CN1681528A - 尿素酶用于抑制癌症细胞生长的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于抑制哺乳动物患者癌细胞生长的药物组合物和方法。该组合物包括尿素酶、以及当给予将药物给予患者时，与尿素酶相关的有效提高酶至癌细胞释放的化学整体。本发明还公开了提高弱碱性抗肿瘤化合物效能的方法，评价患者实体肿瘤的存在、大小或情况的方法，以及用于治疗患者癌症的基因治疗组合物。

Description

尿素酶用于抑制癌症细胞生长的用途
                相关申请的交叉参考
本申请要求了2002年7月18日申请的美国临时专利申请系列No.60/397,244的优先权和权益，其所公开的全部在此并入作为参考用于所有目的。
                     发明领域
本发明涉及使用尿素酶蛋白和多肽的抗癌治疗方法。
                     发明背景
癌症占美国总死亡率的五分之一，并且是第二大导致死亡的原因。通常通过细胞群体不受控制的分裂来表征癌症。不受控制的分裂可以涉及血细胞，如各种类型的淋巴瘤，或特定组织或器官中聚集或天生的细胞，例如实体肿瘤，如乳腺、肝脏、食道、胃、肠、脑、骨，或前列腺的继发瘤或原发瘤。
已经提出了各种用于癌症治疗的治疗方式。这些通常包括实体肿瘤的外科切除、用如X-射线辐射治疗、化疗、免疫治疗，以及基因治疗。给定癌症选择的治疗类型依赖于这些因素如患者年龄、癌症定域的程度，以及癌症的类型和时期。通常治疗包括两种或多种方式的结合，如X-射线治疗结合化疗，或结合免疫治疗和化疗。
已经有大量的化疗化合物和组合物以及策略用于治疗癌症。许多抗肿瘤化合物设计来破坏快速分裂细胞的复制，或来抑制活性增殖细胞中的关键代谢链。尽管这些方法已经在特定类型的癌症或特定阶段的癌症中获得了一定程度的成功，化疗通常伴随不愉快导致虚弱的副作用，如不舒服、恶心、无食欲、脱发，以及贫血。进一步，作用于细胞复制水平的化合物，通过将核苷酸类似物导入分裂细胞，或通过破坏正常的复制，具有将普遍的遗传突变导入患者正常细胞的可能。此外，通过限制试剂摄入细胞，或通过改变试剂在细胞内的代谢，癌细胞可以产生对多种类型的抗癌试剂的耐受性。
针对这些局限性，已经进行试验来改变化疗试剂以降低它们的副作用、克服耐受性问题，或提高它们对选择的肿瘤位点的目标靶向。而这些努力已经在一些情况中产生了改善的治疗结果，但仍然需要提供改良化疗试剂和方法。尤其是这样的试剂：可以有效地杀灭或抑制癌细胞生长，就副作用和所治疗患者的遗传完整性长期效果而言相对无毒性，以及优选以可交付使用的形式使其直接引入肿瘤或选择性地靶向肿瘤。
                        发明概述
本发明提供了用于抑制哺乳动物患者中癌细胞生长的药物组合物。该组合物包括尿素酶，如细菌或植物尿素酶，以及当将组合物给予患者时，用于提高酶向癌细胞释放的与尿素酶相关化学整体。
在一个实施方案中，化学整体包括结合尿素酶的亲水聚合体，其量能有效延长血液循环时间或减少所述组合物相对于天然尿素酶抗原性。聚合物可以是，例如，聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯甲醚、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚羟丙基甲基丙烯酸酯、聚羟乙基丙烯酸酯、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟乙基噁唑啉、聚羟丙基噁唑啉、聚天冬酰胺，或亲水的纤维素衍生物。聚合物优选为直链聚合物，例如聚乙二醇直链，具有约为1,000至10,000道尔顿的分子量。
化学整体可以是连接至尿素酶的靶向部分，如抗癌抗原抗体、抗hCG抗体，或可以特异性结合癌细胞表面受体的配体。靶向部分是多肽，组合物可以是靶向部分和尿素酶的融合蛋白。或者，其中尿素酶可以在其C或N端包括特征为所选择电荷以及具有和第二个相反电荷的螺旋型肽结合来形成稳定的α螺旋型的卷曲螺旋型杂二聚体的能力的第一个螺旋型肽；以及化学整体可以包括含有第二个螺旋型肽的靶向部分。
化学整体可以包括含有包载形式尿素酶的小泡。小泡的实例包括当组合物是静脉内给药时，其依靠聚乙二醇链外部涂层的长效循环并做成能渗入肿瘤区域大小的脂质体，以及具有结合靶向部分表面的脂质体。小泡可以包括其它试剂，如尿素，治疗活性的抗癌剂或显影剂。
化学整体可以包括与其相关的尿素酶抑制剂，其量足够足以抑制所述酶活性。
另一方面，本发明包括抑制哺乳动物癌细胞生长的方法。该方法包括使细胞接触尿素酶，尿素酶的量足够抑制癌细胞生长。
癌细胞包括实体肿瘤，尿素酶可以直接注射入患者的肿瘤中，或通过除了直接给药的非肠道给药，例如，注射。除了尿素酶药物学上可接受的载体以外，各种包含上述尿素酶的组合物适用于本发明。
该方法可以包括调节尿素酶作用于癌细胞的活性，通过给予患者适量尿素酶抑制剂来有效减少尿素酶作用于所述癌细胞的活性。通过在给药尿素酶之前，之中，或之后给患者服用尿素，可以反方向调节尿素酶活性。
尿素酶可以以两个阶段给药，第一个阶段包括肿瘤靶向部分和具有与第二个结合部分相互作用能力的第一个结合部分的结合体；以及第二个阶段包括与尿素酶结合的第二个结合部分的第二个结合体。
仍然在另在一个实施方案中，该方法可以包括给予患者基因治疗组合物，该基因治疗组合物由给予患者时有效地选择性地转染癌细胞的靶向载体和所述载体携带的有效地在转染癌细胞中产生尿素酶mRNA的重组核苷酸序列组成。载体实例是腺病毒。核苷酸序列的实例编码了尿素酶和有效提高尿素酶从转染癌细胞中分泌的分泌前导序列。
在相关方面，本发明提供了在接受治疗肿瘤试剂的患者中提高弱碱性抗癌化合物治疗效能的方法，该化合物的效能是通过实体肿瘤中较高胞内/较低胞外pH的梯度降低的。该方法包括给予患者适量尿素酶以有效于减少或颠倒实体肿瘤中较高胞内/较低胞外的pH梯度。优选，给药的尿素酶量是有效地提高肿瘤胞外流体至pH至少为7.2。如上尿素酶可以直接注射入肿瘤中，或通过除了直接给药外非肠道给药。
抗癌化合物可以是，例如，阿霉素、柔红霉素、米托蒽醌、表柔比星、丝裂霉素、博来霉素、长春花属生物碱如长春碱和长春新碱、烷化剂如环磷酰胺和二氯甲基二乙胺盐酸盐，以及antrineoplastic嘌呤或嘧啶衍生物。
仍然是另一方面，本发明用于评价患者中实体肿瘤的存在、大小或情况。在此，在有效地将尿素酶定位于患者实体肿瘤的条件下，给患有或怀疑患有实体肿瘤的患者给予尿素酶。然后用能够检测患者组织中胞外pH改变的诊断工具如荧光、MRI，或正电子放射成像对患者进行检查，不管pH敏感报告子是否存在，用来鉴定显示胞外pH上升的患者组织区域。
该方法可用于和上述治疗方法结合来评价尿素酶定量或治疗的程度和/或效能。因此，例如，将尿素酶给予患者，肿瘤区域内pH改变的范围和程度随后可以指导尿素酶给药，或来评价治疗过程中肿瘤大小或程度的改变。
本发明还公开了用于抑制哺乳动物癌细胞生长的试剂盒。试剂盒具有包括尿素酶的药物组合物，以及教导将将组合物给予患者的说明书，用于治疗患者的癌症。
说明书可以教导依赖于肿瘤的大小将尿素酶将组合物给予患者，通过直接注射入肿瘤给药时，0.1至100国际单位尿素酶活性每mm3肿瘤，优选0.5至10国际单位尿素酶活性每mm3肿瘤，当组合物除了直接注射入肿瘤外非肠道给予患者时，以100-100,000国际单位/kg的量，优选500-10,000国际单位/kg国际单位尿素酶活性/kg患者体重。
说明书可以教导将尿素酶将组合物给予还接受了弱碱性抗肿瘤化合物的患者，该化合物的效能是通过实体肿瘤中较高胞内/较低胞外pH梯度来降低的，以尿素酶的量有效地降低或逆转实体肿瘤中较高胞内/较低胞外pH梯度。
说明书可以教导在有效地将尿素酶定位于患者实体肿瘤中的条件下，将将尿素酶组合物给予患有或怀疑患有实体肿瘤的患者，用能够测定患者组织中胞外pH改变的诊断工具检查患者，并鉴定所述给药后显示胞外pH提升的患者组织区域。
本发明还公开了用于抑制哺乳动物患者癌细胞生长的基因治疗组合物。该组合物包括，如上所述，给予患者时，有效地选择转染癌细胞的靶向载体，以及载体所携带的有效地在转染癌细胞中产生尿素酶mRNA的重组核苷酸序列。
当本发明的下列详细描述结合附图阅读时，本发明的这些和其他目的和特征将变得完全清晰。
                       附图简述
图1A-1D说明了尿素酶反应的步骤。尿素通过尿素酶分解产生一分子的氨和一分子的氨基甲酸盐(A)。氨基甲酸盐自发地分解为氨和碳酸(B)。碳酸在水中平衡(C)，以及两分子的氨质子化产生胺离子和羟离子(D)。反应导致了反应环境pH的升高。
图2显示了含有根据本发明一实施例制得的尿素酶粗制样品的质谱图；
图3说明了根据本发明的另一实施例，尿素酶亲和性纯化在纯化过程各个阶段的图，
图4说明了根据本发明一实施例制得的E-螺旋-αhEGFR IgG结合体通过蛋白质-G柱的纯化；以及
图5显示了根据本发明一实施例制得的纯化E-螺旋-αhEGFR IgG结合体的抗体滴定，通过固定K-螺旋ELISA来测定。
                       发明详述
I. 定义
除非另外指出，本发明在此所用的所有技术和科学术语对于本领域普通技术人员具有相同的意思。专业人员尤其受Sambrook等(2001)“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”冷泉港出版社，第3版；和Ausubel，F.M.，等(1993)Current Protocols in Molecular Biology的指导，用于本领域的定义和术语。可以理解本发明不受限制于所述的特别方法论、规程，和试剂，这些是可以改变的。
术语“尿素酶”指的是具有尿素氨基水解酶(E.C.3.5.1.5)酶活性的酶，天然产生的或通过如重组核酸技术/或化学合成获得的。尿素酶还可以包括含有完整尿素酶、亚基，或其片段的融合蛋白，和/或通过氨基酸取代、删除或添加而保持肽的尿素氨基水解酶活性的尿素酶。在此所用的平端尿素酶序列是尿素酶的片段，其从完整尿素酶序列的一部分脱离出来，从尿素酶的氨基端或羧基端开始。下列给出了分离天然尿素酶、合成重组尿素酶，和鉴定活性片段以及修饰尿素酶多肽的方法。
术语“癌症”的意思指的是异常细胞，或组织块。这些细胞或组织的生长超过了正常组织或细胞的生长并与正常组织或细胞的生长不协调，且在引起改变的刺激停止后以相同过量的方式持续。这些肿瘤组织或细胞显示了相对于正常组织或细胞结构组织和协调的缺乏，其导致了良性的或恶性的组织或细胞块。如在此所用的，癌症包括肿瘤。这包括但不限制于，黑素瘤、腺癌、恶性神经胶质瘤、前列腺鳞癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、甲状腺癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、脑癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌，等等。
“肿瘤”或“实体肿瘤”指的是癌细胞的粘性块，包括但不限制于半实性和实体肿瘤、实体肿瘤转移、血管纤维瘤、晶状体后纤维增生、血管瘤和karposi‘s肉瘤。
如在此所用的术语“靶向部分”指的是结合所定义细胞群体或所选择细胞类型的分子。靶向部分可以结合受体、寡核苷酸、酶底物、抗原决定簇，或其他存在于靶细胞或细胞群体上或内的结合位点。靶向部分的实例是抗体。可以识别表达抗原的抗体片段和小肽序列也可以用作靶向部分。
如在此所用的术语“抑制(inhibits)癌细胞的生长”或“抑制(inhibiting)癌细胞的生长”指的是任何癌细胞增殖和/或转移率的减慢、癌细胞增殖和/或转移的停止，或癌细胞的杀灭，以致与观察到的或预测的未处理对照癌细胞的生长率相比降低了癌细胞的生长率。术语“抑制生长”还可以指的是癌细胞或肿瘤大小的减小或消失，以及减少其转移的可能性。优选，这样细胞水平的抑制可以减小大小、阻止生长、降低浸润，或预防或抑制患者癌症的转移。本领域的普通技术人员通过任何一种合适的标记可以轻易地判定是否抑制了癌细胞的生长。
例如可以通过癌细胞在细胞周期特定阶段的停止来证实癌细胞生长的抑制，如在细胞周期的G2/M阶段停止。也可以通过癌细胞或肿瘤大小的直接或间接测量来证实癌细胞生长的抑制。在人类癌症患者中，通常使用公知的成像方法如磁共振成像、计算机化轴向断层检查和X-射线来进行这样的测量。还可以间直接测定癌细胞的生长，如通过测定循环癌胚抗原的含量、前列腺特异性抗原或其他与癌细胞生长有关的癌症特异性抗原。癌细胞生长的抑制通常还和患者的延长存活和/或增强健康和保持良好状态相关。
如在此所用的术语“诱导凋亡”指的是通过DNA片段表征的可程式化细胞死亡形式的提升。可以通过本领域公知的方法来测定凋亡。例如，可购买通过原位免疫组织化学检测片段DNA存在的试剂盒(例如，Apoptag，可从Intergen，Purchase，N.Y.购买获得)。此外，凋亡可以通过FACS分析来测定，其中凋亡细胞显示了亚G1 DNA内容物，表明了DNA断裂。
如在此所用的术语“抗体”指的是肽、多肽，或包含一个或多个肽或多肽的蛋白质，肽或多肽基本上或部分由至少一种免疫球蛋白核苷酸分子或免疫球蛋白基因或至少一种免疫球蛋白分子或免疫球蛋白基因的片段编码的。公知的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。重链分类为γ、μ、α、δ，或ε，其依次分别定义了免疫球蛋白的种类，IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。典型的免疫球蛋白(例如，抗体)结构单元包括四聚物。每个四聚物由两对相同的肽链组成，每对具有一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每条链的N端定义约100至110或更多氨基酸的主要用于抗原识别的可变区。术语“可变轻链”(VL)和“可变重链”(VH)各自指的是这些轻链和重链。抗体以完整免疫球蛋白的形式或以由各种肽酶消化产生的若干清楚表征的片段形式存在。因此，例如，胃蛋白酶消化铰链区二硫键下面的抗体来产生F(ab)’2，Fab的二聚物，其自身是通过二硫键连接至VH-CH1的轻链。可以在低碳情况下还原(Fab)’2来破坏铰链区的二硫键，因此将F(ab)’2二聚物转化成Fab’的单体。Fab’单体实质上是Fab和部分铰链区(参见Fundamental Immunology，W.E.Paul，等，Raven出版社，N.Y(1993)，其它抗体片段的更详细描述)。而用完整抗体的消化来定义各种抗体片段，本领域普通技术人员将意识到可以化学地或利用重组DNA方法来重新合成这样的Fab’片段。因此，在此所用的术语“抗体”还包括抗体片段，由整个抗体的修饰或使用重组DNA方法重新合成制得的。抗体包括单链抗体，包括单链Fv(sFv)抗体，其中VH和VL连接在一起(直接或通过肽连接子)来形成连续的肽。
抗体的“抗原结合片段”是抗体结合抗原的肽或多肽片段。通过有助于、有关的，或影响抗原结合的抗体的那些氨基酸来形成抗原结合位点。参见Scott，T.A.和Mercer，E.I.，CONCISE ENCYCLOPEDIA：BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY(Gruyter，第三版，1997)和Watson，J.D.等，RECOMBINANT DNA(第二版，1992)，其中每个都以其全部在此并入作为参考用于所有目的。术语“抗体片段”还包括任何合成或遗传工程蛋白，其通过结合特异性抗原形成复合体而用作抗体。
在此可交替使用的术语“活性剂”、“药物”和“药物活性剂”指的是化学物质或化合物，其在给予患者时诱导了所期望的药理效果，且意味着包括诊断或治疗剂，包括放射性核素、药物、抗癌剂、毒素等等。优选，术语活性剂包括蛋白质、糖蛋白、天然或合成肽、生物碱、多糖、核酸分子、小分子等等。更优选，术语活性剂指的是蛋白质。活性剂的实例是尿素酶。
“pH敏感性”活性剂指的是其诱导所期望药理效果的能力至少部分依赖于周围胞外环境pH的活性剂。
如在此所用的术语“清除剂”指的是可以和给药部分如靶向部分-配体、靶向部分-抗配体或抗配体单独结合、络合或其它联合的试剂，存在于接受者的循环中，因此有助于将循环部分从接受者体内清除、从血液循环去除，或钝化其循环。清除剂优选由物理特性表征的，如大小、电荷、外形或其组合，在作为清除剂相同处理规程使用中，其限制了清除剂通向由靶向部分识别的靶细胞群体。
术语“显影剂”意思是指可以检测到的化合物。
术语“辅剂”指的是加入制剂或组合物中来帮助主要成分作用的物质或试剂。
术语“胞间”和“胞外”液指的是在哺乳动物细胞之间或浸泡哺乳动物细胞的液体。
在此可交替使用的术语“患者”、“个体”和“病人”指的是治疗的任何目标。本发明还提供了在原位，或在其正常位置或所在治疗癌细胞的方法，例如，乳腺或前列腺肿瘤的瘤细胞。这些原位肿瘤可以在各种宿主内或上定位；例如，人宿主、犬宿主、猫宿主、马宿主、牛宿主、猪宿主等等。可以治疗任何发现有肿瘤或肿瘤细胞的宿主且与本发明相关。因此患者包括脊椎动物，优选哺乳动物，更优选为人。
“靶细胞停留时间”意味着尿素酶或其他活性剂停留在靶细胞表面或靶细胞里面的时间量。
如在此所用的术语“结合”包括化学结合(共价或非共价键)、融合蛋白等等。
在此可交替所用的术语“蛋白质”、“多肽”或“肽”指的是由氨基酸或氨基酸类似物亚基组成的生物聚合体，通常为生物蛋白质中发现的20个常见L-氨基酸的一些或全部，由肽亚基间的键或其他亚基间的键来连接。蛋白质具有由其亚基序列表示的初级结构，且可以具有螺旋或纵褶的二级结构，以及外部的三维结构。尽管“蛋白质”通常指的是相对大的肽，例如，包含100或更多氨基酸，以及“肽”指的是较小的多肽，但是在此术语可以交替使用。即，术语“蛋白质”可以指的是较大的多肽，以及较小的肽，且反之亦然。
“尿素酶的抑扬调节剂”是尿素酶的抑制剂或尿素酶的增强剂。
“尿素酶的抑制剂”包括干涉：(1)尿素酶的表达、修饰、调节、活化或降解；或(2)尿素酶的一种或多种正常功能的分子或分子群。尿素酶的正常功能包括尿素的水解，导致氨基甲酸盐和胺的产生。当抑制剂通过静电或化学作用结合尿素酶时，抑制剂“直接作用于尿素酶”。这样的作用可以由或不由其他分子作为介质。当其最大的瞬即效应是作用于影响尿素酶表达、活化或功能的尿素酶以外的分子时，抑制剂“间接地作用于尿素酶”。
“尿素酶增强剂”包括提高：(1)尿素酶的表达、修饰、调节或活化；或(2)尿素酶的一种或多种正常功能的分子或分子群。当其最大的瞬即效应是作用于影响尿素酶表达、活化或功能的尿素酶以外的分子时，增强剂“间接地作用于尿素酶”。
尿素酶基因中的“工程突变”包括尿素酶基因核苷酸序列的改变，该改变导致产生(1)相对于没有这样改变下的产生量，增加或减少的尿素酶蛋白量；或(2)相对于没有这样改变下的功能，具有提高或削弱正常功能的尿素酶蛋白。
术语“药物组合物”意思是适用于包括动物或人类患者药物学使用的组合物。药物组合物通常包括有效量的活性剂和载体，包括，例如，药物学上可接受的载体。
“药物学上可接受的制剂”包括适用于将活性剂(例如，尿素酶或尿素酶抑扬调节剂)以达到所期望结果的方式给药的制剂，而且足够使内科医生确信不产生对病人潜在害处大于对病人潜在益处的不利副作用。注射制剂的基础配料通常是水载体。有用的含水载体包括氯化钠(NaCl)溶液，Ringer′s溶液，NaCl/葡聚糖溶液，等等。水混溶的载体对影响活性剂的全部溶解也是有用的。依需要可以使用抗菌剂、缓冲液和抗氧化剂。同样，如在此所提供的化合物“药物学上可接受的”盐或“药物学上可接受的”衍生物是盐或其他衍生物，其不是生物学上或其他不合需要的。
术语“受控制的释放”指的是任何含有药物的制剂，其中药物从制剂中释放的方式和型是受控制的。术语“受控制的释放”指的是即时和非即时释放制剂，非即时释放制剂包括但不限制于持续释放和延迟释放制剂。
术语“持续释放”(也如“延伸释放(extended release))以其常规的意思使用，指的是在持续的时间段提供药物逐步释放的药物制剂，以及优选，尽管不是必需的，导致在持续的时间段里药物血含量基本上恒定。术语“延迟释放”以其常规的意思使用，指的是在制剂给药和其药物释放之间存在时间延迟的药物制剂。“延迟释放”可以包括或不包括在持续时间段内药物的逐步释放，以及因此可以是或不是“持续释放”。
“治疗剂治疗”是给予显示病理学、疾病，或紊乱症状或信号患者的治疗，其中治疗是给予患者用于减轻或消除那些病理学、疾病，或紊乱症状或信号。“治疗活性”是如核酸、载体、基因、多肽、蛋白质、物质，或其组合物试剂的活性，当给予遭受这样信号或症状的患者时来消除或减轻病理学、疾病或失调信号或症状。“治疗学上有用的”试剂或化合物(例如，核酸或多肽)表示用于减轻、治疗，或消除这样病理学、疾病或失调信号或症状的试剂或化合物。
术语“小分子“包括合成的、天然衍生的，或部分合成的化合物或分子复合体，其优选具有小于5,000道尔顿的分子量。更优选，小分子具有100至1,500道尔顿的分子量。
在此的术语“核酸分子”或“寡核苷酸”或语法上的等价物指的是至少两个共价连接在一起的核苷酸，且通常指的是RNA、DNA和cDNA分子。本发明的核酸优选是单链或双链的，通常包含磷酸二酯键，尽管在一些情况中也包括具有互生骨架的核酸类似物，包括，例如，磷酰胺、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯，和/或O-甲基氨基磷酸盐连接。可以理解的是，作为遗传编码简并的结果，可以产生编码所给肽如尿素酶的许多核苷酸序列。
“异种的”核酸构建体或序列具有一部分不是细胞天然表达的序列。异种，相对于对照序列，指的是实质上不是作用来调节其通常调节的相同基因表达的对照序列(即，促进剂或增强剂)。通常，异种核酸序列不是它们所存在细胞或基因组部分内生的，通过感染、转染、显微注射、电穿孔等等加入细胞中。异种核酸构建体可以包括对照序列/DNA编码序列组合，其可以和天然细胞中发现的对照序列/DNA编码序列组合相同或不同。
如在此所用的术语“载体”指的是设计用于不同宿主细胞之间传递的核酸构建体。“表达载体”指的是具有合并和表达外源细胞中的异种DNA片段能力的载体。许多原核和真核表达载体都是可购得的。合适表达载体的选择是在本领域普通技术人员的知识范围内的。
如在此所用的“表达盒”或“表达载体”是重组或合成产生的核酸构建体，具有一系列特异的核酸序列使特定核酸在靶细胞中或活体外转录。重组表达盒可以并入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒，或核酸片段。通常，表达载体的重组表达盒部分包括除了序列以外，转录的核酸序列和启动子。
如在此所用的术语“质粒”指的是用作克隆载体的圆形双链DNA构建体，其形成了许多细菌和一些真核生物中染色体外自我复制的遗传序列。
如在此所用的术语“可选择标记-编码核苷酸序列”指的是可以在宿主细胞内表达的核苷酸序列，以及其中可选择标记的表达给予包含表达基因细胞的以在相应选择性试剂存在下生长的能力。
如在此所用的术语“启动子”和“转录启动子”指的是作用于下游基因直接转录的核酸序。启动子通常适于目标基因表达的宿主细胞。启动子，和其它转录和翻译调控核酸序列(也称为“控制序列”)一起，对表达所给的基因是必需的。通常，转录和翻译调控核酸序列包括，但不限制于，启动子序列、核糖体结合位点、转录开始和停止序列、翻译开始和停止序列，和增强子或激活剂序列。
如在此所定义的“嵌合体基因”和“异种核酸构建体”指的是非天然基因(即，已经引入宿主的基因)可以由不同基因部分组成，包括调控序列。用于宿主细胞转化的嵌合体基因构建体通常由可操作地连接至异种蛋白质编码序列的转录调控区域(启动子)组成，或在可选择标记嵌合体基因内连接至编码给予转化寄主细胞以抗生素抗性蛋白质的可选择标记基因。用于转化进寄主细胞的本发明典型的嵌合体基因，包括转录调控区域，其是由以下构成的或包括：蛋白质编码序列，和终止基因序列。如果期望目标蛋白的分泌，嵌合体基因构建体还可以包括编码信号肽的第二DNA序列。
当其放入和其它核酸序列的功能关系中时，核酸是“可操作地连接”。例如，如果其作为参与多肽分泌的前蛋白表达，编码分泌前导的DNA是可操作地连接至用于多肽的DNA；如果其作用于序列的转录，启动子或增强子可操作地连接至编码序列；或如果其定位以便有助于翻译，核糖体结合位点可操作地连接至编码序列。通常，“可操作地连接”意思是连接的DNA序列是邻接的，以及在分泌前导的情况下是邻接的和在阅读框中。然而，增强子不是必须邻接的。通过在方便的限制位点连接反应来完成连接。如果不存在这样的位点，可以根据常规操作使用合成的寡核苷酸连接物或连接子。
如在此所用的术语“基因”意思是涉及产生多肽链的DNA片段，可以包括或不包括在前和在后的编码区域，例如，5’非翻译(5’UTR)或“先导”序列和3’UTR或“非转录尾区”序列，以及在各自编码片段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
如在此所用的“重组”包括参考通过引入异种核酸序列修饰的细胞或载体或源自这样修饰细胞的细胞。因此，例如，重组细胞表达细胞天然(非重组)形式中没有发现同一形式的基因或表达其它非正常表达的天然基因，表达不足或根本未表达作为人类故意干涉的结果。
术语“引入”，在将核酸序列插入细胞的内容中，意思为“转染”、“转化”或“转导”和包括参考核酸序列并入真核或原核细胞中，其中核酸序列可以并入细胞的基因组(例如，染色体、质粒、质体，或线粒体DNA)，转入自主复制，或暂时表达(例如，转染mRNA)。
如在此所用的术语“表达”指的是基于基因的核酸序列产生多肽的过程。该过程同时包括转录和翻译。
术语“信号序列”指的是氨基酸序列，在蛋白质的N端部分有助于细胞外蛋白质成熟形式的分泌。胞外蛋白质的成熟形式缺失信号序列，其在分泌过程中劈离。
术语“宿主细胞”意思是包含载体和支持表达构建体的复制，或转录和翻译(表达)的细胞。本发明所用的宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，或真核细胞如酵母、植物、昆虫、两栖动物，或哺乳动物细胞。
如在此所用的，活性剂的“有效量”或“药物学上的有效量”指的是通过给药一个或多个药物学剂量单位足够得到可测量的靶细胞或患者生理参数的改变和/或提供或调节活性剂表达或活性的量。这样的有效量可以根据他们的情况、高度、体重、年龄，和/或健康、活性剂(例如，尿素酶或尿素酶抑扬调节剂)给药的方式、给药的特别活性剂，以及其它因素而个人对个人地改变。因此，在一组特别的情况下对于特别的病人以经验为主地决定有效量是有用的。
在此所引用的所有群体和病人特意在此并入作为参考，用于描述和公开可以与本发明结合使用的组合物和方法的目的。
II. 本发明的组合物
一方面，本发明包括含有尿素酶作为活性剂用于抑制癌细胞生长的组合物。如以下所述的，化学整体可以和活性剂联合使用来提高活性剂至癌细胞的传递。已经发现如在此所述的将病人的癌细胞接触尿素酶提供了对病人癌症的有效治疗。癌细胞可以包括于肿瘤例如实性或半实体肿瘤中。或者，癌细胞可以在患者血流循环中。
癌症、肿瘤和/或瘤包括细胞或组织的新生长，其中细胞增殖是不受控制的和递增的。一些这样的生长是良性的，但是其它的称为“恶性的”将导致有机体的死亡。恶性肿瘤与良性生长区分开来，由于除了显示浸润的细胞增殖，癌症侵略周围的组织并转移。此外，恶性肿瘤表征为它们显示了其组织相对于另一个与它们周围的组织分化的较大丢失。
以下考虑的是本发明组合物中包括的成分。
尿素酶
如以上所示，组合物中的活性剂是尿素酶。尿素酶可以是任何来源的，包括，例如，细菌、植物、真菌和病毒。一些研究已经提供了关于来自各种进化不同的细菌、植物、真菌和病毒的尿素酶遗传学的详细信息(Mebley，H.L.T等(1995)Microbiol.Rev，59：451-480；Eur.J.Biochem.，175，151-165(1988)；Labigne，A.(1990)国际公布No.WO90/04030；Clayton，C.L.等，(1990)Nucleic Acid Res.18，362；以及美国专利No6,248,330和5,298,399，每个在此并入作为参考)。特别值得注意的是植物中发现的尿素酶(Sirko，A.和Brodzik，R.(2000)Actabiochim Pol 47(4)：1189-95)。植物尿素酶的一个实例是刀豆尿素酶，在实施例2-3中描述。刀豆尿素酶氨基酸序列的实例由SEQ ID NO：7来表示。
有用的尿素酶序列可以在公众数据库中鉴定，例如，Entrez(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/)。此外，用于来自多种有机体尿素酶扩增的引物，可以利用如Baker，K.M.和Collier，J.L所描述的(http：//www.science.smith.edu/departments/Biology/lkatz/NEMEB_webpage/abstracts.html)或使用如Rose，等(1998)在Nucleic Acid Res.26：1628中所描述的CODEHOP(共有区简并杂交寡核苷酸引物)。
尿素酶可以接触处于胞外环境或围绕肿瘤细胞胞间液中的肿瘤细胞，或在癌细胞内或邻近癌细胞的细胞内表达。不希望通过结合任何特异性分子机理成为尿素酶成功抑制癌细胞生长的基础，通过将尿素酶加入患者的胞间液中，尿素酶化合物可以提高癌细胞浸泡在其中的胞间液的pH。尿素酶可以将底物尿素转化为胺和氨基甲酸盐。酶活性可以提高pH使环境碱性更强(图1A-1D)。围绕癌细胞的环境是典型的酸性(Webb，S.D.，等(2001)Novartis Found Symp 240：169-81)。因此，通过以这样的方式提高胞外环境的pH，抑制了癌细胞的生长。因此，本发明特定实施例中活性剂的添加导致以约0.1pH单位提高了胞间液的pH，例如，0.1-0.5pH单位或更高。
因此，本发明的活性剂包括天然产生形式的尿素酶及其功能上的活性变体。考虑了两种常见类型的氨基酸序列变体。氨基酸序列变体是在特定氨基酸中具有一个或多个取代而没有破坏尿素酶活性的那些。这些变体包括沉默变体和基本上与天然蛋白质同源以及功能上等价的保守修饰变体。当其氨基酸序列的至少约80％，更优选至少约90％，甚至更优选至少约95％，还是更优选约98％，以及最优选至少约99％和天然蛋白质的氨基酸序列一致时，天然蛋白质的变体和天然蛋白质是“基本上同源”的。变体可以尽可能少的有1个或高达10个或更多个氨基酸的不同。
变体的第二个类型包括从尿素酶活性片段分离的尿素酶的大小变体。大小变体可以通过例如化学修饰、蛋白酶消化，或其组合来将尿素酶分段而形成。此外，遗传工程技术，以及从氨基酸残基直接合成多肽的方法，也可以用来产生大小变体。
通过“功能等价”将变体序列定义为产生具有和天然尿素酶基本上相同生物活性蛋白质的链。本发明也包括这样的包含基本序列变化的功能等价变体。因此，天然尿素酶蛋白质的功能等价变体具有用于治疗的足够的生物活性。在本领域可获得用于测定功能等价的方法。使用特地设计用于测量天然尿素酶蛋白质活性的试验可以测定生物活性，如实施例3。此外，提高对抗生物活性天然蛋白质的抗体可以检测它们结合功能等价变体的能力，其中有效的连接用具有和天然蛋白质相同构象的蛋白质来表示。
本领域普通技术人员可以认知的是由于遗传密码的简并，可以产生很多编码本发明尿素酶多肽的核酸序列，其中一些具有和公知尿素酶核酸序列的最小序列同源性。以下讨论，这样的“沉默变化”是“保守修饰变化”的一种。本发明提供了编码本发明多肽的核酸序列的每一个可能的变化，其由基于可能的密码子选择的选择组合而获得的。这些组合根据标准的三个一组遗传密码而获得，用于编码本发明尿素酶蛋白质多肽的核酸序列。
本发明的尿素酶多肽包括公知尿素酶多肽序列的一个或多个保守修饰变化(或简单地“保守变化”)。这样的保守变化包括改变、增加或删除单个氨基酸或小百分数氨基酸的取代、增加或删除。本领域普通技术人员可以认识到序列中取代、删除，或增加单个氨基酸或小百分数氨基酸(通常低于5％，通常更低于4％，2％，1％，或更低)的个别取代、删除，或增加通常构成了保守性变化，其中这样的改变导致氨基酸的删除、氨基酸的增加，或氨基酸的取代而获得化学性质上相似的氨基酸。
提供功能相似氨基酸保守取代的表格是本领域普通技术人员公知的。表1列出了6组包含彼此保守取代或保守变化的氨基酸。
表1.保守取代组
    1     丙氨酸(A)     丝氨酸(S)     苏氨酸(T)
    2     天冬氨酸(D)     谷氨酸(E)
    3     天冬酰胺(N)     谷氨酰胺(Q)
    4     精氨酸(R)     赖氨酸(K)
    5     异亮氨酸(I)     亮氨酸(L)     甲硫氨酸(M)     缬氨酸(V)
    6     苯丙氨酸(F)     酪氨酸(Y)     色氨酸(W)
氨基酸的其他组合也可以制成表。例如，氨基酸可以通过相似功能或化学结构或组合物来分组(例如，酸性、碱性、脂肪族的、芳香族的、含硫的)。例如，脂肪族的组合可以包括：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸。含有彼此保守取代氨基酸的其他组合包括以下的：(i)芳香族：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；(ii)含硫的：甲硫氨酸、半胱氨酸；(iii)碱性：精氨酸、赖氨酸、组氨酸；以及(iv)酸性：天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺。参见Creighton(1984)蛋白质，W.H.Freeman和Company，氨基酸的其他组合。
本发明的尿素酶蛋白质序列，包括保守取代序列，可以以较大多肽序列的部分存在，如一个或多个结构域的添加用于纯化蛋白质(例如，聚合组氨酸片段，FLAG标记片段，等等)，例如，其中添加的功能域对蛋白质的尿素酶蛋白质部分的活性影响很小或没有，或其中添加的域可以通过后续合成处理步骤来去除，如通过用蛋白酶来处理。
不会改变本发明核酸分子编码活性的一个或多个核酸或序列的添加，如非功能序列的添加，是碱性核酸分子的保守性变化，且不会改变本发明多肽活性的一个或多个氨基酸残基的添加是碱性多肽的保守性变化。这样类型的添加都是本发明的特征。本领域普通技术人员可以认知到所公开的核酸构建体的许多保守性变化产生了功能上同一的构建体。
可以使用各种测定序列相关性的方法，包括人工排序，和计算机辅助排序和分析。由于通过计算机辅助方法获得了增加的生产能力，后者的方法在本发明中是优选的方法。进行排序的各种计算机程序是可获得，或通过本领域普通技术人员制得。
如上所述，用于本发明的核酸和多肽序列(及其片段)与本发明的尿素酶多肽或核酸分子(或其片段)或相关分子的相应序列不需要是同一的，但可以是基本上同一的(或基本上相似)。例如，多肽可以接受各种改变，如一个或多个氨基酸或核酸的插入、删除，和取代，保守性的或非保守性的，包括其中，例如，这样的改变可能在其使用中提供特定的优势，例如，在它们治疗或预防用途中或给药或诊断应用中。
相对短的(少于约30个残基)氨基酸序列的排列和比较通常是简单的。较长序列的比较需要更多的复杂的方法来获得两个序列的最佳排序。用于排列比较窗口的序列最佳排序可以通过Smith和Waterman(1981)Adv Appl Math 2：482的局部同源算法，Needleman和Wunsch(1970)J Mol Biol 48：443的同源排序算法，Pearson和Lipman(1988)Proc Nat’l Acad Sci USA 85：2444的对于相似性方法的研究，通过这些算法的计算机执行(Wisconsin Genetics Software PackageRelease7.0中的GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA，遗传学计算机组，575 Science Dr.，Madison，Wis.；和BLAST，参见，例如，Altschul等，(1977)Nuc Acid Res 25：3389-3402和Altschul等，(1990)J Mol Biol215：403-410)来操作，或通过由选择的各种方法产生的最佳排序来检查(即，导致在比较窗口序列相似性或序列同一性的最高百分比)。
适用于测定序列同一性百分数(同一性百分数)和序列相似性的算法实例是FASTA算法，其在Pearson，W.R.& Lipman，D.J.(1988)ProcNat’l Acad Sci USA 85：2444中得到描述。还可以参见W.R.Pearson，(1996)Methods Enzymology 266：227-258。最佳化DNA序列的FASTA排序中使用的来计算同一性百分数的优选参数，BL50矩阵15：-5，k-元组＝2；joining penalty＝40，最佳化＝28；gap penalty＝-12，gap length penalty＝-2，以及width＝16。
本领域普通技术人员可以理解的是，上述研究和排序算法的讨论也可以用于鉴定和评价多核苷酸序列，包含核苷酸序列的疑问序列的取代，和其中核酸数据库选择的认知。
B. 相关化学整体(chemical entity)
本发明的组合物可以包括化学整体，其和活性剂联合来提高活性剂至癌细胞的传递。如以下所述的多种相关化学整体都可以使用。
B1. 聚合物
化学整体可以包括聚合物，包括，例如亲水性聚合物和疏水性聚合物，优选亲水性聚合物。如在此所用的术语“亲水性”指的是组合物、物质或原料，例如，聚合物，其通常可以和水轻易地结合。因此，尽管本发明使用的亲水性聚合物可以具有不同类型的结构域，例如，更亲水的结构域或更疏水的结构域，亲水性聚合物的总体特性优选是亲水的，当然可以理解该亲水性可以改变，从相对高的亲水性至相对低的亲水性的连续穿越。
多种聚合物可以用于本发明的组合物和制剂中。通常如在此所述的，聚合物是具有所期望的亲水性和/或疏水性的，且其可以形成基质，以及和目标配体共价连接。聚合物可以是交联的或非交联的。如在此所用的术语“交联(crosslink)”、“交联的(crosslinked)”和“交联(crosslinking)”通常指的是两个或更多化合物或物质通过一个或多个桥梁的交联，例如，聚合物。桥梁，其可以由一个或更多元素，基团或化合物组成，通常用来从第一个化合物或物质分子的原子连接至第二个化合物或物质分子的原子。交联桥可以包括共价和/或非共价连接。任何一种元素，基团和/或化合物可以形成交联桥，以及化合物或物质可以天然或通过合成方式来交联。
根据特定实施例，不管线性的、星形的或分支的聚合物，可以选自聚烷撑氧、聚烷撑亚胺、聚烷撑胺、聚硫化亚烃、聚烷撑磺酸盐、聚亚烃砜、聚(亚烃基硫酰烯化亚胺)及其共聚体。
如上所述，根据使用的特定聚合物，聚合物可以是相对更亲水性的或相对更疏水性的。，合适的相对更亲水性聚合物的实例包括，但不限制于，聚乙二醇、聚丙二醇、支链聚乙烯亚胺、聚烯吡酮、聚交酯、聚(交酯-共-乙交酯)、聚山梨酸酯、聚环氧乙烷、聚(环氧乙烷-共-环氧丙烷)，聚(乙氧基化的)丙三醇、聚(乙氧基化的)山梨糖醇、聚(乙氧基化葡萄糖)、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟乙基噁唑啉、聚羟丙基噁唑啉、聚乙烯醇、聚(羟烷基羧酸)、聚羟乙基丙烯酸、聚羟丙基异丁烯酸、聚羟基戊酸盐、聚羟基丁酸盐、聚唑烷、聚天冬酰胺、聚唾液酸，及其衍生物、混合物和共聚物。
因此，优选亲水性的聚合物，可以连接至活性剂，或在此公开的其他相关的化学整体来提高活性剂至癌细胞的传递。聚合物-活性剂结合体优选以相对于天然或非衍生的活性剂有效地延长所述组合物的血液循环时间和/或降低了抗原性和/或免疫原性的量来给药。特别优选的亲水性聚合物包括，但不限制于，聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯甲醚、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚羟丙基甲基丙烯酸酯、聚羟乙基丙烯酸酯、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟乙基噁唑啉、聚羟丙基噁唑啉、聚天冬酰胺，和/或亲水性纤维素衍生物。优选的亲水性聚合物是具有例如分子量约1,000至10,000道尔顿的聚乙二醇。在一个实施方案中，聚乙二醇具有1,000至5,000道尔顿的分子量。其他打算用于本发明的聚合物在U.S.在前公开No.20020041898中有更详细的讨论，2002年4月11日公开，在此并入作为参考。
B2. 靶向部分
靶向部分用作本发明的化学整体，并连接至所定义的，选择的细胞类型或靶细胞群体，如癌细胞。在这点上有用的靶向部分包括抗体和抗体片段、肽，和激素。对应已知细胞表面受体的蛋白质(包括低密度的脂蛋白、铁传递蛋白和胰岛素)、纤维蛋白溶酶、抗-HER2、血小板结合蛋白如膜联蛋白，以及生物反应调节物(包括白细胞间介素、干扰素、促红细胞生成素和集落刺激因子)也是靶向部分。寡核苷酸，例如和靶细胞核酸的一部分互补的反义寡核苷酸，可以用作本发明的靶向部分。靶向部分也可以是结合至靶细胞表面的寡核苷酸。上述列出靶向部分的保持和所定义靶细胞群体结合能力的类似物也可以用作靶向部分。
上述靶向部分的功能等价物也可以用作本发明的靶向部分。靶向部分功能等价物的实例是有机化学构建体，设计来模拟正确构造和/或方向用于靶向部分靶细胞结合。另一个靶向部分功能等价物是显示了靶向部分结合亲和性的短肽。
本发明优选的靶向部分是抗体、肽、寡核苷酸等等，其和靶细胞表面上的抗原反应。可以使用可购得的或在文献中描述的多克隆和单克隆抗体。抗体可以是整个抗体或其片段。单克隆抗体和片段可以根据常规技术制得，如杂交瘤合成、重组DNA技术和蛋白质合成。有用的单克隆抗体和片段可以源自任何物种(包括人类)或形成如使用了来自多于一个物种序列的嵌合体蛋白质。
本发明的在一个实施方案中，人单克隆抗体或人化的鼠抗体用作靶向部分。人化的靶向部分能够减少宿主接受者的抗体或多肽的免疫反应性，使半衰期增加并减少不利的免疫反应。可以通过例如将编码鼠Fv区域的核苷酸序列或其互补的决定区域和编码人恒定结构域和Fc区域的核苷酸序列遗传重组来人化鼠单克隆抗体。鼠残基还可以保留在人可变区域框架结构域来保证正确的靶位点结合特性。靶向部分的一个非限制性实例是脑胶质细胞(α-2-糖蛋白)的抗a-2-GP抗体，其在Slepnev等，Bioconjugate Chem.3：273-274(1992)中得到描述。用于各种活性剂至癌细胞释放的遗传工程抗体在Bodey，B.(2001)ExpertOpin Biol.Ther.1(4)：603-17中有评述。
本发明的另一个实施方案中，靶向部分是和靶细胞表面上的受体反应的配体。因此，靶向部分可以包括但不限制于具有细胞结合成分亲和性的激素、通过细胞结合成分认定的含有碳水化合物部分的任何分子，以及结合细胞结合成分的药物或小分子。词组“结合成分”包括受体和接受体分子。优选，结合成分是细胞表面结合成分。在一个实施方案中，靶向部分是结合至靶位点的天然产生的蛋白质，如胰岛素。细胞因子，包括白细胞间介素和如粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和肿瘤坏死因子(TNF)的因子也是特异性的靶向部分，已知结合至其受体高水平表达的特异性细胞(Terlikowski，SJ(2002)Toxicology 174(3)：143-152)。
为了减少尿素酶或其他活性剂接触非靶细胞或组织，可以筛选靶向部分来鉴定显示了最小非靶活性的那些，而保持靶特异性和活性。通过减少非靶接触(以及不利的非靶定位和/或毒性)，可以增加给药的尿素酶或其他活性剂的剂量。为了最大化靶细胞的接触，允许尿素酶或其他治疗剂的最高可能浓度的给药，而保持低于不能接受的非靶细胞毒性的极限。
本发明的特定实施例中，使用两个或多个活性剂-靶向部分结合体，其中每个结合体包括不同的靶向部分，例如，不同的抗体特异性。每个所用的靶向部分结合至不同靶位点区域，可以联合相同或不同的靶位点。每个给药结合体的活性剂成分可以是相同的或不同的。参见，例如，U.S.专利No.4,867,962和5,976,535，在此将每个并入作为参考。在本发明这个实施例的实施中，提高了连接至靶位点活性剂的靶位点增加，因为每个靶向部分，例如，抗体特异性，认知不同的靶位点区域，例如，靶位点抗原决定部位。这种选择靶位点区域的方法提供了用于活性剂的靶位点接合点的更多可能。因此，例如通过抗原决定部位饱和度和/或位阻，可以避免实际或有效的靶位点饱和度。因此，可以完成活性剂例如尿素酶的添加累积。或者，或结合其他尿素酶特异性基因产物可以用作例如用于靶位点催化活性全酶产生的活性剂。尿素酶脱辅基酶的实例包括由细菌ureABC基因编码的γ、β和α亚基(Burne，R.A.和Chen，Y.M.(2000)Microbes and Infection2：533-542)。
可以分析用于直接对抗特定靶位点的单克隆抗体的交叉反应模式来鉴定一系列两个或多个靶特异性单克隆抗体，和非重叠交叉反应用于诊断或治疗应用中。词组“交叉反应的非重叠模式”表明通过一个抗体种类结合的非靶组织基本上不同于通过另一个抗体种类结合的非靶组织。交叉反应模式与用于治疗应用的成比例减少活性剂接触必需的程度不同。优选较少的抗体对(或较大系列的抗体)重叠。
可以通过各种方法来筛选抗体。可以使用免疫组织化学分析来测定靶组织的反应性和非靶组织的交叉反应性。结合抗体种类的组织可以通过将组织接触于抗体来得到鉴定；洗涤组织来除去任何未结合的抗体；并检测结合抗体的存在。活体外组织化学的程序是本领域公知的。参见，例如，Sanchez-Islas，E.和Leon-Olea，M.(2001)Nitric Oxide5(4)：302-16。
本发明的组合物还可以用于hCG-分泌肿瘤的治疗。因为胎盘滋养层是hCG合成的正常位点，可以理解妊娠期或非妊娠期滋养层肿瘤合成和分泌hCG。当然，hCG测定对于这些肿瘤的诊断、肿瘤的病期，以及用于监控治疗效果已经十分有用。此外，一些非滋养层肿瘤可以异位产生hCG。hCG可以作为一些肿瘤的生长因子(Melmed S.和Braunstein GD：Human chorionic gonadotropin stimulates proliferation ofNb 2 rat lymphoma cells.J.Clin.Endocrinol.Metab 56：1068-1070，(1983))。参见，例如，U.S.专利No.6,448,022，在此并入作为参考。
因此，根据本发明的一个实施例，使用抗-hCG抗体将活性剂对准hCG-分泌肿瘤来抑制hCG-分泌肿瘤的生长。因此，特定实施例中，本发明的化学整体是连接至活性剂的靶向部分，并且是抗肿瘤抗原抗体、抗hCG抗体或可以特异性结合至癌细胞表面受体的配体。优选，靶向部分是连接尿素酶形成融合蛋白的多肽。
如上所述，根据本发明的一个实施例，活性剂直接连接至靶向部分。或者，根据本发明的另一个实施例，使用两步或三步方法将活性剂传递至癌细胞。因此，活性剂可以包括能够和第二结合部分相互作用的第一结合部分，且化学整体可以包括含有第二结合部分的靶向部分。这些实施例在以下的部分III有更详细的描述。
本领域普通技术人员认识到本发明的靶向部分和活性剂可以以任何顺序连接在一起。因此，其中靶向部分是多肽，活性剂可以连接至靶向分子的氨基或羧基端。靶向部分还可以连接至活性剂的内部区域，或相反地，活性剂可以连接至靶向部分的内部区域，只要连接不会影响分子各自的活性。
靶向部分和活性剂可以通过本领域普通技术人员公知的任何数量的方式来连接。通常，活性剂直接或通过连接子(隔离物)连接至靶向部分。然而，当靶向部分和活性剂都是多肽，优选重组表达作为单链融合蛋白的嵌合体分子。
在一个实施方案中，靶向部分(例如，ahEGFR IgG Ab)是化学连接至活性剂或化学整体(例如，药物、尿素酶或脂质体)。化学连接分子的方式是本领域普通技术人员公知的。
将试剂连接至抗体或其他多肽靶向分子的程序可以根据试剂的化学结构而改变。多肽通常含有各种功能基团；例如，羧酸(COOH)或自由胺基(-NH2)，其可以和活性剂上的合适功能基团反应，将其连接至靶向部分。
或者，可以将靶向部分和/或活性剂衍生以接触或连接其它的活性功能基团。衍生可以包括任何数量的连接子分子连接如那些可从PierceChemical Company，Rockford III获得的。
如在此所用的“连接子”是用于将靶向部分连接至活性剂的分子。连接子可以形成同时连接至靶向部分和活性剂的共价键。合适的连接子是本领域普通技术人员公知的，包括但不限制于，直链或支链碳连接子、杂环碳连接子，或肽连接子。当靶向部分和活性剂是多肽时，连接子可以通过它们的侧基连接至组成的氨基酸(例如，通过二硫化物连接子连接至半胱氨酸)。然而，在优选实施例中，连接子可以连接至氨基酸末端的α碳氨基和羧基。
具有一个与特定试剂上基团反应的功能性基团和另一个与抗体反应的基团的双重功能连接子可以用于形成所期望的免疫连接。或者，衍生可以包括靶向部分的化学处理，例如，用高碘酸盐进行糖蛋白抗体的糖部分的乙二醇分裂来产生自由的醛基。抗体上的自由醛基可以和试剂上自由的胺基或肼基反应来将其结合至试剂。(参见美国专利No.4,671,958)。如抗体或抗体片段的多肽上自由巯基的产生程序也是已知的(参见美国专利No.4,659,839)。
用于各种化合物包括放射性核素金属螯合物、毒素和药物至蛋白质如抗体的许多程序和连接子分子是已知的(参见，例如，欧洲专利公开号No.188,256，美国专利No.4,671,958，4,659,839，4,414,148，4,699,784；4,680,338；4,569,789；和4,589,071；以及Borlinghaus等，(1987)Cancer Res.47：4071-4075)。尤其是，各种抗毒素的产生是本领域公知的且例如在“Monoclonal Antibody-Toxin Conjugate：Aiming the MagicBullet，”Thorpe等，Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine，Academic出版，pp.168-190(1982)，Waldmann(1991)Science，252：1657，美国专利No.4,545,985和4,894,443中找到。
在一些情况中，当嵌合体分子已经到达其靶位点时，所期望的是从靶向部分释放活性剂分子。因此，当效应物在靶位点释放时，可以使用包含靶位点邻近可裂连接的嵌合结合体。将试剂从靶向部分释放的连接断裂可以通过酶活性或结合体在靶细胞内部或靶位点邻近的条件来激起。合适的是当靶位点是肿瘤时，在肿瘤位点存在的条件下可以使用可分裂的连接子(例如，当接触肿瘤相关的酶或酸性pH时)。
一些不同的可分裂的连接子对本领域技术人员是公知的(参见美国专利No.4,618,492，4,542,225，和4,625,014)。从这些连接子基团释放活性剂的机理包括，例如对光不稳定键的照射和酸催化的水解。例如美国专利No.4,671,958，包括免疫结合体的描述，该免疫结合体含有在体外靶位点通过病人补体系统的蛋白水解酶可分裂的连接子。鉴于已经报道了大量用于将各种放射诊断化合物、药物、毒素，和其它试剂连接至靶向部分的方法，本领域普通技术人员能够决定合适的方法用于将所给的试剂连接至所选的靶向部分。
当靶向部分和/和活性剂是相对短的，它们可以使用标准化学肽合成技术来合成。当两个分子都是相对短的，可以以单个邻接的多肽来合成嵌合体分子。或者，靶向部分和活性剂可以分开合成，然后通过一个分子氨基末端和另一个分子羧基末端的缩聚来融合，因此形成肽键。或者，靶向部分和活性剂分子可以由每个和肽间隔物分子的一端缩聚，因此形成邻接的融合蛋白。
其中氨基酸序列的C-端是连接至不溶的支持物，接着通过序列中残余氨基酸连续添加的固相合成是用于本发明多肽化学合成方法的一个实例。用于固相合成的技术由Barany和Merrifield，Solid-Phase PeptideSynthesis；pp.3-284，在The Peptide：Analysis，Synthesis，Biology中，Vol.2：Special Methods in Peptide Synthesis，Part A.，Merrifield，等，J.Am.Chem.Soc.，85：2149-2156(1963)，和Stewart等，Solid Phase Peptide Synthesis，第二版，Pierce Chem.Co.，Rockford，III.(1984)得到描述。
在优选实施例中，本发明的嵌合体融合蛋白使用重组DNA技术来合成。通常，这包括形成编码融合蛋白的DNA序列，在特定启动子控制下将DNA放入表达盒中，在宿主中表达蛋白质，将表达的蛋白质分离，以及如果需要，将蛋白质复性。
本发明编码融合蛋白的DNA可以通过任何合适的方法制得，包括，例如，适当序列的克隆和限定或直接化学合成通过如Narang等，(1979)Meth.Enzymol.68：90-99的磷酸二酯方法；Brown等，(1979)Meth.Enzymol.68：109-151的磷酸二酯方法；Beaucage等(1982)Tetra.Lett.，22：1859-1862的二乙基氨基磷酸盐方法；以及美国专利No.4,458,066中的固体支持物方法。
化学合成产生单链寡核苷酸。这可以通过互补序列杂交转化为双链DNA，或使用单链DNA作为模板用DNA聚合酶聚合。本领域普通技术人员可以认识到DNA的化学合成是受限于约100个碱基的序列，较长序列可以通过较短序列的连接反应而获得。
或者，可以克隆亚序列并使用合适的限制性内切酶将合适的亚序列分开。然后将片段连接来产生所需要的DNA序列。
而两个分子优选基本上直接连接在一起，本领域普通技术人员可以认识到可以通过由一个或多个氨基酸组成的肽间隔物来分隔分子。通常该间隔物不具有特异性生物活性除了连接蛋白质或保持最小距离或其它它们之间的空间关系。然而，间隔物的组成氨基酸可以选来影响分子的一些特性，如折叠、净电荷，或疏水性。
编码融合蛋白的核酸序列可以在各种宿主细胞中表达，包括大肠杆菌、其它细菌宿主、酵母，以及各种较高等的真核细胞如COS、CHO和HeLa细胞系以及骨髓瘤细胞系。重组蛋白质基因可以可操作地连接至每个宿主的合适表达控制序列。对于大肠杆菌这包括启动子如T7、色氨酸，或λ启动子，核糖体结合位点和优选转录终止信号。对于真核细胞，控制序列将包括启动子和优选源自免疫球蛋白的增强子，SV40、细胞肥大病毒，等等，和聚腺苷酸化序列，以及可以包括剪接供体和受体序列。
可以通过公知的方法如对于大肠杆菌氯化钙转化和对于哺乳动物细胞磷酸钙处理或电穿孔将本发明的质粒转移进所选的宿主细胞。可以通过质粒上包含的如amp、gpt、neo和hyg基因给予的抗生素抗性来选择质粒转化的细胞。
一旦表达，可以根据本领域的标准程序将重组的融合蛋白纯化，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等等(参见，R.Scopes(1982)Protein Purification，Springer-Verlag，N.Y.；Deutscher(1990)Methols inEnzymology Vol.182：Guide to Protein Purification，Academic出版有限公司，纽约)。用于制药基本上纯化组合物优选至少约90至95％均一性，最优选98至99％或更高均一性。一旦纯化至部分地或所期望的均一性，然后可以将多肽用于治疗。
本领域普通技术人员将认识到化学合成、生物表达，或纯化后，目标融合蛋白可以具有基本上不同于组成多肽的天然构象的构象。在这种情况下，必需来变性和还原多肽，然后使多肽再重叠成优选的构象。还原和变性蛋白质以及诱导再重叠的方法是本领域普通技术人员公知的(参见，Debinski等，(1993)J.Biol.Chem.，268：14065-14070；Kreitman和Pastan(1993)Bioconjug.Chem.，4：581-585；以及Buchner等，(1992)Anal.Biochem.，205：263-270)。
本领域普通技术人员将认识到可以修饰目标融合蛋白而没有消除它们的生物活性。一些修饰可以有助于靶向分子进入融合蛋白的克隆、表达，或合并。这样的修饰是本领域普通技术人员公知的，包括例如在氨基端添加甲硫氨酸来提供起始位点，或将其他的氨基酸放置在任一端来创造方便定位的限制性内切位点或终止密码子。
B3. 包裹的活性剂
特定实施例中，本发明涉及小泡如脂质体和/或纳米胶囊作为化学整体用于活性剂如尿素酶传递至癌细胞的使用。这样的制剂优选用于在此所公开的多肽、药物，和/或抗体的药物学上可接受制剂的导入。脂质体的配制和使用通常是本领域普通技术人员公知的。(参见，例如，Backer，M.V.，等(2002)Bioconjug Cheml 3(3)：462-7)。优选实施例中，公开的组合物可以包载于脂质体中。
纳米胶囊通常可以以稳定和可再生的方式包载化合物(Whelan，J.(2001)Drug Discov Today 6(23)：1183-84)。为了避免由于胞内聚合的超负荷引起的副作用，使用可以在体外降解的聚合物来设计这样超细的颗粒(大小约0.1μm)。符合这些要求的可生物降解的聚异丁基氰基丙烯酸酯毫微粒子可以用于本发明，且这样的颗粒是易制造的，如在Lambert，G.，等(2001)Int J Pharm 214(1-2)：13-6中描述的。含有生物活性基质的聚烷基氰基丙烯酸酯毫微粒子的制备方法及其使用描述于美国专利No.4,329,332，4,489,055和4,913,908中。纳米胶囊是可购得的从如Capsulution，Inc.( www.capsulution.com)。
用于活性剂传递的含有纳米胶囊的药物组合物描述于美国专利No.5,500,224，5,620,708和6,514,481中。美国专利No.5,500,224描述了纳米胶囊胶体悬浮液形式的药物组合物，含有基本上由其中溶解表面活性剂的油组成的油质相，以及悬浮其中的大量纳米胶囊具有小于500纳米的直径。美国专利No.5,620,708描述了用于药物和其他活性剂给药的组合物和方法。组合物包括连接至结合部分的活性剂载体颗粒，其特异性地结合至存在于哺乳动物真核细胞表面上的靶分子。结合部分通过足够启动特定活性剂载体胞吞或吞噬作用的结合亲和性或亲合力连接至靶分子，以致载体通过肠上皮细胞吸收。然后活性剂从载体中释放至宿主的系统循环中。这样，可以避免降解敏感药物如多肽在肠道内的降解，而来自肠道的蛋白质和多肽的吸收增加。或者，本发明涉及活性剂在靶细胞周围环境中的释放。例如，在一个实施方案中，接着靶向部分结合至靶细胞，尿素酶从纳米胶囊中释放，以致尿素酶释放进入靶细胞如肿瘤细胞周围的微环境。美国专利No.6,379,683和6,303,150描述了纳米胶囊的制造方法及其使用，在此并入作为参考。
因此，本发明的一个实施方案中，接触包括将含有靶向分子和通过所选电荷和与第二相反电荷的螺旋型肽反应来形成稳定的α螺旋卷曲螺旋型杂二聚物的能力来表征的第一个螺旋型肽的结合体加入细胞。随后，将脂质体加入细胞。脂质体包括外表面和内部间隔；定位在脂质体的内部间隔中的活性剂如尿素酶；大量的第二肽，其中每个第二肽和脂质体的外表面连接。
另在一个实施方案中，以下将更详细描述，接触包括将脂质体加入细胞，其中脂质体具有以包裹形式的活性剂如尿素酶，脂质体的外表面包括有效地特异性连接至靶表面的细胞靶向部分，以及有效地遮挡靶向分子和靶表面反应的亲水性聚合物外壳。亲水性聚合物外壳可以由聚合物链制得，其通过可释放的键共价连接至脂质体中的表面脂成分。在该实施例中，以有效地导致所添加脂质体中一部分键基本上释放的量将释放剂加入癌细胞，因此将靶向部分暴露于靶表面。可释放的键可以是可还原的化学键如二硫化物、酯和肽键。优选，亲和性部分是有效地特异性结合至癌症特异性抗原。
根据本发明的这个实施例，获得了用于哺乳动物患者的基于脂质体的治疗方法。该方法包括给患者系统地给药例如间隔给药具有表面结合靶向部分和亲水性聚合物外壳的脂质体。由可释放的连接聚合物链组成的亲水性聚合物外壳有效地遮挡了靶向部分和其目标的反应。在上面讨论了优选的亲水性聚合物。给药的脂质体允许系统地循环直至获得所期望的脂质体的体内分解。如以下所述，释放剂是以有效地导致相当大部分开裂的量给予患者，例如，给药脂质体中可释放键高于约50％，优选高于约70％，以及更优选高于约90％。亲水性聚合物链一释放就将靶向部分接触来和其目标反应。
优选实施例中，脂质体用于实体肿瘤的治疗。脂质体包括尿素酶以及任意地其它活性剂例如抗肿瘤药物，以包裹形式且通过有效地特异性连接至肿瘤特异性抗体的靶向部分来对准肿瘤区域。一个实例方法中，通过脂质体中含有的VEGF配体将脂质体对准肿瘤的血管内皮细胞，用于选择性地连接至在增生肿瘤内皮细胞上表达的Flk-1，2受体(Niederman，T.M.，等(2002)Proc Natl Acad Sci 99(10)：7009-14)。
优选，脂质体具有约30-400nm的大小。已经显示出在该大小范围内的脂质体通过存在于肿瘤脉管系统内皮细胞内层的“间隙”能够进入肿瘤(Maruyama，K，等，(1999)Adv Drug Deliv Rev 40(1-2)：89-102)。
接着脂质体的给药，例如静脉内给药，以及经过足够时间使脂质体在患者体内分布并连接至肿瘤后，将释放剂给予患者来从脂质体释放亲水性的表面外壳。表面外壳的释放是有效地将靶向部分接触使脂质体结合至靶细胞。在一个实施方案中，通过pH敏感键将亲水性表面外壳连接至脂质体。脂质体连接至肿瘤以后将键释放。
以上描述的任一实施例中的脂质体可以任意地包括一种或多种包载的抗肿瘤药物或显影剂或两者都有。在给药释放剂来释放亲水性表面外壳以接触连接的靶向部分和启动结合之后，可以加入脂质体并使其分布。因此，包载的抗肿瘤药物或显影剂或两者可以特异性地和定位给予目标。抗癌药物的实例描述于以下的部分IIIA。用于本发明方法中的显影剂实例描述于以下的部分IIIB。可以如美国专利No.6,043,094中描述的来制备脂质体和给药，其在此并入作为参考。
其它释放剂如美国专利No.6,180,114中描述的小单层脂质体(SUV’s)可以用于本发明，其在此以其整体并入作为参考。
B4. 活性剂调节剂
活性剂调节剂也用作本发明相关的化学整体。优选的活性剂调节剂是尿素酶抑扬调节剂。“尿素酶抑扬调节剂”是尿素酶抑制剂或尿素酶增强剂。组合物(例如，药物组合物)中的抑扬调节剂可以相应地选自尿素酶多核苷酸序列、尿素酶反义分子、尿素酶多肽、蛋白质、肽，或尿素酶生物活性的有机抑扬调节剂如抑制剂、拮抗剂(包括抗体)或促效剂的全部或部分。优选，在通过尿素酶表达或尿素酶活性为媒介或改良的医学情况处理中抑扬调节剂是有效的。
“尿素酶抑制剂”包括干涉以下情况的分子或分子群：(1)尿素酶的表达、修饰、调节、活化或降解；或(2)尿素酶的一种或多种正常功能，包括导致氨基甲酸盐和胺产生的尿素水解。当抑制剂通过静电或化学作用结合至尿素酶时，抑制剂“直接作用于尿素酶”。这样的作用可以由或不由其他分子作为介质。当其最大的瞬即效应是作用于影响尿素酶表达、活化或功能的尿素酶以外的分子时，抑制剂“间接地作用于尿素酶”。
尿素酶抑制剂用于减缓尿素至胺离子的转化。尿素酶抑制剂包括但不限制于异羟肟酸衍生物(例如，乙酰氧肟酸)、磷酰胺衍生物(例如，flurofamide)、磷酸盐、硫醇(例如，2-巯基乙醇等)、硼酸、卤素化合物(例如，氟化物等)，以及桂皮提取物。其它尿素酶抑制剂是本领域普通技术人员公知的且描述于美国专利No.4,824,783(1989年4月25日)，其在此并入作为参考。
“尿素酶增强剂”包括提高：(1)尿素酶的表达、修饰、调节或活化；或(2)尿素酶的一种或多种正常功能的分子或分子群。当增强剂通过静电或化学作用结合至尿素酶时，增强剂“直接作用于尿素酶”。这样的作用可以由或不由其他分子作为介质。当其最大的瞬即效应是作用于影响尿素酶表达、活化或功能的尿素酶以外的分子时，增强剂“间接地作用于尿素酶”。
C. 其它活性剂
其它活性剂也可以包括于本发明的组合物中。其它活性剂，例如抗肿瘤剂(对抗增生细胞有效的试剂)，也可以在细胞和第一活性剂接触之前、之中，或之后用于组合物中。例如，尿素酶已经击中肿瘤细胞后，其具有调整或调节肿瘤外部环境的能力，如通过pH改变。活性剂，例如，偏好碱性环境的抗肿瘤剂然后将更有效。
特定实施例中，能够通过尿素酶酶促处理的底物可以用作活性剂。优选，活性剂是尿素酶可以利用来形成胺离子的底物，如尿素。
抗肿瘤剂的实例包括细胞因子和其它部分，如白细胞间介素(例如，IL-2、IL-4、IL-6、IL12等等)，β转化生长因子、淋巴毒素、肿瘤坏死因子、干扰素(例如，γ-干扰素)、集落刺激因子(例如，GM-CSF、M-CSF等等)，血管通透因子、植物凝集素炎症反应促进剂(选择蛋白)，如L-选择蛋白，E-选择蛋白，P-选择蛋白，以及蛋白质的部分，如C1q和NK受体蛋白。其它合适的抗肿瘤剂包括抑制血管生成以及因此抑制转移的化合物。这样的试剂实例包括鱼精蛋白甲孕酮、戊聚糖聚硫酸盐、苏拉明、紫杉酚、反应停、制管张素、α-干扰素、金属蛋白酶抑制剂、血小板因子4、促生长素抑制素、血小板反应蛋白。根据本发明的有用活性剂的其它代表和非限制性的实例包括长春新碱、长春碱、白消安、苯丁酸氮芥、spiroplatin、顺氯氨铂、卡波铂、阿糖腺苷、乐疾宁、邻氯苯对氯苯二氯乙烷、甲基下肼、更生霉素(放线菌素D)、柔红霉素、盐酸吗啉吡咯酮、紫杉酚、普卡霉素、氨鲁米特、雌氮芥、氟他米特、leuprolide、甲地孕酮、三苯氧胺、睾内酯、曲洛司坦、安吖啶(m-AMSA)、天冬酰胺酶(L-天冬酰胺酶)、足叶乙甙、血液制品如血卟啉，或前述的衍生物。活性剂的其它实例包括遗传物质如天然或合成来源的核酸、RNA，和DNA，包括重组RNA和DNA。编码特定蛋白质的DNA可以用于许多不同类型疾病的治疗。例如，肿瘤坏死因子或白细胞间介素-2基因可以用来治疗进行性癌症；胸苷激酶基因可以用来治疗卵巢癌或乳腺癌；以及白细胞间介素-2基因可以用来治疗成神经细胞瘤、恶性黑素瘤或肾癌。其它可用于本发明的活性剂在美国专利No.6,261,537中描述，其整体在此并入作为参考。抗肿瘤剂和用于检测这样试剂的筛选在Monga，M.和Sausville，E.A.(2002)Leukemia 1 6(4)：520-6中有评论。
特定实施例中，活性剂是弱碱性抗肿瘤化合物，其效能是通过实体肿瘤中较高胞内/较低胞外pH梯度诱导的。弱碱性抗肿瘤化合物的实例包括阿霉素、柔红霉素、米托蒽醌、表柔比星、丝裂霉素、博来霉素、长春花属生物碱如长春碱和长春新碱、烷化剂如环磷酰胺和氮芥盐酸盐，以及antrineoplastic嘌呤和嘧啶衍生物。
本发明的在一个实施方案中，组合物包括尿素酶，以及基本上没有任何细胞因子，例如，肿瘤坏死因子和/或干扰素。在该实施例中，尿素酶单独，或和除了细胞因子以外的活性剂一起，优选结合小分子抗肿瘤剂，有效地来抑制癌细胞生长。因此，在该实施例中，组合物可以和或不和存在于将要治疗患者中的内源或天然细胞因子一起作用，但是给药的组合物没有包含其它内源细胞因子。
D. 显影剂
同样，显影剂也可以包括于组合物中或添加的组合物中。合适的显影剂包括可购得的用于正电子发射断层扫描(PET)、计算机辅助断层扫描(CAT)、单个光子发射计算机化的断层扫描、X-射线、荧光检查，以及磁共振成像(MRI)的试剂。
显影剂包括金属、放射性同位素和不透射线的试剂(例如，含有镓、锝、铟、锶、碘、钡、溴和磷的化合物)、射线可透过的试剂、造影剂、染料(例如，荧光染料和发色团)和催化比色或荧光反应的酶。通常，可以使用如上所述的各种技术来连接或包载这样的试剂，且可以存在于任何方向。参见，例如，美国专利No.6,159,443和6,391,280，在此特意将两者并入作为参考。
根据本发明的造影剂在显象方式中是有用的，如X-射线对比剂、光显像探针、自旋标记物或放射性单位。
用作MRI中造影剂的合适原料包括目前可获得的钆螯合物，如二乙撑三胺五乙酸(DTPA)和gadopentotate二甲葡胺，以及铁、镁、锰、铜，和铬。
CAT和X-射线有用的物质实例包括基于碘的物质，如由泛影葡胺和脑影酸盐为代表的离子单体、如碘异酞醇、isohexol和碘佛醇的非离子单体、如iotrol和iodixanol的非离子二聚物，以及离子二聚物，例如，ioxagalte。
空气和其它气体可以并入用于超声成像。这些试剂可以使用本领域可得的标准技术和可购得的设备得到检测。
根据本发明的一个实施例，癌细胞在和活性剂接触之前或之后，或之前和之后同时，与显影剂接触。例如，在尿素酶击中肿瘤细胞后，其可以例如通过pH改变而具有调整或调节肿瘤外部环境的能力。偏好碱性环境的显影剂然后将更有效。
基于发光三环萜镧螯合物和那些主要产生磁共振信号的显示出对pH改变敏感。用于感知pH改变的发光探针通常检测镧离子作为pH功能的荧光寿命的改变。类似地，通过pH改变调整水质子弛豫性能的磁共振造影剂用于本发明。在两种情况中，通过改变所给系统中的pH，可以预见提高反差的试剂。
因此，在癌细胞或附近使用pH敏感造影剂。癌细胞接触含有尿素酶的尿素酶组合物导致在癌细胞或附近的pH改变。这样，pH改变导致水质子核磁共振衰减特性或其它原子核在水介质中以pH反射方式改变。可以使用的pH敏感造影剂的实例包括那些含有镧系金属的试剂，如Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Db、Dy、Ho、Er、Tm、Yb，等等，或其它顺磁的元素，如Fe、Mn、17O，等等。可以使用的特异性造影剂包括H(2)(17)O，GdDOTA-4AmP(5-)，其在Magn ResonMed.2003年2月；49(2)249-57中有描述，以及铁(III)内消旋-四(4-磺化苯基)卟吩(Fe-TPPS4)，如在Helpern等(1987)Magnetic Resonance inMedicine 5：302-305和美国专利No.6,307,372中有描述，其在此并入作为参考。此外，基于Gd的聚离子也可用于本发明，如在Mikawa等，Acad.Radiol(2002)9(附录1)：S109-S1111中描述的。
作为其它的选择，可以提供位移试剂于癌细胞周围的水介质中。配置该位移试剂以致以pH反射方式影响水质子或其它原子核化学位移特性的pH改变。然后可以使用核磁共振测定活性剂是否是生物活性的来测定化学位移特性的改变。可以使用的位移试剂实例包括含有镧系金属的那些，如Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Db、Dy、Ho、Er、Tm、Yb，等等，或其它顺磁的元素。可以使用的特异性位移试剂的实例包括Tm(DOTP)(5-)、1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N’，N”，N-四(亚甲基磷酸酯)的铥(III)复合体，Dy(PPP)(2)(7)-镝三聚磷酸盐，等等。
本发明的在一个实施方案中，使用两个钆试剂的双造影剂策略，如pH不敏感的GdDOTP(5-)和pH敏感的GdDOTA-4AmP(5-)，可以用来通过MRI产生pH图，如在Magn Reson Med.(2003)二月；49(2)249-57中描述的。
用于PET扫描的优选试剂包括13N和氟去氧葡萄糖(FDG)。
E. 组合物制剂
如上所述，本发明的组合物包括活性剂以及任意地相关化学整体。例如，尿素酶多肽或尿素酶多核苷酸，和/或包括作为尿素酶表达或尿素酶活性抑扬调节剂有效的化学或生物化合物。此外，还可以包括生物相容的药物学载体、助剂，或赋形剂。
组合物还可以包括与赋形剂或其它药物学上可接受载体混合的其它核苷酸序列，多肽、药物，或激素。除了药物组合物以外的组合物任意地包含液体，即，水或水基液体。
加入药物组合物的药物学上可接受的赋形剂也是本领域普通技术人员公知的，且是容易获得的。赋形剂的选择部分地决定于用于给药本发明产品的特定方法。因此，存在多种合适的制剂用于本发明的上下文中。
用于药物组合物配制和给药的方法可以在Remington’sPharmaceutical Sciences，第19版，Williams&Wilkins，1995中找到，是本领域普通技术人员公知的。赋形剂的选择部分地决定于用于给药本发明产品的特定方法。因此，存在多种合适的制剂用于本发明的上下文中。以下的方法和赋形剂仅仅是实例，且决不是限制。
可以使用任何常规的方法来制造本发明的药物组合物，例如，混合、溶解、造粒、磨细、乳化、装入胶囊、包载、熔体纺丝、喷雾干燥，或冻干处理。然而，最佳药物配制由本领域普通技术人员根据给药途径和理想的剂量来决定。这样的配制可以影响给药试剂的物理状态、稳定性、体内释放率，以及体内清除率。根据将要治疗的情况，这些药物组合物可以如以下部分III所述的配制和给药。
药物组合物配制成含有合适的药物学上可接受载体，以及可以任意地包括赋形剂和助剂，有助于活性化合物进入药物学上可以使用的制剂中。给药的形式通常决定载体的性质。例如，用于非肠道给药的制剂可以含有水溶形式的活性化合物水溶液。适用于非肠道给药的载体可以选自盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水，和其它生理配伍溶液。用于非肠道给药的优选载体是生理配伍缓冲液如Hank’s溶液、Ringer’s溶液，或生理缓冲盐水。对于组织或细胞给药，适于渗透特定屏障的渗透剂用于制剂中。这样的渗透剂通常是本领域已知的。对于含有蛋白质的制剂，制剂可以包括稳定物质，如多元醇(例如，蔗糖)和/或表面活性剂(例如，非离子表面活性剂)，等等。
或者，用于非肠道使用的制剂可以包括制备成合适油质注射悬浮液的活性化合物悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂油如芝麻油，以及合成脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酸酯，或脂质体。水注射悬浮液可以含有增加悬浮液粘性的物质如羧甲基纤维素钠、山梨醇、或葡聚糖。任意地，悬浮液还可以含有合适的稳定剂或增强化合物溶解度的试剂来用于高度浓缩溶液的制备。可以使用乳浊液，例如水包油或油包水分散体，任意地通过乳化剂或分散剂(表面活性物质；表面活性剂)来稳定。如上所述的，含有活性剂的脂质体还可以用于非肠道给药。
或者，含有适于口服剂量试剂的药物组合物可以使用本领域公知的药物学上可接受载体来配制。用于口服的配制制剂可以是片剂、药丸、胶囊、药包、锭剂、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液，或粉末的形式。为了说明，用于口服使用的药物制剂可以通过将活性化合物和固体赋形剂结合而获得，任意地研磨所得的混合物，如果期望，在加入合适的助剂以后处理混合物的颗粒来获得片剂。口服试剂可以使用与那些描述的用于非肠道使用类型相似的液体载体，例如，缓冲水溶液、悬浮液，等等。
这些制剂可以包含一种或多种赋形剂，其包括，而无限制：a)稀释剂，如糖类，包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇，或山梨醇；b)粘合剂如硅酸铝镁，来自玉米、小麦、大米、土豆等的淀粉；c)纤维素物质如甲基纤维素、羟丙甲基纤维素，以及羧甲基纤维素钠、聚烯吡酮，树胶如阿拉伯胶和黄蓍胶，以及蛋白质如明胶和胶原；d)崩解剂或增溶剂如交联聚烯吡酮、淀粉、琼脂、海藻酸或其盐如海藻酸钠；或泡腾剂组合物；e)润滑剂如二氧化硅、滑石、硬脂酸或其镁或钙盐，以及聚乙二醇；f)食用香料和甜味剂；g)着色剂或色素，如，用于识别产物或表征活性剂的量(剂量)；以及h)其它配料如防腐剂、稳定剂、膨润剂、乳化剂、溶解促进剂、调节渗透压的盐，以及缓冲剂。
药物组合物可以以活性剂的盐来提供，其可以是和多种酸形成的，包括但不限制于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、马来酸、琥珀酸等。盐在水中或其它相应的自由碱基形式的质子性溶剂中更易于溶解。
如上所述，试剂自身的特性和试剂的剂型可以影响给药试剂的物理状态、稳定性、体内释放率，以及体内清除率。可以通过体外和体内临床前的研究来收集这样的药物动力学和药效的信息，随后在人临床试验过程中得到证实。进行基于动物体内数据的人类临床试验的指导可以从许多来源获得，包括，例如 http：//www.clinicaltrials.gov。因此，对于本发明方法中所用的任何化合物，可以从生化和/或基于细胞的试验初步估计哺乳动物尤其是人类中治疗有效的剂量。然后，可以配制动物模型中的剂量来获得所需的调节活性剂表达或活性的循环浓度范围。如所进行的人类研究，将进一步出现关于合适剂量水平和各种疾病与条件的治疗持续时间的信息。
这样化合物的毒性和治疗效能可以通过细胞培养物或实验动物的标准药物程序来测定，例如，用于测定LD50(群体50％的致死剂量)和ED50(群体50％治疗有效的剂量)。
III. 本发明的方法
本发明的另一个方面包括抑制癌细胞生长的方法。该方法使用以上部分II和/或以下部分IV-VII中所述组合物中的一种或多种成分。该方法包括使细胞接触作为活性剂的尿素酶，尿素酶以有效地抑制癌细胞生长的量。
A. 使癌细胞接触活性剂
尿素酶组合物，例如，尿素酶单独或尿素酶和有效地提高酶至癌细胞释放的化学整体结合，可以通过许多本领域公知的方法传递至癌细胞。在治疗应用中，以足够抑制癌细胞生长的量将将组合物给予具有癌细胞的病人。可以通过许多途径给药包括但无限制，非肠道、肠、穿过上皮、穿过粘膜、穿过皮肤，和/或外科，将本发明的药物组合物接触癌细胞。
非肠道给药形式包括那些其中组合物给药是通过例如，静脉内、动脉内、腹膜内、髓内、肌内、关节内、鞘内，以及心室内注射，皮下、生殖腺内或肿瘤内针弹丸注射，或延长持续的，脉动的或计划的灌注或使用合适泵技术的显微灌输。肠给药形式包括例如口服(包括口腔的和舌下的)和直肠给药。穿过上皮给药的形式包括例如穿过粘膜给药和穿过皮肤给药。穿过粘膜给药包括例如肠给药以及鼻、吸入，以及深肺给药、鞘给药，和直肠给药。穿过皮肤给药包括被动或主动穿过皮肤或经过皮肤的形式包括例如碎片和离子电渗疗法设备，以及浆、油膏，或药膏的局部滴施。外科技术包括植入贮存(储存)组合物、渗透泵，等等。
活性剂的单个或多个给药可以根据所需的剂量和频率以及患者的耐受性给药。无论如何，组合物应该提供足够量的本发明的活性剂来有效地治疗患者。
本领域普通技术人员可以认知到存在一些没有严重地血管化或由紧密连接的细胞和/或活性迁移机理保护的区域，其减少或防止了存在于血流中的大分子的进入。因此，例如，治疗神经胶质瘤或其它脑癌治疗法的系统给药可以通过血脑屏障来约束，其抵抗大分子进入蛛网膜下隙。在这些类型的肿瘤中，治疗组合物可以优选直接给予肿瘤位点。因此，例如，可以通过将治疗组合物直接给予肿瘤位点来治疗脑瘤，例如，通过弹丸注射、显微注射，或外科植入导管。
接触可以包括利用图像导向工具来观察癌细胞或肿瘤，例如，在Ehanced Magnetic Resonance Imaging，V.M.Runge编辑，C.V.Mosby公司(1989)用于MRI；例如EP188，256；Kozak等，TIBTEC 1986年10月，262；Radiotracers for Medical Applications，CRC出版社，Boca Raton，Fla.，用于放射诊断和/或放射治疗；Positron Emission Tomography of the Brain，Springer Verlag 1983，用于PET；以及在J.W.Nowicky等，“MacroscopicUV-Marking through Affinity”J.Tumor Marker Oncology 31，463-465(1988)中描述的。因此，任何一种诊断试剂可以并入组合物中，可以在给予病人后局部地或系统地传递并入的试剂。
如上所述的显影剂可以用来监控病人给药组合物后的肿瘤治疗。例如，他们通常在成像程序进行之前给药。其中所期望例如在药物动力学研究中，给药还可能是和成像同时发生的。对于定位靶位点所需的最佳时间段和最佳图象增强也可以随着活性剂和/或结合体和/或组织和/或成像方式而改变，也是常规可测定的。通常，活性剂从位点有效清除之前将发生显像，其时间段也可以通过本领域普通技术人员来常规测定。在特定实施例中，将在进行成像程序之前的15分钟至4小时时给药活性剂或结合体，因为如以下进一步的讨论，活性剂可以轻易地定位于其靶位点，然后任意地从那里轻易地清除。
本发明的在一个实施方案中，接触包括用能够检测患者组织细胞外pH改变的诊断工具来检查患者，并鉴定患者体内给药后胞外pH显示选定上升的组织区域。基于鉴定，可以重复接触直至获得整个实体肿瘤中胞外pH的选定改变。
本发明的在一个实施方案中，接触包括将活性剂组合物非肠道给予患者除了直接注射。如以上部分II所讨论的，活性剂可以衍生。
如上所讨论的，尿素酶催化了尿素的水解，导致氨基甲酸盐和胺的产生。在水环境中，氨基甲酸盐快速地和自发地分解产生第二个胺分子和一个二氧化碳(图1)。尿素酶具有多种功能，其主要环境作用是使有机体利用外部和内部产生的尿素作为氮源。在植物中尿素酶可以参与系统氮转移途径且可能作为毒性防御蛋白。
尿素酶的底物是尿素，其在肝脏中产生，通过血流携带至肾脏且在尿中排泄。健康人体的尿素血清浓度通常为1至10mM，但是尿中的尿素含量可以超过0.5M(Merck Manual of Diagnosis and Therapy，Merckand Co.，Inc.，Rahway，NJ，1999)。尿素还以大约相当于血清中的浓度存在于主要的和次要的外分泌腺中，因此循环尿素的大部分通过分泌系统移位至细胞表面上或组织分泌物中(Brune，R.A.和Chen，Y.M.，Microbesand Infection，2，2000；533-542)。例如，成年人差不多每天分泌1升含有1-10mM尿素的唾液，以及产生总尿素的约20-25％进入肠道而不是存在于体内尿液中(Visek，W.J.Fed.Proc，31(1972)1178-1193)。对于尿素的外分泌没有存在明白的活性溢出机理，因此相信未改变的尿素分子仅仅随着水穿过细胞且和上皮紧密结合。因而，人体内细胞表面是浸泡在含有尿素的流体中(McLean R.J.C.，等，CRC，Crit.Rev.Microbiol.16(1988)37-39)。
B. 二-和三-级接触
如上所述，根据本发明的一个实施例，活性剂直接结合靶向部分。或者，根据本发明的另一个实施例，使用二级方法来将活性剂传递至癌细胞。优选，肿瘤细胞包含于患者体内。二级方法具有活性剂从其靶向部分去耦的药物动力学优势。使靶向部分粘连至靶位点而结合第一个结合伙伴，例如螺旋型肽。接着靶向部分的粘连，基本上所有非靶向连接物可以从患者循环中清除。然后可以将活性剂和补充的结合伙伴成员结合给药，例如，第二个螺旋型肽。
可以使用本领域已知的任何二级系统，如生物素、半抗原等。具有高度亲和性的结合伙伴，例如，抗生物素蛋白、特异性抗体等。参见例如美国专利No.6,190,923，6,187,285，和6,183,721。
优选的二级系统包括卷曲螺旋系统。因此，本发明特定实施例中使用了如上所述的二级法，将包含靶向部分和第一个盘绕形成的肽通过所选定的电荷以及与第二个相反电荷的盘绕形成的肽反应形成稳定的α螺旋状的卷曲螺旋型杂二聚物的能力来表征的第一个结合体加入至肿瘤细胞。用于结合抗体靶向部分至螺旋型肽的方法实例描述于实施例4中。
随后含有第二个螺旋型和活性剂的第二个结合体加至细胞。优选活性剂是尿素酶。用于将刀豆尿素酶连接螺旋型的方法实例描述于实施例2中。
在偏好α螺旋状的卷曲螺旋杂二聚物形成的条件下，第一个螺旋型和第二个螺旋型混合在一起时，它们对形成二亚基α螺旋状的卷曲螺旋型杂二聚物复合体有影响。α螺旋状的盘绕-盘绕构象的肽影响了由主要序列每个肽决定的另一个特征方式。α螺旋的三级结构是主要序列中的七个残基对应于α螺旋的大约两个旋转。因此，引起α螺旋构象的主要氨基酸序列可以破裂为七个残基各自的单元，称为“七价物”。杂二聚物亚基肽由一系列七价物串联组成。当七价物的序列在特定杂二聚物亚基肽中重复时，七价物可以称为“七价物重复”或简单地“重复”。
第一个螺旋型肽和第二个螺旋型肽可以以平行或反平行构型装配入杂二聚物卷曲螺旋型螺旋(卷曲螺旋型杂二聚物)中。在平行构型中，两个杂二聚物亚基肽螺旋排列成行以致它们具有相同的方向(氨基端至羧基端)。在反平行构型中，螺旋排列成一个螺旋的氨基末端与另一个螺旋的羧基末端排列成行，反之亦然。这样的杂二聚物亚基描述于PCT专利申请WO95/31480“杂二聚物多肽免疫原载体组合物和方法”，公开日1995年11月23日，在此以其整体并入作为参考。在此所指的亚基实例如K螺旋，指的是正电荷亚基，其电荷主要由赖氨酸残基提供，以及E螺旋，指的是负电荷亚基，其电荷主要由谷氨酸残基提供。上述提及的申请中优选的实例包括SEQ ID NOS：1-2。
根据存在于上述参考申请中的指导而设计的杂二聚物亚基肽通常显示和反平行构型相比对于平行构型装配的偏好。例如，由SEQ IDNO；3和SEQ ID NO：4识别的实例肽形成平行构型杂二聚物，以及其他的肽序列(如在WO95/31480申请中描述的)。其他的实例肽包括由7氨基酸形成的K螺旋，例如，SEQ ID NO：5重复。在一个实施方案中，K-螺旋长为35个氨基酸；其是正电荷的，在溶液中没有特异性结构。E-螺旋可以是由7氨基酸构成的肽，例如，SEQ ID NO：6重复。在一个实施方案中，E-螺旋长为35个氨基酸，其是负电荷的，在溶液中没有特异性结构。
如所述的，杂二聚物两个亚基肽中的一个含有靶向部分，而另一个肽含有活性剂。在两种情况中，肽可以合成或在合成后衍生来提供所需要的连接功能。肽合成方法的实例在实施例1中描述。通常，大多数连接方法不会破坏任一卷曲型肽的卷曲型活性，这样的连接也不会破坏连接的活性剂或靶向部分的活性。
考虑到第一个螺旋型肽的修饰，可以在其N-或C-端合成肽以携带可以作为靶向部分和肽螺旋型部分之间间隔物的其他末端肽。如上所述可以通过固态、PCR，或重组方法，体内或体外合成靶向部分-螺旋型肽和/或活性剂-螺旋型肽。
通过固态方法形成结合体中，活性剂或靶向分子优选共价结合至N-端氨基酸残基，或结合至面对杂二聚物接触面的残基中的一个。优选结合基团是赖氨酸残基的硫醇基，其可以通过标准方法轻易地修饰。其他有用的结合基团包括甲硫氨酸的硫酯、组氨酸的咪唑基团、精氨酸的酚基、酪氨酸的酚基和色氨酸的吲哚基。这些连接基团可以使用本领域普通技术人员公知的反应条件来衍生。
为了将活性剂-第二个螺旋型肽结合至靶向部分-第一个螺旋型肽，两个肽在偏好杂二聚物形成的条件下接触。偏好卷曲螺旋型杂二聚物形成的介质实例是通常具有约6至约8的pH和约50mM至约500mM盐浓度的生理相容水溶液。优选，盐浓度为约100mM至约200mM。实例介质具有以下组合物：50mM磷酸钾、100mM KCl，pH7。同样有效的介质可以通过取代而制得，例如，磷酸钠替代磷酸钾和/或NaCl替代KCl。杂二聚物可以在上述pH和盐浓度、介质范围外的条件下形成，但是一些分子相互作用和杂二聚物对同二聚物的相对稳定性可以不同于以上详述的特征。例如，由于例如谷氨酸侧链在酸性pH的质子化，或例如赖氨酸侧链在碱性pH的去质子，可以在低或高的pH值下破坏易于稳定杂二聚物离子团之间的离子反应。然而通过增加盐浓度，可以克服这样对卷曲螺旋型杂二聚物有效的低和高pH值。
增加盐浓度可以中和稳定离子引力或抑制失稳离子排斥。特定盐具有中和离子反应的较高效能。例如，在K螺旋形肽的情况中，需要1M或更高浓度的ClO4-阴离子来诱导最大的α螺旋结构，而需要3M或更高浓度的Cl-来达到相同的效果。卷曲螺旋构型的高盐效果在低和高pH还显示了对于螺旋形成不是必需的螺旋内部离子引力，而是，控制卷曲螺旋相对于同型二聚物是否易于形成杂二聚物。如实施例2中描述的，第一个螺旋型肽，例如E螺旋形肽，以及第二个螺旋型肽，例如，K螺旋形肽也可以连接至靶向部分和活性剂，共有美国申请号09/654,191(Attorney Docket#：4800-0015.31)，在此以其整体并入作为参考。以及参见美国专利No.6,300,141，在此以其整体并入作为参考。
本发明的一个实施方案中，活性剂-螺旋型肽具有短的血清半衰期且通过肾脏途径排泄。因此，活性剂粘连至靶位点或快速地从患者去除。活性剂的这种体内分解有助于保护接受者正常组织不受不期望的接触。为了提高肾排泄，可以使用促进体内分解引导分子肾排泄的结合图。最佳清除步骤的替换是允许经过足够量的时间来使患者天然清除机制基本上去除循环的第一个结合体。
另一个实施方案中，使用基于抗体或非基于抗体的靶向部分来将配体或抗配体结合至含有未调节抗原的靶位点。优选，为该目的使用天然结合剂用于这样未调节抗原。例如，如肝癌或骨髓瘤的疾病通常通过未调节的IL-6受体来表征，由于相对于那些快速增生的靶细胞类型，IL-6起自分泌或副分泌部分的作用。对于这样疾病的治疗，因此可以使用IL-6作为靶向部分。参见，例如，Miki，C.等，(2002)Cancer94(5)：1584-92。
例如，IL-6和第一个螺旋型肽可以通过化学方式结合或作为重组分子形成。IL-6-第一个螺旋型肽结合体给予接受者，结合体的IL-6成分指引结合体定位于IL-6受体。该定位将择优发生在带有未调节IL-6受体的位点。在发生靶位点定位后，任意地给药如下所述的清除剂来基本上清除接受者循环中的IL-6-第一个螺旋型肽结合体。用于该目的合适清除剂是，例如，IL-6受体-HSA-半乳糖或抗IL-6抗体-HSA-半乳糖。在用于基本上例如50％、70％，或优选90％IL-6从接受者循环中清除的足够时间后，给药活性剂-第二个螺旋型肽，例如，尿素酶-第二个螺旋型肽，并通过IL-6-第一个螺旋型肽结合体定位至靶位点。
如以下部分VII中更详细的描述，源自反向病毒，腺病毒，疱疹或牛痘病毒，或来自各种细菌质粒的表达载体可以用于将重组尿素酶分子传递至靶细胞群体。可以使用本领域普通技术人员公知的方法来构建含有尿素酶的重组载体，参见，例如，Sambrook等和Ausubel等描述的技术。或者，可以利用如以上部分II中描述的脂质体或纳米胶囊将活性剂传递至靶细胞。在一个实施方案中，本发明的方法包括将含有活性剂和有效地将组合物对准细胞的靶向部分的组合物加入患者中。
C. 清除剂
如上所述，清除剂可以给予患者。清除剂能够直接将第一个结合体循环至肝细胞受体，因此在给药第二个结合体之前减少第一个结合体的循环量。
如上所述，当肿瘤细胞是包含于患者例如人体内时，具有有助于未结合靶向部分结合体体内络合和血液清除物理特性的蛋白质或非蛋白质组合物的清除剂是有用的。清除剂优选显示了一个或多个以下特征的：快速、有效地和体内靶向部分络合；从血中快速清除随后能够结合给药活性剂的靶向部分结合体；高负载清除或钝化大量的靶向部分结合体；以及低免疫原性。
有用的清除剂包括基于己糖和非基于己糖部分。基于己糖的清除剂是已经衍生并入一个或多个己糖(六碳糖部分)的分子，通过Ashwell受体或其它和内皮细胞和/或肝脏Kupffer细胞结合的受体如甘露糖/N-乙酰氨基葡萄糖受体或甘露糖6-磷酸受体来识别。己糖实例包括半乳糖、甘露糖、6-磷酸甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖等等。也可以使用通过Ashwell受体识别的其它部分包括葡萄糖、N-氨基半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、半乳糖的硫苷以及通常D-半乳糖苷和葡糖苷。可以完成将半乳糖硫苷结合至蛋白质，例如，如在Lee等，(1976)Biochemistry，15(18)：3956或Drantz等(1976)Biochemistry，15(18)：3963中的描述。
蛋白质型基于半乳糖的清除剂包括具有内生接触半乳糖残基或其已经衍生至接触或并入这样半乳糖残基的蛋白质。接触的半乳糖残基指引清除剂通过特异性受体(Ashwell受体)胞吞进入肝脏来快速清除。这些受体结合清除剂且诱导胞吞进入肝细胞，导致与溶酶体的融合和受体回至细胞表面的再循环。该清除机制是以高效、高负载和快速动力学为特征的。
基于蛋白质/带有半乳糖变种的清除剂实例是人α-1酸性糖蛋白的脱唾液酸血清类粘蛋白衍生物。从脱唾液酸血清类粘蛋白的血中快速清除描述于Galli等，J of Nucl Med Allied Sci(1988)32(2)：110-16。用唾液酸苷酶处理α-酸性糖蛋白来去除唾液酸残基，因此接触半乳糖残基。其它衍生的清除剂包括例如半乳糖苷化的清蛋白、半乳糖苷化的IgM、半乳糖苷化的IgG、脱唾液酸结合珠蛋白、脱唾液酸胎球蛋白和脱唾液酸血浆铜蓝蛋白。
其它的清除剂描述于美国专利No.6,358,490，2002年3月19日公开；美国专利No.6,172,045，2001年1月9日公开；以及美国专利No.5,886,143，1999年3月23日出版，每个在此并入作为参考。
用于本发明的另一类清除剂包括小分子，例如，约500至约10,000道尔顿。小分子可以用半乳糖衍生。小分子清除剂优选能够(1)快速有效地和相关结合体、螺旋型肽、活性剂，和/或靶向部分络合；和(2)通过半乳糖受体、肝脏特异性降解系统从血中清除这样地络合物，如与肺和脾吸收聚集络合物相反。此外，半乳糖为介的肝吸收快速动力学和配体-抗配体相互作用亲和性的结合，允许使用介质或更低分子量的载体。
本发明的一个实施方案中，使用蛋白质型和非基于半乳糖的聚合物型清除剂，这些清除剂可以通过聚集介质机理起作用。在本发明的这个实施例中，使用的清除剂可以选择基于从其出口将清除剂排除的靶器官。例如当涉及肿瘤细胞目标时，高分子量，例如，从约200,000至约1,000,000道尔顿是有用的。
另一类清除剂包括不去除循环活性剂/靶向部分结合体的试剂，但是通过将活性剂、靶向部分、脂质体、病毒载体上的相关位点，和/或其任何其它部分阻塞来替代钝化循环结合体。这些“帽子型”清除剂优选是小的例如500至10,000道尔顿、高电荷分子，例如，衍生的6，6’-[(3，3’-二甲基[1，1’-联苯]4，4’-二某基)二(偶氮)二[4-氨基-5-羟基-1，3-萘二磺酸]四钠盐。
D. 剂量/给药
对于本发明的方法，可以使用调整服药时间和顺序的任何有效的给药方式。对于人患者剂量的实例依赖于给药的模式、肿瘤的程度(大小和分布)、忍耐力大小，和对尿素酶治疗的癌症反应性。
将尿素酶组合物直接注射入肿瘤时，实例剂量是0.1至1,000国际单位尿素酶活性每mm3肿瘤。例如，且假设获得尿素酶在肿瘤中相对均匀的分布，0.5至5国际单位之间的剂量是合适的。注射针的放置可以由常规图像指引技术例如荧光法来指引，以致内科医生可以观察到针相对于目标组织的位置。这样的指引工具可以包括超声、荧光、CT或MRI。
根据本发明的一个方面，在尿素酶直接注射入肿瘤的过程中或之后可以监控给药尿素酶剂量的效能或分布，通过能够检测患者癌组织区域中pH改变的工具来监控肿瘤组织。这样的工具包括可以直接插入肿瘤中的pH探针，或成像工具，如磁共振成像(MRI)、计算机断层扫描(CT)，或荧光。MRI检查可以在其他显影剂存在下进行，简单地基于随pH改变的组织磁性特征的差别。CT或荧光成像需要其他暗度受组织介质pH影响的pH敏感显影剂。这样的试剂是本领域普通技术人员公知的。
在任何尿素酶注射前，通过其相对于周围正常组织较低的pH可以目测肿瘤组织。因此，正常组织可以具有正常的pH约7.2，而肿瘤组织是低0.1至0.4或更多pH单位。即，在任何尿素注射之前，可以通过其较低的pH来确定肿瘤组织的范围。接着尿素酶给药，带有尿素酶肿瘤区域的pH开始上升，且可以通过所得图像和较早给药前图像的比较来鉴定。
通过这种方式来检查组织，可以监控pH改变的程度和受影响组织的范围。基于这种检查，内科医师可以将其他将组合物给予位点，和/或可以将将组合物给予肿瘤位点中其他区域。可以重复这种程序直至到达所期望的pH改变程度，例如，在实体肿瘤的整个区域已经获得0.2至0.4个pH单位。
直接注射的剂量可以以合适的间隔重复，例如，每周一次或一周两次，直至所需的终点，优选观察到肿瘤块基本上或完全退化。可以如上通过目测治疗过程中受治疗肿瘤的pH改变来监控治疗效能。因此，在每个增加的注射之前，可以目测组织的pH来测定现存肿瘤的范围，其后组织pH改变可以用于监控给予该组织的尿素酶组合物新剂量。
其中尿素酶通过除了直接注射以外的方法来非肠道给药时，尿素酶剂量的实例是100-1000,000国际单位/kg尿素酶活性/kg患者体重。如在此所述，该方法中的尿素酶组合物优选包括靶向剂，将尿素酶对准癌细胞例如实体肿瘤位点或用于选择性地在肿瘤位点例如以脂质体的形式螯合尿素酶。
如上，对组织pH改变敏感的成像技术可以用于监控给药剂量的效能。因此这样的导向目标可以花费数小时或更多，该方法可以包括监控肿瘤pH，如上在尿素酶注射之前以及给药后数小时例如12-24小时来证实肿瘤位点已经明确地给药了，如通过肿瘤区域pH升高来证明。根据该检查的结果，该方法可以规定增加的剂量直至观察到所需的pH升高，例如，0.2-0.4个pH单位。一旦建立该剂量，病人可以在定期基础上如一周一或两次用相似剂量的尿素酶组合物来治疗，直至获得肿瘤大小或情况的改变。
给药的两种情况中，最终给药方案由参与的内科医师鉴于好的医疗实践来决定，考虑各种会改变药物作用的因素例如试剂的特异性活性，疾病状态的严重程度，病人的应激性，病人的年龄、条件、体重、性别以及饮食，任何感染的严重程度，等等。其他可能起作用的因素包括给药的时间和频率、药物组合、反应灵敏性，和对治疗的耐受性/反应。涉及任何在此提及制剂的进一步适用于治疗的给药方案通过有经验的开业医生来按常规确定，尤其是根据所公开的剂量信息和试验，以及在临床试验中观察到的药物动力学数据。可以通过建立的用于测定体液或其他样品中试剂浓度的试验和剂量反应数据一起使用来确定合适的剂量。
定量的频率依赖于试剂的药物动力学数据和给药的途径。调节剂量和给药来提供活性剂的足够含量或来维持所期望的效果。因此，药物组合物可以以单次剂量给药、多次不连续的给药、连续灌输、持续释放贮存，或其结合，如所需的来维持所期望的最小试剂含量。
短期作用的药物组合物(即，短半衰期)可以一天给药一次或一天多于一次(例如，一天两次、三次或四次)。长期作用的药物组合物可以每三至四天、每周，或两周一次给药。泵，如皮下的、腹膜内的，或硬膜下的泵，可以优选用于连续灌输中。
可以制备在药物学上可接受载体中含有如以上部分II中描述配制的本发明活性剂的组合物，放置于合适的容器中，以及标明治疗的指示条件。标签上指示的条件可以包括但不限制于各种癌症类型的治疗和诊断。也可以使用如以下所述的试剂盒，其中试剂盒包括药物组合物的剂型和含有治疗医学条件下组合物使用说明的包装说明书。
通常，用于本发明的活性剂以有效量给予患者。通常，有效量是有效地来(1)减轻设法治疗疾病症状；或(2)诱导与设法治疗疾病治疗相关药物学改变的量。对于癌症，有效量可以包括有效地减小肿瘤大小；减缓肿瘤生长；预防或抑制转移；或增加受侵袭患者预期寿命的量。将活性剂给予小鼠的实例方法描述于以下的实施例6中。
本发明的活性剂、清除剂，和/或显影剂可以以单次或多次剂量给药。或者，可以在长期的时间段内静脉内灌输试剂。例如，可以以连续的方式在足够清除靶向部分的时间段内静脉内给药清除剂。
本发明多靶向部分给药的实施例中，如上所述可以通过参与的内科医师根据他或她的经验；接受者条件的详细资料，例如，将影响靶向部分选择和给药途径决定的靶位点的特性和定位，包括其相关的抗原；以及使用的靶向部分的组合，例如，抗体表现可以随着抗原密度和抗原抗体的亲和性而改变来决定每个给药成分的剂量。
IV. 增效抗癌药物的方法
如上所述，目前化学疗法的一个局限是目标肿瘤变得日益耐抗肿瘤化合物。该抗药性可能是由于吸入肿瘤细胞化合物的减少、药物在吸收位点可用性的减小，或胞内代谢的增强。
对于多数弱碱性的药物，即，具有一个或多个质子化胺的药物，药物吸收的机理涉及以不带电的形式穿过细胞膜的被动扩散。因此，化合物穿过细胞膜的移动速率依赖于内/外pH梯度。如果胞外pH是等于或高于胞内pH如约pH7.2，化合物将易于以不带电形式进入细胞，至少和其从细胞出来的频率一样。相反，如果胞外pH低于胞内pH如在实体肿瘤中，较低的外部pH偏好带电的、质子化形式的化合物，且这将抑制药物进入细胞的吸收。实际上，肿瘤较低胞外pH的一个效能是保护肿瘤对抗弱碱性抗肿瘤化合物。
其活性受较低胞外pH不利影响的弱碱性抗肿瘤化合物包括阿霉素、柔红霉素、米托蒽醌、表柔比星、丝裂霉素、博来霉素、长春花属生物碱如长春碱和长春新碱、烷化剂如环磷酰胺和氮芥盐酸盐，以及antrineoplastic嘌呤和嘧啶衍生物。
本方法中，尿素酶和含有尿素酶的组合物以有效升高肿瘤流体胞外pH至少0.1个pH单位如0.1至0.5个或更多pH单位的量来给予实体肿瘤。特定实施例中，流体胞外pH上升至至少pH7.0，7.2，或更高。
可以如以上部分III中描述的给药尿素酶，例如直接进入患者的肿瘤或除了直接注射以外的非肠道给药。还是如上所述，使用用于目测肿瘤pH的成像工具，或通过直接测量肿瘤的pH，可以测定肿瘤组织中pH改变以及改变的程度来监控由尿素酶给药而产生的pH改变。
该方法中给药的剂量可以少于尿素酶是单独抗肿瘤剂中所需的，只要注射量足够产生所期望的肿瘤pH升高。或者，该方法可以涉及尿素酶治疗量和抗癌化合物治疗量或低剂量的给药。如值得重视的，该方法可以允许以低于抗肿瘤化合物正常的剂量给药，因为尿素酶提高了化合物的治疗效能，以及因为尿素酶其自身承担了治疗效能。结果是较高的效能而较低的副作用。
在一个实施方案中，如上所述，化学整体还可以结合活性剂来提高活性剂的传递。在该实施例中，活性剂可以通过任何方法给药，例如，非肠道，除了直接注射。
V. 监控抗癌治疗的方法
仍然是另一方面，本发明还提供了监控抗癌治疗的方法，通过评估患者实体肿瘤的存在、大小或情况。该方法包括将如上所述的活性剂如尿素酶给予含有或怀疑含有实体肿瘤的患者。在有效地来将活性剂定位于患者实体肿瘤中的条件下将活性剂给药。
如上所述用能够检测患者组织中胞外pH改变的诊断工具来检查患者。该诊断工具优选是pH敏感诊断试剂，如显影剂、造影剂或位移试剂，如以上部分II中所述的，能够在活性剂给药之前、之后或同时定位于肿瘤中。在患者内部鉴定显示了给药后胞外pH升高的组织区域。能够鉴定诊断试剂的任何工具可以用于检测试剂，如以上所述的MRI、PET扫描，等等。
在一个实施方案中，该方法包括将尿素酶给予进行抗癌治疗的患者，并进行检测尿素酶在实体肿瘤中定位的鉴定。
该鉴定可用于监控响应尿素酶给药的肿瘤形状和大小的改变。
一个使用PET扫描的实施例中，患者给药13N-标记的氨。然后以有效到达肿瘤位点的量将尿素酶给予病人。尿素酶水解尿素产生非标记的氨。随着时间的过去，标记的氨稀释或置换，导致在扫描中逐渐清除。
另一个使用PET扫描的实施例中，患者给药13N-标记的尿素。然后以有效到达肿瘤位点的量将尿素酶给予病人。尿素酶水解标记的尿素产生标记的氨，其可以在扫描上检测到。
VI. 试剂盒
仍然是另一方面，本发明提供了使用在此所述的方法抑制肿瘤细胞生长的试剂盒。该试剂盒包括含有一种或多种活性剂的容器。该试剂盒可以增加包括任何在此所述的用于实施本发明方法的其它成分。这样的成分包括但不限制于药物成分、靶向部分、显影剂、清除剂、基因治疗成分，等等。
该试剂盒可以任意地包括说明(即治疗方案)说明书，公开了用于抑制肿瘤细胞生长的活性剂的使用。因此，在一个实施方案中，试剂盒包括含有活性剂优选尿素酶的药物组合物，和教导了将将组合物给予患者的说明书，用于治疗患者的癌症。在一个实施方案中，该说明书教导了当组合物是通过直接注射入肿瘤中给药时，以依赖于肿瘤大小和每mm3肿瘤0.1至100国际单位尿素酶活性的量将尿素酶将组合物给予患者，当组合物是除了直接注射进入肿瘤以外的非肠道给予患者时，量为100-100,000国际单位/kg国际单位尿素酶活性/kg患者体重。
另一个实施方案中，说明书教导了以尿素酶有效地降低或逆转实体肿瘤中较高胞内/较低胞外pH梯度的量，将尿素酶将组合物给予还接受了效能是通过实体肿瘤中较高胞内/较低胞外pH梯度减少的弱碱性抗肿瘤化合物的患者。
或者，说明书教导了在有效地将尿素酶定位于患者实体肿瘤中的条件下，将尿素酶给予含有或怀疑含有实体肿瘤的患者，用能够检测患者组织胞外pH改变的诊断工具来检查患者，并鉴定患者体内所述给药后显示了胞外pH升高的组织区域。
而说明书通常包括不限制于写或印刷的材料。能够保存这样的指导并将它们传递至最终使用者的任何介质可以用于本发明。这样的介质包括但不限制于电子存储介质(例如，磁盘、磁带、盒式磁带、芯片)、光学介质(例如，光盘只读存储器)，等等。这样的介质可以包括提供这样说明书的互联网点地址。
VII. 基因/细胞治疗
本发明的另一个方面还可以使用基因治疗组合物，用于抑制哺乳动物患者中癌细胞的生长。基因治疗组合物包括当给予患者时有效地选择性转染癌细胞的靶向载体以及在所述载体中携带的有效地产生核酸分子如mRNA的重组核酸序列，其在转染的癌细胞中编码活性剂，优选尿素酶。
在一个实施方案中，肿瘤细胞和表达编码活性剂的同源核酸分子的非致癌工程细胞接触。非致癌工程细胞可以是但并不限制于成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、骨细胞、角质化细胞，或源自肿瘤的辐射的、工程非致癌细胞。
另一个实施方案中，肿瘤细胞用编码细胞靶向部分和同源核酸分子的基因构建体转染，该同源核酸分子编码尿素酶蛋白和分泌前导序列。该基因构建体能够表达作为肿瘤细胞中结合体的细胞靶向部分和同源尿素酶蛋白以及分泌前导序列，且借此通过分泌前导序列将结合体引出细胞，此后用于选择性的定位在通过细胞靶向部分识别的细胞表面抗原。
优选，细胞靶向分子选择性地定位于细胞表面抗原，以及细胞表面抗原对至少一个人实体肿瘤是特异性的。基因构建体可以包括含有增强子和控制序列的转录调控序列，控制序列包含控制基因构建体表达的基因开关。
根据本发明的一个实施例，基因构建体是包载于病毒性载体中的。各种用于肿瘤靶向的病毒性载体是可获得的。细小病毒是公知的来选择性传染肿瘤细胞。或者，根据公开的方法可以设计在肿瘤细胞中选择性复制的病毒。参见，例如，Puhlmann M；等，Hum Gene Ther，(1999)10(4)：649-57；Noguiez-Hellin P；等，Proc Natl Acad Sci USA，(1996)93(9)：649-80；和Cooper MJ，Semin oncol(1996)23(1)172-87。例如，可以改变病毒来含有突变的胸苷激酶或聚合酶基因，使病毒复制只在含有这些酶的快速分裂细胞中复制。或者，病毒可以遗传设计来含有肿瘤特异性控制序列，例如，肿瘤特异性启动子区域，其是响应性的并表达所需的蛋白质或用于只在肿瘤细胞中病毒复制所需的蛋白质。优选，基因构建体包载于腺病毒中。
A. 用于克隆的载体、基因转染和表达
本发明的特定实施例中，使用表达载体来表达尿素酶多肽产物，然后将其纯化。另在一个实施方案中，表达载体用于基因治疗。表达载体可以包括提供于载体中的合适信号，以及各种调控序列如来自病毒和/或哺乳动物来源的增强子/启动子来起动宿主细胞中重要基因的表达。还可以确定设计来最优化宿主细胞中信使RNA稳定性和可翻译性的序列。还提供了用于建立永久的、稳定细胞系表达产物的许多控制药物选择标记的使用条件，如将药物选择性标记的表达连接至多肽表达的序列。
B. 调控元件
术语“表达构建体”意味着包括任何类型的遗传构建体含有核酸编码，用于其中部分或全部核酸编码序列能够转录的基因产物。转录产物可以翻译成蛋白质，但不是必需的。特定实施例中，表达包括基因转录和将mRNA翻译成基因产物。另在一个实施方案中，表达仅仅包括编码重要基因的核酸序列的转录。
优选实施例中，核酸编码基因产物是在启动子的转录控制下。“启动子”指的是通过细胞合成机构或引入的合成机构来识别的DNA序列，所需来启动基因的特异性转录。短语“在转录控制下”意思是启动子在相对于核酸的正确位置和方向来控制RNA聚合酶启动和基因的表达。
在此所用的术语启动子指的是聚集在RNA聚合酶II启动位点周围的转录分子群。启动子可以由分泌功能模块组成，每个由大约7-20bp的DNA组成，以及含有一个或多个用于转录激发剂或抑制剂蛋白质的识别位点。每个启动子中至少一个模块起将RNA合成起始位点定位的功能。实例模块是TATA盒，但在一些启动子中缺失TATA盒，如用于哺乳动物末端转脱氧核苷酰酶基因的启动子和用于SV40后期基因的启动子，覆盖起始位点自身的分泌序列有助于固定起始的放置。
用来控制重要核酸序列表达的特别启动子认为不是重要的，只要其能够控制靶细胞中核酸的表达。因此，其中人细胞为目标时，优选将核酸编码区域放置在能够在人细胞内表达的启动子的邻近并在其控制下。通常，这样的启动子可以包括人或病毒的启动子。
在各种实施例中，人细胞巨化病毒(CMV)立即早期基因启动子，SV40早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒长末端重复，小鼠胰岛素启动子和甘油醛-3-磷酸盐脱氢酶可以用于获得重要编码序列的高水平表达。以及使用其它病毒性的哺乳动物细胞或细菌噬菌体启动子，其是本领域公知的来获得重要编码序列的表达。
其中使用了eDNA插入，期望其包括作用于基因转录的正确聚核苷作用的聚核苷信号。聚核苷信号的性质是对成功实施本发明不认为是决定性的，以及可以使用任何这样的序列。还可以作为表达盒序列使用的是终止基因。这些序列可以用来提高信息水平和最小化通过盒进入其它序列的阅读。
C. 可选择的标记
本发明的特定实施例中，含有本发明核酸构建体的细胞可以在体外或体内通过包括于构建体中的标记。这样的标记给细胞提供了可鉴定的改变使含有表达构建体细胞的鉴定变得容易。通常，药物选择标记的融合有助于转化体的克隆和选择，例如，提供了对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin和组氨醇抗性的基因是有用的选择性标记。或者，可以使用如疱疹单纯病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素转乙酰酶的酶。还可以使用免疫标记。合适标记的更多实施例是本领域普通技术人员公知的。参见，例如，Baumann，R.P.等(2002)Biotechnique32(5)：1030-34。
D. 表达载体的传递
存在许多其中表达载体可以导入细胞的途径。本发明特定实施例中，表达构建体包括病毒或源自病毒基因组的工程构建体，其用于将尿素酶组合物传递至靶细胞。特定病毒通过受体-为介的胞吞作用进入细胞来整合宿主细胞基因组并稳定有效地表达病毒基因的能力已经使它们成为具有吸引力的将外源基因转染进入哺乳动物细胞的候选者。
用于活体内传递的一个优选方法包括使用腺病毒表达载体。“腺病毒表达载体”意味着包括含有足够(a)支持构建体的包载和(b)表达在此已克隆多核苷酸的腺病毒序列的那些构建体。关于这一点，表达不需要合成的基因产物。参见，例如，Barnett，B.G等，(2002)“Targeted Adenovirus Vectors”Biochim Biophys Acta 1575(1-3)：1-14。
本发明的一个实施例，表达载体可以包括遗传工程形式的腺病毒。对腺病毒的遗传构成的认识，36kb，线性，双链DNA病毒，使腺病毒DNA和外源序列大片段的替代可高达7kb。与反向病毒相反，宿主细胞的腺病毒感染不导致染色体整合，因为腺病毒DNA可以以游离基因的方式复制而无潜在的生殖毒性。还有，腺病毒结构稳定以及在大范围的扩增之后没有检测到染色体组基因重排。
由于其中等大小的基因组、易操纵、高滴定度、宽泛的靶细胞范围和高感染性，腺病毒尤其适合用作基因转染载体。腺病毒载体的产生和增殖依赖于辅助细胞系。辅助细胞系可以源自人细胞，如人胚胎肾脏细胞、肌肉细胞、造血细胞或其它人胚胎间叶细胞或上皮细胞。或者，辅助细胞可以源自其它哺乳动物种类的可用于人腺病毒的细胞。这样的细胞包括，例如，Vero细胞或其它猴子的胚胎间叶细胞或上皮细胞。辅助细胞系的实例是293细胞系，其从人胚胎肾脏细胞通过Ad5DNA片段转变而成的并基本上表达E1蛋白。已经公开了培养293细胞和繁殖腺病毒的方法。
其它病毒载体也可以用作本发明中的表达构建体。可以使用源自病毒的载体如牛痘病毒(Walther，W.和Stein，U.(2000)Drugs 60(2)：249-71)，腺相关病毒(Zhao，N.等，(2001)Mol Biotechnol 19(3)：229-37)和疱疹病毒(Burton，E.A.等，(2001)Adv Drug Deliv Rev 53(2)：155-70)。其他可以用于本发明的肿瘤特异性、复制选择性病毒在Hawkins，L.K.等，(2002)Lancet Oncol 3(1)：17-26中有评述。
本发明也可以使用数种将表达构建体转移至培养的哺乳动物细胞中的非病毒方法。这些包括磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖、电穿孔、直接显微注射、DNA装载脂质体和脂质转染胺-DNA复合体、细胞超声处理、使用高速度显微子弹的基因轰击，以及受体为介的转染。
一旦表达载体转移进细胞中，编码重要基因如尿素酶基因的核酸可以在不同位点定位并表达。特定实施例中，编码活性剂的核酸可以稳定地整合进细胞的基因组。整合可以通过同源重组(基因替代)在同源的位置和方向，或可以是随机的、非特异性定位(基因增加)整合。还是另在一个实施方案中，核酸可以稳定地作为DNA分离的、游离的片段保持在细胞中。这样的核酸片段或“游离基因”编码充分允许独立复制或和宿主细胞循环同步复制和维持的序列。将表达构建体传递并定位于保留核酸的细胞中的方法依赖于所使用表达构建体的类型。
还是本发明的另一个实施例，表达构建体可以简单地由裸露的重组DNA或质粒组成。构建体的转染可以通过上述提及的任一种方法来进行，其物理地或化学地渗透细胞膜。这尤其适用于体外转染，但也可以用于体内。
用于将裸露DNA表达构建体转染入细胞的仍然是本发明的另一个实施例可以包括粒子轰击。该方法依赖于将包覆DNA的微子弹加速至高速度使其穿透细胞膜并进入细胞而没杀死它们的能力。在这方面数种用于加速小颗粒的设备是有用的。一个这样的设备依赖于高电压放电来产生电流，其依次提供了原动力。使用的微子弹由生物惰性物质如钨或金珠组成。
在一个实施方案中，这样的表达构建体可以使用以上部分II中所述的一种或多种方法包载于脂质体、脂质复合体、纳米胶囊，或其他制剂中。也可以使用脂质转染胺DNA复合体。
本发明的特定实施例中，脂质体可以和血凝病毒(HVJ)复合。另一个实施方案中，脂质体可以和核内非组蛋白蛋白质(HGM-1)复合或结合使用。还是另一个实施方案中，脂质体可以同时和HVJ和HGM-1复合或结合使用。
其他可以用于将编码特别基因的核酸传递进入细胞的表达构建体是受体为介的传递载体。这些具有几乎全部真核细胞中通过受体为介胞吞选择性吸收大分子的优势。由于各种受体细胞类型的特异性分布，传递将是高度特异性的。
受体为介的基因靶向载体通常由两个组分组成：细胞受体特异性配体和DNA结合剂。数个配体已经用于受体为介的基因转染，例如，脱唾液酸血清类粘蛋白和铁传递蛋白。此外，表皮生长因子(EFG)已经用于将基因传递至鳞状癌细胞(欧洲专利申请公开号No.EP0360257，在此特意并入作为参考)。
另一个实施方案中，传递载体可以包括配体和脂质体。因此，通过任何数量的受体-配体系统和或不和脂质体，也可以特异性地将编码特定基因的核酸传递至如肺、上皮或肿瘤细胞的细胞类型是可行的。例如，EFG或其他小分子可以用作受体，用于编码许多肿瘤细胞中显示EGF受体上调基因的核酸的介质传递(Basela，J.(2002)J Clin Oncol20(9)：2217-9)。以及，CD5(CLL)、CD22(淋巴瘤)、CD25(Y-细胞白血病)和MAA(黑素瘤)的抗体同样可以用作靶向部分。
特定实施例中，在来自体内的情况下基因转染更容易进行。来自体内的基因治疗指的是细胞从动物分离、核酸在体外进入细胞的传递，以及然后将修饰的细胞返回动物中。这可以包括动物手术切除的组织/器官或细胞和组织的原始培养。参见，例如，Ahonen，M.等，(2002)Mol Ther 5(6)：705-15和Kawai，K.等，(2000)Mol Urol 4(2)：43-6；美国专利No.6,395,712,6,149,904，和6,410,029，其中每个在此并入作为参考。
可以用各种途径来制备原始哺乳动物细胞培养物。为了细胞在体外能保持有生活力并和表达构建体接触，细胞通常保持和适当比例的氧气、二氧化碳和营养素接触，并防止微生物的污染。细胞培养技术是本领域普通技术人员公知的。
有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是Vero和Hela细胞以及中国仓鼠卵巢细胞系，W138、BHK、COS-7、293、HepG2、NIH3T3、RIN和MDCK细胞。此外，宿主细胞株可以选择来以所期望的方式调节插入序列的表达，或修饰和加工基因产物。蛋白质产物这样的修饰(例如，糖基化)和加工(例如，裂解)对于蛋白质的功能是重要的。不同宿主细胞具有特有的和特异性的蛋白质翻译后加工和修饰的机理。可以选择合适的细胞系或宿主系统来保证表达的外源蛋白的正确修饰和加工。
可以使用许多选择系统包括，但不限制于，在tk-，hgprt-或aprt-细胞中分别使用HSV胸苷激酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤转磷酸核糖基酶和腺嘌呤转磷酸核糖基酶基因。以及，抗代谢物抗性可以用作gpt、neo以及hygro的选择基础，其分别提供了对霉酚酸的抗性、对氨基糖苷类G418抗性以及对潮霉素的抗性。
从上述的，可以看出本发明的各种目的和特征。
                                       表2
                              提供的支持本发明的序列
                                       说明     SEQ.ID NO.
E-螺旋Glu Val Ser Ala Leu Glu Lys Glu Val Ser Ala Leu Glu Lys Glu Val Ser Ala LeuGlu Lys Glu Val Ser Ala Leu Glu Vys Glu Val Ser Ala Leu Glu Lys     1
K-螺旋Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val Ser Ala LeuLys Glu Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu     2
Glu Val Glu Ala Leu Glu Lys Glu Val Ser Ala Leu Glu Lys Glu Val Ser Ala LeuGlu Cys Glu Val Ser Ala Leu Glu Lys Glu Val Glu Ala Leu Glu Lys     3
Lys Val Glu Ala Leu Lys Lys Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val Ser Ala LeuLys Cys Gls Val Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val Glu Ala Leu Lys Lys     4
K-螺旋KVSALKE     5
E-螺旋EVSALEK     6
刀豆尿素酶MKLSPREVEKLGLHNAGYLAQKRLARGVRLNYTEAVALIASQIMEYARDGEKTVAQLMCLGQHLLGRRQVLPAVPHLLNAVQVEATFPDGTKLVTVHDPISRENGELQEALFGSLLPVPSLDKFAETKEDNRIPGEILCEDECLTLNIGRKAVILKVTSKGDRPIQVGSHYHFIEVNPYLTFDRRKAYGMRLNIAAGTAVRFEPGDCKSVTLVSIEGNKVIRGGNAIADGPVNETNLEAAMHAVRSKGFGHEEEKDASEGFTKEDPNCPFNTFIHRKEYANKYGPTTGDKIRLGDTNLLAEIEKDYALYGDECVFGGGKVIRDGMGQSCGHPPAISLDTVITNAVIIDYTGIIKADIGIKDGLIASIGKAGNPDIMNGVFSNMIIGANTEVIAGEGLIVTAGAIDCHVHYICPQLVYEAISSGITTLVGGGTGPAAGTRATTCTPSPTQMRLMLQSTDDLPLNFGFTGKGSSSKPDELHEIIKAGAMGLKLHEDWGSTPAAIDNCLTIAEHHDIQINIHTDTLN     7
 EAGFVEHSIAAFKGRTIHTYHSEGAGGGHAPDIIKVCGIKNVLPSSTNPTRPLTSNTIDEHLDMLMVCHHLDREIPEDLAFAHSRIRKKTIAAEDVLNDIGAISIISSDSQAMGRVGEVISRTWQTADKMKAQTGPLKCDSSDNDNFRIRRYIAKYTINPAIANGFSQYVGSVEVGKLADLVMWKPSFFGTKPEMVIKGGMVAWADIGDPNASIPTPEPVKMRPMYGTLGKAGGALSIAFVSKAALDQRVNVLYGLNKRVEAVSNVRKLTKLDMKLNDALPEITVDPESYTVKADGKLLCVSEATTVPLSRNYFLF
IV. 实施例
以下的实施例进一步说明了在此所述的发明且决不是试图来限制本发明的范围。
A 实施例1
A1. 肽合成
通过固相合成方法使用常规的N-t-羟丁基羰基(t-Boc)化学处理来制备肽。通过和含有10％茴香醚和2％1，2-乙烷双硫醇的氟化氢(20ml/g树脂)在4℃反应1.5小时，从树脂上洗脱肽。粗制肽用冷的醚洗涤，并用冰醋酸从树脂上提取并冻干。通过反相HPLC在Zorbax半制备C-8柱上(250×10mm I.D.，6.5-μm的粒径，300-孔径大小)用线性AB梯度(从0.2至1.0％B/分钟)以2ml/分钟的流速提纯合成的肽，其中溶剂A是三氟乙酸(TFA)的水溶液以及溶剂B是0.05％TFA的乙腈。纯化肽的均一性通过HPLC反相分析、氨基酸分子和MALDI质谱来鉴定。
A2. 尿素酶的亲和性纯化
通过羟基脲与环氧活化的琼脂糖6B(Amersham Biociences)反应来制备亲和性柱。使用1M的乙醇胺嵌段残余的活性基团。
如下进行纯化。用PEB(0.02M磷酸盐，1mM EDTA，1mMβ-巯基乙醇，pH7.0)平衡柱子。使用粗制的尿素酶样品(图2)(PEB中0.5mg/ml，总共8ml)。柱子用15ml的PB(0.02M磷酸盐，1mMβ-巯基乙醇，pH7.0)洗涤。然后用8ml的以下溶液分别洗涤柱子：PB+0.1MNaCl，PB+0.5M NaCl，和PB+0.95M NaCl。用8ml的EB(0.2M磷酸盐，1mMβ-巯基乙醇，pH4.6)洗脱尿素酶，收集1ml片段。通过280nm下的OD(图3)和HPLC(C5柱)分析来检测片段。柱子保存在0.01％NaN3中。
B. 实施例2--尿素酶-螺旋结合体的制备
通过将10mg刀豆尿素酶溶解于300μl的2mM pH7.2的磷酸缓冲液中来制备尿素酶螺旋结合体。然后将5mg双重功能交联剂硫代-MBS加入溶液中，然后将混合物在室温下缓慢搅拌一小时。然后将混合物在2mM pH7.2的磷酸缓冲液中透析来除去过多的交联剂。
将K-螺旋或E-螺旋和C-末端半胱氨酸交联剂(1.5mg)加入交联剂修饰的尿素酶溶液中，并在室温下缓慢搅拌3小时。螺旋尿素酶结合体在新鲜的2mM pH7.2的磷酸缓冲液中透析过夜来去除未结合的螺旋形肽。将透析的尿素酶结合体冻干，然后溶解于1mL的2mM pH7.2的磷酸缓冲液中，并使用交联葡聚糖G75柱来进一步纯化。收集含有螺旋尿素酶结合体的空隙体积片段，冻干并保存于4℃。
结合体的纯化和制备物中螺旋对尿素酶的比例通过使用标准程序的氨基酸分析和MALDI质谱来测定。
C. 实施例3--尿素酶和尿素酶结合体的活性试验
尿素酶或尿素酶结合体的酶活性和谷氨酸脱氢酶(GLDH)进行联合酶反应。氧化NADH的量通过测量340nm吸收值的改变来测定(Kaltwasser，H.和Schlegel，H.G，Anal.Biochem.，16，132，1966)。使用的试剂是：0.10M磷酸钾缓冲液，pH7.6；磷酸盐缓冲液中制备的1.80M尿素；缓冲液中0.025M腺苷-5‘-二磷酸盐(ADP)(10.7mg/ml)；磷酸盐缓冲液中0.008M NADH(5mg/ml)；磷酸盐缓冲液中0.025Mα-酮戊二酸盐(3.7mg/ml)；谷氨酸脱氢酶(GLDH)溶液，没有铵离子；在试验前制备的新鲜50U/ml磷酸盐缓冲液。通过溶解于磷酸盐缓冲液来制备尿素酶溶液产生0.1-0.5U/ml的浓度。在试验前新鲜制备该溶液。
通过在比色皿中加入2.0mL的磷酸盐缓冲液2.40ml，各自0.1ml的尿素、ADP、NADH、GLDH和α-酮戊二酸盐后开始试验。分光光度计调节至340nm和25℃。将加入组分的比色皿放置在25℃的分光光度计中5分钟来达到温度平衡，然后若有的话，在340nm建立空白率。
将0.1ml尿素酶溶液加入比色皿中来开始酶反应。记录304nm的吸收改变值15分钟。酶活性与340nm每分钟吸收值的减少有关。
D. 实施例4--螺旋抗体结合体的制备
材料包括：(1)小鼠抗-hEGFR IgG2a(Serotec)，200μg/0.2ml(即，1mg/ml)；(2)E-螺旋(N-交联剂)；(3)间高碘酸钠(Pierce)；和(4)双重功能交联剂，KMUH(Pierce)。
E-螺旋的功能修饰通过以下步骤来进行：
a.将KMUH溶解于DMSO来制备10mg/ml溶液(250μl DMSO中2.5mg)。
b.将E-螺旋溶解于PB中(392μl 10mM PB中～2mg，pH7.4+4μl TCEP，100mM贮备)
c.将1μlTris(2M)加入来中和E-螺旋溶液
d.将E-螺旋溶液加入至KMUH溶液并在R.T.培养2小时
e.溶液在4℃过夜
f.第二天早晨，12000转离心5分钟，来去除没有溶解的沉淀。
g.在C8 HPLC柱上去除KMUH和DMSO(0-20％乙腈/H2O和0.05％TFA)和收集所有肽的级分(75％乙腈)。
h.将肽的级分冻干并通过质谱检测。
通过以下步骤氧化抗体：
a.每2mg抗体，称重20mg高碘酸盐于琥珀指管中。
b.加2mlPBS，pH7.2和2ml贮备抗体至指管中(最终[抗体]为0.5mg/ml)并轻柔振荡直至高碘酸盐粉末溶解。
c.室温培养30分钟。
d.通过pH5.5的100mM醋酸盐缓冲液透析三次来去除高碘酸盐。
通过以下步骤来制备结合体
a.使用微孔超滤单元(30k MWc/o)将氧c的抗体浓缩。
b.将功能化的75μl E-螺旋溶液(4μg/μl ddH2O)加入一半的氧化抗体溶液中(醋酸盐缓冲液中含有～0.75mg抗体，pH5.5)。
c.室温下振荡培养2小时。
d.使用蛋白质G柱纯化抗体混合物(参见图4)。
e.比较和分析样品(在亲和纯化之前或之后)。
E. 实施例5--螺旋尿素酶结合体和螺旋抗体结合体的Biacore分析
根据制造商建议的规程将含有K-螺旋形肽或E-螺旋形肽的半胱氨酸共价连接至Pioneer B1芯片。简要的，传感芯片的葡聚糖表面首先用NHS/EDC(15μl)活化，然后加入PDEA(20μl)。将pH4.3 10mM醋酸钠缓冲液的K-螺旋或E-螺旋(50μg/ml)注入并使其反应达到表面密度约为200-400RU。然后通过注入(10μl)50mM半胱氨酸、1MNaCl、0.1M甲酸盐，pH4.3的钝化溶液将活化基团嵌段。
在25℃BIAcore3000设备上进行动力学试验。每个生物传感器运行由以下组成(1)600秒样品注入阶段(螺旋尿素酶或螺旋抗体)，(2)600秒分离阶段，和(3)2×15秒再生阶段(6M盐酸胍)。在整个循环中保持5μl/分钟的流速。PBS用作缓冲液。每0.5秒实时记录样品的SPR信号并绘制RU对时间的图(传感图)。校正每个获得的传感图，用于空白细胞表面上相应样品注入循环替代引起的体积折射率改变。
F. 实施例6--动物研究
人乳腺癌异种移植的无胸腺v/v雌性小鼠用于测试。选择的动物通常为5-7周大，且它们的体重在处理开始约为15至28克。
MCF-细胞用于产生异种移植。细胞在补充青霉素/链霉素5000U/ml、L-谷氨酰胺200mM、丙酮酸钠、非必需氨基酸、维生素，和10％FBS的MEM培养基中生长；细胞培养保持5％CO2，37.5℃，和80％湿度。细胞用0.25％(w/v)胰蛋白酶-0.03％(w/v)EDTA溶液收集。100μl中大约1×106个细胞皮下注射至每个小鼠的右侧。
使肿瘤生长进行约6-8天使肿瘤大小达到至少直径为2-4mm。通过肿瘤内注射给药药剂。每个动物的药剂体积是50μL。每个实体肿瘤以“fanning fashion”注射所给试验样品的药剂。通过外径卡尺测量来获得肿瘤体积。在试验开始和处死时测量体重。
如以下的表3所示，结果显示在处理24小时后没有观察到肿瘤。
                               表3
                                 小鼠肿瘤的成功治疗
小鼠 1  2 3 4 5 6
注射的MCF细胞 0.8×106  0.8×106 0.8×106 0.8×106 1.3×106 0.8×106
治疗前肿瘤大小 22.5mm3  33.5mm3 15.6mm3 31.1mm3 32.5mm3 8.2mm3
注射的尿素酶量 50U/50uL  50U/50uL 50U/50uL 50U/50uL 40U/50uL 10U/50uL
注射后肿瘤大小(24小时) 未观察到  未观察到 未观察到 未观察到 未观察到 未观察到
尽管本发明已经根据特定的实施例进行了描述，对本领域普通技术人员而言各种不脱离本发明的改变和修饰是显而易见的。
                                 序列表
<110>赫利克斯生物药品公司
<120>尿素酶用于抑制癌症细胞生长的用途
<130>548008023W00
<140>Not Yet Assigned
<141>Filed Herewith
<150>US 60/397,244
<151>2002-07-18
<160>7
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>35
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>E-螺旋形肽
<400>1
Glu Val Ser Ala Leu Glu Lys Glu Val Ser Ala Leu Glu Lys Glu Val
 1               5                  10                  15
Ser Ala Leu Glu Lys Glu Val Ser Ala Leu Glu Lys Glu Val Ser Ala
            20                  25                  30
Leu Glu Lys
        35
<210>2
<211>35
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>K-螺旋形肽
<400>2
Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val
 1               5                  10                  15
Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val Ser Ala
            20                  25                  30
Leu Lys Glu
        35
<210>3
<211>35
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>螺旋形肽
<400>3
Glu Val Glu Ala Leu Gln Lys Glu Val Ser Ala Leu Glu Lys Glu Val
 1               5                  10                  15
Ser Ala Leu Glu Cys Glu Val Ser Ala Leu Glu Lys Glu Val Glu Ala
            20                  25                  30
Leu Gln Lys
        35
<210>4
<211>35
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>螺旋形肽
<400>4
Lys Val Glu Ala Leu Lys Lys Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val
 1               5                  10                  15
Ser Ala Leu Lys Cys Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu Lys Val Glu Ala
            20                  25                  30
Leu Lys Lys
        35
<210>5
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>K-螺旋形肽
<400>5
Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu
 1               5
<210>6
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>E-螺旋形肽
<400>6
Glu Val Ser Ala Leu Glu Lys
 1               5
<210>7
<211>840
<212>PRT
<213>Canavalia ensiformis
<400>7
Met Lys Leu Ser Pro Arg Glu Val Glu Lys Leu Gly Leu His Asn Ala
 1               5                  10                  15
Gly Tyr Leu Ala Gln Lys Arg Leu Ala Arg Gly Val Arg Leu Asn Tyr
            20                  25                  30
Thr Glu Ala Val Ala Leu Ile Ala Ser Gln Ile Met Glu Tyr Ala Arg
        35                  40                  45
Asp Gly Glu Lys Thr Val Ala Gln Leu Met Cys Leu Gly Gln His Leu
    50                  55                  60
Leu Gly Arg Arg Gln Val Leu Pro Ala Val Pro His Leu Leu Asn Ala
65                  70                  75                  80
Val Gln Val Glu Ala Thr Phe Pro Asp Gly Thr Lys Leu Val Thr Val
                85                  90                  95
His Asp Pro Ile Ser Arg Glu Asn Gly Glu Leu Gln Glu Ala Leu Phe
            100                 105                 110
Gly Ser Leu Leu Pro Val Pro Ser Leu Asp Lys Phe Ala Glu Thr Lys
        115                 120                 125
Glu Asp Asn Arg Ile Pro Gly Glu Ile Leu Cys Glu Asp Glu Cys Leu
    130                 135                 140
Thr Leu Asn Ile Gly Arg Lys Ala Val Ile Leu Lys Val Thr Ser Lys
145                 150                 155                 160
Gly Asp Arg Pro Ile Gln Val Gly Ser His Tyr His Phe Ile Glu Val
                165                 170                 175
Asn Pro Tyr Leu Thr Phe Asp Arg Arg Lys Ala Tyr Gly Met Arg Leu
            180                 185                  190
Asn Ile Ala Ala Gly Thr Ala Val Arg Phe Glu Pro Gly Asp Cys Lys
        195                 200                 205
Ser Val Thr Leu Val Ser Ile Glu Gly Asn Lys Val Ile Arg Gly Gly
    210                 215                 220
Asn Ala Ile Ala Asp Gly Pro Val Asn Glu Thr Asn Leu Glu Ala Ala
225                 230                 235                 240
Met His Ala Val Arg Ser Lys Gly Phe Gly His Glu Glu Glu Lys Asp
                245                 250                 255
Ala Ser Glu Gly Phe Thr Lys Glu Asp Pro Asn Cys Pro Phe Asn Thr
            260                 265                 270
Phe Ile His Arg Lys Glu Tyr Ala Asn Lys Tyr Gly Pro Thr Thr Gly
        275                 280                 285
Asp Lys Ile Arg Leu Gly Asp Thr Asn Leu Leu Ala Glu Ile Glu Lys
    290                 295                 300
Asp Tyr Ala Leu Tyr Gly Asp Glu Cys Val Phe Gly Gly Gly Lys Val
305                 310                 315                 320
Ile Arg Asp Gly Met Gly Gln Ser Cys Gly His  Pro Pro Ala Ile Ser
                325                 330                  335
Leu Asp Thr Val Ile Thr Asn Ala Val Ile Ile Asp Tyr Thr Gly Ile
            340                 345                 350
Ile Lys Ala Asp Ile Gly Ile Lys Asp Gly Leu Ile Ala Ser Ile Gly
        355                 360                 365
Lys Ala Gly Asn Pro Asp Ile Met Asn Gly Val Phe Ser Asn Met Ile
    370                 375                 380
Ile Gly Ala Asn Thr Glu Val Ile Ala Gly Glu Gly Leu Ile Val Thr
385                 390                 395                 400
Ala Gly Ala Ile Asp Cys His Val His Tyr Ile Cys Pro Gln Leu Val
                405                 410                 415
Tyr Glu Ala Ile Ser Ser Gly Ile Thr Thr Leu Val Gly Gly Gly Thr
            420                 425                 430
Gly Pro Ala Ala Gly Thr Arg Ala Thr Thr Cys Thr Pro Ser Pro Thr
        435                 440                 445
Gln Met Arg Leu Met Leu Gln Ser Thr Asp Asp Leu Pro Leu Asn Phe
    450                 455                 460
Gly Phe Thr Gly Lys Gly Ser Ser Ser Lys Pro Asp Glu Leu His Glu
465                 470                 475                 480
Ile Ile Lys Ala Gly Ala Met Gly Leu Lys Leu His Glu Asp Trp Gly
                485                 490                 495
Ser Thr Pro Ala Ala Ile Asp Asn Cys Leu Thr Ile Ala Glu His His
            500                 505                 510
Asp Ile Gln Ile Asn Ile His Thr Asp Thr Leu Asn Glu Ala Gly Phe
        515                 520                 525
Val Glu His Ser Ile Ala Ala Phe Lys Gly Arg Thr Ile His Thr Tyr
    530                 535                 540
His Ser Glu Gly Ala Gly Gly Gly His Ala Pro Asp Ile Ile Lys Val
545                 550                 555                 560
Cys Gly Ile Lys Asn Val Leu Pro Ser Ser Thr Asn Pro Thr Arg Pro
                565                 570                 575
Leu Thr Ser Asn ThrIle Asp Glu His Leu Asp Met Leu Met Val Cys
            580                585                 590
His His Leu Asp Arg Glu Ile Pro Glu Asp Leu Ala Phe Ala His Ser
        595                 600                 605
Arg Ile Arg Lys Lys Thr Ile Ala Ala Glu Asp Val Leu Asn Asp Ile
    610                 615                 620
Gly Ala Ile Ser Ile Ile Ser Ser Asp Ser Gln Ala Met Gly Arg Val
625                 630                 635                 640
Gly Glu Val  Ile Ser Arg Thr Trp Gln Thr Ala Asp Lys Met Lys Ala
                 645                 650                 655
Gln Thr Gly Pro Leu Lys Cys Asp Ser Ser Asp Asn Asp Asn Phe Arg
            660                 665                 670
Ile Arg Arg Tyr Ile Ala Lys Tyr Thr Ile Asn Pro Ala Ile Ala Asn
        675                 680                 685
Gly Phe Ser Gln Tyr Val Gly Ser Val Glu Val Gly Lys Leu Ala Asp
    690                 695                 700
Leu Val Met Trp Lys Pro Ser Phe Phe Gly Thr Lys Pro Glu Met Val
705                 710                 715                 720
Ile Lys Gly Gly Met Val Ala Trp Ala Asp Ile Gly Asp Pro Asn Ala
                725                 730                 735
Ser Ile Pro Thr Pro Glu Pro Val Lys Met Arg Pro Met Tyr Gly Thr
            740                 745                 750
Leu Gly Lys Ala Gly Gly Ala Leu Ser Ile Ala Phe Val Ser Lys Ala
        755                 760                 765
Ala Leu Asp Gln Arg Val Asn Val Leu Tyr Gly Leu Asn Lys Arg Val
   770                  775                 780
Glu Ala Val  Ser Asn Val Arg Lys Leu Thr Lys Leu Asp Met Lys Leu
785                  790                 795                 800
Asn Asp Ala Leu Pro Glu Ile Thr Val Asp Pro Glu Ser Tyr Thr Val
                805                 810                 815
Lys Ala Asp Gly Lys Leu Leu Cys Val Ser Glu Ala Thr Thr Val  Pro
            820                 825                 830
Leu Ser Arg Asn Tyr Phe Leu Phe
        835                 840

Claims (23)

1.用于抑制哺乳动物患者癌细胞生长的含有药学载体中的尿激酶的药物组合物。
2.根据权利要求1所述的组合物，当将组合物给予患者时，其包括有效地提高酶向癌细胞释放的化学整体。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述的化学整体包括亲水性聚合物(i)结合至尿素酶，(ii)选自聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯甲醚、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚羟丙基甲基丙烯酸酯、聚羟乙基丙烯酸酯、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟乙基噁唑啉、聚羟丙基噁唑啉、聚天冬酰胺，以及亲水性纤维素衍生物，和(iii)以有效地延长血液循环时间或降低所述组合物相对于天然尿素酶抗原性的量存在。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述的亲水性聚合物是具有约1,000至10,000道尔顿分子量的聚乙二醇。
5.根据权利要求2或3所述的组合物，其中所述的化学整体是连接至所述尿素酶的靶向部分，且选自抗肿瘤抗原抗体、抗-hCG抗体，和能够特异性结合至癌细胞表面受体的配体。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述的靶向部分是多肽，且所述所述的组合物是靶向部分和尿素酶的融合蛋白。
7.根据权利要求5所述的组合物，其中所述的尿素酶在其C-或N-端包括特征为通过所选择电荷以及能与第二个相反电荷螺旋形肽相互作用的能力的第一个螺旋形肽，形成稳定的α-螺旋卷曲螺旋型杂二聚体，且所述的化学整体包括含有所述第二个螺旋形肽的靶向部分。
8.根据权利要求2所述的组合物，其中所述的化学整体包括以包裹形式含有尿素酶的小泡。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述的小泡是脂质体，当组合物是静脉内给药时，其依靠聚乙二醇链外涂层长效循环，且大小能溢出进入肿瘤区域。
10.根据权利要求8所述的组合物，其中所述小泡是具有表面结合靶向部分的脂质体，表面结合靶向部分选自抗肿瘤抗原抗体、抗-hCG抗体，和能够特异性结合至癌细胞表面受体的配体。
11.根据权利要求2所述的组合物，其中所述的化学整体包括与其相关的尿素酶抑制剂，其量足够抑制所述酶活性。
12.根据权利要求1所述的组合物，其中所述尿素酶是植物或细菌尿素酶。
13.根据权利要求1所述的组合物，进一步包括选自尿素、治疗活性抗肿瘤试剂和显影剂的试剂。
14.根据权利要求13所述的组合物，其进一步包括以包裹形式含有尿素酶和试剂的小泡。
15.根据权利要求1所述的组合物，进一步包括弱碱性抗肿瘤化合物，其效能是通过实体肿瘤中较高胞内/较低胞外pH梯度来减少的。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中抗肿瘤化合物选自阿霉素、柔红霉素、米托蒽醌、表柔比星、丝裂霉素、博来霉素、长春花属生物碱如长春碱和长春新碱、烷化剂如环磷酰胺和氮芥盐酸盐，和antrineoplastic嘌呤和嘧啶衍生物。
17.尿素酶在制备用于治疗或诊断哺乳动物患者癌症的药物中的用途。
18.根据权利要求17所述的用途，用于制备治疗哺乳动物患者实体肿瘤的药物。
19.根据权利要求17所述的用途，用于制备治疗用弱碱性抗肿瘤化合物治疗的患者的实体肿瘤药物，弱碱性抗肿瘤化合物的效能是通过实体肿瘤中较高胞内/较低胞外pH梯度来减少的。
20.根据权利要求17所述的用途，用于制备产生关于患者实体肿瘤区域内pH诊断信息的药物。
21.用于抑制哺乳动物患者癌细胞生长的基因治疗组合物，包括当给予将药物患者时，有效地选择转染癌细胞的靶向载体，和所述载体携带的在转染癌细胞中有效产生尿素酶mRNA的重组核酸序列。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述的载体是腺病毒。
23.根据权利要求21的基因治疗组合物，其中所述的序列编码尿素酶和有效促进尿素酶从转染癌细胞分泌的分泌前导序列。
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ZA (1) ZA200500423B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105247047A (zh) * 2013-04-08 2016-01-13 赫利克斯生物药品公司 抗体-尿素酶偶联物在诊断和治疗中的应用
CN113433087A (zh) * 2021-06-22 2021-09-24 中南大学 一种尿素浓度快速检测方法及检测传感器和应用

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7264800B2 (en) * 2002-07-18 2007-09-04 Helix Biopharma Corporation Method and composition for inhibiting cancer cell growth
AU2003272341A1 (en) * 2002-09-11 2004-04-30 Duke University Methods and compositions for blood pool identification, drug distribution quantification and drug release verification
US7769423B2 (en) * 2002-09-11 2010-08-03 Duke University MRI imageable liposomes for the evaluation of treatment efficacy, thermal distribution, and demonstration of dose painting
US20070104732A1 (en) * 2003-10-24 2007-05-10 Bernard Massie Ligand-pseudoreceptor system for generation of adenoviral vectors with altered tropism
IL182956A0 (en) * 2007-05-03 2008-01-20 Yeda Res & Dev Glycan modified soluble receptors and binding proteins and their use
US8892184B2 (en) 2010-10-18 2014-11-18 Siemens Medical Solutions Usa, Inc. Systems and methods for reducing interference in a dual modality imaging system
CN107206103A (zh) 2015-01-23 2017-09-26 赫利克斯生物药品公司 用于治疗目的的抗体‑脲酶缀合物
CN110022891A (zh) 2016-09-24 2019-07-16 赫利克斯生物药品公司 恢复肿瘤酸化t细胞的功能
JP2020504761A (ja) * 2017-01-05 2020-02-13 へリックス バイオファーマ コープ． 抗ｖｅｇｆｒ−２ウレアーゼコンジュゲート
US20230181570A1 (en) * 2020-05-20 2023-06-15 Medrx Co., Ltd. Transdermal Formulation Containing Apomorphine
CN115803035A (zh) * 2020-06-15 2023-03-14 株式会社Kortuc 抗癌疗法的增敏剂

Family Cites Families (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4329332A (en) 1978-07-19 1982-05-11 Patrick Couvreur Biodegradable submicroscopic particles containing a biologically active substance and compositions containing them
US4489055A (en) 1978-07-19 1984-12-18 N.V. Sopar S.A. Process for preparing biodegradable submicroscopic particles containing a biologically active substance and their use
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
FR2504010B1 (fr) 1981-04-15 1985-10-25 Sanofi Sa Medicaments anticancereux contenant la chaine a de la ricine associee a un anticorps antimelanome et procede pour leur preparation
FR2504408B1 (fr) 1981-04-24 1986-02-14 Couvreur Patrick Procede de preparation de particules submicroscopiques, particules ainsi obtenues et compositions pharmaceutiques les contenant
US4671958A (en) 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
DE3377484D1 (en) 1982-04-19 1988-09-01 Nissan Motor Method for controlling reduction ratio of continuously variable transmission with acceleration compensation
US4824783A (en) 1983-12-20 1989-04-25 Enichem S.P.A. Oxidized sulfur derivatives of diaminophosphinyl compounds as urease inhibitors
US4545985A (en) 1984-01-26 1985-10-08 The United States Of America As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Pseudomonas exotoxin conjugate immunotoxins
US4894443A (en) 1984-02-08 1990-01-16 Cetus Corporation Toxin conjugates
US4625014A (en) 1984-07-10 1986-11-25 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Cell-delivery agent
US4542225A (en) 1984-08-29 1985-09-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Acid-cleavable compound
US4659839A (en) 1984-10-10 1987-04-21 Mallinckrodt, Inc. Coupling agents for radiolabeled antibody fragments
ATE66469T1 (de) 1985-01-14 1991-09-15 Neorx Corp Metall-radionuklid markiertes protein fuer diagnose und therapie.
US4837380A (en) * 1985-09-30 1989-06-06 Regents Of University Of California Liposome-calcitonin preparation
US4699784A (en) 1986-02-25 1987-10-13 Center For Molecular Medicine & Immunology Tumoricidal methotrexate-antibody conjugate
US4680333A (en) 1986-04-14 1987-07-14 National Starch And Chemical Corporation Removable hot melt pressure sensitive adhesive
US4867962A (en) 1988-02-26 1989-09-19 Neorx Corporation Functionally specific antibodies
CA1340323C (en) 1988-09-20 1999-01-19 Arnold E. Hampel Rna catalyst for cleaving specific rna sequences
FR2637612B1 (fr) 1988-10-06 1993-09-10 Pasteur Institut Sequences de nucleotides codant pour une proteine a activite ureasique
EP0460607A3 (en) * 1990-06-05 1992-04-01 Bristol-Myers Squibb Company Novel monoclonal antibody to novel antigen associated with human tumors
US5298399A (en) 1990-08-10 1994-03-29 Sapporo Breweries Limited Gene and process for producing a thermostable urease
US5140100A (en) 1990-12-28 1992-08-18 Cedars-Sinai Medical Center Protein that inhibits production of human choriogonadotropin
FR2683159B1 (fr) 1991-10-31 1994-02-25 Coletica Procede de fabrication de nanocapsules a paroi a base de proteines reticulees; nanocapsules ainsi obtenues et compositions cosmetiques, pharmaceutiques et alimentaires en comportant application.
US5573934A (en) * 1992-04-20 1996-11-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Gels for encapsulation of biological materials
EP0633943A4 (en) * 1992-04-03 1997-05-02 Alexander T Young GENTHERAPY USING TARGETED VIRAL VECTORS.
US5976535A (en) 1992-06-09 1999-11-02 Neorx Corporation Pretargeting protocols for the enhanced localization of cytotoxins to target sites and cytotoxic combinations useful therefore
US6358490B2 (en) 1992-06-09 2002-03-19 Neorx Corporation Three-step pretargeting methods and compounds
US6290962B1 (en) * 1992-11-03 2001-09-18 Oravax, Inc. Urease-based vaccine and treatment for helicobacter infection
GB9300875D0 (en) 1993-01-18 1993-03-10 Ucb Sa Nanocapsule containing pharmaceutical compositions
WO1994018955A1 (en) 1993-02-22 1994-09-01 Alza Corporation Compositions for oral delivery of active agents
WO1995014093A1 (en) * 1993-05-19 1995-05-26 Institut Pasteur Immunogenic compositions against helicobacter infection, polypeptides for use in the compositions and nucleic acid sequences encoding said polypeptides
WO1995031480A1 (en) * 1994-05-18 1995-11-23 S.P.I. Synthetic Peptides Incorporated Heterodimer polypeptide immunogen carrier composition and method
GB9417873D0 (en) 1994-09-06 1994-10-26 Sandoz Ltd Organic compounds
US5886143A (en) 1994-12-07 1999-03-23 Neorx Corporation Hepatic-directed compounds and reagents for preparation thereof
US6172045B1 (en) 1994-12-07 2001-01-09 Neorx Corporation Cluster clearing agents
FR2732605B1 (fr) * 1995-04-07 1997-05-16 Pasteur Merieux Serums Vacc Composition destinee a l'induction d'une reponse immunitaire mucosale
DK0848757T3 (da) * 1995-09-06 2002-07-01 Austrian Nordic Biotherapeutic Anvendelse af WAP eller MMTV regulatoriske sekvenser for målrettet ekspression af sammenkædede heterologe gener i humane mammae celler, inklusiv humane mammae carcinoma celler
AU1846297A (en) 1996-01-31 1997-08-22 Regents Of The University Of California, The Method for inhibiting tumor cell growth
EP0894139A1 (en) 1996-03-20 1999-02-03 Board Of Regents The University Of Texas System Sensitization of her-2/neu overexpressing cancer cells to chemotherapy
JPH1017492A (ja) * 1996-07-02 1998-01-20 Fuji Yakuhin Kogyo Kk 腫瘍細胞増殖抑制剤
US5958892A (en) 1996-07-30 1999-09-28 Board Of Regents, The University Of Texas System 2-methoxyestradiol-induced apoptosis in cancer cells
US5750496A (en) * 1996-08-12 1998-05-12 Utah State University Method of controlling cryptosporidium infectons using protease inhibitors
EP0824019B1 (en) * 1996-08-13 2002-11-20 Quest International B.V. Inhibition or reduction of oral malodour
WO1998016201A1 (en) 1996-10-11 1998-04-23 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic liposome composition and method
US6261537B1 (en) 1996-10-28 2001-07-17 Nycomed Imaging As Diagnostic/therapeutic agents having microbubbles coupled to one or more vectors
CN1181422A (zh) * 1996-10-31 1998-05-13 上海市肿瘤研究所 与生长因子受体结合的多肽所构建的基因转移载体
US6180114B1 (en) 1996-11-21 2001-01-30 University Of Washington Therapeutic delivery using compounds self-assembled into high axial ratio microstructures
US6045774A (en) 1997-01-10 2000-04-04 Epicyte Pharmaceutical Inc. J chain polypeptide targeting molecule linked to an imaging agent
GB9703633D0 (en) 1997-02-21 1997-04-09 Imp Cancer Res Tech Cancer therapy
US6190923B1 (en) 1997-09-05 2001-02-20 David K. Johnson Diethylenetriamine-N,N′,N″-triacetic acid derivatives
FR2772025B1 (fr) 1997-12-10 2000-03-03 Guerbet Sa Chelates metalliques de macrocycles polyaminocarboxyliques et leur application a l'imagerie par resonance magnetique
US6426086B1 (en) * 1998-02-03 2002-07-30 The Regents Of The University Of California pH-sensitive, serum-stable liposomes
US6753310B1 (en) * 1998-10-16 2004-06-22 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Neovascular-specific peptides
AU5646800A (en) 1999-03-02 2000-09-21 Helix Biopharma Corporation Card-based biosensor device
FR2790405B1 (fr) 1999-03-02 2001-04-20 Oreal Nanocapsules a base de polymeres dendritiques
US6159443A (en) 1999-04-29 2000-12-12 Vanderbilt University X-ray guided drug delivery
AU784045B2 (en) * 1999-06-25 2006-01-19 Genentech Inc. Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies
US6307372B1 (en) 1999-11-02 2001-10-23 Glaxo Wellcome, Inc. Methods for high throughput chemical screening using magnetic resonance imaging
US6514481B1 (en) 1999-11-22 2003-02-04 The Research Foundation Of State University Of New York Magnetic nanoparticles for selective therapy
US20020041898A1 (en) 2000-01-05 2002-04-11 Unger Evan C. Novel targeted delivery systems for bioactive agents
JPWO2002015925A1 (ja) * 2000-08-22 2004-07-08 協和醗酵工業株式会社 アポトーシスの制御方法およびアポトーシス制御ポリペプチド
US7148038B2 (en) * 2001-10-16 2006-12-12 Raven Biotechnologies, Inc. Antibodies that bind to cancer-associated antigen CD46 and methods of use thereof

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105247047A (zh) * 2013-04-08 2016-01-13 赫利克斯生物药品公司 抗体-尿素酶偶联物在诊断和治疗中的应用
CN109248311A (zh) * 2013-04-08 2019-01-22 赫利克斯生物药品公司 抗体-尿素酶偶联物在诊断和治疗中的应用
CN113433087A (zh) * 2021-06-22 2021-09-24 中南大学 一种尿素浓度快速检测方法及检测传感器和应用

Also Published As

Publication number Publication date
KR20110123786A (ko) 2011-11-15
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RU2326691C2 (ru) 2008-06-20
SI1530482T1 (sl) 2014-03-31
PL217626B1 (pl) 2014-08-29
US20040115186A1 (en) 2004-06-17
EP1530482B1 (en) 2013-10-23
CA2492472A1 (en) 2004-01-29
WO2004009112A1 (en) 2004-01-29
WO2004009112A8 (en) 2005-09-15
BR0312664A (pt) 2005-05-03
ES2443416T3 (es) 2014-02-19
UA81634C2 (ru) 2008-01-25
PL374675A1 (en) 2005-10-31
JP5850561B2 (ja) 2016-02-03
JP2016014066A (ja) 2016-01-28
KR101352826B1 (ko) 2014-01-17
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AU2003250658A1 (en) 2004-02-09
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IL166249A0 (en) 2006-01-15
CA2492472C (en) 2014-01-07
IL166249A (en) 2011-10-31
NZ538284A (en) 2008-04-30
MXPA05000778A (es) 2005-08-29
RU2005104113A (ru) 2005-09-10
US7211250B2 (en) 2007-05-01
JP2006501196A (ja) 2006-01-12
ZA200500423B (en) 2006-08-30

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