer cancer en hvilken som helst neoplasme. Dette inkluderer, men er ikke begrenset til melanoma, adenokarsinoma, malignant glioma, prostatisk-, nyre-, blære-, pankreatisk-, tyroid-, lunge-, kolon-, rektal-, hjerne-, lever-, bryst- eller ovarie karsinoma, og lignende.
En "tumor" eller "fast tumor" henviser til en kohesiv masse av cancerceller inkludert, men ikke begrenset til halvfaste og faste tumorer, faste tumor metastaser, angiofibromaer, retrolental fibroplasi, hemangiomer og Karposis sarkom.
Som benyttet her henviser uttrykket "innsiktingsdel" eller lignende til et molekyl som binder til en definert populasjon av celler eller valgt celletype. Innsiktingsdelen kan binde en reseptor, et oligonukleotid, et enzymatisk substrat, en antigenisk determinant eller andre bindingsseter som er tilstede på målcelle- eller - celle populasjonen. Et eksempel på en innsiktingsdel er et antistoff. Antistoff fragmenter og små peptid sekvenser som er i stand til å gjenkjenne uttrykte antigener er også omfattet av innsiktingsdeler.
Som benyttet her henviser uttrykket "inhibering av veksten av cancerceller" eller lignende til en hvilken som helst reduksjon av hastigheten av cancercelle prolifereringen og/eller migreringen, stans av cancercelle proliferering og/eller migrering, eller avlivning av cancerceller, slik at hastigheten for cancercelleveksten reduseres sammenlignet med den observerte eller predikterte veksthastighet for ikke behandlede kontroll cancerceller. Uttrykket "inhibere vekst" kan også henvise til en reduksjon i størrelse eller forsvinning av en cancercelle eller tumor, så vel som en reduksjon i dens metastatiske potensial. Fortrinnsvis kan en slik inhibering på cellulært nivå redusere størrelsen, senke veksten, redusere aggressiviteten eller forhindre eller inhibere metastase av en cancer hos en pasient. Fagmannen på området kan lett bestemme, ved hjelp av en varietet av egnede indiser, hvorvidt cancercelleveksten er inhibert.
Inhibering av cancercellevekst kan påvises for eksempel ved stans av cancerceller i en spesiell fase av celle syklusen, for eksempel stans av G2/M fasen av celle syklusen. Inhibering av cancercellevekst kan også påvises ved direkte eller indirekte måling av cancercelle- eller tumor størrelse. I human cancer pasienter foretas slike målinger generelt ved bruk av kjente billed opptaksmetoder som magnetisk resonans opptak, datamaskinstyrt aksial tomografi og røntgenstråler. Cancercellevekst kan også bestemmes indirekte, for eksempel ved å bestemme nivåene av sirkulerende karsinoembryonisk antigen, prostata spesifikt antigen eller andre cancer spesifikke antigener som er korrelert med cancercellevekst. Inhibering av cancer vekst er også generelt korrelert med forlenget overlevelse og/eller øket helse og velvære hos individet.
Som benyttet her henviser uttrykket "induserer apoptose" til promosjon av en form for programmert celledød som karakteriseres ved DNA fragmentering. Apoptose kan bestemmes på i og for seg kjent måte. For eksempel er det kommersielt tilgjengelig sett som detekterer nærværet av fragmentert DNA ved in situ immunohistokjemi (for eksempel Apoptag, tilgjengelig fra Intergen, Purchase, NY). I tillegg kan apoptose også bestemmes ved FACS analyse hvori apoptotiske celler viser et sub-Gl DNA innhold som antyder DNA fragmentering.
Som benyttet her henviser "antistoff til et peptid, polypeptid eller protein som omfatter et eller flere peptider eller polypeptider som i det vesentlige eller partielt er kodet av minst et immunoglobulin nukleinsyre molekyl eller immunoglobulin gen eller et fragment av minst et immunoglobulin molekyl eller immunoglobulin gen. De gjenkjente immunoglobulin gener inkluderer kappa-, lambda-, alfa-, gamma-, delta-, epsilon- og mu konstantområde gener så vel som en myriade av immunoglobulin variable region gener. Lette kjeder er klassifisert som enten kappa eller lambda. Tunge kjeder er klassifisert som gamma, mu, alfa, delta eller epsilon, som i sin tur definerer immunoglobulin klassene IgG, IgM, IgA, IgD henholdsvis IgE. En typisk immunoglobulin (for eksempel antistoff) strukturenhet omfatter en tetramer. Hver tetramer består av to identiske par av polypeptid kjeder, hvert par har en "lett" kjede (rundt 25 kD) og en "tung" kjede (rundt 50-70 kD). N-terminus av hver kjede definerer et variabelt område på rundt 100 til 110 eller flere aminosyrer som primært er ansvarlig for antigen gjenkjenningen. Uttrykkene "variabel lett kjede" (VL) og "variabel tung kjede" (VH) henviser til disse lette og tunge kjeder. Antistoffer foreligger som intakte immunoglobuliner eller som et antall godt karakteriserte fragmenter som er produserte ved diggstering av forskjellige peptidaser. Således digesterer for eksempel pepsin et antistoff under disulfid bindingene i hengselområdet og produserer F(ab)'2, en dimer av Fab som i seg selv er en lett kjede forenet til VH-CH1 ved en disulfid binding. F(ab)'2 kan reduseres under milde betingelser for å bryte disulfid bindingen i hengselområdet og derved konvertere (Fab')2 dimeren til en Fab' monomer. Fab' monomeren er i det vesentlige en Fab med en del av hengselområdet (se FundamentalImmunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, NY (1993) for en mer detaljert beskrivelse av andre antistoff fragmenter). Mens forskjellige antistoff fragmenter er definert uttrykt ved digesteringen av et intakt antistoff vil fagmannen erkjenne at slike Fab' fragmenter kan syntetiseres de novo enten kjemisk eller ved å benytte rekombinant DNA metodologi. Uttrykket "antistoff' slik det benyttes her inkluderer også antistoff fragmenter, enten produsert ved modifisering av hele antistoffer eller syntetisert de novo ved bruk av rekombinante DNA metodologier. Antistoffer inkluderer enkeltkjede antistoffer inkludert enkeltkjede F v (sFv) antistoff hvori en VH og en VL er forenet (direkte eller via en peptid linker) for å danne et kontinuerlig polypeptid.
Et "antigen-bindende fragment" av et antistoff er et peptid eller polypeptid fragment av antistoffet som binder et antigen. Et antigen-bindende sete dannes av de aminosyrer i antistoffet som bidrar til, er involvert i eller bevirker binding av antigenet, se T. A. Scott og E.I. Mercer, CONCISE ENCYCLOPEDIA: BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY (de Gruyter, 3. utg. 1997) samt J.D. Watson et al. i RECOMBINANT DNA (2. utg. 1992). Uttrykket "antistoff fragment" inkluderer også ethvert syntetisk eller genetisk konstruert protein som virker som et antistoff ved binding til et spesifikt antigen for å danne et kompleks.
Uttrykket "aktivt middel", "medikament" og "farmakologisk aktivt middel" er benyttet om hverandre her for å henvise til et kjemisk materiale eller forbindelse som, ved administrering til et individ, induserer en ønsket, farmakologisk effekt, og er ment å inkludere et diagnostisk eller terapeutisk middel inkludert radionukleider, medikamenter, anticancer midler, toksiner og lignende. Fortrinnsvis inkluderer uttrykket aktivt middel proteiner, glykoproteiner, naturlige og syntetiske peptider, alkaloider, polysakkarider, nukleinsyre molekyler, småmolekyler og lignende. Mer foretrukket henviser uttrykket aktivt middel til proteiner. Et eksempel på aktivt middel er urease.
Et "pH sensitivt" aktivt middel henviser til et aktivt middel hvis evne til å indusere en ønsket farmakologiske effekt i det minste delvis avhenger av pH verdien for den omgivende, ekstracellulære omgivelse.
Uttrykket "klaringsmiddel" slik det benyttes her henviser til et middel som er i stand til å binde, kompleksdanne eller på annen måte å assosiere med en administrert del, for eksempel en målsøkende del ligand, en målsøkende del antiligand eller en antiligand alene, tilstede i resipientenes sirkulering, for derved å lette klaring av den sirkulerende del fra resipientens legeme, fjerning fra blodsirkulasjonen eller inaktivering i sirkulasjonen. Denne klaringseffekt karakteriseres fortrinnsvis ved fysiske egenskaper som størrelse, ladning, konfigurasjon eller en kombinasjon derav, som begrenser klaringsmiddelets tilgang til populasjonen av målceller som er gjenkjent av en målrettet del som benyttes i den samme behandlingsprotokoll som klaringsmiddelet.
Uttrykket "billed middel" er ment å henvise til forbindelser som kan detekteres.
Uttrykket "adjuvant" henviser til en substans eller et middel som settes til en formulering eller et preparat for å understøtte arbeidet med hoved bestanddelen.
Uttrykkene "interstitsial" og "ekstracellulær" fluid henviser til det fluid som ligger mellom eller bader cellene i pattedyr.
Uttrykkene "individ" og "pasient" benyttes om hverandre for å henvise til et hvilket som helst mål for behandlingen. Tumor celler kan behandles in situ eller i deres normale posisjon eller lokasjon, for eksempel neoplastiske celler i bryst- eller prostata tumorer. Disse in situ tumorer kan lokaliseres i eller på et vidt spektrum av verter; for eksempel human-, kanin-, felin-, equin-, bovin- og porcin verter og lignende. En hvilken som helst vert i hvilken det finnes en tumor eller tumor celler kan behandles. Et individ inkluderer således en vertebrat, fortrinnsvis et pattedyr og helst et menneske.
Med "målcelle retensjonstid" menes den tid et urease molekyl eller et annet aktivt middel forblir på målcelle overflaten eller i målcellen.
Som benyttet her omfatter uttrykket "konjugat" kjemiske konjugater (bundet kovalent eller ikke kovalent), fusjonsproteiner og lignende.
Uttrykkene "protein", "polypeptid" eller "peptid" henviser, slik de benyttes her, om hverandre til en biopolymer bestående av aminosyre- eller aminosyre analog subenheter, typisk noen eller alle av de 20 vanlige L-aminosyrer som finnes i biologiske proteiner, bundet av peptid intersubenhet bindinger, eller andre intersubenhet bindinger. Proteinet har en primær struktur som representeres ved dens subenhet sekvens og kan ha sekundære skrueformede eller rette strukturer så vel som en total tredimensjonal struktur. Selv om "protein" vanligvis henviser til et relativt stort polypeptid, for eksempel inneholdende 100 eller flere aminosyrer, og "peptid" til mindre polypeptider, benyttes uttrykkene om hverandre her. Det vil si at uttrykket "protein" kan henvise til et større polypeptid så vel som til et mindre polypeptid og vise versa.
En "urease modulator" er enten en inhibitor for urease eller en utbytter av urease.
En "urease inhibitor" eller lignende omfatter et molekyl eller en gruppe molekyler som interfererer med: (1) eksprimering, modifisering, regulering, aktivering eller degradering av urease; eller (2) en eller flere av de vanlige funksjoner for urease. De normale funksjoner for urease inkluderer hydrolysen av urea som fører til produksjonen av karbamat og ammoniakk. En inhibitor "virker direkte på urease" når inhibitoren binder til urease via elektrostatiske eller kjemiske interaksjoner. Slike interaksjoner kan eventuelt medieres av andre molekyler. En inhibitor virker "indirekte på urease" når dens mest umiddelbare effekt er på et molekyl annet enn ureasen som innvirker eksprimering, aktivering eller funksjonering av urease.
En "urease forsterker" eller lignende omfatter et molekyl eller en gruppe av molekyler som forsterker: (1) eksprimering, modifisering, regulering eller aktivering av urease; eller (2) en eller flere av de vanlige funksjoner hos urease. En forsterker virker "indirekte på urease" når dens mest umiddelbare effekt er på et molekyl annet enn urease som så innvirker på eksprimering, aktivering eller funksjonering av urease.
En "konstruert mutasjon" i et urease gen omfatter en forandring i nukleotid sekvensen i urease genet som resulterer i produksjon av (1) økede eller reduserte mengder av urease protein i forhold til mengden som produseres i fravær av en slik forandring; eller (2) urease protein med forsterket eller forringede normal funksjoner i forhold til slike funksjoner i fravær av slike forandringer.
Uttrykket "farmasøytisk preparat" betyr et preparat som er egnet for farmasøytisk bruk i et individ inkludert et menneske eller dyr. Et farmasøytisk preparat omfatter generelt en effektiv mengde av et aktivt middel og en bærer inkludert for eksempel en farmasøytisk akseptabel bærer.
En "farmasøytisk akseptabel formulering" omfatter en formulering som er egnet for administrering av det aktive middel (for eksempel urease eller urease modulator) på en måte som gir de ønskede resultater og som heller ikke gir ugunstige bivirkninger tilstrekkelig til å overbevise en lege om at potensiell skade til en pasient er større enn den potensielle fordel. Hovedbestanddelen for en injiserbar formulering er typisk en vannbærer. Vandige bærere som er brukbare inkluderer natrium klorid (NaCl) oppløsning, Ringers oppløsning, NaCl/dekstrose oppløsning, og lignende. Vann blandbare bærere er også brukbare for å bevirke full oppløselighet for det aktive middel. Antimikrobielle midler, buffere og antioksidanter kan være brukbare, avhengig av behovet. Tilsvarende er et "farmasøytisk akseptabelt" salt eller et "farmasøytisk akseptabelt" derivat av en forbindelse, slik det tilveiebringes her, et salt eller et annet derivat som ikke er biologisk eller på annen måte uønsket.
Uttrykket "kontrollert frigivning" er ment å henvise til en hvilken som helst medikamentholdig formulering hvori måten og profilen for medikament frigivning fra formuleringen er kontrollert. Uttrykket "kontrollert frigivning" henviser til umiddelbar så vel som ikke umiddelbar frigivning der formuleringer for ikke umiddelbar frigivning inkluderer men ikke er begrenset til opprettholdt frigivning og forsinket frigivning. Uttrykket "opprettholdt frigivning" (også angitt som "forlenget frigivning") benyttes i konvensjonell forstand for å henvise til en medikamentformulering som tilveiebringer gradvis frigivning av et medikament over et forlenget tidsrom og som fortrinnsvis, men ikke nødvendigvis, resulterer i i det vesentlige konstante blodnivåer av et medikament over lengre tidsrom. Uttrykket "forsinket frigivning" benyttes i den konvensjonelle betydning for å henvise til en medikamentformulering der det er en tidsforsinkelse mellom administrering av formuleringen og frigivning av medikamentet. "Forsinket frigivning" kan eventuelt involvere gradvis frigivning av medikament over lengre tid og kan således eventuelt være "opprettholdt frigivning".
En "terapeutisk behandling" er en behandling som administreres til et individ som viser symptomer eller tegn på patologi, sykdom eller lidelser, der behandlingen administreres til individet for å redusere eller eliminere disse tegn eller symptomer på patologi, sykdom eller lidelse. En "terapeutisk aktivitet" er aktiviteten til et middel, for eksempel en nukleinsyre, vektor, et gen, polypeptid, protein, stoff eller preparat derav, som eliminerer eller reduserer tegnene eller symptomene på patologi, sykdom eller lidelse, administrert til et individ som lider av slike tegn eller symptomer. Et "terapeutisk brukbart" middel eller en slik forbindelse (for eksempel nukleinsyre eller polypeptid) antyder at et middel eller en forbindelse er brukbart med henblikk på å redusere, behandle eller eliminere slike tegn eller symptomer på en patologi, sykdom eller lidelse.
Uttrykket "små molekyler" inkluderer en forbindelse eller molekylært kompleks, enten syntetisk, naturlig avledet eller partielt syntetisk, som fortrinnsvis har en molekylvekt mindre enn 5000 Dalton. Mer spesielt har et lite molekyl en molekylvekt mellom 100 og 1500 Dalton.
Uttrykket "nukleinsyre molekyl" eller "oligonukleotid" eller grammatikalske ekvivalenter, henviser til minst to nukleotider som kovalent er bundet sammen og henviser karakteristisk til RNA-, DNA- og cDNA molekyler. En nukleinsyre skal forstås som fortrinnsvis enkelttrådet eller dobbelttrådet og vil generelt inneholde fosfodiester bindinger selv om i enkelte tilfelle nukleinsyre analoger er inkludert som kan ha alternative skjeletter omfattende for eksempel fosforamid-, fosfortioat-, fosforditioat- og/eller O-metylfosforamidit bindinger. Det vil være klart at, som et resultat av degenerering av den genetiske kode, det kan fremstilles et stort antall nukleotid sekvenser som koder gitte peptider som ureaser.
Et "heterologt" nukleinsyre konstrukt eller en -sekvens har en del av sekvensen som ikke er nativ til cellen i hvilken den uttrykkes. Heterologt, i forbindelse med en kontrollsekvens, henviser til en kontrollsekvens (det vil si promoter eller enhanser) som ikke funksjonerer i naturen for å regulere det samme gen hvis ekspresjon det her regulerer. Generelt er heterologe nukleinsyre sekvenser ikke endogene til cellen eller en del av genomet i hvilken de er tilstede, og er føyet til cellen, ved infeksjon, transfeksjon, mikroinjeksjon, elektroporering og lignende. Et heterologt nukleinsyre konstrukt kan inneholde en kontrollsekvens/DNA kodene sekvenskombinasjon som er den samme som, eller er forskjellig fra en kontrollsekvens/DNA kodene sekvenskombinasjon som finnes i den native celle.
Som benyttet her henviser uttrykket "vektor" til et nukleinsyre konstrukt som er konstruert for overføring mellom forskjellige vertceller. En "ekspresjonsvektor" henviser til en vektor som har evnen til å inkorporere og å uttrykke heterologe DNA fragmenter i en fremmed celle. Mange prokaryotiske og eukaryotiske ekspresjonsvektorer er kommersielt tilgjengelige. Seleksjon av egnede ekspresjonsvektorer ligger innenfor fagmannens kunnskapsområde.
Som benyttet her er en "ekspresjonskassett" eller "ekspresjonsvektor" et nukleinsyre konstrukt som er generert rekombinant eller syntetisk, med en serie spesifikke nukleinsyre elementer som tillater transkripsjon av en spesiell nukleinsyre i en målcelle in vitro. Den rekombinante ekspresjonskassett kan være innarbeidet i et plasmid, kromosom, mitokondrial DNA, plastid DNA, virus eller nukleinsyre fragment. Typisk inkluderer den rekombinante ekspresjonskassett del en ekspresjonsvektor blant andre sekvenser en nukleinsyre sekvens som skal transkriberes, og en promoter.
Slik uttrykket benyttes her henviser "plasmid" til et sirkulært, dobbelttrådet DNA konstrukt som benyttes som en kloningsvektor og som danner et ekstrakromosomalt, selvreplikerende, genetisk element i mange bakterier og noen eukaryoter.
Som benyttet her henviser uttrykket "selekterbar markørkodene nukleotid sekvens" til en nukleotid sekvens som er i stand til ekspresjon i vertceller og der ekspresjonen av den selekterbare markør gir cellen som inneholder det uttrykte gen evnen til å vokse i nærvær av tilsvarende selektive midler.
Som benyttet her henviser uttrykkene "promoter" og "transkripsjons initiator" til en nukleinsyre sekvens som virker til direkte transkripsjon av et nedstrøms gen. Promoteren vil generelt være egnet for vertcellen i hvilken målgenet uttrykkes. Promoteren, sammen med andre transkripsjonelle og translasjonelle, regulatoriske nukleinsyre sekvenser (også kalt "kontrollsekvenser") er nødvendige for å uttrykke et gitt gen. Generelt inkluderer de transkripsjonelle og translasjonelle regulatoriske sekvenser, uten at det er noen begrensning, promoter sekvenser, ribosomale bindingsseter, transkripsjonelle start- og stopp sekvenser, translasjonelle start- og stopp sekvenser og enhanser- eller aktivator sekvenser.
"Kimerisk gen" eller "heterologt nukleinsyre konstrukt" som definert her henviser til et ikke nativt gen (det vil si et som er innført i en vert) som kan bestå av deler av forskjellige gener inkludert regulatoriske elementer. Et kimerisk gen konstrukt for transformasjon i en vertcelle består typisk av et transkripsjonelt regulatorisk område (promoter) operativt forbundet til en heterolog proteinkodene sekvens eller, i et selekterbart markør kimerisk gen, til et selekterbart markør gen som koder et protein som gir antibiotisk resistens til transformerte vertceller. Et typisk kimerisk gen for transformering til en vertcelle inkluderer et transkripsjonelt, regulatorisk område som er konstitutivt eller induserbart, en proteinkodene sekvens og en
terminator sekvens. Et kimerisk gen konstrukt kan også inkludere en andre DNA sekvens som koder et signal peptid hvis sekresjon av målproteinet er ønsket.
En nukleinsyre er "operativt forbundet" når den er plassert i funksjonell sammenheng med en annen nukleinsyre sekvens. For eksempel er DNA som koder en sekretorisk leder operativt forbundet til DNA for et polypeptid hvis den uttrykkes som et preprotein som deltar i sekresjonen av polypeptidet; en promoter eller enhanser er operativt forbundet til en kodene sekvens hvis den påvirker transkripsjonen av sekvensen; eller et ribosom bindingssete er operativt forbundet til en kodene sekvens hvis den er posisjonert slik at den letter translasjon. Generelt betyr "operativt forbundet" at DNA sekvensene som er forbundet er i rekkefølge og, når det gjelder en sekretorisk leder, i rekkefølge og i lesefase. Imidlertid behøver ikke enhansere å være i rekkefølge. Bindingen gjennomføres ved ligering ved hensiktsmessige restriksjonsseter. Hvis slike seter ikke eksisterer benyttes de syntetiske oligonukleotid adaptorer eller -linkere i henhold til konvensjonell praksis.
Som benyttet her betyr uttrykket "gen" det segment av DNA som er involvert i produksjonen av en polypeptidkjede, som eventuelt kan inkludere områder som kommer foran og følger etter det kodene område, for eksempel 5' ikke translatert (5' UTR)- eller "leder" sekvenser eller 3' UTR- eller "følger" sekvenser, så vel som intervenerende sekvenser (introner) mellom individuelle kodene segmenter (exoner).
Som benyttet her inkluderer "rekombinant" referanse til en celle eller vektor som er modifisert ved innføring av en heterolog nukleinsyre sekvens eller at cellen er avledet fra en således modifisert celle. Rekombinante celler uttrykkes såleder for eksempel gener som ikke finnes i identisk form i den native (ikke rekombinante) form av cellen eller uttrykker native gener som er unormalt uttrykt, underuttrykt eller ikke uttrykt i det hele tatt som et resultat av tilsiktet human intervensjon.
Uttrykket "innført" eller lignende i konteksten innføring av en nukleinsyre sekvens i en celle betyr "transfeksjon", "transformasjon" eller "transduksjon", og inkluderer henvisning til innarbeiding av en nukleinsyre sekvens i en eukaryotisk eller prokaryotisk celle der nukleinsyre sekvensen kan innarbeides i cellens genom (for eksempel kromosom, plasmid, plastid eller mitokondrial DNA) konvertert til et autonomt replikon eller uttrykkes transient (for eksempel transfektert mRNA).
Som benyttet her henviser uttrykket "ekspresjon" eller tilsvarende til den prosess der et polypeptid produseres basert på nukleinsyre sekvensen i et gen. Prosessen inkluderer både transkripsjon og translasjon.
Uttrykket "signalsekvens" henviser til en sekvens av aminosyrer ved N-terminal delen av et protein som letter sekresjonen av den mature form av proteinet utenfor cellen. Den mature form av det ekstracellulære protein mangler signalsekvensen som spaltes av under sekresjonsprosessen.
Med uttrykket "vertcelle" menes en celle som inneholder en vektor og som understøtter replikasjonen, eller transkripsjonen og translasjonen (ekspresjonen) av ekspresjonskonstruktet. Vertceller for bruk kan være prokaryotiske celler som E. coli, eller eukaryotiske celler som gjør-, planter-, insekt-, amfibie- eller pattedyr celler.
Som benyttet her henviser "effektiv mengde" eller "farmasøytisk effektiv mengde" av en aktiv bestanddel til en mengde som er tilstrekkelig til å gi en målbar forandring i en fysiologisk parameter for målcellen eller individet og/eller å tilveiebringe eller modulere aktiv middel ekspresjon eller -aktivitet gjennom administrering av en eller flere av de farmasøytiske enhetsdoser. Slik effektiv mengde kan variere fra person til person avhengig av tilstand, høyde, vekt, alder og/eller helstetilstand, administreringsmodus for det aktive middel (for eksempel urease eller urease modulator), det spesielle aktive middel som administreres, og andre faktorer. Som et resultat kan de være brukbart empirisk å bestemme en effektiv mengde for en spesiell
pasient under et spesielt sett av omstendigheter.
II. Preparater i følge oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse inkluderer i et aspekt et preparat inneholdende urease som en aktiv bestanddel for bruk ved inhibering av veksten av en fast tumor. En kjemisk form av et anti-tumor antigen antistoff er konjugert til det aktive middel for å forsterke avleveringen av det aktive middel til cancerceller. Det er funnet at eksponering av cancerceller hos en pasient til urease, som beskrevet her, gir en effektiv behandling mot cancer hos pasienten. Cancercellene kan foreligge i en tumor, for eksempel en fast eller halvfast tumor. Alternativt kan cancercellene sirkulere i blodstrømmen til et individ.
Cancere, tumorer og/eller neoplasmer inkluderer ny vekst av celler eller vev på en måte der multiplikering av celler er ukontrollert og progressiv. Noen slike vekstformer er benigne mens andre angis som "malignante", og fører til organismens død. Malignante neoplasmer skiller seg fra benigne vekstformer i at, i tillegg til å vise aggressiv cellulær proliferering, invaderer cancere omgivende vev og metastaserer. Videre karakteriseres malignante neoplasmer ved at de viser et større tap av differensiering og av organisering i forhold til hverandre og det omgivende vev.
Nedenfor følger en diskusjon av komponentene som inkluderes i de beskrevne preparatene.
A. Urease
Som nevnt ovenfor er det aktive middel i preparatet urease. Ureasen kan være av en hvilken som helst opprinnelse inkludert for eksempel bakterier, planter, fungi og vimser. Et antall studier har gitt detaljert informasjon om genetikken til ureaser fra et antall evolusjonærte diverse bakterier, og planter, fungi og viruser (H.L.T. Mobley et al. (1995) Microbiol. Rev. 59: 451-480; Eur. J. Biochem., 175, 151-165 (1988); A. Labigne, (1990) WO 90/04030; CL. Clayton et al. (1990) Nucleic AcidRes. 18, 362; og US patent 6,248,330 og 5,298,399). Av spesiell interesse er urease som finnes i planter (A. Sirko og R. Brodzik (2000) Acta Biochim Pol 47(4): 1189-95). Et eksempel på en plante urease er jack bønne urease som er beskrevet i eksemplene 2-3. Et eksempel på en aminosyre sekvens i jack bønne urease er representert ved SEQ ID NO: 7.
Brukbare urease sekvenser kan være identifisert i offentlige databaser, for eksempel Entrez ( http: // www, ncbi. nlm. nih. gov/ Entr ezi). I tillegg kan primere som er brukbare for å forsterke ureaser fra et vidt spektrum av organismer benyttes som beskrevet av K.M. Baker og J.L. Collier ( http:// www. science. smith. edu/ departments/ Biology/ lkatz/ NEMEB webpage/ abstracts. html) eller ved bruk av CODEHOP (Consensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primer) som beskrevet i Rose et al. (1998) Nucl Acids Res. 26:1628.
Ureasen kan komme i kontakt med tumor cellene, posisjoneres i den ekstracellulære omgivelse eller interstitsial fluidet som omgir tumor cellene, eller uttrykkes i cancercellene eller cellene nær cancercellene. Uten å ønske å være bundet av noen spesiell molekyl mekanisme som ligger under den vellykkede inhibering av veksten av cancerceller ved hjelp av urease kan urease forbindelsen øke pH verdien i interstitsial fluidet hvori cancercellene er badet ved å bringe ureasen til interstitsial fluidet hos individet. Urease kan konvertere substrat urea til ammoniakk og karbamat. Den enzymatiske aktivitet kan øke pH verdien ved å gjøre omgivelsene mer basisk (Fig. IA-ID). Omgivelsene rundt en cancercelle er typisk sure (S.D. Webb et al. (2001) Novartis Found Symp 240:169-81. Ved således å heve pH verdien for den ekstracellulære omgivelse på denne måte kan veksten av cancercellene inhiberes. I henhold til dette forårsaker tilføyelse av det aktive middel eventuelt at pH verdien i interstitsial fluidet heves med rundt 0.1 pH enheter, det vil si 0.1-0.5 pH enheter eller mer.
Således inkluderer de aktive midler de naturlig forekommende former av ureaser så vel som funksjonelt aktive varianter derav. To generelle typer aminosyre sekvens varianter er tatt sikte på. Aminosyre sekvens varianter er de som har en eller flere substitusjoner i spesifikke aminosyrer som ikke ødelegger urease aktiviteten. Disse varianter inkluderer tause varianter og konservativt modifiserte varianter som i det vesentlige er homologe og funksjonelt ekvivalente med det native protein. En variant av et nativt protein er "i det vesentlige homologt" med det native protein når minst rundt 80%, fortrinnsvis minst rundt 90%, helst rundt 95%, allerhelst rundt 98% og helt spesielt rundt 99% av aminosyre sekvensen er identisk med aminosyre sekvensen i det native protein. En variant kan være forskjellig når det gjelder helt ned til 1 eller også opp til 10 eller flere aminosyrer.
En annen type varianter inkluderer størrelsesvarianter av urease som er isolerte, aktive fragmenter av urease. Størrelsesvarianter kan dannes for eksempel ved fragmentering av urease, ved kjemisk modifisering, ved proteolytisk enzym digestering, eller ved kombinasjoner derav. I tillegg kan gen konstruksjonsteknikker så vel som metoder for syntetisering av polypeptid direkte fra aminosyre rester, benyttes for å produsere størrelsesvarianter.
Med "funksjonelt ekvivalent" menes at sekvensen av varianten definerer en kjede som produserer et protein med i det vesentlige samme biologiske aktivitet som den native urease. Slike funksjonelt ekvivalente varianter som omfatter vesentlige sekvensvariasjoner omfattes også av oppfinnelsen. Således vil en funksjonelt ekvivalent variant av det native urease protein ha en tilstrekkelig biologisk aktivitet til å være terapeutisk nyttig. Metoder er tilgjengelige i teknikken for å bestemme funksjonell ekvivalens. Biologisk aktivitet kan måles ved bruk av analyser som spesifikt er konstruert for å måle aktiviteten til det native urease protein, se eksempel 3.1 tillegg kan antistoffer mot det biologisk aktive, native protein testes på evnen til å binde den funksjonelt ekvivalente variant der effektiv binding er en indikasjon på et protein som har en konformasjon tilsvarende den til det native protein.
Det vil være klart for fagmannen at på grunn av degenerensen i den genetiske kode kan det produseres et stort antall nukleinsyre sekvenser som koder urease polypeptider som kan anvendes i foreliggende oppfinnelse, noen av hvilke kan bære minimal sekvens homologi med kjente urease nukleinsyre sekvenser. Slike "tause variasjoner" er spesier av "konservativt modifiserte variasjoner, diskutert nedenfor. Det kan tilveiebringes enhver mulig variant av nukleinsyre sekvens som koder et polypeptid som kan dannes ved å selektere kombinasjoner basert på mulige kodon valg. Disse kombinasjoner lages i henhold til den standard triplett genetiske kode som anvendt på nukleinsyre sekvensene som koder et urease protein polypeptid som kan anvendes i foreliggende oppfinnelsen.
Urease polypeptider som kan anvendes inkluderer en eller flere konservativt modifiserte variasjoner (eller ganske enkelt "konservative variasjoner") av sekvensen av kjente urease polypeptid sekvenser. Slike konservative variasjoner omfatter substitusjoner, addisjoner og delesjoner som endrer, føyer til eller fjerner en enkelt aminosyre eller en liten prosentandel av aminosyrer. Fagmannen på området vil erkjenne at en individuell substitusjon, delesjon eller addisjon som substituerer, deleterer eller adderer en enkelt aminosyre eller en liten prosentandel aminosyrer (typisk mindre enn 5% og mer typisk mindre enn 4%, 2%, 1% eller mindre) i en sekvens typisk utgjør konservative variasjoner der slike forandringer resulterer i delesjon av en aminosyre, addisjon av en aminosyre eller substitusjon av en aminosyre med en kjemisk lik aminosyre.
Konservativ substitusjonstabeller som tilveiebringer funksjonalitetslike aminosyrer er velkjente for fagmannen. Tabell 1 angir seks grupper som inneholder aminosyrer som er konservative substitusjoner eller konservative variasjoner av hverandre.
Ytterligere grupper av aminosyrer kan også formuleres. For eksempel kan aminosyrer grupperes ved lik funksjon eller kjemisk struktur eller sammensetning (for eksempel sur, basisk, alifatisk, aromatisk, svovelholdig). For eksempel kan en alifatisk gruppe omfatte: glysin, alanin, valin, leucin, isoleucin. Andre grupper inneholdende aminosyrer som er konservative substitusjoner for hverandre inkluderer de følgende: (i) aromatiske: fenylalanin, tyrosin, tryptofan; (ii) svovelholdige: metionin, cystein; (iii) basiske: arginin, lysin, histidin; og (iv) sure: aspartinsyre, glutaminsyre, asparagin, glutamin. Når det gjelder dette henvises det til Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company, for ytterligere grupperinger av aminosyrer.
Urease proteinsekvensene som kan anvendes inkludert konservativt substituerte sekvenser, kan være tilstede som en del av større polypeptid sekvenser slik de inntrer ved addisjon av et eller flere domener for rensing av proteinet (for eksempel poly his segmenter, FLAG tag segmenter og så videre), for eksempel der de ytterligere funksjonelle domener har liten eller ingen innvirkning på aktiviteten til urease protein delen av proteinet, eller der de ytterligere domener kan fjernes ved post syntese prosesseringstrinn som ved behandling med en protease.
Addisjonen av en eller flere nukleinsyrer eller sekvenser som ikke endrer den kodede aktivitet for et nukleinsyre molekyl som kan anvendes, for eksempel addisjonen av en ikke funksjonell sekvens, er en konservativ variasjon av basis nukleinsyre molekylet, og addisjonen av en eller flere aminosyre rester som ikke endrer aktiviteten til polypeptidet, er en konservativ variasjon av basis polypeptidet. Fagmannen på området vil erkjenne at mange konservative variasjoner av nukleinsyre konstruktene som er beskrevet, gir et funksjonelt identisk konstrukt.
En varietet av metoder for bestemmelse av sekvens sammenhenger kan benyttes, inkludert manuell innretning og datamaskin assistert sekvens innretning og -analyse. Den siste tilnærmelse er foretrukket på grunn av den økede kapasitet som de dataassisterte metoder gir. Det finnes tilgjengelig et antall datamaskin programmer for å gjennomføre sekvens innretning eller de kan produseres av fagmannen.
Som angitt ovenfor behøver sekvensene i nukleinsyren og polypeptidene (og fragmentene derav) ikke å være identiske (men kan være i det vesentlige like), med de tilsvarende sekvenser i et urease polypeptid eller et nukleinsyre molekyl (eller fragment derav) eller relatert molekyl. For eksempel kan polypeptidene være underkastet forskjellige forandringer som en eller flere aminosyre- eller nukleinsyre insersjoner, delesjoner og substitusjoner, enten konservative eller ikke konservative, inkludert der for eksempel slike forandringer kan tilveiebringe visse fordeler ved anvendelsen, for eksempel i den terapeutiske eller profylaktiske bruk eller administrering eller diagnostiske anvendelse.
Innretning og sammenligning av relativt korte aminosyre sekvenser (mindre enn rundt 30 rester) er typisk grei. Sammenligning av lengre sekvenser kan kreve mer sofistikerte metoder for å oppnå optimal innretning av to sekvenser. Optimal innretning av sekvenser for å rette inn et sammenligningsvindu kan gjennomføres ved hjelp av lokal homologi algoritmen til Smith og Waterman (1981) AdvApplMath 2:482, ved homologi innretningsalgoritmen til Needleman og Wunsch (1970) JMol Biol 48:443, ved øking på likhet i henhold til Pearson og Lipman (1988) Proe Nat' lAcad Sei USA 85:2444, ved datamaskinstyrt implementering av disse algoritmer (GAP, BESTFIT, FASTA og TFASTA i Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.; og BLAST, se for eksempel Altschul et al.
(1977) NucAcids Res 25:3389-3402 og Altschul et al. (1990) JMol Biol 215:403-410), eller ved inspeksjon, med den beste innretning (det vil si som resulterer i den høyeste prosentandel sekvenslikhet eller sekvens identitet over sammenligningsvinduet), generert ved de forskjellige metoder som velges.
Et eksempel på en algoritme som er egnet for å bestemme prosent sekvensidentitet (prosent identitet) og sekvenslikhet er FASTA algoritmen som er beskrevet av W.R Pearson & D.J. Lipman (1988) Proe Nat'l Acad Sei USA 85:2444. Se også W.R. Pearson (1996) Methods Enzymology 266:227-258. Foretrukne benyttede parametre i en FASTA innretning av DNA sekvenser for å beregne prosent identitet er optimalisert BL50 Matrix 15: -5, k-tuple=2; joining penalty=40, optimization=28; gap penalty= -12, gap length penalty= -2; og width=16.
Fagmannen vil se at den ovenfor angitte diskusjon om søker- og innretnings algoritmen også gjelder identifisering og evaluering av polynukleotid sekvenser, med substitusjon av spurte sekvens omfattende nukleotid sekvenser og, der det er hensiktsmessig, seleksjon av nukleinsyre databaser.
B2. Målsiktingsdel
Målsiktingsdeler er ansett som kjemiske deler i foreliggende søknad og binder til en definert, valgt type eller målcelle populasjon som cancerceller. Målsiktingsdeler som kan benyttes i denne forbindelse inkluderer antistoffer og antistoff fragmenter, peptider og hormoner. Proteiner tilsvarende kjente celle overflate reseptorer (inkludert lav densitets lipoproteiner, transferrin og insulin), fibrinolytiske enzymer, anti-HER2, platebindende proteiner som anneksiner, og biologiske responsmodifiserere (inkludert interleukin, interferon, erytropoietin og kolonistimulerende faktor) ansees også som målsøkende deler.
Oligonukleotider, for eksempel antisens oligonukleotider som er komplementære til en del av en målcelle nukleinsyre, kan benyttes som målsøkende deler i følge beskrivelsen. Disse deler kan også være oligonukleotider som binder til en målcelle overflate. Analoger av de ovenfor nevnte målsøkende deler som bibeholder evnen til å binde til en definert målcelle populasjon kan også benyttes som målsøkende deler.
Funksjonelle ekvivalenter av de ovenfor nevnte målsøkende deler er også brukbare som målsøkende deler i følge beskrivelsen. Et eksempel på en målsøkende dels funksjonelle ekvivalent er et organisk kjemisk konstrukt som er konstruert for å etterligne den egentlige konfigurasjon og/eller orientering for målsøkende del - målcelle binding. En annen funksjonell ekvivalent for en målsøkende del er et kort polypeptid som viser bindingsaffiniteten for den målsøkende del.
Foretrukne slike deler i følge beskrivelsen er antistoffer, peptider, oligonukleotider eller lignende, som er reaktive med et antigen på målcellens overflate. Både polyklonale og monoklonale antistoffer som enten er tilgjengelige kommersielt eller beskrevet i litteraturen, kan benyttes. Antistoffene kan være hele antistoffer eller fragmenter derav. Monoklonale antistoffer og fragmenter kan produseres i henhold til konvensjonelle teknikker som hybridoma syntese, rekombinante DNA teknikker og protein syntese. Brukbare, monoklonale antistoffer og -fragmenter kan avledes fra hvilke som helst spesier (inkludert mennesker) eller kan dannes som kimeriske proteiner som benytter sekvenser fra mer enn en spesie.
Humane monoklonale antistoffer eller humaniserte murine antistoffer kan benyttes som målsøkende deler. Humaniserte, målsøkende deler er i stand til å redusere immunoreaktiviteten for antistoffet eller polypeptidet i vertsresipienten og tillate en økning i halveringstiden og en reduksjon av ugunstige immunreaksjoner. Murin monoklonale antistoffer kan humaniseres ved for eksempel genetisk å rekombinere nukleotidsekvensen som koder murin Fv området eller de komplementaritetsbestemmende områder derav med nukleotid sekvensene som koder et human konstant domene område og et F c område. Murin rester kan også bibeholdes i de humane variabel områder rammeverks domener for å sikre riktig målsete bindingskarakteristika. Et ikke begrensende eksempel på en målsøkende del er anti-a-2-GP antistoffet mot hjerne glial celler (a-2-glykoprotein) som er beskrevet av Slepnev et al., Bioconjugate Chem. 3:273-27' 4
(1992). Genetiske konstruerte antistoffer for avlevering av forskjellige aktive bestanddeler mot cancerceller er oppsummert av B. Bodey (2001) i Expert Opin Biol. Ther. 1(4):603-17.
Den målsøkende del kan være en ligand som er reaktiv med en reseptor på overflaten av målcellen. Således kan den målsøkende del uten begrensning inkludere hormoner med affinitet for en cellulær bindingskomponent, et hvilket som helst molekyl som inneholder en karbohydrat del som gjenkjennes av en cellulær bindingskomponent og medikamenter eller små molekyler som binder til en cellulær bindingskomponent. Uttrykket "bindingskomponent" inkluderer både reseptor- og akseptor deler. Fortrinnsvis er bindingskomponenten en celleoverflate bindingskomponent. Den målsøkende del kan være et naturlig forekommende protein som insulin, som binder til et målsete. Cytokiner inkludert interleukiner og faktorer som granulocytt/makrofag koloni stimulerende faktor (GM-CSF) og tumor nekrose faktor (TNF) er også spesifikke målsøkende deler, kjent for å binde spesifikt til celler som uttrykker høy nivåer av deres reseptorer (S.J. Terlikowski (2002) Toxicology 174(3): 143-152).
For å redusere urease- eller annen aktiv middel eksponering til ikke målceller eller vev kan målsøkende deler avskjermes for å identifisere de som viser minimal ikke-målreaktivitet mens man bibeholder målspesifisitet og -reaktivitet. Ved å redusere ikke-måleksponering (og ugunstig ikke-mållokalisering og/eller -toksisitet) kan økede doser av urease og andre aktive bestanddeler administreres. Dette tillater administrering av de høyest mulige konsentreringer av urease eller andre terapeutiske midler for å maksimalisere eksponering av målceller mens man forblir under terskelen for ikke akseptabel ikke-målcelle toksisitet.
To eller flere aktiv middel målsøkende del-konjugater der hvert konjugat inkluderer en forskjellig målsøkende del, for eksempel en annen antistoff spesie kan anvendes. Hver av de benyttede målsøkende deler binder til et annet målsete område som kan assosieres med den samme eller et annet målsete. Den aktive bestanddels komponent i hvert administrerte konjugat kan være lik eller forskjellig, se for eksempel US patent nr. 4,867,962 og 5,976,535. På denne måte blir målsete akkresjonen av aktiv middel konjugatet mot målsete forbedret fordi hver målsøkende del, for eksempel antistoff spesie, gjenkjenner et annet målsete område, for eksempel målsete epitop. Denne vei med alternativt målsete område gir flere potensielle målsete bindingspunkter for den aktive bestanddel. Som en konsekvens kan derfor den reelle eller effektive målsete metning, for eksempel via epitop metning og/eller sterisk hindring, unngås. Derfor kan additiv akkumulering av aktivt middel, for eksempel urease, oppnås. Alternativt, eller i kombinasjon, kan ytterligere urease spesifikke genprodukter benyttes som aktive midler, for eksempel for produksjon av et katalytisk aktivt holoenzym på målsete. Et eksempel på urease apoenzym inkluderer y-, 13- eller a subenheten som kodes av de bakterielle «reABC gener (R. A. Burne og Y.M. Chen (2000) Microbes andInfection 2:533-542).
Mønstrene for kryss-reaktiviteten for monoklonale antistoffer rettet mot et spesielt målsete kan analyseres for å identifisere et sett av to eller flere målspesifikke, monoklonale antistoffer med ikke-overlappende kryss-reaktivitet for anvendelse i en diagnostisk eller terapeutisk anvendelse. Uttrykket "ikke-overlappende mønster av kryss-reaktivitet" antyder at de ikke-målvev som er bundet av en antistoff spesie skiller seg vesentlig fra de ikke-målvev bundet av et annet antistoff spesie. Kryss-reaktivitets mønstrene skiller seg fra hverandre i den grad som er nødvendig for proporsjonalt å redusere eksponeringen av aktivt middel for terapeutiske applikasjoner. Mindre antistoff par (eller større sett av antistoffer) overlapping er foretrukket.
Antistoffer kan screenes ved et antall metoder. Immunohistokjemiske analyser kan gjennomføres for å bestemme reaktiviteten ved målvev og kryss-reaktivitet med ikke-målvev. Vev hvortil antistoff spesiene binder kan identifiseres ved å eksponere vevet til antistoffet; vasking av vevet for å fjerne tilstedeværende ikke-bundet antistoff; og å detektere nærværet av bundet antistoff. In vitro histokjemiske prosedyrer er kjent i teknikken, se for eksempel E. Sanchez-Islas og M. Leon-Olea (2001) Nitric Oxide 5(4):302-16.
Preparatet kan også være av nytte ved behandling av hCG-sekreterende tumorer. Fordi den plasentale trofoblast er det normale sete for syntesen av hCG er det forståelig at både gestasjonelle og ikke-gestasjonelle trofoblastiske tumorer syntetiserer og skiller ut hCG. Således har hCG målinger vært svært nyttige for av diagnose av disse tumorer, bedømmelse av utviklingen av tumorene og for å overvåke effektiviteten av terapien. I tillegg kan visse ikke-trofoblastiske tumorer produsere hCG ektopisk. hCG kan virke som en vekstfaktor for visse tumorer (S. Melmed og GD. Braunstein: Human chorionic gonadotropin stimulates proliferation of Nb 2 rat lymphoma cells. J. Clin. Endocrinol. Metab 56:1068-1070, (1983)). Det henvises også til US patent nr. 6,448,022.
Anvendelsen av et anti-hCG antistoff for å innsikte det aktive middel mot en anti-hCG utskillende tumor kan undertrykke veksten av den hCG utskillende tumor. I visse tilfeller er derfor den kjemiske enhet en målsøkende del festet til et aktivt middel og er et antitumor antigen antistoff, et anti-hCG antistoff eller en ligand som er i stand til å binde spesifikt til cancercelle overflatereseptorene. Den målsøkende del er fortrinnsvis et polypeptid bundet til urease enzymet for å danne et fusjonsprotein.
Fagmannen på området vil erkjenne at de målsøkende deler og de aktive midler kan forenes i en hvilken som helst rekkefølge. Når således den målsøkende del er polypeptid kan det aktive middel forenes til enten amino- eller karboksy termini av det målsøkende molekyl. Den målsøkende del kan også være forenet med et indre område av det aktive middel eller omvendt kan det aktive middel være forenet med en indre lokasjon av den målsøkende del, så lenge festingen ikke interfererer med molekylenes respektive aktiviteter.
Den målsøkende del og den aktive bestanddel kan være festet til en hvilken som helst av et antall midler som er velkjente for fagmannen. Karakteristisk er den aktive bestanddel konjugert, enten direkte eller via en linker (spacer), til den målsøkende del. Der imidlertid både den målsøkende del og den aktive bestanddel er polypeptider kan det være foretrukket rekombinant å uttrykke det kimeriske molekyl som et enkeltkjede fusjonsprotein.
Den målsøkende del (for eksempel cchEGFR IgG Ab) kan være kjemisk konjugert til den aktive bestanddel eller kjemiske del (for eksempel et medikament, urease eller liposom). Midler for kjemisk å konjugere molekylene er velkjente for fagmannen.
Prosedyren for å feste et middel til et antistoff eller et annet polypeptid målsøkende molekyl vil variere i henhold til den kjemiske struktur for middelet. Polypeptider inneholder karakteristisk et antall funksjonelle grupper: for eksempel karboksylsyre (COOH)- eller fri amin (~NH2) grupper, som er tilgjengelige for reaksjon med en egnet funksjonell gruppe på et aktivt middel for å binde en målsøkende dertil.
Alternativt kan den målsøkende del og det aktive middel derivatiseres for å eksponere eller å feste ytterligere reaktive, funksjonelle grupper. Derivatiseringen kan involvere festing av et hvilket som helst av et antall linker molekyler som de som er tilgjengelige fra Pierce Chemical Company, Rockford Ul.
En "linker" slik uttrykket benyttes her, er et molekyl som benyttes for å forene den målsøkende del med den aktive bestanddel. Linkeren er i stand til å danne kovalente bindinger med både den målsøkende del og den aktive bestanddel. Egnede linkere er velkjente for fagmannen på området og inkluderer, men er ikke begrenset til, rette eller forgrenede karbonlinkere, heterosykliske karbonlinkere eller peptidlinkere. Der den målsøkende del og aktiv bestanddels molekylet er polypeptider kan linkerne forenes til de konstituente aminosyrer via deres sidegrupper (det vil si via en disulfid binding til cystein). Imidlertid kan linkerne forenes til a karbonamino- og karboksyl gruppene i terminal aminosyrene.
En bifunksjonell linker med en funksjonell gruppe som er reaktiv med en gruppe på et spesielt middel, eller en annen gruppe som er reaktiv til et antistoff, kan benyttes for å danne det ønskede immunokonjugat. Alternativt kan derivatiseringen involvere kjemisk behandling av den målsøkende del, for eksempel glykol spalting av sukker delen i et glykoprotein antistoff med perjodat for å generere frie aldehyd grupper. De frie aldehyd grupper på antistoffet kan omsettes med frie amin- eller hydrazin grupper på et middel for å binde middelet dertil, se US patent nr. 4,671,958. Prosedyrer for å generere frie sulfhydryl grupper på et polypeptid som antistoffer eller antistoff fragmenter, er også kjent, se US patent nr. 4,659,839.
Mange prosedyrer og linker molekyler for festing av forskjellige forbindelser, inkludert radiomuklid metall sjelater, toksiner og medikamenter, til proteiner som antistoffer, er kjent, se for eksempel EP 188, 256; US patent nr. 4,671,958, 4,659,839, 4,414,148, 4,699,784; 4,680,338; 4,569,789; og 4,589,071; samt Borlinghaus et al. (1987) Cancer Res. 47:4071-4075). Særlig er produksjonen av forskjellige immunotoksiner velkjent i teknikken og kan for eksempel finnes i "Monoclonal Antibody-Toxin Conjugates: Aiming the Magic Bullet", Thorpe et al., Monoclonal Antibodies in ClinicalMedicine, Academic Press, s. 168-190 (1982), Waldmann (1991) Science, 252:1657, US patent nr. 4,545,985 og 4,894,443.
Under visse omstendigheter er det ønskelig å befri aktiv bestanddels molekylet fra det målsøkende molekyl når det kimeriske molekyl har nådd målsetet. Derfor kan det benyttes kimeriske konjugater omfattende bindinger som er spaltbare i nærhet av målsetet benyttes når effektoren skal frigis ved målsetet. Spalting av bindingen for å frigi middelet fra den målsøkende del kan tilveiebringes ved enzymatisk aktivitet eller under betingelser konjugatet underkastes enten inne i målcellen eller nær målsetet. Det skal være klart at når målsetet er en tumor kan det benyttes en linker som er spaltbar under betingelsene som er tilstede ved tumor sete (for eksempel ved eksponering til tumor-assosierte enzymer eller sur pH verdi).
Et antall forskjellige, spaltbare linkere er kjente i teknikken, se US 4,618,492; 4,542,225 og 4,625,014. Mekanismene for frigivning av et aktivt middel fra disse linker grupper inkluderer for eksempel bestråling av en fotolabil binding eller syrekatalysert hydrolyse. US 4,671,958 inneholder for eksempel en beskrivelse av immunokonjugat omfattende linkere som spaltes på målsete in vivo ved proteolytiske enzymer i pasientens komplementsystem. I lys av det store antall metoder som er rapportert for å feste et antall radiodiagnostiske forbindelser, radioterapeutiske forbindelser, medikamenter, toksiner og andre midler til målsøkende deler vil fagmannen være i stand til å bestemme en egnet metode for å feste et gitt middel til en valgt, målsøkende del.
Der den målsøkende del og/eller det aktive middel er relativt kort kan de syntetiseres ved bruk av kjemiske standard peptid synteseteknikker. Der begge molekyler er relativt korte kan det kimeriske molekyl syntetiseres som et enkelt, sammenhengende polypeptid. Alternativt kan den målsøkende del og den aktive bestanddel syntetiseres separat og så fuseres ved kondensering av amino terminus av et molekyl med karboksyl terminus av det andre molekyl og derved å danne en peptid binding. Alternativt kan den målsøke del- og aktiv middel molekylene begge kondenseres med en ende av et peptid spacer molekyl for derved å danne et sammenhengende fusjonsprotein.
Fast fase syntese hvori C-terminal aminosyren i sekvensen er festet til en uoppløselig bærer fulgt av sekvensiell tilsetning av de gjenværende aminosyrer i sekvensen er tatt sikte på for en alternativ form av metoden for kjemisk syntese av polypeptidene. Teknikker for fast fase syntese er beskrevet av Barany og Merrifield, Solid- Phase Peptide Synthesis; s. 3-284 i The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. vol. 2: SpecialMethods in Peptide Synthesis, del A, Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc, 85:2149-2156 (1963), og av Stewart et al, SolidPhase Peptide Synthesis, 2. utg. Pierce Chem. Co., Rockford, III. (1984).
De kimeriske fusjonsproteiner kan bli syntetisert ved bruk av rekombinant DNA metodologi. Generelt involverer dette å tildanne en DNA sekvens som koder fusjonsproteinet, plasserer DNA i ekspresjonskassett under kontroll av en spesiell promoter, uttrykker proteinet i en vert, isolerer det uttrykte protein og, hvis nødvendig, renaturerer proteinet.
DNA som koder fusjonsproteinene kan fremstilles ved en hvilken som helst egnet metode inkludert for eksempel kloning og restriksjon av egnede sekvenser eller direkte kjemisk syntese ved metoder som fosfotriester metoden i henhold til Narang et al. (1979) iMeth. Enzymol. 68:90-99; fosfodiester metoden i henhold til Brown et al. (1979) iMeth. Enzymol. 68: 109-151; dietylfosforamidit metoden i henhold til Beaucage et al. (1981) i Tetra. Lett., 22; 1859-1862; og fast bærer metoden i henhold til US 4,458,066.
Kjemisk syntese gir et enkelttrådet oligonukleotid. Dette kan konverteres til dobbelttrådet DNA ved hybridering med en komplementær sekvens, eller ved polymerisering ved en DNA polymerase ved bruk av den enkle tråd som templat. Fagmannen vil erkjenne at mens kjemisk syntese av DNA er begrenset til sekvenser på rundt 100 baser kan lengre sekvenser oppnås ved ligering av kortere sekvenser.
Alternativt kan subsekvenser klones og de egnede subsekvenser spaltes ved bruk av egnede restriksjonsenzymer. Fragmentene kan så ligeres for å gi den ønskede DNA sekvens.
Mens to molekyler fortrinnsvis i det vesentlige forenes direkte vil fagmannen erkjenne at molekyler kan separeres med en peptid spacer bestående av en eller flere aminosyrer. Generelt vil spaceren ikke ha noen spesiell biologisk aktivitet annet enn å forene proteinene eller å bevare en viss minimum avstand eller en annen rommelig sammenheng mellom disse. Imidlertid kan bestanddels aminosyrene i spaceren velges for å gi molekylet visse egenskaper som folding, nettoladning eller hydrofobisitet.
Nukleinsyre sekvensene som koder fusjonsproteinene kan uttrykkes i et antall vertceller inkludert E. coli, andre bakterielle verter, gjær- og forskjellige høyere eukaryotiske celler som COS-, CHO- og HeLa cellelinjer og myeloma cellelinjer. Det rekombinante protein gen vil være operativt forbundet til egnede ekspresjonskontroll sekvenser for hver vert. For E. coli inkluderer dette en promoter som T7-, trp- eller lambda promoterne, et ribosom bindingssete og fortrinnsvis et transkripsjonsterminering signal. For eukaryotiske celler vil kontrollsekvensene inkludere en promoter og fortrinnsvis en enhanser avledet fra immunoglobulin gener, SV40, cytomegaloviruser og så videre, og en polyadenyleringssekvens, og kan inkludere spleise donor- og -akseptor sekvenser.
Plasmidene kan overføres til den valgte vert ved kjente metoder som kalsium klorid transformasjon for E. coli og kalsium fosfat behandling eller elektroporering for pattedyr celler. Celler som er transformert med plasmidene kan velge ved resistens mot antibiotika gitt av gener som er inneholdt på plasmidene som amp-, gpt-, neo- og hyg genene.
Når de er uttrykt kan det rekombinante fusjonsprotein renses i henhold til standard prosedyrer i teknikken inkludert ammoniumsulfat presipitering, affinitetskolonner, kolonne kromatografi, gel elektroforese og lignende (se for eksempel R. Scopes (1982) Protein Purification, Springer-Verlag, NY; Deutscher (1990) Methods in Enzymology vol. 182; Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. NY). Vesentlig rene preparater med minst rundt 90 til 95% homogenitet er foretrukket og 98 til 99% eller høyere homogenitet er mest foretrukket for farmasøytisk bruk. Etter rensing, partiell eller til homogenitet, etter ønsker, kan polypeptidene benyttes terapeutisk.
Fagmannen på området vil erkjenne at etter kjemisk syntese, biologisk ekspresjon eller rensing, kan det innsiktede fusjonsprotein ha en konformasjon som er vesentlig forskjellig fra den native konformasjon av bestanddels polypeptidene. I dette tilfellet kan det være nødvendig å denaturere og å redusere polypeptidet og så å bringe polypeptidet til ny folding i den foretrukne konformasjon. Metoder for reduksjon og denaturering av proteiner og indusering av refolding er velkjente for fagmannen (se Debinski et al. (1993) i J. Biol. Chem., 268:14065-14070; Kreitman og Pastan (1993) Bioconjug. Chem., 4:581-585; og Buchner et al. (1992) Anal. Biochem., 205:263-270).
Fagmannen vil erkjenne at modifikasjoner kan foretas på mål fusjonsproteinene uten å redusere deres biologiske aktivitet. Visse modifikasjoner kan foretas for å lette kloning, ekspresjon eller innarbeiding av målsøkende molekyler i et fusjonsprotein. Slike modifikasjoner er velkjente for fagmannen på området og inkluderer for eksempel et metionin addert ved amino terminus for å gi et initieringssete, eller ytterligere aminosyrer anbrakt på hver terminus for å skape hensiktsmessig lokaliserte restriksjonsseter eller termineringskodoner.
B3. Innfangede aktive bestanddeler
Vesikler som liposomer og/eller nanokapsler kan brukes som kjemiske enheter for avlevering av den aktive bestanddel eller de aktive midler, for eksempel ureaser, mot cancerceller. Slike formuleringer kan være foretrukket for innføring av farmasøytisk akseptable formuleringer av de polypeptider, farmasøytika og/eller antistoffer som er beskrevet her. Dannelsen og bruken av liposomer er generelt kjent for fagmannen (se for eksempel M.V. Backer et al. (2002) Bioconjug Chem 13(3):462-7). Det beskrevne preparat kan være inneholdig et liposom.
Nanokapsler kan generelt fange inn forbindelser på en stabil og reproduserbar måte (J. Whelan (2001) Drug Discov Today 6(23): 1183-84). For å unngå bivirkninger på grunn av intracellulær polymer overbelastning kan slike ultrafine partikler (størrelse rundt 0.1 um) konstrueres ved bruk av polymerer som kan brytes ned in vivo. Bionedbrytbare polyisobutylcyanoakrylat nanopartikler som tilfredsstiller disse krav kan lett fremstilles som beskrevet for eksempel av G. Lambert et al (2001) i IntJPharm 214(1-2): 13-6. Metoder for å fremstille polyalkyl-cyano-akrylat nanopartikler inneholdende biologisk aktive substanser og deres anvendelser er beskrevet i US 4,329,332, 4,489,055 og 4,913,908. Nanokapsler er tilgjengelige kommersielt fra kilder som Capsulution, Inc. ( Www, capsulution. conf).
Farmasøytiske preparater inneholdende nanokapsler for avlevering av aktive midler er beskrevet i US 5,500,224, 5,620,708 og 6,514,481. US 5,500,224 beskriver et farmasøytisk preparat i form av en kolloid suspensjon av nanokapsler omfattende en oljefase bestående i det vesentlige av en olje som inneholder en surfaktant og som i suspendert form inneholder et antall nanokapsler med en diameter mindreenn 500 nanometer. US 5,620,708 beskriver preparater og metoder for administrering av medikamenter og andre aktive bestanddeler. Preparatene omfatter en bærerpartikkel for aktiv bestanddel festet til en bindende del som binder spesifikt til et mål molekyl som er tilstede på overflaten av en pattedyr enterocytt. Bindingsdelen binder til mål molekylet med en bindingsaffinitet eller aviditet som er tilstrekkelig til å initiere endocytose eller fagocytose for partikkel aktiv middel bæreren slik at bæreren absorberes av enterocytten. Det aktive middel vil så frigis fra bæreren til vertens systemiske sirkulasjon. På denne måte kan nedbrytning av nedbrytningssensitive medikamenter som polypeptider, i innvollene, unngå mens absorpsjon av proteiner og polypeptider fra fordøyelseskanalen økes. Alternativt kan det tas sikte på frigivning av den aktive bestanddel i omgivelser som omgir målcellen. Urease kan for eksempel bli frigitt fra nanokapselen etter at måldelen binder til målcellen slik at urease frigis til mikroomgivelsene rundt målcellen, for eksempel en tumor celle. US 6,379,683 og 6,303,150 beskriver metoder for fremstilling av nanokapsler og anvendelsen av disse.
Kontakten kan således inkludere addering til cellene av et konjugat omfattende en målsøkende del og et første viklingsdannende peptid som karakteriseres ved en valgt ladning og en evne til å interagere med et andre, motsatt ladet, viklingsdannende peptid for å danne en stabil a-helikal viklet-oppviklet heterodimer. Deretter settes et liposom til cellene. Liposomet omfatter en ytre overflate og et indre rom; et aktiv middel, for eksempel urease, lokalisert i det indre rom av liposomer; og et antall andre peptider der hvert andre peptid er forbundet med den ytre overflate av liposomet.
Kontakten kan eventuelt inkluderer å sette liposomer til cellene der liposomene har den aktive bestanddel, for eksempel ureasen, i innfanget form, og ytre overflater av liposomet med en celle søkende del som er effektiv til spesifikt å binde til en mål overflate, og et hydrofilt polymerbelegg som effektivt avskjermer den målsøkende del fra interaksjon med mål overflaten. De hydrofile polymerbelegg kan bestå av polymerkjeder som kovalent er bundet med overflate lipid komponentene i liposomene via frigivbare bindinger. Et frigivende middel kan bli satt til tumor cellene i en mengde effektiv til å forårsake frigivning av en vesentlig del av bindingene i de tilsatte liposomer for derved å eksponere måldelen til mål overflaten. De frigivbare bindinger kan være reduserbare, kjemiske bindinger som disulfid-, ester- og peptid bindinger. Fortrinnsvis er affinitetsdelen effektiv til å binde spesifikt til et cancer-spesifikt antigen.
Det kan tilveiebringes en metode for liposom-basert terapi for et pattedyr individ. Metoden inkluderer systemisk administrering til individet, for eksempel intravenøs administrering, av liposomer med en overflatebundet målsøkende del og et hydrofilt polymerbelegg. Det hydrofile polymerbelegg, bestående av frigivbart festede polymerkjeder, er effektive for å skjerme den målsøkende del fra interaksjon med sitt mål. Foretrukne, hydrofile polymerer er diskutert ovenfor. De administrerte liposomer tillater å sirkulere systemisk inntil det er oppnådd en ønsket biofordeling av liposomene. Et frigivningsmiddel som beskrevet nedenfor administreres til individet i en mengde effektiv til å forårsake spalting av en vesentlig del, for eksempel mer enn 50%, fortrinnsvis mer enn 70% og helst mer enn 90% av de frigivbare bindinger i de administrerte liposomer. Den målsøkende del eksponeres ved frigivning av den hydrofile polymerkjede for interaksjon med målet.
Alternativt kan liposomer benyttes for behandling av en fast tumor. Liposomene inkluderer urease og eventuelt et ytterligere aktivt middel, for eksempel et antitumor medikament, i innfanget form eller er
innsiktet mot tumor området ved innsiktningsdelen som er effektiv for spesifikt å binde til et tumor spesifikt antigen. I et eksempel på en metode blir liposomer siktet inn mot de vaskulære, endoteliale celler av tumorer ved å inkludere en VEGF ligand i liposomene, for selektiv festing til Fik-1,2 reseptorer som uttrykkes på de proliferende tumor endotelial celler (T.M. Niederman et al. (2002) Proe Nati Acad Sei 99(10): 7009-14).
Liposomene kan ha en størrelse mellom rundt 30-400 nm. Liposomer i dette størrelsesområde er påvist å være i stand til å tre inn i tumorer gjennom "åpninger" som er tilstede i endotelial celleforingen av tumor vaskulatur (K. Maruyama et al (1999) Adv Drug Deliv Rev 40(1-2): 89-102).
Etter administrering av liposomene, for eksempel intravenøs administrering, og etter at det er gått tilstrekkelig tid til å tillate at liposomene er fordelt i individet og binder til tumoren, administreres et frigivningsmiddel til individet for å frigi det hydrofile overflatebelegg fra liposomene. Frigivning av overflatebelegg bevirker eksponering av den målsøkende del for å tillate binding av liposomene til målcellene. Dethydrofile overflatebelegg kan være festet til liposomene ved pH sensitive bindinger. Bindingene frigis etter at liposomene binder til tumoren.
Liposomene som beskrevet ovenfor kan eventuelt inkludere ett eller flere innfangede antitumor medikamenter eller billedmidler eller begge deler. Liposomene kan tilsettes og tillates å fordele seg hvoretter et frigivningsmiddel kan administreres for å frigi det hydrofile overflatebelegg for å eksponere den festede, målsøkende del og å initiere binding. Således blir det innfangede antitumor medikament eller billedmiddel eller begge deler spesifikt og lokalt administrert til målet. Eksempler på anticancer medikamenter er beskrevet i del ULA. nedenfor. Eksempler på billedmidler for bruk i metoden er beskrevet i del UIB. nedenfor. Liposomer kan fremstilles og administreres som beskrevet i US 6,043,094.
Ytterligere avleveringsmidler som små, unilamellære vesikler (SUVer) er beskrevet i US 6,180,114.
B4. Aktiv middel modulatorer
Aktiv middel modulatorer kan være assosierte, kjemiske enheter. En foretrukken aktiv middel modulator er en urease modulator. En urease modulator er enten en inhibitor av urease eller en forsterker av urease. Modulatoren i preparatene (for eksempel farmasøytiske preparater) kan i henhold til dette velges blant alle eller deler av urease polynukleotid sekvenser, urease antisens molekyler, urease polypeptider, protein, peptid eller organiske modulatorer av urease bioaktivitet som inhibitorer, antagonister (inkludert antistoffer) eller agonister. Fortrinnsvis er modulatoren aktiv med henblikk på å behandle en medisinsk tilstand som medieres av, eller forbedres av urease ekspresjon eller urease aktivitet.
En "urease inhibitor" omfatter et molekyl eller en gruppe av molekyler som interfererer med: (1) eksprimering, modifisering, regulering, aktivering eller degradering av urease; eller (2) en eller flere av de normale funksjoner for urease, inkludert hydrolysen av urea som fører til produksjonen av karbamat og ammoniakk. En inhibitor "virker direkte på urease" når inhibitoren binder til urease via elektrostatiske eller kjemiske interaksjoner. Slike interaksjoner kan men behøver ikke være mediert av andre molekyler. En inhibitor virker "indirekte på urease" når den mest umiddelbare effekt er på et molekyl annet enn urease som innvirket på eksprimering, aktivering eller funksjonering av urease.
Urease inhibitorer tjener til å redusere konverteringen av urea til ammonium ioner. Urease inhibitorer inkluderer, men er ikke begrenset til hydroksamsyre derivater (for eksempel acetohydroksamsyre), fosforamid derivater (for eksempel flurofamid), fosfater, tioler (for eksempel 2-merkaptoetanol og så videre), borsyre, halogen forbindelser (for eksempel fluorider og så videre), og cassia bark ekstrakt. Ytterligere urease inhibitorer er velkjente for fagmannen på området og er beskrevet i US 4,824,783 (25. april 1989).
En "urease enhanser" omfatter et molekyl eller en gruppe av molekyler som forsterker: (1) ekspresjon, modifisering, regulering eller aktivering av urease; eller (2) en eller flere av ureasenes normale funksjoner. En enhanser "virker direkte på urease" når enhanseren binder til urease via elektrostatiske eller kjemiske interaksjoner. Slike interaksjoner kan eventuelt være mediert av andre molekyler. En enhanser virker "indirekte på urease" når den mest umiddelbare effekt er på et molekyl annet enn urease som påvirker eksprimering, aktivering eller funksjoneringen av urease.
C. Ytterligere aktive bestanddeler
Ytterligere aktive midler kan også innarbeides i preparatene. De ytterligere, aktive bestanddeler, for eksempel et antitumor middel (et middel som er aktivt mot prolifererende celler) kan benyttes i preparatene før, samtidig med eller etter at cellene er brakt i kontakt med et første aktivt middel. Etter at urease er siktet inn mot tumor cellene kan det for eksempel ha evnen til å modulere eller regulere den eksterne tumor omgivelse, for eksempel via pH forandringer. Aktive midler, for eksempel antitumor midler, som favoriserer en basisk omgivelse, vil så være mer effektiv.
I visse tilfeller er det tatt sikte på substrater som er i stand til enzymatisk å kunne prosesseres av urease for bruk som aktive midler. Fortrinnsvis er det aktive middel et substrat som urease kan benytte for å gi ammonium ioner, for eksempel urea.
Eksempler på antitumor midler inkluderer cytokiner og andre deler som interleukiner (for eksempel JX-2, IL-4, IL-6, IL-12 og lignende), transformerende vekstfaktor-J3, lymfotoksin, tumor nekrose faktor, interferoner (for eksempel y-interferon), koloni stimulerende faktorer (for eksempel GM-CSF, M-CSF og lignende), vaskulær permeabilitetsfaktor, lektin inflammatorisk respons promotere (selektiner), som L-selektin, E-selektin, P-selektin, og proteinholdige deler som Clq- og NK reseptor protein. Ytterligere, egnede antitumor midler inkluderer forbindelser som inhiberer angiogenese og derfor inhiberer metastase. Eksempler på slike midler inkluderer protamin medroksyprogesteron, pentosan polysulfat, suramin, taksol, talidomid, angiostatin, interferon-cc, metalloproteinase inhibitorer, blodplate faktor 4, somatostatin, tromobospondin. Andre representative og ikke-begrensende eksempler på aktive midler som er brukbare i forbindelse med oppfinnelsen inkluderer vinkristin, vinblastin, vindesin, busulfan, klorambucil, spiroplatin, cisplatin, karboplatin, metotreksat, adriamycin, mitomycin, bleomycin, cytosin arabinosid, arabinosyl adenin, merkaptopurin, mitotan, prokarbazin, daktinomycin (antinomycin D), daunorubicin, doksorubicin hydroklorid, taksol, plikamycin, aminoglutetimid, estramustin, flutamid, leuprolid, megestrol acetat, tamoksifen, testolakton, trilostan, amsakrin (m-AMSA), asparaginase (L-asparaginase), etoposid, blodprodukter som hematoporfyriner eller derivater av de foregående. Andre eksempler på aktive midler inkluderer genetisk materiale som nukleinsyrer, RNA, og DNA av naturlig eller syntetisk opprinnelse inkludert rekombinant RNA og DNA. DNA som koder visse proteiner kan benyttes ved behandling av mange forskjellige typer sykdommer. For eksempel kan tumor nekrose faktor- og interleukin-2 gener tilveiebringes for å behandle avanserte cancere; tymidin kinase gener kan tilveiebringes for å behandle ovarie cancer eller hjernetumorer; og interleukin-2 gener kan tilveiebringes for å behandle neuroblastom, malignant melanom eller nyre cancer. Ytterligere, aktive midler som er tatt sikte på for bruk er beskrevet i US 6,261,537. Antitumor midler og screening for detektering av slike midler er oppsummert av M. Monga ogE.A. Sausville (2002) iLeukemia 16(4):520-6.
Den aktive bestanddel kan være en svakt basisk antitumor forbindelse hvis effektivitet reduseres av en høyere intracellulær/lavere ekstracellulær pH gradient i en fast tumor. Eksempler på svakt basiske antitumor forbindelser inkluderer doksorubicin, daunorubicin, mitoksantron, epirubicin, mitomycin, bleomycin, vinka alkaloider som vinblastin og vinkristin, alkyleringsmidler som cyklofosfamid og mekloretamin hydroklorid, og antineoplastisk purin- og pyrimidin derivater.
Preparatet kan inkludere urease, og mangler i det vesentlige enhver form for cytokiner, for eksempel tumor nekrose faktor og/eller interferoner. I dette tilfellet er urease alene, eller med aktive bestanddeler andre enn cytokiner, fortrinnsvis i kombinasjoner med småmolekyl antitumor midler, effektiv for å inhibere cancercellevekst. Preparatet kan her således eventuelt virke sammen med endogene eller native cytokiner som er tilstede i individet som behandles, men preparatet som administreres inneholder ikke ytterligere, eksogene cytokiner.
D. Billedmidler
På samme måte kan billedmidler inkluderes i preparatene eller i ytterligere preparater. Egnede billedmidler inkluderer kommersielt tilgjengelige midler som benyttet ved positron emisjonstomografi (PET), computer assistert tomografi (CAT), enkeltfoton emisjons datastyrt tomografi, røntgen, fluoroskopi og magnetisk resonans billedopptak (MRI).
Billedmidler inkluderer metaller, radioaktive isotoper og radioopaque midler (for eksempel gallium-, teknesium-, indium-, stronsium-, jod-, barium-, brom- og fosfor holdige forbindelser), radiolucente midler, kontrastmidler, fargestoffer (for eksempel fluorescente fargestoffer og kromoforer) og enzymer som katalyserer en kolorimetrisk eller fluorometrisk reaksjon. Generelt kan slike midler være festet til eller fanget ved bruk av et antall teknikker som beskrevet ovenfor, eller kan være tilstede i en hvilken som helst orientering, se for eksempel US 6,159,443 og 6,391,280.
Kontrastmidler er brukbare ved billedopptaks modaliteter som røntgen kontrastmidler, lysbilledgivende prober, spin merkelapper eller radioaktive enheter.
Eksempler på egnede materialer for anvendelse som kontrastmidler ved MRI inkluderer gadolinium chelatene som i dag er tilgjengelige, som dietylen triamin pentaeddiksyre (DTPA) og gadopentotat dimeglumin, så vel som jern, magnesium, mangan, kobber og krom.
Eksempler på materialer som er brukbare for CAT og røntgen inkluderer jod-baserte materialer som ioniske monomerer, eksemplifisert ved diatrizoat og iotalamat, ikke-ioniske monomerer som iopamidol, isoheksol og ioversol, ikke-ioniske dimerer som iotrol og iodiksanol, og ioniske dimerer som ioksagalt.
Luft og andre gasser kan innarbeides for anvendelse i ultralyd billedopptak. Disse midler kan detekteres ved bruk av standard teknikker som er tilgjengelige i teknikken og kommersielt tilgjengelig utstyr. Cancercellene kan bli brakt i kontakt med et billedgivende middel før eller etter eller både før og etter kontakt med den aktive bestanddel. Etter at urease er innsiktet mot tumor cellen kan den for eksempel ha evnen til å modulere eller å regulere den ytre tumor omgivelse, for eksempel ved pH forandringer. Billedgivende midler som favoriserer en basisk omgivelse vil i dette tilfellet være mer effektive.
Både luminescente cyklen-baserte lantanide chelater og de som primært gir magnetisk resonans signaturer har vist seg å være sensitive for forandringer i pH verdien. Luminescente prober som benyttes for å avføle pH forandringer detekterer typisk forandringer i fluorescens levetiden for lantanid ionet som en funksjon av pH verdien. Analogt er resonans kontrastmiddelet som modulerer vann proton relaksiviteten via forandringer i pH verdien brukbare. I begge tilfelle kan man ved å forandre pH verdien i et gitt system ta sikte på midler med forbedret kontrast.
I henhold til dette benyttes det et pH sensitivt kontrastmiddel ved eller nær cancercellen. Cancercellen eller -cellene eksponeres altså til et urease preparat inneholdende urease enzym for å forårsake en forandring i pH verdien ved eller nær cancercellen. På denne måte forårsaker en forandring i pH verdien det nukleær magnetiske resonans relaksasjons egenskaper for vann protoner eller andre kjerner i det vandige medium som forandres på en måte som er reflektiv for pH verdien. Eksempler på pH sensitive kontrastmidler som kan benyttes inkluderer de midler som inneholder lantanid metall som Ce, Pr, Nd, Sm, Eu, Gd, Db, Dy, Ho, Er, Tm, Yb og lignende, eller et annet paramagnetisk element som Fe, Mn, 170, eller lignende. Spesifikke kontrastmidler som kan benyttes inkluderer H (2)(17)0, GdDOTA-4AmP(5-) som er beskrevet iMagn ResonMed. 2003 Feb; 49(2):249-57, og Fe(UI)meso-tetra(4-sulfonatofenyl)porfin (Fe-TPPS4) som beskrevet av Helpern et al. (1987) Magnetic Resonance in Medicine 5:302-305 og US 6,307,372.1 tillegg kan Gd basert med polyion som beskrevet av Mikawa et al. Acad. Radiol (2002) 9(suppl 1): S109-S1111.
Som et annet alternativ kan en shift reagens tilveiebringes i det vandige medium som omgir cancercellen. Shift reagensen er konfigurert slik at en forandring i pH verdien bevirker kjemiske shift egenskaper i vann protonene eller andre kjerner på en måte som reflekterer pH verdien. Forandringen i kjemiske shift egenskaper kan så måles ved bruk av kjernemagnetisk resonans for å bestemme hvorvidt det aktive middel er biologisk aktivt. Eksempler på shift reagenser som kan benyttes inkluderer de som inneholder et lantanid metall som Ce, Pr, Nd, Sm, Eu, Gd, Db, Dy, Ho, Er, Tm eller Yb, eller et annet paramagnetisk element. Eksempler på spesifikke shift reagenser som kan benyttes inkluderer Tm(DOTP) (5-), tulium (Ul) komplekset av l,4,7,10-tetraazacylododekan-N,N',N",N"'-tetra(metylenfosfat), Dy(PPP) (2)(7)-dysprosium tripolyfosfat, og lignende.
En dual-kontrast-middel strategi som benytter to gadolinium midler som det pH innsensitive GdDOTP (5-) og det pH-sensitive GdDOTA-4AmP(5-), kan benyttes for å generere pH kart ved MRI som beskrevet i Magn Reson Med (2003) Feb;49(2):249-57.
Foretrukne midler for anvendelse med PET scan inkluderer 13N og fluordeoksyglukose (FDG).
E. Preparat formulering
Som angitt ovenfor omfatter preparatene et urease enzym konjugert til et anti-tumor antigen antistoff, eventuelt i kombinasjon med en svakt basisk antitumor forbindelse .
Preparatet kan også inkludere andre nukleotid sekvenser, polypeptider, medikamenter eller hormoner blandet med en eller flere eksipienter eller andre farmasøytisk akseptable bærere. Preparater andre enn farmasøytiske preparater omfatter eventuelt væske, for eksempel vann eller en vannbasert væske.
Farmasøytisk akseptable eksipienter for anvendelse sammen med farmasøytiske preparater er også velkjente for fagmannen på området og er lett tilgjengelige. Valget av eksipient vil bestemmes delvis av den spesielle metode som benyttes for å administrere produktet. I henhold til dette er det et vidt spektrum av egnede formuleringer for anvendelse.
Teknikker for formulering og administrering av farmasøytiske preparater kan finnes i Remingtons Pharmaceutical Science, 19. utg., Williams & Wilkins, 1995, og er velkjente for fagmannen på området. Valget av eksipient vil bestemmes delvis av den spesielle metode som benyttes for å administrere produktet. I henhold til dette er det et vidt spektrum av egnede formuleringer for anvendelse. De følgende metoder og eksipienter er kun eksempler og ikke på noen måte begrensende.
De farmasøytiske preparater kan fremstilles ved bruk av en hvilken som helst egnet metode, for eksempel blanding, oppløsning, granulering, levigering, emulgering, innkapsling, innfanging, smeltespinning, spray tørking eller lyofilisering. Imidlertid vil den optimale, farmasøytiske formulering bestemmes av fagmannen avhengig av administreringsvei og den ønskede dosering. Slike formuleringer kan påvirke den fysiske tilstand, stabilitet, in vivo frigivning og in vivo klaringshastighet for det administrerte middel. Avhengig av tilstanden som behandles kan disse farmasøytiske preparater formuleres og administreres som beskrevet i del Ul nedenfor.
De farmasøytiske preparater formuleres til å inneholde egnede, farmasøytisk akseptable bærere og kan eventuelt omfatte eksipienter og hjelpestoffer som letter prosessering av de aktive forbindelser til preparater som kan benyttes farmasøytisk. Administreringsmodaliteten vil generelt bestemme arten av bærer. For eksempel kan formuleringer for parenteral administrering omfattende vandige oppløsninger av de aktive forbindelser i vannoppløselig form. Bærere som er egnet for parenteral administrering kan velges blant saltoppløsning, bufiret saltoppløsning, dekstrose, vann og andre fysiologisk kompatible oppløsninger. Foretrukne bærere for parenteral administrering er fysiologisk kompatible buffere som Hanks oppløsning, Ringers oppløsning og fysiologisk bufret saltoppløsning. For vev- eller cellulær administrering benyttes penetranter som er egnet for den spesielle bærer som skal permeeres, i formuleringen. Slike penetranter er generelt kjent i teknikken. For preparater som omfatter proteiner kan formuleringen inkludere stabiliseringsmidler som polyoler (for eksempel sukrose) og/eller surfaktanter (for eksempel ikke-ioniske surfaktanter), og lignende.
Alternativt kan formuleringer for parenteral bruk omfatte suspensjoner av de aktive forbindelser fremstilt som egnede olje injeksjonssuspensjoner. Egnede lipofile oppløsningsmidler eller vehikler inkluderer fettoljer som sesamolje og syntetiske fettsyre estere som etyloleat eller triglyserider, eller liposomer. Vandige injeksjonssuspensjoner kan inneholde stoffer som øker viskositeten for suspensjonen som natrium karboksymetyl cellulose, sorbitol eller dekstran. Eventuelt kan suspensjonen også inneholde egnede stabilisatorer eller midler som øker oppløseligheten for forbindelsene for å tillate fremstilling av meget konsentrerte oppløsninger. For eksempel kan det også benyttes emulsjoner, for eksempel olje-i-vann- og vann-i-olje dispersjoner, eventuelt stabilisert med et emulgeringsmiddel eller et dispergeringsmiddel (overflate aktive stoffer; surfaktanter). Liposomer som beskrevet ovenfor, inneholdende den aktive bestanddel, kan også benyttes for parenteral administrering.
Alternativt kan de farmasøytiske preparater omfattende midler i doseringer egnet for oral administrering, formuleres ved bruk av farmasøytisk akseptable bærere som velkjent i teknikken. Preparatene som formuleres for oral administrering kan foreligge i form av tabletter, piller, kapsler, kachets, lozenger, væsker, geler, siruper, oppslamminger, suspensjoner eller pulvere. For å illustrere dette kan farmasøytiske preparater for oral anvendelse oppnås ved å kombinere de aktive forbindelser med en fast eksipient, eventuelt oppmaling av den resulterende blanding og prosessering av blandingen av granuler etter tilsetning av egnede hjelpestoffer hvis dette er nødvendig, for å oppnå tabletter. Orale formuleringer kan benytte flytende bærere som av type tilsvarer de som er beskrevet for parenteral bruk, for eksempel bufrede, vandige oppløsninger, suspensjoner og lignende.
Disse preparater kan inneholde en eller flere eksipienter som, uten begrensning, inneholder: a) diluenter som sukkere inkludert laktose, dekstrose, sukrose, mannitol eller sorbitol; b) bindemidler som magnesium aluminium silikat, stivelse fra mais, hvete, ris, potet og så videre; c) cellulose materialer som metyl cellulose, hydroksypropylmetyl cellulose og natrium karboksymetyl cellulose, polyvinyl pyrrolidon, gummier som gummi arabikum eller gummi tragakant, og proteiner som gelatin og kollagen; d) disintegrerings- og oppløseliggjørende midler som fornettet polyvinyl pyrrolidon, stivelser, agar, alginsyre eller et salt derav som natrium alginat, eller effervescente preparater; e) smøremidler som silika, talkum, stearinsyre eller dennes magnesium eller kalsium salt, og polyetylen glykol; f) smaksstoffer og søtere; g) fargestoffer eller pigmenter, for eksempel for å identifisere produktet eller for å karakterisere mengden (doseringen) av aktivt middel; og h) andre bestanddeler som preserverings-, stabiliserings-, svelle- eller emulgeringsmidler, oppløsningspromotere, salter for å regulere osmotisk trykk, og buffere.
Det farmasøytiske preparat kan tilveiebringes som et salt av det aktive middel som kan tildannes med mange syrer, inkludert, men ikke begrenset til salt-, svovel-, eddik-, melke-, vin-, eple- eller ravsyre og så videre. Salter har en tendens til å være mer oppløselige i vandige eller andre protoniske oppløsninger enn de tilsvarende frie baseformer.
Som angitt ovenfor kan egenskapene for middelet per se og formuleringen av middelet påvirke den fysiske tilstand, stabilitet, hastighet for frigivning in vivo og klaringshastighet in vivo for det administrerte middel. Slike farmakokinetiske og farmakodynamiske informasjoner kan samles via prekliniske in vitro og in vivo studier og bekreftet seg senere i mennesker under forløpet av kliniske prøver. Veiledning for å gjennomføre human kliniske tester basert på in vivo dyre data kan oppnås fra et antall kilder inkludert for eksempel http:// www, clinicaltrials. go4 For enhver forbindelse som benyttes kan det således estimeres en terapeutisk effektiv dose i pattedyr og særlig mennesker fra biokjemiske og/eller celle baserte analyser. Således kan doseringen formuleres i dyremodeller for å oppnå et ønsket sirkulasjonskonsentrasjonsområde som modulerer aktiv middel ekspresjonen eller -aktiviteten. Etter hvert som human studier gjennomføres vil man oppnå ytterligere informasjon med henblikk på de egnede dosenivåer og behandlingsvarigheten for de forskjellige sykdommer og tilstander.
Toksisitet og terapeutisk effektivitet for slike forbindelser kan bestemmes ved farmasøytiske standardprosedyrer i cellekulturer eller forsøksdyr, for eksempel for å bestemme LD50 (den letale dose for 50% av populasjonen) og ED50 (den terapeutisk effektive dose i 50% av populasjonen).
in. Anvendelse i følge oppfinnelsen
Ett aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører et farmasøytisk preparat for bruk ved inhibering av vekst av en fast tumor. Anvendelsen inkluderer eksponering av cellene for urease som et aktivt middel i en mengde effektiv til å inhibere veksten av cancerceller.
A. Eksponering av cancerceller til aktivt middel
Urease preparatet, urease i kombinasjon med en kjemisk enhet som er effektiv for å forsterke avleveringen av enzymet til cancerceller, kan avleveres til cancercellene på et antall i og for seg kjente metoder. Ved terapeutiske applikasjoner blir preparatet administrert til en pasient med cancerceller i en mengde tilstrekkelig til å inhibere veksten av cancerceller. Det farmasøytiske preparat kan eksponeres til cancercellene ved administrering via et antall veier inkludert, uten begrensning, parenteral, enteral, transepitelial, transmukosal, transdermal og/eller kirurgisk administrering.
Parenterale administreringsmodaliteter inkluderer de der preparatet administreres for eksempel intravenøst, intraarterielt, intraperitonealt, intramedullært, intramuskulært, intraartikulært, intratekalt og intraventrikulært ved injeksjon og videre ved subkutan, intragonadal eller intratumoral nåle bolus injeksjon, eller forlengede kontinuerlige, pulsatile eller planlagte perfusjoner eller mikroinfusjoner ved bruk av egnet pumpetekmologi. Enterale administreringsmodaliteter inkluderer for eksempel oral (inkludert bukal og sublingual) og rektal administrering. Transepiteliale administreringsmodaliteter inkluderer for eksempel transmukosal administrering og transdermal administrering. Transmukosal administrering inkluderer for eksempel enteral administrering så vel som nasal, inhalerings- og dyp lunge administrering, vaginal og rektal administrering. Transdermal administrering inkluderer passive eller aktive transdermale eller transkutane modaliteter inkludert for eksempel puter eller iontoforese innretninger så vel topiske applikasjoner av pastaer, salver og lignende. Kirurgiske teknikker inkluderer implantering av depot (reservoir) preparater, osmotiske pumper og lignende.
Enkle eller multiple administreringer av den aktive bestanddel kan administreres avhengig av dose og frekvens etter behov og i henhold til toleransen hos individet. I ethvert tilfelle bør preparatet gi en tilstrekkelig mengde av aktiv bestanddel til effektivt å behandle individet.
Fagmannen på området vil erkjenne at det finnes visse områder som ikke er tungt vaskularisert eller som besluttet av celler som er forenet ved tette forbindelser og/eller aktive transportmekanismer som reduserer eller forhindrer tilgang av makromolekyler som er tilstede i blodstrømmen. Således kan for eksempel systemisk administrering av terapeutika for å behandle gliomer eller andre hjerne cancere, være begrenset av blod-hjerne barrieren som motstår inntrenging av makromolekyl i det subaraknoide rom. I disse typer tumorer kan det terapeutiske preparat fortrinnsvis administreres direkte til tumorsete. For eksempel kan hjernetumorer behandles ved administrering av det terapeutiske preparat direkte til tumorsetet, for eksempel ved en bolus injeksjon, mikroinfusjon eller et kirurgisk implantert kateter.
Eksponeringen kan inkluderer visualisering av cancercellen eller tumoren med et billed ledeverktøy, for eksempel som beskrevet i "Enhanced Magnetic Resonance Imaging", V.M. Runge utg., CV. Mosby Co.
(1989) for MRI; for eksempel i EP 188,256; Kozak et al., TH3TEC oktober 1986, 262; Radiotracers for Medical Applications, CRC Press, Boca Raton, Fla., for radiodiagnose og/eller radioterapi; i "Positron Emission Tomography of the Brain", Springer Verlag 1983, for PET; og i J.W. Nowicky et al., "Macroscopic UV-Marking through Affinity", J. Tumor Marker Oncology 31, 463-465 (1988). Således kan en hvilken som helst av et antall diagnosemidler innarbeides i preparatene som lokal eller systemisk kan gi de innarbeidede midler etter administrering til en pasient.
Billedgivende midler som beskrevet ovenfor kan benyttes for å tillate overvåking av tumor behandling etter administrering av preparatet til en pasient. For eksempel blir de typisk administrert før gjennomføring av billedopptaks prosedyren. Det er også mulig at administreringen er samtidig med billedopptaket der dette er ønskelig, for eksempel i farmakokinetiske studier. Det optimale tidsrom som er nødvendig for lokalisering ved målsete og optimal billed forsterkning kan også variere med det aktive middel og/eller konjugat og/eller vev og/eller billed modalitet og vil også kunne bestemmes rutinemessig. Karakteristisk vil billedopptak skje før signifikant klaring av den aktive bestanddel fra setet, hvilket tidsrom også rutinemessig kan bestemmes av fagmannen. I visse tilfeller vil aktive midler eller konjugater administreres 15 minutter til 4 timer før gjennomføring av billedopptaks prosedyren fordi de aktive midler kan lokaliseres hurtig til sine målseter og så eventuelt klares hurtig fra disse slik det skal diskuteres nærmere nedenfor.
Eksponeringen kan inkludere en undersøkelse av individene i et diagnostisk verktøy i stand til å detektere forandringer i ekstracellulær pH verdi i et individs vev og å identifisere et vev område innen individet som viser en valgt forhøyelse i ekstracellulær pH verdi etter administrering. Basert på identifiseringen kan eksponeringen gjentas inntil en valgt forandring i ekstracellulær pH verdi i hele den faste tumor, er oppnådd.
Eksponeringen kan inkludere administrering av det aktive middel preparat parenteralt til individet annet enn ved direkte injeksjon. Det aktive middel kan være derivatisert som diskutert i del II ovenfor.
Som diskutert ovenfor katalyserer urease hydrolysen av urea og fører til produksjonen av karbamat og ammoniakk. I en vandig omgivelse dekomponerer karbamat hurtig og spontant og gir et andre molekyl av ammoniakk og et av karbondioksid (fig. l).Urease har et vidt spektrum av funksjoner. Den umiddelbare omgivelsesrolle er å tillate organismer å benytte eksterne og internt generert urea som nitrogenkilde. I planter kan urease delta i den systemiske nitrogen transportvei og eventuelt virke som toksisk forsvarsprotein.
Substratet for urease er urea som produseres i leveren, bæres i blodstrømmen til nyrene og skilles ut i urin. Serum konsentrasjoner av urea i friske mennesker er karakteristisk mellom en og 10 mM, men urea nivåer i urinen kan overskride 0.5M (Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Merck and Co., Inc., Rahway, NJ, 1999). Urea er også tilstede i utskillingene fra de store og små eksokrin kjertler i konsentrasjoner omtrent ekvivalent til serum slik at en stor andel av sirkulerende urea translokaliseres på celleoverflater av sekretoriske systemer, eller i vev eksudater (R. A. Burne og Y.M. Chen, Microbes and Infection, 2, 2000; 533-542). For eksempel skiller voksne mennesker ut så å si 1 liter spytt hver dag inneholdende 1-10 mM urea og rundt 20-25% av all produsert urea går inn i fordøyelseskanalen heller enn å tre ut av kroppen i urin (W.J. Visek, Fed. Proe. 31 (1972) 1178-1193). Det er ingen åpenbare aktiv effluks mekanisme for eksokrin sekresjon av urea slik at det antas at det uforandrede urea molekyl ganske enkelt følger vannet gjennom cellene og tette skjøter av epitelium. Som en konsekvens er overflatene av cellen i det humane legeme badet i et fluid som inneholder urea (R.J.C. McLean et al. CRC, Crit. Rev. Microbiol. 16 (1988) 37-79).
B. To- og tretrinns eksponering
Det aktive middel kan være direkte konjugert til den målsøkende del. Alternativt benyttes en totrinns vei for å avgi aktivt middel til tumorcellene. Fortrinnsvis inneholdes tumorcellene i et individ. Totrinns veien har fordelen av dekobling av farmakokinetikk til det aktive middel fra den til målsøkings molekylet. Den målsøkende del tillates å komme frem til målsete, konjugert til en første bindingspartner, for eksempel et viklingsdannende peptid. Etter at den målsøkende del har kommet frem kan i det vesentlige all ikke-innsiktet konjugat klares fra individets sirkulasjon. Det aktive middel kan så administreres som et konjugat til den komplementære bindingspartner del, for eksempel et andre viklingsdannende peptid.
Et hvilket som helst totrinns system som kjent i teknikken kan benyttes, for eksempel biotin, haptener og så videre, med en høy affinitets bindingspartner, for eksempel avidin, spesifikke antistoffer og så videre, se US 6,190,923, 6,187,285 og 6,183,721.
Et foretrukket totrinns system inkluderer et oppviklet viklingssystem. Det kan således benyttes en totrinns vei som beskrevet ovenfor der et første konjugat omfattende en målsøkende del og et første viklingsdannende peptid som karakteriseres ved en valgt ladning og evnen til å interagere med et andre, motsatt ladet, viklingsdannende peptid for å danne en stabil a-helikal viklet viklingsheterodimer settes til tumorcellene. Et eksempel på en metode for konjugering av en antistoff søkende del til et viklingsdannende peptid er beskrevet i eksempel 4.
Deretter blir et andre konjugat omfattende et andre viklingsdannende peptid og det aktive middel satt til cellene. Et foretrukket aktivt middel er urease. Et eksempel på metoden for konjugering av jack bønne urease til et viklingsdannende peptid er beskrevet i eksempel 2.
Når et første viklingsdannende peptid og et andre viklingsdannende peptid blandes sammen under betingelser som favoriserer dannelsen av a-helikal viklede viklingsheterodimerer kan disse interagere og danne et to-subenhet av a-helikal viklet viklingsheterodimerisk kompleks. Peptider i en a-helikal viklet viklingskonformasjon interagerer med hverandre på en karakteristisk måte som bestemmes ved primærsekvensen for hvert peptid. Tertiærstrukturene for en a-heliks er slik at syv aminosyre rester i primærsekvensen tilsvarer rundt to viklinger av en a-heliks. I henhold til dette kan en primær aminosyre sekvens som gir opphav til en a-helikal konformasjon brytes ned til enheter på syv rester hver kalt "heptader". Heterodimer-subenhet peptidene består av en serie heptader i tandem. Når sekvensen av en heptade gjentatt i et spesielt heterodimer-subenhet peptid kan heptaden kalles en "heptade repetisjon" eller ganske enkelt "repetisjon".
Et første viklingsdannende peptid og andre viklingsdannende peptid kan gå sammen til en heterodimer viklet viklingsheliks (viklet-viklingsheterodimer) i enten parallell eller antiparallell konfigurasjon. I en parallell konfigurasjon blir de to heterodimer-subenhet peptid helikser rettet inn slik at de har samme orientering (aminoterminal til karboksyterminal). I en antiparallell konfigurasjon er heliksene arrangert slik at aminoterminal enden for en heliks er innrettet med karboksyterminalen for den andre heliks og vise versa. Slike heterodimere subenheter er beskrevet i WO 95/31480 "Heterodimer Polypeptide Immunogen Carrier Composition and Method", publisert 23. november 1995. Eksempler på subenheter angis her som K-viklinger og refererer til positivt ladede subenheter hvis ladning er tilveiebrakt hovedsakelig av lysin rester, og E-viklinger som refererer til negativt ladede subenheter hvis ladning tilveiebringes overveiende av glutaminsyre rester. Foretrukne eksempler fra den ovenfor nevnte søknad inkluderer SEQ ID NO: 1-2. Heterodimer-subenhet peptider som er konstruert i henhold til retningslinjene som presenteres i den ovenfor angitte søknad viser typisk en preferanse for sammensetning i en parallell orientering i forhold til en antiparallell orientering. For eksempel danner eksempel peptidene identifisert som SEQ ID NO: 3 og SEQ ID NO: 4 parallell-konfigurasjons heterodimerer på samme måte som andre peptid sekvenser (som diskutert i WO 95/31480). Et ytterligere eksempel på peptid inkluderer et K-viklingspeptid bestående av 7-aminosyre, for eksempel SEQ ID NO: 5, repetisjoner. I et tilfelle er K-viklinger 35 aminosyrer lang, er positivt ladet, uten spesifikk struktur i oppløsning. E-viklingen kan være et peptid bestående av 7-aminosyre, for eksempel SEQ ID NO: 6 repetisjoner. E-viklingen kan være 35 aminosyrer lang, negativt ladet og ha ingen spesifikk struktur i oppløsning.
Som angitt inneholder ett av de to subenhet peptider i heterodimeren en målsøkende del og det andre peptid inneholder et aktivt middel. I begge tilfelle kan peptidet syntetiseres eller derivatiseres etter syntese for å gi den krevde festingsfunksjon. Et eksempel på en metode for peptidsyntese er beskrevet i eksempel 1. Generelt disrupterer de fleste konjugeringsmetoder ikke den viklingsdannende aktivitet for noen av de viklingsdannende peptider og heller ikke disrupterer slike konjugasjoner aktiviteten for det konjugerte, aktive middel eller målsøkende del.
Tatt i betraktning modifikasjonen av det første viklingsdannende peptid kan peptidet syntetiseres ved enten N- eller C-terminus for å bære ytterligere terminalpeptider som kan virke som spacer mellom den målsøkende del og den helikal dannende del av peptidet. Det målsøkende-viklingsdannende peptid og/eller det aktive middel-viklingsdannende peptid kan syntetiseres som angitt ovenfor ved enten fast tilstand-, PCR-eller rekombinante metoder, in vivo eller in vitro.
Ved å danne konjugatet via fast tilstands metoder blir det aktive middel eller den målsøkende del fortrinns kovalent festet til den N-terminale aminosyre rest eller til en av restene som vender mot den eksponerte flate av heterodimeren. Foretrukne koblingsgrupper er tiol gruppene i cystein restene som lett modifiseres ved standard metoder. Andre brukbare koblingsgrupper inkluderer tioestere hos metionin, imidazolyl gruppen hos histidin, guanidinyl gruppen hos arginin, den fenoliske gruppe hos tyrosin og indolyl gruppen hos tryptofan. Disse koblingsgrupper kan derivatiseres ved bruk av reaksjonstilstander som er velkjente for fagmannen.
For å binde det aktiv middel andre viklingsdannende peptid til det målsøkende del første viklingsdannende peptid blir de to peptider brakt i kontakt under betingelser som favoriserer heterodimer dannelse. Et eksempel på medium som favoriserer viklet viklingsheterodimer dannelse er en fysiologisk kompatibel vandig oppløsning som karakteristisk har en pH verdi mellom rundt 6 og rundt 8 og en saltkonsentrasjon mellom rundt 50 mM og rundt 500 mM. Fortrinnsvis ligger saltkonsentrasjonen mellom rundt 100 mM og rundt 200 mM. Et eksempel på medium har følgende sammensetning: 50 mM kalium fosfat, 100 mM KC1, pH 7. Like effektive media kan fremstilles ved for eksempel å benytte natrium fosfat i stedet for kalium fosfat og/eller natrium klorid i stedet for kalium klorid. Heterodimerer kan dannes under betingelser utenfor det ovenfor angitte pH- og saltområde men noen av de molekylære interaksjoner og den relative stabilitet for heterodimerene versus homodimerene kan skille seg fra karakteristika som er detaljert ovenfor. For eksempel kan de ioniske interaksjoner mellom ioniske grupper som tenderer til å stabilisere heterodimerer brytes ned ved lave eller høye pH verdier på grunn av protonering av for eksempel Glu sidekjeder ved sur pH verdi eller deprotonering av for eksempel Lys sidekjeder ved basisk pH verdi. Slike effekter for lave og høye pH verdier på viklede viklingsheterodimer dannelse kan imidlertid overvinnes ved å øke saltkonsentrasj onen.
En økning av saltkonsentrasjonen kan nøytralisere den stabiliserende ioniske tiltrekning eller undertrykke den destabiliserende ioniske repulsjon. Visse salter har større effektivitet med henblikk på nøytralisering av ioniske interaksjoner. Når det for eksempel gjelder K-viklingspeptidet er en IM eller høyere konsentrasjon av CIO<4>"anioner nødvendig for å indusere maksimal a-helikal struktur mens en 3M eller større konsentrasjon av Cl"er krevd for den samme effekt. Effektene av høyt salt innhold på viklede viklingsdannelser ved lav og høy pH verdi viser også at interhelikale ioniske attraksjoner ikke er vesentlige for heliksdannelse men heller kontrollerer hvorvidt en viklet vikling tenderer til å dannes som en heterodimer versus en homodimer. Det første viklingsdannende peptid, for eksempel et E-viklingspeptid og det andre viklingsdannende peptid, for eksempel et K-viklingspeptid, kan også konjugeres til målsøkende deler og aktive midler som beskrevet i eksempel 2 i søkers US SN 09/654,191 (Attorney Docket#: 4800-0015.31). Det skal også henvises til US 6,300,141.
Aktiv middel - viklingsdannende peptid kan ha en kort serum halveringstid og skilles ut via renal veien. Således vil det aktive middel enten komme frem til målsetet eller hurtig fjernes fra individet. Biofordelingen av aktivt middel letter beskyttelsen av normalvev hos resipienten fra uønsket eksponering. For å øke renal ekskresjon kan det benyttes konjugering til et renal ekskresjonsfremmende biofordelingsstyrende molekyl. Et alternativ til det eventuelle klaringstrinn er å tillate et tilstrekkelig forløp av tid som tillater at individets native klaringsmekanisme i det vesentlige fjerner det sirkulerende første konjugat.
Alternativt kan antistoff baserte eller ikke antistoff baserte målsøkende deler benyttes for å levere en ligand eller en antiligand til et målsete som bærer et ikke regulert antigen. Fortrinnsvis benyttes det for dette formål et naturlig bindingsmiddel for et slikt ikke regulert antigen. For eksempel karakteriseres sykdommer som hepatoma eller myeloma generelt ved ikke regulerte IL-6 reseptorer for hvilke IL-6 virker som en autokrin eller parakrin del med henblikk på hurtig proliferering av disse målcelle typer. For behandling av slike tilstander kan derfor IL-6 benyttes som målsøkende del, se for eksempel C. Miki et al. (2002) i Cancer 94(5): 1584-92.
For eksempel kan IL-6 og et første viklingsdannende peptid konjugeres via kjemiske midler eller dannes som et rekombinant molekyl. Det IL-6 første viklingsdannende peptid-konjugat administreres til en resipient og IL-6 komponenten av konjugatet styrer lokaliseringen av konjugatet til IL-6 reseptorer. Denne lokalisering vil inntre preferensielt til seter som bærer ikke regulerte IL-6 reseptorer. Etter at målsete lokalisering inntrer administreres eventuelt et klaringsmiddel som beskrevet ovenfor for i det vesentlige å befri resipientenes sirkulering for IL-6 første viklingsdannende peptid konjugat. Egnede klaringsmidler for dette formål er for eksempel IL-6 reseptor-HSA-galaktose eller anti-IL-6-antistoff-HSA-galaktose. Etter et tidsrom tilstrekkelig for i det vesentlige 50%, 70% eller fortrinnsvis 90% klaring av IL-6 fra mottakerens sirkulasjon administreres aktivt middel - andre viklingsdannende peptid, for eksempel urease andre viklingsdannende peptid, og dette lokaliseres til målsete via IL-6 første viklingsdannende peptid konjugat.
Som beskrevet i større detalj i del VU nedenfor kan ekspresjonsvektorer som er avledet fra retroviruser, adenoviruser, herpes eller vaksinevirus, eller fra forskjellige bakterielle plasmider, benyttes for avlevering av rekombinante urease molekyler til den innsiktede celle populasjon. Metoder som er velkjente for fagmannen kan benyttes for å konstruere rekombinante vektorer inneholdende urease, se for eksempel de teknikker som er beskrevet av Sambrook et al og av Ausubel et al. Alternativt kan aktive midler avleveres til målceller ved bruk av liposomer eller nanokapsler som beskrevet i del U ovenfor.
C. Klaringsmidler
Som diskutert ovenfor kan et klaringsmiddel administreres til et individ. Klaringsmiddelet er i stand til å styre sirkulerende første konjugat til hepatocytt reseptorer for derved å redusere mengden av sirkulerende første konjugat før administrering av det andre konjugat.
Som angitt ovenfor kan klaringsmidler av protein- eller ikke protein sammensetning med fysiske egenskaper som letter bruk for in vivo kompleksdannelse og blodklaring av ikke bundne målsøkende delkonjugater, være brukbare når tumorceller inneholdes i et individ, for eksempel et menneske. Klaringsmidler viser fortrinnsvis ett eller flere av de følgende karakteristika: hurtig, effektiv kompleksdannelse med målsøkende del in vivo; hurtig klaring fra blodet for målsøkende delkonjugat i stand til binding av et etterfølgende administrert aktivt middel; evne til klaring eller inaktivering av store mengder målsøkende delkonjugater; og lav immunogenisitet.
Brukbare klaringsmidler inkluderer heksose baserte og ikke heksose baserte deler. Heksose baserte klaringsmidler er molekyler som er derivatisert til å inkorporere en eller flere heksoser (seks karbonsukker deler) som gjenkjennes av Ashwell reseptorer eller andre reseptorer som mannose/N-acetylglukosamin reseptorer som er assosiert med endotelial celler og/eller Kupffer celler i leveren eller mannose 6-fosfat reseptoren. Eksempler på heksoser inkluderer galaktose, mannose, mannose 6-fosfat, N-acetylglukosamin og lignende. Andre deler som gjenkjennes av Ashwell reseptorer inkludert glukose, N-galaktosamin, N-acetylgalaktosamin, tioglykosider av galaktose og, generelt, D-galaktosider og glukosider, kan også benyttes. Galaktose tioglykosid konjugering til et protein kan oppnås for eksempel som beskrevet av Lee et al. (1976) i Biochemistry, 15(18):3956 eller Drantz et al. (1976) i Biochemistry, 15(18):3963.
Protein type galaktose baserte klaringsmidler inkluderer proteiner som har endogene eksponerte galaktose rester eller som er derivatisert til å eksponere eller inkorporere slike galaktose rester. Eksponerte galaktose rester styrer klaringsmiddel for hurtig klaring ved endocytose til leveren via spesifikke reseptorer (Ashwell reseptorer). Disse reseptorer binder klaringsmiddel og induserer endocytose i hepatocytten og fører til fraksjon med et lysosom og resirkulerer reseptoren tilbake til celle overflaten. Klaringsmekanismen karakteriseres ved høy effektivitet, høy kapasitet og hurtig kinetikk.
Et eksempel på klaringsmiddel av den protein baserte/galaktose bærende varietet er asialoorosomukoid derivatet av human a-1 syre glykoprotein. Den hurtige klaring fra blod av asialoorosomukoidet er beskrevet av Galli et al., iJofNuclMedAlliedSci (1988) 32(2): 110-16. Behandling av orosomukoid med neuraminidase fjerner sialsyre restene og eksponerer derved galaktose restene. Ytterligere derivatiserte klaringsmidler inkluderer for eksempel galaktosylalert albumin, galaktosylalert-IgM, galaktosylalert-IgG, asialohaptoglobin, asialofetuin og asialoceruloplasmin.
Ytterligere klaringsmidler er beskrevet i US 6,358,490, av 19. mars 2002; US 6,172,045, av 9. januar 2001; og US 5,886,143, av 23. mars 1999.
En ytterligere klasse klaringsmidler som er brukbare inkluderer små molekyler som ligger for eksempel fra rundt 500 til rundt 10,000 Dalton. De små molekyler kan være derivatisert med galaktose. Små molekyl klaringsmidlene er fortrinnsvis i stand til (1) hurtig og effektiv kompleksdannelse med det relevante konjugat, viklingsdannende peptid, aktiv middel og/eller målsøkende del; og (2) klaring av slike komplekser fra blodet via galaktose reseptoren, et spesifikt lever nedbrytningssystem, i motsetning til aggregering i komplekser som for eksempel tas opp i lunge og milt. I tillegg tillater den hurtige kinetikk ved galaktosemediert lever opptak koblet med affiniteten for ligand-anti-ligand interaksjon bruken av midlere eller sågar lavmolekylvekts bærere.
Proteintype- og polymertype ikke-galaktosebaserte klaringsmidler kan benyttes. Disse klaringsmidler kan virke via en aggregeringsmediert mekanisme. Det benyttede klaringsmiddel kan velges basert på målorganet til hvilket av gangen for klaringsmidler skal ekskluderes. For eksempel kan høy molekylvekt, for eksempel i området rundt 200,000 til rundt 1,000,000 Dalton, være nyttig når tumorcelle målet er involvert.
En annen klasse klaringsmidler inkluderer midler som ikke fjerner sirkulerende aktiv bestanddel/målsøkende del konjugater men i stedet inaktiverer de sirkulerende konjugater ved å blokkere de relevante seter på det aktive middel, målsøkingsdelen, liposomer, den virale vektor og/eller en hvilken som helst del derav. Disse "lokk-type" klaringsmidler er fortrinnsvis små, for eksempel 500 til 10,000 Dalton, høyt ladede molekyler, for eksempel derivatisert 6,6'-[(3,3'-dimetyl[l,r-bifenyl]-4,4'-diyl)bis(azo)bis[4-amino-5-hydroksy-l,3-naftalen disulfonsyre]tetranatriumsalt.
E. Dosering/ administrering
For anvendelsen kan det benyttes et hvilket som helst effektivt administreringsregime som regulerer timing og sekvens for dosene. Eksempler på dosenivåer for et human individ vil avhenge av administreringsmåte, grad (størrelse og fordeling) av tumoren, pasientstørrelse og cancerens responsilitet på urease behandling.
Der et urease preparat injiseres direkte i en tumor er eksempel på en dose 0.1 til 1,000 internasjonale enheter urease aktivitet per mm<3>tumor. For eksempel og under den antagelse at det oppnås en enhetlig fordeling av ureasen i tumoren, kan en dose mellom 0.5 og 5 internasjonale enheter være egnet. Plasseringen av injeksjonsnålen kan foretas under rettledning av konvensjonelle billedopptaks teknikker som fluoroskopi slik at legen kan se posisjonen for nålen i forhold til målvevet. Slike føringsverktøy kan inkludere ultralyd, fluoroskopi, CT eller MRI.
Effektiviteten eller fordelingen av den administrerte urease dose kan overvåkes, under eller etter direkte injeksjon av urease inn i tumoren, ved å overvåke tumor vevet ved hjelp av et verktøy som er i stand til å detektere endringer i pH verdien i det cancerøse vev området av individet. Slike verktøy kan inkludere en pH probe som kan innføres direkte i tumoren, eller et visualiseringsverktøy som magnetisk resonans billedopptak (MRI), datastyrt tomografi (CT) eller fluoroskopi. MRI undersøkelse kan gjennomføres i fravær av ytterligere billedopptaks midler, basert ganske enkelt på forskjellene i magnetiske egenskap for vev som en funksjon av pH verdien. CT eller fluoroskopiske billedopptak kan kreve ytterligere pH sensitive billedopptaks midler hvis opasitet påvirkes av pH verdien i vevmediet. Slike midler er velkjente for fagmannen på området.
Før enhver urease injeksjon kan tumor vevet visualisere ved sin lavere pH verdi i forhold til omgivende normalvev. Således kan normalvev ha en normal pH verdi på rundt 7.2 mens tumor vevet kan ligge 0.1 til 0.4 eller flere pH enheter lavere. Det vil si at før urease injiseres kan utstrekningen av tumor vev defineres ved den lavere pH verdi. Etter urease administrering vil pH verdien for tumor området med urease begynne å stige og kan identifiseres ved sammenligning av de resulterende bilder ved de tidligere predoseringsbilder.
Ved å undersøke vevet på denne måte kan graden av endring i pH verdi og graden av vev som påvirkes, overvåkes. Basert på denne undersøkelse kan legen administrere ytterligere preparat til sete og/eller kan administrere preparat til ytterligere områder innen tumorsete. Denne prosedyre kan gjentas inntil det er oppnådd en ønsket grad av pH endringer, for eksempel 0.2 til 0.4 pH enheter, over hele området for en fast tumor.
Dosering ved direkte injeksjon kan gjentas i egnede intervaller, for eksempel hver uke eller to ganger per uke inntil et ønsket sluttpunkt, fortrinnsvis inntil det observeres en fortrinnsvis i det vesentlige eller fullstendig regresjon av tumormassen. Behandlingseffektiviteten kan overvåkes som ovenfor ved visualisering av endringer i pH verdien for det behandlede vev under forløpet av behandlingen. Før hver ytterligere injeksjon kan således pH verdien for vevet visualiseres for å bestemme den gjeldende eksisterende utstrekning av tumoren, hvoretter forandringer i pH verdien for vevet kan benyttes for å overvåke administreringen av nye doser av urease preparat til vevet.
Der urease administreres parenteralt med en metode annen enn direkte injeksjon er en eksempeldose av urease 100-100,000 internasjonale enheter/kg urease aktivitet/kg individ kroppsvekt. Som angitt her inkluderer urease preparatet ved denne metode fortrinnsvis et målsøkende middel for å styre ureasen mot cancercellene, det vil si sete for en fast tumor, eller for sekvestering av urease, for eksempel i liposomal form, selektivt ved tumorsete.
Som ovenfor kan billedteknikker som er sensitive ovenfor endringer i vev pH verdi benyttes for å overvåke effektiviteten ved den administrerte dose. Fordi slik målsøking kan ta flere timer eller mer kan metoden
involvere overvåking av tumor pH verdi som ovenfor før urease injeksjon og flere timer, for eksempel 12-24 timer etter dosering, for å bekrefte at tumorsete er dosert riktig, påvist ved en stigning av pH verdien i tumor området. Avhengig av resultatene ved denne interrogering kan metoden diktere ytterligere dosering inntil en ønsket stigning i pH verdien, for eksempel 0.2-0.4 pH enheter, er observert. Når først denne dose er fastlagt kan pasienten behandles med en tilsvarende dose av urease preparatet på regulær basis, for eksempel en eller to ganger per uke, inntil en endring i tumorstørrelse eller tilstand er oppnådd.
Ved begge typer administrering vil det endelige doseregimet bestemmes av legen under hensyntagen til god medisinsk praksis, betrakning av forskjellig faktorer som modifiserer virkningen av medikamenter, for eksempel middelets spesifikke aktivitet, alvoret av sykdomstilstanden, pasientens responsivitet, alder, tilstand, kroppsvekt, kjønn og pasientens diett, alvoret av tilstedeværende infeksjoner og lignende. Ytterligere faktorer som kan tas i betraktning inkluderer tid og frekvens for administrering, medikamentkombinasjon(er), reaksjonssensitiviteter og toleranse/respons på terapien. Ytterligere tilpasning av doseringen som er egnet for behandling involverer en hvilken som helst av de formuleringer som her er nevnt gjennomført rutinemessig av fagmannen, særlig i lys av doseringsinformasjoner og analyser som beskrevet, så vel som de farmakokinetisk data som observeres i kliniske prøver. Egnede doseringer kan sikres via bruk av statistiske analyser for å bestemme konsentrasjonen av middelet i et kroppsfluid eller en annen prøve sammen med doseresponsdata.
Doseringsfrekvensen vil avhenge av de farmakokinetiske parametere for middelet og administreringsveien. Dosering og administrering justeres for å gi tilstrekkelige nivåer av det aktive middel eller for å opprettholde den ønskede effekt. I henhold til dette kan farmasøytiske preparater administreres i en enkelt dose, flere atskilte doser, ved kontinuerlig infusjon, ved depoter med opprettholdt frigivning, eller kombinasjoner av disse, som krevd for å opprettholde et ønsket minimumsnivå av middelet.
Kortvirkende, farmasøytiske preparater (for eksempel kort halveringstid) kan administreres en gang per dag eller mer enn en gang per dag (for eksempel to, tre eller fire ganger per dag). Lengevirkende, farmasøytiske preparater kan administreres hver tredje til fjerde dag, hver uke eller en gang hver annen uke. Pumper som subkutane, intraperitoneale eller subdurale pumper, kan være foretrukket for kontinuerlig infusjon.
Preparater omfattende et aktivt middel, formulert som beskrevet i del II ovenfor, i en farmasøytisk akseptabel bærer, kan fremstilles, anbringes i en egnet beholder og merkes for behandling av en indikert tilstand. Tilstander som er indikert på merkelappen kan inkludere men er ikke begrenset til behandling og diagnose av forskjellige cancertyper. Sett som beskrevet nedenfor er også omfattet der settet omfatter en doseringsform av et farmasøytisk preparat og et pakningsinnlegg inneholdende instruksjoner for bruk av preparatet ved behandling av en medisinsk tilstand.
Generelt blir de aktive midler som benyttes administrert til et individ i en effektiv mengde. Generelt er en effektiv mengde en mengde som er effektiv til enten (1) å redusere symptomene på sykdommen som ønskes behandlet; eller (2) å indusere en farmakologisk forandring som er relevant for behandling av sykdommen som ønskes behandlet. For cancer kan en effektiv mengde inkludere en mengde som er effektivt for: å redusere størrelsen av en tumor; sinke veksten av tumoren; forhindre eller inhibere metastaser; eller øke livsforventningene for det angjeldende individ. Et eksempel på en metode for administrering av den aktive bestanddel til mus er beskrevet i eksempel 6 nedenfor.
Aktive midler, klaringsmidler og/eller billedgivende midler kan administreres i enkelt- eller multipell doser. Alternativt kan midlene infuseres intravenøst over et utstrakt tidsrom. For eksempel kan et klaringsmiddel administreres intravenøst i et tidsrom tilstrekkelig til å fjerne målsøkingsdelen på kontinuerlig måte.
I de multi målsøkende administreringsformer som beskrevet ovenfor kan dosene av hver administrerte komponent bestemmes av den angjeldende lege i henhold til hans eller hennes erfaring; spesielle trekk ved mottakers tilstand, for eksempel art og lokalisering av målsete inkludert antigenene som er assosiert dermed og som vil påvirke måldel seleksjon og administreringsvei; og kombinasjonen av målsøkende del som skal benyttes, for eksempel kan antistoff ytelsene variere med henblikk på antigen densitet og affinitet hos antistoffet for antigenet.
IV. Metode for potensiering av et anticancer medikament
Som angitt ovenfor er en av begrensningene i dagens kjemoterapi at måltumoren blir i økende grad resistent mot innvirkningene av antitumor forbindelse. Denne resistens kan skyldes redusert opptak av forbindelsen i tumorceller, redusert tilgjengelighet for medikament på opptakssete, eller øket intracellulær metabolisme.
For et antall svakt basiske medikamenter, det vil si medikamenter som har ett eller flere protoniserbare aminer, kan mekanismen for medikamentopptak involvere passiv diffusjon gjennom cellemembraner i ikke ladet form. I henhold til dette vil graden av bevegelse av forbindelsen over cellemembran avhenge av innside/utside pH gradient. Hvis den ekstracellulære pH verdi er lik eller større enn den intracellulære pH verdi, for eksempel rundt pH 7.2, vil forbindelsen tendere til å passere inn i cellene i ikke ladet form i det minste like hyppig som den trer ut av cellen. Når omvendt den ekstracellulære pH verdi faller i forhold til den intracellulære pH verdi, slik tilfellet er i faste tumorer, vil den lavere utvendige pH verdi favorisere den ladede, protoniserte form av forbindelsen, og dette vil inhibere opptak av medikament i cellen. Som effekt er en av effektene av den lavere, ekstracellulære pH verdi i tumorer å beskytte tumoren mot svakt basiske antitumor forbindelser.
Svakt basiske antitumor forbindelser hvis aktivitet ugunstig kan påvirkes av en lavere, ekstracellulær pH verdi inkluderer doksorubicin, daunorubicin, mitoksantron, epirubicin, mitomycin, bleomycin, vinka alkaloider som vinblastin og vinkristin, alkyleringsmidler som cyklofosfamid og mekloretamin hydroklorid, og antineoplastiske purin- og pyrimidin derivater.
Urease eller urease holdige preparater kan bli administrert til en fast tumor i en mengde som er effektiv til å heve den ekstracellulære pH verdi i tumorfluidet med minst 0.1 pH enhet, for eksempel 0.1 til 0.5 pH enheter eller mer. I visse tilfeller heves den ekstracellulære pH verdi i fluidet til minst pH 7.0, 7.2 eller høyere.
Ureasen kan administreres som beskrevet i del in ovenfor, for eksempel direkte til individets tumor eller parenteralt på annen måte enn ved direkte injeksjon. Som videre beskrevet ovenfor kan forandringen i pH verdi som oppnås ved administreringen av urease overvåkes ved å bestemme forandringer i pH verdien i tumor vev og graden av disse forandringer, ved bruk av billed verktøy for visualisering av tumor pH verdi eller ved direkte pH målinger av tumoren.
Den dose som administreres ved denne metode kan være mindre enn den som er nødvendig der urease er det eneste antitumor middel, så lengde mengden som injiseres er tilstrekkelig til å gi den ønskede økning i tumor pH verdi. Alternativt kan metoden involvere administrering av en terapeutisk mengde av urease og en terapeutisk eller subterapeutisk mengde av anticancer forbindelsen. Som det vil erkjennes kan metoden tillate en lavere enn normal dose av antitumor forbindelsen, både fordi urease øker den terapeutiske effekt av forbindelsen og fordi urease per se bidrar til den terapeutiske effekt. Resultatet kan være større effektivitet med færre bivirkninger.
En kjemisk enhet som beskrevet ovenfor kan også assosieres med det aktive middel for å forbedre avlevering av aktivt middel. I denne eksempelet kan det aktive middel administreres på en hvilken som helst måte, for eksempel parenteralt, annet enn direkte injeksjon.
V. Metode for overvåking av anticancer behandling
Det er også mulig med en metode for å overvåke anticancer behandling ved å bedømme nærværet, størrelsen eller tilstanden av en fast tumor hos et individ. Metoden inkluderer administrering av et aktivt middel som beskrevet ovenfor, for eksempel urease, til et individ som har, eller mistenkes for å ha, en fast tumor. Det aktive middel administreres under betingelser som er effektive for å lokalisere det aktive middel i den faste tumor hos individet.
Individet undersøkes med et diagnostisk verktøy som er i stand til å detektere forandringer i ekstracellulær pH verdi i et individs vev som beskrevet ovenfor. Det diagnostiske verktøy er fortrinnsvis et pH sensitivt, diagnostisk verktøy som en billedgivende, kontrast- eller shift reagens som beskrevet i del II ovenfor, i stand til lokalisering i tumoren som kan administreres før, etter eller samtidig med det aktive middel. Et vev område identifiseres i individet som viser en forhøyelse i ekstracellulær pH verdi etter administrering. Et hvilket som helst verktøy som er i stand til identifisering av det diagnostiske middel kan benyttes for å detektere middelet, for eksempel MRI, PET scan og lignende, som beskrevet ovenfor.
Metoden kan inkludere administrering av urease til individet benyttet i en antitumor terapi, og identifiseringen benyttes for å detektere lokaliseringen av urease i en fast tumor.
Identifiseringen kan benyttes for å overvåke forandringer i størrelse og form av tumoren som respons på urease administrering.
Ved anvendelse av PET scan administreres individet 13N-merket ammoniakk. Pasienten administreres så urease i en mengde som er effektiv til å nå tumorsete. Ureasen hydrolyserer urea og gir ikke-merket ammoniakk. Med tid fortynnes merket ammoniakk eller fortrenges og forårsakes en gradvis klaring av den benyttede scanering.
I en annen anvendelse som benytter PET scan blir individet gitt 13N-merket urea. Pasienten gis så urease i en mengde effektiv til å nå tumorsete. Ureasen hydrolyserer den merkede urea og gir merket ammoniakk som kan detekteres på den benyttede scan.
VI. Kite
Det er mulig å tilveiebringe kite for inhibering av veksten av tumorceller ved bruk av metoder som beskrevet her. Disse kite inkluderer en beholder inneholdende et eller flere aktive midler. Disse kits kan i tillegg inkludere en hvilken som helst av de andre komponenter som her er beskrevet for gjennomføring av metodene i følge beskrivelsen. Slike komponenter inkluderer, men er ikke begrenset til farmasøytiske komponenter, målsøkende deler, billedgivende midler, klaringsmidler, genterapi komponenter og lignende.
Disse kits kan eventuelt inkludere instruksjonsmateriale inneholdende retningslinjer (for eksempel protokoller) som beskriver bruken av aktive midler for inhibering av tumor cellevekst. Et slikt kit kan inneholde et farmasøytisk preparat inneholdende et aktivt middel, fortrinnsvis et urease enzym, og instruksjonsmateriale som beskriver administrering av preparatet til et individ for behandling av cancer hos individet. Instruksjonsmaterialet kan beskrive administrering av urease preparat til et individ i en mengde som er avhengig av tumorens størrelse og ligger mellom 0.1 til 100 internasjonale enheter urease aktivitet per mm3 tumor, når preparatet administreres ved direkte injeksjon i tumoren, og i en mengde mellom 100-100,000 internasjonale enheter/kg internasjonale enheter urease aktivitet/kg individ kroppsvekt når preparatet administreres parenteralt til individet på en måte forskjellig fra direkte injeksjon i tumoren.
Eventuelt kan instruksjonsmaterialet beskrive administrering av urease preparater til et individ som også mottar en svakt basisk antitumor forbindelse hvis effektivitet reduserer ved en høyere intracellulær/lavere ekstracellulær pH gradient i en fast tumor, i en urease mengde som er effektiv til å redusere eller reversere den høyere intracellulære/lavere ekstracellulære pH gradient i en fast tumor.
Alternativt beskriver instruksjonsmaterialet administreringen av urease preparater til et individ som har eller mistenkes for å ha en fast tumor, under betingelser som er effektive for å lokalisere urease i en fast tumor i individet, og undersøke individet med et diagnostisk verktøy som er i stand til å detektere forandringer i ekstracellulær pH verdi i et individs vev, og å identifisere et vevområde hos individet som viser en økning i ekstracellulær pH verdi etter administreringen.
Mens instruksjonsmaterialet karakteristisk omfatter skrevet eller trykket materiale er det ikke begrenset til dette. Et hvilket som helst medium som er i stand til lagring av slike instruksjoner og å kommunisere dem til en sluttbruker kan anvendes. Slike medier inkluderer men er ikke begrenset til elektroniske lagringsmedier (for eksempel disketter, tape, bånd, chips og lignende), optiske medier (for eksempel CD ROM), og lignende. Slike medier kan inkludere internett adresser som gir slik instruksjonsmateriale.
VU. Gen-/ celle terapi
Et genterapi preparat kan være for bruk ved inhibering av vekst av cancerceller hos et pattedyr. Genterapi preparatet inkluderer en målsøkende vektor som, administrert til individet, er effektivt for selektivt å transfektere cancerceller og, båret i vektoren, en rekombinant nukleinsyre sekvens som er effektiv med henblikk på å produsere et nukleinsyre molekyl, for eksempel mRNA, som koder det aktive middel, fortrinnsvis urease, i transfekterte cancerceller.
I ett eksempel bringes tumorcellene i kontakt med konstruerte, ikke tumorigene celler som uttrykker et heterologt nukleinsyre molekyl som koder det aktive middel. De ikke tumorigenisk konstruerte celler kan, uten begrensning, være fibroblaster, epitelialceller, endotelialceller, benceller, keratinocytter eller bestrålte, konstruerte ikke tumorogeniske celler avledet fra tumorer.
I et annet eksempel blir tumorcellene transfektert med et genkonstrukt som koder en celle innsiktende del og et heterologt nukelinsyre molekyl som koder urease proteiner og en sekretorisk ledersekvens. Genkonstruktet er i stand til å uttrykke den celle målsøkende del og det heterologe urease protein og den sekretoriske ledersekvens som et konjugat i tumorcellene og hvorved konjugatet styres av den sekretoriske ledersekvens til å forlate cellen deretter for selektiv lokalisering ved et celle overflate antigen som gjenkjennes av den cellesøkende del.
Den cellesøkende del kan være selektivt lokalisert til et celle overflate antigen og celle overflate antigenet er spesifikt for minst en fast human tumor. Genkonstruktet kan omfatte en transkripsjonen, regulatorisk sekvens omfattende en promoter og et kontrollelement som omfatter en genetisk bryter til kontrollekspresjon av genkonstruktet.
I ett eksempel er genkonstruktet pakket i en viral vektor. Det er tilgjengelig et antall virale vektorer for tumor målsøking. Parvoviruser er kjent for å infektere tumorceller selektivt. Alvernativt kan virusen konstrueres for å replikere selektivt i tumorceller i henhold til publiserte metoder, se for eksempel M. Puhlmann et al., Hum Gene Ther, (1999) 10 (4):649-57; P. Noguiez-Hellin et al., Proe Nati Acad Sei USA
(1996) 93(9):4175-80; og MJ Cooper, Semin Oncol (1996) 23(1) 172-87. For eksempel kan virusene endres til å inneholde en mutert tymidin kinase eller et polymerase gen som tillater virale replikering kun i hurtigdelene celler inneholdende disse enzymer. Alternativt kan virusen konstrueres genetisk til å inneholde tumor spesifikke kontrollelementer, for eksempel tumor spesifikk promoter områder, som er responsive og uttrykker det ønskede protein eller proteinet som er nødvendig for viral replikering kun i tumorceller. Fortrinnsvis er det genetiske konstrukt pakket i adenovirus.
A. Vektorer for kloning, gen overføring og ekspresjon
Ekspresjonsvektorer kan bli benyttet for å uttrykke urease polypeptid produktet som så kan renses. Eventuelt benyttes ekspresjonsvektorene i genterapi. Ekspresjonsvektorer kan inkludere egnede signaler for tilveiebringelse i vektoren, og forskjellige regulatoriske elementer som enhansere/promotere fra virale og/eller mammale kilder som driver ekspresjonen av genene av interesse i vertceller. Elementer konstruert for å optimalisere meddeler RNA stabilitet og translaterbarhet i vertceller, defineres også. Betingelsene for å benytte et antall dominante medikament seleksjonsmarkører for å etablere permanente, stabile cellekloner som uttrykker produktene, tilveiebringes også, på samme måte som et element som forbinder ekspresjonen av medikament seleksjonsmarkørene med ekspresjonen av polypeptidet.
B. Regulatoriske elementer
Uttrykket "ekspresjonskonstrukt" er ment å inkludere en hvilken som helst type genetisk konstrukt inneholdende en nukleinsyre som koder for et genprodukt hvori en del av eller hele den nukleinsyrekodene sekvens er i stand til å kunne transkriberes. Transkriptet kan translateres til et protein men må ikke nødvendigvis bli det. I visse eksempler inkluderer ekspresjonen både transkripsjon av et gen og translasjon av mRNA inn i et genprodukt. I andre eksempler inkluderer ekspresjonen kun transkripsjon av nukleinsyren som koder et gen av interesse.
I foretrukne eksempler er nukleinsyren som koder et genprodukt under transkripsjonen kontroll av en promoter. En "promoter" henviser til en DNA sekvens som gjenkjennes av det syntetiske maskineri i cellen, eller innført syntetisk maskineri, nødvendig for å initiere den spesifikke transkripsjon av et gen. Uttrykket "under transkripsjonen kontroll" betyr at promoteren er i den korrekte lokasjon og orientering i forhold til nukleinsyren for å kontrollere RNA polymerase initiering og ekspresjon av genet.
Uttrykket promoter benyttes her for å henvise til en gruppe av transkripsjonelle kontrollmoduler som er klustret rundt initieringssete for RNA polymerase II. Promoterene kan bestå av diskrete, funksjonelle moduler, hver bestående av rundt 7-20 bp DNA, og inneholder et eller flere gjenkjennelsesseter for transkripsjonen aktivator eller repressor proteiner. Minst en modul i hver promoter bevirker å posisjonere startsete for RNA syntese. Et eksempel på en modul er TATA boksen men i enkelte promotere som mangler en TATA boks, for eksempel promoteren for mammal terminal deoksynukleotidyl transferase genet og promoteren for sene SV40 gener, understøtter et diskret element som ligger over startsete per se en fiksering av initieringsplassen.
Den spesielle promoter som benyttes for å kontrollere ekspresjonen av en nukleinsyre sekvens av interesse antas ikke å være viktig så lenge den er i stand til å styre ekspresjonen av nukleinsyren i målcellen. Der således en human celler er innsiktet er det foretrukket å posisjonere det nukleinsyre kodene området nær og under kontroll av en promoter som er i stand til å kunne uttrykkes i en human celle. Generelt kan en slik promoter inkludere enten en human eller en viral promoter.
Den humane cytomegalovirus (CMV) umiddelbart tidlig gen promoter, den SV40 tidlige promoter, Rous sarkoma virus langterminal repetisjonen, rotte insulin promoteren og glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase kan benyttes for å oppnå høy nivå ekspresjon av den kodene sekvens av interesse.
Der det benyttes et cDNA innskudd kan man ønske å inkludere et polyadenyleringssignal for å bevirke riktig polyadenylering av gen transkriptet. Arten av polyadenyleringssignalet antas ikke å være vesentlig for vellykket gjennomføring av oppfinnelsen og en hvilken som helst slik sekvens kan benyttes som for eksempel human veksthormon og SV40 polyadenyleringssignaler. Videre omfattet som element av ekspresjonskassettene er en terminator. Disse elementer kan tjene til å forsterke meddeler nivåene og å minimalisere gjennomlesning fra kassetten til andre sekvenser.
C. Selekterbar markør
Cellene kan inneholde nukleinsyre konstrukter som identifiseres in vitro eller in vivo ved å inkludere en markør i ekspresjonskonstruktet. Slike markører gir cellen en identifiserbar forandring som tillater lett identifisering av celler inneholdende ekspresjonskonstruktet. Karakteristisk understøtter inklusjon av medikament seleksjonsmarkør kloning og seleksjon av transformanter, for eksempel er gener som gir resistens mot neomycin, puromycin, hygromycin, DHFR, GPT, zeocin og histidinol brukbare selekterbare markører. Alternativt kan det benyttes enzymer som herpes simplex virus tymidin kinase (tk) eller kloramfenikol acetyltransferase. Immunologiske markører kan også benyttes. Ytterligere eksempler på selekterbare markører er velkjente for fagmannen, se for eksempel R.P. Baumann et al. (2002) i Biotechniques 32(5): 1030-34.
D. Avlevering av ekspresjonsvektorer
Det finnes et antall måter på hvilke ekspresjonsvektorer kan innføres i celler. Ekspresjonskonstruktet kan omfatte en virus eller et konstruert konstrukt avledet fra et viralt genom som benyttes for å avlevere et urease preparat til en målcelle. Evnen hos visse viruser til å tre inn i celler via reseptormediert endocytose, og intregrere inn i vertcelle genomet og å uttrykke virale gener stabilt og effektivt, har gjort dem til attraktive kandidater for overføring av fremmed gener til pattedyr celler.
En av de foretrukne metoder for in vivo avlevering involverer bruken av en adenovirus ekspresjonsvektor. "Adenovirus ekspresjonsvektor" er ment å inkludere de konstrukter som inneholder adenovirus sekvenser tilstrekkelig til (a) å understøtte pakking av konstruktet, og (b) å uttrykke et polynukleotid som er klonet deri. I denne kontekst krever ekspresjonen ikke at genproduktet syntetiseres, se for eksempel B.G. Barnett et al. (2002) i "Targeted Adenovirus Vectors" Biochim Biophys Acta 1575(1-3): 1-14.
Ekspresjonsvektoren kan omfatte en genetisk konstruert form av adenovirus. Kjennskap til den genetiske organisering av adenovirus, et 36 kb lineær, dobbelttrådet DNA virus, tillater substitusjon av store deler av adenoviralt DNA med fremmedsekvenser opptil 7 kb. I motsetning til retroviruser resulterer den adenovirale infeksjon av vertceller ikke i kromosomal integrering fordi adenoviralt DNA kan replikkere på episomal måte uten potensiell genotoksisitet. Videre er adenoviruser strukturelt stabile og intet genom rearrangement er detektert etter ekstensiv forsterkning.
Adenovirus er spesielt egnet for bruk som gen overføringsvektor på grunn av dens middels store genom, lette manipulering, høye titer, brede målcelle område og høye infektivitet. Generering og propagering av adenovirus vektorer kan avhenge av en hjelpecellelinje. Hjelpecellelinjer kan avledes fra human celler som human embryoniske nyreceller, muskelceller, hematopoietiske celler eller andre human embryoniske mesenchymale eller epitelial celler. Alternativt kan hjelpecellene avledet fra celler fra andre mammal spesier som er permissive for human adenovirus. Slike celler inkluderer for eksempel Vero celler og andre embryoniske ape mesenchymale eller -epitelial celler. Et eksempel på hjelpecellelinjer er cellelinjen 293 som ble transformert fra human embryoniske nyreceller av Ad5 DNA fragmenter og som konstitutivt uttrykker El proteinene. Metoder for dyrking av 293 celler og propagering av adenovirus er beskrevet.
Vektorer avledet fra viruser som vaksinevirus (W. Walther og U. Stein (2000) Drugs 60(2):249-71), adeno-assosiert virus (N. Zhao et al. (2001) MolBiotechnol 19(3):229-37) og herpesvirus (E.A. Burton et al.
(2001) Adv Drug Deliv Rev 53(2):155-70) kan benyttes. Ytterligere tumor spesifikke, replikasjonsselektive viruser som kan benyttes finnes i en oversikt av L.K. Hawkins et al. (2002) i Lancet Oncol 3(1): 17-26.
Flere ikke virale metoder for overføring av ekspresjonskonstrukter til dyrkede mammal celler inkluderer kalsium fosfat presipitering, DEAE-dekstran, elektroporering, direkte mikroinjeksjon, DNA-ladede liposomer og lipofektamin-DNA komplekser, celle sonikering, gen bombardering ved bruk av høyhastighets mikroprosjektiler, og reseptormedierttransfeksjon.
Når først ekspresjonskonstruktet er avlevert til cellen kan nukleinsyren som koder genet av interesse, for eksempel urease genet, posisjoneres og uttrykkes ved forskjellige seter. Nukleinsyren som koder det aktive middel kan stabilt integreres i cellens genom. Denne integreringen kan skje i kognat lokasjon og orientering via homolog rekombinasjon (gen erstatning) eller kan integreres i vilkårlig, ikke-spesifikk lokasjon (gen forsterkning). Ytterligere kan nukleinsyren stabilt holdes i cellen som et separat, episomalt segment av DNA. Slike nukleinsyre segmenter eller "episomer" koder sekvenser tilstrekkelig til å tillate opprettholdelse og replikering uavhengig av eller i synkronisering med vertcelle syklusen. Metoden for avlevering av ekspresjonskonstruktet og lokasjonen i cellen der nukleinsyren forblir er avhengig av typen ekspresjonskonstrukt som benyttes.
Ekspresjonskonstrukt kan ganske enkelt bestå av nakent rekombinant DNA eller plasmider. Overføring av konstruktet kan gjennomføres ved en hvilken som helst av de metoder som er nevnt ovenfor og som fysisk eller kjemisk permeabiliserer cellemembranen. Dette gjelder spesielt overføring in vitro men kan også gjelde in vivo anvendelse.
Overføring av naken DNA ekspresjonskonstrukt til cellene kan involvere partikkel bombardering. Denne metode avhenger av evne til å aksellerere DNA belagte mikroprosjektiler til høy hastighet for å tillate at de
trenger gjennom cellemembraner og trer inn i celler uten å avlive dem. Diverse innretninger for å aksellerere små partikler er brukbare i denne forbindelse. En slik innretning er basert på en høyspenningsutladning for å generere en elektrisk strøm som i sin tur gir en bevegelseskraft. De benyttede mikroprosjektiler kan bestå av biologisk inerte stoffer som wolfram- eller gull kuler.
Slike ekspresjonskonstrukter kan være fanget i et liposom, et lipid kompleks, nanokapsel eller en annen formulering ved bruk av en eller flere av de metoder som er beskrevet i del II ovenfor. Videre omfattet er lipofektamin-DNA komplekser.
Liposomer kan komplekseres med en hemagglutinerende virus (HVJ). Alternativt kan liposomer kompleksere eller benyttes i forbindelse med nukleære ikke-histon kromosomale proteiner (HMG-1). Liposomet kan også komplekseres eller benyttes i forbindelser med både HVJ og HMG-1.
Andre ekspresjonskonstrukter som kan benyttes for å avlevere en nukleinsyre som koder et spesielt gen i celler er reseptormedierte avleveringsvehikler. Disse trekker fordelen av det selektive opptak av makromolekyler av reseptormediert endocytose i så å si alle eukaryotiske celler. På grunn av den celletype spesifikke fordeling av forskjellige reseptorer kan avleveringen være meget spesifikk.
Reseptormediert gen innsiktingsvehikler består generelt av to komponenter: en celle reseptor-spesifikk ligand og et DNA bindende middel. Diverse ligander har vært benyttet for reseptormediert gen overføring, for eksempel asialoorosomukoid og transferrin. I tillegg er epidermal vekstfaktor (EGF) også benyttet for å avlevere gener til squamøse karsinoma celler (EP 0360257).
Avleveringsvehikler kan alternativt omfatte en ligand og et liposom. Det er således tenkbart at en
nukleinsyre som koder et spesielt gen også spesifikt kan avleveres til en celletype som lunge-, epitelial- eller tumorceller, ved hjelp av et hvilket som helst antall av reseptor ligand system med eller uten liposomer. For eksempel kan EGF og andre små molekyler benyttes som reseptor for mediert avlevering av en nukleinsyre som koder et gen i mange tumorceller som viser oppregulering av EGF reseptor (J. Baseia (2002) J Clin Oncol 20(9):2217-9). Videre kan antistoffer mot CD5 (CLL), CD22 (lymfoma), CD25 (T-celle leukemi) og MAA (melanoma) tilsvarende benyttes som målsøkende deler.
Genoverføring kan eventuelt lettere gjennomføres under ex vivo betingelser. Ex vivo gen terapi henviser til isolering av celler fra et dyr, avlevering av en nukleinsyre til cellene irt vitro og så tilbakeføring av de modifiserte celler til dyret. Dette kan involvere den kirurgiske fjerning av vev/organer fra et dyr eller primærkultur av celler og vev, se for eksempel M. Ahonon et al. (2002) Mol Ther 5(6):705-15 og K. Kawai et al. (2000) Mol Uroi 4(2):43-6; US 6,395,712, 6,149,904 og 6,410,029.
Primære mammal cellekulturer kan separeres på forskjellige måter. For at cellene skal holdes levedyktige når de er in vitro og i kontakt med ekspresjonskonstruktet vil cellene karakteristisk bibeholde kontakt med det korrekte forhold mellom oksygen og karbondioksid og næringsstoffer, og beskyttes mot mikrobiell kontaminering. Cellekultur teknikker er velkjente for fagmannen.
Eksempler på brukbare mammal vertcellelinger er Vero- og HeLa celler og cellelinjer av Kinesisk hamster ovarie-, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, NIH3T3, RIN og MDCK celler. I tillegg kan en vertcellestamme velge som modulerer ekspresjonen av de innskutte sekvenser, eller modifiserer og prosesserer genproduktet på ønsket måte. Slike modifikasjoner (for eksempel glykosylering) og prosessering (for eksempel spalting) av proteinprodukter kan være viktig for proteinets funksjon. Forskjellige vertceller har karakteristika og spesifikke mekanismer for den posttranslasjonelle prosessering og modifisering av proteiner. Egnede cellelinjer eller vertsystemer kan velges for å sikre den korrekte modifikasjon og prosessering av det uttrykte fremmed protein.
Et antall seleksjonssystemer kan benyttes inkludert, men ikke begrenset til HSV tymidin kinase-, hypoksantin-guanin fosforibosyltransferase- og adenin fosforibosyltrasferase gener, i tk-, hgprt- eller aprt-celler. Videre kan antimetabolitt resistensen benyttes som basis for seleksjon for gpt som gir resistens mot mykofenolsyre; neo som gir resistens mot aminoglykosidet G418; og hygro som gir resistens mot hygromycin.
IV. Eksempler
A. Eksempel 1
Al. Peptid syntese
Peptider ble fremstilt ved fast fast syntese metodologi ved bruk av konvensjonell N-t-butyloksykarbonyl (t-Boc) kjemi. Peptider ble spaltet fra harpiksen ved omsetning med hydrogenfluorid (20 ml/g harpiks) inneholdende 10% anisol og 2% 1,2-etanditiol i 1.5 timer ved 4°C. Urene peptider ble vakset med kald eter og ekstrahert fra hapriksen med iseddik og frysetørket. Syntetisk peptid ble renset med reversfase HPLC på en Zorbax semi-preparativ C-8 kolonne (250 x 10 mm I.D., 6.5-um partikkelstørrelse, 300-Å porestørrelse) med en lineær AB gradient fra 0.2 til 1.0% B/min) med en strømningshastighet på 2 ml/min der oppløsningsmiddel A er vandig 0.05% trifluoreddiksyre (TFA) og oppløsningsmiddel B er 0.05% TFA i acetonitril. Homogeniteten for de rensede peptider ble verifisert ved analytisk reversfase HPLC, aminosyre analyse og MALDI masse spektrometri.
A2. Affinitetsrensing av urease
Affinitetskolonnen ble preparert ved omsetning av hydroksyurea til epoksy-aktivert Sefarose 6B (Amersham Biosciences). Gjenværende aktive grupper ble blokkert ved bruk av IM etanolamin.
Rensingen ble gjennomført som følger. Kolonnen ble ekvilibrert med PEB (0.02M fosfat, 1 mM EDTA, 1 mM 6-merkaptoetanol, pH 7.0). En uren urease prøve (fig. 2) ble brakt på (0.5 mg/ml i PEB, til sammen 8 ml). Kolonnen ble vasket med 15 ml PB (0.02M fosfat, 1 mM 13-merkaptoetanol, pH 7.0). Kolonnen ble så vasket med 8 ml hver av de følgende: PB + 0.1M NaCl, PB + 0.5M NaCl, og PB + 0.95M NaCl. Ureasen ble eluert med 8 ml EB (0.2M fosfat, 1 mM 6-merkaptoetanol, pH 4.6), samlet i 1 ml fraksjoner. Disse ble undersøkt ved å avlese OD ved 280 nm (fig. 3) og HPLC (C5 kolonne) analyse. Kolonnen ble lagret i 0.01% NaN3.
B. Eksempel 2 - Fremstilling av urease viklingskonjugat
Urease viklingskonjugat ble preparert ved oppløsning av 10 mg av Jack bønne urease i 300 ul 2 mM fosfat buffer pH 7.2. Deretter ble 5 mg av den bifunksjonelle fornettet sulfo-MBS satt til oppløsningen og blandingen så langsomt omrørt i 1 time ved romtemperatur. Blandingen ble så dialysert mot 2 mM fosfat buffer ved pH 7.2 for å fjerne overskytende linker.
K-vikling og E-vikling med en C-terminal cys linker (1.5 mg) ble satt til den linker modifiserte urease oppløsning og langsomt blandet i 3 timer ved romtemperatur. Viklings urease konjugatet ble dialysert mot frisk 2 mM fosfat buffer ved pH 7.2 over natten for å fjerne ikke konjugert viklingspeptid. Dialysert urease konjugat ble lyofilisert og så oppløst i 1 mL 2 mM fosfat buffer pH 7.2 og brakt på en sefadex G75 kolonne for ytterligere rensing. Tomvolum fraksjonene som inneholdt viklings urease konjugat ble slått sammen, frysetørket og lagret ved 4°C.
Renheten for konjugatet og forholdet mellom vikling og urease i preparatet ble bestemt ved aminosyre analyse og MALDI masse spektrometri ved bruk av standard prosedyrer.
C. Eksempel 3 - Aktivitetsanalyse for urease og urease konjugat
Den enzymatiske aktivitet for urease eller urease konjugat ble gjennomført i en koblet enzym reaksjon med glutamat dehydrogenase (GLDH). Mengden NADH som var oksidert ble bestemt ved å måle forandringen i absorbans ved 340 nm (H. Kaltwasser og H.G. Schlegel, i Anal. Biochem., 16, 132, 1966). De benyttede reagenser var: 0.1 OM kalium fosfat buffer, pH 7.6; 1.80M urea preparert i fosfat buffer; 0.025M adenosin-5'-difosfat (ADP) (10.7 mg/ml) i buffer; 0.008M NADH (5 mg/ml) i fosfat buffer; 0.025M cc-ketoglutarat (3.7 mg/ml) i fosfat buffer; glutamat dehydrogenase (GLDH) oppløsning, fri for ammonium ioner; 50 U/ml fosfat buffer fremstilt friskt før analysen. Urease oppløsningen ble fremstilt ved oppløsning i fosfat buffer for å gi en konsentrasjon på 0.1-0.5 U/ml. Denne oppløsning var nypreparert før analyse.
Analyse ble initiert ved tilsetning av 2.0 mL av fosfat buffer 2.40 ml, 0.10 ml hver av urea, ADP, NADH, GLDH og cc-ketoglutarat i en cuvette. Spektrofotometeret ble justert til 3.40 nm og 25°C. Cuvetten med de tilsatte bestanddeler ble anbrakt i spektrofotometeret ved 25°C i 5 minutter for å nå temperatur likevekt og så etablere en blank verdi hvis noen ved 340 nm.
For å initiere den enzymatiske reaksjon ble 0.1 ml av urease oppløsningen satt til cuvetten. Forandringene i absorbans ved 340 nm ble notert til 15 minutter. Enzym aktiviteten ble korrelert med en reduksjon i absorbans ved 340 nm per minutt.
D. Eksempel 4 - Fremstilling av viklings antistoff konjugat
Materialene inkluderte: (1) Rotte anti-hEGFR IgG2a (Serotec), 200 ug/0.2 ml (det vil si 1 mg/ml); E-vikling (N-linker); (3) natrium m-perjodat (Pierce); og (4) bifunksjonell fornetter, KMUH (Pierce).
Funksjonell modifisering av E-vikling ble gjennomført ved å gjennomføre de følgende trinn:
a. Oppløsning av KMUH i DMSO for å fremstille en 10 mg/ml oppløsning (2.5 mg i 250 ul DMSO). b. Oppløsning av E-vikling i PB (~2 mg i 392 ul 10 mM PB, pH 7.4 + 4 ul TCEP, 100 mM forråd).
c. 1 ul Tris (2M) tilsettes for å nøytralisere E-viklings oppløsningen.
d. E-viklings oppløsning settes til KMUH oppløsning for å inkubere ved romtemperatur i 2 timer.
e. Oppløsningen holdes ved 4°C over natten.
f. Neste morgen sentrifugeres det hele ved 12000 rpm i 5 minutter for å fjerne uoppløselig presipitat. g. KMUH og DMSO fjernes på en C8 HPLC kolonne (0-20% acetonitril:H20 med 0.05% TF A) og alle
peptid fraksjoner samles (75% acetonitril).
h. Peptid fraksjonene lyofiliseres og undersøkes ved MS.
Antistoffet ble oksidert ved de følgende trinn:
a. For hvert 2 mg antistoff ble det veiet inn 20 mg perjodat i en rav ampulle.
b. 2 ml PBS, pH 7.2 samt 2 ml forråds antistoff ble satt til ampullen (slutt[antistoff] er 0.5 mg/ml) og
det hele ble forsiktig slynget inntil perjodat pulveret var oppløst.
c. Det hele inkuberes ved romtemperatur i 30 minutter.
d. Perjodatet fjernes ved dialysering 3 ganger mot 100 mM acetatbuffer, pH 5.5.
Konjugering ble gjennomført ved de følgende trinn:
a. Oksidert antistoff ble konsentrert (~2 mg i 4 ml) ved bruk av Millipore Ultrafree Filter enheter (30k
MWc/o).
b. 75 ul av den funksjonaliserte E-viklingsoppløsning (4 ug/ul ddH20) ble satt til halvparten av den
oksiderte antistoff oppløsning (inneholdende rundt 0.75 mg antistoff i acetatbuffer, pH 5.5).
c. Det hele inkuberes ved romtemperatur i 2 timer under risting.
d. Antistoff blandingen renses ved bruk av en protein G kolonne (se fig. 4).
e. Prøven sammenlignes og analyseres (før og etter affinitetsrensing).
E. Eksempel 5 - Biacore analyse av viklings urease konjugat og viklings antistoff
konjugat
Cystein inneholdende K-vikling peptidet eller E-viklings peptidet ble kovalent koblet til en Pioneer Bl biosensor brikke i henhold til produsentens foreslåtte protokoll. Kort sagt ble dekstran overflaten av sensor brikken først aktivert med NHS/EDC (15 ul) fulgt av tilsetning av PDEA (20 ul). K-vikling (eller E-vikling)(50 ug/ml) i 10 mM natrium acetatbuffer pH 4.3 ble injisert og tillatt å reagere for å gi en overflate densitet på rundt 200-400 RU. Gjenværende, aktiverte grupper ble så blokkert ved injeksjon (10 ul) av en 50 mM cystein, IM NaCl, 0.1M format, pH 4.3 deaktiveringsoppløsning.
Kinetiske forsøk ble gjennomført på et BIAcore3000 instrument ved 25°C. Hver biosensor kjøring bestod av (1) en 600 sekunders prøveinjeksjonsfase (viklings urease eller viklings antistoff), (2) en 600 sekunders dissosiasjonsfase og (3) en 2x 15 sekunders regenereringsfase (6M guanidin HC1). En strømningshastighet på 5 ul/min ble opprettholdt gjennom syklusen. PBS ble benyttet som en buffer. SPR signalet ble notert i sanntid med prøvetaking hvert 0.5 sekund og plottet som RU mot tid (sensorgram). Hvert oppnådde senorgram ble korrigert for masserefraktiv indeksforandringer ved å trekke fra den tilsvarende prøve injeksjons syklus på en blank celle overflate.
F. Eksempel 6 - Dyrestudier
Atymiske nu/nu hunnmus med human i de valgte dyr var generelt 5 til 7 uker gamle og kroppsvekten ved behandlingsbegynnelsen var fra rundt 15 til rundt 28 gram.
MCF-celler ble benyttet for å generere xenograftene. Cellene ble dyrket i MEM media supplementert med penicillin/streptomycin 5000U/ml, L-glutamin 200 mM, natrium pyruvat, ikke essensielle aminosyrer, vitaminer og 10% FBS. Celle inkubatoren ble opprettholdt med 5% C02, 37.50°C, og 80% fuktighet. Cellene ble høstetmed 0.25% vekt/volum trypsin-0.03% vekt/volum EDTA oppløsning. Rundt 1 x IO<6>celler i 100 uL ble injisert subkutant i den høyre flanke av hver mus.
Tumorveksten fikk fortsette i rundt 6-8 dager og man tillot tumorstørrelsen å nå minst 2-4 mm i diameter. Doser ble administrert via intratumor injeksjon. Dosevolumet for hvert dyr var 50 uL. Hver faste tumor ble injisert med den gitte dose av testgjenstand i en såkalt "fanning fashion". Tumorvolumer ble så tatt ved eksterne kaliper målinger. Kroppsvekter ble tatt ved starten av prøven og ved avlivningstiden.
Resultatene som vist i tabell 3 nedenfor viser at tumorer ikke var perseptible 24 timer etter behandling.

Claims (6)

1. Farmasøytisk sammensetning for bruk ved inhibering av vekst av en fast tumor i et individ, hvor nevnte sammensetning omfatter: i) et urease enzym konjugert til et anti-tumor antigen antistoff som effektivt øker avlevering av enzymet til cancerceller når sammensetningen administreres til et individ; og ii) en farmasøytisk bærer.
2. Farmasøytisk sammensetning for bruk ifølge krav 1, hvor ureasen er en plante- eller bakteriell urease.
3. Farmasøytisk sammensetning for bruk ifølge krav 1, hvor sammensetningen ytterligere omfatter en svakt basisk antitumor forbindelse hvis effektivitet reduseres ved en høyere intracellulær/lavere ekstracellulær pH gradient i en fast tumor.
4. Farmasøytisk sammensetning for bruk ifølge krav 3, hvor antitumor forbindelsen er valgt fra gruppen bestående av doksorubicin, daunorubicin, mitoksantron, epirubicin, mitomycin, bleomycin, vinka alkaloider som vinblastin og vinkristin, alkyleringsmidler som cyklofosfamid og mekloretamin hydroklorid, og antineoplastiske purin- eller pyrimidin derivater.
5. Anvendelsen av et urease enzym sammen med en svakt basisk antitumor forbindelse, for fremstilling av et medikament for behandling eller diagnostisering av cancer i et pattedyr individ, hvori nevnte urease enzym er konjugert til et anti-tumor antigen antistoff som effektivt øker avlevering av enzymet til cancerceller og effektiviteten til nevnte svakt basisk antitumor forbindelse reduseres ved en høyere intracellulær/lavere ekstracellulær pH gradient i faste tumorceller.
6. Anvendelse ifølge krav 5, hvori nevnte antitumor forbindelse er valgt fra gruppen bestående av doksorubicin, daunorubicin, mitoksantron, epirubicin, mitomycin, bleomycin, vinka alkaloider som vinblastin og vinkristin, alkyleringsmidler som cyklofosfamid og mekloretamin hydroklorid, og antineoplastiske purin- eller pyrimidin derivater.
NO20050793A 2002-07-18 2005-02-15 Farmasøytisk sammensetning for bruk ved inhibering av vekst av en fast tumor NO336811B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US39724402P 2002-07-18 2002-07-18
PCT/CA2003/001061 WO2004009112A1 (en) 2002-07-18 2003-07-16 Use of urease for inhibiting cancer cell growth

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20050793L NO20050793L (no) 2005-04-18
NO336811B1 true NO336811B1 (no) 2015-11-02

Family

ID=30771022

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20050793A NO336811B1 (no) 2002-07-18 2005-02-15 Farmasøytisk sammensetning for bruk ved inhibering av vekst av en fast tumor

Country Status (23)

Country Link
US (1) US7211250B2 (no)
EP (2) EP2324846B1 (no)
JP (4) JP2006501196A (no)
KR (2) KR20050038005A (no)
CN (1) CN100577203C (no)
AU (1) AU2003250658B2 (no)
BR (1) BR0312664A (no)
CA (1) CA2492472C (no)
DK (1) DK1530482T3 (no)
ES (1) ES2443416T3 (no)
HK (2) HK1158103A1 (no)
IL (1) IL166249A (no)
MX (1) MXPA05000778A (no)
NO (1) NO336811B1 (no)
NZ (1) NZ538284A (no)
PL (1) PL217626B1 (no)
PT (1) PT1530482E (no)
RU (1) RU2326691C2 (no)
SI (1) SI1530482T1 (no)
TR (1) TR200500108T2 (no)
UA (1) UA81634C2 (no)
WO (1) WO2004009112A1 (no)
ZA (1) ZA200500423B (no)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7264800B2 (en) * 2002-07-18 2007-09-04 Helix Biopharma Corporation Method and composition for inhibiting cancer cell growth
WO2004023981A2 (en) * 2002-09-11 2004-03-25 Duke University Methods and compositions for blood pool identification, drug distribution quantification and drug release verification
US7769423B2 (en) * 2002-09-11 2010-08-03 Duke University MRI imageable liposomes for the evaluation of treatment efficacy, thermal distribution, and demonstration of dose painting
CA2543200A1 (en) * 2003-10-24 2005-05-06 National Research Council Of Canada Ligand-pseudoreceptor system for generation of adenoviral vectors with altered tropism
IL182956A0 (en) * 2007-05-03 2008-01-20 Yeda Res & Dev Glycan modified soluble receptors and binding proteins and their use
US8892184B2 (en) 2010-10-18 2014-11-18 Siemens Medical Solutions Usa, Inc. Systems and methods for reducing interference in a dual modality imaging system
CN105247047A (zh) * 2013-04-08 2016-01-13 赫利克斯生物药品公司 抗体-尿素酶偶联物在诊断和治疗中的应用
MX2017009537A (es) 2015-01-23 2018-04-10 Helix Biopharma Corp Conjugados ureasa-anticuerpo con fines terapeuticos.
CA3045327A1 (en) 2016-09-24 2018-03-29 Helix Biopharma Corp. Restoring function of tumour acidified t cells
WO2018126315A1 (en) * 2017-01-05 2018-07-12 Helix Biopharma Corporation Anti-vegfr-2 urease conjugates
JPWO2021235436A1 (no) * 2020-05-20 2021-11-25
EP4166147A1 (en) * 2020-06-15 2023-04-19 KORTUC Inc. Sensitiser for cancer treatment
CN113433087A (zh) * 2021-06-22 2021-09-24 中南大学 一种尿素浓度快速检测方法及检测传感器和应用

Family Cites Families (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0007895B1 (fr) 1978-07-19 1983-06-22 Patrick Couvreur Nanoparticules biodégradables, compositions pharmaceutiques les contenant et procédé pour leur préparation
US4489055A (en) 1978-07-19 1984-12-18 N.V. Sopar S.A. Process for preparing biodegradable submicroscopic particles containing a biologically active substance and their use
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
FR2504010B1 (fr) 1981-04-15 1985-10-25 Sanofi Sa Medicaments anticancereux contenant la chaine a de la ricine associee a un anticorps antimelanome et procede pour leur preparation
FR2504408B1 (fr) 1981-04-24 1986-02-14 Couvreur Patrick Procede de preparation de particules submicroscopiques, particules ainsi obtenues et compositions pharmaceutiques les contenant
US4671958A (en) 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
DE3377484D1 (en) 1982-04-19 1988-09-01 Nissan Motor Method for controlling reduction ratio of continuously variable transmission with acceleration compensation
US4824783A (en) 1983-12-20 1989-04-25 Enichem S.P.A. Oxidized sulfur derivatives of diaminophosphinyl compounds as urease inhibitors
US4545985A (en) 1984-01-26 1985-10-08 The United States Of America As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Pseudomonas exotoxin conjugate immunotoxins
US4894443A (en) 1984-02-08 1990-01-16 Cetus Corporation Toxin conjugates
US4625014A (en) 1984-07-10 1986-11-25 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Cell-delivery agent
US4542225A (en) 1984-08-29 1985-09-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Acid-cleavable compound
US4659839A (en) 1984-10-10 1987-04-21 Mallinckrodt, Inc. Coupling agents for radiolabeled antibody fragments
DE3680924D1 (de) 1985-01-14 1991-09-26 Neorx Corp Metall-radionuklid markiertes protein fuer diagnose und therapie.
US4837380A (en) * 1985-09-30 1989-06-06 Regents Of University Of California Liposome-calcitonin preparation
US4699784A (en) 1986-02-25 1987-10-13 Center For Molecular Medicine & Immunology Tumoricidal methotrexate-antibody conjugate
US4680333A (en) 1986-04-14 1987-07-14 National Starch And Chemical Corporation Removable hot melt pressure sensitive adhesive
US4867962A (en) 1988-02-26 1989-09-19 Neorx Corporation Functionally specific antibodies
CA1340323C (en) 1988-09-20 1999-01-19 Arnold E. Hampel Rna catalyst for cleaving specific rna sequences
FR2637612B1 (fr) 1988-10-06 1993-09-10 Pasteur Institut Sequences de nucleotides codant pour une proteine a activite ureasique
EP0460607A3 (en) * 1990-06-05 1992-04-01 Bristol-Myers Squibb Company Novel monoclonal antibody to novel antigen associated with human tumors
US5298399A (en) 1990-08-10 1994-03-29 Sapporo Breweries Limited Gene and process for producing a thermostable urease
US5140100A (en) 1990-12-28 1992-08-18 Cedars-Sinai Medical Center Protein that inhibits production of human choriogonadotropin
FR2683159B1 (fr) 1991-10-31 1994-02-25 Coletica Procede de fabrication de nanocapsules a paroi a base de proteines reticulees; nanocapsules ainsi obtenues et compositions cosmetiques, pharmaceutiques et alimentaires en comportant application.
US5573934A (en) * 1992-04-20 1996-11-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Gels for encapsulation of biological materials
EP0633943A4 (en) * 1992-04-03 1997-05-02 Alexander T Young GENTHERAPY USING TARGETED VIRAL VECTORS.
US5976535A (en) 1992-06-09 1999-11-02 Neorx Corporation Pretargeting protocols for the enhanced localization of cytotoxins to target sites and cytotoxic combinations useful therefore
US6358490B2 (en) 1992-06-09 2002-03-19 Neorx Corporation Three-step pretargeting methods and compounds
US6290962B1 (en) * 1992-11-03 2001-09-18 Oravax, Inc. Urease-based vaccine and treatment for helicobacter infection
GB9300875D0 (en) 1993-01-18 1993-03-10 Ucb Sa Nanocapsule containing pharmaceutical compositions
WO1994018955A1 (en) 1993-02-22 1994-09-01 Alza Corporation Compositions for oral delivery of active agents
WO1995014093A1 (en) 1993-05-19 1995-05-26 Institut Pasteur Immunogenic compositions against helicobacter infection, polypeptides for use in the compositions and nucleic acid sequences encoding said polypeptides
ATE196297T1 (de) * 1994-05-18 2000-09-15 Synthetic Peptides Inc Heterodimere trägerzusammensetzung von immunogenen polypeptiden und verfahren zu deren verwendung
GB9417873D0 (en) 1994-09-06 1994-10-26 Sandoz Ltd Organic compounds
US6172045B1 (en) 1994-12-07 2001-01-09 Neorx Corporation Cluster clearing agents
US5886143A (en) 1994-12-07 1999-03-23 Neorx Corporation Hepatic-directed compounds and reagents for preparation thereof
FR2732605B1 (fr) * 1995-04-07 1997-05-16 Pasteur Merieux Serums Vacc Composition destinee a l'induction d'une reponse immunitaire mucosale
JPH11511979A (ja) * 1995-09-06 1999-10-19 ババリアン・ノルディック・リサーチ・インスティテュート・アクティーゼルスカブ ヒト乳癌細胞を含むヒト乳腺細胞を標的として、連結された異種性遺伝子を発現させるためのｗａｐまたはｍｍｔｖ制御配列の使用
JP2000504670A (ja) 1996-01-31 2000-04-18 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 腫瘍細胞の成長を抑制する方法
AU733737B2 (en) 1996-03-20 2001-05-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Sensitization of her-2/neu overexpressing cancer cells to chemotherapy
JPH1017492A (ja) * 1996-07-02 1998-01-20 Fuji Yakuhin Kogyo Kk 腫瘍細胞増殖抑制剤
US5958892A (en) 1996-07-30 1999-09-28 Board Of Regents, The University Of Texas System 2-methoxyestradiol-induced apoptosis in cancer cells
US5750496A (en) * 1996-08-12 1998-05-12 Utah State University Method of controlling cryptosporidium infectons using protease inhibitors
EP0824019B1 (en) * 1996-08-13 2002-11-20 Quest International B.V. Inhibition or reduction of oral malodour
EP0932390A1 (en) 1996-10-11 1999-08-04 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic liposome composition and method
US6261537B1 (en) 1996-10-28 2001-07-17 Nycomed Imaging As Diagnostic/therapeutic agents having microbubbles coupled to one or more vectors
CN1181422A (zh) * 1996-10-31 1998-05-13 上海市肿瘤研究所 与生长因子受体结合的多肽所构建的基因转移载体
US6180114B1 (en) 1996-11-21 2001-01-30 University Of Washington Therapeutic delivery using compounds self-assembled into high axial ratio microstructures
US6045774A (en) 1997-01-10 2000-04-04 Epicyte Pharmaceutical Inc. J chain polypeptide targeting molecule linked to an imaging agent
GB9703633D0 (en) * 1997-02-21 1997-04-09 Imp Cancer Res Tech Cancer therapy
US6190923B1 (en) 1997-09-05 2001-02-20 David K. Johnson Diethylenetriamine-N,N′,N″-triacetic acid derivatives
FR2772025B1 (fr) 1997-12-10 2000-03-03 Guerbet Sa Chelates metalliques de macrocycles polyaminocarboxyliques et leur application a l'imagerie par resonance magnetique
US6426086B1 (en) * 1998-02-03 2002-07-30 The Regents Of The University Of California pH-sensitive, serum-stable liposomes
US6753310B1 (en) * 1998-10-16 2004-06-22 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Neovascular-specific peptides
FR2790405B1 (fr) 1999-03-02 2001-04-20 Oreal Nanocapsules a base de polymeres dendritiques
WO2000052457A1 (en) 1999-03-02 2000-09-08 Helix Biopharma Corporation Card-based biosensor device
US6159443A (en) 1999-04-29 2000-12-12 Vanderbilt University X-ray guided drug delivery
BR122014028365B8 (pt) 1999-06-25 2021-07-06 Genentech Inc artigo industrializado compreendendo um primeiro recipiente que compreende uma composição de humab4d5-8 nele contida e um segundo recipiente que compreende uma composição rhumab 2c4 nele contida
US6307372B1 (en) 1999-11-02 2001-10-23 Glaxo Wellcome, Inc. Methods for high throughput chemical screening using magnetic resonance imaging
AU4305101A (en) 1999-11-22 2001-06-04 Research Foundation Of The State University Of New York, The Magnetic nanoparticles for selective therapy
US20020041898A1 (en) 2000-01-05 2002-04-11 Unger Evan C. Novel targeted delivery systems for bioactive agents
JPWO2002015925A1 (ja) * 2000-08-22 2004-07-08 協和醗酵工業株式会社 アポトーシスの制御方法およびアポトーシス制御ポリペプチド
ATE524196T1 (de) * 2001-10-16 2011-09-15 Macrogenics West Inc An das krebsassoziierte antigen cd46 bindende antikörper und verwendungsverfahren dafür

Also Published As

Publication number Publication date
JP2011207913A (ja) 2011-10-20
HK1158103A1 (en) 2012-07-13
ZA200500423B (en) 2006-08-30
SI1530482T1 (sl) 2014-03-31
TR200500108T2 (tr) 2005-04-21
JP2013213055A (ja) 2013-10-17
WO2004009112A1 (en) 2004-01-29
EP1530482B9 (en) 2014-04-16
PL374675A1 (en) 2005-10-31
CA2492472C (en) 2014-01-07
KR101352826B1 (ko) 2014-01-17
ES2443416T3 (es) 2014-02-19
JP5850561B2 (ja) 2016-02-03
IL166249A0 (en) 2006-01-15
WO2004009112A8 (en) 2005-09-15
NZ538284A (en) 2008-04-30
AU2003250658B2 (en) 2009-07-16
EP2324846A1 (en) 2011-05-25
NO20050793L (no) 2005-04-18
RU2005104113A (ru) 2005-09-10
EP1530482B1 (en) 2013-10-23
EP1530482A1 (en) 2005-05-18
CA2492472A1 (en) 2004-01-29
KR20050038005A (ko) 2005-04-25
PT1530482E (pt) 2014-01-15
CN1681528A (zh) 2005-10-12
US20040115186A1 (en) 2004-06-17
KR20110123786A (ko) 2011-11-15
MXPA05000778A (es) 2005-08-29
BR0312664A (pt) 2005-05-03
CN100577203C (zh) 2010-01-06
AU2003250658A1 (en) 2004-02-09
PL217626B1 (pl) 2014-08-29
DK1530482T3 (da) 2014-01-20
RU2326691C2 (ru) 2008-06-20
HK1076739A1 (en) 2006-01-27
EP2324846B1 (en) 2014-11-12
UA81634C2 (ru) 2008-01-25
JP2006501196A (ja) 2006-01-12
JP2016014066A (ja) 2016-01-28
US7211250B2 (en) 2007-05-01
IL166249A (en) 2011-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO336811B1 (no) Farmasøytisk sammensetning for bruk ved inhibering av vekst av en fast tumor
Qian et al. Targeted drug delivery via the transferrin receptor-mediated endocytosis pathway
US11643662B2 (en) Targeted protease compositions and uses related thereto
JP6876618B2 (ja) 治療目的のための抗体−ウレアーゼコンジュゲート
Grigoletto et al. The evolution of polymer conjugation and drug targeting for the delivery of proteins and bioactive molecules
US20090011984A1 (en) Biotin-binding receptor molecules
Joshi et al. Transferrin Receptor and Targeting Strategies
Wu et al. EGFR-targeted humanized single chain antibody fragment functionalized silica nanoparticles for precision therapy of cancer
CA2493282A1 (en) Method and composition for inhibiting cancer cell growth using urease and weakly basic anti-cancer compounds

Legal Events

Date Code Title Description
MM1K Lapsed by not paying the annual fees