CN1934266A - 抗肌肉生长抑素抗体 - Google Patents
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Abstract
在人肌肉生长抑素成熟形式的氨基酸40－64内鉴定了中和表位。结合该表位的抗体处于本发明的范围内并可以是鼠的、嵌合的或人源化抗体、抗体的免疫连接物或其抗原结合片段。本发明的抗体可用于增加肌肉量、增加骨密度，或用于在哺乳动物中治疗多种紊乱。
Description
技术领域
本发明属于医学领域，特别是属于抗肌肉生长抑素(myostatin)的单克隆抗体领域。更具体地，本发明涉及中和性抗肌肉生长抑素单克隆抗体，该抗体结合在肌肉生长抑素成熟形式上鉴定的新表位。本发明的抗体可以是鼠的、嵌合的或人源化的抗体、抗体的免疫缀合物或其抗原结合片段。本发明的抗体可用于哺乳动物以增加肌肉量、增加骨密度，或用于治疗其中肌肉生长抑素的存在引起或促进不期望的病理效果或其中肌肉生长抑素水平的减少促进理想的治疗效果的疾病。
背景技术
β-转化生长因子(TGF-β)超家族蛋白质的成员涉及胚胎发育和成年组织的内环境稳定。TGF-β超家族成员具有相同的结构，该结构包括蛋白分泌所需的短肽信号序列和氨基末端片段，所述的该氨基末端片段通过蛋白质水解从大的前体蛋白质(“前蛋白质”)的羧基末端裂解约105-140个氨基酸而产生成熟蛋白质。成熟蛋白质的特征是高度保守的半胱氨酸残基，而该蛋白质的活性形式是二硫键连接的成熟蛋白质二聚体(Gray，A.，和Maston，A.，Science，247：1328，1990)。也发现了TGF-β超家族成员的异二聚体并显示具有与同型二聚体不同的生物学特性。
肌肉生长抑素(也称为生长分化因子-8(GDF-8))是TGF-β超家族蛋白质的成员。肌肉生长抑素主要在发育的和成熟的骨骼肌中表达并行使骨骼肌的负调节物的功能。肌肉生长抑素在不同物种中高度保守；在人、小鼠、大鼠和奶牛中的肌肉生长抑素成熟形式的氨基酸序列是100％相同的。本发明中确定的免疫原性表位在人、小鼠、大鼠、鸡、狗、马、山羊、绵羊、奶牛和猪中是100％相同的。生长分化因子11(也称为GDF-11或BMP-11)是与肌肉生长抑素最同源的TGF-β超家族蛋白质成员。人肌肉生长抑素和GDF-11在它们成熟链内的氨基酸水平上是90％相同的。
美国专利NO.5,827,733教导了人肌肉生长抑素的多核苷酸序列和氨基酸序列，而美国专利NO.6,096,506要求对与GDF-8多肽或其表位特异性反应的抗体享有权利。美国专利申请2003/0138422要求对特异性结合含有特定肽的GDF-8蛋白质的抗体享有权利。美国专利NO.6,468,535要求对通过施用抗GDF-8抗体来增加动物肌肉量的方法享有权利。美国专利NO.6,368,597教导了使用GDF-8抗体来治疗糖尿病。
目前存在有限的将得益于肌肉量和/或肌肉强度的增加的紊乱或病症的有效治疗，所述的疾症或病症包括肌肉萎缩症、虚弱、病危护理肌病和癌症或其它病症导致的恶病质，包括但不限于HIV感染、病危护理和肌病。由于其作为骨骼肌生长的负调节物的作用，肌肉生长抑素是治疗介入这些病症的一个理想靶标。对特异性抑制肌肉生长抑素而不抑制或最低程度抑制其它TGF-β超家族蛋白质活性的手段存在极大的治疗需要。也存在特异性降低存在于患者中的肌肉生长抑素的水平而不相应地降低其它TGF-β超家族蛋白质的水平的治疗需要。特别是，对肌肉生长抑素有特异性反应(例如，特异性结合或识别肌肉生长抑素或其部分)且与蛋白质TGF-β超家族的其它成员(如GDF-11)具有显著少的反应性或无反应性的单克隆抗体可能提供特别有利的疗法以增加肌肉量和/或增加肌肉强度的。特别具有治疗效用的是这种单克隆抗体的嵌合或人源化形式。肌肉生长抑素在各物种间在序列上和功能上是高度保守的；因此，这样一种抗体不仅可能可用于在人中治疗这种紊乱，而且也可用于在其它哺乳动物包括，例如，家畜(例如犬和猫)、运动动物(例如马)和食物源动物(例如，牛、猪、鸟和羊)中治疗这种紊乱，特别是当抗体的构架区和恒定区基本源于其中将该抗体用来治疗的动物物种时。本发明的抗肌肉生长抑素抗体也可用于治疗得益于肌肉生长抑素水平降低的紊乱或病症，包括(但不限于)得益于增加骨密度的那些疾病(例如骨质疏松症)、II型糖尿病、代谢综合征、肥胖症、骨关节炎、脓毒症、慢性阻塞性肺疾病(“COPD”)和与肌肉萎缩相关的病症，如肾脏病、心力衰竭或心脏病和肝病。
本发明的抗肌肉生长抑素提供相对本领域其它抗肌肉生长抑素抗体的优势。本发明提供能结合由肌肉生长抑素成熟形式的残基40-64处的氨基酸(例如人肌肉生长抑素的SEQ ID NO：46)组成的多肽并且体外、体内或原位中和肌肉生长抑素活性的中和性抗肌肉生长抑素单克隆抗体。因为TGF-β家族成员具有高度同源性(例如，肌肉生长抑素与GDF-11约90％同源)，抗肌肉生长抑素抗体如本发明的那些抗体，其与在建立骨骼模式中起重要作用的GDF-11(McPherron，A.，等，Nature Genetics，22：260-265，1999)不交叉反应或最低程度交叉反应，相比于与GDF-1更大程度地交叉反应的抗体，其优选用于治疗用途。
发明概述
本发明描述了抗肌肉生长抑素单克隆抗体，或其抗原结合片段，所述的单克隆抗体或其片段特异性结合或识别由来自哺乳动物源的肌肉生长抑素成熟形式的氨基酸40-64组成的多肽，优选由来自人的ANYCSGE
CEFVFLQKYPHTHLVHQA(SEQ ID NO：46)组成的多肽，或由序列：ANYCSGE
SEFVFLQKYPHTHLVHQA(SEQ ID NO：43)组成的多肽。这种抗体在此称为“本发明的单克隆抗体”或“本发明抗体”。本发明的单克隆抗体可以是鼠的、嵌合的或人源化抗体、这种抗体的免疫缀合物或其抗原结合片段。优选本发明的单克隆抗体存在于同源的或基本同源的群体中。优选本发明的单克隆抗体在跨越氨基酸ANYCSGE
CEFVFLQKYPHTHLVHQA(SEQ ID NO：46)的结构域内结合肌肉生长抑素(该蛋白质的前蛋白质或成熟形式，单体或二聚体形式)并因而拮抗或中和与肌肉生长抑素或其一部分相关的至少一种体外、体内或原位生物活性或特性。
本发明的单克隆抗体相较于GDF-11优先结合或识别肌肉生长抑素，所述的GDF-11是其成熟形式与肌肉生长抑素的成熟形式具有约90％的氨基酸同源性的TGF-β超家族的成员。优选地，所述的抗体以比它们结合GDF-11的亲和性或特异性更大的亲和性或特异性结合肌肉生长抑素，所述的亲和性或特异性例如由ELISA测定法、竞争性ELISA测定法或BIAcore测定法中的KD值(例如，见实施例4)确定。而且，本发明的单克隆抗体对于结合肌肉生长抑素比对于结合GDF-11可能具有更有利的Kon、Koff或Ka值。优选本发明的抗体与GDF-11不交叉反应或与GDF-11以5％、4％、3％、2％、1％或更低的水平交叉反应。
在一个实施方案中，本发明的抗肌肉生长抑素克隆抗体含有具有选自SEQ ID NO：3、4、5、6、7、8、9、10和11的氨基酸序列的轻链可变区(“LCVR”)的多肽。在一个实施方案中，本发明的抗肌肉生长抑素克隆抗体含有具有选自SEQ ID NO：12、13、14、15、16和17的氨基酸序列的重链可变区(“HCVR”)的多肽。在另一个实施方案中，本发明的抗肌肉生长抑素含有具有SEQ ID NO：12的HCVR多肽，所述的SEQ ID NO：12的氨基酸26-37由SEQ ID NO：47、48、49、50、51、52、53或54替换。与每个SEQ ID号相关的序列显示于这里的表1和2以及图4和5中。
在另一个实施方案中，本发明的抗肌肉生长抑素克隆抗体含有(a)具有选自SEQ ID NO：3、4、5、6、7、8、9、10和11的氨基酸序列的LCVR多肽和(b)具有选自SEQ ID NO：12、13、14、15、16和17的氨基酸序列的HCVR多肽或具有SEQ ID NO：12的HCVR多肽，所述的SEQ IDNO：12的氨基酸26-37由SEQ ID NO：47、48、49、50、51、52、53或54替换。可考虑含有上述LCVR和HCVR多肽的任意组合的本发明抗体，但优选含有以下LCVR和HCVR组合的抗体：(i)SEQ ID NO：3和12；(ii)SEQ ID NO：4和13；(iii)SEQ ID NO：3和14；(iv)SEQ ID NO：5和12；(v)SEQ ID NO：6和15；(vi)SEQ ID NO：7和17；(vii)SEQ IDNO：8和12；(viii)SEQ ID NO：9和16；(ix)SEQ ID NO：10和12；(x)SEQ ID NO：11和12；(xi)SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：12，该SEQ IDNO：12的氨基酸26-37由SEQ ID NO：47、48、49、50、51、52、53或54替换。
在另一个实施方案中，本发明的单克隆抗体是一种能与竞争性抗体竞争结合至人肌肉生长抑素或人肌肉生长抑素的部分的单克隆抗体，所述竞争性抗体含有具有下面显示序列的两个多肽：(i)SEQ ID NO：3和12、(ii)SEQ ID NO：4和13、(iii)SEQ ID NO：3和14、(iv)SEQ ID NO：5和12、(v)SEQ ID NO：6和15、(vi)SEQ ID NO：7和17、(vii)SEQ IDNO：8和12、(viii)SEQ ID NO：9和16，(ix)SEQ ID NO：10和12、(x)SEQ ID NO：11和12和(xi)SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：12，该SEQ ID NO：12的氨基酸26-37由SEQ ID NO：47、48、49、50、51、52、53或54替换。
在另一个实施方案中，本发明的抗肌肉生长抑素单克隆抗体的LCVR含有选自具有如SEQ ID NO：38、23和56(见表1)中显示的序列的肽的1、2或3种肽。优选当具有SEQ ID NO：38中显示序列的肽存在于所述抗体中时，其位于LCVR CDR1。优选地，当具有SEQ ID NO：23中显示序列的肽存在于所述抗体中时，其位于LCVR CDR2。优选地，当具有SEQID NO：56中显示的序列的肽存在于所述抗体中时，其位于LCVR CDR3。
在另一个实施方案中，本发明的抗肌肉生长抑素单克隆抗体的LCVR含有选自具有如(a)SEQ ID NO：18、19、20、21或22；(b)SEQ ID NO：23和(c)SEQ ID NO：24、25、26、27或28中显示的序列的肽的1、2或3种肽。优选地，当具有SEQ ID NO：18、19、20、21或22中显示的序列的肽存在于所述的抗体时，其位于LCVR CDR1。优选地，当具有在SEQ ID NO：23中显示的序列的肽存在于本发明的抗体时，其位于LCVRCDR2。优选地，当具有在SEQ ID NO：24、25、26、27或28中显示的序列的肽存在于本发明的抗体时，其位于LCVR CDR3。LCVR将还含有构架序列。在用于在人中治疗用途的人源化抗体中，构架序列可以是基本人源的。在用于非人动物中的抗体中，构架区序列可以基本源于其中该抗体用来治疗的动物的基因组。
在另一个实施方案中，本发明的抗肌肉生长抑素单克隆抗体的HCVR含有选自具有如SEQ ID NO：55，41和42(见表2)中显示序列的肽的1、2或3种肽。优选地，当具有在SEQ ID NO：55中显示的序列的肽存在于本发明的抗体时，其位于HCVR CDR1。优选地，当具有在SEQ ID NO：41中显示的序列的肽存在于本发明的抗体时，其位于HCVR CDR2。优选地，当具有在SEQ ID NO：42中显示的序列的肽存在于本发明的抗体时，其位于HCVR CDR3。
在另一个实施方案中，本发明的抗肌肉生长抑素单克隆抗体含有选自具有如在(a)SEQ ID NO：29、30、31、47、48、49、50、51、52、53或54；(b)SEQ ID NO：32、33、34或35；和(c)36或37中显示序列的肽的1、2或3种肽。优选地，当具有在SEQ ID NO：32、33、34或35中显示的序列的肽存在于本发明的抗体时，其位于HCVR CDR2。优选地，当具有在SEQ ID NO：36或37中显示的序列的肽存在于本发明的抗体时，其位于HCVR CDR3。HCVR将还包含构架序列。在用于人中治疗用途的人源化抗体中，构架序列可以是基本人源的。在用于非人动物中的抗体中，该构架序列可以基本源于其中该抗体用来治疗的动物的基因组。
本发明的一个实施方案提供含有具有在SEQ ID NO：38、23、56、55、41和42中显示序列的六种肽的抗肌肉生长抑素单克隆抗体。优选地，在所述的抗体中，具有SEQ ID NO：38中显示序列的肽位于LCVR CDR1，具有SEQ ID NO：23中显示序列的肽位于LCVR CDR2，具有SEQ ID NO：56中显示序列的肽位于LCVR CDR3，具有SEQ ID NO：55中显示序列的肽位于HCVR CDR1，具有SEQ ID NO：41中显示序列的肽位于HCVRCDR2，以及具有SEQ ID NO：42中显示序列的肽位于HCVR CDR3。
本发明的另一个实施方案提供含有具有在SEQ ID NO：(i)18；(ii)23；(iii)24；(iv)29、47、48、49、50、51、52、53或54；(v)32；和(vi)36中显示序列的六种肽的抗肌肉生长抑素单克隆抗体。优选地，在所述的抗体中，具有SEQ ID NO：18中显示序列的肽位于LCVR CDR1，具有SEQ ID NO：23中显示序列的肽位于LCVR CDR2，具有SEQ ID NO：24中显示序列的肽位于LCVR CDR3，具有SEQ ID NO：29、47、48、49、50、51、52、53或54中显示序列的肽位于HCVR CDR1，具有SEQ ID NO：32中显示序列的肽位于HCVR CDR2，以及具有SEQ ID NO：36中显示序列的肽位于HCVR CDR3。
本发明的另一个实施方案提供含有具有在SEQ ID NO：19、23、25、30、33和37中显示序列的六种肽的抗肌肉生长抑素单克隆抗体。优选地，在所述的抗体中，具有SEQ ID NO：19中显示序列的肽位于LCVR CDR1，具有SEQ ID NO：23中显示序列的肽位于LCVR CDR2，具有SEQ ID NO：25中显示序列的肽位于LCVR CDR3，具有SEQ ID NO：30中显示序列的肽位于HCVR CDR1，具有SEQ ID NO：33中显示序列的肽位于HCVRCDR2，以及具有SEQ ID NO：37中显示序列的肽位于HCVR CDR3。
本发明的另一个实施方案提供含有具有在SEQ ID NO：18、23、24、31、32和36中显示序列的六种肽的抗肌肉生长抑素单克隆抗体。优选地，在所述的抗体中，具有SEQ ID NO：18中显示序列的肽位于LCVR CDR1，具有SEQ ID NO：23中显示序列的肽位于LCVR CDR2，具有SEQ ID NO：24中显示的序列肽位于LCVR CDR3，具有SEQ ID NO：31中显示的序列肽位于HCVR CDR1，具有SEQ ID NO：32中显示序列的肽位于HCVRCDR2，以及具有SEQ ID NO：36中显示序列的肽位于HCVR CDR3。
本发明的另一个实施方案提供含有具有在SEQ ID NO：20、23、25、29、32和36中显示序列的六种肽的抗肌肉生长抑素单克隆抗体。优选地，在所述的抗体中，具有SEQ ID NO：20中显示序列的肽位于LCVR CDR1，具有SEQ ID NO：23中显示序列的肽位于LCVR CDR2，具有SEQ ID NO：25中显示序列的肽位于LCVR CDR3，具有SEQ ID NO：29中显示序列的肽位于HCVR CDR1，具有SEQ ID NO：32中显示序列的肽位于HCVRCDR2，以及具有SEQ ID NO：36中显示序列的肽位于HCVR CDR3。
本发明的另一个实施方案提供含有具有在SEQ ID NO：20、23、26、30、34和36中显示序列的六种肽的抗肌肉生长抑素单克隆抗体。优选地，在所述的抗体中，具有SEQ ID NO：20中显示序列的肽位于LCVR CDR1，具有SEQ ID NO：23中显示序列的肽位于LCVR CDR2，具有SEQ ID NO：26中显示序列的肽位于LCVR CDR3，具有SEQ ID NO：30中显示序列的肽位于HCVR CDR1，具有SEQ ID NO：34中显示序列的肽位于HCVRCDR2，以及具有SEQ ID NO：36中显示序列的肽位于HCVR CDR3。
本发明的另一个实施方案提供含有具有在SEQ ID NO：18、23、24、29、35和36中显示序列的六种肽的抗肌肉生长抑素单克隆抗体。优选地，在所述的抗体中，具有SEQ ID NO：18中显示序列的肽位于LCVR CDR1，具有SEQ ID NO：23中显示序列的肽位于LCVR CDR2，具有SEQ ID NO：24中显示序列的肽位于LCVR CDR3，具有SEQ ID NO：29中显示序列的肽位于HCVR CDR1，具有SEQ ID NO：35中显示序列的肽位于HCVRCDR2，以及具有SEQ ID NO：36中显示序列的肽位于HCVR CDR3。
本发明的另一个实施方案提供含有具有在SEQ ID NO：18、23、27、29、32和36中显示序列的六种肽的抗肌肉生长抑素单克隆抗体。优选地，在所述的抗体中，具有SEQ ID NO：18中显示序列的肽位于LCVR CDR1，具有SEQ ID NO：23中显示序列的肽位于LCVR CDR2，具有SEQ ID NO：27中显示序列的肽位于LCVR CDR3，具有SEQ ID NO：29中显示序列的肽位于HCVR CDR1，具有SEQ ID NO：32中显示序列的肽位于HCVRCDR2，以及具有SEQ ID NO：36中显示序列的肽位于HCVR CDR3。
本发明的另一个实施方案提供含有具有在SEQ ID NO：21、23、28、29、32和36中显示序列的六种肽的抗肌肉生长抑素单克隆抗体。优选地，在所述的抗体中，具有SEQ ID NO：21中显示序列的肽位于LCVR CDR1，具有SEQ ID NO：23中显示序列的肽位于LCVR CDR2，具有SEQ ID NO：28中显示序列的肽位于LCVR CDR3，具有SEQ ID NO：29中显示序列的肽位于HCVR CDR1，具有SEQ ID NO：32的序列肽位于HCVR CDR2，以及具有SEQ ID NO：36中显示序列的肽位于HCVR CDR3。
本发明的另一个实施方案提供含有具有在SEQ ID NO：20、23、24、29、32和36中显示的序列的六种肽的抗肌肉生长抑素单克隆抗体。优选地，在所述的抗体中，具有SEQ ID NO：20中显示序列的肽位于LCVRCDR1，具有SEQ ID NO：23中显示序列的肽位于LCVR CDR2，具有SEQID NO：24中显示序列的肽位于LCVR CDR3，具有SEQ ID NO：29中显示序列的肽位于HCVR CDR1，具有SEQ ID NO：32中显示序列的肽位于HCVR CDR2，以及具有SEQ ID NO：36中显示序列的肽位于HCVRCDR3。
本发明的另一个实施方案提供含有具有在SEQ ID NO：22、23、27、29、32和36中显示序列的六种肽的抗肌肉生长抑素单克隆抗体。优选地，在所述的抗体中，具有SEQ ID NO：22中显示序列的肽位于LCVR CDR1，具有SEQ ID NO：23中显示序列的肽位于LCVR CDR2，具有SEQ ID NO：27中显示序列的肽位于LCVR CDR3，具有SEQ ID NO：29中显示序列的肽位于HCVR CDR1，具有SEQ ID NO：32中显示序列的肽位于HCVRCDR2，以及具有SEQ ID NO：36中显示序列的肽位于HCVR CDR3。
本发明的抗肌肉生长抑素单克隆抗体可以还含有选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM和IgD的重链恒定区。本发明的抗肌肉生长抑素单克隆抗体可以还含有κ或λ轻链恒定区。当抗体用作人治疗剂时，该恒定区优选是基本人源的。当抗体是在非人动物中用作治疗剂时，该恒定区优选基本源于其中该抗体用作治疗剂的动物。
本发明的抗肌肉生长抑素单克隆抗体可以含有或由完整的抗体(即全长)、基本完整的抗体、Fab片段、F(ab′ )2片段或单链Fv片段组成。
在一优选的实施方案中，本发明的抗肌肉生长抑素单克隆抗体是嵌合抗体。在一更优选的实施方案中，本发明的抗肌肉生长抑素单克隆抗体是人源化抗体，其中存在于抗体中的构架序列和恒定区序列是基本人源的。该人源化抗体优选是全长抗体。备选地，存在于该抗体中的构架区或其部分以及任一恒定区可以基本源于该抗体在其中用作治疗剂的动物的基因组，所述动物例如，家畜(例如犬、猫)、运动动物(例如马)和食物源动物(例如，牛、猪、鸟和羊)。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的核酸分子，所述核酸分子含有编码本发明抗体的LCVR、本发明抗体的HCVR或本发明的抗肌肉生长抑素单克隆抗体的核酸。一个编码本发明LCVR的示范性多核苷酸具有SEQ ID NO：44中显示的序列。一个编码本发明的HCVR的示范性多核苷酸具有SEQ ID NO：45中显示的序列。
在另一个实施方案中，本发明提供载体，优选(但不限于)含有编码本发明的抗肌肉生长抑素单克隆抗体的多核苷酸的质粒、重组表达载体、酵母表达载体或逆转录病毒表达载体。备选地，本发明的载体含有编码本发明LCVR的多核苷酸和/或编码HCVR的多核苷酸。当LCVR和HCVR编码序列同时存在于相同的载体时，它们可以从它们两者有效连接的一个启动子转录，或它们可以独立地，每个从其有效连接的分开的启动子转录。如果编码LCVR和HCVR的序列存在于相同的载体并从它们一起有效连接的一个启动子转录，LCVR可以5’连接至HCVR或LCVR可以3’连接至HCVR，而且载体中的LCVR和HCVR编码区可以由任意大小或含量的接头序列分开，优选地，这种序列(当存在时)是编码内部核糖体进入位点的多核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明提供含有本发明核酸分子的宿主细胞。优选地，本发明的宿主细胞含有一个或多个载体或构建体，所述载体或构建体含有本发明的核酸分子。本发明的宿主细胞是已经经引入(例如，通过转化、转导、感染)本发明载体的细胞，所述载体含有编码本发明抗体LCVR的多核苷酸和/或编码本发明HCVR的多核苷酸。本发明也提供已经引入本发明两种载体的宿主细胞；一种载体含有编码本发明抗体LCVR的多核苷酸而另一种载体含有编码存在于本发明抗体中的HCVR的多核苷酸并且各多核苷酸与启动子序列有效地连接。宿主细胞类型包括哺乳动物、细菌、植物和酵母细胞。优选的宿主细胞是CHO细胞、COS细胞、SP2/0细胞、NS0细胞、酵母细胞或任何优选的细胞类型的派生物或子代。
在另一个实施方案中，本发明提供制备本发明的抗肌肉生长抑素单克隆抗体的方法，方法包括在适于表达本发明的单克隆抗体的条件下培养本发明的宿主细胞(即已经用本发明的载体转化、转导或感染的宿主细胞)，由此这种抗体得以表达。该方法还可以包括从细胞或优选从所述细胞在其中生长的培养物中分离本发明单克隆抗体的步骤。
本发明包括通过用以下免疫源性肽注射非人动物(优选啮齿动物，更优选小鼠)产生本发明抗体的方法，所述免疫原性肽为：(i)由具有如SEQ ID NO：46或43中显示序列的肽组成的免疫源性肽，或(ii)由具有如SEQ ID NO：46或43中显示序列的肽的24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个连续氨基酸组成的免疫源性肽，优选所述免疫源性肽跨越这样的氨基酸残基，该氨基酸残基中1、2、3、4或5个所述连续氨基酸选自成熟肌肉生长抑素的残基号46、49、50、52和62处的氨基酸，其中所述残基号处的氨基酸不同于存在于GDF-11的等同位置上的氨基酸(见图3)，或(iii)由任一哺乳动物的肌肉生长抑素成熟形式的位置40-64处的氨基酸组成的免疫源性肽，或(iv)由24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5连续氨基酸组成的免疫源性肽，所述的连续氨基酸来自由任一哺乳动物成熟形式的位置40-64处的氨基酸组成的肽，优选所述的免疫源性肽跨越这样的氨基酸残基，该氨基酸残基中1、2、3、4或5个所述连续氨基酸不同于存在于相同哺乳动物中的GDF-11的等同位置处的氨基酸。使用本领域任何已知方法，从经免疫的动物产生抗肌肉生长抑素单克隆抗体，优选通过杂交瘤合成法。通过本领域任何可用的方法(例如噬菌体展示、核糖体展示、酵母展示、细菌展示、ELISA测定)，根据与成熟肌肉生长抑素或其含有免疫源性肽的部分结合，或与免疫源性肽结合而筛选抗肌肉生长抑素单克隆抗体。任选地，通过本领域可用的任何方法，根据与成熟GDF-11或其部分结合而筛选抗肌肉生长抑素单克隆抗体。选择相对于GDF-11特异或优先结合肌肉生长抑素的抗肌肉生长抑素单克隆抗体。本发明还包括由该方法制备的单克隆抗体。优选地，所述的单克抗体与肌肉生长抑素的结合比其与GDF-11的结合大至少5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100倍；更优选比其与GDF-11的结合大至少150、200、250、300、350、400、450、500、550或600倍，所述结合强度由本领域技术人员已知的方法测定，例如通过ELISA、竞争性ELISA或BIAcore测定法中的KD值测定。更优选该单克隆抗体在本领域可利用的任何结合测定法中不会以高于本底水平结合GDF-11。
本发明还包括通过用以下免疫源性肽注射非人动物(优选啮齿动物，更优选小鼠)产生本发明抗体的方法，所述免疫原性肽为：(i)包含具有如SEQ ID NO：46或43中显示序列的肽的免疫源性肽，或(ii)包含如SEQ ID NO：46或43中显示序列的肽的24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个连续氨基酸的免疫源性肽，优选所述的免疫源性肽跨越这样的氨基酸残基，该氨基酸残基中1、2、3、4或5个所述连续氨基酸选自成熟肌肉生长抑素的残基号46、49、50、52和62处的氨基酸，其中所述残基号处的氨基酸不同于存在于GDF-11的等同位置上的氨基酸(见图3)，或(iii)含有任一哺乳动物肌肉生长抑素成熟形式的位置40-64处的氨基酸的免疫源性肽，或(iv)含有24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个连续氨基酸的免疫源性肽，所述的连续氨基酸来自由任一哺乳动物成熟形式的位置40-64处的氨基酸组成的肽，优选所述免疫源性肽跨越这样的氨基酸残基，该氨基酸残基中1、2、3、4或5个所述连续氨基酸不同于存在于相同哺乳动物中的GDF-11的等同位置处的氨基酸。使用本领域任何已知方法，从经免疫的动物产生抗肌肉生长抑素单克隆抗体，优选通过杂交瘤合成法。通过本领域利用的任何方法(例如噬菌体展示、核糖体展示、酵母展示、细菌展示、ELISA测定)根据与以下抗原肽的结合筛选抗肌肉生长抑素单克隆抗体，所述抗原肽为：(i)由如SEQ ID NO：46或43中显示序列组成的抗原肽，或(ii)由24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个连续氨基酸组成的抗源肽，所述的连续氨基酸来自由如SEQ ID NO：46或43中显示序列组成的肽，优选所述的肽跨越这样的氨基酸残基，该氨基酸残基中1、2、3、4或5个所述连续氨基酸选自成熟肌肉生长抑素的残基号46、49、50、52和62处的氨基酸，其中所述残基号处的氨基酸不同于存在于GDF-11的等同位置上的氨基酸(见图3)，或(iii)由任一哺乳动物的肌肉生长抑素成熟形式的位置40-64处的氨基酸组成的抗原肽，或(iv)由24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5连续氨基酸组成的抗原肽，所述的连续氨基酸来自由任一哺乳动物成熟形式的位置40-64处的氨基酸组成的肽，优选所述的抗原肽跨越这样的氨基酸残基，该氨基酸残基中1、2、3、4或5个所述连续氨基酸不同于存在于相同哺乳动物中的GDF-11的等同位置处的氨基酸。任选地，通过本领域可用的任何方法根据与成熟GDF-11或其部分结合而筛选抗肌肉生长抑素单克隆抗体。选择相对于GDF-11特异或优先结合肌肉生长抑素的抗肌肉生长抑素单克隆抗体。本发明还包括由该方法制备的单克隆抗体。优选地，所述的单克抗体与肌肉生长抑素的结合比其与GDF-11的结合大至少5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100倍；更优选比其与GDF-11的结合大至少150、200、250、300、350、400、450、500、550或600倍，所述结合强度由本领域技术人员已知的方法测定，例如通过ELISA、竞争性ELISA或BIAcore测定法中的KD值测定。更优选该单克隆抗体在本领域可利用的任何结合测定法中不会以高于本底水平结合GDF-11。
考虑由本发明的任何方法制备的所述抗体可以还改变为嵌合抗体，在所述的嵌合抗体中至少一部分构架区和/或恒定区源于与受到免疫而产生该单克隆抗体的哺乳动物不同的哺乳动物，并且所述嵌合抗体仍然在本发明的范围内。本发明的抗体可以人源化，其中鼠的CDR区存在于基本的人构架区内，且恒定区(如果其存在于抗体中)也是基本人源的。本发明的抗体可以是这样的，即鼠的CDR区存在于构架区内并且恒定区(如果其存在于抗体中)源于其中该抗体将用于治疗的动物的种系序列。
本文设想本发明抗体的多种形式。例如，本发明的抗肌肉生长抑素单克隆抗体可以是全长抗体(例如，具有免疫球蛋白恒定区)或抗原片段(例如F(ab′)2)。应该理解该抗体的所有这种形式在此包含于术语“抗体”之内。而且，该抗体可以根据本领域已知的方法用可检测标记物标记、固定在固相上和/或与异源化合物(例如，酶或毒素)缀合。
考虑了本发明的单克隆抗体的诊断用途。在一种诊断应用中，本发明提高用于测定肌肉生长抑素蛋白质存在的方法，所述方法包括将怀疑含有肌肉生长抑素蛋白质的测试样品曝露于本发明的抗肌肉生长抑素抗体并测定该抗体与样品的特异性结合。本发明的抗肌肉生长抑素抗体可用于通过将测试样品值与标准曲线比较而测定在测试样品中的肌肉生长抑素的水平，所述的标准曲线是通过将所述抗体与具有已知量的肌肉生长抑素结合而产生的。本发明还提供包含本发明抗体的试剂盒，优选包括关于使用该抗体来检测在例如测试样品中的肌肉生长抑素的说明书。
在另一个实施方案中，本发明提供含有本发明的抗肌肉生长抑素单克隆抗体的药物组合物。本发明的药物组合物可以还含有可药用载体。在所述的药物组合中，本发明的抗肌肉生长抑素单克隆抗体是活性成分。优选地，该药物组合物含有本发明的抗肌肉生长抑素单克隆抗体的同质或基本同质群体。用于治疗用途的该组合物是无菌的并可以是冻干的。
本发明提供在有此需要的哺乳动物(优选人)中抑制肌肉生长抑素活性的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量或预防有效量的本发明抗肌肉生长抑素单克隆抗体。本发明另外提供通过抑制肌肉生长抑素与其受体结合而产生的信号转导而改善的疾病或紊乱的治疗或预防方法，方法包括施用给需要这种治疗或预防的患者(例如人)治疗或预防有效量的本发明单克隆抗体。如此处使用的，“治疗或预防”涉及与异常的肌肉生长抑素水平相关的或受益于抑制肌肉生长抑素活性或受益于存在的肌肉生长抑素水平的改变的疾病或紊乱。用本发明的抗体治疗或预防的疾病或紊乱包括(但不限于)虚弱、恶病质、年龄有关的肌肉减少(sarcopenia)、肌肉萎缩、肌病、肌肉营养不良、骨质疏松症、肥胖症、COPD、肾衰竭或肾病、肝衰竭或肝病、心力衰竭或心脏病、代谢综合征和II型糖尿病。本发明还提供用于在有所需要的哺乳动物(优选人)中增加肌肉量、增加肌肉强度和增加骨密度的方法，所述的方法是通过施用治疗有效量的本发明的抗肌肉生长抑素单克隆抗体。
本发明包括用于生产施用于哺乳动物(优选人)的药物的本发明抗肌肉生长抑素单克隆抗体，所述的药物用于在有所需要的哺乳动物(优选人)中通过向所述哺乳动物施用治疗有效量或预防有效量的本发明抗肌肉生长抑素单克隆抗体来治疗例如虚弱、恶病质、年龄有关的肌肉减少、肌肉萎缩、肌病、肌肉营养不良、骨质疏松症、肥胖症、COPD、肾衰竭或肾病、肝衰竭或肝病、心力衰竭或心脏病、代谢综合征和II型糖尿病
本发明包括制成品，所述制成品包括包装材料和包含于所述包装材料中的本发明抗体，并且其中该包装材料包括包装说明书，该说明书标明该抗体特异性中和肌肉生长抑素活性或降低肌肉生长抑素水平。任选地，该包装说明书还标明通过相对于结合GDF-11优先结合肌肉生长抑素，该抗体相对于GDF-11活性优先中和肌肉生长抑素活性或相对于降低GDF-11水平优先降低肌肉生长抑素水平。
表1CDR序列-轻链可变区(LCVR)
| FAb | CDR1 | CDR2 | CDR3 |
| 3 | SASSSISYMH(SEQ ID NO：18) | DTSKLAS(SEQ ID NO：23) | QQWYSNPLT(SEQ ID NO：24) |
| 5 | SASSSVHYMH(SEQ ID NO：19) | DTSKLAS(SEQ ID NO：23) | QQWSSNPLT(SEQ ID NO：25) |
| 7 | SASSSISYMH(SEQ ID NO：18) | DTSKLAS(SEQ ID NO：23) | QQWYSNPLT(SEQ ID NO：24) |
| 8 | SASSSVSYMH(SEQ ID NO：20) | DTSKLAS(SEQ ID NO：23) | QQWSSNPLT(SEQ ID NO：25) |
| 9 | SASSSVSYMH(SEQ ID NO：20) | DTSKLAS(SEQ ID NO：23) | QQWSRNPLT(SEQ ID NO：26) |
| 10 | SASSSISYMH(SEQ ID NO：18) | DTSKLAS(SEQ ID NO：23) | QQWYSNPLT(SEQ ID NO：24) |
| 11 | SASSSISYMH(SEQ ID NO：18) | DTSKLAS(SEQ ID NO：23) | QQWNSNPLT(SEQ ID NO：27) |
| 12 | SASSSVYYMH(SEQ ID NO：21) | DTSKLAS(SEQ ID NO：23) | QQWTYNPLT(SEQ ID NO：28) |
| 14 | SASSSVSYMH(SEQ ID NO：20) | DTSKLAS(SEQ ID NO：23) | QQWYSNPLT(SEQ ID NO：24) |
| 15 | SASSSINYMH(SEQ ID NO：22) | DTSKLAS(SEQ ID NO：23) | QQWNSNPLT(SEQ ID NO：27) |
| 共有序列 | SASSSX29X30 *YMH(SEQ ID NO：38) | DTSKLAS(SEQ ID NO：23) | QQWX91X92NPLT**(SEQ ID NO：56) |
*X29是疏水性氨基酸，X30是S、T、H、Y或N
**X91是Y、S、N或T，X92是R、K、Y、S或T
表2CDR序列-重链可变区(LCVR)
| FAb | CDR1 | CDR2 | CDR3 |
| 3 | GFSLRTSGMSVS(SEQ ID NO：29) | HIYWDDDKRYNPSLRN(SEQ ID NO：32) | RAITTVIGGGTMDY(SEQ ID NO：36) |
| 5 | GFSLSTSGMSVS(SEQ ID NO：30) | HIYWDDDKRYNPSLRS(SEQ ID NO：33) | RGITTVLGGGTMDY(SEQ ID NO：37) |
| 7 | GFSLTTSGMIVS(SEQ ID NO：31) | HIYWDDDKRYNPSLRN(SEQ ID NO：32) | RAITTVIGGGTMDY(SEQ ID NO：36) |
| 8 | GFSLRTSGMSVS(SEQ ID NO：29) | HIYWDDDKRYNPSLRN(SEQ ID NO：32) | RAITTVIGGGTMDY(SEQ ID NO：36) |
| 9 | GFSLSTS GMSVS(SEQ ID NO：30) | HIYWDDDKRYNPSLKS(SEQ ID NO：34) | RAITTVIGGGTMDY(SEQ ID NO：36) |
| 10 | GFSLRTSGMSVS(SEQ ID NO：29) | HIYWDDDERYNPSLRN(SEQ ID NO：35) | RAITTVIGGGTMDY(SEQ ID NO：36) |
| 11 | GFSLRTSGMSVS(SEQ ID NO：29) | HIYWDDDKRYNPSLRN(SEQ ID NO：32) | RAITTVIGGGTMDY(SEQ ID NO：36) |
| 12 | GFSLRTSGMSVS(SEQ ID NO：29) | HIYWDDDKRYNPSLRN(SEQ ID NO：32) | RAITTVIGGGTMDY(SEQ ID NO：36) |
| 14 | GFSLRTSGMSVS(SEQ ID NO：29) | HIYWDDDKRYNPSLRN(SEQ ID NO：32) | RAITTVIGGGTMDY(SEQ ID NO：36) |
| 15 | GFSLRTSGMSVS(SEQ ID NO：29) | HIYWDDDKRYNPSLRN(SEQ ID NO：32) | RAITTVIGGGTMDY(SEQ ID NO：36) |
| 16 | GFSLRTSGSSVS(SEQ ID NO：47) | HIYWDDDKRYNPSLRN(SEQ ID NO：32) | RAITTVIGGGTMDY(SEQ ID NO：36) |
| 17 | GFSLRKSGMSVS(SEQ ID NO：48) | HIYWDDDKRYNPSLRN(SEQ ID NO：32) | RAITTVIGGGTMDY(SEQ ID NO：36) |
| 18 | GFSLRTVGMSVS(SEQ ID NO：49) | HIYWDDDKRYNPSLRN(SEQ ID NO：32) | RAITTVIGGGTMDY(SEQ ID NO：36) |
| 19 | GFSLRTLGMSVS(SEQ ID NO：50) | HIYWDDDKRYNPSLRN(SEQ ID NO：32) | RAITTVIGGGTMDY(SEQ ID NO：36) |
| 20 | GFSLRTLGSSVS(SEQ ID NO：51) | HIYWDDDKRYNPSLRN(SEQ ID NO：32) | RAITTVIGGGTMDY(SEQ ID NO：36) |
| 21 | GFSLRKVGSSVS(SEQ ID NO：52) | HIYWDDDKRYNPSLRN(SEQ ID NO：32) | RAITTVIGGGTMDY(SEQ ID NO：36) |
| 22 | GFSLRKLGSSVS(SEQ ID NO：53) | HIYWDDDKRYNPSLRN(SEQ ID NO：32) | RAITTVIGGGTMDY(SEQ ID NO：36) |
| 23 | GFSLRKSGSSVS(SEQ ID NO：54) | HIYWDDDKRYNPSLRN(SEQ ID NO：32) | RAITTVIGGGTMDY(SEQ ID NO：36) |
| 共有序列 | GFSLX5X6X7GX9X10VS*(SEQ ID NO：55) | HIYWDDDX8RYNPSLX15X16 **(SEQ ID NO：41) | RX2ITTVX7GGGTMDY***(SEQ ID NO：42) |
*X5是R、K、T或S；X6是T或K，X7是S、V或L，X9是M或S，X10是S、T、I、L或V
**X8是K、R、E或D；X15是K或R，X16是S、T、N或Q
***X2是A或G；X7是I、L或V
附图简述
图1显示人肌肉生长抑素的氨基酸序列(信号序列用下划线标出)和构成肌肉生长抑素成熟形式的单体的羧基端蛋白质部分(粗体字母)。
图2显示人成熟肌肉生长抑素的氨基酸序列。本发明的抗原表位用下划线标出。
图3显示人肌肉生长抑素与人GDF-11的成熟形式的氨基酸序列比对，本发明的抗原表位用下划线标出，肌肉生长抑素和GDF-11之间位于抗原表位内的不同残基用粗黑体打印。符号(+)表示在那个位置上肌肉生长抑素和GDF-11之间的保守性氨基酸差异而符号(-)表示在那个位置上肌肉生长抑素和GDF-11之间的非保守性氨基酸差异。
FIG.4显示Fab 3、5、7、8、9、10、11、12、14和15的LCVR的比对，CDR结构域用粗体打印。符号(*)表示在Fab中有变化的残基。
FIG.5显示Fab 3、5、7、8、9、10、11、12、14和15的HCVR的比对，CDR结构域用粗体打印。符号(*)表示在Fab中有变化的残基。
发明详述
本发明涉及特异性结合哺乳动物肌肉生长抑素或其片段的单克隆抗体或其功能性片段(例如，抗原结合片段)。本发明的单克隆抗体结合的抗原表位位于成熟肌肉生长抑素的残基40-64。在一个实施方案中，本发明的单克隆抗体阻碍配体(例如肌肉生长抑素受体)结合至肌肉生长抑素或抑制肌肉生长抑素的生物活性。
本发明的抗体以至少约1×10-7M、优选至少约9×10-8M或7×10-8M，更优选至少约5×10-8M的亲和力特异性结合成熟肌肉生长抑素或其部分。优选本发明的抗体在本领域已知的任何标准结合测定法中不会以高于本底的水平结合GDF-11。在一个实施方案中，本发明的抗体显示以少于150μg/ml、优选少100于μg/ml、更优选少于90、80、70、60或50μg/ml，以及更优选少于约20μg/ml，以及更优选少于约2或0.2或0.02μg/ml体内或体外抑制肌肉生长抑素生物活性。当在此使用时，术语“成熟的肌肉生长抑素”可以指肌肉生长抑素的前蛋白质形式经蛋白质水解裂解后得到的蛋白质单体或二聚体形式，优选同型二聚体。
天然存在的全长抗体是一个免疫球蛋白分子，其由4条肽链，即通过二硫键相互连接的两条重(H)链(全长时约50-70kDa)和两条轻(L)链(当全长时约35kDa)组成。每条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100-110个或更多氨基酸的可变区。每条链的羧基末端部分限定主要负责效应物功能的恒定区。
轻链分为κ或λ并由一特别的恒定区表征。重链分为γ链、μ、α、δ或ε，并分别定义抗原的同种型为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。每条重链类型由特别的恒定区表征。
每条重链由重链可变区(这里称为“HCVR”)和重链恒定区组成。IgG、IgD和IgA的重链恒定区由三个结构域(CH1、CH2和CH3)组成；以及IgM和IgE的重链恒定区由4个结构域(CH1、CH2、CH3和CH4)组成。每条轻链由轻链可变区(这里称为“LCVR”)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域(即CL)组成。HCVR和LCVR区可以还细分为高度可变区，称为互补决定区(CDR)，散布有更保守的区域，称为构架区(FR)。每个HCVR和LCVR由三个CDR和四个FR组成，它们以下列次序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。划分各个结构域的氨基酸是根据公知的惯例[例如，Kabat，“Sequences of Proteins of Immunological Interest，”National Institutes ofHealth，Bethesda，Md.(1991)或如在Al-Lazikani等，J.Mol.Biol.273：927-948，1997中描述的Chothia numbering scheme，也参见互联网址http:www.rubic.rdg.ac.uk/～andrew/bioinf.org/abs]。抗体结合特定抗原的功能能力由六个CDR一起决定。然而，即使仅含有三个抗原特异性CDR的单个可变结构域可以具有识别并结合抗原的能力，尽管是以比完整Fab低的亲和力。
术语“抗体”(关于本发明的抗肌肉生长抑素单克隆抗体)，如此处使用，指单克隆抗体。如此处使用的“单克隆抗体”，指啮齿类(优选鼠类)抗体、嵌合抗体、灵长类化抗体或人源化抗体。本发明的单克隆抗体可以用例如本发明熟知的杂交瘤技术，以及重组技术、噬菌体展示技术、合成技术或本领域容易已知的这类技术的组合产生。如此处使用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。“单克隆抗体”指源于一单拷贝或克隆的抗体，包括例如任何真核、原核或噬菌体克隆，而不是源于产生它的方法。“单克隆抗体”可以是完整(全长)抗体、基本完整的抗体，或含有抗原结合片段的抗体的部分或片段，例如鼠抗体或嵌合抗体或人源化抗体的Fab片段、Fab’片段或F(ab′)2片段。
如此处使用的，“抗原结合部分”或“抗原结合区”或“抗原结合结构域”在此可互换地指含有与抗原相互作用并赋予抗体对抗原特异性和亲和性的氨基酸残基的抗体分子部分。该抗体部分包括保持抗原结合残基的正确构象所必需的“构架”氨基酸残基。优选本发明抗体的抗原结合区的CDR是鼠源的。在另外的实施方案中，该抗原结合区可以源于其它非人物种，包括但不限于兔、大鼠或仑鼠。
此外，如此处使用的“单克隆抗体”可以是单链Fv片段，其可以通过将编码LCVR和HCVR的DNA与接头序列连接而产生。(见，Pluckthun，《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，卷113，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，New York，269-315页，1994)。应该理解，无论片段是否指定，如此处使用的术语“抗体”包括这种片段还有单链形式。只要蛋白质保持特异性或优先结合其目的靶标(即表位或抗原)的能力，其就包含于术语“抗体”内。抗体可以是或不是经糖基化的并仍处于本发明的范围内。
“单克隆抗体”的群体，指同质或基本同质的(或纯的)抗体群体(即该群体中至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％，更优选至少97％或98％或最优选至少99％的抗体是相同的，并在ELSIA测定中竞争结合相同的抗原或表位)。
如此处使用的术语“特异性结合”或“优先结合”指这样一种情况，即其中特异性结合对的一员不会显著结合不同于其特异性结合配偶体的分子。当例如本发明抗体的抗原结合结构域特异于由许多抗原携带的一特定表位时，该术语也是适用的，在该情况下携带抗原结合结构域的特异性抗体将能够结合携带该表位的多种抗原。因此本发明的单克隆抗体特异性结合和/或优先结合肌肉生长抑素而它不会特异性结合或优先结合GDF-11。
在一个实施方案中，本发明的单克隆抗体与非肌肉生长抑素蛋白质或肽(例如GDF11)或不含有SEQ ID NO：46或43中显示序列的17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个连续氨基酸的蛋白质具有少于20％的交叉反应性(更优选百分之19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1的交叉特异性)，所述的交叉反应性是通过本领域标准技术测量，如ELISA测定法、竞争ELISA测定法或如BIAcore测定法中所测的KD值测量。优选地，本发明抗体与肌肉生长抑素的结合比其与GDF-11的结合大至少5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100倍；更优选比其与GDF-11的结合大至少150、200、250、300、350、400、450、500、550或600倍，所述的结合强度由例如竞争性ELISA或BIAcore测定法测定。更优选地，本发明抗体在本发明可利用的任何结合测定法中不以高于本底的水平结合GDF-11。本发明的单克隆抗体可以结合肌肉生长抑素的单体或二聚体形式或其部分。
关于本发明的抗体，短语“生物特性”或“生物性质”或术语“活性”或“生物活性”，在这里可互换使用并包括(但不限于)表位/抗原亲和性和特异性(例如，抗肌肉生长抑素单克隆抗体结合肌肉生长抑素或由SEQID NO：46或43中显示序列组成的肽)、体内、体外或原位拮抗肌肉生长抑素的活性的能力、抗体的免疫源特性。本领域公认的抗体的其它可确认生物特性或特征包括，例如交叉反应性(即，一般来说，与靶肽的非人同系物，或与其它蛋白质或组织的交叉反应性)，以及在哺乳动物细胞中保持高的表达水平的能力。上述的特性或特征可以用领域公认的技术来观测或测量或评价，这些技术包括(但不限于)ELISA、竞争性ELISA、BIAcore表面等离振子共振分析、体外和体内中和测定，其不限于受体结合、细胞因子或生长因子产生和/或分泌、非洲爪蟾动物冠发育、信号转导和使用来自不同来源(包括人、灵长类)或根据需要的任何其它来源的组织切片的免疫组织化学。
如此处使用的有关本发明抗体的活性的术语“抑制”或“中和”表示基本拮抗、抑制、阻止、限制、减慢、破坏、消除、终止或逆转例如正在被抑制的那些(包括但不限于生物活性或特性、疾病或病状)的进展或严重性的能力。
术语“分离的”当用于涉及核酸或蛋白质(例如，抗体)时指从至少一种通常伴随其天然来源的污染物分离或鉴定的核酸序列或蛋白质。优选地，“分离的抗体”是基本没有其它具有不同抗原特异性的抗体的抗体(例如，本发明的药物组合物含有一种特异性结合肌肉生长抑素的抗体并基本没有特异性结合不同于肌肉生长抑素的抗原的抗体)。
术语“Kabat编号”和“Kabat标记”在此互换使用。本领域公认的这些术语指给本发明抗体的重链和轻链可变区中的比其它氨基酸残基更可变的(即高度可变的)氨基酸残基编号的系统(Kabat等，Ann.NY Acad.Sci.190：382-93(1971)；Kabat等，《Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest》，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版号91-3242(1991))。
当多核苷酸置于与其它多核苷酸的功能关系中时，其是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录的话，则其与该序列有效连接。
在此互换使用的术语“个体”、“受试者”和“患者”指哺乳动物，包括(但不限于)鼠类、猿类、人、哺乳动物的农业动物、哺乳动物的运动动物和哺乳动物宠物；优选该术语指人。
术语“载体”包括能转运其所连接的另一核酸的核酸分子，所述载体包括(但不限于)质粒和病毒载体。某些载体能在它们导入的宿主细胞中自我复制而另外的载体一旦导入宿主细胞中便可以整合进入宿主的基因组，并因而与宿主基因组一起复制。而且，某些载体能指导它们有效连接的基因的表达。在此这种载体被称为“重组表达载体”(或简称“表达载体”)并且范例性载体在本领域中是熟知的。
术语“宿主细胞”包括个体细胞或细胞培养物，其为本发明的任何分离的多核苷酸或含有本发明的HCVR、LCVR或单克隆抗体的重组载体的接受者。宿主细胞包括单个宿主细胞的子代，并且由于天然的、偶然的或有意的突变和/或改变，该子代(在形态学上或在总DNA互补上)可以不必与原初亲本细胞完全相同。宿主细胞包括用表达本发明的单克隆抗体或其轻链或重链的重组载体或多核苷酸体内、原位或体外转化、转导或感染的细胞。含有本发明的重组载体(或稳定地整合进宿主染色体或没有)的宿主细胞也可称为“重组宿主细胞”。用于本发明的优选宿主细胞是CHO细胞(例如ATCC CRL-9096)、NS0细胞、SP2/0细胞和COS细胞(ATCC，例如CRL-1650、CRL-1651)、HeLa(ATCC CCL-2)。用于本发明的额外的宿主细胞包括植物细胞、酵母细胞、其它哺乳动物细胞和原核细胞。
本发明涉及结合肌肉生长抑素的分离的单克隆抗体。特定地，本发明的抗体结合跨越氨基酸40-64的肌肉生长抑素的成熟形式。而且，本发明的抗体体内、体外或原位中和肌肉生长抑素生物活性。本发明的抗肌肉生长抑素单克隆抗体(包括其抗原结合部分以及具有类似特异性的人源化单克隆抗体)特异性结合肌肉生长抑素，使得所述的抗体能被用作肌肉生长抑素相关的疾病和病症(即得益于降低肌肉生长抑素水平活或抑制肌肉生长抑素的生物活性的疾病或病症)的治疗剂或预防剂。
本发明的抗体结合的表位(“本发明的肌肉生长抑素表位”)位于跨越任何哺乳类物种(优选人)的成熟肌肉生长抑素氨基酸40至64的肽之内。结合所述的表位的抗体，当与之结合GDF-11比较时特异或优先结合肌肉生长抑素。
术语“表位”指能由抗体的一个或多个抗原结合区识别并结合的分子部分。表位通常由聚集分子的化学活性表面基团(如氨基酸或糖侧链)组成并具有特定的三维结构特征以及特定电荷特征。“抑制表位”和/或“中和表位”旨在表示一个表位，其当处于完整分子(在本情况下是肌肉生长抑素)中并受抗体结合时，体内、体外或原位导致该分子或含有该分子的生物生物活性丧失或减少。
在此使用的术语“表位”还指动物，优选为哺乳动物(如小鼠或人)中具有抗原和/或免疫原活性的多肽部分。如在此使用的，术语“抗原表位”定义为抗体能特异性结合的多肽的一部分，所述的结合可通过本领域公知的任何方法测定，例如通过常规的免疫测定法测定。抗原性表位不必须是免疫原性的，但可以是免疫原性的。如在此使用的，术语“免疫原表位”定义为在动物中引起抗体应答的多肽的部分，所述抗体应答可通过本领域已知的任何方法测定(见例如Geysen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3998-4002(1983))。本发明的人肌肉生长抑素抗原表位具有如SEQ ID NO：43和46中显示的氨基酸序列。用于任一哺乳动物种类的本发明肌肉生长抑素抗原表位存在于由肌肉生长抑素的成熟形式的氨基酸40-64组成的肽内。
本发明的抗肌肉生长抑素的单克隆抗体可结合发现位于成熟肌肉生长抑素的氨基酸40-64的抗原表位。本发明的肌肉生长抑素免疫原表位和/或抗原表位由如在SEQ ID NO：46或43中显示的序列组成，或由如在SEQID NO：46或43中显示序列组成的肽的24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个连续氨基酸组成，优选免疫原表位跨越这样的氨基酸残基，所述的氨基酸残基中1、2、3、4或5个所述的连续氨基酸选自成熟肌肉生长抑素的残基号46、49、50、52和62处的氨基酸，即在所述残基号的氨基酸不同于存在于GDF-11的等同位置处的氨基酸(见图3)。而且，本发明的肌肉生长抑素免疫原表位在任一哺乳动物的肌肉生长抑素成熟形式的位置40-64内，或由肽的24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个连续氨基酸组成，所述肽由任一哺乳动物成熟形式的肌肉生长抑素位置40-64处的氨基酸组成，优选所述的免疫原性肽表位跨越这样的氨基酸残基，该氨基酸残基中1、2、3、4或5个所述连续氨基酸不同于存在于相同哺乳动物中的GDF-11的等同位置处的氨基酸。本发明的免疫原表位也可认为是抗原表位。抗原表位可以具有成熟肌肉生长抑素的氨基酸40-64以外的额外的肌肉生长抑素残基，但本发明的单克隆抗体不需要这些额外的残基来特异性结合肌肉生长抑素。而且，氨基酸40-64以外的肌肉生长抑素的残基(即抗原表位)可能影响抗原结构域的构象结构并从而改变本发明抗体与抗原表位的结合。本发明的单克隆抗体与肌肉生长抑素的结合比与GDF-11的结合至少高5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100倍(例如，更大的亲和力或更大的特异性)；更优选地，比与GDF-11结合至少高150、200、250、300、350、400、450、500、550或600倍，所述的结合强度例如通过ELISA测定法、竞争ELISA测定法或Biacore测定法中的KD值测定。
跨越成熟肌肉生长抑素的氨基酸40-64(包括在内)的结构域或由在此描述的免疫原表位组成的任何肽可用作免疫原性肽，优选与载体蛋白质(如KLH)缀合以产生本发明的单克隆抗体。免疫原性肽可用于免疫非人动物，优选免疫哺乳动物，更优选免疫小鼠。然后将抗肌肉生长抑素抗体从经免疫的动物中分离并通过本领域公知的方法筛选以分离特异性结合肌肉生长抑素的氨基酸40-64的抗体。
通常，可以通过将适当的无限增殖细胞系(例如骨髓瘤细胞系，如SP2/0)与经免疫动物的产生抗体的细胞融合来产生杂交瘤。可从经目的抗原免疫的动物获得产生抗体的细胞，优选脾脏或淋巴结的产抗体细胞。可使用选择性培养条件分离融合细胞(杂交瘤)，并通过有限稀释克隆。产生具有理想结合特性的抗体的细胞可通过适宜的测定法选择。用于上述分离和筛选的方法是本领域公知的。已经证明使用富集技术例如噬菌体展示(Matthews DJ和Wells JA.Science.260：1113-7，1993)、核糖体展示(Hanes等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95：14130-5，1998)、细菌展示(Samuelson P.等人，Journal of Biotechnology.96：129-54，2002)或酵母展示(Kieke MC等人，Protein Engineering，10：1303-10，1997)从文库中选择抗体片段是经典杂交瘤技术的成功的备选方法(最近的综述：Little M.等人，Immunology Today，21：364-70，2000)。本发明的抗体可使用本领域公知的方法改变成嵌合的或人源化形式。
可使用其它产生或分离结合成熟肌肉生长抑素的氨基酸40-64的抗体(包括人或人工抗体)的适当方法，包括例如从文库中选择重组抗体(如单链Fv或Fab)的方法，或依赖能产生人抗体的所有组成成分的转基因动物(如小鼠)的免疫的方法(见如Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551-2555，1993；Jakobovits等人，Nature，362：255-258，1993；Lonberg等人，U.S.Patent Number 5,545,806；Surani等人，U.S.Patent Number 5,545,807)。
含有源于不同物种的部分的单链抗体和嵌合的、人源化或灵长类化(CDR移植的)抗体，以及嵌合或CDR移植的单链抗体等也包含于本发明和术语“抗体”中。这些抗体的多个部分可通过常规技术的化学方法、合成方法连接在一起而合成，或可采用遗传工程技术制备成连续的蛋白质。例如，编码嵌合的或人源化链的核酸可以经表达产生连续的蛋白质。见例如，美国专利No.4,816,567；欧洲专利No.0,125,023B1；美国专利No.4,816,397；欧洲专利No.0,120,694B1；WO 86/01533；欧洲专利No.0,194,276B1；美国专利No.5,225,539；欧洲专利No.0,239,400B1和美国专利NO.5,585,089和5,698,762。还可见，关于灵长源抗体的Newman，R.等人，BioTechnology，10：1455-1460，1993和关于单链抗体的Ladner等人，美国专利No.4,946,778和Bird，R.E.等人，Science，242：423-426，1988。
此外，还可产生抗体的功能片段，包括嵌合、人源化、灵长化的或单链抗体的片段。前述的抗体的功能片段保留了它们来源的全长抗体的至少一种结合功能和/或生物学功能。优选的功能片段保留了相应的全长抗体的抗原结合功能(例如结合哺乳动物肌肉生长抑素的成熟形式的能力)。特别优选的功能片段保留了抑制一种或多种哺乳动物成熟肌肉生长抑素的功能或生物活性特征，例如结合活性、信号活性和/或刺激细胞应答的能力。例如，在一个实施方案中，功能片段能够抑制成熟肌肉生长抑素与它的一种或多种配体相互作用和/或能够抑制一种或多种受体介导的功能。
能够结合哺乳动物成熟肌肉生长抑素或其部分的抗体片段，包括但不限于Fv、Fab、Fab’且F(ab′)2片段包含于本发明。这种片段可以通过酶促切割或通过重组技术产生。例如，木瓜蛋白质酶或胃蛋白质酶切割可分别产生Fab或F(ab′)2片段。还可以使用在其天然终止位点上游引入一个或多个终止密码子的抗体基因产生多种截短形式的抗体。例如，编码F(ab′)2重链部分的嵌合基因可设计来包含编码CH1结构域和重链绞链区的DNA序列。
在一个优选的实施方案中，本发明提供描述的方法产生的抗肌肉生长抑素单克隆抗体，所述单克隆抗体优选以至少约1×10-7M，优选至少约9×10-8M或7×10-8M，并且更优选至少约5×10-8M的亲和力(可通过固相BIAcore表面等离振子共振测定法测定)结合成熟肌肉生长抑素或其片段并能够拮抗成熟肌肉生长抑素的生物活性。
本发明的一个优选的单克隆抗体具有一种LCVR，所述的LCVR含有具有选自SEQ ID NO：3、4、5、6、7、8、9、10和11的序列的肽，和/或具有一种HCVR，所述的HCVR含有具有有选自SEQ ID NO：12、13、14、15、16、17的序列的肽，且SEQ ID NO：12的氨基酸26-37经SEQ IDNO：47、48、49、50、51、52、53或54的氨基酸替换(关于序列和它们在Fab中的位置见文中的表1和2及图4和5，)。此外，本发明的单克隆抗体是一种受含有具有以下显示序列的两种多肽的单克隆抗体竞争性抑制与成熟人肌肉生长抑素(或其部分)的结合的抗体：(i)SEQ ID NO：3和12，(ii)SEQ ID NO：4和13，(iii)SEQ ID NO：3和14，(iv)SEQ ID NO：7和17，(v)SEQ ID NO：6和15，(vi)SEQ ID NO：7和17，(vii)SEQID NO：8和12，(viii)SEQ ID NO：9和16，(ix)SEQ ID NO：10和12，以及(x)SEQ ID NO：11和12，以及(xi)SEQ ID NO：3，且SEQ ID NO：12的氨基酸26-37经SEQ ID NO：47、48、49、50、51、52、53或54的氨基酸替换。
在另一个实施方案中，本发明的抗肌肉生长抑素单克隆抗体的LCVR含有选自具有SEQ ID NO：38、23和56中显示序列(见表1)的肽的1、2或3种肽。本发明的抗肌肉生长抑素的单克隆抗体的HCVR含有选自具有SEQ ID NO：55、41和42中显示序列(见表2)的肽的1、2或3种肽。
在一个优选的实施方案中，本发明的抗肌肉生长抑素的单克隆抗体是嵌合抗体或人源化抗体。备选地，存在于抗体中的构架区和任何恒定区基本上源于其中该抗体用作治疗剂的动物的基因组。优选的抗体是全长抗体。
本发明还关注于表达本发明的抗肌肉生长抑素单克隆抗体或其部分的细胞系。产生本发明单克隆抗体的细胞系的产生和分离可使用本领域已知的标准技术完成。优选的细胞系包括COS、CHO、SP2/0、NS0和酵母(从公共储藏处如ATCC，美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA获得)。
许多种宿主表达系统可用于表达本发明抗体，所述的表达体统包括原核(细菌)和真核生物表达系统(如酵母、杆状病毒、植物、哺乳动物和其它动物细胞，转基因动物，和杂交瘤细胞)，以及噬菌体展示表达系统。适宜的细菌表达载体的实例是pUC119，并且适宜的真核生物表达载体是具有削弱的DHFR选择系统的改良的pcDNA3.1载体。其它的抗体表达系统也是本领域已知的并在此考虑。
本发明抗体可通过在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白的轻链和重链基因而制备。为重组表达抗体，将宿主细胞用一种或多种重组表达载体转化、转导、感染等，所述重组表达载体携带编码抗体的免疫球蛋白轻链和/或重链的DNA片段，这样该轻链和/或重链在宿主细胞中得以表达。重链和轻链可以在一个载体中从它们有效连接的不同启动子独立表达，或备选地，该重链和轻链可以在两个载体中从它们有效连接的不同启动子独立表达，一个载体表达重链而一个载体表达轻链。任选地，重链和轻链可以在不同的宿主细胞中表达。优选地，重组抗体分泌进宿主细胞在其中培养的培养基中，该抗体可从该培养基回收或纯化。标准的重组DNA方法用于获得抗体的重链和轻链基因，将这些基因整合至重组表达载体中，并将载体导入宿主细胞。这种标准重组DNA技术例如在Sambrook、Fritsch和Maniatis(编辑)，《Molecular Cloning；A Laboratory Manual》，第二版，Cold SpringHarbor，N.Y.，1989；Ausubel等人(编辑)《Current Protocols in MolecularBiology》，Greene Publishing Associates，1989中描述。
可以通过将编码HCVR的DNA与另一种编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的DNA分子有效连接而将编码HCVR区的分离的DNA转变为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的。见例如Kabat等，《Sequences of Proteins of Immunological Interest》，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242(1991)。包含这些区域的DNA片段可例如通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是任何类型(如IgG、IgA、IgE、IgM或IgD)、类别(如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)或亚类恒定区和其如Kabat(前文)中描述的任何异型变体。备选地，抗原结合部位可以是Fab片段、Fab’片段、F(ab′)2片段、Fd或单链Fv片段(scFv)。对于Fab片段重链基因，HCVR编码DNA可有效地连接至另一种仅编码重链CH1恒定区的DNA分子。
可以通过将编码LCVR的DNA与另一种编码轻链恒定区(CL)的DNA分子有效连接而将编码LCVR区的分离的DNA转变为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的。见例如Kabat，前文。包含这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
为产生scFv基因，将编码HCVR和LCVRDNA片段有效地连接至编码一柔性接头序列的另一片段，如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的片段，这样HCVR和LCVR序列可作为连续的单链蛋白质表达，HCVR和LCVR区通过柔性接头序列连接。见例如Bird等人，Science，242：423-426(1988)；Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：5879-83(1988)；McCafferty等人，Nature，348：552-4(1990)。
为表达本发明的抗体，将如上描述而获得的编码部分或全长轻链和/或重链的DNA插入表达载体，这样该基因有效地连接至转录和翻译控制序列。选择与使用的表达宿主细胞相容的表达载体和表达控制序列。可将抗体轻链基因和抗体重链基因插入不同载体或者，更通常地，将两种基因插入相同的表达载体。抗体基因可通过标准方法插入表达载体。而且，重组表达载体可编码促进抗肌肉生长抑素单克隆抗体的轻链和/或重链从宿主细胞分泌的信号肽。可将抗肌肉生长抑素单克隆抗体轻链和/或重链基因克隆进载体中，以使信号肽框内有效连接抗体链基因的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽。
除了抗体重链和/或轻链基因，本发明的重组表达载体还携带控制该抗体链基因在宿主细胞表达的调控序列。术语“调控序列”旨在包括启动子、增强子和其它表达控制元件(如多腺苷酸化信号)，根据需要，所述的调控序列控制抗体链基因转录或翻译。表达载体的设计(包括选择调控序列)可能取决于如要转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白质表达水平之类的因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选的调控序列包括引导在哺乳动物细胞中高水平的蛋白质表达的病毒元件，例如源于巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。
除抗体重链和/或轻链基因和调控序列外，本发明的重组表达载体还可携带另外的序列，如调节载体在宿主细胞中的复制(如复制起始点)的序列和一个或多个可选则的标记基因。可选择的标记基因有助于选择已导入载体的宿主细胞。例如，通常可选择的标记基因赋予已导入载体的宿主细胞抗药性，例如抗G418、潮霉素或甲氨喋呤。优选的可选择的标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于用甲氨喋呤选择/扩增的DHFR负型宿主细胞)、Neo基因(用于G418选择)，以及用于选择/扩增的GS阴性细胞系(例如NSO)中的谷氨酸合酶(GS)。
为了表达轻链和/或重链，将编码重链和/或轻链的表达载体通过标准技术如电穿孔术、磷酸钙沉淀、DEAE葡聚糖转染、转导、感染等导入宿主细胞。虽然理论上有可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明抗体，但优选在真核细胞，并最优选在哺乳动物宿主细胞中表达，因为这些细胞更可能装配和分泌正确折叠并具有免疫活性的抗体。用于表达本发明重组抗体的优选的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括DHFR-CHO细胞，在Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-20，1980中描述，例如，如Kaufman和Sharp，J.Mol.Biol.159：601-21，1982中描述的，其与DHFR可选择标记一起使用)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2/0细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过培养宿主细胞一段时间来产生抗体，所述的时间需足够使该抗体在宿主细胞中表达或，更优选地，使该抗体分泌至宿主细胞于其中生长的培养基。可使用标准纯化方法从宿主细胞和/或培养基回收抗体。
宿主细胞还可以通过本身是常规的技术用于产生完整抗体的部分或片段，例如Fab片段或scFv分子。应该理解，上面的方法中的变化在本发明范围内。例如，用编码本发明抗体的轻链或重链的DNA转染宿主细胞可能是理想的。重组DNA技术还可以用于除去一些或所有对于结合肌肉生长抑素不需要的编码轻链和重链之一或两者的DNA。从这种截短的DNA分子表达的分子也包含于本发明的抗体中。
在一优选的用于重组表达本发明抗体的系统中，将编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体通过例如磷酸钙介导的转染导入DHFR-CHO细胞中。在重组表达载体内，抗体重链和轻链基因各自与增强子/启动子调控元件(例如，源于SV40、CMV、腺病毒等，如CMV增强子/AdMLP启动子调控元件或SV40增强子/AdMLP启动子调控元件)有效连接，以促使高水平的基因转录。重组表达载体还携带DHFR基因，其使得能使用甲氨喋呤选择/扩增来选择已经用该载体转染的CHO细胞。培养选择的转化宿主细胞让其表达抗体重链和轻链并从培养基回收完整的抗体。将标准的分子生物学技术用于制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化细胞，培养宿主细胞并从培养基回收抗体。本发明的抗体或其抗原结合部分可以在人免疫球蛋白基因的转基因动物(如小鼠)中表达(见例如Taylor等人，Nucleic Acids Res.20：6287-95，1992)。
一旦表达，本发明的完整抗体、它们的二聚体、单独的轻链和重链或其它免疫球蛋白形式可以根据本领域的标准方法纯化，包括硫酸铵沉淀、离子交换、亲和性、反相、疏水性相互作用柱层析、凝胶电泳法等。对于制药用途，至少约90％、92％、94％或96％同质性的基本纯化的免疫球蛋白是优选的，并且98-99％或更大同质性是最优选的。一旦纯化(部分纯化或达到如期望的同质性)，该肽随后可用于如本文指出的治疗或预防。
如在此使用的，术语“嵌合抗体”包括单价、二价或多价的免疫球蛋白。单价嵌合抗体是由通过二硫键与嵌合轻链连接的嵌合重链形成的二聚体。二价嵌合抗体是由通过至少一个二硫键连接的两个重链轻链二聚体形成的四聚体。
用于人的抗体的嵌合重链含有源于对肌肉生长抑素特异性的非人抗体的重链的抗原结合区，所述的抗原结合区连接至少一部分人重链恒定区，例如CH1或CH2。用于人的抗体的嵌合轻链含有源于对肌肉生长抑素特异性的非人抗体的轻链抗原结合区，所述的抗原结合区连接至少一部分人轻链恒定区(CL)。具有相同或不同可变区结合特异性的嵌合重链和轻链的抗体、片段或衍生物也可以根据已知的方法步骤，通过恰当地连接独立的多肽链而制备。对于该方法，将表达嵌合重链的宿主与表达嵌合轻链的宿主分开培养，并分别回收免疫球蛋白链然后将其连接。备选地，可以共同培养宿主并让链在培养基中自然连接，随后回收装配的免疫球蛋白或片段。
用于产生嵌合抗体的方法是本领域公知的(见例如美国专利NO.6,284,471；5,807,715；4,816,567和4,816,397)。
在一优选的实施方案中，产生了一种基因，该基因含有编码至少非人源的抗原结合区(例如，如在此的表1、2和图4和5中的Fab 3、5、7、8、9、10、11、12、14或15的区)的第一种DNA片段，例如具有连接的(J)片段的功能性重排的可变(V)区，该DNA片段与如美国专利No.6,284,471中描的编码至少人恒定(C)区的一部分的第二种DNA片段连接。
优选地，用于治疗目的的本发明抗体将具有这样一种构架区和恒定区的序列，所述的序列存在于该抗体将用作治疗剂治疗的哺乳动物的抗体中，以便减少该哺乳动物产生拮抗该治疗性抗体的免疫应答的可能性。
人源化抗体是特别有意义的，因为它们认为是对治疗应用有价值的，避免对啮齿动物抗体通常观察到人抗小鼠抗体反应。如在此使用的术语“人源化抗体”指含有不同源的抗体部分的免疫球蛋白，其中至少一部分是人源的。例如，人源化抗体可含有源于具有所需特性的非人源(例如小鼠)的抗体部分，以及含有源于人的抗体部分，所述的抗体部分通过常规技术(例如合成技术)用化学方法连接在一起或使用基因工程技术制备成连续的多肽。优选地，无论“人源化抗体”是否在人细胞中产生，其具有源于非人抗体(优选小鼠单克隆抗体)的CDR，同时构架和恒定区，在其存在的程度上，(或它的重要或基本部分，即至少约90％、92％、94％、96％、98％或99％)可通过这样一种核酸序列信息编码，所述的核酸序列信息存在于人种系免疫球蛋白区(见例如International ImMunoGeneTicsDatabase)或存在于其重组的或突变形式。人源化抗体可以是完整的抗体、基本上完整的抗体、含有抗原结合位点的抗体部分，或含有Fab片段、Fab’片段、F(ab′)2或单链Fv片段的抗体部分。考虑在产生人源化抗体的过程中，位于CDR任一末端的氨基酸(见，例如表1和2)可由存在于人种系的作为邻接构架序列片段的氨基酸代替。
人源化抗体可使用本领域常规使用的方法进行体外诱变(或者，当使用人Ig序列转基因的动物时，接受体内体细胞诱变)并且，从而，人源化重组抗体的HCVR和LCVR区的构架区氨基酸序列是(当源于与人种系HCVR和LCVR序列相关的那些序列时)可能不是在体内天然存在于人抗体种系所有组成成分的序列。设想这些人源化重组抗体的HCVR和LCVR构架区的氨基酸序列与人种系序列至少90％、92％、94％、96％、98％或最优选至少99％一致。
在用于人的治疗中，人源化抗体比非人的和嵌合抗体具有至少三个潜在的优势：(i)效应物部分是人的，其可以与人免疫系统的其它部分更好地相互作用(例如，通过补体依赖性细胞毒性或抗体依赖性细胞毒性更有效地破坏靶细胞)；(ii)人免疫系统将不会将该人源抗体的构架或恒定区识别成外来物，并从而拮抗这种注入的抗体的抗体反应应该比拮抗完全外源的非人抗体或部分外源的嵌合抗体的抗体反应弱；以及(iii)据报道注入的非人抗体在人循环中具有的半衰期比人抗体的半衰期短许多。注入的人源化抗体可能具有与天然存在的人抗体相似的半衰期，从而使得能施用更小及较少频率的剂量。
人源化可能在某些情况下会不利地影响抗体结合抗原。优选地，本发明人源化的抗肌肉生长抑素单克隆抗体对肌肉生长抑素具有的结合亲和性不少于亲本鼠抗体的约50％，更优选不少于约30％，并且最优选不少于约25％、20％、15％、10％或5％，优选Fab 3、5、7、8、9、10、11、12、14或15(见在此的图4和5)对肌肉生长抑素的结合亲和性。优选地，本发明的人源化抗体将与在此描述的Fab 3、5、7、8、9、10、11、12、14或15结合相同的表位。所述的抗体基于其与Fab 3、5、7、8、9、10、11、12、14或15竞争结合成熟肌肉生长抑素或竞争结合具有如SEQ ID NO 46或43中显示序列的肽的能力而得以鉴定。
通常，人源化抗体可通过如下产生：获取编码结合本发明肌肉生长抑素抗原表位的抗体的HCVR和LCVR的核酸序列，确定上述HCVR和LCVR(非人)中的CDR，并将这种编码CDR的核酸序列移植在选择的编码人构架的核酸序列上。优选地，选择人构架氨基酸序列，这样使得得到的抗体有可能适合体内施用于人。这可以例如基于含有这种人构架序列的抗体的先前使用而得以确定。优选地，人构架序列本身不是显著致免疫的。
备选地，将欲进行人源化的抗体构架区的氨基酸序列(例如Fab 3、5、7、8、9、10、11、12、14或15)与已知的人构架序列比较，用于CDR-移植的人构架序列将基于它们含有与那些亲本抗体(例如结合肌肉生长抑素的鼠抗体)的序列高度相似的序列而得以选择。在本领域已经分离了许多人构架序列并且报导了它们的序列。这提高了得到的CDR移植的人源化抗体基本上保留抗原结合结构并因此保留亲本抗体的结合亲和性的可能性，所述的人源化抗体含有移植至选择的人构架区(并也可能为人恒定区)的亲本(如鼠的)抗体的CDR。为保留显著水平的抗原结合亲和性，选择的人构架区将优选为期望适于体内施用的那些，即非免疫原性的。
在任一方法中，获得了编码优选为鼠抗肌肉生长抑素抗体的HCVR和LCVR区的DNA序列。用于克隆编码免疫球蛋白的核酸序列的方法是本领域公知的。这类方法可能例如涉及通过聚合酶链式反应(PCR)，使用适当的引物来扩增将要克隆的免疫球蛋白编码序列。适合扩增免疫球蛋白核酸序列的引物以及特定的鼠HCVR和LCVR序列已经在文献中报导。在克隆了这类免疫球蛋白编码序列后，通过本领域公知的方法对它们测序。
一旦确定将要进行人源化的抗体的CDR和构架区的DNA编码序列，则确定编码CDR的氨基酸序列(基于该核酸序列和遗传密码并通过与以前的抗体序列比较而推断得到)并将该编码CDR的核酸序列移植至选择的编码人构架的序列上。这可使用适当的引物和接头完成。用于选择合适的准备用来连接目的核酸序列的引物和接头序列的方法完全在本领域一般技术人员的能力范围内。
将编码CDR的序列移植到选择的编码人构架的序列上后，表达得到的编码“人源化”可变重链和轻链序列的DNA序列以产生结合肌肉生长抑素的人源化Fv或人源化抗体。通常，人源化HCVR和LCVR作为完整的抗肌肉生长抑素抗体分子的部分，即作为具有人恒定结构域序列的融合蛋白质表达，所述的人恒定结构域序列的编码DNA序列已经从商业可获得的文库得到或其已经使用例如一种上面描述的获得DNA序列的方法或本领域的方法获得。然而，HCVR和LCVR序列还可以在没有恒定序列的情况下表达产生人源化抗肌肉生长抑素Fv。然而，人恒定序列的融合可能是理想的，因为得到的人源化抗肌肉生长抑素抗体可能具有人效应物功能。
用于合成编码已知序列的蛋白质的DNA的方法是本领域公知的。使用这种方法，合成了编码受试者人源化HCVR和LCVR序列(有或无恒定区)的DNA序列，然后将其在适于表达重组抗体的载体系统中表达。这可以在任何载体系统中实现，所述的载体系统让受试者人源化HCVR和LCVR序列作为具有人恒定域序列的融合蛋白质表达并联合以产生功能性(抗原结合的)抗体或抗体片段。
人恒定结构域序列是本领域公知的，并已经在文献中报导。优选的人轻链恒定区序列包括κ和λ轻链恒定区序列。优选的人恒定区重链序列包括人γ1、人γ2、人γ3、人γr及它们突变的版本，所述突变的版本提供了改变的作用或功能，例如增强的体内半衰期、降低的Fc受体结合等。
如果存在，人构架区优选来自与抗原结合区供体类似或等价区具有序列相似性的人抗体可变区。人源化抗体人源部分的构架区的其它来源包括人可变区共有序列(见例如Kettleborough，C.A.等人，Protein Engineering4：773-783(1991)；Carter等人，WO 94/04679)。例如，可以如在Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，NIH，U.S.Government Printing Office(1991)中描述的将用于获得非人部分的抗体或可变区的序列与人序列相比较。在一特别优选的实施方案中，人源化抗体链的构架区源于人可变区，其与非人供体的可变区具有至少约60％的全序列一致性，优选至少约70％的全序列一致性并更优选至少约85％的全序列一致性。人的部分还可以源于这样的人抗体，所述的人抗体与非人供体的等价部分(例如FR)相比较时，在使用的具体部分(例如FR)内，具有至少约65％的序列一致性，并优选至少约70％的序列一致性。
在某些情况下，通过将CDR(来自结合肌肉生长抑素的抗体)移植到选择的人构架区上而产生的人源化抗体可提供对肌肉生长抑素具有理想的亲和性。然而，进一步修饰选择的人构架区的特定残基以便增强抗原结合是必需或理想的。优选地，保留维持或影响结合位点结构的亲本(例如鼠)抗体的那些构架残基。这些残基可以通过对亲本抗体或Fab片段进行X射线晶体衍射而鉴定，从而鉴定抗原结合部位的三维结构。
进一步描述涉及人源化可能使用的鼠抗体的方法的参考文献是，例如Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：2869，1991；美国专利No.5,693,761；美国专利No.4,816,397；美国专利No.5,225,539；如Levitt，M.，J.Mol.Biol.168：595-620，1983中描述的计算机程序ABMOD和ENCAD。
如在此描述的，本发明的抗体可用于治疗、诊断和研究应用。本发明抗体可用于诊断与人肌肉生长抑素的表达相关的紊乱或疾病。以类似的方式，本发明的抗体可用于测定法以监控接受治疗肌肉生长抑素相关的疾病的患者中的肌肉生长抑素水平。诊断测定法包括利用本发明的抗体和标记物在样品(例如在人体液或在细胞或组织提取物)中测定肌肉生长抑素的方法。结合组合物(例如抗体)经修饰或未经修饰使用，并通过共价或非共价连接可检测部分来标记。可检测的部分可以是能直接或间接产生可检测信号的任何部分。例如，可检测部分可能是放射性同位元素，例如3H、14C、32P、35S或125I；荧光或化学发光的化合物，例如异硫氰酸荧光素、若丹明或萤光素；或酶例如碱性磷酸酯酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶。可采用本领域已知的用于将抗体独立地缀合至可检测部分的任何方法，包括由Hunter等人，Nature 144：945，1962；David等人，Biochemistry 13：1014，1974；Pain等人，J.Immunol.Meth.40：219，1981和Nygren，J.Histochem.And Cytochem.30：407，1982描述的方法。
多种用于测定肌肉生长抑素的常规方法，包括例如ELISA、RIA和FACS是本领域已知的并为诊断肌肉生长抑素表达的改变或异常水平提供了基础。正常或标准的表达值用任何领域已知的技术测定，例如在适合形成抗原：抗体络合物的条件下，通过将含有肌肉生长抑素的样品与例如抗体结合而测定。将抗体用可检测物质直接或间接标记以便于检测结合或未结合的抗体。合适的可检测物质包括多种酶、辅基、荧光物质、发光物质和放射性物质。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基络合物的实例包括抗链霉抗生物素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光物质的实例包括7-羟基香豆素、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基氨基荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的实例包括鲁米诺；以及合适的放射性物质的实例包括125I、131I、35S或3H。(见例如Zola，Monoclonal Antibodies：A Manualof Techniques，CRC Press，Inc.(1987))。
形成的标准络合物的量可通过多种方法，例如光度计法测定。然后将在受试者、对照和样品(例如来自活检组织)中表达的肌肉生长抑素多肽的值与标准值比较。标准值和受试者的值之间的偏差确立了用于将特定的紊乱、状态、病状、综合征或疾病与肌肉生长抑素多肽的某种表达水平(或其缺少)相关联的参数。
一旦确立了紊乱、状态、病状、综合征或疾病的存在并且开始进行治疗方案，则定期地重复测定以监控肌肉生长抑素的表达水平。从连续的测定获得的结果用于显示在几天至几个月的时期内的治疗效果。关于特定的紊乱(例如，虚弱或恶病质)，在来自受试者的活检组织或液体(例如血清或尿)中存在改变的肌肉生长抑素的量可以说明有紊乱、状态、病状、综合征或疾病的发展的倾向或其可以提供用于在出现真正的临床症状前检测这种紊乱、状态、病状、综合征或疾病的手段或其可以确定更可能对本发明的抗体发生治疗性反应的群体。更明确的初始检测可以使得更早治疗从而预防和/或改善细胞增殖的进一步发展。
本发明抗体可以整合进适合施用给受试者的药物组合物中。本发明化合物可以以单次剂量或多剂量单独施用或与可药用载体、稀释剂和/或赋形剂组合施用。将用于施用的药物组合物设计为适合于选择的施用模式，并且如果合适，使用可药用稀释剂、载体和/或赋形剂例如分散剂、缓冲剂、表面活性剂、防腐剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等。所述的组合物根据例如Remington，《The Science and Practice of Pharmacy》，第19版，Gennaro，编辑，Mack Publishing Co.，Easton，PA 1995中的常规技术来设计，该文献提供了从业人员通常已知的制备技术的概要。
包含本发明抗肌肉生长抑素单克隆抗体的药物组合物可使用标准施用技术施用给有可能或已显示在此描述的病理学的患者，所述的施用技术包括口服、静脉内、腹膜内、皮下、肺、经皮、肌肉、鼻内、口腔、舌下或栓剂施用。
本发明药物组合物优选是“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明抗体。“治疗有效量”指在所需的剂量和时间内能有效获得理想的治疗效果的量。抗体的治疗有效量可根据若干因素而不同，这些因素如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及抗体或抗体部分在个体中引起理想的反应的能力。治疗有效量也是其中抗体的治疗有利效果胜过其毒性或有害作用的量。“预防有效量”指在必需的剂量和时间内能有效地达到理想的预防效果的量。通常，由于预防剂量是在疾病前或在疾病早期用于受试者中，所以预防有效量将少于治疗有效量。
治疗有效量是赋予受试者治疗益处所需的活性剂的至少最小剂量，但低于毒性剂量。换而言之，治疗有效量是在哺乳动物，优选在人中增加肌肉量、增加骨密度或治疗其中肌肉生长抑素的存在引起或促进不理想的病理效果或者肌肉生长抑素水平的减少导致在哺乳动物，优选在人中产生好的治疗效果的疾病的量，所述的疾病包括但不限于肌肉萎缩、虚弱、年龄相关的肌肉减少、骨质疏松症、肥胖症、任何类型的肌肉营养不良、病危护理肌病、脓毒症、恶病质(例如癌症-相关的或HIV诱导的)、COPD、骨关节炎、肾衰竭、肝衰竭、心力衰竭或疾病、代谢综合症和II型糖尿病。
本发明抗体的施用途径可以是口服的、肠胃外的、通过吸入或局部的。优选地，本发明抗体可以整合进适合肠胃外施用的药物组合物中。如在此使用的术语“肠胃外的”包括静脉内的、肌肉的、皮下的、直肠、阴道或腹膜内施用。优选通过静脉内或腹膜内或皮下注射进行的外周全身递送。用于这类注射的合适的载体是本领域显而易见的。
药物组合物通常必须是无菌并在制造条件下和存储于提供的容器(包括例如密封的小瓶或注射器)中是稳定的。因此，药物组合物可以在制成制剂后经无菌过滤，或以微生物学可接受的条件制备。用于静脉输注的典型的组合物可含有250-1000ml体积的流体，例如无菌林格氏溶液、生理盐水、葡萄糖溶液和Hank’s溶液以及治疗有效量(例如1-100mg/mL或更多)的抗体浓缩物。剂量可根据疾病的类型和严重性而不同。正如医学领域公知的，用于任一受试者的剂量取决于多种因素，包括患者身材、体表面积、年龄、要施用的特定化合物、性别、施用时间和途径、一般健康以及同时施用的其它药物。通常的剂量可以是例如，在0.001-1000μg范围内；然而，特别是考虑上面提及的因素，也考虑低于或高于这一示例性范围的剂量。每日的肠胃外给药方案可以是约0.1μg/kg总体重至约100mg/kg总体重，优选为约0.3μg/kg至约10mg/kg以及更优选为约1μg/kg至1mg/kg，甚至更优选为每天约0.5-10mg/kg体重。可以通过周期性评估定来监控进展。对于在几天或更长时间内的反复施用(取决于患者的情况)，反复治疗直到出现对疾病症状的理想的抑制。然而，其它的给药方案也是有用的并因此不排除在外。理想的剂量可通过单次大剂量(singlebolus)施用、通过多次大剂量(multiple bolus)施用或通过连续灌注施用抗体来递送，这取决于医生希望获得的药物动力学衰变模式。
这些建议的抗体剂量接受许多治疗判断。获得的结果是选择适当剂量和时间安排的关键因素。在本文中考虑的因素包括接受治疗的具体紊乱、接受治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床情况、紊乱的原因、抗体的递送部位、抗体的具体类型、施用方法、施用时间的安排和医生已知的其它因素。
本发明的治疗剂可经冷冻或冻干存储并在使用之前在适宜的无菌载体中重建。冻干和重建可导致不同程度的抗体活性丧失。可能必须调整剂量来补偿。通常，6和8之间的pH是优选的。
治疗用途
肌肉生长抑素在肌肉生长和许多相关的紊乱或疾病中起作用(见例如美国专利申请2003/0074680和2003/0082181)。在成人中，尽管也能在脂肪组织和心脏组织中发现较低浓度的肌肉生长抑素mRNA，但是其主要在骨骼肌中检测到(Sharma，M.等人，J.Cell Physiol.180：1，1999)。去除肌肉生长抑素的小鼠比它们野生型的同窝小鼠具有多两到三倍的肌肉量。增加的肌肉量是纤维肥大或增生的结果(McPherron，A.等人，Nature 387：83-90，1997和Zhu，X.等人，FEBS Letters 474：71)。而且，去除肌肉生长抑素的小鼠比它们野生型的同窝小鼠积累较少的脂肪然而却表现出正常和健康。最近，已经显示肌肉生长抑素是脂肪形成的重要调节物(Rebbapragada，A.等人，Mol.and Cell.Bio.23：7230-7242，2003)。而且，最近已经在肌肉生长抑素缺乏的小鼠中研究了骨的结构和含量(Hamrick M.W.等人，J.Orthopaedic Research 21：1025，2003；Hamrick，M.W.等人，Calcif Tissue Int 71：63，2002)。
因此，含有本发明抗肌肉生长抑素单克隆抗体的药物组合物可用于增加肌肉量、增加骨密度或可用于治疗其中肌肉生长抑素的存在引起或促进不理想的病理效果或者肌肉生长抑素水平的减少在哺乳动物中具有治疗益处的疾病，所述的紊乱包括但不限于肌肉萎缩、虚弱、年龄相关的肌肉减少、骨质疏松症、肥胖症、肌肉营养不良、肌病、恶病质、脓毒病、骨关节炎、COPD、肾衰竭、肝衰竭、心力衰竭或疾病、代谢综合症和II型糖尿病。
在此考虑了本发明抗肌肉生长抑素单克隆抗体用于治疗或预防至少一种上面提及的紊乱中的用途，在所述的紊乱中肌肉生长抑素活性是有害的或其中生物活性的肌肉生长抑素的减少的水平是有利的。而且，本发明抗肌肉生长抑素单克隆抗体用于生产治疗至少一种上面提及的紊乱的药物的用途是受到考虑的。
如在此使用的，术语“处理”、“治疗”等等，指获得期望的药理学和/或生理学效果。该效果在完全或部分预防疾病或其症状的方面可以是预防性的和/或在部分或完全治愈疾病和/或该疾病引起的不利效果的方面可以是治疗性的。如在此使用的，“治疗措施”包括施用本发明化合物用于在哺乳动物，特别是在人中治疗疾病或病状，并包括：(a)预防疾病在倾向感染这种疾病但又还未诊断出患有它的受试者中出现；(b)抑制疾病，即阻止其发展；和(c)减轻疾病，即引起该疾病或紊乱消退或减轻其症状或并发症。可调节给药方案以提供最优化的理想应答(如治疗或预防应答)。例如，可施用单次大剂量，可以在一定时期内施用若干分开的剂量或剂量可以如治疗情况的紧急情况指示按比例减少或增加。
仅为了说明目的提供下面的实施例并且无意以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1：抗肌肉生长抑素Fab合成
将抗肌肉生长抑素Fab的克隆从Fab文库分离，所述的Fab文库通过用OmniclonalTM抗体技术(Biosite，San Diego，CA)免疫C57B1/6野生型小鼠而产生。该小鼠用具有氨基酸序列：
ANYCSGE
SEFVFLQKYPHTHLVHQA(SEQ ID NO：43)的免疫原性多肽免疫。除了野生型人成熟肌肉生长抑素中的位置47处的Cys残基(在上面的SEQ ID NO：43中用下划线标出)改变为Ser残基以防止载体或半抗原在该残基处连接该肽外，该序列与跨越人肌肉生长抑素的成熟形式(SEQ ID NO：2)的氨基酸40-64序列相同。为了提高该肽的免疫原性，根据标准方法将匙孔槭血蓝蛋白和辅助T细胞肽与该免疫源性肽缀合。这里(表1和2；Fig.4和5)公开的HCVR和LCVR以及构架氨基酸序列经鉴定为来自该文库的Fab的序列，所述的Fab序列结合成熟肌肉生长抑素(例如SEQ ID NO：2)和该免疫源性肽并中和肌肉生长抑素活性。编码Fab的LCVR和HCVR的代表性核酸序列在下面表3中列出。
表3-编码Fab LCVR和HCVR的代表性核酸序列
LCVR(SEQ ID NO：44)
5’caaattgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtca
ccatgacctgcagtgccagctcaagtataagttacatgcactggtaccagcagaagccag
gcacctcccccaaaagatggatttatgacacatccaaactggcttctggagtccctgctc
gcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagcatggaggctg
aagatgctgccacttattactgccagcagtggtatagtaacccactcacgttcggtgctg
ggaccaagctggagctgaaacgggctgat 3′
HCVR(SEQ ID NO：45)
5’caggttacgctgaaagagtctggccctgggatattgcagtcctcccagaccctcagtc
tgacttgttctctctctgggttttcactgagaacgtctggtatgagtgtgagctggattc
gtcagtcttcaggaaagggtctggagtggctggcacacatttattgggatgatgacaagc
gctataacccatccctgaggaaccgactcacaatctccaaggataccttgagaaaccagg
tcttcctcaagatcaccagtgtgggcactgcagatactgccacatactactgtgctcgaa
gagctattactacggtaatagggggagggactatggactactggggtcaaggaacctcag
tcaccgtctcctca 3′
实施2：ELISA测定法
A.抗肌肉生长抑素Fab优先结合成熟的肌肉生长抑素
在ELISA测定法中测试本发明的小鼠抗肌肉生长抑素Fab(见图4和5)，其中测量了Fab与在96孔板上以多种浓度包被的成熟肌肉生长抑素(二聚体形式)的结合。以测试Fab与GDF-11的结合。
将两块96孔板的每个孔用70μl重组小鼠肌肉生长抑素(R&Dsystems，目录号788-G8/CF，无载体，1μg/ml于碳酸盐缓冲液中，pH 9.6)或70μl重组人GDF-11(Peprotech公司，目录号120-11，无载体，1μg/ml于碳酸盐缓冲液中，pH 9.6)包被。将板于4℃下孵育过夜。抽吸每孔并用洗涤缓冲液(20mM Tris(羟甲基)氨基甲烷，pH 7.4、0.15M NaCl、0.1％Tween-20)洗涤两次。用200μl封闭缓冲液/孔(上面的洗涤缓冲液中的5％Carnation速溶牛奶)封闭该板5小时。
将待测试的Fab以10μg/ml、2μg/ml、0.4μg/ml、0.08μg/ml和0.016μg/ml稀释进封闭缓冲液中。将50微升每种Fab溶液加至GDF-8和GDF-11包被的孔中，一式两份。室温下孵育该板1小时。然后用洗涤缓冲液洗涤孔3次。
将过氧物酶缀合的第二抗体(50μl山羊抗小鼠κHRP(SouthernBiotech)，1∶2000稀释于封闭缓冲液中)加至每孔并室温下孵育1小时。然后用洗涤缓冲液洗涤孔3次。将50微升显色底物(即OPD底物)加至每孔并让其室温下显色13分钟。通过加入100μl 1N HCl至每孔终止反应。490nm下的OD读取为每孔的吸光度。测定两份板孔的平均吸光度。
这些数据表明本发明的Fab 3、5和7(图4和5)结合板结合的人成熟肌肉生长抑素并当与GDF-11结合比较时优先结合肌肉生长抑素。
A.抗肌肉生长抑素Fab结合肌肉生长抑素的肽免疫原(I)。
将小鼠抗肌肉生长抑素Fab 3、5、7、8、9、10、11、12、14和15在ELISA测定法中检测，其中Fab与用于免疫小鼠的多肽(“肽免疫原”)的结合得以测量。这些多肽跨越成熟肌肉生长抑素的氨基酸40-64并具有在此描述的氨基酸序列ANYCSGE
SEFVFLQKYPHTHLVHQA(SEQ IDNO：43)。
将两块96孔板的每孔用70μl用于产生该Fab的肽免疫原(2μg/ml于碳酸盐缓冲液，pH 9.6)包被。将板除去盖在37℃烘箱中孵育过夜。抽吸每孔并用洗涤缓冲液(20mM Tris(羟甲基)氨基甲烷，pH 7.4、0.15MNaCl、0.1％Tween-20)洗涤两次。用200μl封闭缓冲液/孔(上面的洗涤缓冲液中的5％BioRad印迹级牛奶)封闭该板2.5小时。
将Fab以10μg/ml、2μg/ml、0.4μg/ml、0.08μg/ml和0.016μg/ml稀释进封闭缓冲液中。将大鼠抗肌肉生长抑素单克隆抗体(R&D Systems，目录号MAB788，克隆号84214)和多克隆抗肌肉生长抑素抗体(R&DSystems，目录号AF788)以上面的浓度用作对照并也稀释进封闭缓冲液中。将50微升每种抗体溶液加至肽包被的一式两份的孔中。室温下孵育该板1.5小时。然后用洗涤缓冲液洗涤孔3次。
将Fab的过氧化物酶缀合的第二抗体(50μl山羊抗小鼠κHRP(Southern Biotech))、单克隆的50μl小鼠抗大鼠第二抗体(JacksonImmunoResearch)、多克隆的50μl兔抗山羊第二抗体(JacksonImmunoResearch)，其全部以1∶2000稀释于封闭缓冲液中，加至每孔并室温下孵育1小时。然后用洗涤缓冲液洗涤孔3次。将50微升显色底物(即OPD底物)加至每孔并让其室温下显色10分钟。通过加入100μl 1N HCl至每孔终止反应。490nm下读取每孔的吸光度。测定两份板孔的平均吸光度，并将这些值列于下面的表4中。
Fab结合板结合的肽免疫原。多克隆抗体也以比Fab要小的程度结合肽免疫原。R&D单克隆抗体的结合是在本底水平，这与R&D单克隆抗体识别与免疫原性肽包含的表位不同的表位一致。
A.抗肌肉生长抑素Fab结合多种TGF-β超家族成员。在ELISA测定法中测试小鼠抗肌肉生长抑素Fab 3、5、7(见图4和5)和多克隆抗肌肉生长抑素抗体(R&D Systems)，其中测量了Fab和抗体与包被于板上的抗原(GDF-8/肌肉生长抑素)的家族成员的结合。测试Fab与下组TGF-β超家族成员的结合：GDF-8/肌肉生长抑素(对照)、GDF-11、BMP-2、BMP-5、BMP-6、BMP-7、激活蛋白A、激活蛋白B、TGF-α、TGF-β1和TGF-β2。也测试了IGF-1作为阴性对照。
将96孔板的每孔用70μl上面列出的其中一种生长因子(10μg/ml于碳酸盐缓冲液，pH 9.6)包被，一式两份。来源和目录号见下表5。将板4℃下孵育过夜。抽吸每孔并用洗涤缓冲液(20mM Tris(羟甲基)氨基甲烷，pH 7.4、0.15M NaCl、0.1％Tween-20)洗涤两次。用200μl封闭缓冲液/孔(上面的洗涤缓冲液中的5％Carnation速溶牛奶)封闭该板3小时。
将抗体以10μg/ml稀释于封闭缓冲液中。将50微升每种抗体溶液加至生长因子包被的孔中。室温下孵育该板1小时。然后用洗涤缓冲液洗涤孔3次。
将过氧物酶缀合的第二抗体(Fab的50μl山羊抗小鼠κHRP(Southern Biotech)、多克隆的50μl兔抗山羊(JacksonImmunoResearch)，1∶2000稀释于封闭缓冲液中)加至每孔并室温下孵育1小时。然后用洗涤缓冲液洗涤孔3次。将50微升显色底物(即OPD底物)加至每孔并让其室温下显色10分钟。通过加入100μl 1N HCl至每孔终止反应。490nm下读取每孔的吸光度。测定两份板孔的平均吸光度，这些值列于下面的表6中。
这些数据显示Fab 3、5和7比结合其它测试的蛋白质优先结合肌肉生长抑素。据检测，在这些条件下Fab很少或没有在本底上与任何其它TGF-β超家族成员结合，除了Fab 3十分少量的结合GDF-11。然而，R&D抗肌肉生长抑素多克隆抗体也结合GDF-11(见下表6)。
表5
| 来源公司 | 目录号 | |
| GDF-8GDF-11IGF-1BMP-2BMP-5BMP-6BMP-7激活蛋白A激活蛋白BTGF-aTGF-b1TGF-b2 | R&D SystemsPeprotech，Inc.R&D SystemsR&D SystemsR&D SystemsR&D SystemsR&D SystemsR&D SystemsR&D SystemsR&D SystemsPeprotech，Inc.Peprotech，Inc. | 788-G8/CF120-11291-G1355-BEC/CF615-BM507-BP354-BP338-AC659-AB239-A100-21R100-35 |
表6
| GDF-8 | GDF-11 | IGF-1 | BMP-2 | BMP-5 | BMP-6 | |
| R&D polyFab 3Fab 5Fab 7R&D polyFab 3Fab 5Fab 7 | 2.9410.41950.2020.358BMP-70.0420.0330.0320.031 | 2.6210.07050.0340.04激活蛋白A0.0490.0330.0330.0325 | O.0450.0340.0350.034激活蛋白B0.04850.0320.0330.031 | 0.05250.03450.0320.0335TGF-a0.04450.0330.0330.0315 | 0.0380.0340.0330.0345TGF-b10.04250.0340.03250.032 | O.07450.03350.03250.035TGF-b20.05250.0340.0340.0345 |
实施例3肌肉生长抑素中和测定
将外胚层外植体通过标准方法从阶段8-9囊胚爪蟾胚分离并在外加生长因子(GDF8或GDF11)的0.5×MBS(1×MBS：88mM NaCl、1mMKCl、0.7mM CaCl2、1mM MgSO4、5mM HEPES、2.5mM NaHCO3，1∶1000v/v庆大霉素、0.1％牛血清白蛋白)中于18℃下培养18小时，由此时间对照胚达到了早期神经胚阶段(阶段15-16)。对外植体拍照并用设计用于动物冠定量的图像分析算法测量每个外植体的长度。没有用生长因子或Fab处理的外植体(对照)成长为表皮球(balls of epidermis)。肌肉生长抑素和GDF-11在这些外胚层外植体中诱导中胚层，这引起外植体伸长并形成哑铃状的结构。当测试中和活性时，在整个培养时长将抗体或Fab加至含有肌肉生长抑素的培养基并评估它们抑制生长因子诱导的伸长运动的能力。肌肉生长抑素以25ng/ml加入至外植体。抗体或Fab以20μg/ml加入。Fab34是针对不相关抗原产生的Fab。也测试商业提供的抗肌肉生长抑素多克隆抗体；这些抗体在用纯化的小鼠GDF8免疫的山羊中产生并且生产商表明该抗体当以约10-50μg/ml存在时其中和了由25ng/ml鼠GDF8引起的爪蟾动物冠的伸长(R&D Systems公司，目录号AF788)。测试了商业提供的单克隆抗小鼠GDF8抗体，该抗体由生产商表明当以约10-20μg/ml存在时中和了由25ng/ml鼠GDF8引起的爪蟾动物冠的伸长(R&D Systems，目录号MAB788)。注意，在此的实施例2的ELISA显示该R&D抗体结合与本发明Fab所结合的不同的肌肉生长抑素的区域。
将ImagePro(v4.5.1.22，来自Media Cybernetics)用于图像处理。编写了宏以自动化图像处理。该宏处理图像并以字节单位记录长度。也可使用如本领域已知的备选测量方法。在动物冠测定中，Fab 3、5、7、8、9、10、11、12、14和15能明显中和GDF8活性。
实施例4：单克隆Fab的亲和性测量
本发明的抗肌肉生长抑素Fab 3、5、7、8、9、10、11、12、14、15的亲和力(KD)和Kon和Koff率用含有CM5传感芯片的BIAcore2000仪测量。BIAcore利用表面等离振子共振的光学特性来检测右旋糖苷生物传感器内相互作用分子的蛋白质浓度的改变。除了指出的以外，全部试剂和材料购自BIAcoreAB(Upsala，Sweden)。所有测量在25℃下进行。将含有大鼠或人肌肉生长抑素的样品溶解于HBS-EP缓冲液中(150mM氯化钠、3mM EDTA、0.005％(w/v)表面活性剂P-20和10mM HEPES，pH 7.4)。捕获抗体即山羊抗小鼠κ(Southern Biotechnology公司)用胺偶联化学固定于流动池(flow cell)上。流动池(1-4)用0.1M N-羟基琥珀酰亚胺和0.1M 3-(N，N-二甲基氨基)丙基-N-乙基碳酰二亚胺的1∶1混合物以10μl/分钟的流速活化7分钟。将山羊抗小鼠κ(30μg/mL于10mM乙酸钠，pH 4.5)以10μL/分钟手动注射在全部4个流动池上。监控表面密度并且如果需要将额外的山羊抗小鼠κ注射至个别池直至全部池达到4500-5000反应单位(RU)的表面密度。表面通过注射7分钟1M乙醇胺-HCl，pH 8.5(10μL/分钟)封闭。
为了确保完全除去任何非共价结合的山羊抗小鼠κ，注射两次15μL 10mM甘氨酸。
用于动力学试验的电泳缓冲液含有10mM HEPES，pH 7.4、150mMNaCl、0.005％P20。
动力学结合数据的收集在最大流速(100μL/min)和低表面密度下进行以使堆移效应(mass transport effects)最小化。每个分析循环由以下步骤组成：(i)通过以10μL/分钟的流速注射5-10μL 5μg/ml溶液于不同Fab的流动池2、3和4来捕获300-350RU的Fab(BioSite)，(ii)注射200μL(2分钟)人肌肉生长抑素(浓度范围为50nM-1.56nM，以2-倍稀释增加)于全部4个流动池上，流动池1作为参照流动池，(iii)10分钟离解(buffer flow)(iv)通过15秒钟注射10mM甘氨酸，pH 1.5再生山羊抗小鼠κ表面，(V)30秒钟空白注射电泳缓冲液，并(Vi)在开始下个循环前稳定2分钟。信号以流动池2减去流动池1、流动池3减去流动池1和流动池4减去流动池1监控。以随机次序一式两份注射样品和缓冲液空白。用BIAevaluation 3.1软件处理数据并将数据在CLAMP全局分析软件中拟合至1∶1结合模型。
Fab 3、5、7、8、9、10、11、12、14和15具有在7×10-6和4.0×10-8之间的KD。
实施例5肌肉骨骼功效的体内小鼠模型
将雄性ICR小鼠(8周大，Taconic NY)根据批准的方法阉割(性腺切除，GDX)并让其消耗10周。也获取年龄匹配的假手术(Sham)小鼠。除了不切除它们的睾丸，假手术小鼠以与阉割的小鼠相同的方式操作。将动物圈养在具有颠倒的12小时光/暗周期的温控室内(24℃)并随意提供水和食物。
为了证明体内功效，通过皮下注射将本发明的化合物每隔一周注射至阉割的八周大小鼠(体重约48-50g)和年龄一致的假手术小鼠。将测试化合物在磷酸缓冲盐水中施用至动物。将仅用同种型匹配的IgG1处理的阉割小鼠用作阴性对照。
将试验动物(每组12只小鼠)在15周时间内用例如60mg/kg/2周的本发明化合物经皮下给药。在每个给药时间点，根据每只动物的体重调整剂量。以下的测量值在试验的开始和结束记录：体重、定量磁共振(QMR，Echo Medical Systems，TX)分析得到的身体肌肉量和身体握力(Columbus Instruments，OH)。
15周处理后，作为肌肉活性的指标，试验组的骨骼肌(四头肌)的湿重得以测定并与阉割的、仅IgG对照组中的该重量比较。作为骨骼活性的指标，通过微型计算机X射线断层术(qCT)(Research M，Stratec)分析将试验动物的股骨的骨量(骨矿物质密度，BMD，mg/cc)同样与阉割的、仅IgG对照组的股骨的骨量比较。
含有Fab 3的抗肌肉生长抑素抗体在这里描述的条件下对肌肉和骨都有合成作用。
序列表
<110>伊莱利利公司
<120>抗肌肉生长抑素受体
<130>X-16397
<140>PCT/US2005/009307
<141>2005-03-17
<150>US60/559,621
<151>2004-04-05
<150>US60/555,456
<151>2004-03-24
<160>56
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>375
<212>PRT
<213>人
<400>1
Met Gln Lys Leu Gln Leu Cys Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile
1 5 10 15
Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn
20 25 30
Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr
35 40 45
Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu
50 55 60
Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Val Ile Arg Gln Leu
65 70 75 80
Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val
85 90 95
Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His
100 105 110
Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu
115 120 125
Met Gln Val Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser
130 135 140
Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu
145 150 155 160
Arg Pro Val Glu Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu
165 170 175
Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu
180 185 190
Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val
195 200 205
Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly
210 215 220
Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr
225 230 235 240
Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys
245 250 255
Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys
260 265 270
Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val
275 280 285
Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr
290 295 300
Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys
305 310 315 320
Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala
325 330 335
Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr
340 345 350
Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val
355 360 365
Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser
370 375
<210>2
<211>109
<212>PRT
<213>人
<400>2
Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys
1 5 10 15
Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile
20 25 30
Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu
35 40 45
Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala
50 55 60
Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser
65 70 75 80
Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly
85 90 95
Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser
100 105
<210>3
<211>109
<212>PRT
<213>小鼠
<400>3
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Tyr Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp
100 105
<210>4
<211>109
<212>PRT
<213>小鼠
<400>4
Gln Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val His Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp
100 105
<210>5
<211>109
<212>PRT
<213>小鼠
<400>5
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp
100 105
<210>6
<211>109
<212>PRT
<213>小鼠
<400>6
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp
100 105
<210>7
<211>109
<212>PRT
<213>小鼠
<400>7
Gln Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Tyr Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp
100 105
<210>8
<211>109
<212>PRT
<213>小鼠
<400>8
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp
100 105
<210>9
<211>109
<212>PRT
<213>小鼠
<400>9
Gln Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Tyr Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Arg Ser Gly Ala Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Tyr Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp
100 105
<210>10
<211>109
<212>PRT
<213>小鼠
<400>10
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Tyr Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp
100 105
<210>11
<211>109
<212>PRT
<213>小鼠
<400>11
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Glu Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Asn Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp
100 105
<210>12
<211>124
<212>PRT
<213>小鼠
<400>12
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Ser Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Leu Ser Gly Phe Ser Leu Arg Thr Ser
20 25 30
Gly Met Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Ser Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Arg Asn Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Leu Arg Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Gly Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>13
<211>124
<212>PRT
<213>小鼠
<400>13
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Ser Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Ser Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Arg Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Arg Gly Ile Thr Thr Val Leu Gly Gly Gly Thr Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>14
<211>123
<212>PRT
<213>小鼠
<400>14
Gln Val Thr Leu Lys Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Ser Ser Gln Thr
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Ser Leu Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Ser Gly
20 25 30
Met Ile Val Ser Trp Ile Arg Gln Ser Ser Gly Arg Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Arg Asn Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Leu Arg Asn Gln Val Phe
65 70 75 80
Leu Trp Ile Ser Ser Val Gly Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Met Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>15
<211>124
<212>PRT
<213>小鼠
<400>15
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Ser Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Val Leu Gly Gly Gly Thr Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>16
<211>124
<212>PRT
<213>小鼠
<400>16
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Met Leu Gln Ser Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Leu Ser Gly Phe Ser Leu Arg Thr Ser
20 25 30
Gly Met Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Ser Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Arg Asn Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Leu Arg Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Gly Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>17
<211>124
<212>PRT
<213>小鼠
<400>17
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Leu Ser Gly Phe Ser Leu Arg Thr Ser
20 25 30
Gly Met Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Ser Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Glu Arg Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Arg Asn Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Leu Arg Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Gly Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>18
<211>10
<212>PRT
<213>小鼠
<400>18
Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met His
1 5 10
<210>19
<211>10
<212>PRT
<213>小鼠
<400>19
Ser Ala Ser Ser Ser Val His Tyr Met His
1 5 10
<210>20
<211>10
<212>PRT
<213>小鼠
<400>20
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210>21
<211>10
<212>PRT
<213>小鼠
<400>21
Ser Ala Ser Ser Ser Val Tyr Tyr Met His
1 5 10
<210>22
<211>10
<212>PRT
<213>小鼠
<400>22
Ser Ala Ser Ser Ser Ile Asn Tyr Met His
1 5 10
<210>23
<211>7
<212>PRT
<213>小鼠
<400>23
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210>24
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>24
Gln Gln Trp Tyr Ser Asn Pro Leu Thr
1 5
<210>25
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>25
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
1 5
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<213>小鼠
<400>26
Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Leu Thr
1 5
<210>27
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>27
Gln Gln Trp Asn Ser Asn Pro Leu Thr
1 5
<210>28
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>28
Gln Gln Trp Thr Tyr Asn Pro Leu Thr
1 5
<210>29
<211>12
<212>PRT
<213>小鼠
<400>29
Gly Phe Ser Leu Arg Thr Ser Gly Met Ser Val Ser
1 5 10
<210>30
<211>12
<212>PRT
<213>小鼠
<400>30
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Ser Val Ser
1 5 10
<210>31
<211>12
<212>PRT
<213>小鼠
<400>31
Gly Phe Ser Leu Thr Thr Ser Gly Met Ile Val Ser
1 5 10
<210>32
<211>16
<212>PRT
<213>小鼠
<400>32
His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Asn
1 5 10 15
<210>33
<211>16
<212>PRT
<213>小鼠
<400>33
His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser
1 5 10 15
<210>34
<211>16
<212>PRT
<213>小鼠
<400>34
His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210>35
<211>16
<212>PRT
<213>小鼠
<400>35
His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Glu Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Asn
1 5 10 15
<210>36
<211>14
<212>PRT
<213>小鼠
<400>36
Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Met Asp Tyr
1 5 10
<210>37
<211>14
<212>PRT
<213>小鼠
<400>37
Arg Gly Ile Thr Thr Val Leu Gly Gly Gly Thr Met Asp Tyr
1 5 10
<210>38
<211>10
<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>X是疏水氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>X是Ser、Thr、His、Tyr或Asn
<400>38
Ser Ala Ser Ser Ser Xaa Xaa Tyr Met His
1 5 10
<210>39
<211>109
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>X是Asp或Asn
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>X是Phe或Leu
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>X是Thr或Ser
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(46)..(46)
<223>X是Glu或Gln
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(49)..(49)
<223>X是Phe或Tyr
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(50)..(50)
<223>X是Val或Met
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(52)..(52)
<223>X是Leu或Met
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(62)..(62)
<223>X是His或Gln
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(89)..(89)
<223>X是Gly或Asp
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(91)..(91)
<223>X是Glu或Gln
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(100)..(100)
<223>X是Ala或Gly
<400>39
Xaa Xaa Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Xaa Glu Ser Arg Cys Cys
1 5 10 15
Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile
20 25 30
Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Xaa Cys Glu
35 40 45
Xaa Xaa Phe Xaa Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val Xaa Gln Ala
50 55 60
Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser
65 70 75 80
Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Xaa Lys Xaa Gln Ile Ile Tyr Gly
85 90 95
Lys Ile Pro Xaa Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser
100 105
<210>40
<211>109
<212>PRT
<213>人
<400>40
Asn Leu Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Ser Glu Ser Arg Cys Cys
1 5 10 15
Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile
20 25 30
Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Gln Cys Glu
35 40 45
Tyr Met Phe Met Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val Gln Gln Ala
50 55 60
Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser
65 70 75 80
Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Asp Lys Gln Gln Ile Ile Tyr Gly
85 90 95
Lys Ile Pro Gly Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser
100 105
<210>41
<211>16
<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>X是Lys、Arg、Glu或Asp
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>X是Lys或Arg
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>X是Ser、Thr、Asn或Gln
<400>41
His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Xaa Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Xaa Xaa
1 5 10 15
<210>42
<211>14
<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>X是Ala或Gly
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>X是Ile、Leu或Val
<400>42
Arg Xaa Ile Thr Thr Val Xaa Gly Gly Gly Thr Met Asp Tyr
1 5 10
<210>43
<211>25
<212>PRT
<213>小鼠
<400>43
Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Ser Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr
1 5 10 15
Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala
20 25
<210>44
<211>327
<212>DNA
<213>小鼠
<400>44
caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60
atgacctgca gtgccagctc aagtataagt tacatgcact ggtaccagca gaagccaggc 120
acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg tatagtaacc cactcacgtt cggtgctggg 300
accaagctgg agctgaaacg ggctgat 327
<210>45
<211>372
<212>DNA
<213>小鼠
<400>45
caggttacgc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagt cctcccagac cctcagtctg 60
acttgttctc tctctgggtt ttcactgaga acgtctggta tgagtgtgag ctggattcgt 120
cagtcttcag gaaagggtct ggagtggctg gcacacattt attgggatga tgacaagcgc 180
tataacccat ccctgaggaa ccgactcaca atctccaagg ataccttgag aaaccaggtc 240
ttcctcaaga tcaccagtgt gggcactgca gatactgcca catactactg tgctcgaaga 300
gctattacta cggtaatagg gggagggact atggactact ggggtcaagg aacctcagtc 360
accgtctcct ca 372
<210>46
<211>25
<212>PRT
<213>小鼠
<400>46
Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr
1 5 10 15
Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala
20 25
<210>47
<211>12
<212>PRT
<213>小鼠
<400>47
Gly Phe Ser Leu Arg Thr Ser Gly Ser Ser Val Ser
1 5 10
<210>48
<211>12
<212>PRT
<213>小鼠
<400>48
Gly Phe Ser Leu Arg Lys Ser Gly Met Ser Val Ser
1 5 10
<210>49
<211>12
<212>PRT
<213>小鼠
<400>49
Gly Phe Ser Leu Arg Thr Val Gly Met Ser Val Ser
1 5 10
<210>50
<211>12
<212>PRT
<213>小鼠
<400>50
Gly Phe Ser Leu Arg Thr Leu Gly Met Ser Val Ser
1 5 10
<210>51
<211>12
<212>PRT
<213>小鼠
<400>51
Gly Phe Ser Leu Arg Thr Leu Gly Ser Ser Val Ser
1 5 10
<210>52
<211>12
<212>PRT
<213>小鼠
<400>52
Gly Phe Ser Leu Arg Lys Val Gly Ser Ser Val Ser
1 5 10
<210>53
<211>12
<212>PRT
<213>小鼠
<400>53
Gly Phe Ser Leu Arg Lys Leu Gly Ser Ser Val Ser
1 5 10
<210>54
<211>12
<212>PRT
<213>小鼠
<400>54
Gly Phe Ser Leu Arg Lys Ser Gly Ser Ser Val Ser
1 5 10
<210>55
<211>12
<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>X是Arg、Lys、Thr或Ser
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>X是Thr或Lys
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>X是Ser、Val或Leu
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>X是Met或Ser
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>X是Ser、Thr、Ile、Leu或Val
<400>55
Gly Phe Ser Leu Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Val Ser
1 5 10
<210>56
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>X是Tyr、Ser、Asn或Thr
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>X是Arg、Lys、Tyr、Ser或Thr
<400>56
Gln Gln Trp Xaa Xaa Asn Pro Leu Thr
1 5
Claims (17)
1.抗肌肉生长抑素单克隆抗体，所述的抗体含有具有以下列出序列的两种多肽：
(i)SEQ ID NO：3和12，
(ii)SEQ ID NO：4和13，
(iii)SEQ ID NO：3和14，
(iv)SEQ ID NO：5和12，
(v)SEQ ID NO：6和15，
(vi)SEQ ID NO：7和17，
(vii)SEQ ID NO：8和12，
(viii)SEQ ID NO：9和16，
(ix)SEQ ID NO：10和12，及
(x)SEQ ID NO：11和12。
2.抗肌肉生长抑素单克隆抗体，所述的抗体包含含有1、2或3种选自以下肽的LCVR：(i)CDR1具有如SEQ ID NO：38显示序列的肽，(ii)CDR2具有如SEQ ID NO：23显示序列的肽，和(iii)CDR3具有如SEQ ID NO：56显示序列的肽。
3.抗肌肉生长抑素单克隆抗体，所述的抗体包含含有1、2或3种选自以下肽的HCVR：(i)CDR1具有如SEQ ID NO：55显示序列的肽，(ii)CDR2具有如SEQ ID NO：41显示序列的肽，和(iii)CDR3具有如SEQ ID NO：42显示序列的肽。
4.权利要求3的单克隆抗体，所述的抗体还包含含有1、2或3种选自以下肽的LCVR：(i)CDR1具有如SEQ ID NO：38显示序列的肽，(ii)CDR2具有如SEQ ID NO：23显示序列的肽，和(iii)CDR3具有如SEQ ID NO：56显示序列的肽。
5.权利要求1-4中任一项的单克隆抗体，其中所述的LCVR含有1、2或3种选自以下的肽：(i)LCDR CDR1具有如SEQ ID NO：18、19、20、21或22中显示序列的肽，(ii)LCVR CDR2具有如SEQ ID NO：23显示序列的肽，和(iii)LCVR CDR3具有如SEQ ID NO：24、25、26、27或28显示序列的肽。
6.权利要求1-5中任一项的单克隆抗体，其中HCVR含有1、2或3种选自以下的肽：(i)HCDR CDR1具有如SEQ ID NO：29、30、31、47、48、49、50、51、52、53或54中显示序列的肽，(ii)HCVR CDR2具有如SEQ ID NO：32、33、34或35中显示序列的肽，和(iii)HCVRCDR3具有如在SEQ ID NO：36或37中显示序列的肽。
7.权利要求1-6中任一项的单克隆抗体，其中单克隆抗体是全长的抗体、基本完整的抗体、嵌合抗体、Fab片段、F(ab′)2片段或单链Fv片段。
8.如权利要求1-7中任一项的单克隆抗体，其中单克隆抗体是人源化抗体。
9.如权利要求1-6中任一项的单克隆抗体，其中存在于抗体中的恒定区源于选自家畜、运动动物和食物源动物的动物基因组。
10.产生抗肌肉生长抑素单克隆抗体的方法，所述方法通过：
(i)通过注射选自以下的肽来免疫非人动物：
a)由具有如SEQ ID NO：46或43中显示序列的肽组成的免疫原性肽，
b)由具有如SEQ ID NO：46或43中显示序列的肽的24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个连续氨基酸组成的免疫原性肽，其中至少一个氨基酸不同于GDF-11中等价位置上的氨基酸，
c)由任一哺乳动物的成熟肌肉生长抑素氨基酸40-64组成的免疫原性肽，
d)由任一哺乳动物的成熟肌肉生长抑素氨基酸40-64组成的肽的24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个连续氨基酸组成的免疫原性肽，其中至少一个氨基酸不同于GDF-11中等价位置上的氨基酸，
(ii)从该经免疫动物产生抗肌肉生长抑素单克隆抗体，并且，
(iii)从产生的抗肌肉生长抑素单克隆抗体中筛选特异性结合成熟肌肉生长抑素，或其含有免疫原性肽的部分，或免疫原性肽的抗体。
11.由权利要求10的方法产生的单克隆抗体。
12.产生抗肌肉生长抑素单克隆抗体的方法，所述方法通过：
(i)通过注射选自以下的肽来免疫非人动物：
a)含有具有如在SEQ ID NO：46或43中显示序列的肽的免疫原性肽，
b)含有具有如SEQ ID NO：46或43中显示序列的肽的24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个连续氨基酸的免疫原性肽，其中至少一个氨基酸不同于GDF-11中等价位置上的氨基酸，
c)含有任一哺乳动物的成熟肌肉生长抑素氨基酸40-64的免疫原性肽，
d)含有由任一哺乳动物的成熟肌肉生长抑素氨基酸40-64组成的肽的24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个连续氨基酸的免疫原性肽，其中至少一个氨基酸不同于GDF-11中等价位置上的氨基酸，
(ii)从该经免疫动物产生抗肌肉生长抑素单克隆抗体，并且，
(iii)从产生的抗肌肉生长抑素单克隆抗体中筛选特异性结合以下肽的抗体：
a)由具有如SEQ ID NO：46或43中显示序列的肽组成的抗原肽，
b)由具有如SEQ ID NO：46或43中显示序列的肽的24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个连续氨基酸组成的抗原肽，其中至少一个氨基酸不同于GDF-11中等价位置上的氨基酸，
c)由任一哺乳动物肌肉生长抑素成熟形式的位置40-64的氨基酸组成的抗原肽，和
d)由任一哺乳动物肌肉生长抑素成熟形式的位置40-64的氨基酸组成的肽的24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个由连续氨基酸组成的抗原肽，其中至少一个氨基酸不同于GDF-11中等价位置上的氨基酸。
13.由权利要求12的方法产生的单克隆抗体。
14.药物组合物，所述药物组合物含有权利要求1-9、11和13中任一项的抗体。
15.权利要求14的药物组合物，所述药物组合物还含有可药用载体。
16.增加肌肉量的方法，所述方法包括向有所需要的受试者施用治疗有效量的权利要求14-15中任一项的药物组合物。
17.治疗或预防虚弱、恶病质、肌肉萎缩、肌无力、肌病、肌肉营养不良、骨质疏松症、COPD、肾衰竭或肾病、肝衰竭或肝病、心力衰竭或心脏病、II型糖尿病或代谢综合征的方法，所述方法通过向有所需要的受试者施用治疗有效量的权利要求14-15中任一项的药物组合物。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101970487A (zh) * | 2007-11-01 | 2011-02-09 | 惠氏有限责任公司 | Gdf8抗体及其用途 |
-
2005
- 2005-03-17 CN CN 200580009577 patent/CN1934266A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101970487A (zh) * | 2007-11-01 | 2011-02-09 | 惠氏有限责任公司 | Gdf8抗体及其用途 |
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