CN101970487A - Gdf8抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开文本提供了与生长与分化因子-8(GDF8)相关的、可能体外和/或体内抑制GDF8活性和信号的新颖分子，尤其是对GDF8特异性的表位和GDF8的其它特异性拮抗剂，尤其是抗-GDF8抗体或抗原结合蛋白质或其片段。本公开文本还提供了用于检测和定量GDF8的免疫测定法。本公开文本还提供了用于诊断、预防、改善和治疗与GDF8相关的病症(例如肌肉、骨和胰岛素代谢的退行性病症)的方法。最后，本公开文本提供了通过使用本发明的抗体、多肽、多核苷酸和载体治疗这类病症的药物。

Description

GDF8抗体及其用途
发明领域
本发明的技术领域涉及对生长与分化因子-8(growth and differentiationfactor-8)(GDF8)特异性的表位及其拮抗剂(例如肽模拟物、抗-GDF8抗体(例如小鼠、人和人源化抗体、其片段等)、重组多核苷酸、抑制性多核苷酸等)，所述拮抗剂可用于体外和/或体内抑制GDF8活性。所述领域还涉及在生物样品中检测GDF8的免疫检验方法，以及治疗、改善、预防、诊断、预测和/或监测GDF8-相关病症(例如肌肉病症、神经肌肉病症、骨-退行性病症、代谢或诱导的骨病症、肥胖病症、葡萄糖代谢病症或胰岛素相关病症)的方法，尤其是在具有生育能力的妇女中。
发明背景
生长及分化因子-8(GDF8)(也称作肌抑制素(myostatin))是一种分泌型蛋白质，并且是结构相关的转化生长因子-β(TGF-β)超家族的成员。这一超家族的成员具有生长-调节和形态发生的特性(Kingsley等(1994)Genes Dev.8：133-46；Hoodless等(1998)Curr.Topics Microbiol.Immunol.228：235-72)。人GDF8作为375个氨基酸的前体蛋白质被合成，所述前体蛋白质形成同二聚体复合物。在加工期间，已知为“潜伏-相关肽(latency-associated peptide，LAP)”的氨基端前肽被切割，并且保持与同二聚体非共价结合，形成被命名为“小潜伏复合物(latent complex)”的活性复合物(Miyazono等(1988)J.Biol.Chem.263：6407-15；Wakefield等(1988)J.Biol.Chem.263：7646-54；Brown等(1999)Growth Factors 3：35-43；Thies等(2001)Growth Factors 18：251-59；Gentry等(1990)Biochemistry 29：6851-57；Derynck等(1995)Nature 316：701-05；Massague(1990)Ann.Rev.Cell Biol.12：597-641)。蛋白质例如卵泡抑素(follistatin)和卵泡抑素-相关蛋白质包括GASP-1(Gamer等(1999)Dev Biol.208：222-232，美国专利公开No.2003-0180306-A1；美国专利公开No.2003-0162714-A1)，其结合成熟的GDF8同二聚体并抑制GDF8生物活性。
来自多种物种的推知的GDF8氨基酸序列的比对证明GDF8是保守的(McPherron等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94：12457-61)。人、小鼠、大鼠、猪和鸡GDF8的序列在C-端区中100％相同，而狒狒、牛和羊GDF8在C-端差异仅为3个氨基酸。GDF8跨物种的高保守性提示GDF8具有重要的生理功能。
已显示GDF8通过抑制成肌细胞和卫星细胞的增殖以及分化而在肌肉发育和内稳态中起主要作用(Lee和McPherron(1999)Curr.Opin.Genet.Dev.9：604-7；McCroskery等(2003)J.Cell Biol.162：1135-47)。其在发育中的骨骼肌中早期表达，并且在成年骨骼肌中继续表达，优选地在快速颤搐(fast twitch)类型的骨骼肌中表达。GDF8也涉及肌肉-特异性酶(例如肌酸激酶)的生产和成肌细胞增殖(WO 00/43781)。
成年小鼠中GDF8的过表达导致显著的肌肉减少(Zimmers等(2002)Science 296：1486-88)。类似地，多种研究指出提高的GDF8表达与HIV-诱导的肌肉消耗相关(Gonzalez-Cadavid等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95：14938-43)。相反，GDF8敲除转基因小鼠的特征是显著的骨骼肌肥大和增生，以及改变的皮质骨结构(cortical bone structure)(McPherron等(1997)Nature 387：83-90；Hamrick等(2000)Bone 27：343-49)。另外，使GDF8基因无活性的天然突变显示在动物和人中均引起肥大以及增生(Lee和McPherron(1997)，上文)。例如，在牛中的天然GDF8突变中，骨骼肌量的提高是明显的(Ashmore等(1974)Growth 38：501-07；Swatland等(1994)J.Anim.Sci.38：752-57；McPherron等，上文；Kambadur等(1997)Genome Res.7：910-15)。
大量人和动物的肌肉和谷歌病症与功能受损的肌肉组织相关，因此可与GDF8相关。例如，GDF8可以涉及以下的发病机制：肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、肌营养不良(“MD”；包括Duchenne’s肌营养不良、筋膜肩胛(fascioscapular)肌营养不良和筋膜肩胛肱(facioscapulohumeral)肌营养不良)、肌萎缩、腕管综合征(carpal tunnelsyndrome)、器官萎缩、虚弱、充血性阻塞性肺病(COPD)、老年性肌肉萎缩、恶病质和其它疾病和病症引起的肌肉消耗综合征。
还相信GDF8参与大量其它生理学过程和相关病症，包括2型糖尿病发生期间的葡萄糖内稳态、糖耐量减低(impaired glucose tolerance)、代谢综合征(即涉及一组健康状况(其可包括胰岛素抗性、腹部肥胖症、异常脂肪血症、高血压、慢性炎症、前血栓形成状态(prothrombotic state)等)的同时发生的综合征(例如综合征X)，其将人置于2型糖尿病和/或心脏病的高度风险下)、胰岛素抗性(例如创伤如烧伤或氮失衡诱导的抗性)和脂肪组织病症(例如肥胖症、异常脂肪血症、非酒精性脂肪肝疾病等)(Kim等(2000)Biochem.Biophys.Res.Comm.281：902-06)。目前几乎不存在用于治疗这些病症的可靠或有效的疗法。这些过程的病理学表明GDF8是这些相关病症的治疗中潜在的靶标。
除了人中的神经肌肉病症以外，还存在与骨损耗相关的生长因子-相关病症，例如骨质疏松和骨关节炎，它们主要影响老年和/或绝经后的女性。这类代谢性骨疾病和病症包括由于慢性糖皮质激素疗法、过早的性腺衰竭、雄性激素阻抑、维生素D缺乏、继发性甲状旁腺功能亢进、营养缺乏和神经性厌食症(anorexia nervosa)导致的低骨量。尽管目前针对这些病症的许多疗法通过抑制骨再吸收来发挥作用，但是促进骨形成的疗法会是有用的替代性治疗。因为GDF8在骨发育以及肌肉发育中起作用，所以GDF8也是用于治疗骨-退行性病症的极佳的药理学靶标。
与转化生长因子-β(TGF-β)家族的其它成员类似，GDF8被合成为376个氨基酸的前体蛋白质，其含有信号序列、N-端前肽结构域和被认为是活性分子的C-端结构域。GDF8通过与其前肽结合而以潜伏形式(潜伏-相关肽，LAP)被分泌；前肽结构域和C-端结构域之间的蛋白水解加工产生N-端前肽和成熟形式的GDF8。未经加工的和成熟的GDF8均形成二硫键-连接的二聚体，并且经加工的GDF8代表了所述蛋白质的唯一活性形式。在血清以及骨骼肌中，可发现GDF8与能够调控其活化、分泌或受体结合的若干蛋白质结合。
GDF8通过跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶异四聚体受体家族发挥其作用，其活化增强受体转磷酸化，导致丝氨酸/苏氨酸激酶活性的刺激。已经显示GDF8通路涉及活性GDF8二聚体与高亲和力受体ActIIRB的结合，所述ActIIRB随后募集并活化低亲和力受体ALK4/ALK5的转磷酸化。还显示蛋白质Smad 2和Smad 3随后被活化并与Smad 4形成复合物，然后易位至核，随后活化靶基因转录。Lee和McPherron(Proc Natl Acad Sci USA2001，98：9306-9311)证实ActRIIB受体能够体内介导GDF8的影响，因为小鼠中显性负相形式ActRIIB的表达模拟GDF8基因敲除。
已显示在GDF8的影响下，C2C12成肌细胞在细胞周期的G0/G1和G2期累积，因此降低S-期细胞的数量。GDF8还诱导成肌细胞分化的失败，这与分化标记物表达的强降低相关。GDF8表达还降低了细胞在增殖和分化条件下的凋亡速率(Thomas等，J.Biol Chem 2000，275：40235-40243)。
肌抑制素(GDF8)表达的抑制导致肌肉肥大以及增生(Lee和McPherron，上文；McPherron等，上文)。肌抑制素负调节损伤后的肌肉再生，并且GDF8无效小鼠中肌抑制素的缺乏导致加速的肌肉再生(McCroskery等，(2005)J.Cell.Sci.118：3531-41)。人抗-GDF8抗体(美国公开的申请No.2004/0142382)已显示在体外和体内结合GDF8并且抑制GDF8活性，包括与骨骼肌量和骨密度负调节相关的GDF8活性。例如，在野生型小鼠(Whittemore等(2003)Biochem.Biophys.Res.Commun.300：965-71)和肌营养不良模型的mdx小鼠(Bogdanovich等(2002)Nature420：418-21；Wagner等(2002)Ann.Neurol.52：832-36)的骨骼肌中，肌抑制素-中和抗体提高体重、骨骼肌量和的肌肉尺寸和强度。另外，这些小鼠中的肌抑制素抗体降低了对膈的损害，所述膈是也在ALS发病机制期间被靶向的肌肉。已推测生长因子例如HGF对肌肉的作用可归因于肌抑制素表达的抑制(McCroskery等(2005)，上文)，从而帮助将再生和退化之间的平衡正向移动。然而，这些现有技术的抗体对GDF8而言是非特异性的，即这些抗体对TGF-β超家族的其它成员例如BMP11具有高亲和力。
迄今为止，所有已知的GDF8活性抑制剂(例如前肽、可溶的ActRIIB受体、抗-GDF8抗体等等)还中和具有重要生物功能的其它因子(例如BMP11、激活蛋白等)的生物活性。例如激活蛋白和BMP11在胚胎发生期间起重要作用。激活蛋白βA被鉴定为关键的生殖腺生长因子，BMP11负责中轴骨骼(axial skeleton)的同种转化(homeotic transformation)。纯合的BMP11敲除小鼠是围产期(perinatal)致死的；具有一个野生型拷贝的BMP11基因的小鼠是可存活的，但是具有骨骼缺陷。因为激活蛋白和BMP11在胚胎发生期间起重要作用，所以抑制GDF8和其它因子(例如BMP11)的拮抗剂提出了理论上的安全性风险，所述安全性风险可以表现为被治疗的患者中的毒性或者例如具有生育能力的女性的生殖毒性。因此存在对下述化合物和治疗方法的需要，所述化合物和治疗方法有助于肌肉量和/或强度和/或骨密度的总体提高(尤其是在人中)，但是不干扰例如BMP11。也就是说，在期望提高肌肉量、尺寸、强度等等的GDF8-相关病症的治疗中，尤其是在具有生育能力的女性中，需要特异性抑制GDF8活性。
因为已开发了使用GDF-8调节剂的方法，所以需要开发监测和优化对个体施用这类药剂的方法。具体地，测量生物流体中GDF-8蛋白质水平的能力对于目前的临床试验而言具有重要意义。例如，循环GDF-8水平可能诊断可受益于抗-GDF-8疗法的病理状况，或者可能预测哪个个体更可能对抗-GDF-8疗法作出应答。另外，抗-GDF-8治疗期间外周血中GDF-8水平的改变可以是肌肉量和/或功能的晚期可测量应答的早期指示器。
为了完成这样的优化目标，需要检测或监测生物流体(例如血清和血浆)中的GDF-4蛋白质水平。期望在用GDF-8调节剂治疗之前、期间和之后监测GDF-8水平，从而例如鉴定适合这类治疗的个体、监测对治疗的应答，和跟踪治疗后进展。具体地，需要允许检测和/或定量应答GDF-8调节剂(包括GDF-8抑制剂和抗-GDF-8抗体)施用的内源GDF-8水平的方法。
因此，提供特异性抑制GDF8活性的化合物和方法以及检测和定量生物样品(例如血清和血浆)中GDF-8水平的免疫检验是本发明的一个主要目的。
发明内容
本发明基于特异性结合生长与分化因子8(GDF8)的抗体或抗原结合蛋白的发现，所述抗体或抗原加合蛋白特异性地拮抗至少一种GDF8活性(例如GDF8与其受体的结合或其它GDF8-介导的信号转导事件)。本发明还基于GDF8上被这些特异性抗-GDF8抗体或抗原结合蛋白识别的表位的鉴定，因为本发明的抗体对GDF8是特异性的，并且不特异性结合例如BMP11。
除了提供对GDF8特异性的表位以外，本发明还提供了对GDF8特异性的拮抗剂(在本文中也称作“特异性GDF8拮抗剂”、“GDF8拮抗剂”等等)，例如特异性拮抗(例如抑制、降低和/或中和)至少一种GDF8活性(例如GDF8-介导的信号转导事件(例如GDF8与其受体(例如其ALK4/ALK5受体)的结合))并且不显著拮抗BMP11活性的拮抗剂。本发明还提供了用于检测和定量生物样品中GDF-8的方法。在某些实施方式中，所述方法包括免疫检验，所述样品是血清和/或血浆。本发明还提供了本发明方法中使用的试剂盒。本发明还提供了在治疗(包括改善、预防、诊断、预测)或监测GDF8-相关病症(例如肌肉病症、神经肌肉病症、骨-退行性病症、代谢或诱导的骨病症、肥胖病症、葡萄糖代谢病症、胰岛素-相关病症等等)的方法中使用所公开的特异性GDF8拮抗剂的方法。
因此，在一个方面中，本发明提供了对GDF8的拮抗剂，其中所述拮抗剂包括GDF8结合结构域的肽模拟物至少之一；经分离的核酸，其编码GDF8结合结构域的肽模拟物的氨基酸；对GDF8特异性的抑制多核苷酸；和特异性结合GDF8但是不特异性结合BMP11的抗-GDF8抗体或抗原结合蛋白。
在一个实施方式中，本发明提供了本文所述的拮抗剂，其中所述拮抗剂是GDF8结合结构域的肽模拟物，并且选自基本上由选自以下的氨基酸序列组成的组：SEQ ID NO：4的氨基酸序列、SEQ ID NO：6的氨基酸序列、SEQ ID NO：8的氨基酸序列、SEQ ID NO：10的氨基酸序列和SEQ IDNO：12的氨基酸序列。在一些实施方式中，本发明提供了下述拮抗剂，所述拮抗剂是本文所述的肽模拟物并且被环化。在一些实施方式中，本发明提供了下书拮抗剂，所述拮抗剂是本文所述的肽模拟物，并且通过二硫键被环化。在任意一个或多个实施方式中，本发明提供了下述拮抗剂，所述拮抗剂是本文所述的肽模拟物并且具有至少一个D-氨基酸。在一些实施方式中，本发明提供了下述拮抗剂，所述拮抗剂是可用作免疫原的肽模拟物。
在另一个实施方式中，本发明提供了本文所述的拮抗剂，其中所述拮抗剂是特异性结合GDF8并且不特异性结合BMP11的抗-GDF8抗体、抗原结合蛋白或其片段，其中所述抗体或抗原结合蛋白选自：多克隆抗体；单克隆抗体；单特异性抗体；多特异性抗体(polyspecific antibody)；人源化抗体；四聚体抗体；四价抗体；多样特异性抗体(multispecific antibody)；单链抗体(single chain antibody)；结构域-特异性抗体；单结构域抗体；结构域-缺失的抗体；融合蛋白；ScFc融合蛋白；单-链抗体(single-chainantibody)；嵌合抗体；合成抗体；重组抗体；杂合抗体；经突变的抗体；CDR-移植的抗体；抗体片段，其可包括Fab、F(ab′)2、Fab′片段、Fv片段、单-链Fv(ScFv)片段、Fd片段、dAb片段；抗原结合蛋白，包括双抗体(diabody)、CDR3肽、受约束的(constrained)FR3-CDR3-FR4肽、微体(nanobody)、二价微体、小模块免疫药物(SMIPs)、鲨鱼(shark)可变IgNAR结构域和小体(minibody)。在一些实施方式中，本发明的拮抗剂是单克隆抗体。在一些实施方式中，本发明的拮抗剂是人源化的抗体。
在一些实施方式中，本发明提供了一种拮抗剂，所述拮抗剂是对GDF8特异性的抗体、抗原结合蛋白质或其片段，其由至少一个互补性决定区(CDR)组成，所述互补性决定区包含选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO：19的氨基酸序列、SEQ ID NO：20的氨基酸序列、SEQ ID NO：21的氨基酸序列、SEQ ID NO：22的氨基酸序列、SEQ ID NO：23的氨基酸序列、SEQ ID NO：24的氨基酸序列、SEQ ID NO：25的氨基酸序列、SEQ IDNO：26的氨基酸序列、SEQ ID NO：27的氨基酸序列、SEQ ID NO：28的氨基酸序列、SEQ ID NO：29的氨基酸序列、SEQ ID NO：30的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明的拮抗剂是包含下述重链的抗-GDF8抗体、抗原结合蛋白或其片段，所述重链包含第一、第二和第三CDR，其中所述第一CDR包含选自SEQ ID NO：19的氨基酸序列和SEQ ID NO：15的氨基酸序列的氨基酸；所述第二CDR包含选自SEQ ID NO：20的氨基酸序列和SEQ ID NO：26的氨基酸序列的氨基酸；所述第三CDR包含选自SEQID NO：21的氨基酸序列和SEQ ID NO：27的氨基酸序列的氨基酸。在一些实施方式中，本发明的抗体或抗原结合蛋白包含下述重链，所述重链包含选自SEQ ID NO：14的氨基酸序列和SEQ ID NO：18的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明的拮抗剂是包含下述轻链的抗-GDF8抗体或抗原结合蛋白，所述轻链包含第一、第二和第三CDR，其中所述第一CDR包含选自SEQ ID NO：22的氨基酸序列和SEQ ID NO：28的氨基酸序列的氨基酸；所述第二CDR包含选自SEQ ID NO：23的氨基酸序列和SEQID NO：29的氨基酸序列的氨基酸；所述第三CDR包含选自SEQ ID NO：24的氨基酸序列和SEQ ID NO：30的氨基酸序列的氨基酸。在一些实施方式中，本发明的拮抗剂是包含下述轻链的抗体或抗原结合蛋白，所述轻链包含选自SEQ ID NO：16的氨基酸序列和SEQ ID NO：17的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明的拮抗剂是下述抗-GDF8抗体或抗原结合蛋白，其包含含有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链，还包含含有SEQID NO：14的氨基酸序列的重链。在一些实施方式中，本发明的拮抗剂是下述抗-GDF8抗体或抗原结合蛋白，其包含含有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的轻链，还包含含有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的重链。在一些实施方式中，本发明提供了编码包含本发明GDF8拮抗剂的任意一种或多种氨基酸的多核苷酸，如本文所述。
在一些实施方式中，本发明的拮抗剂是下述抑制性多核苷酸，其特异性结合GDF8并且选自siRNA分子和反义分子。在一些实施方式中，本发明提供了任意一种或多种编码本发明拮抗剂的本文所述多核苷酸。在一些实施方式中，本发明提供了编码下述氨基酸序列的多核苷酸，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO：4的氨基酸序列、SEQ ID NO：6的氨基酸序列、SEQID NO：8的氨基酸序列、SEQ ID NO：10的氨基酸序列和SEQ ID NO：12的氨基酸序列。在另一实施方式中，本发明提供了下述多核苷酸，其中所述经分离的多核苷酸主要由选自以下的核酸序列组成：SEQ ID NO：3的核酸序列、SEQ ID NO：5的核酸序列、SEQ ID NO：7的核酸序列、SEQ IDNO：9的核酸序列、SEQ ID NO：11的核酸序列，及其片段的核酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供了包含任意一种或多种本发明多核苷酸的宿主细胞，其中所述多核苷酸与调控序列可操作地连接。在另一实施方式中，本发明提供了包含本发明任意多核苷酸的载体。在另一实施方式中，本发明提供了包含含有任意一种或多种本发明多核苷酸的载体的宿主细胞。
在一些实施方式中，本发明提供了从本文所述经培养的包含任意一种或多种本发明多核苷酸的宿主细胞中生产GDF8拮抗剂并分离宿主细胞所表达的GDF8拮抗剂的方法。还在另一实施方式中，本发明提供了通过本文所述用于生产GDF8拮抗剂的方法生产的经分离的GDF8拮抗剂。
在本发明的另一方面中，本发明提供了检测来自受试者的样品中GDF8存在的测定法，其包含以下步骤：将(i)样品和(ii)特异性结合GDF8的捕获试剂和(iii)特异性结合GDF8的检测试剂合并，并检测捕获试剂与GDF8之间是否发生特异性结合，其中特异性结合的检测表明样品中存在GDF8。
在本发明的一个实施方式中，样品中的GDF8与样品中存在的GDF8结合蛋白和抗-GDF8解离。在一个实施方式中，本发明的检验还包括在将样品与捕获试剂合并之前将样品与酸性缓冲液合并，如本文所述。在另一实施方式中，本发明检验的酸性缓冲液具有约pH 1.0和pH 6.0之间的pH。在另一实施方式中，酸性缓冲液的pH约为pH 2.5。
在一个实施方式中，本发明提供了任意一种或多种本文所述的检验，其中样品选自血清、全血、血浆、活组织检查样品、组织样品、细胞悬浮液、唾液、口腔流体(oral fluid)、脑脊液、羊水、乳、初乳、乳腺分泌物、淋巴、尿、汗、泪液、胃液、滑液和粘液。在另一实施方式中，本发明提供的样品选自全血、血清或血浆。
在一个实施方式中，本发明提供了任意一种或多种本文所述检验，其中所述检测步骤包含至少一种夹层检验(sandwich assay)和竞争性结合检验。在一些实施方式中，所述检测步骤包含夹层检验。在一些实施方式中，检测步骤包含至少以下之一：检测与样品接触的固体光学表面处折射指数的改变；检测发光的改变；测量颜色的改变；检测放射性的改变；使用biolayer干涉测定法(interferometry)测量；使用悬臂-检测(cantilever-detection)测量；使用无标记的内在成像测量；和使用听觉检测测量。在一些实施方式中，本发明的检测步骤测量颜色的改变。在一些实施方式中，检测步骤包括选自以下的检验：酶联免疫吸附检验(ELISA)；电-化学发光检验(ECL)；放射免疫检验(RIA)；固-相放射免疫检验(SPRIA)；免疫印迹；免疫沉淀；荧光活化的细胞分选(FACS)。在另一实施方式中，检测步骤包括ELISA。
在一个实施方式中，通过化合物与特异性结合GDF8的检测试剂的特异性结合检测GDF8的存在，其中所述化合物还包含可检测的标记。在另一实施方式中，可检测的标记包括至少一种选自以下的标记：酶标记；发光标记；蛋白质标记；维生素标记；发色标记；放射性同位素标记和电子致密分子(electron dense molecule)标记。在另一实施方式中，可检测的标记是蛋白质，并且还包括生物素。
在一个实施方式中，本发明的检验提供了选自以下的捕获试剂：抗-GDF8抗体、抗原结合蛋白或其片段；GDF8结合蛋白；和GDF8结合结构域。在另一实施方式中，本发明的检验提供的捕获剂是抗-GDF8抗体、抗原结合蛋白或其片段，并且选自RK35、RK22、MYO-028、MYO-029和JA16。在一些实施方式中，捕获试剂是RK35。在一些实施方式中，捕获试剂是RK22。
在本发明检验的一个实施方式中，提供的检测试剂选自：抗-GDF8抗体、抗原结合蛋白或其片段；GDF8结合蛋白和GDF8结合结构域。在一个实施方式中，检测试剂是抗-GDF8抗体、抗原结合蛋白或其片段，并且选自RK22和RK35。在另一实施方式中，本发明的检验提供的检测试剂是RK35。在另一实施方式中，本发明的检验提供的检测试剂是RK22。
在一个实施方式中，本发明提供了下述检验，其中捕获试剂是RK22，并且检测试剂是RK35。在另一实施方式中，本发明提供了下述检验，其中捕获试剂是RK35并且检测试剂是RK22。
在本发明的另一方面中，本发明提供了定量来自受试者的样品中GDF8存在的检验，所述检验包括以下步骤：将(i)样品和(ii)特异性结合GDF8的捕获试剂和(iii)特异性结合GDF8的检测试剂合并，检测捕获试剂与GDF8之间是否发生特异性结合并定量样品中的GDF8水平，其中特异性结合的检测表明样品中存在GDF8，并且可以被定量。在本发明的一个实施方式中，样品中的GDF8与样品中存在的GDF8结合蛋白和抗-GDF8解离。在一个实施方式中，本发明的检验还包括在将样品与捕获试剂合并之前将样品与酸性缓冲液合并，如本文所述。在另一实施方式中，本发明检验的酸性缓冲液具有约pH 1.0和pH 6.0之间的pH。在另一实施方式中，酸性缓冲液的pH约为pH 2.5。
在本发明的另一方面中，本发明提供了用于在受试者中治疗(包括改善和/或预防)GDF8-相关病症的药物组合物，其包含可药用载剂和至少一种GDF8拮抗剂，所述GDF8拮抗剂选自：GDF8结合结构域的肽模拟物；经分离的核酸，其编码GDF8结合结构域肽模拟物的氨基酸；GDF8特异性的抑制性多核苷酸；和特异性结合GDF8但是不特异性结合BMP11的抗-GDF8抗体、抗原结合蛋白或其片段。
在一个实施方式中，本发明的药物组合物包含对GDF8特异性的结合结构域的肽模拟物，其基本上由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ IDNO：4的氨基酸序列、SEQ ID NO：6的氨基酸序列、SEQ ID NO：8的氨基酸序列、SEQ ID NO：10的氨基酸序列和SEQ ID NO：12的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本发明的药物组合物包含经分离的核酸，其编码对GDF8特异性的氨基酸，所述核酸基本上由选自以下的核酸序列组成：SEQ ID NO：3的核酸序列、SEQ ID NO：5的核酸序列、SEQ ID NO：7的核酸序列、SEQ ID NO：9的核酸序列、SEQ ID NO：11的核酸序列及其片段的核酸序列。
在一个实施方式中，本发明的药物组合物包含特异性结合GDF8但是不特异性结合BMP11的抗-GDF8抗体、抗原结合蛋白或其片段，其包含含有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链，并且其中所述抗体还包含含有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的重链。在另一实施方式中，本发明的药物组合物提供了特异性结合GDF8但是不特异性结合BMP11的抗-GDF8抗体、抗原结合蛋白或其片段，其包含含有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的轻链，并且其中所述抗体、抗原结合蛋白或其片段还包含含有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的重链。
在一个实施方式中，本发明的药物组合物包含下述抗-GDF8抗体、抗原结合蛋白或其片段，其特异性结合GDF8但是不结合BMP11并且包含至少一个下述互补性决定区(CDR)，所述CDR包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：19的氨基酸序列、SEQ ID NO：20的氨基酸序列、SEQID NO：21的氨基酸序列、SEQ ID NO：22的氨基酸序列、SEQ ID NO：23的氨基酸序列、SEQ ID NO：24的氨基酸序列、SEQ ID NO：25的氨基酸序列、SEQ ID NO：26的氨基酸序列、SEQ ID NO：27的氨基酸序列、SEQ IDNO：28的氨基酸序列、SEQ ID NO：29的氨基酸序列、SEQ ID NO：30的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本发明的药物组合物被用于在哺乳动物患者中治疗选自以下的GDF8相关病症：肌肉病症、神经肌肉病症、骨-退行性病症、代谢或诱导的骨病症、肥胖病症、葡萄糖代谢病症和胰岛素相关病症。在本发明的药物组合物的另一实施方式中，其中GDF8相关病症选自：肌营养不良、ALS、肌肉萎缩、器官萎缩、腕管综合征、虚弱、充血性阻塞性肺病、老年性肌肉萎缩、恶病质、肌肉消耗综合征、肥胖症、2型糖尿病、糖耐量减低、代谢综合征、胰岛素抗性、营养病症、过早的性腺衰竭、雄性激素阻抑、继发性甲状旁腺功能亢进、骨质疏松、骨质减少、骨关节炎、骨量过低(low bone mass)、维生素D缺乏和神经性厌食症。
本发明的另一方面提供了在哺乳动物患者中治疗(包括改善和/或预防)GDF8-相关病症的方法，所述方法包括对患者施用治疗有效量的几乎无毒到无毒的GDF8特异性拮抗剂。在另一实施方式中，本发明的方法提供的本发明的拮抗剂选自：GDF8结合结构域的肽模拟物；经分离的核酸，其编码GDF8结合结构域的肽模拟物的氨基酸；GDF8特异性的抑制性多肽；和特异性结合GDF8但不特异性结合BMP11的抗-GDF8抗体、抗原结合蛋白或其片段。
在一个实施方式中，本发明提供的本发明的拮抗剂是GDF8结合结构域的肽模拟物，并且所述GDF8结合结构域基本上由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID NO：4的氨基酸序列、SEQ ID NO：6的氨基酸序列、SEQID NO：8的氨基酸序列、SEQ ID NO：10的氨基酸序列，和SEQ ID NO：12的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本发明的治疗方法提供了下述治疗方法，其中本发明的拮抗剂是编码GDF8特异性氨基酸的经分离的核酸，其基本上由选自以下的核酸序列组成：SEQ ID NO：3的核酸序列、SEQ ID NO：5的核酸序列、SEQ ID NO：7的核酸序列、SEQ ID NO：9的核酸序列、SEQ IDNO：11的核酸序列，及其片段的核酸序列。
在一个实施方式中，本发明提供了下述治疗方法，其中本发明的拮抗剂是抗-GDF8抗体、抗原结合蛋白或其片段，其特异性结合GDF8但不特异性结合BMP11，并且包含含有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链，还包含含有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的重链。在一些实施方式中，本发明的治疗方法提供的本发明的拮抗剂是抗-GDF8抗体、抗原结合蛋白或其片段，其特异性结合GDF8但不特异性结合BMP11，并且包含含有SEQID NO：18的氨基酸序列的轻链，其中所述抗体、抗原结合蛋白或其片段还包含含有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的重链。在一些实施方式中，本发明的治疗方法提供的本发明的拮抗剂是抗-GDF8抗体、抗原结合蛋白或其片段，其特异性结合GDF8但是不结合BMP11并且包含至少一个下述互补性决定区(CDR)，所述CDR包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：19的氨基酸序列、SEQ ID NO：20的氨基酸序列、SEQ ID NO：21的氨基酸序列、SEQ ID NO：22的氨基酸序列、SEQ ID NO：23的氨基酸序列、SEQ IDNO：24的氨基酸序列、SEQ ID NO：25的氨基酸序列、SEQ ID NO：26的氨基酸序列、SEQ ID NO：27的氨基酸序列、SEQ ID NO：28的氨基酸序列、SEQ ID NO：29的氨基酸序列、SEQ ID NO：30的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方式中，本发明的治疗方法提供的GDF8-相关病症选自受试者中的肌肉病症、神经肌肉病症、骨-退行性病症、代谢或诱导的骨病症、肥胖病症、葡萄糖代谢病症和胰岛素相关病症。在本发明的一些实施方式中，本发明的治疗方法提供的GDF8-相关病症选自：肌营养不良、ALS、肌肉萎缩、器官萎缩、腕管综合征、虚弱、充血性阻塞性肺病、老年性肌肉萎缩、恶病质、肌肉消耗综合征、肥胖症、2型糖尿病、糖耐量减低、代谢综合征、胰岛素抗性、营养病症、过早的性腺衰竭、雄性激素阻抑、继发性甲状旁腺功能亢进、骨质疏松、骨质减少、骨关节炎、骨量过低、维生素D缺乏和神经性厌食症。
本发明的另一方面提供了诊断、预测或检测受试者是否遭受GDF8-相关病症的方法，所述方法包括步骤：从受试者获得第一样品；将第一样品与本发明的拮抗剂合并；检测第一样品中GDF8的存在；定量第一样品中的GDF8水平；从未遭受GDF8-相关病症的受试者获得第二样品；将第二样品与拮抗剂合并；检测第二样品中的GDF8水平；定量第二样品中的GDF8水平并且比较第一和第二样品中的GDF8水平；其中与第一样品相比，第二样品中GDF8水平的提高、降低或类似表明GDF8-相关病症的严重性是否改变。
本发明的另一方面提供了监测GDF8-相关病症严重性的方法，所述方法包括步骤：(i)从受试者获得第一样品；(ii)将第一样品与权利要求1-16中任一项的拮抗剂合并；(iii)检测第一样品中GDF8的存在；(iv)定量第一样品中的GDF8水平；(v)从未遭受GDF8-相关病症的受试者中获得第二样品；(vi)将第二样品与拮抗剂合并；(vii)检测第二样品中的GDF8水平；(viii)定量第二样品中的GDF9水平；和(ix)比较第一和第二样品中的GDF8水平；其中与第二样品相比，第一样品中GDF8水平的提高、降低或类似表明GDF8-相关病症的严重性是否改变。
本发明的另一方面提供了预测受试者会发生GDF8-相关病症的可能性的方法，所述方法包括步骤：(i)从受试者获得第一样品；(ii)将第一样品与权利要求1-16中任一项的拮抗剂合并；(iii)检测第一样品中GDF8的存在；(iv)定量第一样品中的GDF8水平；(v)从未遭受GDF8-相关病症的受试者中获得第二样品；(vi)将第二样品与拮抗剂合并；(vii)检测第二样品中的GDF8水平；(viii)定量第二样品中的GDF9水平；和(ix)比较第一和第二样品中的GDF8水平；其中与第一样品相比，第二样品中GDF8水平的提高、降低或类似表明受试者会发生GDF8-相关病症的可能性。
本发明的另一方面提供了预测受试者会发生GDF8-相关病症的可能性的方法，所述方法包括步骤：(i)从受试者获得第一样品；(ii)将第一样品与权利要求1-16中任一项的拮抗剂合并；(iii)检测第一样品中GDF8的存在；(iv)定量第一样品中的GDF8水平；(v)从未遭受GDF8-相关病症的受试者中获得第二样品；(vi)将第二样品与拮抗剂合并；(vii)检测第二样品中的GDF8水平；(viii)定量第二样品中的GDF9水平；和(ix)比较第一和第二样品中的GDF8水平；其中与第二样品相比，第一样品中GDF8水平的提高、降低或类似表明受试者会发生GDF8-相关病症的可能性。
本发明的另一方面提供了药物组合物在制备用于在哺乳动物患者中治疗(包括改善和/或预防)GDF8-相关病症的药物中的用途，其中所述药物组合物包含可药用载剂和至少一种选自以下的GDF8拮抗剂：GDF8结合结构域的肽模拟物；经分离的核酸，其编码GDF8结合结构域肽模拟物的氨基酸；GDF8特异性的抑制性多核苷酸；和特异性结合GDF8但是不特异性结合BMP11的抗-GDF8抗体、抗原结合蛋白或其片段。
本发明的另一方面提供了用于在来自受试者的样品中检测GDF8存在的试剂盒，所述试剂盒包含特异性结合GDF8的捕获试剂和特异性结合GDF8的检测试剂，其中GDF8对捕获和检测试剂的特异性结合的检测表明样品中存在GDF8。在一些实施方式中，本发明的试剂盒还包含酸性缓冲液。
本发明的另一方面提供了用于定量来自受试者的样品中GDF8的试剂盒，所述试剂盒包含特异性结合GDF8的捕获试剂和特异性结合GDF8的检测试剂，其中GDF8对捕获和检测试剂的特异性结合的检测允许定量样品中的GDF8。在一些实施方式中，本发明的试剂盒还包含酸性缓冲液。
在另一方面中，本发明提供了本文所述的抗体，其中所述抗体是特异性结合GDF8但是不特异性结合BMP11的抗-GDF8抗体、抗原结合蛋白或其片段，其中所述抗体或抗原结合蛋白选自：多克隆抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体、人源化抗体、四聚体抗体、四价抗体、多样特异性抗体、单链抗体、结构域-特异性抗体、单结构域抗体、结构域-缺失的抗体、融合蛋白、ScFc融合蛋白、单-链抗体、嵌合抗体、合成抗体、重组抗体、杂合抗体、经突变的抗体、CDR-移植的抗体，抗体片段，所述抗体片段可包括Fab、F(ab′)2、Fab′片段、Fv片段、单-链Fv(ScFv)片段、Fd片段和dAb片段，抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白可包括双抗体、CDR3肽、受约束的FR3-CDR3-FR4肽、微体、二价微体、小模块免疫药物(SMIPs)、鲨鱼可变IgNAR结构域和小体。在一些实施方式中，本发明的拮抗剂是单克隆抗体。在一些实施方式中，本发明的拮抗剂是人源化抗体。在一些实施方式中，抗体是抗-GDF8抗体。在一些实施方式中，本发明的抗体是下述抗-GDF8抗体或抗原结合蛋白，其包含含有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链，还包含含有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的重链。在一些实施方式中，本发明的抗体是下述抗-GDF8抗体或抗原结合蛋白，其包含含有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的轻链，还包含含有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的重链。
序列简述
DNA和氨基酸序列公开于序列表中，并列举在表1中。
表1
  SEQ ID NO  说明
  1  氨基酸序列 成熟人GDF8
  2  氨基酸序列 人GDF8前体
  3  DNA序列 肽模拟物(GE1)
  4  氨基酸序列 肽模拟物(GE1)
  5  DNA序列 肽模拟物(GE2)
  6  氨基酸序列 肽模拟物(GE2)
  7  DNA序列 肽模拟物(GE3)
  8  氨基酸序列 肽模拟物(GE3)
  9  DNA序列 肽模拟物(GE4)
  10  氨基酸序列 肽模拟物(GE4)
  11  DNA序列 肽模拟物(GE5)
  12  氨基酸序列 肽模拟物(GE5)
  13  DNA序列RK22 VH小鼠
  14  氨基酸序列RK22 VH小鼠
  15  DNA序列RK22 VL小鼠
  16  氨基酸序列RK22 VL小鼠
  17  氨基酸序列RK22 VL人源化的
  18  氨基酸序列RK22 VH人源化的
  19  氨基酸序列CDR H1(Kabat)
  20  氨基酸序列CDR H2(Kabat)
  21  氨基酸序列CDR H3(Kabat)
  22  氨基酸序列CDR L1(Kabat)
  23  氨基酸序列CDR L2(Kabat)
  24  氨基酸序列CDR L3(Kabat)
  25  氨基酸序列CDR H1(AbM)
  26  氨基酸序列CDR H2(AbM)
  27  氨基酸序列CDR H3(AbM)
  28  氨基酸序列CDR L1(AbM)
  29  氨基酸序列CDR L2(AbM)
  30  氨基酸序列CDR L3(AbM)
  31  DNA序列RK35VH
  32  DNA序列RK35VL
  33  DNA序列MYO-029VH
  34  DNA序列MYO-029VL
  35  DNA序列ActRIIB
  36  氨基酸序列ActRIIB
附图简述
图1A和1B展示了来自表达RK11和RK35(结合GDF8和BMP11二者的对照抗体)的杂交瘤的多种浓度(ng/ml；x-轴)的上清液与GDF8或BMP11的结合(O.D..450nm；y-轴)。
图2展示了通过BIAcore 2000系统Sensor Chip SA测定的RK22抗体和GDF8之间相互作用的动力学速率常数(kinetic rate constant)。
图3展示了在不存在(10mg/ml)或存在多种浓度(M Ig；x-轴)的RK22和RK35抗体和结合GDF8和/或BMP11任一的其它RK抗体(A到E)时，用10ng/ml GDF8处理的A204横纹肌肉瘤细胞中，通过萤光素酶活性(LCPS；y-轴)测量的pGL3(CAGA)12-TGF-β启动子报告基因的诱导。
图4展示了在不存在(运载体)或存在1、10或40mg/kg/周RK22或Myo-29时，用运载体处理四周后从SCID小鼠上切下的腓肠肌(Gastroc)、四头肌(Quad)和胫骨前肌(Tibialis anterior)的肌肉重量(g；y-轴)。
图5展示了单独的GDF或用多种浓度([M]；x-周)的RK22、分特异性抗体、其它RK抗体(D和E)、阻断GDF8对ActRIIB结合的对照抗体(RK35)、对照IgG抗体预孵育的GDF8或可溶的ActRIIB对ActRIIB的结合(OD450；y-轴)。
图6展示了与48个个体和重叠的13-残基肽孵育的20ng/ml对照抗体、RK22的表位作图点图的结果，所述13-残基肽代表了整个成熟的GDF8肽。每个点图下是GDF8到序列，针对所述抗体的GDF8表位加有下划线(如各自点图中所标明)。
图7展示了RK22可变重链结构域(RK22_VH)与DP-7的人种系框架序列(DP-7_germl_VH)和DP-5的人种系框架序列(DP-5_germl_VH)的比对；在人源化RK22可变重链结构域中被改变的鼠RK22可变重链结构域的氨基酸用星号标注，RK22的CDR加框并且加有下划线。
图8展示了RK22可变轻链结构域与DPK 24VL的人种系框架序列的比对；在人源化RK22可变轻链结构域中被改变的鼠RK22可变轻链结构域的氨基酸用星号标注，RK22的CDR加框并且加有下划线。
图9A展示了免疫检验模式的比较：RK35是捕获试剂，经生物素化的RK22是检测试剂。图9B展示的RK22是捕获抗体，经生物素化的RK35是检测抗体。
图10展示了先前所述的ELISA检验显示背景，并且所述背景可能是人抗-小鼠抗体(HAMA)作用。检验背景归因于血清与ELISA检验中用作捕获抗体的单克隆抗体RK22的交叉反应性。使用RK35作为捕获抗体时观察到相同的作用(数据未显示)。
图11展示了GDF-8ELISA的结果，其中在平板上涂覆RK35抗体，并且使用可商业获得的试剂IIR(免疫球蛋白抑制试剂-Bioreclamation，NY)降低ELISA的背景。使用IIR的结果与仅使用缓冲液的背景有利地比较。
图12展示了存在MYO-029时抗体RK35不结合GDF-8。将MYO-029抗体涂覆在HBX检验平板上，并添加1200pg/ml的GDF-8和递增浓度的经生物素化的检测抗体(RK22或RK35)。使用经生物素化的RK35没有产生信号。结果表明RK35和MYO-029之间与GDF-8结合的交叉反应性。
图13A和13B展示了MYO-029可在ELISA检验中用作GDF-8的抑制剂。通过ELISA针对GDF-8测定与恒定浓度的GDF-8(250pg/ml)一起掺入检验缓冲液或10％人血清中的递增浓度的MYO-029。图13A展示使用RK22作为捕获抗体时，存在约30％的信号抑制。图13B展示使用RK35作为捕获抗体时抑制接近100％(从5到20μg/ml的MYO-029)。还展示了使用2IR(也已知为“IIR”)对背景信号(血清)的降低。两幅图中均展示了总信号，并且未转化为抑制百分比。
图14A和14B展示了来自“掺入回收实验”的结果，其中向三个独立的血清样品(血清#1、#2和#3)中的100％血清中添加GDF-8。每个样品通过+/-20μg/ml MYO-029分析。在测试的所有浓度的GDF-8下，20μg/ml MYO-029的添加阻断检验信号(图13A)。图13B展示了来自掺入-回收检验的结果，其中添加血清但不添加MYO-029。结果展示信号随GDF-8添加而线性提高。
图15展示了在正常小鼠、敲除(KO)小鼠和人血清中产生的标准曲线的比较。单独使用THST缓冲液的曲线斜率比在血清中产生的陡得多，并且不能被用于定量血清中的数值。
图16展示了在THST缓冲液中产生的观察到的GDF8数值与预期数值相比。
图17展示了来自实验的结果，其中展示加热至约80℃时MYO-029可失活/与GDF-8解离。对血清样品掺入GDF-8或潜伏GDF-8+/-5μg/mlMYO-029并加热至80℃。结果显示加热MYO-029样品恢复了检测GDF-8的能力，表明MYO-029与GDF-8解离，并且在加热至80℃时被活化。结果还显示向经加热的样品中添加回MYO-029时，GDF-8信号再次被降低。还展示了与成熟的GDF-8样品相比，在掺入潜伏GDF-8的样品中加热后内源GDF-8信号的提高甚至更加显著。
图18展示了从人血清中清除GDF-8之前和之后，GDF-8的ELISA检验的结果。在室温(“RT”)下和加热至80℃后，针对GDF-8分析正常的人血清+/-20μg/ml MYO-029。将这些数值与下述相同样品比较，所述样品通过首先预-加热至65℃ 10分钟然后在1mg MYO-029亲和柱上经过三次来去除GDF-8。结果表明在该ELISA中，从人血清中清除GDF-8有效降低GDF-8的背景水平。结果还显示加热经清除的血清不显示用加热后的正常血清所观察到的信号的最初提高。该经加热的/经GDF-8清除(H/D)的血清可用于产生GDF-8标准曲线。
图19展示了在经加热、GDF-8清除然后掺入递增浓度的成熟GDF-8或潜伏GDF-8的血清中产生的标准曲线图。标准曲线在室温(RT)下或加热至80℃时测量。掺入潜伏GDF-8的血清样品在加热后显示大幅信号提高，这在掺入成熟GDF-8的样品中未观察到。
图20展示了在连续两天在不同平板上运行的两条标准曲线的分析。使用具有已知浓度成熟GDF-8的经加热的/GDF-8清除的血清产生标准曲线。相对于成熟GDF-8浓度绘制来自每一曲线的OD值。对在经加热的/GDF-8清除的血清中产生的GDF-8值而言，非线性回归曲线拟合是更加准确的相关性。曲线拟合比线性回归曲线具有更好的相关性系数，并且具有更大的准确性范围。使用来自Prism Graph的软件，从GDF-8 ELISA检验中产生的OD值计算GDF-8浓度。
图21展示了测量九个正常血清样品中游离GDF-8和总GDF-8的检验结果。结果被展示为+/-MYO-029。数值作为以pg/ml计的GDF-8给出，并对应于100％血清中GDF-8的内源水平。
图22展示了测量八个正常血清样品中游离GDF-8和总GDF-8的检验结果。该图代表了在独立的两天进行的两个单独的实验。在第二天的实验时，通过将样品加热10分钟(与在第一天实验时进行的5分钟加热相比)分析总GDF-8。游离GDF-8的数值范围是227到1241pg/ml，总GDF-8的数值范围是514到4329pg/ml。
图23展示了在热变形后通过ELISA测量GDF-8的检验结果。将人血清的小份试样在室温下与+/-10μg/ml的MYO-029孵育1小时。接着在进行ELISA分析之前，将样品在梯度热循环仪中在多种温度下加热变性。通过从标准曲线的检验结果中内插进行测试样品中GDF-8水平的定量，所述标准曲线由掺入合并的人血清中已知浓度的经纯化的重组GDF-8二聚体的稀释系列组成，所述人血清通过亲和色谱清除了GDF-8。不存在MYO-029时最大的GDF-8检测发生在约60℃。MYP-29的存在掩蔽了低温下血清中GDF-8的检测，但是在大于65℃的温度下，GDF-8检测部分恢复。
图24A和24B展示了在存在MYO-029时在低pH下可以检测GDF-8。在图24A中，将稀释于THST缓冲液+/-10μg/ml MYO-029中的GDF-8二聚体五倍稀释进中性pH的检验缓冲液(THST)、pH 5.0的200mM乙酸钠(NaOAc)、pH 3或7的200mM磷酸-柠檬酸缓冲液(PO4Cit)、或pH 2.5的200mM甘氨酸-HCl(Gly)中。然后将样品1∶1稀释进涂覆了THST缓冲液或未经缓冲的Tris的ELISA孔(用RK35抗体涂覆)中。用具有不同pH和缓冲能力的溶液稀释GDF-8并随后稀释进THST或未经缓冲的Tris中允许在从约3到8的pH范围下测量分析物捕获步骤的效率。在达到中性pH的检验条件下，MYO-029降低GDF-8检测(THST/THST)。用甘氨酸-HCl酸化并随后稀释进THST缓冲液中的GDF-8保持足够低的pH来防止MYO-029结合并允许在存在或不存在MYO-029时(Gly/THST)完全检测GDF-8。然而，将经甘氨酸酸化的GDF-8稀释进未经缓冲的Tris中导致在大于7的pH下的分析物捕获条件，摒弃降低了存在MYO-029(Gly/未经缓冲的Tris)时GDF-8的检测。图24B展示了在pH 3(左图)和pH 7(右图)下ELISA检验的流程图。
图25提供了下述实验的结果，所述实验展示了鼠抗体RK35在酸性条件下结合GDF-8，而MYO-029则不。将人血清+/-多种浓度的RK35或MYO-029预孵育，并用THST缓冲液(中性pH)或甘氨酸-HCl(酸性pH)稀释五倍。然后将血清添加至含有与平板结合的RK35和THST或甘氨酸-HCl缓冲液二者之任一的ELISA孔中。在不存在RK35或MYO-029时，由于复合物解离和游离GDF-8蛋白质的释放，与中性条件下相比，在酸性条件下检测到更多的内源GDF-8(见最初两条柱)。最后六条柱代表了在酸性pH下获得的数据。溶液中递增的RK35量能够结合并与平板结合的RK35竞争结合GDF-8，导致在酸性条件下降低的GDF-8检测。MYO-029不能在达到pH3的溶液中结合GDF-8，使得溶液中的GDF-8能够与ELISA平板上涂覆的RK35抗体结合。
图26展示了将MYO-029浓度提高至100μg/ml未减小使用酸性解离ELISA方案时的GDF-8检测。在加热或酸解离后测定人血清+/-10、40或100μg/ml MYO-029。通过从标准曲线中内插估计GDF-8的浓度，所述标准曲线是插入已清除GDF-8的合并的人血清中的重组GDF-8成熟二聚体的标准曲线。在不存在MYO-029时，在接近中性pH(HS)下进行分析物捕获时，血清中GDF-8的浓度被测定为～1ng/ml。在存在MYO-029(HS+Myo，63℃；无Ab)时，通过热解离释放血清结合蛋白后GDF-8的检测为～3ng/ml。在存在MYO-029时，甚至在测试的最低浓度下，热解离不能允许与不存在MYO-029(HS+MYO，73℃)时相同的检测水平。血清样品的酸处理检测出非常相似的GDF-8量，与存在的MYO-029量无关(HS+MYO，酸)。
图27展示了分析物捕获不降低检验特异性时的酸性条件。血清的酸化在所有测试的野生型(WT)动物、短尾猴(NHP-31)、小鼠(WT Mm)和奶牛(WT牛)中均导致更大的信号检测(白色柱vs.黑色柱)。在中性或酸性pH下从经遗传改造的GDF-8敲除(KO Mm)小鼠或天然存在的GDF-8KOBelgian Blue牛(KO牛)中测量的血清不能产生高于平板背景的信号。
图28A-C在针对校准标准反算(back-calculated)的浓度的相对误差方面，对比了五个GDF-8ELISA平板的三种不同的校准曲线拟合方法。绘制了来自五个GDF-8ELISA平板的结果。相对误差被定义为(B-N)/Nx100，其中B是使用校准曲线针对标准反算的浓度，N是标准的正常浓度。三种曲线拟合方法是：1)图36A-通过最小二乘法(least squares，LS)对光密度的4-参数对数模型；2)图36B-通过LS对光密度平方根的4-参数对数模型；和3)图36C-5-通过LS对光密度的平方根的5-参数对数模型。参照线为-20和20。
图29A.正常和肌抑制素-无效动物中的血清肌抑制素水平。在解离的、酸性条件(pH2.5)下测量来自Belgian Blue牛、正常牛(wt牛)、肌抑制素无效小鼠(mstn KO小鼠)和野生型同窝仔(wt小鼠)的血清，并从肌抑制素-缺乏的血清基质中重组人肌抑制素的标准曲线外推数值。柱代表重复样品(n＝3)中的均值+/-SD。肌抑制素-无效动物中的肌抑制素浓度低于最低校准样品的浓度(147pg/mL)。
图29B和29C.在非解离(pH 8.0，图B)或解离(pH 2.5，图C)条件下，添加递增浓度的抗-肌抑制素抗体MYO-029或可溶肌抑制素受体ActRIIB-Fc后，在肌抑制素ELISA中测量的短尾猴血清中的肌抑制素水平。柱代表重复样品(n＝3)的均值+/-SD。虚线表示LLQ。
图30A.年轻和年老男性中血清肌抑制素水平的盒须图(Box andwhisker plot)(均值、SD、中位数和第一和第三个四分位数)。盒中的水平线代表均值，盒的上界和下界代表第一和第三四分位数，竖直棒代表SD。*，P＝0.03。图30B.显示年轻男性中基线肌抑制素水平与无脂肪体重相关性的回归图。图30C.显示年老男性中基线肌抑制素水平与无脂肪体重相关性的回归图。
图31.年轻男性中应答分级剂量的睾酮施用的肌抑制素水平的改变(柱状图显示基线、低56天和140天的均值+/-SEM水平)。图31A展示了基线、处理第56天和140天年轻(左图)和年老(右图)男性中的肌抑制素水平。数据为均值+/-SEM。*，与基线水平相比的P值。低140天的肌抑制素水平不与基线水平显著不同。图31B展示了在年轻和年老男性中血清肌抑制素水平的基线相对于第56天基线的改变百分比。*，P＝0.03。
图32.回归图，其展示年轻和年老男性中从基线到第56天的肌抑制素水平改变和总睾酮与游离睾酮浓度和无脂肪体重的改变。图32A展示了年轻男性中从基线到第56天肌抑制素水平的改变百分比和血清总睾酮浓度改变百分比的线性回归图。图32B展示了年老男性中从基线到第56天肌抑制素水平的改变百分比和血清总睾酮浓度改变百分比的线性回归图。图32C展示了年轻男性中从基线到第56天肌抑制素水平的改变百分比和血清游离睾酮浓度改变百分比的线性回归图。图32D展示了年老男性中从基线到第56天肌抑制素水平的改变百分比和血清游离睾酮浓度改变百分比的线性回归图。图32E展示了年轻男性中从基线到第56天肌抑制素水平的改变百分比和从基线到第140天无脂肪体重改变百分比的线性回归图。图32F展示了年老男性中从基线到第56天肌抑制素水平的改变百分比和从基线到第140天血清无脂肪体重改变百分比的线性回归图。
图33.年轻行经、手术绝经和年老的女性中肌抑制素水平的盒须图(均值、SD、中位数和第一和第三个四分位数)。盒中的水平线代表均值，盒的上界和下界代表第一和第三个四分位数，竖直棒代表SD。三组中的肌抑制素水平不是统计学显著的。
发明详述
定义
在说明书和附带的权利要求书中使用时，除非上下文另有明确说明，单数形式“一个”(″a″、″an″)和“这个”(″the″)包括复数。
本文使用术语“抗体”是指免疫球蛋白或其片段，并且包括但不限于：多克隆抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体、人源化抗体、四聚体抗体、四价抗体、多样特异性抗体、单链抗体、结构域-特异性抗体、单结构域抗体、结构域-缺失的抗体、融合蛋白、ScFc融合蛋白、单-链抗体、嵌合抗体、合成抗体、重组抗体、杂合抗体、经突变的抗体、CDR-移植的抗体和抗体片段，所述抗体片段包括：Fab、F(ab′)2、Fab′片段、Fv片段、单-链Fv(ScFv)片段、Fd片段和dAb片段，或任何经化学或遗传操作的保持抗原-结合功能的前述抗体的副本。
本发明还提供了与本文所述抗体不同的抗原结合蛋白，其包括双抗体、CDR3肽、受约束的FR3-CDR3-FR4肽、微体(美国专利申请2008/0107601)、二价微体、小模块免疫药物(SMIPs)、鲨鱼可变IgNAR结构域(WO 03/014161)、小体，和任何经化学或遗传操作的保持抗原-结合功能的副本。典型地，这类片段应包含抗原-结合结构域。本领域技术人员应当明白，任何这类分子，例如“人源化”抗体或抗原结合蛋白可以被改造(例如“种系化(germlined)”)以降低其免疫原性，提高其亲和力，改变其特异性或为了其它目的。
本发明的抗体可以通过例如传统的杂交瘤技术(Kohler等，Nature256：495-499(1975))、重组DNA方法(美国专利No.4,816,567)或使用抗体文库的噬菌体展示技术(Clackson等，Nature 352：624-628(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1991))来制造。对于多种其它抗体生产技术，参阅Antibodies：A Laboratory Manual，eds.Harlow等，Cold SpringHarbor Laboratory，1988。术语“抗原”是指化合物、组合物或免疫原性物质，其能够在动物中刺激抗体的生产或T-细胞应答或二者兼有，其包括被注射或吸收进动物中的组合物。免疫应答可以针对整个分子产生，或者针对分子的部分(例如表位或半抗原)产生。该术语可被用于表示个体大分子或同质或异质的抗原性大分子群。抗原与具有特定体液和/或细胞免疫力的产物反应。术语“抗原”广义地包括下述部件，包括蛋白质、多肽、抗原性蛋白质片段、核酸、寡糖、多糖、有机或无机化学品或组合物等等。术语“抗原”包括所有相关的抗原性表位。给定抗原的表位可以使用本领域公知的任何数量的表位作图技术鉴定。参阅例如Epitope MappingProtocols in Methods in Molecular Biology，Vol.66(Glenn E.Morris，Ed.，1996)Humana Press，Totowa，N.J。例如，可以如下测定线性表位：例如在固体支持物上同时合成大量肽，并使所述肽与抗体反应同时所述肽仍然与支持物结合，其中所述肽对应于蛋白质分子的部分。这类技术是本领域已知的，并且描述于例如美国专利No.4,708,871；Geysen等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3998-4002；Geysen等(1986)Molec.Immunol.23：709-715中，所述文献均通过引用整体并入本文。类似地，通过检测氨基酸的空间构来容易地鉴定构象表位，例如通过x-射线晶体学和2-维核磁共振来鉴定。参阅例如Epitope Mapping Protocols，上文。另外，就本发明的目的而言，“抗原”还包括对天然序列的修饰，例如缺失、添加和替换(通常天然是保守的，但是它们可以是非保守的)，使得蛋白质维持引发免疫应答的能力。这些修饰可以是故意的，如通过定向诱变或通过具体的合成步骤或通过遗传工程途径，也可以是偶然的，例如通过产生抗原的宿主的突变。另外，抗原可以衍生自或得自任何病毒、细菌、寄生虫、原生动物或真菌，并且可以是整个生物。类似地，例如在核酸免疫应用中表达抗原的寡核苷酸或多核苷酸也包括在该定义中。合成的抗原也包括在内，例如多肽、侧翼表位和其它重组或合成衍生的抗原(Bergmann等(1993)Eur.J.Immunol.23：2777 2781；Bergmann等(1996)J.Immunol.157：3242 3249；Suhrbier，A.(1997)Immunol.and Cell Biol.75：402 408；Gardner等(1998)12th World AIDS Conference，Geneva，Switzerland，Jun.28 Jul.3，1998)。
术语“抗原-结合结构域”、“抗体的活性片段”或抗原结合蛋白等等表示抗体或抗原结合蛋白分子的部分，所述部分包含特异性结合抗原部分或全部或与之互补的区域。当抗原较大时，抗体可仅结合所述抗原的具体部分。“表位”、“表位的活性片段”或“抗原决定簇”等等是负责与抗体的抗原-结合结构域的特异性相互作用的抗原分子的部分。抗原-结合结构域可由一个或多个抗体可变区提供(例如由VH结构域组成的所谓的Fd抗体片段)。抗原-结合结构域可包含抗体轻链可变结构域(VL)和抗体重链可变结构域(VH)(美国专利No.5,565,332)。
“样品”是从细胞、组织、器官或生物中收集的用于例如检测分析物的生物材料。示范性的生物样品包括血清、血、血浆、活组织检查样品、组织样品、细胞悬浮液、唾液、口腔流体、脑脊液、羊水、乳、初乳、乳腺分泌物、淋巴、尿、汗、泪液、胃液、滑液、粘液和其它临床样本和样品。
术语“捕获试剂”是指能够结合生物样品中要检测的目标分子或分析物的试剂，例如抗体或抗原结合蛋白。典型地，捕获试剂被固定在例如检验表面上，例如固体底物或试管上。“GDF-8捕获试剂”特异性地结合GDF-8。
“检测试剂”是在本发明的免疫检验中使用的特异性结合目标蛋白质例如GDF-8的试剂，例如抗体或抗原结合蛋白。检测试剂可任选地包含可检测的标记。检测试剂典型地在与捕获试剂不同的结合位点或表位处识别和结合目标蛋白质。检测试剂可与可检测的标记偶联。“GDF-8检测试剂”特异性结合GDF-8。
术语“互补性决定区”或“CDR”是指抗体或抗原结合蛋白分子的高变区，其由来自重链的三个环和来自轻链的三个环组成，它们一起形成抗原结合结构域。
术语“检测”以最广义的含义使用，包括目标分析物的定性和定量测量，在本文中为特定目标分子例如GDF-8或BMP-11的测量。本文所述检验方法可以被用于鉴定生物样品中GDF-8或BMP-11的存在，或可被用于定量样品中GDF-8或BMP-11的量。
“检测剂”或“检测试剂”可在本发明的方法中用于检测由来自包含间接标记的检测抗体或抗原结合蛋白产生的信号。检测剂或试剂是允许检测GDF-8调节剂或复合物的蛋白质或小分子。在一个优选的实施方式中，检测剂特异性结合GDF-8调节剂。检测剂可任选地包含可检测的标签。检测剂也可以通过包含可检测标签的物质来检测自身。例如，通过本文提供的方法检测的GDF-8调节剂也可以在所述方法中用于检测其它GDF-8调节剂。
“与GDF8活性相关的病症”、“与GDF8相关的病症”、“GDF8-相关病症”等等表示可完全或部分由GDF8的失调(例如异常提高的GDF8表达和/或活性)引起的病症，和/或可通过调节和/或监测GDF8蛋白质和/或活性来治疗、改善、预防、预测和/或监测的病症。GDF8相关病症包括肌肉病症、神经肌肉病症、骨-退行性病症、代谢或诱导的骨病症、肥胖病症、葡萄糖代谢病症或胰岛素-相关病症。
术语“有效剂量”、“治疗有效剂量”或“有效量”是指足以在个体(包括患有GDF-8相关病症的个体)中改善临床症状或实现期望的生物学结果(例如提高肌肉质量、肌肉强度和/或骨密度)的剂量或水平。例如，这样的量可足以降低与骨骼肌质量和骨密度的副调节相关的GDF-8的活性。治疗性结果和临床症状可包括肌肉量的提高、改善的心血管指标或改善的葡萄糖代谢调节。GDF-8抑制剂可以例如提高肌肉质量、肌肉强度、调控肌肉特异性酶的水平和/或刺激成肌细胞增殖。在一个优选的实施方式中，GDF-8抑制剂降低GDF-8相关病症的临床迹象。GDF-8调节剂可以调控前脂肪细胞(preadipocyte)分化称为脂肪细胞、降低脂肪累积、降低血清甘油三酯水平、降低血清胆固醇水平、调控葡萄糖代谢、调控骨密度和降低高血糖。GDF-8抑制剂也可以被施用给个体，从而提高肌肉质量，或提高或加速生长，包括肌肉生长。治疗有效量的GDF-8抑制剂是指下述用量，所述用量在单剂量或多剂量施用给个体后有效治疗、预防、治愈、延迟病症或复发病症，降低其至少一个症状的严重性或改善至少一个症状，或延长患者存活至超过不使用这类治疗时的预期。
患有GDF-8相关病症的个体、处于发生GDF-8相关病症风险下的个体、用GDF-8调节剂进行治疗的个体、和是施用GDF-8调节剂的候选者的个体，可以是本文提供的方法的候选者。本发明的方法可监测或预防有害的免疫应答，和/或评价使用GDF-8调节剂的效力、生物稳定性或适合性。
患有GDF-8相关病症(例如肌肉-相关病症或神经肌肉病症)或处于发生所述病症风险下的个体是本文提供的方法的候选者。GDF-8活性的抑制增加个体(包括患有肌肉-相关病症的个体)中的肌肉组织。大量病症与功能受损的肌肉或神经组织相关，例如但不限于肌营养不良、肌萎缩侧索硬化(ALS)、老年性肌肉萎缩、恶病质、肌肉消耗、肌肉萎缩或虚弱。肌营养不良包括例如假肥大性营养不良、筋膜肩胛肱营养不良和肢带型(limb-girdle)营养不良。示范性的肌营养不良包括Duchenne’s肌营养不良(Leyden-Mobius)、Becker肌营养不良、Emery Dreifuss肌营养不良、肢带型肌营养不良、强直性脊柱综合征(rigid spine syndrome)、Ullrich综合征、Fukuyama肌营养不良、Walker Warberg综合征、肌肉-眼-脑病(muscle_eye_brain)、筋膜肩胛肱肌营养不良(Landouzy-Dejerine)、先天性肌营养不良、强直性肌营养不良(Steinart’s病)和其它肌强直和Gower’s病。
GDF-8相关肌肉病症还包括选自以下的病症：与心血管疾病相关，或由另一疾病或病症例如器官萎缩、器官衰竭、癌症、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、卧床(bed rest)、固定、长期缺乏使用或其它疾病或病症而继发的肌肉退化也包括在该术语中。
患有脂肪组织病症例如肥胖症、心血管病症(与肌肉损失或肌肉消耗相关时)和胰岛素代谢病症或处于所述病症风险下的个体可以是候选者。类似地，患有下述病症或处于发生下述病症风险下的个体是本文提供的治疗方法的候选者，所述病症为：与骨损失相关的病症，包括骨质疏松，特别是在年老和/或绝经后女性中，糖皮质激素-诱导的骨质疏松、骨质减少、骨关节炎和骨质疏松-相关的骨折。其它GDF-8相关病症包括以低骨质量为特征的代谢骨疾病和病症，例如归因于慢性糖皮质激素疗法、过早的性腺衰竭、雄性激素阻抑、维生素D缺乏、继发性甲状旁腺功能亢进、营养缺乏和神经性厌食症。
心血管疾病的例子包括冠状动脉疾病(动脉粥样硬化)、咽峡炎(包括急性和不稳定的咽峡炎)、心脏病发作、中风(包括缺血性中风)、与心血管疾病相关的高血压、心力衰竭、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、高血压、高脂血症、外周动脉疾病和外周血管疾病。胰岛素代谢病症的例子包括与异常葡萄糖内稳态、2型糖尿病、前驱糖尿病、糖耐量减低、血脂障碍、代谢综合征(例如综合征X)和创伤如烧伤或氮失衡诱导的胰岛素抗性相关的病症。
术语“GDF-8”是指特定的生长与分化因子-8，并且也可称作“肌抑制素”。该术语表示全长的未经加工的前体形式的GDF-8以及由翻译后切割得到的成熟和前肽形式。除非另有说明为“无活性的”，“GDF-8蛋白”保留一种或多种GDF-8生物活性。该术语还表示保持至少一种与如本文所述的成熟GDF-8相关的生物活性的任何GDF-8片段和变体，包括经修饰的序列。成熟人GDF-8的氨基酸序列在SEQ ID NO：1中提供。本发明设计来自所有脊椎动物物种的GDF-8，所述动物包括但不限于人、牛、鸡、小鼠、大鼠、猪、羊、火鸡、狒狒和鱼(序列信息参阅例如McPherron等，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.94：12457-12461(1997))。
术语“GDF-8活性”是指与活性GDF-8蛋白相关的一种或多种生理学生长-调节或形态发生活性。例如，活性GDF-8是骨骼肌质量的负调节物。活性GDF-8也可调控肌肉-特异性酶(例如肌酸激酶)的生产、刺激成肌细胞增殖和调控前脂肪细胞分化成脂肪细胞。“GDF-8活性”包括“GDF-8结合活性”。例如，成熟的GDF-8特异性结合GDF-8的前肽区、结合ActRIIB、或结合GDF-8受体、结合激活蛋白、结合卵泡抑制素(follistatin)、结合含卵泡抑制素-结构域的蛋白质、结合GASP-1和其它蛋白质。GDF-8抑制剂，例如抗体或抗原结合蛋白或其片段，可诱导这些结合活性中的一种或多种。GDF-8的生物活性是本领域技术人员公知的，参阅例如美国专利申请No.2004/0223966的实施例5-6和8-12。
“GDF-8相关病症”是其中受试者会受益于GDF-8调控物例如GDF-8抑制剂的施用的病症或状况。GDF-8相关病症包括医学病症例如肌肉-相关或神经肌肉病症或状况，例如肌营养不良，肌萎缩侧索硬化(ALS)，老年性肌肉萎缩，恶病质，肌肉消耗，肌肉萎缩，或肌肉退化，包括消耗、萎缩或虚弱。肌营养不良包括例如假肥大性肌营养不良、筋膜肩胛肱肌营养不良和肢带型(limb-girdle)肌营养不良。示范性的肌营养不良包括Duchenne’s肌营养不良
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Becker肌营养不良、EmeryDreifuss肌营养不良、肢带型肌营养不良、强直性脊柱综合征、Ullrich综合征、Fukuyama肌营养不良、Walker Warberg综合征、肌肉-眼-脑病、筋膜肩胛肱肌营养不良(Landouzy-Dejerine)、先天性肌营养不良、强直性肌营养不良(Steinart’s病)和其它肌强直和Gower’s病。
与心血管疾病相关，或由另一疾病或病症例如器官萎缩、器官衰竭、癌症、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、卧床、固定、长期缺乏使用或其它疾病或病症而继发的肌肉退化也包括在该术语中。
GDF-8相关病症还包括脂肪组织病症(例如肥胖症)、心血管疾病或病症(与肌肉损失或肌肉消耗相关时)和胰岛素代谢病症。GDF-8相关病症还包括与骨损失相关的病症，包括骨质疏松，特别是在年老和/或绝经后女性中，糖皮质激素-诱导的骨质疏松、骨质减少、骨关节炎和骨质疏松-相关的骨折。其它病症包括以低骨质量为特征的代谢骨疾病和病症，例如归因于慢性糖皮质激素疗法、过早的性腺衰竭、雄性激素阻抑、维生素D缺乏、继发性甲状旁腺功能亢进、营养缺乏和神经性厌食症的那些。
心血管病症的例子包括冠状动脉疾病(动脉粥样硬化)、咽峡炎(包括急性和不稳定的咽峡炎)、心脏病发作、中风(包括缺血性中风)、与心血管疾病相关的高血压、心力衰竭、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、高血压、高脂血症、外周动脉疾病和外周血管疾病。胰岛素代谢病症的例子包括与异常葡萄糖内稳态、2型糖尿病、前驱糖尿病、糖耐量减低、血脂障碍、代谢综合征(例如综合征X)和创伤如烧伤或氮失衡诱导的胰岛素抗性相关的病症。
术语“GDF-8潜伏复合物”是指在成熟的GDF-8同二聚体和GDF-8前肽之间形成的蛋白质复合物。相信两个GDF-8前肽与同二聚体中两个成熟的GDF-8分子结合，形成无活性的四聚体复合物。潜伏复合物可包含其它GDF抑制剂来代替或者补充一个或多个GDF-8前肽。
术语“成熟的GDF-8”是指从GDF-8前体蛋白质的羧基端结构域上切下的蛋白质。成熟的GDF-8可作为单体、同二聚体存在，或存在于GDF-8潜伏复合物中。根据条件，成熟的GDF-8可在任意或所有这些不同形式之间建立平衡。在其生物活性形式下，成熟的GDF-8也被称作“活性GDF-8”。有生物活性的GDF-8不在GDF-8潜伏复合物中。该术语还表示维持与本文所述成熟的GDF-8相关的至少一种生物活性的GDF-8的任何片段和变体，包括经修饰的序列。
术语“GDF-8前肽”是指从GDF-8前体蛋白质的氨基端结构域上切下的多肽。GDF-8前肽能够结合成熟GDF-8上的前肽结合结构域。GDF-8前肽与成熟的GDF-8同二聚体形成复合物。相信两个GDF-8前肽与同二聚体中的两个成熟的GDF-8分子结合形成无活性的四聚体复合物，称作“潜伏复合物”。潜伏复合物可包含其它GDF抑制剂来代替或者补充一个或多个GDF-8前肽。
术语“GDF-8调节剂”包括能够调控GDF-8的活性、表达、加工或分泌的任何试剂或其可药用的衍生物。GDF-8调节剂会提高或降低一种或多种GDF-8活性。GDF-8调节剂，包括“GDF-8抑制剂”可被用于治疗例如脂肪细胞病症、葡萄糖代谢-相关病症或骨病症。GDF-8调节剂的生物衍生物包括在该术语中。在某些实施方式中，GDF-8调节剂或抑制剂会影响GDF-8与一种或多种其生理学结合配偶体的结合，所述配偶体包括但不限于受体(例如ActRIIB)、含卵泡抑制素结构域的蛋白质(例如卵泡抑制素、FLRG、GASP-1、GASP-2)或GDF-8蛋白质例如GDF-8前肽及其突变体和衍生物。GDF-8调节剂包括例如特异性结合GDF-8的抗体(包括MYO-029、MYO-028、MYO-022、JA-16及其片段和衍生物)、特异性结合GDF-8受体的抗体(参阅例如美国专利No.6,656,475、美国专利公开No.2004/0077053-A1)、经修饰的可溶受体(包括受体融合蛋白质，例如ActRIIB-Fc融合蛋白)、特异性结合GDF-8或BMP-11的其它蛋白质(例如GDF-8或BMP-11前肽、GDF-8前肽的突变体和衍生物、卵泡抑制素、含卵泡抑制素结构域的蛋白质，和这些蛋白质的Fc融合物)、结合GDF-8受体或这些蛋白质Fc融合物的蛋白质、并且包括模拟物。非蛋白质抑制剂(例如核酸)也包括在术语GDF-8抑制剂内。GDF-8抑制剂包括蛋白质、抗体、肽、肽模拟物、核酶、反义寡核苷酸、双链RNA(包括siRNA或微小RNA)和特异性抑制GDF-8的其它小分子。
术语“个体”是指任何脊椎动物，包括哺乳动物、鸟、爬行动物、两栖动物或鱼。术语“哺乳动物”包括被归类为雄性或雌性的任何动物，包括人、非人灵长类、猴子、狗、马、猫、绵羊、猪、山羊、牛等等。非哺乳动物动物的例子包括鸡、火鸡、鸭、鹅、鱼(例如鲑鱼、鲶鱼、鲈鱼、斑马鱼和鳟鱼)和蛙。个体可选自例如人，或家养动物、原料(feedstock)动物、家畜动物、动物园动物、运动动物、竞赛动物或宠物动物。
术语“抑制”和“抑制的”是指相对于不存在相同抑制剂时，GDF-8抑制剂对GDF-8的一种或多种活性的降低。活性的降低优选地为至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。在某些实施方式中，被一种或多种本文公开的抑制剂影响时，GDF-8的活性被降低至少50％，优选地至少约60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、92％、94％、96％、98％或99％，甚至更优选的至少95％到100％。术语“中和”和“中和的”表示一种或多种GDF-8活性被降低至少80％、85％、90％或95％。GDF-8活性的抑制可以如Thies等Growth Factors 18：251-259(2001)中所述在pGL3(CAGA)12报告基因检验中或如下文实施例所述在ActRIIB报告检验中测量。
术语“经分离的”是指基本与其天然环境隔离的分子。例如，经分离的蛋白质是与其来自的细胞或组织来源基本隔离的蛋白质。
标记也可以是酶，例如转化底物的酶，例如过氧化物酶(例如辣根过氧化物酶)、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶和β-半乳糖苷酶。过氧化物酶与可溶底物(例如3，3’，5，5’四甲基联苯胺(TMB)、邻苯二胺(OPD)、2，2’-联氮-二[3-乙基-苯噻唑啉]磺酸盐(ABTS)、鲁米诺、多酚、吖啶酯和萤光素)孵育时在底物中导致可以通过分光镜检测的发色或发光改变。典型地，在用底物孵育固定的时间段后，将反应淬灭(例如通过酸化)，并通过测量光密度(吸光度)或发光来定量结果。可以将吸光度结果与来自发色反应的线性范围内的OD值比较，并以相对光单位(RLU)计测量发光免疫反应。
标记也可以是生物素、半抗原或表位标签(例如组氨酸、HA(血凝素肽)、麦芽糖结合蛋白、或谷胱甘肽-S-转移酶)，其可以通过添加经标记的测定剂来检测，所述测定剂与结合了GDF 8调节剂或检测剂的标记相互作用。经生物素标记的(“生物素化的”)检测剂可以在与抗生物素蛋白-酶缀合物和合适的发色或发光底物先后孵育之后，通过其与抗生物素蛋白-酶缀合物(例如抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶)的相互作用来检测。铕也是一种标记。
本文使用的术语“肽模拟物”是指下述肽，所述肽生物模拟激素、细胞因子、酶底物、病毒或其它生物分子上的活性决定簇，并且拮抗、刺激或以其它方式调控天然配体的生理活性。肽模拟物优选地被定义为具有二级结构(如肽)并任选地具有其它结构特征的化合物；它们的作用模式与天然肽的作用模式大幅相似或相同，然而它们的活性(例如作为拮抗剂或抑制剂)与天然肽(特别是受体或酶)相比可以被修饰。另外，它们可以模仿天然肽(激动剂)的作用。在本申请文件通篇中，术语“肽模拟物”是指下述分子，其由于结构特性而能够模拟任一功能性GDF8或非功能性GDF8的生物功能。在本发明中，提出包含GDF8结合/二聚体化结构域的GDF8片段作为GDF8的显性负相(dominant negative)发挥作用。具有GDF8结合/二聚体化结构域的肽模拟物自身可以多摩尔过量(in multimolarexcess)地存在，并可“胜出”野生型GDF8并与野生型分子形成异二聚体，从而作为GDF8的生物功能的显性负相发挥作用。在这一含义中，GDF8功能会被破坏，从而缓解对肌肉生长的抑制。这类促进生长的GDF8模拟物活性的体内生物学检验的一个例子是：通过施用有效量的至少一种本发明的促进生长的模拟物，提高正常小鼠或其它测试动物中的骨骼肌质量。
术语“经纯化的”是指下述分子，其基本不含在其天然环境中与之结合的其它材料。例如，经纯化的蛋白质基本不含所述蛋白质来自的细胞或组织中的细胞材料或其它蛋白质。该术语表示下述制剂，其中经分离的蛋白质足够纯净到作为治疗组合物被施用，或至少70％到80％(w/w)纯净，更优选地至少80％-90％(w/w)纯净，进一步更优选地，90-95％纯净；最优选地至少95％、96％、97％、98％、99％或100％(w/w)纯净。
本文使用的术语“siRNA”是指小干扰RNA分子，其可以被用于使目标基因的表达沉默。siRNA可以是具有19-25个核苷酸的dsRNA。siRNA可以通过称作Dicer的RNase III-相关核酶对更长dsRNA分子的降解来内源生产。siRNA也可以被内源地引入细胞中，或者通过表达构建体的转录引入细胞中。一旦形成，siRNAs与蛋白质成分装配成为含有核糖核酸内切酶的复合物，其已知为RNA-诱导的沉默复合物(RISCs)。产生ATP的siRNA解旋使RISCs活化，所述RISCs随后通过Watson-Crick碱基配对靶向互补的mRNA转录本，从而切割并破坏所述mRNA。mRNA的切割发生在被siRNA链结合的区域中部附近。该序列特异性mRNA降解导致基因沉默。
可以使用至少两种方式来实现siRNA-介导的基因沉默。首先，可以体外合成siRNA并将其引入细胞中来瞬时阻抑基因表达。siRNA是短混合的寡核苷酸的双链体，其可包含例如具有对称的二核苷酸3’悬突的19个RNA核苷酸。使用合成的21bp siRNA双链体(例如19个RNA碱基后是UU或dTdT 3′悬突)，可以在哺乳动物中实现序列特异性基因沉默。这些siRNA可在哺乳动物细胞中特异性阻抑目标基因翻译，而不通过更长的双链RNAs(dsRNA)活化DNA-依赖型蛋白质激酶(PKR)，所述活化可导致许多蛋白质翻译的非特异性抑制。
其次，siRNA可以由载体体内表达。这一途径可以用于在细胞或转基因动物中稳定表达siRNA。siRNA表达载体被改造为驱动来自聚合酶III(pol III)转录单元的siRNA转录。Pol III转录单元适合发夹siRNA表达，因为它们利用导致对发夹siRNA添加2bp悬突(例如UU)的短的富含AT的转录终止位点，这是对siRNA功能有用的一个特性。Pol III表达载体也可被用于创建表达siRNA的转基因小鼠。
siRNA也可以组织特异性方式表达。在这一途径下，首先在选择的细胞系或转基因小鼠的核中由启动子(例如CMV(pol II))表达长dsRNA。长dsRNA在核中(例如被Dicer)加工成siRNA。siRNA离开核并介导基因特异性沉默。类似的途径可与组织特异性(pol II)启动子组合使用，来创建组织特异性击倒小鼠。
术语“小分子”是指不是大分子的化合物。参阅例如Karp，(2000)Bioinformatics Ontology 16：269-85；Verkman，(2004)AJP-Cell Physiol.286：465-74。因此，小分子通常被认为是小于1000道尔顿的化合物(例如Voet and Voet，Biochemistry，2nd ed.，ed.N.Rose，Wiley and Sons，New York，14(1995))。例如，Davis等((2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：5981-86)使用短语小分子表示叶酸盐/酯、氨甲喋呤核神经肽，而Halpin和Harury((2004)PLos Biology 2：1022-30)使用该短语表示小分子基因产物，即DNA、RNA核肽。天然小分子的例子包括胆固醇、神经递质核siRNA；合成的小分子包括大量可商业获得小分子数据库例如FCD(精细化学品数据库)、SMID(小分子相互作用数据库)、ChEBI(生物学感兴趣的化学实体)和CSD(剑桥结构数据库)中所列的多种化学品(参阅例如Alfarano等(2005)Nuc.Acids Res.Database Issue 33：D416-24)。
术语“特异性结合的”、“特异性结合”等等表示两个或多个分子形成复合物，所述复合物在生理或检验条件下是可测量的，并且是选择性的。如果在适当选择的条件下这类结合基本上不被抑制而同时非特异性的结合被抑制，则称作抗体或抗原结合蛋白或其它抑制剂与蛋白质“特异性结合”。特异性结合的特征是高亲和力并对化合物或蛋白质是选择性的。非特异性结合通常具有低亲和力。例如在IgG抗体中的结合通常特征是至少约10-7M或更高，例如至少约10-8M或更高，或至少约10-9M或更高，或至少约10-10或更高，或至少约10-11M或更高，或至少约10-12M或更高的亲和力。该术语还适用于例如抗原-结合结构域对不被大量抗原所带有的具体的表位而言是特异性时，在这种情况下带有所述抗原-结合结构域的抗体或抗原结合蛋白通常不会结合其它抗原。
某些方法需要特异性结合的高亲和力，而其它方法例如表面等离子共振检验可检测较不稳定的复合物和更低亲和力的相互作用。需要时，可以通过改变结合条件来降低非特异性结合而不大幅影响特异性结合。这类条件是本领域已知的，技术人员使用常规技术可选择合适的条件。条件通常在结合配偶体浓度、溶液离子强度、温度、允许结合的时间、非-相关分子(例如血清白蛋白、乳酪蛋白)浓度等等方面定义。示范性的结合条件在下文实施例中公开。
术语“特异性GDF8拮抗剂”或“特异性GDF8抑制剂”包括任何下述试剂，所述试剂能够抑制、降低和/或中和GDF8的活性、表达、加工或分泌，但不显著抑制、降低和/或中和例如TGF-β超家族的其它蛋白质(例如BMP11)的活性、表达、加工或分泌。这类抑制剂包括大分子和小分子，例如蛋白质、抗体、肽、肽模拟物、siRNA、核酶、反义寡核苷酸、双链RNA、和特异性抑制GDF8活性的其它小分子。这类抑制剂被称作特异性“拮抗”(例如“抑制”、“降低”、“减少”或“中和”)GDF8的生物活性。GDF-8抑制剂回抑制或中和或降低GDF-8的至少一种生物活性，例如与活性GDF-8蛋白质相关的生理活性、生长调节活性或形态发生活性。例如，GDF-8是骨骼肌生长的负调节物。GDF-8抑制剂可提高肌肉质量、提高肌肉强度、调控肌肉特异性酶的水平、刺激成肌细胞增殖、调控前脂肪细胞分化成为脂肪细胞、降低脂肪累积、降低血清甘油三酯水平、降低血清胆固醇水平、调控血糖代谢和/或降低高血糖。
术语“治疗”在本文中与术语“治疗方法”可交换地使用，并且表示治疗性治疗和预防性/预防手段。术语治疗还被定义未能够改善、治疗或预防病症。需要治疗的对向可包括已经患有具体医学病症的个体，以及可能最终获得病症的个体(即需要预防手段的个体)。
除非另有说明，本发明的实践回使用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些属于本领域的技术。这些技术在文献中全面地解释。参阅例如Sambrook，等，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，Second Edition(1989)；DNA Cloning，Volumes I And II(D.N Glover ed.1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.，1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney ed.1986)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In Enzymology(Academic Press，Inc.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.1987，Cold Spring Harbor Laboratory)，Methods in Enzymology第154卷和第155卷(分别为Wu和Grossman，和Wu编)，Mayer和Walker编(1987)，Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Academic Press，London)，Scopes，(1987)，Protein Purification：Principles And Practice，Second Edition(Springer-Verlag，N.Y.)和Handbook Of Experimental Immunology，Volumes I IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell编(1986)。
对GDF8特异性的表位及其拮抗剂
使用GDF8抗体和重叠的人GDF8的13个氨基酸肽进行的表位作图揭示了对GDF8特异的候选表位，所述候选表位可在GDF8的特异性拮抗中被靶向(实施例4.2)。以这一途径为基础，鉴定了对GDF8特异性的五个独立表位。本发明提供了这些表位(包括其肽模拟物)、编码所述表位的多核苷酸、其抑制性多核苷酸和与之相关的抗体作为GDF8活性的特异性拮抗剂。
对GDF8特异的表位及其肽模拟物
本发明提供了与表位同源的新颖的经分离的和经纯化的多肽，其可被生物学表征为对GDF8特异，并因此在本文中被称作GDF8特异性表位。这些GDF8特异性表位的肽模拟物可用作GDF8拮抗剂(即拮抗GDF8活性，例如GDF8与其受体的结合)是本发明的一部分。
例如，本发明提供了经纯化的和经分离的下述多核苷酸，所述多核苷酸编码五个GDF8特异性结合结构域(可包括GDF8的ALK4/ALK4受体结合位点)，所述结构域也发挥GDF8受体拮抗剂/肽模拟物的功能，在本文中被称作“GE1”、“GE2”、“GE3”、“GE4”、和“GE5”。根据本发明的核酸可包括DNA或RNA并可以是完全或部分合成的。除非上下文另有需要，本文公开的核苷酸序列包括具有指定序列的DNA分子或基因组等同物(例如互补序列)，以及其中用U替换T的具有指定序列的RNA分子。优选的本发明的DNA序列包括基因组和cDNA序列和化学合成的DNA序列。
编码人GE1、GE2、GE3、GE4和GE5的cDNA(指定的人cDNA)的核苷酸序列分别作为SEQ ID NOs：3、5、7、9和11公开。本发明的多核苷酸还包括在严格条件下与下述多核苷酸杂交的多核苷酸，所述多核苷酸具有如SEQ ID NOs：3、5、7、9和11公开的核苷酸序列或其互补体和/或基本由其组成，和/或分别编码保留GE1、GE2、GE3、GE4或GE5的基本生物活性的多肽。本发明的多核苷酸还包括包含至少12个连续核苷酸的如SEQ ID NOs：3、5、7、9和11公开的核苷酸序列的连续部分。
人GE1、GE2、GE3、GE4和GE5的氨基酸序列及其模拟性多肽分别作为SEQ ID NOs：4、6、8、10和12公开。本发明的多肽还包括具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列具有包含至少4个连续氨基酸的如SEQ ID NOs：4、6、8、10和12中公开的任何序列的连续部分和/或基本由其组成。本发明的多肽还包括如SEQ ID NOs：4、6、8、10和12公开的任何序列，包括其连续部分，其中用相应的D-氨基酸替换一个或多个L-氨基酸。本发明的多肽还包括SEQ ID NOs：4、6、8、10和12的活性片段，即保留全长人GE1、GE2、GE3、GE4和GE5的基本生物活性的如SEQID NOs：4、6、8、10和12公开的任何序列的任何部分，即SEQ ID NOs：4、6、8、10和12的任何片段，所述片段是GFD8特异性结合结构域和/或其模拟肽可以是GDF8活性的特异性拮抗剂。另外，可以使用公知方法将本发明的多肽乙酰化和/或酰胺封闭。除上述多核苷酸以外，本发明的多核苷酸还包括下述多核苷酸，所述多核苷酸编码如SEQ ID NOs：4、6、8、10和12中所公开的任何氨基酸序列及其连续部分，并且与上述人来源的多核苷酸仅由于公知的遗传密码子的简并性而不同。
本发明还提供了经纯化和经分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码对GDF8特异的环化的模拟肽，例如GE1、GE2、GE3、GE4和GE5。本发明优选的DNA序列包括基因组和cDNA序列和化学合成的DNA序列。本领域技术人员应当明白，本发明还包括其它环化的分子，例如以对GDF8特异的其它结合结构域为基础的环化的模拟肽。另外，可以使用公知的方法将本发明的环化的模拟肽乙酰化和/或酰胺封闭。
对GDF8特异的抗体
本公开提供了与GDF8特异性相互作用的新颖的抗体(例如抗体或抗原结合蛋白片段)。这类抗体的非限制性阐述实施方式被称作RK22。本发明的抗体具有独特和有益的特征。首先，这些抗体能够以高亲和力结合成熟的GDF8(实施例2)。第二，公开的抗体与GDF8特异性相互作用，即本发明的抗体不以高亲和力结合TGF-β亚家族的其它成员，例如BMP11(实施例2)。第三，如所证明的，本发明的抗体体外和体内抑制GDF8活性(实施例3)。第四，公开的抗体可抑制与骨骼肌质量和骨密度的负调节相关的GDF8活性(实施例3)。
在一个实施方式中，本文公开的抗体能够与GDF8特异性相互作用；即注意到所述抗体不会与其它蛋白质广泛反应，例如属于TGF-β超家族的蛋白质例如BMP11、激活蛋白、mullerian-抑制物质、神经胶质-衍生的神经营养因子或除GDF8之外的其它生长与分化因子。在本发明的一个非限制性的实施方式中，本发明的特异性GDF8抗体或抗原结合蛋白以5-10倍于BMP11的偏好结合GDF8。在本发明的一个非限制性的实施方式中，本发明的特异性抗-GDF8抗体或抗原结合蛋白以10-100倍于BMP11的偏好结合GDF8。在本发明的一个非限制性的实施方式中，感兴趣的特异性抗-GDF8抗体或抗原结合蛋白以100-1000倍于BMP11的偏好结合GDF8。在另一实施方式中，本发明的特异性抗-GDF8抗体或抗原结合蛋白结合对GDF8特异的表位，包括本文公开的表位(例如对GDF8特异的表位或其活性片段，所述表位具有如SEQ ID NOs.：4、6、8、10和12中公开的氨基酸序列和/或基本由其组成)。在本发明的一个实施方式中，关注的抗体与成熟的GDF8预测的ALK4/ALK5结合位点(例如具有SEQ ID NOs：4，6或8中公开的氨基酸序列的GDF8表位)特异性相互作用。
本领域普通技术人员应当明白，本发明的抗体可用于检测、测量和抑制来自多种物种的GDF8蛋白质(例如本申请文件所述的蛋白质)。通过标准比对算法测定同一性百分比，所述算法例如为Altschul等((1990)J.Mol.Biol.215：403-10)中描述的Basic Local Alignment Tool(BLAST)、Needleman等((1970)J.Mol.Biol.48：444-53)的算法，或Meyers等((1988)Comput.Appl.Biosci.4：11-17)的算法。通常，本发明的抗体和抗体或抗原结合蛋白片段可与任何下述蛋白质一起使用，所述蛋白质保留基本的GDF8生物活性并包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列与作为SEQ IDNO：1公开的成熟形式GDF8的至少100、80、60、40、20或15个连续氨基酸的任何序列至少约70％、80％、90％、95％或更多相同。
完整的抗体(也已知为免疫球蛋白)典型地是由每条约25kDa的两条轻(L)链和每条约50kDa的两条重链组成的四聚体糖基化蛋白质。抗体中存在两种类型的轻链，称作λ和κ。根据重链恒定区的氨基酸序列，将免疫球蛋白指定为五个大组：A、D、E、G和M，其中若干组被进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。每条轻链由N-端可变(V)结构域(VL)和恒定(C)结构域(CL)组成。每条重链由N-端V结构域(VH)、三或四个C结构域(CH)和铰链区组成。最接近VH的CH结构域被称作CH1。VH和VL结构域组成具有相对保守序列的四个区域，称作框架区(FR1、FR2、FR3和FR4)，其形成三个高变序列区(互补性决定区，CDR)的支架。CDR含有负责抗体或抗原结合蛋白与抗原的特异性相互作用的大部分残基。CDR被称作CDR1、CDR2和CDR3。因此，重链上的CDR组分被称作H1、H2和H3，而轻链上的CDR组分被称作L1、L2和L3。CDR3是抗体或抗原结合蛋白-结合位点内分子多样性的最大来源。例如，H3可以短达两个氨基酸残基或大于26个氨基酸。不同种类免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是本领域公知的。抗体结构的综述参阅Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Eds.Harlow等，1988。本领域技术人员应当明白，每种亚基结构(例如CH、VH、CL、VL、CDR和/或FR结构)包含活性片段。例如，活性片段可由VH、VL或CDR亚基结合抗原的部分(即抗原-结合片段)或CH亚基结合和/或活化Fc受体和/或补体的部分组成。
包括在本文使用的术语“抗体或抗原结合蛋白片段”中的结合片段的非限制性例子包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由单一抗体臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段；和(vi)经分离的CDR。另外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是它们可以通过合成的接头重组接合，产生单条蛋白质链，其中所述VL和VH结构域配对形成单价分子(已知为单链Fv(scFv))。最广泛使用的接头是15-残基的(Gly4Ser)3肽，但是其它接头也是本领域已知的。单链抗体也旨在被包括在术语“抗体或抗原结合蛋白”或抗体的“抗原-接合片段”内。
这些抗体使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并以与完整抗体相同的方式筛选片段的效用。通过编码可变区的多个种系基因和多种体细胞事件(somatic event)产生抗体多样性。体细胞事件包括具有多样性(D)的可变基因区段和接合(J)基因区段的重组，用于制造完整的VH结构域，以及可变和接合基因区段的重组，用于制造完整的VL结构域。重组过程自身是不精确的，导致V(D)J接合处氨基酸的损失或增加。这些多样性机制发生于抗原暴露前的发育中的B细胞中。抗原刺激后，B细胞中表达的抗体基因经历了体细胞突变。基于评价的种系基因区段数量、这些区段的随机重组和随机VH-VL配对，可以生产多达1.6×107种不同的抗体(Fundamental Immunology，3rd ed.(1993)，ed.Paul，Raven Press，New York，NY)。考虑到有助于抗体多样性的其它方法(例如体细胞突变)时，认为可以产生多达1x1010种不同的抗体(Immunoglobulin Genes，2nd ed.(1995)，eds.Jonio等，Academic Press，San Diego，CA)。因为有产生抗体多样性的许多方法，所以不可能具有相同抗原特异性的独立衍生的单克隆抗体会具有相同的氨基酸序列。
因此，本发明提供了与GDF8特异性相互作用的新颖抗体，即特异性GDF8抗体。本发明的抗体或抗原结合蛋白，例如含有CDR的结构，通常会是抗体或抗原结合蛋白重链或轻链序列，或其活性片段，其中CDR被置于对应于天然存在的VH和VL的CDR的位置上。免疫球蛋白可变结构域(例如CDR)的结构和位置可以使用公知的编号方案来定义，例如Kabat编号方案、Chothia编号方案、Kabat和Chothia的组合(AbM)等等(参阅例如Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S.Department of Health and Human Services(1991)，eds.Kabat et al.；Al-Lazikani等(1997)J.Mol.Bio.273：927-948)。
因此，本发明还提供了新颖的CDR。用于负载本发明CDR的结构通常应是多肽，例如抗体或抗原结合蛋白重链或轻链序列或其基本部分，其中所述CDR位于对应于天然存在的VH和VL结构域的CDR的位置处。免疫球蛋白可变区的结构和位置可以如例如Kabat等，上文和Al-Lazikani等，上文中所述测定。
能够与本发明的多肽特异性相互作用的抗体或抗原结合蛋白分子可以通过本领域技术人员公知的方法生产。例如，单克隆抗体可以根据已知方法通过杂交瘤的产生来生产。随后使用标准方法例如酶联免疫吸附检验(ELISA)和Biacore分析筛选以这种方式形成的杂交瘤，来鉴定生产下述抗体的一种或多种杂交瘤，所述抗体与GDF8特异性相互作用(例如接合GDF8)和/或拮抗(例如抑制、降低和/或中和)至少一种GDF8活性(例如GDF8与其受体的结合或其它下游GDF8信号转导事件)。
可以使用重组的GDF8、天然存在的GDF8和GDF8的抗原肽片段作为免疫原。抗原肽片段包含至少六个连续的氨基酸，并且包括下述表位，所述表位使得根据所述表位产生的抗体与GDF8形成特异性免疫复合物。优选地，抗原肽包含至少四个氨基酸残基。另外，优选GDF8的抗原肽片段包含对GDF8特异的表位(例如具有如SEQ ID NOs：4、6、8、10、12中公开的氨基酸序列和/或基本由其组成的肽或其活性片段转移)。
在本发明的一个实施方式中，可以使用全长GDF8多肽作为免疫原，或者可以使用所述多肽的抗原肽片段。例如，免疫原可以是GDF8特异性表位(例如对GDF8特异的表位，和/或下述表位，针对所述表位的特异性抗-GDF8抗体和/或模拟肽是GDF8信号转导的特异性拮抗剂(例如SEQID NOs：4、6、8、10、12的氨基酸序列中的一个或多个或其活性片段))和/或相关的肽或环化肽。本发明多肽的抗原肽包含至少四个连续的氨基酸残基，并且包括下述表位，所述表位使得针对所述肽产生的抗体与所述多肽形成特异性免疫复合物。优选地，抗原肽由至少四个氨基酸残基，更优选地至少六个氨基酸残基，进一步更优选地至少九个氨基酸残基组成。
作为制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的替代方式，可以通过用本发明的多肽筛选重组组合免疫球蛋白文库(例如抗体噬菌体展示文库)来鉴定和分离本发明多肽的单克隆抗体，从而分离与所述多肽结合的免疫球蛋白文库成员。用于产生和筛选噬菌体展示文库的技术和可商业获得的试剂盒是本领域技术人员公知的。另外，尤其适合用于产生和筛选抗体或抗原结合蛋白的方法和试剂的例子可在文献中找到。
可以通过用GDF8、其变体和/或其部分，例如用本发明的特异性GDF8表位来免疫合适的受试者，来生产多克隆血清和抗体。可通过标准技术，例如使用ELISA，或者通过使用固定的GDF8或其它标记物蛋白质(例如FLAG)，随时间监测被免疫的受试者中的抗体效价。需要时可以从受试者或培养基中分离指向本发明多肽的抗体分子，并通过公知的技术例如A蛋白色谱进一步纯化，获得IgG级分。
另外，可以使用标准重组DNA技术生产本发明多肽的嵌合、人源化和单-链抗体，所述抗体包含人部分和非人部分。也可以使用不能表达内源免疫球蛋白重链和轻链基因但是能够表达人重链和轻链基因的转基因小鼠生产人源化抗体。
本发明的抗体或抗原结合蛋白分子(包括片段)(例如与GDF8特异性相互作用的抗体或抗原结合蛋白分子)包括但不限于，单克隆RK22抗体、其变体(例如人源化变体)及其片段。与GDF8特异性相互作用的本发明的抗体或抗原结合蛋白也可以是特异性GDF8拮抗剂，因此，这些抗体或抗原结合蛋白分子可用于抑制或治疗GDF8相关病症，例如骨、肌肉、脂肪和葡萄糖代谢-相关病理学。
因此，本发明还提供了编码特异性GDF8抗体区域的经纯化的和经分离的多核苷酸，所述抗体可以拮抗至少一种GDF8活性，例如RK22及其变体。优选的本发明的DNA序列包括基因组、cDNA和化学合成的DNA序列。如上文所述，编码本发明的抗体或抗原结合蛋白区域的多核苷酸可包括DNA或RNA，并可以是完全或部分合成的。除非上下文另有需要，本文公开的核苷酸序列包括具有指定序列的DNA分子或基因组等同物(例如互补序列)，以及其中用U替换T的具有指定序列的RNA分子。
本发明的核苷酸序列包括编码鼠RK22轻链可变结构域的序列，例如作为SEQ ID NO：15所公开的核苷酸序列。本发明的核苷酸序列还包括编码鼠RK22重链可变结构域的序列，例如作为SEQ ID NO：13公开的核苷酸序列。本发明的多核苷酸还包括在严格条件下与下述多核苷酸杂交的多核苷酸，所述多核苷酸具有如SEQ ID NOs：13和15公开的核苷酸序列或其互补体和/或基本由所述序列组成，和/或编码保持RK22可变结构域的基本生物活性的多肽(即其活性片段)。本发明的多核苷酸还包括如SEQ ID NOs：13和15中公开的序列的连续部分，其包含至少15个连续核苷酸。
鼠RK22轻链可变结构域的氨基酸序列作为SEQ ID NO：16公开。鼠Rk22的重链可变结构域的氨基酸序列作为SEQ ID NO：14公开。人源化可变重链和轻链结构域的氨基酸序列分别在SEQ ID NOs：17和18中公开。鼠RK22重链中包含的CDR的氨基酸序列作为SEQ ID NOs：19-21和25-27公开。鼠RK22轻链中含有的CDR的氨基酸序列作为SEQ ID NOs：22-24和28-30公开。本发明的多肽还包括基本如SEQ ID NOs：14、16、17、18和19-30公开的任意序列的连续部分，其包含至少5个连续的氨基酸。本发明的一种优选的多肽包括作为SEQ ID NOs：14、16、17、18和19-30的活性片段，即作为SEQ ID NOs：14、16、17、18和19-30公开的任意序列的任意连续部分，其基本保利本发明抗体或抗原结合蛋白的生物活性。除了上述这些多核苷酸，本发明还包括编码基本如SEQ ID NOs：14、16、17、18和19-30公开的氨基酸序列的多核苷酸，或其连续部分，并且仅由于公知的遗传密码子简并性而与上文所述的抗体或抗原结合蛋白多核苷酸不同。
如上文所述，CDR含有负责与抗原特异性相互作用的大部分残基，并且分别包含在VH和VL结构域(即重链可变结构域和轻链可变结构域)内。因此，倘若抗体包含本发明抗体或抗原结合蛋白的至少一个CDR，例如包含选自如SEQ ID NOs：19-30所公开的氨基酸序列的氨基酸序列的CDR，或其活性抗体或抗原结合蛋白片段，则其为本发明的抗体，即与GDF8特异性相互作用(例如结合GDF8)和/或特异性拮抗GDF8活性的抗体。因此，本发明的实施方式包括含有一个或多个下述CDR的抗体，所述CDR包含选自如SEQ ID NOs：19-30中公开的氨基酸序列的氨基酸序列，或其活性片段的氨基酸序列。因此，本领域技术人员应当明白，本发明的抗体包括下述抗体或抗原结合蛋白，其中VL结构域的CDR是如SEQ ID NOs：22-24和28-30所公开的一种或多种CDR，和/或VH结构域的CDR是如SEQ ID NOs：19-21和25-27中所公开的一种或多种CDR。
抗原-结合片段可以是Fv片段，其由VH和VL结构域组成。因此，RK22的Fv片段可组成本发明的抗体，条件是所述片段与GDF8特异性相互作用。本领域技术人员应当明白，含有RK22的Fv片段的任何抗体或抗原结合蛋白片段也可以是本发明的抗体。另外，含有一种或多种具有下述氨基酸序列的CDR的Fv片段、scFv片段、Fab片段或F(ab’)2片段也可以是本发明的抗体或抗原结合蛋白，所述氨基酸序列选自如SEQ ID NOs：19-30所公开的氨基酸序列。
本发明的某些实施方式包括RK22的Fv片段的VH和/或VL结构域。本发明抗体的片段，例如Fab、F(ab’)2、Fd和dAb片段可以通过根据本领域公知的方法切割抗体例如RK22来产生。例如，可以通过用酶(例如分别用木瓜蛋白酶和胃蛋白酶)处理抗体来产生具有免疫活性的Fab和F(ab’)2片段。
其它一些实施方式包括本文公开的抗体的VH结构域(例如RK22的VH结构域(作为SEQ ID NOs：14和19公开))和本文公开的抗体的VL结构域(例如RK22的VL结构域(作为SEQ ID NOs：16和18公开))之任意的一种或多种CDR(例如如SEQ ID NOs：19-21和25-27所公开的一种或多种CDR)。一个实施方式包含RK22的VH结构域(如SEQ IDNO：21所公开)的H3片段。
为了便利，将VH和VL结构域内的每个CDR的大致位置列于表2中。
表2
RK22小鼠和人源化抗体的可变区内根据Kabat(非斜体)或AbM(斜体)定义接近的CDR位置
 CDR   RK22SEQ ID NO：14   RK22SEQ ID NO：17
 H1   50-54或45-54   26-35
 H2   69-85或69-77   50-66
 H3   116-128或116-128   99-109
  RK22SEQ ID NO：16   RK22SEQ ID NO：18
 L1   44-60或44-60   24-40
 L2   76-82或76-82   56-62
 L3   115-123或115-123   95-101
本文公开的抗体可还包含抗体或抗原结合蛋白恒定结构域或其部分。例如，本发明的VL结构域可在其C-端与抗体或抗原结合蛋白轻链恒定结构域例如人Cκ或Cλ链，优选Cλ链结合。类似地，以VH结构域为基础的特异性抗原-结合片段可以在其C-端与来自任何抗体同种型(例如IgG、IgA、IgE和IgM)和任何同种型亚类(尤其是IgG1和IgG4)的免疫球蛋白重链的所有或部分结合。在示范性的实施方式中，抗体包含人IgG1λ的重链和轻链的C-端片段。应当理解，由于遗传密码子的简并性，序列1简述中所列的DNA序列仅代表编码感兴趣的氨基酸序列、肽和抗体的核酸序列，而不被解释为限制。
本发明的某些实施方式包含RK22的Fv片段的VH和/或VL结构域。其它实施方式包含任意这些VH和VL结构域的一个或多个互补性决定区(CDR)。一个实施方式包含RK22的VH结构域的H3片段。本发明的VH和VL结构域在某些实施方式中是种系化(germlined)的，即使用常规分子生物学技术改变这些结构域的框架区(FR)，使其匹配人种系基因产物的共有氨基酸序列。这也已知为人源化或种系化抗体。在其它实施方式中，框架序列保持与种系不同。人源化抗体可以使用不能表达内源免疫球蛋白重链和轻链基因但是能够表达人重链和轻链基因的转基因小鼠生产。
本发明的另一方面提供了获得GDF8特异性抗体抗原-结合结构域的方法。技术人员应当明白，本发明的抗体不限于如表2中所列的VH和VL结构域的特定序列，而是包括保留抗原结合能力的这些序列的变体。这类变体可使用本领域已知的技术衍生自所提供的序列。可以在FR或CDR中制造氨基酸替换、缺失或添加。框架区中的改变通常被设计为促进抗体的稳定性并降低免疫原性，而CDR中的改变通常被设计为提高抗体对其靶标的亲和力。这类提高亲和力的改变典型地通过改变CDR和测试抗体来根据经验测定。这类改变可以根据例如Antibody Engineering，2nd ed.，ed.Borrebaeck，Oxford University Press，1995中所述方法制造。
因此，本发明的抗体或其抗原结合蛋白(或其片段)还包括与GDF8特异性相互作用并且在重链和轻链的恒定区中具有突变的那些。有时期望使恒定区的某些片段突变和失活。例如，有时期望重链恒定结构域中的突变生产对Fc受体(FcR)和/或补体具有降低结合的抗体；这类突变是本领域中公知的。本领域技术人员也应明白，确定CL和CH亚基的哪些活性片段是必需的会取决于要应用本发明抗体的应用。例如，在生产完整抗体时，CL和CH亚基中涉及它们彼此共价连接的活性片段会是重要的。
制造作为本文公开的VH结构域的氨基酸序列变体的VH结构域的方法包括下述步骤：在本文公开的VH结构域的氨基酸序列中添加、缺失、替换或插入一个或多个氨基酸，任选地组合VH结构域从而提供一个或多个VL结构域，并测试VH结构域或一种或多种VH/VL组合与GDF8的特异性相互作用，和(优选地)测试这类抗原-结合结构域调控一种或多种GDF8-相关活性的能力。VL结构域可具有基本如本文所公开的氨基酸序列。可以使用类似的方法，其中将本文公开的VL结构域的一种或多种序列变体与一种或多种VH结构域组合。
本发明的另一方面提供了制备与GDF8特异性相互作用的抗原-结合片段的方法。所述方法包括：提供编码VH结构域的核酸的起始组成成分(repertoire)，所述核酸包含要替换的CDR(例如CDR3)的编码区或缺乏CDR(例如CDR3)的VH结构域的编码区；经所述组成成分与编码本发明的供体CDR的供体核酸(例如编码包含SEQ ID NO：14、16、17、18的活性片段的CDR的供体核酸)合并，使得所述供体核酸被插入组成成分的CDR(例如CDR3)区域中，从而提供编码VH结构域的核酸的产物组成成分；表达产物组成成分的核酸；选择对GDF8特异的抗原-结合片段；和回收所述特异性抗原-结合片段或编码它的核酸。还可以使用类似的方法，其中将本发明的VL CDR(例如L3)与编码VL结构域的核酸的组成成分合并，所述核酸的组成成分包含要被替换的CDR或缺乏CDR编码区。
可以使用重组DNA技术将本发明CDR(例如CDR3)的编码序列引入缺乏CDR(例如CDR3)的可变结构域的组成成分中。例如，Marks等((1992)Bio/Technology 10：779-83)描述了生产抗体或抗原结合蛋白可变结构域的组成成分的方法，其中与人VH基因第三框架区的共有引物一起，使用指向可变结构域区域5’端或与之相邻的共有引物，来提供缺乏CDR3的VH可变结构域的组成成分。可以将所述组成成分与具体抗体的CDR3组合。使用类似的技术，可以用缺乏CDR3的VH或VL结构域的组成成分改组本发明的CDR3-衍生的序列，并将经改组的整个VH或VL结构域与同源的(cognate)VL或VH结构域组合，提供本发明的特异性抗原-结合片段。然后可将所述组成成分在合适的宿主系统(例如WO 92/01047的噬菌体展示系统)中展示，从而可以选择合适的抗原-结合片段。
类似物改组或组合技术还由Stemmer((1994)Nature 370：389-91)公开，他描述了与β-内酰胺酶基因相关的技术，但是观察到所述途径可用于产生抗体。另一替代方式是使用一种或多种选择的VH和/或VL基因的随机诱变在整个可变区中产生突变，从而产生带有本发明的CDR-衍生的序列的新颖的VH或VL结构域。这样的技术描述于使用易错PCR的Gram等((1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：3576-80)中。可用于产生新颖抗体或其片段的另一方法是VH或VL基因的CDR的定向诱变。这类技术公开于Barbas等((1994)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：3809-13)和Schier等((1996)J.Mol.Biol.263：551-67)。
类似地，可以将一个、两个或所有三个CDR移植进VH或VL结构域的组成成分中，然后针对GDF8特异性结合配偶体或结合片段来筛选。大部分免疫球蛋白可变结构域会包含至少一个CDR，并任选地包含来自如本文公开的抗体片段的插入的框架区。所述部分还应包含至少约50％的FR1和FR4任一或二者，所述50％是FR1的C-端50％和FR4的N-端50％。大部分可变区N-端或C-端的其它残基可以是通常不与天然存在的可变结构域相关的残基。例如，通过重组DNA技术制造的本发明的特异性抗体或抗原结合蛋白片段的构建可导致由接头编码的N-端或C-端残基的引入，所述接头被引入用于简化克隆或其它操作步骤。如下文更详细描述的，其它操作步骤包括引入接头将本发明的可变区与其它蛋白质序列接合，所述其它蛋白质序列包括免疫球蛋白重链、其它可变结构域(例如在双抗体的生产中)或蛋白质标记。
尽管实施例中所列实施方式包括VH和VL结构域的“匹配”配对，但是本发明还包括含有衍生自VH或VL任一结构域(特别是VH结构域)序列的单个可变结构域的结合片段，例如dAb片段。在任一单链特异性结合结构域的情况下，这些结构域可用于筛选能够形成能够结合GDF8的双-结构域特异性抗原-结合结构域的互补结构域。这可通过使用如例如WO 92/01047中所公开的所谓的分级二元组合途径，通过噬菌体展示筛选方法来实现。在这一技术中，使用含有H或L链克隆的个体菌落来感染编码其它链(L或H)的克隆的完整文库，并根据噬菌体展示技术(例如所述参考文献中公开的技术)选择得到的双-链特异性抗原-结合结构域。这一技术还公开于Marks等，上文。
抗体可通过化学方法与放射性核素、药物、大分子或其它物质缀合，并可被制造成包含一个或多个本发明的CDR的融合蛋白。
抗体或抗原结合蛋白融合蛋白含有VH-VL对，其中这些链之一(通常是VH)和另一蛋白质作为单条多肽链被合成。这些类型的产物与抗体的区别在于它们通常具有额外的功能元件(例如小分子的活性部件或缀合或融合的大分子的主要分子结构特性)。
除了上文列出的对氨基酸序列的改变以外，抗体还可以被糖基化、PEG化、或与白蛋白或非蛋白质聚合物连接。例如，本文公开的抗体可与多种非-蛋白质聚合物例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧乙烯之一连接。抗体可被化学修饰，例如通过与聚合物共价缀合来提高它们的循环半衰期。示范性的聚合物和将它们与肽结合的方法是本领域已知的。
在其它实施方式中，可以将抗体或抗原结合蛋白修饰为具有改变的糖基化模式(即相对于原始或天然的糖基化模式而言)。在本文中使用时，“改变的”表示缺失了一个或多个碳水化合物部件，和/或对原始抗体添加了一个或多个糖基化位点。对本文公开的抗体添加糖基化位点通过改变氨基酸序列使其含有糖基化位点共有序列的公知方法完成。提高抗体上碳水化合物部件数量的另一手段是通过糖苷与抗体的氨基酸残基的化学偶联或酶促偶联。抗体上存在的任何碳水化合物部件的去除可以如本领域所已知的化学完成或酶促完成。
本发明的抗体也可以带有可检测的或功能性的标记例如131I或99Tc的标签，所述标签可使用本领域已知的常规方法与本发明的抗体结合。标记还包括酶标记，例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。标记还包括化学部件，例如生物素，其可以通过与特定的同源可检测部件(例如经标记的抗生物素蛋白)结合而被检测。
其中CDR序列与本文公开的抗体的CDR序列仅非实质性不同的抗体包括在本发明的范围内。非实质性的差异包括较少的氨基酸改变，例如CDR序列中任意五个氨基酸中一个或两个的替换。典型地，用具有类似电荷、疏水性或立体化学特征的相关氨基酸替换氨基酸。这类替换应当在技术人员的常规技术范围内。结构框架区(FR)可以比CDR更大量地被修饰而不不利地影响抗体的结合特性。对FR的改变包括但不限于人源化非人衍生的框架，或改造对抗原接触而言重要的或用于稳定结合位点的某些框架残基，例如改变恒定结构域的种类或亚类，改变可能改变效应器功能例如Fc受体结合的特定氨基酸残基(例如Lund等(1991)J.Immunol.147：2657-62；Morgan等(1995)Immunology 86：319-24)，或改变恒定结构域的来源物种。抗体可在重链的CH2结构域中具有降低或改变效应器功能(例如Fc受体结合和补体活化)的突变。例如，抗体可具有例如美国专利号Nos.5,624,821和5,648,260中所述的突变。抗体可具有稳定免疫球蛋白的两个重链之间二硫键的突变，例如如例如Angal等(1993)Mol.Immunol.30：105-08中公开的IgG4铰链区中的突变。
本发明的多肽和抗体还包括在结构上与公开的多肽和抗体不同的蛋白质，例如具有改变的序列但是具有与公开的多肽和抗体基本相同的生物化学特性的蛋白质，例如仅在对功能不重要的氨基酸中具有改变。这类分子包括含有改变、替换、置换、插入或缺失的天然存在的等位基因变体和人工改造的变体。用于这类改变、替换、置换、插入或缺失的技术是本领域技术人员公知的。
另外，本发明的抗体可以使用下述转基因非人动物生产，所述动物被修饰从而在应答抗原攻击时产生完全人抗体，而不是动物的内源抗体。参阅例如PCT公开WO 94/02602。非人宿主中编码免疫球蛋白重链和轻链的内源基因已被失活，并向宿主的基因组中插入编码人重链和轻链免疫球蛋白的活性基因座。例如，使用含有所需人DNA区段的酵母人工染色体掺入人基因。然后通过含有少于全部修饰的中间产物转基因动物的杂交育种(crossbreeding)，作为后代获得提供所有期望修饰的动物。这样的非人动物的一个实施方式是小鼠，并且称作XENOMOUSETM，如PCT公开WO96/33735和WO 96/34096中所公开的。所述动物生产分泌完全人免疫球蛋白的B细胞。可以在用感兴趣的免疫原(例如多克隆抗体制剂)免疫后从动物中，或者从来自于动物的永生化B细胞(例如生产单克隆抗体的)中直接获得抗体。另外，可以回收并表达编码具有人可变结构域的免疫球蛋白的基因，来直接获得抗体，或者可所述基因进一步修饰，获得抗体的类似物，例如单链Fv分子。
因此，本文中使用术语抗体或抗原结合蛋白包括完整抗体、抗体片段(例如Fab、F(ab’)2、Fd、dAb和scFv片段)和在其恒定和/或可变结构域任一中被突变(例如生产嵌合、部分人源化或完全人源化抗体以及生产具有期望的性状的突变，所述期望的性状例如为增强的GDF8结合和/或降低的FcR结合)的完整抗体和片段。同样，这些抗体或抗原结合蛋白包括在本发明的范围内，条件是所述抗体或抗原结合蛋白与GDF8特异性相互作用。
也可以使用其它蛋白质-结合分子来调控GDF8的活性。这类抗原结合分子包括小模块免疫药物(SMIPTM)(Trubion Pharmaceuticals，Seattle，WA)。SMIP是单-链的多肽，其由同源结构(例如抗原、反受体等等)的结合结构域、具有一个或不具有半胱氨酸残基的铰链-区多肽和免疫球蛋白CH2和CH3结构域组成。SMIP及其用途和应用公开于例如美国公开的专利申请Nos.2003/0118592、2003/0133939、2004/0058445、2005/0136049、2005/0175614、2005/0180970、2005/0186216、2005/0202012、2005/0202023、2005/0202028、2005/0202534和2005/0238646，及其相关专利家族成员，所有这些文件通过引用整体并入本文。
可以通过以下方法测量本发明的抗体或抗原结合蛋白的结合能力：如下文实施例中所述的Biacore分析、酶联免疫吸附检验(ELISA)、X-射线晶体学、序列分析和扫描诱变，和本领域中公知的其它方法。可以通过以下非限制性的方法列表来测量本发明的抗体或抗原结合蛋白抑制、降低和/或中和一种或多种GDF8-相关活性的能力：用于测量GDF8-依赖型细胞系增殖的检验；用于测量GDF8-介导的多肽表达的检验；测量下游信号转导分子活性的检验；测试本发明的抗体或抗原结合蛋白在相关动物模型中预防肌肉病症的效力的检验；如下文实施例中所述的检验；和本领域公知的其它检验。
本发明的另一方面提供了选择下述抗体的方法，所述抗体能够与GDF8特异性相互作用和/或特异性拮抗一种或多种GDF8活性。所述方法包括：将大量抗体与GDF8接触；选择与GDF8结合的第二大量抗体；测试所述第二大量抗体结合TGF-β超家族其它成员的能力；和从第二大量抗体中选择第三大量抗体，其中第三大量抗体以更小的亲和力与TGF-β超家族的其它成员结合。
在另一实施方式中，所述方法还包括下述步骤：测试第三大量抗体拮抗至少一种GDF8活性(例如阻止GDF8与GDF8受体结合)的能力；和选择能够拮抗一种或多种GDF8活性(例如阻止GDF8与其受体结合)的抗体。
本发明的抗-GDF8抗体还可用于分离、纯化和/或检测上清液、细胞裂解物或细胞表面上的GDF8。本发明中公开的抗体可在诊断上用于监测GDF8蛋白质水平，作为临床测试步骤的一部分。另外，本发明的抗体可在需要中和和/或抑制一种或多种GDF8-相关病症的治疗(例如用于肌肉相关病理学的治疗)中使用。本发明还提供了与针对人GDF8的新颖抗体相关的、新颖的经分离的和经纯化的多核苷酸和多肽。本发明的基因、多核苷酸、蛋白质和多肽包括但不限于GDF8的鼠和人源化抗体(例如RK22)及其变体。
拮抗剂重组多核苷酸和多肽
本发明还提供了下述经分离和经纯化的核酸作为特异性GDf8拮抗剂，所述核酸编码对GDF8特异的表位或其肽模拟物或其抗体，如上文所述。根据本发明的核酸可包含DNA或RNA，并可以是完全或部分合成的。除非上下文另有需要，本文公开的核苷酸序列包括具有指定序列的DNA分子或基因组等同物，以及其中用U替换T的具有指定序列的RNA分子。
经分离的本发明的多核苷酸，例如SEQ ID NOs：3、5、7、9、11、13和15可用作杂交探针和引物，来鉴定和分离下述核酸，所述核酸具有与编码公开的多核苷酸的核酸相同或相似的序列。作为一个非限制性的例子，可以使用在这一方式中使用抗体或抗原结合蛋白多核苷酸分离的多核苷酸，来生产鸩毒GDF8的特异性抗体，或鉴定表达这类抗体的细胞。用于鉴定和分离核酸的杂交方法包括聚合酶链式反应(PCR)、Southern杂交、原位杂交和Northern杂交，并且是本领域技术人员所公知的。
杂交反应可以在具有不同严格度的条件下进行。杂交反应的严格度包括两个核酸分子会彼此杂交的难度。优选地，每种用于杂交的多核苷酸在降低的严格度条件下、更优选地在严格条件下，最优选地在高严格度条件下与其相应的多核苷酸杂交。严格度条件的例子展示于下表3中：高严格度条件是至少与例如条件A-F同样严格的条件；严格条件是至少与例如条件G-L同样严格的条件；降低的严格度条件是至少与例如条件M-R同样严格的条件。
表3
  条件   杂合物   杂合物长度(bp)1   杂交温度和缓冲液2   洗涤温度和缓冲液2
  A   DNA:DNA ＞50   65℃；1XSSC-or-42℃；1X SSC，50％甲酰胺   65℃；0.3XSSC
  B   DNA:DNA ＜50   TB*；1X SSC   TB*；1X SSC
  C   DNA:RNA ＞50   67℃；1XSSC-or-45℃；1X SSC，50％甲酰胺   67℃；0.3XSSC
  D   DNA:RNA ＜50   TD*；1X SSC   TD*；1X SSC
  E   RNA:RNA ＞50   70℃；1XSSC-or-50℃；1X SSC，50％甲酰胺   70℃；0.3XSSC
  F   RNA:RNA ＜50   TF*；1X SSC   TF*；1X SSC
  G   DNA:DNA ＞50   65℃；4XSSC-or-42℃；4X SSC，50％甲酰胺   65℃；1X SSC
  H   DNA:DNA ＜50   TH*；4X SSC   TH*；4X SSC
  I   DNA:RNA ＞50   67℃；4XSSC-or-45℃；4X SSC，50％甲酰胺   67℃；1X SSC
  J   DNA:RNA ＜50   TJ*；4X SSC   TJ*；4X SSC
  K   RNA:RNA ＞50   70℃；4XSSC-or-50℃；4X SSC，50％甲酰胺   67℃；1X SSC
  L   RNA:RNA ＜50   TL*；2X SSC   TL*；2X SSC
  M   DNA:DNA ＞50   50℃；4XSSC-or-40℃；6X SSC，50％甲酰胺   50℃；2X SSC
  N   DNA:DNA ＜50   TN*；6X SSC   TN*；6X SSC
  O   DNA:RNA ＞50   55℃；4XSSC-or-42℃；6X SSC，50％甲酰胺   55℃；2X SSC
  P   DNA:RNA ＜50   TP*；6X SSC   TP*；6X SSC
  Q   RNA:RNA ＞50   60℃；4XSSC-or-45℃；6X SSC，50％甲酰胺   60℃；2X SSC
  R   RNA:RNA ＜50   TR*；4X SSC   TR*；4X SSC
1杂合物长度是出现在用于杂交的多核苷酸的杂交区域中的长度。将多核苷酸与具有未知序列的目标多核苷酸杂交时，杂合物长度被假设为用于杂交的多核苷酸的长度。杂交具有已知序列的多核苷酸时，杂合物长度可以通过比对多核苷酸的序列并鉴定具有最优序列互补性的一个或多个区域来测定。
2在杂交和洗涤缓冲液中SSPE(1xSSPE是0.15M NaCl、10mMNaH2PO4和1.25mM EDTA，pH 7.4)可以被替换为SSC(1xSSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)；在杂交完成后进行15分钟的洗涤。
TB*-TR*：参与的杂合物长度少于50个碱基对的杂交温度应当比所述杂合物的解链温度(Tm)低5-10℃，其中Tm根据以下等式测定。对于长度少于18个碱基对的杂合物而言，Tm(℃)＝2(#A+T碱基)+4(#G+C碱基)。对于长度在18和49个碱基对之间的杂合物而言，Tm(℃)＝81.5+16.6(log10Na+)+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N是杂合物中的碱基数量，Na+是杂交缓冲液中钠离子的浓度(1X SSC的Na+＝0.165M)。
用于多核苷酸杂交的严格度条件的其它例子在Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Chs.9 & 11，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)和Ausubel等，eds.，CurrentProtocols in Molecular Biology，Sects.2.10 & 6.3-6.4，John Wiley & Sons，Inc.(1995)中提供，所述参考文献通过引用并入本文。
经分离的本发明的多核苷酸可用作杂交探针和引物，来鉴定和分离下述DNA，所述DNA具有编码所公开的多核苷酸的等位基因变体的序列。等位基因变体是所公开的多核苷酸的天然存在的替代形式，其编码与公开的多核苷酸编码的多肽相同或具有显著相似性的多肽。优选地，等位基因变体与公开的多核苷酸具有至少90％的序列同一性(更优选地，至少95％的同一性；最优选地，至少99％的同一性)。
经分离的本发明的多核苷酸也可用作杂交探针和引物，来鉴定和分离下述DNA，所述DNA具有编码与公开的多核苷酸同源的多肽的序列。这些同源物是从与所公开的多肽和多核苷酸不同的物种或相同的物种中分离的多核苷酸和多肽，但是与所公开的多核苷酸和多肽具有显著的序列相似性。优选地，多核苷酸同源物与所公开的多核苷酸具有至少50％的序列同一性(更优选地至少70％的同一性；最优选地，至少90％的同一性)，而多肽同源物与所公开的抗体/多肽具有至少30％的序列同一性(更优选地，至少45％的同一性；最优选地，至少60％的同一性)。优选地，所公开的多核苷酸和多肽的同源物是从哺乳动物物种中分离的多核苷酸或多肽。
经分离的本发明的多核苷酸也可以用作杂交探针和引物，来鉴定表达本发明的GDF8特异性表位或抗体的细胞和组织，以及它们被表达的条件。
另外，经分离的本发明的多核苷酸可用于改变(即增强、降低或修饰)对应于本发明多核苷酸的基因在细胞或生物中的表达。这些“相应基因”是本发明的基因组DNA序列，其被转录产生mRNA，本发明的多核苷酸来自于所述mRNA。
本发明相关序列在细胞或生物中的改变的表达可以通过使用多种抑制性多核苷酸(例如反义多核苷酸、结合和/或切割本发明基因转录而来的mRNA的核酶、靶向基因调节区的形成三联体的寡核苷酸，和引起靶mRNA的序列-特异性降解的短干扰RNA)来实现(例如Galderisi等(1999)J.Cell.Physiol.181：251-57；Sioud(2001)Curr.Mol.Med.1：575-88；Knauertand Glazer(2001)Hum.Mol.Genet.10：2243-51；Bass(2001)Nature411：428-29)。这类抑制性多核苷酸被认为是本发明的拮抗剂。技术人员应当明白，本发明的抑制性多核苷酸应当针对上文提供的GDF8特异性的表位(而不是本发明的拮抗剂抗体)。
本发明包括的形成三联体的抑制性寡核苷酸(TFOs)以高特异性和亲和力结合在双链体DNA的大沟中(Knauert和Glazer，上文)。本发明基因的表达可以被与基因调节区(即启动子和/或增强子序列)互补的靶向TFO抑制，形成阻止基因转录的三螺旋结构。
在本发明的一个实施方式中，本发明的抑制性多核苷酸是短干扰RNA(siRNA)分子(参阅例如Galderisi等(1999)J.Cell Physiol.181：251-57；Sioud(2001)Curr.Mol.Med.1：575-88)。这些siRNA分子是引起靶向的mRNA的序列特异性降解的短双链体RNA分子。这一降解已知为RNA干扰(RNAi)(例如Bass(2001)Nature 411：428-29)。最初在低等生物中鉴定的RNAi已被有效应用于哺乳动物细胞中，并且最近显示在用靶向FasmRNA的siRNA分子处理的小鼠中阻止爆发肝炎(Song等(2003)NatureMed.9：347-51)。另外，最近报道鞘内递送siRNA在大鼠中的两种模型(激动剂-诱导的疼痛模型和神经病疼痛模型)中阻断疼痛应答(Dorn等(2004)Nucleic Acids Res.32(5)：e49)
本发明的siRNA分子的双链体结构可包含一条或多条聚合的RNA链，即双链体结构可以由包含发夹环或两条互补链的单一-自身互补的RNA链形成。还发现相对于靶向的序列而言具有插入、缺失和单点突变的siRNA序列有效抑制靶向的序列的表达(Fire等，美国专利No.6,506,559)因此，优选本发明的siRNA分子包含下述核苷酸序列，所述核苷酸序列与对应于靶向的本发明GDF8特异性表位的mRNA的至少一部分具有显著的序列同一性。例如，本发明的siRNA分子的双链体区与对应于靶向的GDF8特异性表位的mRNA的至少部分可具有大于90％的序列同一性，优选地具有100％的序列同一性。或者，显著的序列同一性可以被定义为siRNA分子双链体区的至少一条链与靶向的GDF8特异性表位的至少一部分在至少例如在上表3中被定义为条件G-L的严格条件下杂交的能力。在本发明的一个优选但是非限制性的实施方式中，siRNA分子在高度严格条件(例如至少与上表3中的条件A-f同样严格的条件)下与靶向的GDF8特异性表位的至少一部分杂交。基本相同的核苷酸序列的长度可以至少为10、15、19、21、23、25、50、100、200、300、400或500个核苷酸，优选地为19-27个核苷酸，最优选地为19或21个核苷酸(参阅Fire，等，上文)。
本发明的抑制性多核苷酸可以基于本领域公知的标准(例如Elbashir等(2001)EMBO J.20：6877-88)和/或通过使用公知的算法(例如公众和获得的算法)来设计。例如，本发明的抑制性多核苷酸的靶向部分(例如siRNA分子的双链体区域)优选地应当以AA(最优选的)、TA、GA或CA开始；本发明的siRNA分子优选地应当包含其中GC比例为45-55％的序列；本发明的siRNA分子优选地应当不含有连续的三个相同的核苷酸；本发明的siRNA分子优选地应当不连续含有七个混合的G/C。基于这些标准或者其它已知的标准(例如Reynolds等(2004)Nat.Biotechnol.22：326-30)，靶向GDF8特异性表位的本发明的siRNA分子可以由本领域常规技术人员设计。例如，在一个实施方式中，本发明的siRNA分子可具有下述核苷酸序列和/或基本由其组成，所述核苷酸序列选自SEQ ID NO：3的核苷酸序列、SEQ ID NO：5的核苷酸序列、SEQ ID NO：7的核苷酸序列、SEQ ID NO：9的核苷酸序列、SEQ ID NO：11的核苷酸序列及其片段。在这一实施方式中，本发明的siRNA分子还包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列的互补体、SEQ ID NO：5的核苷酸序列的互补体、SEQ ID NO：7的核苷酸序列的互补体、SEQ ID NO：9的核苷酸序列的互补体、SEQ ID NO：11的核苷酸序列的互补体，及其片段的互补体。
例如，可以通过将两条互补的单-链RNA分子退火在一起(Fire等，上文)或通过使用单发夹RNA分子产生本发明的siRNA分子，所述单发夹RNA分子自身折叠产生必需的双-链部分(Yu等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：6047-52)。siRNA分子可以化学合成(Elbashir等(2001)Nature 411：494-98)或使用单-链DNA模板通过体外转录生产(Yu等，上文)。或者，可以使用下述表达载体瞬时(Yu等，上文；Sui等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：5515-20)或稳定(Paddison等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：1443-48)地生物生产siRNA，所述表达载体包含相对于其启动子而言为有义和/或反义方向的与本发明相关的多核苷酸。重组RNA聚合酶可以被用于体内或体外转录，或经修饰的细胞的内源RNA聚合酶可以介导体内转录。最近，使用表达发夹RNA(其被进一步加工成siRNA分子)的腺病毒证实初原人细胞中靶mRNA水平以有效和序列特异性的方式降低(Arts等(2003)Genome Res.13：2325-32)。
可以使用化学合成和酶连接反应(包括本领域公知的步骤)构建本发明的抑制性多核苷酸。经化学合成的多核苷酸的核苷链接可以被修饰，来增强它们抗核酸酶-介导的降解的能力，避免一些生物中由双链体RNA产生的普遍恐慌性应答(general panic response)，和/或提高它们的序列特异性。这类链接修饰包括但不限于硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、氨基磷酸盐(phosphoroamidate)、硼酸磷酸盐(boranophosphate)、吗啉代和肽核酸(PNA)链接(Galderisi等，上文；Heasman(2002)Dev.Biol.243：209-14；Micklefield(2001)Curr.Med.Chem.8：1157-79)。
如上文所述，与本发明相关的经分离的多核苷酸或其连续部分可以有义或反义方向与表达控制序列可操作地连接和/或被连接进用于本发明的抑制性多核苷酸(例如siRNA分子)的重组表达的表达载体中。
本发明还提供了质粒、载体、转录或表达盒形式的构建体，所述构建体包含至少一种上述本发明的核酸。
本发明的经分离的多核苷酸可与表达控制序列可操作地连接，用于重组生产本发明的特异性表位(例如肽模拟物)或抗体。另外，本领域技术人员应当明白，本发明的抗体或抗原结合蛋白编码多核苷酸可与编码多种抗体同种型恒定区的公知核苷酸序列可操作地连接。例如，编码本发明的轻链可变区的本发明的多核苷酸(例如具有如SEQ ID NO：15中公开的核苷酸序列的多核苷酸)可与编码κ轻链或λ轻链任一的恒定区(或其衍生物)的核苷酸序列可操作地连接，使得连接的核苷酸的表达会得到具有与GDF8特异性相互作用和/或特异性拮抗GDF8的可变结构域的全长κ轻链或λ轻链。类似地，编码本发明的重链可变结构域的本发明的多核苷酸(例如具有如SEQ ID NOs：13所公开的核苷酸序列的多核苷酸)可与编码重链同种型(或其衍生物)例如IgM、IgD、IgE、IgG和IgA的恒定区的核苷酸序列可操作地连接。表达重组蛋白质的一般方法是本领域公知的。这类重组蛋白质可以是用于治疗GDF8相关病症的可溶形式。本发明的重组表达载体可带有额外的序列，例如调节宿主细胞中载体复制的序列(例如复制起点)、标签序列例如组氨酸和可选择的标记物基因。可选择的标记物基因有助于引入了所述载体的宿主细胞的选择。例如，典型地，可选择的标记物基因对引入了所述载体的宿主细胞赋予对药物例如G418、潮霉素或甲氨喋呤的抗性。优选的可选择标记物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于用甲氨喋呤选择/扩增的dhfr宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。
可以选择或构建合适的载体，所述载体含有适当的调控序列，适当地包括启动子序列、终止子序列、多聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记物基因和其它序列。载体可以适当地是质粒或病毒，例如噬菌体或噬菌粒。更多的细节参阅例如Molecular Cloning：a Laboratory Manual：2nd ed.，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。用于操作核酸(例如制备核酸构建体、诱变、测序、将DNA引入细胞和基因表达，和蛋白质分析)的许多已知技术和方案详细描述于Current Protocols in Molecular Biology，2nd ed.，Ausubel等eds.，John Wiley & Sons，1992中。
本发明还提供了包含一种或多种上文构建体的宿主细胞，例如编码任何GDF8特异性表位、CDR(H1、H2、H3、L1、L2或L3)、VH结构域、VL结构域或本文提供的特异性抗原-结合片段的核酸形成了本发明的一个方面。
本发明还包括通过在宿主细胞中由编码核酸表达蛋白质来生产肽的方法。可以通过在适当的条件下培养含有所述核酸的重组宿主细胞来实现表达。
多种细胞系是对本发明的多肽和抗体的重组表达而言合适的宿主细胞。哺乳动物宿主细胞系包括但不限于：COS细胞、CHO细胞、293T细胞、A431细胞、3T3细胞、CV-1细胞、HeLa细胞、L细胞、BHK21细胞、HL-60细胞、U937细胞、HaK细胞、Jurkat细胞以及来自初原组织和初原外植体的体外培养物的细胞株系。这类宿主细胞还允许剪接由基因组DNA组成的本发明的多核苷酸。
或者，可能在低等真核生物例如酵母或原核生物中重组生产本发明的多肽和抗体。可能合适的酵母菌株包括但不限于Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces菌株和Candida菌株。可能合适的细菌菌株包括Escherichia coli、Bacillus subtilis和Salmonella typhimurium。如果本发明的多肽在酵母或细菌中制造，则可能必须通过例如适当位点的磷酸化或糖基化来修饰它们，从而获得功能蛋白质。这类共价结合可以使用公知的化学或酶促方法来完成。
也可以通过在一个或多个昆虫表达载体(例如杆状病毒载体)中将经分离的本发明的多核苷酸与合适的控制序列可操作地连接并使用昆虫细胞表达体系来重组生产本发明的多肽和抗体。用于杆状病毒/Sf9表达体系的材料和方法可以试剂盒的形式商业获得(例如试剂盒，Invitrogen，Carlsbad，CA)。
在适当的宿主细胞中重组表达后，可以使用已知的纯化方法(例如凝胶过滤和离子交换色谱)，从培养基或细胞提取物中纯化本发明的多肽和抗体。纯化也可包括用已知结合本发明多肽和抗体的试剂进行亲和色谱。这些纯化方法也可用于从天然来源中纯化本发明的多肽和抗体。
或者，可以以便于纯化的形式重组表达本发明的多肽和抗体。例如，多肽可以作为与蛋白质例如麦芽糖-结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或硫氧还蛋白(TRX)的融合物来表达。用于表达和纯化这类融合蛋白的试剂盒可分别从New England BioLabs(Beverly，MA)、Pharmacia(Piscataway，NJ)和Invitrogen商业获得。本发明的多肽和抗体也可以加上小表位标签，随后使用对所述表位特异性的抗体或抗原结合蛋白鉴定或纯化。一种优选的表位是FLAG表位，其可从Eastman Kodak(New Haven，CT)商业获得。
本发明的多肽和抗体也可以通过已知的常规化学合成来生产。用于化学合成本发明多肽和抗体的方法是本领域技术人员公知的。这类化学合成的多肽和抗体可具有与天然经纯化的多肽和抗体共有的生物特性，因此可用作天然多肽和抗体的生物活性或免疫替代物。
本发明的另一方面提供了包含如本文公开的核酸、多肽、载体或抗体及其片段的宿主细胞。又一方面提供了包括将本发明的核酸引入宿主细胞中的方法。所述引入可使用任何可用的技术。对真核细胞而言，合适的技术可包括磷酸钙转染、DEAE Dextran、电穿孔、脂质体-介导的转染和使用逆转录病毒或其它病毒(例如牛痘，或对昆虫细胞而言杆状病毒)的转导。对细菌细胞而言，合适的技术可包括氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体的感染。
核酸的引入之后可以引起或允许从所述核酸生产蛋白质，例如通过在适合基因表达的条件下培养宿主细胞来实现。这类条件是本领域公知的。
根据本发明的抑制性多肽、GDF8的特异性表位(例如作为肽模拟物和/或免疫原)、特异性抗体或抗原结合蛋白片段、VH结构域、和/或VL结构域、和编码的核酸分子和载体可以如下提供：例如从其天然环境中经分离和经纯化的，以基本纯净或同质的形式，或者在核酸的情况下不含或基本不含除了编码具有所需功能的多肽的序列之外的其它来源核酸或基因。
检测和定量生物样品中GDF8的方法
本发明涉及检测和定量生物样品中GDF-8的方法。在一些实施方式中，所述方法包括检测和定量血清、血和血浆中游离GDF-8和总GDF-8的免疫检验。在一种情况下，免疫检验提供了可用作抗-GDF-8疗法的生物标记的数据。特别地，所公开的免疫检验可用作抗-GDF-8疗法之前基线处临床结果的预测/预示标记物，用作对抗-GDF-8疗法的暴露的标记物，用作抗-GDF-8药物效力或应答的标记物，和用作具体疾病状态或生物学过程中GDF-8涉及的诊断标记物。
具体地，所述方法提供了用于在患有GDF-8相关疾病或病症或处于发生所述疾病或病症风险下的哺乳动物中，检测、诊断和预测GDF-8相关疾病或病症的诊断和/或预测性方法。所述方法特别适用于评价人患者接受GDF-8调节剂(例如结合GDF-8或抑制GDF-8生物活性的调节剂)的适应性。
在某些实施方式中，本发明提供了监测下述个体进展的方法，所述个体接受GDF-8调节剂或抗-GDF-8疗法。例如，提供了评价患者对使用GDF-8调节剂的疗法应答的方法。为了评价个体对疗法的应答，可以在施用GDF-8调节剂之前、期间和之后提供免疫检验方法。检测接受治疗性抗体MYO-029的哺乳动物中GDF-8存在的方法也包括在本发明内。
在一个实施方式中，本发明的免疫检验方法检测游离的GDF-8。例如，游离的GDF-8是不与GDF-8结合蛋白或GDF-8调节剂(例如GDF-8结合或中和抗体)结合的GDF-8。在另一实施方式中，提供了检测总GDF-8(例如游离GDF-8加上任何结合的GDF-8)的方法。
患有肌肉-相关病症或处于发生所述病症风险下的个体是本文提供的方法的候选者。GDF-8活性的抑制提高了个体(包括患有肌肉-相关病症的个体)中的肌肉质量。大量病症与功能受损的肌肉组织相关，例如肌营养不良、肌萎缩侧索硬化(ALS)、肌肉萎缩、器官萎缩、虚弱、充血性阻塞性肺病、心力衰竭、老年性肌肉萎缩、恶病质和其它疾病和病症引起的肌肉消耗综合征。另外，期望提高肌肉质量或肌肉强度、提高原料动物中生长或肌肉组织质量的个体或哺乳动物是本文提供的方法的候选者。
患有脂肪组织、代谢或骨-相关病症或状况或处于发生所述病症或状况风险下的个体也是本文所述和要求保护的方法的候选者。这类病症或状况包括与葡萄糖内稳态相关的病症或状况，例如2型糖尿病、代谢综合征(例如综合征X)、例如创伤如烧伤或氮失衡诱导的胰岛素抗性和脂肪组织病症(例如肥胖症)的发生(Kim等，Biochem.Biophys.Res.Comm.281：902-906(2001))。例如，GDF-8调控前脂肪细胞分化成为脂肪细胞(Id.)并抑制从间质前体细胞和前脂肪细胞形成脂肪细胞(Rebbapragada等，Mol.Cell Bio.23：7230-7242(2003))。在GDF-8敲除小鼠和全身性施用GDF-8蛋白质的野生型成年小鼠中，脂肪累积均降低(McPherron等，J.Clinical Invest.109：595-601(2002)；Zimmers等，Science 296：1486-1488(2002))。
本发明方法的其它用途应是本领域技术人员明白的，并且在下文进一步例证。
免疫检验
本文所述的免疫检验是利用至少两种抗-GDF-8抗体的夹层-型ELISA；一种抗体作为GDF8特异性的GDF-8捕获试剂存在，一种抗体作为GDF8特异性的GDF-8检测试剂存在。两种抗体均能够结合生物样品中存在的GDF-8抗原。所述抗体之一优先识别GDF-8超过BMP-11。两种抗体均能够识别和结合GDF-8。另外，在某些实施方式中，抗体能够结合以其任何生物形式(例如活性GDF-8、潜伏的GDF-8、与血清蛋白质结合的GDF-8、与中和性抗-GDF-8抗体MYO-029)存在的GDF-8。
在某些实施方式中，受试者检验中使用的抗体是R35(见SEQ IDNO：s 31-35和美国申请US2007/0087000，所述申请通过应用并入本文)，其为结合GDF-8的经分离的鼠单克隆抗体。在一些实施方式中，使用RK35作为捕获抗体。结合GDF-8的RK35的片段也可以用于本发明的方法中。
在某些实施方式中，受试者检验中使用的第二种抗体是RK22——结合GDF-8的经分离的鼠单克隆抗体。如下文所例证的，RK22不结合BMP-11。在一些实施方式中，使用RK22作为检测试剂。在一些实施方式中，使用其作为捕获试剂。结合GDF-8的RK22片段也可用于本发明的检验中。
在另一实施方式中，本发明的免疫检验使用抗体MYO-029，其为人IgG1抗-GDF-8抗体。MYO-029(参阅SEQ ID NO：s 33和34，美国公开的申请2006/0240488和2006/0240487，所述申请通过引用并入本文)可用于封闭免疫检验中GDF-8的检测，从而获得背景水平，可从不存在MYO-029时产生的信号中减去所述背景水平。这一实施方式可被用于提高定量检验的灵敏度和准确度。
可用于本发明方法中的抗体还包括抗原-结合片段，例如由VH和VL结构域组成的Fv片段，由通过恒定区之间的二硫键共价连接的VH-CH1和VL-CL结构域组成的Fab片段(抗原结合片段)。对于其它可能的抗原结合片段和抗体结构的综述，参阅Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，eds.Harlow等，1988。
用编码非种系化scFv′s MYO-029的噬菌粒载体pCANTAB6个别转化的E.coli培养物在2002年10月2日以各自的保藏名称号PTA-4741保藏于美国组织培养物保藏中心(ATCC)。所述保藏机构的地址是10801University Blvd，Manassas，VA 20110，美国。
将含有GDF8的样品与捕获试剂合并后，可以通过洗涤去除任何未-结合的组分，然后在合适的结合条件下将组分与怀疑含有GDF-8的样品接触。洗涤去除任何未-结合的分子后，在合适的结合条件下添加第二种抗-GDF-8抗体。所述第二种抗体被称作检测抗体或检测试剂。检测抗体可包含可检测的标记，并结合已与捕获抗体反应的分子。因此，存在的任何GDF-8会与结合了样品中GDF-8的捕获试剂以及检测抗体试剂二者结合。通过洗涤去除未结合的分子和组分。因此，标记的存在指出生物样品中GDF-8的存在。
更具体地，可以使用夹层ELISA方法。含有或怀疑含有GDF-8的生物样品是GDF8特异性的捕获试剂。在足以允许GDF-8与捕获试剂结合的孵育时间段后，可以洗涤平板去除未结合的组分，并添加检测组分。允许这些分子与任何捕获的样品GDF-8反应，使用本领域公知的方法洗涤平板并检测标记的存在。
上述检验试剂(包括使用抗原的免疫检验，以及要与被捕获的样品反应的抗体)可以在具有合适的说明书和其它必需试剂的试剂盒中提供，从而进行上文所述的免疫检验。取决于使用的具体免疫检验，所述试剂盒还可含有合适的标记和其它包装的试剂和材料(即洗涤缓冲液等等)。可以使用这些试剂盒进行免疫检验，例如上文所述的免疫检验。
免疫检验的特定实施方式
游离GDF-8的分析
在一个实施方式中，本发明包含用于检测生物样品中游离GDF-8存在的方法。这一实施方式的一个代表性例子展示于图21中。
在本文中使用时，术语游离GDF-8包括以其活性、成熟状态存在的GDF-8。成熟的GDF-8可以是单体、二聚体或同二聚体。游离的GDF-8不包括潜伏的GDF-8(即与GDF-8前肽结合的成熟GDF-8)、与GDF-8结合蛋白结合的GDF-8、或与抗-GDF-8调节剂(例如GDF-8结合和中和抗体)结合的GDF-8。
在一个实施方式中，检测和定量游离GDF-8的方法包括以下步骤：(a)在下述条件下将GDF-8捕获抗体和样品合并，当生物样品中存在GDF-8时所述条件允许其与一种或多种捕获抗体结合形成捕获抗体-GDF-8复合物；添加结合捕获抗体-GDF-8复合物的检测抗体；和(b)如果有的话，检测捕获抗体-GDF-8复合物和检测抗体之间形成的复合物，作为生物样品中GDF-8的指征。
检测抗体或抗原结合蛋白可还包含可检测的标记。在一些情况下，检测抗体未经标记，并且使用特异性识别所述检测抗体的检测剂。
分析总GDF-8
在一个实施方式中，本发明包含检测生物样品中总GDF-8存在的方法。
在本文中使用时，术语总GDF-8包括以其或活性、成熟状态存在的GDF-8，和以其潜伏形式存在的任何GDF-8(即与GDF-8前肽结合的成熟GDF-8)，与GDF-8结合蛋白结合的GDF-8，或与抗-GDF-8调节剂(例如GDF-8结合和中和抗体)结合的GDF-8。总GDF-8的测量包括与治疗性抗体MYO-029结合的GDF-8的测量。
酸解离
在一个实施方式中，检测和定量总GDF-8的方法利用酸解离方法，并且包括以下步骤：(a)在酸性条件(约pH 1.0到约pH 6.0之间，优选地为约pH 2.5)下将GDF-8捕获抗体和生物样品合并，当生物样品中存在GDF-8时所述条件允许其与一种或多种捕获抗体结合形成捕获抗体-GDF-8复合物；在形成复合物的条件下添加GDF-8检测抗体，其中所述检测抗体结合所述捕获抗体-GDF-8复合物；和(b)如果有的话，检测捕获抗体-GDF-8复合物和检测抗体之间形成的复合物，作为生物样品中GDF-8的指征。
检测抗体或抗原结合蛋白可还包含可检测的标记。在一些情况下，检测抗体未经标记，并且使用特异性识别所述检测抗体的检测剂。
热解离
在另一实施方式中，检测和定量总GDF-8的方法利用热解离方法，并且包括以下步骤：(a)使GDF-8捕获抗体或抗原结合蛋白与固体支持物表面接触；(b)将生物样品在至少63℃下，例如65℃、70℃、75℃、80℃、85℃或90℃下加热至少3分钟，例如5、7、9、10、12、14或15分钟，并在下述条件下将生物样品与固体支持物合并，当生物样品中存在GDF-8时所述条件允许其与一种或多种捕获抗体结合形成捕获抗体-GDF-8复合物；(c)在形成复合物的酸性条件下向来自步骤(b)的固体支持物添加检测抗体，其中所述检测抗体结合捕获抗体-GDF-8复合物；和(d)如果有的话，检测捕获抗体-GDF-8复合物和检测抗体之间形成的复合物，作为生物样品中GDF-8的指征。
检测抗体或抗原结合蛋白可还包含可检测的标记。在一些情况下，检测抗体未经标记，并且使用特异性识别所述检测抗体的检测剂。
这一方法的一个实施方式展示于图12中，其中展示了抗体MYO-029抑制检测抗体(例如经生物素化的-RK22)产生的信号。在这种方式下，可以计算检验背景并从步骤(d)中获得的数值中减去。
分析游离GDF-8和总GDF-8的替代性实施方式
在某些实施方式中，例如通过与表面共价或非共价结合，使捕获抗体与固体支持物或试管的表面接触。所述接触可以是直接或间接的。可以通过化学或辐射处理修饰所述表面，来影响表面的结合特征。
在某些实施方式中，将捕获抗体与生物样品接触后，洗涤去除未结合的组分。可以用封闭步骤最小化非-特异性的相互作用，所述步骤中向试管中添加包含至少一种封闭剂(例如不特异性结合靶标的蛋白质)的缓冲液。封闭缓冲液可包括例如可商业获得的封闭缓冲液、血清、牛血清白蛋白、乳、酪蛋白、明胶和/或非-离子洗涤剂。在一些实施方式中，用pH在约5和约9之间的缓冲液(例如柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液、Tris缓冲液或乙酸缓冲液)洗涤试管。或者，在例如检测和定量总GDF-8的酸解离方法中，缓冲液在约pH 3.0和pH 5.0之间。
在本发明方法中要检测的生物样品可选自血清、血、血浆、活组织检查样品、组织样品、细胞悬浮液、唾液、口腔流体、脑脊液、羊水、乳、初乳、乳腺分泌物、淋巴、尿、汗、滑液和泪液。在某些实施方式中，生物样品是流体。在一些实施方式中，生物样品选自血、血清和血浆。在特定的实施方式中，生物样品是血清，例如人、猴、大鼠、小鼠、牛、羊或鸡血清。
在其它一些实施方式中，生物样品从一个或多个个体中分离，并在测试前任选地被处理。例如，样品可以被稀释。稀释缓冲液可任选地包含恒定量的对照生物样品，所述对照生物样品被选择为对应于测试生物样品，例如用于控制背景效应或干扰样品基质。在一个实施方式中，在THST(50mM Tris-HCl，pH 8.0，含有1.0mM甘氨酸、0.5M NaCl和0.05％(v/v)Tween
Figure BPA00001176820000671
)缓冲液中1∶8稀释人血浆的测试样品，并在添加了12.5％已清除GDF-8的人血清的THST中制备超过8-倍的生物样品的稀释液。可以将生物样品大致稀释2、4、5、8、10、12、14、15、16、32、64或128-倍。在其它实施方式中，将生物样品系列稀释1∶1.5或1∶1.6，获得允许验证稀释线性和基质效应(matrix effects)的数据点范围。
稀释剂无具体限制，但是可包括血清，包括例如人血清、已清除GDF-8的人血清、小鼠血清、已清除GDF-8的小鼠血清、去离子水或在pH约3.0到pH约9.0的范围内具有缓冲作用的多种缓冲液，取决于所述检验是否在酸性条件下进行。对于在中性pH下进行的游离GDF-8的分析而言，pH为约6.5到约8.5，约6.5到约7.0，约7.0到约7.5，约7.5到约8.0，或约8.0到约8.5(例如柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液、Tris缓冲液、乙酸缓冲液或硼酸缓冲液)。对在酸性pH下进行的总GDF-8的分析而言，pH为例如约1.0到约2.5、约2.5到约5.5、约2.5到约3.0、约3.0到约3.5、约3.5到约4.0、约4.0到约4.5、或约4.5到约5.5、约5.5到约6.5.
在一些实施方式中，可以使用公知方法将生物样品任选地分级或浓缩，然后添加至本文所述的检验中来检测GDF-8。例如，如果基质干扰限制检验中GDF-8调节剂的检测，则可以使用分级(包括纯化)或浓缩。分级和浓缩技术包括但不限于离心、硫酸铵沉淀、聚乙二醇沉淀、三氯乙酸(TCA)沉淀、亲和技术(例如使用与特定结合配偶体例如抗体、例如抗-GDF-8抗体缀合的树脂的免疫沉淀)、色谱技术和其它分离技术。
生物样品可从天然个体或施用GDF-8调节剂之前、期间或之后采取的生物样品中收集。例如，样品可以得体施用GDF-8调节剂后1、2、4、6、7、8、10、12、14、15、20、25、30或更多天的个体。生物样品也可以在施用GDF-8调节剂后1、2、3、4、6、7、8、10、12、14、16或更多周获得。在一些情况下，多达一年或更多的时间点是适当的。可针对游离和总GDF-8测试生物样品。在用GDF-8调节剂治疗的个体中总GDF-8的分析尤其重要，因为这些调节剂干扰检测或捕获剂结合生物样品中GDF-8的能力。因此，在总GDF-8的分析中利用的酸或热解离方法变得尤其重要。
在某些实施方式中，将要测试的生物样品的小份试样与捕获抗体或抗原结合蛋白接触，并在合适条件(例如23℃)下孵育足够的时间段(例如2-120分钟或1-4小时)，以允许捕获抗体与生物样品中存在的GDF-8(如果有的话)结合，并允许形成抗体/GDF-8复合物。在其它实施方式中，GDF-8/抗体反应在常规用于一般免疫检验的条件下进行。典型的步骤包括在不高于45℃、例如约4℃和约40℃之间、或约23℃和约40℃之间的温度下，孵育或允许下述反应体系进行约0.5和40小时之间、例如约1和约20小时之间，所述反应体系包含捕获抗体和生物样品。
在孵育时间段后，在一些实施方式中用缓冲液洗涤抗体/GDF-8复合物，去除未结合的溶质。在其它实施方式中进行同时检验，其中向试管中同时添加生物样品和检测抗体。
在生物样品后添加检测抗体的具体的实施方式中，步骤可包括在不高于45℃、例如约4℃和约40℃之间、或约23℃和约40℃之间的温度下，孵育或允许下述反应体系进行约0.5和40小时之间、例如约1和约20小时之间，所述反应体系包含抗体/GDF-8复合物和检测抗体。
在一些实施方式中，检测抗体、抗原结合蛋白或其片段包含可检测的标记。在其它实施方式中，例如通过检测剂直接检测检测抗体。在一些实施方式中，检测剂是过量的，使得基本上所有存在于试管中的抗体被结合。
在一些实施方式中，“直接”标记可以是与特定结合成员结合或缀合的任何分子，所述分子能够自发生产可检测的信号而不需添加辅助试剂。一些例子包括放射性同位素(例如125I、3H、14C)，荧光团(例如萤光素酶、绿色荧光蛋白、异硫氰酸荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明、1-N-(2，2，6，6-四甲基-1-氧基-4-哌啶基)-5-N-(天冬氨酸)-2，4-二硝基苯)，染料(例如藻蓝蛋白、藻红蛋白、得克萨斯红、邻苯二醛)，发光分子(包括化学发光和生物发光分子)，胶体金颗粒，胶体银颗粒，其它胶体金属颗粒，聚苯乙烯染料颗粒，微小的有色颗粒(minute colored particles)例如染料溶胶(dye sols)和有色的胶乳颗粒。许多其它合适的标记分子是本领域技术人员公知的，并可用于本发明的方法中。
在某些情况下，标记可以是酶，例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶或β-半乳糖苷酶。在多种实施方式中，要与特定酶一起使用的底物被选择为用于在存在相应酶时产生颜色、荧光或发光的可检测改变。所述酶可以通过戊二醛或还原性氨基化交联与抗体或抗原结合蛋白缀合。然而，如显而易见的，存在大量多种不同的缀合技术，并且可被技术人员容易获得。
在一个优选的实施方式中，检测抗体或抗原结合蛋白被生物素化。适合用作检测抗体的抗-GDF-8抗体可如实施例(参阅例如实施例1：第I节，第5小节)中所公开地被生物素化。多种经生物素化的试剂能够有效地标记蛋白质，包括抗体。生物素衍生物与抗体的摩尔比可约为10、15、20、40或80比1，反应时间反应物浓度和温度可以改变，来调节反应中掺入的生物素的量。生物素衍生物是本领域公知并可获得的，包括多种间隔臂、影响溶解度的修饰和/或允许切割生物素部件的反应性基团。例如，生物素及其衍生物的琥珀酰亚氨基(Succinimidyl)酯，包括水溶性硫代琥珀酰亚氨基酯可用于GDF-8的生物素化。为了定量掺入的生物素量，使用公知的分析和校准(sizing)技术，包括例如反相高压液相色谱、质谱等等。另外，可获得通过例如比色(colorimetric)或荧光检验定量的商业试剂盒(参阅例如EZTM生物素定量试剂盒，Pierce，utilizing HABA(2-(4’-羟基偶氮苯)-苯甲酸))。
在一个实施方式中，经生物素化的RK-22是用于检测GDF-8与RK35结合的检测剂。
在一个具体的实施方式中，向GDF-8/抗体复合物添加经生物素化和/或酶-标记的检测剂(例如抗体或抗原结合蛋白)，并允许其结合。洗去过量的试剂，然后向试管中添加含有适当底物的溶液。底物经历酶-催化的反应，导致可用分光光度计测量的改变，所述改变指示了样品中的GDF-8量。
例如，经生物素化的检测抗体或抗原结合蛋白可以在先后与抗生物素蛋白-酶缀合物和可溶的发色或荧光底物孵育后，通过其与抗生物素蛋白-酶缀合物(例如抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶)的相互作用来检测。经生物素化的检测抗体也可以用铕标记的链霉亲和素来检测。
在某些实施方式中，通过标记信号的定性或定量评价，来检测与试管表面结合的抗体/GDF-8/抗体复合物。在一些情况下，(例如通过荧光或发光)直接或(通过添加底物)间接测量标记。在其它情况下，在用额外的试剂孵育后测量标记。在其中标记是生物素的实施方式中，可以在随后的步骤中添加抗生物素蛋白缀合物(例如辣根过氧化物酶)。在一个具体的实施方式中，抗生物素蛋白缀合物可与固定的检测抗体或抗原结合蛋白结合。洗去过量的抗生物素蛋白缀合物。然后添加所述酶的底物，导致例如颜色、荧光或发光的可测量的改变。在一些实施方式中，辣根过氧化物酶的底物是3，3′，5，5′-四甲基联苯胺。
定量游离GDF-8和总GDF-8
可以使用本领域技术人员公知的方法定量GDF-8水平。在某些实施方式中，将生物样品中的GDF-8水平与已知水平比较，所述已知水平例如通过使用标准曲线获得。GDF-8标准曲线的产生例证于实施例15中。标准曲线可包含在缓冲液中稀释的已知浓度的GDF-8。在某些实施方式中，缓冲液是血清，例如人血清、小鼠血清、灵长类血清、牛血清或羊血清。任选地在添加已知浓度的GDF-8之前清除血清中的内源GDF-8。血清可得自天然缺乏GDF-8的Belgian Blue牛。
在一个实施方式中，用于定量生物样品中游离GDF-8的方法包括在下述条件下合并GDF-8捕获抗体或抗原结合蛋白与生物样品，在生物样品中存在GDF-8时所述条件允许其结合一种或多种捕获抗体，形成捕获抗体或抗原结合蛋白-GDF-8复合物；向来自步骤(b)的固体支持物中添加带标记的GDF-8检测抗体或抗原结合蛋白；(d)通过检测GDF-8检测抗体上的标记产生的信号，来检测捕获抗体-GDF-8复合物与检测抗体之间形成的复合物；和(e)通过将含有带标记的GDF-8检测抗体的复合物产生的信号与通过测定已知量GDF-8的相应信号强度产生的标准曲线相比，定量生物样品中的GDF-8水平。
定量总GDF-8的方法是类似的，不同之处在于在酸性缓冲液中稀释生物样品。
治疗、改善、预防GDF8-相关病症和抑制其发展的方法
GDF8与GDF8-相关病症(例如骨骼肌、骨、葡萄糖内稳态等等)发生和/或调节的关系，以及本发明的新颖特异性GDF8拮抗剂的发生，使得实现了治疗、改善或预防GDF8-相关病症(例如肌肉病症、神经肌肉病症、骨-退行性病症、代谢或诱导的骨病症、葡萄糖代谢病症、肥胖病症和胰岛素-相关病症)的方法。另外，所述拮抗剂允许通过测量生物样品中GDF8的水平来诊断、预测和监测这类病症的发展。具体地，本发明的GDF8特异性的拮抗剂表位(例如其肽模拟物、其抑制性多核苷酸、其抗体、小分子等等)可用于治疗患有GDF8相关病症的个体，或在用于区分个体是否患有GFD8-相关病症的方法中使用。
本发明的拮抗剂适用于在人或动物中预防、诊断或治疗多种医学GDF8相关病症。所述拮抗剂可以被用于抑制、降低和/或中和一种或多种与GDF8相关的活性。更优选地，与不存在本发明的拮抗剂时的GDF8相比，所述拮抗剂抑制或降低一种或多种GDF8活性。在某些实施方式中，相对于不与一种或多种抗-GDF8抗体结合的成熟的GDF8蛋白质，本发明的拮抗剂将GDF8的活性抑制至少50％，优选地至少60％、62％、64％、66％、68％、70％、72％、72％、76％、78％、80％、82％、84％、86％或88％，更优选地至少90％、91％、92％、93％或94％，进一步更优选地至少95％到100％。GDF8活性的抑制或中和可以例如在Thies等，上文所述的pGL3(CAGA)12报告基因检验(RGA)中和实施例中阐述的ActRIIB报告检验中测量。
通过本文公开的拮抗剂诊断、预测、监测、治疗、改善或预防的医学病症是GDF8相关病症，例如肌肉或神经肌肉病症，包括例如肌营养不良(MD；包括Duchenne’s肌营养不良)、肌萎缩侧索硬化(ALS)、肌萎缩、器官萎缩、虚弱、腕管综合征、充血性阻塞性肺病、老年性肌肉萎缩、恶病质和肌肉消耗综合征(例如由其它疾病和病症引起)。另外，可以通过GDF8抗体诊断、预测、监测、治疗、改善或预防的其它医学病症是脂肪组织病症例如肥胖症、2型糖尿病、糖耐量减低、代谢综合征(例如综合征X)、创伤(如烧伤或氮失衡)诱导的胰岛素抗性或骨-退行性疾病(例如骨关节炎和骨质疏松)。在本发明优选但是非限制性的实施方式中，通过本文公开的拮抗剂诊断、预测、监测、治疗、改善或预防的医学病症是肌肉或神经肌肉病症。在本发明的一个更优选但是非限制性的实施方式中，通过本文公开的拮抗剂诊断、预测、监测、治疗、改善或预防的肌肉或神经肌肉病症是MD或ALS。
可以通过本文公开的拮抗剂诊断、治疗、改善或预防的其它医学病症是与骨损失相关的病症，其包括骨质疏松，特别是在年老和/或绝经后的女性中，糖皮质激素-诱导的骨质疏松、骨质减少、骨关节炎和骨质疏松-相关的骨折。其它目标代谢骨疾病和病症包括归因于慢性糖皮质激素疗法、过早的性腺衰竭、雄性激素阻抑、维生素D缺乏、继发性甲状旁腺功能亢进、营养缺乏和神经性厌食症的低骨量。本发明的拮抗剂优选地被用于在哺乳动物，尤其是人(例如计划怀孕或已怀孕的女性)中预防、诊断、改善或治疗这类医学病症。
本发明的拮抗剂以治疗有效量施用。通常，治疗有效量可根据受试者的年龄、病症和性别，以及受试者中医学病症的严重性而变化。剂量可由医师决定，并在需要时调节来适合观察到的治疗效果。这类化合物的毒性和治疗效力可以通过细胞培养物或实验动物中例如用于测定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)的标准药物步骤来测定。毒效应和治疗效应之间的剂量比值(即LD50/ED50)是治疗指数，优选显示大治疗指数的拮抗剂。
从细胞培养物检验和动物检验获得的数据可以用于配制用于人的剂量范围。这类化合物的剂量优选地处于包括ED50、几乎无毒或无毒的循环浓度的范围内。所述剂量可在该范围内变化，取决于剂型和施用途径。对于本发明中使用的任何拮抗剂，治疗有效剂量可以从细胞培养物检验中初步估计。可以在动物模型中配制剂量来达到下述循环血浆浓度范围，所述范围包括如细胞培养物中测定的IC50(例如实现症状或生物活性的半-最大值抑制的测试拮抗剂的浓度)。例如可以通过高效液相色谱来测量血浆水平。可以通过合适的生物检验监测任何具体剂量的效果。合适的生物检验的例子包括但不限于DNA复制检验、基于转录的检验、GDF8蛋白质/受体结合检验、肌酸激酶检验、基于前脂肪细胞分化的检验、基于脂肪细胞中葡萄糖摄取的检验，和免疫检验。
通常施用组合物，使得拮抗剂或其结合片段以从1μg/kg到150mg/kg、1μg/kg到100mg/kg、1μg/kg到50mg/kg、1μg/kg到20mg/kg、1μg/kg到10mg/kg、1μg/kg到1mg/kg、10μg/kg到1mg/kg、10μg/kg到100μg/kg、100μg to 1mg/kg和500μg/kg到1mg/kg的剂量给予。优选地，拮抗剂作为推注剂量给予，从而在给药后最大的时间长度中最大化拮抗剂的循环水平。也可以在推注剂量之前、之后或代替其使用连续输注。
鉴定GDF-8相关病症的治疗剂的方法
本发明的又一方面提供了鉴定可用于治疗例如肌肉、葡萄糖代谢、脂肪和骨病症的治疗剂的方法。适当的筛选方法(例如基于ELISA的方法)是本领域已知的。在这样的筛选检验中，通过将拮抗剂(尤其是GDF8特异性表位的肽模拟物)或本发明的抗体或抗原结合蛋白及其配体GDF8合并形成第一结合混合物，并测量所述第一结合混合物(M0)中配体和抗体之间的结合量。还通过将拮抗剂、配体和要筛选的化合物或试剂合并形成第二结合混合物，并测量第二结合混合物(M1)中配体和抗体的结合量。然后通过计算M1/M0比值来比较第一和第二结合混合物中的结合量。如果与第一结合混合物相比观察到第二结合混合物中结合的降低(即M1/M0＜1，则所述化合物或试剂被认为能够与GDF8特异性相互作用。结合混合物的配制和优化在本领域技术水平范围内；这类结合混合物也可含有增强或优化结合必需的缓冲液和盐，并且本发明的筛选检验中可包括额外的对照检验。
因此可鉴定发现将拮抗剂-配体结合降低至少约10％(即M1/M0＜0.9)、优选地大于约30％的化合物，并且需要时再在其它检验(例如ActRIIB结合检验或如实施例中描述或本领域公知的其它基于细胞和体内的检验)中筛选抑制GDF8的能力。
小分子
也可以通过使用拮抗剂小分子(通常为有机小分子)来实现在遭受GDF8-相关病症(或处于其风险下)的生物(或受试者)中或来自涉及这类病症的生物的细胞中抑制GDF8活性，所述拮抗剂小分子拮抗GDF8，即抑制GDF8的活性。新颖的拮抗剂小分子可以通过上文所述的筛选方法鉴定，并可用于本文所述的本发明的治疗方法中。
相反，也可以通过使用小分子(通常为有机小分子)实现在遭受与降低的GDF8表达和/或活性相关的病症或与降低的GDF8水平相关的病症(或处于其风险下)的生物(或受试者)中提高GDF8活性，所述小分子使GDF显效，即增强GDF8的活性。新颖的激动剂小分子可以通过筛选方法鉴定，并可用于本文所述的本发明的治疗方法中。
诊断、预测和监测GDF8-相关病症发展的方法
除了治疗例如肌肉、骨、葡萄糖代谢和肥胖病症以外，本发明还提供了通过检测生物样品例如血清、血浆、支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavage fluid)、痰、(例如肌肉组织的)活组织检测等等中GDF8的降低或提高来诊断这类病症的方法。“诊断的”或“诊断”表示鉴定病理学状况的存在或不存在。诊断方法涉及如下检测GDF8的存在：例如测定来自受试者(人或非人哺乳动物)的生物样品中GDF8多肽的测试量，并将所述测试量与GDF8多肽的正常量或范围(例如来自已知不患有这样病症的个体的量或范围)比较。尽管具体的诊断方法可能不提供GDF8-相关病症的终局诊断，但是如果所述方法提供了帮助诊断的阳性指征则足够。
本发明还提供了通过检测GDF8的上调来预测GDF8-相关病症例如肌肉、骨、葡萄糖代谢和肥胖病症的方法。“预测的”或“预测”表示预测病理学状况可能的发生和/或严重性。预测方法涉及测定来自受试者的生物样品中GDF8的测试量，并将所述测试量与GDF8的预测量或范围(例如来自具有改变的例如ALS严重性的个体的量或范围)比较。一份测试样品中的多种GDF8量与GDF8-相关病症的某些预测一致。具体预测水平上GDF8量的检测提供了对受试者的预测。
本发明还提供了通过检测GDF8的上调或下调来监测GDF8-相关肌肉、骨、葡萄糖代谢和肥胖病症病程的方法。监测方法涉及在第一次和第二次从受试者采取的生物样品中测试GDF8的测试量，并比较所述量。第一和第二次之间GDF8量的改变标明GDF8-相关病症病程(例如严重性)的改变。技术人员应当明白，在期望肌肉质量增加的GDF8-相关病症中，第一和第二次之间GDF8蛋白质量和/或活性的降低表明病症的缓和，量的增加表明病症的发展。相反，对于其中期望肌肉质量降低的GDF8-相关病症而言，第一和第二次之间GDF8蛋白质量和/或活性的降低表明病症的发展，量的增加表明病症的缓和。这类监测检验也适用于评价针对GDF8-相关病症进行治疗的患者中具体治疗介入的效力(例如疾病减弱和/或反转)。
本发明的拮抗剂可用于通过体内或体外检测GDF8的存在来诊断、预测或监测。这类检测方法是本领域公知的，并包括ELISA、放射免疫检验、免疫印迹、Western印迹、免疫荧光、免疫沉淀和其它相当的技术。拮抗剂可以进一步在诊断试剂盒中提供，所述诊断试剂盒合并了一种或多种这些技术来检测GDF8。这样的试剂盒可含有其它组分、包装、说明书或帮助检测蛋白质和使用试剂盒的其它材料。
当拮抗剂旨在用于诊断、预测或监测的目的时，可期望用例如配体基团(例如生物素)或可检测的标记物基团(例如荧光基团、放射性同位素或酶)来修饰它们。需要时可以使用常规技术标记拮抗剂(无论是多克隆或单克隆的)。合适的标记包括荧光团、生色团、放射性原子、电子-密集试剂、酶和具有特异性结合配偶体的配体。酶典型地通过它们的活性来检测。例如，辣根过氧化物酶可以通过它们将四甲基联苯胺(TMB)转化为蓝色色素的能力来检测，所述色素可以用分光光度计定量。其它合适的标记可包括生物素和抗生物素蛋白或链霉亲和素、IgG和A蛋白，和本领域已知的大量受体-配体对。其它变更和可能性是本领域常规技术人员容易明白的，并且被认为是本发明范围内的等同物。
药物组合物和施用方法
本发明提供了包含本文公开的本发明拮抗剂(即多肽、多核苷酸、载体、抗体、抗体或抗原结合蛋白片段和小分子)的组合物。这类组合物可适合药物用途和施用给受试者。所述组合物典型地包含一种或多种本发明的分子(优选地抗体或抗原结合蛋白)，和可药用的赋形剂。本发明的拮抗剂可以体外使用、离体使用，或者与可药用载体合并时掺入药物组合物中。在本文中使用时，“可药用赋形剂”包括与药物施用相容的任何和所有溶剂、溶液、缓冲液、分散介质、涂层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。除了本发明的拮抗剂和载剂以外，这样的组合物还可含有多种稀释剂、填充剂、盐、缓冲液、稳定剂、增溶剂和本领域公知的其它材料。术语“可药用的”是指不干扰活性成分的生物活性的有效性的无毒材料。载剂的特征应取决于施用途径。用于药物活性物质的这类介质和试剂的用途是本领域公知的。组合物还可含有提供补充、添加或增强的治疗功能的其它活性化合物。药物组合物也可与施用说明书一起包含在容器、包装或分散器中。
本发明的药物组合物可以是脂质体的形式，其中除了其它可药用载剂以外，本发明的拮抗剂还与两亲剂(amphipathic agent)例如脂质合并，所述脂质例如作为胶束、不溶单层、液体晶体或在水性溶液中时作为片层(lamellar layer)以聚集形式存在。用于脂质体配制的合适脂质包括但不限于，甘油单酯、甘油二酯、硫苷脂(sulfatides)、溶血卵磷脂(lysolecithin)、磷脂、皂苷、胆酸等等。这类脂质体配制物的制剂在本领域技术水平范围内。
在本文中使用时，术语“治疗有效量”表示药物组合物或方法的每种活性组分的总量，所述总量足以显示有意义的患者益处，例如改善这类病症的症状、愈合、或提高愈合速率。应用于单独施用的个体活性成分时，所述术语是指单独的所述成分。应用于组合时，所述术语是指导致治疗效果的活性成分的合并量，无论是组合、先后还是同时施用。
在实施本发明的治疗方法或用途中，对受试者例如哺乳动物(例如人)施用治疗有效量的例如GDF8特异性的拮抗剂。本发明的拮抗剂可以根据本发明的方法，单独或与其它疗法(例如消炎剂)组合施用。与一种或多种药剂共同施用时，本发明的拮抗剂可以与第二药剂同时施用，或者相继施用。如果相继施用，则主治医生应决定与其它药剂组合的本发明的拮抗剂的适当施用顺序。
在一个实施方式中，本发明的拮抗剂(例如其药物组合物)在组合疗法中施用，即与适用于治疗病理学状况或病症(例如肌肉病症、神经肌肉病症、骨退行性病症、代谢或诱导的骨病症、肥胖病症、葡萄糖代谢病症或胰岛素相关病症，例如以及变应性和炎性病症)的其它药剂(例如治疗)合并。在本文上下文中，术语“组合”表示所述药剂基本同时(同时或相继)给予。如果相继给予，则在开始施用第二化合物时，两种化合物的第一种优选地在治疗位点或受试者中仍然可在有效浓度下检出。
本发明的药物组合物被配制为与其预期的施用途径相容。完成施用的方法是本领域常规技术人员已知的。也可能获得可以局部或口施用的组合物，或者可能够跨粘膜传递的组合物。用于药物组合物中来实施本发明方法的本发明拮抗剂的施用可以用多种常规方式完成，例如口摄食、吸入、表皮、皮下、或静脉内注射。
用于真皮内或皮下应用的溶液或悬浮液典型地包含一种或多种以下组分：无菌稀释剂例如注射用水、盐水溶液、固定的油脂、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂例如抗坏血酸或重亚硫酸钠；螯合剂例如依地酸钙钠；缓冲液例如乙酸、柠檬酸或磷酸；和用于调节张力的试剂例如氯化钠或葡萄糖。可以用酸或碱(例如盐酸或氢氧化钠)调节pH。这类制剂可以包封在用玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量管中。
适用于注射的药物这无包括无菌水性溶液或分散液，和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对静脉内施用而言，合适的可药用载剂包括生理盐水、抑菌水、CremophorTM EL(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸盐缓冲的盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的，并且应当流动至存在易于注射性(easy syringability)的程度。可药用载剂在制造和储存条件下必须是稳定的，并且必须被保护免受微生物例如细菌和真菌的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等等)及其合适混合物的溶剂或分散介质。可以通过使用涂层例如卵磷脂，在分散液的情况下通过维持需要的颗粒尺寸，和通过使用表面活性剂，来维持合适的流动相。微生物作用的阻止可以通过多种抗菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、柳硫汞等等)来实现。在许多情况下，优选组合物中应当包含等渗剂，例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨醇)和氯化钠。可以通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)，造成可注射的组合物延长的吸收。
通过例如静脉内、表皮或皮下注射施用治疗有效量的本发明的抗体或抗原结合蛋白时，结合剂应当是无热原的、胃肠外可接受的水性溶液的形式。这类胃肠外可接受的蛋白质溶液的配制(具有涉及pH等渗性、稳定性等等的标准)在本领域技术范围内。除了粘合剂以外，用于静脉内、表皮或皮下注射的一种优选的药物组合物还应当含有等渗运载体，例如氯化钠注射剂、Ringer’s注射剂、葡萄糖注射剂、葡萄糖和氯化钠注射剂、加有乳酸盐的Ringer’s注射剂或本领域已知的其它运载体。本发明的药物组合物可还含有稳定剂、防腐剂、缓冲液、抗氧化剂或本领域技术人员已知的其它添加剂。
本发明的药物组合物中本发明拮抗剂的量应取决于被治疗的病症的性质和严重性，以及患者之前经历的治疗的性质。最后，主治医生会决定治疗每个个体患者所用拮抗剂的量。开始，主治医生施用低剂量的拮抗剂并观察患者的应答。可以施用更大剂量的拮抗剂直至对所述患者获得最佳的治疗效果，并且在这一点时剂量通常不再提高。认为用于实施本发明方法的多种药物组合物应当含有每kg体重约0.1mg到50μg的拮抗剂。
使用本发明药物组合物的疗法的持续时间应根据被治疗的疾病的严重性和每个个体患者的状况和可能的特异反应性应答而变化。认为每种拮抗剂应用的持续时间应当通过例如皮下途径进行和例如在一周一次的范围内。最后，主治医生会决定使用本发明药物组合物的疗法的适当持续时间。
口服组合物通常包含惰性的稀释剂或可食用的载剂。它们可以被包封在明胶胶囊中或被压缩成为片剂。就口治疗性施用的目的而言，本发明的拮抗剂(例如抗体或抗原结合蛋白、小分子等)可以掺入赋形剂并以片剂或胶囊的形式使用。可以包含适合药用的粘合剂和/或辅助材料作为组合物的部分。片剂、丸剂、胶囊等等可含有任何以下成分，或具有类似性质的化合物；粘合剂例如微晶纤维素、黄蓍树胶或明胶；赋形剂例如淀粉或乳糖；崩解剂例如褐藻酸(alginic acid)、PrimogelTM或玉米淀粉；润滑剂例如硬脂酸镁或SterotesTM；助流剂例如胶体二氧化硅；甜味剂例如蔗糖或糖精；或调味剂例如欧薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂。
口施用治疗有效量的本发明的药物组合物(例如GDF8特异性拮抗剂)时，所述结合剂会是片剂剂、胶囊、粉末、溶液或酏剂的形式。以片剂形式施用时，本发明的药物组合物可额外含有固体载剂例如明胶或佐剂。片剂、胶囊和粉末含有从约5％到约95％的结合剂，优选地从约25％到90％的结合剂。以液体形式施用时，可以添加液体载剂例如水、石油、动物或植物来源的油脂(例如花生油、矿物油、大豆油或芝麻油)或合成的油脂(在考虑了个体和/或个体的大群体对这类液体载剂的变态反应之后)。液体形式的药物组合物可还含有生理盐水溶液、葡萄糖或其它糖溶液，或多元醇例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。以液体形式施用时，药物组合物含有按重量计从约0.5％到90％的结合剂，和优选地从约1％到50％的结合剂。
为了通过吸入施用，本发明的拮抗剂以来自加压容器或分散器或雾化器的气雾剂喷雾形式递送，所述加压容器或分散器含有合适的推进剂，例如气体，例如一氧化碳。因此，本文所述的化合物可以通过吸入施用至肺组织。除非另有说明，本文使用术语“肺组织”是指呼吸道的任何组织，并且包括上呼吸道和下呼吸道。特异性GDF8拮抗剂可以与一种或多种用于治疗肺疾病的现存模式(modalities)组合施用。
在一个施用的例子中，化合物针对雾化器配制。在一个实施方式中，化合物可以以冻干形式(例如在室温下)储存，并在吸入前在溶液中重建。
还可能使用医学设备例如吸入器(参阅例如美国专利Nos.6,102,035(粉末吸入器)和6,012,454(干粉吸入器))来配制用于吸入的化合物。吸入器可包含独立的处于适合储存的pH下的活性化合物区室，和针对雾化缓冲液的另一区室，和在雾化前立即将所述化合物与雾化缓冲液合并的机制。在一个实施方式中，吸入器是计量剂量吸入器。
尽管不是必需的，但是可以使用递送增强剂例如表面活性剂来进一步增强肺递送。本文中使用的“表面活性剂”是指具有亲水和亲脂部件的化合物，所述化合物通过与两个不相混溶相之间的界面相互作用来促进药物的吸收。表面活性剂可用于干燥颗粒是因为若干个原因，例如降低颗粒团聚、降低巨噬细胞吞噬作用等等。与肺表面偶联时可以实现更有效的化合物吸收，因为表面活性剂例如DPPC会大幅促进化合物的扩散。表面活性剂是本领域公知的，并且包括但不限于磷酸甘油酯，例如磷酯酰胆碱(phosphatidylcholine)、L-α-磷酯酰胆碱二棕榈酰基(DPPC)和二磷酯酰甘油(DPPG)；十六醇；脂肪酸；聚乙二醇(PEG)；聚氧乙烯-9-；氧金根(auryl)醚；棕榈酸；油酸；脱水山梨醇三油酸酯(Span 85)；甘氨胆酸盐；surfactin；poloxomer；脱水山梨醇脂肪酸酯；脱水山梨醇三油酸酯；泰洛沙泊(tyloxapol)；和磷脂。
也可以通过经粘膜或经皮的手段全身施用。例如，在包含Fc部分的抗体的情况下，组合物可能够通过FcRn受体-介导的通路(例如美国专利No.6,030,613)跨粘膜(例如肠、口或肺)传递。通常，跨黏膜施用可以例如通过使用锭剂、鼻喷雾、吸入器或栓剂来实现。对于经皮施用而言，如本领域普遍已知的，将活性化合物配制成软膏剂、油膏(salves)、凝胶、贴片或霜剂。对于经粘膜或经皮施用而言，配制物中使用适合穿透屏障的穿透剂。这类穿透剂是本领域普遍已知的，并且包括例如洗涤剂、胆酸盐、和夫西地酸(fusidic acid)衍生物。
药物组合物也可由适用于基因疗法的组合物(例如由本文公开的多核苷酸组成的组合物)组成。在基因疗法的情况下，可药用载剂可包括例如脂质、胶原球、阳离子乳液体系、水、盐水缓冲液、病毒载体、乳糜微粒残余物(chylomicron remnant)、聚合物纳米颗粒(例如明胶-DNA或壳聚糖-DNA)、金颗粒、聚合物复合物、lipoplexes、polyplexes等等(参阅例如Gardlik等(2005)Med.Sci.Monit.11(4)：RA 110-21)。
稳定化和保留
在一个实施方式中，特异性GDF8拮抗剂与下述部件生理学结合，所述部件将其在循环(例如血、血清、淋巴、支气管肺灌洗液或支气管肺泡灌洗液或其它组织)中的稳定化和/或保留提高例如至少1.5、2、5、10或50倍。
本文公开的本发明的拮抗剂可以用保护免受身体快速清除的载剂制备，所述载剂例如为受控释放配制物，包括植入物和微囊化的递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，例如乙炔乙酸乙烯酯(ethylene vinyl acetate)、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚正酯和聚乳酸。制备这类配制物的方法是本领域技术人员明白的。含有本文公开的拮抗剂的脂质体悬浮液也可用作可药用的载剂。这些可以根据本领域技术人员已知的方法制备。
例如，可以将特异性GDF8拮抗剂与聚合物结合，所述聚合物例如为基本非抗原性的聚合物，例如聚环氧烷或聚环氧乙烷。合适的聚合物重量会大幅变化。可以使用数均分子量范围从约200到约35,000(或约1,000到约15,000，或约2,000到约12,500)的聚合物。
例如，可以将特异性GDF8拮抗剂与水溶性聚合物缀合，所述水溶性聚合物例如为亲水聚乙烯聚合物，例如聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。这类聚合物的非限制性列表包括聚环氧烷均聚物，例如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇、聚氧乙烯化的多元醇、其共聚物和嵌段共聚物，条件是保持所述嵌段共聚物的水溶性。其它有用的聚合物包括聚氧化亚烷基(polyoxyethylene)、聚氧丙烯(polyoxypropylene)、和聚氧乙烯与聚氧丙烯的嵌段共聚物(Pluronics)；聚甲基丙烯酸酯；卡波姆；支化或非支化的多糖，其包含糖单体D-甘露糖、D-和L-半乳糖、岩藻糖、果糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-葡糖醛酸、唾液酸、D-半乳糖醛酸、D-甘露糖醛酸(例如聚甘露糖醛酸、或藻酸)、D-葡糖胺、D-半乳糖胺、D-葡萄糖和神经氨酸，包括同多糖和异多糖，例如乳糖、支链淀粉、淀粉、羟乙基淀粉、直链淀粉、硫酸葡聚糖、葡聚糖、糊精、糖原或酸粘多糖(例如透明质酸)的多糖亚基；糖醇聚合物，例如聚山梨醇和聚甘露醇；肝素；等等。
其它化合物也可与相同的聚合物结合，所述化合物例如为细胞毒素、标记或另一靶向剂，例如另一GDF9拮抗剂或无关配体。单-活化的、烷氧基-末端的聚环氧烷(PAOs)，例如单甲氧基-末端的聚乙二醇(mPEGs)、C1-4烷基-末端的聚合物和双-活化的聚氧乙烯(二醇)可被用于交联(参阅例如美国专利No.5,951,974)。
在一个实施方式中，与配体交联前，聚合物不必须但是优选是水溶性的。通常在交联后，产物是水溶性的，例如显示至少约0.01mg/ml、更优选地至少约0.1mg/ml、进一步更优选地至少约1mg/ml的水溶解度。另外，聚合物在缀合物形式下应当不是高免疫原性的，也不应当具有不适合静脉内输注、烟雾化或注射的粘度，如果缀合物预期通过这些途径来施用的话。
在一个实施方式中，聚合物仅含有具有反应性的单个基团。这帮助避免配体分子彼此交联。然而，本文的范围包括最大化反应条件来降低配体分子之间的交联，或者通过凝胶过滤或离子交换色谱来纯化反应产物从而回收基本同质的衍生物。在其它实施方式中，为了将多个配体与聚合物主链连接的目的，聚合物含有两个或更多反应性基团。也可以使用凝胶过滤或离子交换色谱以基本同质的形式回收期望的衍生物。
聚合物的分子量范围可高达约500,000D，优选地至少约20,000D，或至少约30,000D，或至少约40,000D。选择的分子量可取决于要达到的缀合物的有效尺寸，聚合物的性质(例如结构，例如线性或支化的)，和衍生化程度。
可以使用共价键使特异性GDF8拮抗剂与聚合物结合，例如与配体的N-端氨基和存在于配体赖氨酸残基上的ε氨基以及其它氨基、亚氨基、羧基、巯基、羟基或其它亲水基团交联。聚合物可以与GDF8拮抗剂直接共价键合而不需使用多功能(通常为双功能)交联剂。与氨基的共价结合通过基于氰脲酰氯(cyanuric chloride)、羰基二咪唑和醛-反应性基团(PEG醇盐加溴代乙醛的二乙基乙酰基，PEG加DMSO和乙酸酐，或PEG氯化物加4-羟基苯醛的苯酚盐，活化的琥珀酰亚氨基酯、活化的二硫代碳酸酯PEG、2，4，5-三氯苯基氯甲酸盐(2，4，5-trichlorophenylcloroformate)或对-硝基苯基氯甲酸盐活化的PEG)的已知化学来实现。可以使用碳二亚胺，通过偶联PEG-胺来衍生化羧基。可以通过与马来酰亚胺(maleimido)-取代的PEG(例如烷氧基-PEG胺加4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸硫代琥珀酰亚氨基酯(参阅WO 97/10847)或PEG-马来酰亚胺)偶联来衍生化巯基。或者，可以用2-亚氨基-硫解酶(Traut’s试剂)硫醇化(thiolated)配体上的游离氨基(例如赖氨酸残基上的ε氨基)，然后与含有马来酰亚氨基的PEG衍生物偶联，例如如Pedley等(1994)Br.J.Cancer 70：1126-30中所述。
可以例如从Shearwater Polymers，Inc.(Huntsville，AL)获得可以与GDF8拮抗剂结合的官能化的PEG聚合物。这类可商业获得的PEG衍生物包括例如氨基-PEG、PEG氨基酸酯、PEG-酰阱、PEG-硫醇、PEG-琥珀酸酯、羧甲基化的PEG、PEG-丙酸、PEG氨基酸、PEG琥珀酰亚氨基琥珀酸酯、PEG琥珀酰亚氨基丙酸酯、羧甲基化的PEG的琥珀酰亚氨基酯、PEG的琥珀酰亚氨基碳酸酯、PEG的琥珀酰亚氨基氨基酸酯、PEG-氧羰基咪唑、PEG-硝基苯基碳酸酯、PEG tresylate、PEG-缩水甘油酯、PEG-醛、PEG乙烯砜、PEG-马来酰亚胺、PEG-正吡啶基-二硫化物、异功能的PEG、PEG乙烯基衍生物、PEG硅烷和PEG phospholide。偶联这些PEG衍生物的反应条件可根据特定的GDF8拮抗剂、期望的PEG化程度和使用的PEG衍生物而变化。涉及PEG衍生物选择的一些因素包括：期望的结合点(例如赖氨酸或半胱氨酸R-基)、衍生物的水解稳定性和反应性、稳定性、链接的毒性和抗原性、分析适应性等等。使用任何具体衍生物的特定说明可从制造商处获得。
可以例如通过凝胶过滤或离子交换色谱或其它形式的色谱例如HPLC，将GDF8拮抗剂和聚合物的缀合物可以从未反应的起始材料中分离。以相同方式将异源物类的缀合物彼此纯化。还可能由于未反应的氨基酸的离子特性的差异，来拆分不同物类(例如含有一种或两种PEG残基)(参阅例如WO 96/34015)。
预期本发明的多核苷酸和蛋白质展示本文鉴定的一种或多种用途或生物活性(包括与下文引用的检验相关的用途或活性)。针对本发明蛋白质所述的用途或活性可以通过施用或使用这类蛋白质，或通过施用或使用编码这类蛋白质的多核苷酸(例如在基因疗法中或适用于引入DNA的载体)来提供。
以易于施用和均匀给药的剂型单位配制口或肠胃外组合物可以是有利的。剂量单位形式在本文中用于表示物理上离散的单位，其适合作为要治疗的受试者的单一剂量，每个单位与所需的药物载剂一起含有被计算为生产期望治疗效果的预定量的活性化合物。本发明剂量单位形式的规格由以下规定并直接依赖于它们：活性化合物的独特特征、要实现的具体治疗效果，和本领域配制这类活性化合物用于治疗个体的固有限制。
本发明的另一方面相应地涉及用于进行本发明的GDF8拮抗剂施用的试剂盒，例如其含有或不含有其它治疗性化合物，或者用于使用GDF8拮抗剂作为测定生物样品中GDF8存在和/或水平的研究或治疗功能的试剂盒，例如ELISA试剂盒。在一个实施方式中，所述试剂盒包含配制在药物载剂中的一种或多种抗-GDF8拮抗剂，和适当时配制在一种或多种独立的药物制剂中的至少一种试剂(例如治疗剂)。
公开下文的实施例来帮助理解本发明，但是其不意图，并且不应当被解释为以任何方式限制本发明的范围。这些实施例不包括常规方法例如杂交瘤形成、ELISA、增殖检验、流式细胞术分析和重组DNA技术的详细说明。这类方法是本领域常规技术人员公知的。
本申请通篇中引用的所有参考文献、专利、公开的专利申请和其它专利文件通过引用并入本文。
本发明还通过以下的实施例阐述和支持。然而，这些实施例不应以任何方式被认为进一步限制本发明的范围。相反，本领域常规技术人员应当容易地明白，存在本发明的其它实施方式、修饰和等同物，而不偏离本发明的思想和/或附带的权利要求的范围。
实施例
实施例1
创建杂交瘤细胞和分离RK22抗-GDF8抗体
通过Freund’s完全佐剂和20μg重组GDF8二聚体的皮下注射，免疫GDF8(肌抑制素)敲除小鼠(McPherron等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94：12457-61)，所述重组的CDF8二聚体如Lee和McPherron(1999)Curr.Opin.Genet.Dev.9：604-07中所述从CHO细胞调整的培养基(conditioned media)中纯化。以2周的间隔给予若干次相同量的GDF8和Freund’s不完全佐剂的加强注射。在从小鼠中分离脾细胞之前，在尾静脉中给予2μgPBS的最终静脉内注射，展示抗-GDF8抗体的高效价。将经分离的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(ATCC登记No.P3X63.Ag8.653)融合。10-14天后收获来自杂交瘤的上清液，并通过ELISA测试抗-GDF8抗体水平，见实施例2。为了确保单克隆性，通过重复的限制性稀释克隆被选择用于其它研究的杂交瘤。
在实施例2中描述的检验中，测试来自表达抗-GDF8的杂交瘤的上清液和/或使用本领域公知的标准亲和色谱方法从所述上清液中纯化的抗体。在最初针对与GDF8的结合的测试的13个克隆中，RK22是被选择用于进一步分析的克隆之一。
实施例2
RK22抗体与GDF8特异性相互作用
实施例2.1：在ELISA检验中RK22对GDF8具有比对BMP11更高的亲和力
使用GDF8或BMP11之一的标准ELISA技术被用于测定RK22对GDF8结合的特异性，即测定抗体是否对GDF8展示比对BMP11更高的亲和力。如先前在美国专利公开申请No.2004/0142382中所公开的，纯化和表征重组的人GDF8(成熟的GDF8和GDF8多肽)和BMP11蛋白质。以20摩尔EZ-link Sulfo-NHS-Biotin(Pierce，Rockford，IL，Cat.No.21217)对1摩尔复合物的比例，将GDF8潜伏复合物和BMP11潜伏复合物各自独立地在冰上生物素化2小时。通过使用0.5％TFA降低pH终止反应，并在C4 Jupiter 250×4.6mm柱(Phenomenex，Torrance，CA)上对经生物素化的复合物进行色谱，以分离成熟的蛋白质(例如将成熟的GDF8与GDF8多肽分离，或者将成熟的BMP11与BMP11多肽分离)。将用TFA/CH3CN梯度洗脱的成熟的经生物素化的GDF8或成熟的经生物素化的BMP11的级分合并，浓缩，并通过MicroBCATM蛋白质测定试剂盒(Pierce，Rockford，IL，Cat.No.23235)定量。
用0.5μg/ml经生物素化的GDF8或经生物素化的BMP11将96-孔微量滴定平板(在4℃下用PBS中5μg/ml链霉亲和素预涂覆过夜)在室温下涂覆1小时。通过用含0.1％(v/v)Tween 20(PBST缓冲液)的PBS洗涤去除过量的GDF8或BMP11。在SuperBlockTM溶液(Pierce)中于室温下将平板封闭1小时，然后用PBS冲洗。在室温下将涂覆了GDF8或BMP11的平板用100μl从RK22杂交瘤中收集的预封闭的上清液孵育1小时，或用多种浓度的经纯化的RK22抗体孵育。为了建立非特异性结合的对照，与显示不与GDF8或BMP11任一结合的无关抗体(Irr.Ab)一起使用显示结合并抑制GDF8和BMP11二者的RK35抗体(见美国专利申请No.60/709,704，其通过引用整体并入本文)，并且单独地测试对照培养基。通过用PBST洗涤3次后用PBS洗涤3次，去除未结合的抗体。向每个孔中添加15μl山羊抗-小鼠IgG HRP缀合物的1∶5000稀释液。将平板在室温下孵育1小时。用PBST将每个平板洗涤三次，随后用PBS洗涤3次，并通过添加TMB(四甲基联苯胺)试剂产生颜色反应。通过添加100μl 0.18M H2SO4终止颜色反应。使用微量滴定板读数器，通过读取450nm处每个孔的光密度测量产生的信号。
如图1A和1B中所示，与从对照抗体RK35中分离的上清液相比，来自RK22杂交瘤的上清液展示对GDF8比对BMP11有更强的结合。通过显示这些抗体对GDF8的更高亲和力不是剂量依赖型的，证实RK22对GDF8的更高亲和力的均一性。如图1A和B中所示，在测试的每个浓度下，RK22抗体均展示对GDF8比对BMP11有更强的结合。RK22显示几乎不结合BMP11，相反，RK35对照抗体与GDF8和BMP11二者结合。
实施例2.2：RK22对GDF8的亲合力
使用BIAcore等离子共振技术定量分析RK22抗体与GDF-8的分子动力学相互作用，并衍生了表观动力学速率常数(apparent kinetic rateconstant)。在这些研究中，我们测量了可溶抗体与固相结合的GDF-8的结合。使用经生物素化的GDF-8(bio-GDF-8)控制固定在生物感受器表面上的GDF-8的表面取向，然后将bio GDF-8固定在链霉亲和素生物感受器芯片上，之后一式三份应用不同浓度的抗体，并测量结合作为时间的函数。从这些测量中演绎了表观解离(Kd)和结合(Ka)速率常数，并用于计算相互作用的亲合力常数(Kd)。通过涂覆高表面密度并以不同流速注射抗体，在部分质量转运限制下使用BIAcore测量能够结合固定在芯片上的bio GDF-8的抗体级分，来测定RK22的活性浓度，所述活性浓度被定义为具有生物功能的抗体级分。用biaevaluation软件3.0.2版，使用全局拟合同时计算每个浓度抗体的结合和解离速率。
BIAcore 2000系统、感受器芯片SA(BR-1000-32)、HBS/EP缓冲液(0.01M HEPES pH.7.4、0.15M NaCl、3.0mM EDTA和0.005％聚山梨酯20(v/v)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS-EP)得自BIAcore AB，Uppsala，瑞典。纯化人bio-GDF8(Lot 25251-15)。在水中制备0.1％TFA(v/v)(Sigma)。使用BIAevaluation软件3.0.2版分析来自抗体-抗原相互作用的动力学测定的实验数据。
为了制备bio-GDF8表面，在感受器表面上维持HBS/EP缓冲液的连续流。通过用含有1M NaCl和25mM NaOH的溶液注射3次(每次1分钟)调节感受器表面上的链霉亲和素。对高-密度涂覆(＞2000RU)而言，将bio-GDF8以1ug/ml稀释于HBS/EP缓冲液中，并通过在链霉亲和素芯片上流动而固定在所述芯片上。对低-密度涂覆(20-60RU)而言，将GDF-8进一步稀释至0.1ug/ml并根据所需密度改变注射的bio-GDF-8的体积。第一个流动细胞上的链霉亲和素表面被用作参照表面。作为对照，使用第一流动细胞作为参照表面来校正大量折射指数(bulk refractive index)、基质效应和非特异性结合，用捕获分子涂覆第二、第三和第四流动细胞。
在部分质量转移限制下使用BIAcore分析能够与芯片上固定的bioGDF-8结合的RK22抗体的级分。在这一实验中，以2、10、30、50和100μl/分钟的流速注射200nM和100nM(基于OD 280测量的浓度)的抗-GDF-8抗体。质量运输限制可以通过感受器图像(grams)的目检来测定，因为斜率随递增的流速而提高。使用5μl 0.1％TFA再生生物感受器表面。
将两种RK22抗-GDF-8抗体稀释于HBS-EP缓冲液(Biacore AB)中，以30ul/分钟的流速在已固定的bio-GDF-8上注射小份试样，在注射三分钟后，在BIAcore缓冲液中以相同流速监测10分钟解离。注射的抗体浓度为300、150、75、37.5、18.7、9.3、4.6、2.3和0nM；每次注射一式三份进行。使用双基准(double referencing)从每个感受器图(sensorgram)中减去空白和缓冲液作用。在单独注射流经每个细胞表面的下一样品HBS-EP之前，使用5μl 0.1％TFA再生生物感受器表面。以共振单位(RU)计测量应答，其代表与RK22结合的质量。
使用BIAevaluation软件3.0.2分析动力学数据。假设：二价分析物(A)与单价配体(B)结合的A+B＝AB Ka1*Kd1；AB+B＝AB2Ka2*Kd2；和单价分析物(A)与单价配体(B)结合的A+B＝AB Ka1*Kd1。从感受器图的适当区域计算表观解离(kd)和结合(ka)速率常数。通过下式从动力学速率常数计算抗体和GDF8之间相互作用的亲合力常数：Kd＝kd/ka。如图2中所示，RK22在三个实验的平均中展示7nM的Kd值。
实施例3
RK22在体外和体内抑制GDF8信号转导
实施例3.1：使用RK22在基于细胞的报告基因检验中抑制经纯化的重组人GDF-8的生物活性
为了在体外基于细胞的检验中展示GDF-8的活性，开发了使用报告载体pGL3(CAGA)12的报告基因检验(RGA)，所述报告载体pGL3(CAGA)12在TGF-β诱导的启动子控制下表达萤光素酶。CAGA序列先前被报道为TGF-β诱导的基因PAI-1启动子内的TGF-β应答序列(Thies S等2001)。使用基本的萤光素酶报告制粒pGL3(Promega，Madison，WI)制造含有CAGA框的报告载体。将来自腺病毒主要晚期启动子的TATA框和转录起点(-35/+10)插入BglII和HindIII位点之间。将含有12个CAGA框AGCCAGACA重复的寡核苷酸退火并克隆进XhoI位点中。使用FuGENE6转染试剂(Boehringer Manheim，德国)用pGL3(CAGA)12瞬时转染人横纹肌肉瘤细胞系A204(ATCC HTB-82)。转染后将细胞在96孔平板上在补充有2mM谷氨酰胺、100U/ml链霉素、100μg/ml青霉素和10％胎牛血清的McCoy’s 5A培养基中培养16小时。然后在37℃下用含或不含10ng/ml GDF-8的McCoy’s 5A培养基(含有谷氨酰胺、链霉素、青霉素)和1mg/ml牛血清将细胞处理6小时。使用Luciferase Assay System(Promega)定量经处理的细胞中的萤光素酶。使用10ng/ml BMP-11重复检验。
为了测试RK22的抑制活性，将GDF-8与RK22在室温下预孵育1小时。然后将该混合物添加至经转染的细胞，并在37℃下孵育6小时。使用Luciferase Assay System(Promega)定量萤光素酶。使用相同的方案测量RK22阻断BMP-11活性的能力。
从图3中可以看出，在不存在或存在RK22时未经处理(bkgd)或用10ng/ml GDF8处理细胞时，作为LCPS表示的pGL3(CAGA)12报告子活性的诱导。这些抗体中的每一种以剂量-应答的方式降低至少一种GDF8活性，即GDF8-介导的萤光素酶诱导，其中RK22的IC50为0.4nM。对照抗体RK35具有0.2nm的IC50，无关抗体具有＞100nM的IC50。尽管RK22抑制了GDF-8诱导的信号转导，但是这些抗体未显著抑制BMP11的生物活性；RK22抑制BMP11活性的IC50分别是不可检测的、30nM和＞100nM。这些数据展示了RK22体外特异性抑制GDF8信号转导至与非特异性抗体RK35相似的程度。
实施例3.2：RK22体内抑制GDF8活性
为了测定RK22抗体是否能够体内拮抗GDF8活性，选择RK22作为在成年SCID小鼠中进一步测试的代表性抗体。SCID小鼠遭受严重的组合免疫缺陷，因此在注射抗体例如RK22后不产生免疫反应。在四周的时间段中向SCID小鼠中注射RK22。施用三种RK22剂量：1mg/kg/周、10mg/kg/周和40mg/kg/周。使用以10mg/kg/周剂量施用的Myo-29作为阳性对照，并与施用的不同浓度的RK22比较。
使用肌肉量作为用RK22处理的小鼠中GDF8活性的指征。取下三种不同的肌肉群，腓肠肌、胫骨前肌和四头肌，并测定肌肉重量。如图4中所示，在10mg/kg/周的剂量下RK22显著提高肌肉量。与阳性对照Myo29相比，在10mg/kg/周的RK22和Myo29中肌肉量均提高约10％。
实施例4
RK22结合位点的表征
实施例4.1：评价GDF8对ActRIIB结合的RK22抑制
为了测定RK22抗体是否能够通过阻止GDF8与其ActRIIB受体结合来拮抗GDF8的活性，在ActRIIB结合检验(例如中和检验)中测试所述抗体。在96-孔微量滴定平板检验中，针对抑制经生物素化的GDF8结合固定在塑料上的ActRIIB融合蛋白的能力，筛选经纯化的RK22抗体。通过在4℃下0.2M碳酸钠缓冲液中过夜，以1μg/ml将重组的ActRIIB-Fc嵌合体(R&D Systems，Minneapolis，MN，Cat.No.339-RB/CF)涂覆在96-孔平底检验平板(Costar，NY，Cat.No.3590)上。然后用1mg/ml牛血清白蛋白封闭平板，并在标准ELISA流程后洗涤。对经封闭的ELISA平板添加20ng/ml单独的经生物素化的GDF8，或者20ng/ml在室温下用多种浓度RK22预孵育1小时的GDF8。为了确立通过IC50值测量的克隆效价，添加抗体滴定(titration of antibody)。包含用无关抗体或阻断GDF8对ActIIRB结合的对照抗体预孵育的经生物素化的GDF8作为对照。在室温下一小时后，洗去经抗体-阻断的蛋白质复合物，并在时间-分解荧光测定(time-resolved fluorometric，TRF)检验中，使用DELFIATM试剂盒(PerkinElmerLifeSciences，Boston，MA)，用带有Europeium-标记的链霉亲和素检测与结合在平板上的ActIIRB结合的GDF8量。
ActRIIB中和检验的结果展示于图5中。因此，尽管可能RK22抗体通过抑制GDF8结合ActRIIB的能力而抑制GDF8信号转导，但是更可能涉及另一机制。
实施例4.2：RK22结合GDF8-特异性表位
尽管GDF8和BMP11密切相关，但是RK22是GDF8特异性的。因此，推测这些抗体所识别的表位也是GDF8特异性的，因此GDF8特异性的表位可作为拮抗剂(例如作为肽模拟物)用于特异性抑制GDF8信号转导和/或用于筛选或制造GDF8-特异性拮抗剂。
为了确定抗体RK22识别的GDF8表位，使用点合成技术(Molina等(1996)Peptide Res.9：151-55；Frank等(1992)Tetrahedron 48：9217-32)，在纤维素纸上直接合成48个重叠的13个残基的肽，所述肽代表如SEQ IDNO：1中公开的成熟GDF8的整个序列。肽的重叠为11个氨基酸。在这一阵列中，用丝氨酸代替半胱氨酸残基，从而降低半胱氨酸残基的存在引起的化学复杂性。用聚乙二醇和Fmoc-保护的氨基酸修饰的纤维素膜购自Abimed(Lagenfeld，德国)。通过偶联β-丙氨酸间隔区将阵列固定在膜上，并如先前所述(Molina等，上文；Frank等，上文)使用标准DIC(二异丙基碳二亚胺)/HOBt(羟基苯并三唑)偶联化学合成肽。
使用Abimed ASP 222机器人将活化的氨基酸涂点。手动进行洗涤和去保护步骤，并且在最后的合成循环后将肽N-端乙酰化。肽合成后，将膜在甲醇中洗涤10分钟并在封闭剂(TBST(含0.1％(v/v)TweenTM 20的Tris-缓冲的盐水)和1％(w/v)酪蛋白)中洗涤10分钟。然后在柔和摇动下，用封闭剂中2.5μg/ml的RK22抗-GDF8抗体将膜孵育1小时。用阻断剂洗涤3次每次10分钟后，将膜用HRP-标记的第二抗体(封闭剂中0.25μg/ml)孵育30分钟。然后用封闭剂将膜洗涤三次，每次10分钟，并用TBST洗涤2次，每次10分钟。使用SUPERSIGNALTM West试剂(Pierce)和数码相机(Alphananotech Fluoromager)使结合的抗体显影。点图展示于图6中，结果概括于表4中。点图证明了RK22结合下述GDF8，所述GDF8具有下述氨基酸序列和/或基本由下述氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自：DFGLDS(SEQ ID NO：4)、FEAFGWDWIIAPKRY(SEQ ID NO：6)、FVFLQKYPHTLVHQ(SEQ ID NO：8)、SSGESEFVF(SEQ ID NO：10)、WIIAPKRYKANYSSGESEFVFLQKY(SEQ ID NO：11)及其潜在的亚序列。具体地，RK22的表位位于推定与GDF8I型受体(ALK4/ALK5)相互作用的GDF8区域。
表4
被小鼠单克隆抗体结合的人GDF8的大致区域
  RK22
  表位区域   N-端和I型受体识别区域
  与SEQ ID NO：1的氨基酸相互作用(大致)   1-6；24-38；49-63
实施例5：RK22的人源化
实施例5.1：抗体测序
从生产RK22抗体的杂交瘤细胞中克隆编码RK22的可变重链(VH)和可变轻链(VL)基因，然后测定其氨基酸序列。这些序列作为SEQ ID NOs：14和16列于表1中。
实施例5.2：种系化RK22抗体
使用抗体的序列数据鉴定RK22重链和轻链的最接近的种系序列，例如DP-5和DP-7分别对RK22VH展示约65％和71％的同一性(图7)；而DPK 24对RK22VL展示约78％的同一性(图8)。使用标准定向诱变技术，用合适的诱变引物制造合适的突变。通过序列分析验证序列和抗体的突变。本申请文件在本申请文件中引用的参考文献的教导下最彻底地被理解，所有所述参考文献通过引用整体并入本文。本申请文件中的实施方式提供了对本发明实施方式的阐述，并且不应被理解为限制本发明的范围，技术人员明白所要求保护的本发明包括许多其它实施方式。
实施例6
用于定量和检测GDF8的夹层免疫检验模式
使用来自Pierce的EZ Link Sulfo-LC生物素化试剂盒将下文实施例中所述的每种抗体生物素化。从先前的研究中确定，40倍过量的NHS-生物素对于这些抗体的生物素化是最佳的。使用40倍摩尔过量的生物素将400ug每种抗体生物素化。这导致每摩尔抗体中掺入约3到5摩尔的生物素。生物素化后，将所有抗体在4℃下过夜透析进PBS中，通过BCA测定总蛋白质浓度。为了测定生物素掺入的摩尔比，向2-(4’-羟基偶氮苯)苯甲酸(HABA)和抗生物素蛋白的混合物中添加经生物素化的抗体的溶液。因为其对抗生物素蛋白的更高亲合力，生物素使HABA离开其与抗生物素蛋白的相互作用，并且500nm处的吸光度成比例地下降。可以通过测量添加经生物素化的样品之前和之后HABA-抗生物素蛋白溶液的吸光度，来定量与抗体缀合的生物素的量。吸光度的改变与掺入抗体中的生物素的量相关。
另外，下述研究中使用的血清缺乏内源GDF8。使用固定在经溴化氰(cyanogen bromide)活化的Sepharose珠上的1mg MYO-029单克隆抗体制备用于GDF-8血清清除的亲和柱。将柱用0.1M乙酸预洗涤，并在添加人血清之前用含250mM NaCI pH 7.2的PBS中和。由于加热至65℃对潜伏的GDF-8的明显活化，将血清预热至65℃10分钟，然后在1mg MYO-029抗-GDF8亲和柱上经过三次，并在游离和总GDF-8检验中检验活性。初始将2.5ml体积的血清经过柱。初始测试后，加热更大体积的血清(13ml小份试样)并通过多次经过亲和柱来清除GDF-8，中间在0.1M乙酸中洗涤柱。使用所述经清除的血清作为用已知浓度的成熟GDF-8产生标准曲线的基质。
实施例6.1抗体配对实验：免疫检验模式的比较：RK35捕获与RK22检测，或RK22捕获与RK35检测。
通过以1μg/ml的浓度在4℃过夜或37℃下1小时，在高结合的96孔平板(Immulon 4HBX)上，将每种抗-GDF-8单克隆抗体初始涂覆在0.1M硼酸钠中。洗涤平板然后用Pierce Superblock试剂封闭10粉红。在硅化塑料管中将储存的GDF-8(0.1％三氟乙酸-TFA中1.77mg/ml)在0.1％三氟乙酸(TFA)中稀释至10μg/ml，并以范围从12.5ng/ml到0.2ng/ml的浓度进一步稀释进清除了GDF8的人血清中，作为产生标准曲线的校准物。使用检验平板的柱1-3，一式三份运行标准曲线。在独立的预-封闭的96-孔平板中，向含有120μl THST缓冲液(终浓度20％血清；总体积，150μl)的6个孔中的每个中添加30μl测试血清的小份试样(用于进行一式三份的测定)。对总GDF-8检验而言，将80μl该溶液转移至96-孔PCR平板中，并在80℃加热5分钟。在添加至检验平板之前将经加热的样品在冰上冷却。
对用于标准曲线的孔而言，向孔中添加65μl的THST缓冲液，然后添加10μl校准血清，得到100μl的总体积。从制备平板上取出50μl未加热的20％血清样品，并添加至检验平板中，在100μl总体积中得到10％血清的最终血清浓度。从经加热的平板上取出50μl的20％血清，添加至第二检验平板。将这些第二检验平板在室温下摇动孵育。1.5小时后，洗涤平板并添加Superblock试剂，反应5分钟。以150ng/ml向孔中添加经生物素化的RK22或经生物素化的RK35，摇动反应1.5小时。洗涤平板并再次封闭，之后添加100μl超灵敏的链霉亲和素-HRP(1∶20,000)稀释液，在室温下摇动反应1小时。洗涤并再封闭平板，然后添加TMB底物，在室温下摇动反应15分钟。通过添加0-5M H2SO4终止反应，并在MolecularDevices Spectramax平板读数器上在450nm处读数。免疫检验模式的比较：RK35捕获/RK22检测或RK22捕获/RK35检测可见图9A和9B。如图所示，任一模式能够检测THST检验缓冲液或10％血清中100到10pg/ml之间的GDF8。
实施例6.2：血清对GDF-8检验的影响
先前的结果提出，血清背景作用将吸光度值从0.3OD单位的范围内提高至约0.5OD单位，取决于所分析的血清样品(数据未显示)。通过针对经RK22涂覆或未涂覆(对照)的HBX检验平板测试人血清(图10)，确定信号提高的原因是HAMA作用(即人血清IgG与检验中使用的小鼠单克隆抗体的反应)。不含单克隆抗体的平板不显示信号的提高，指出背景提高并非归因于血清与平板的非特异性结合，而是依赖于单克隆抗体的存在。
进行的降低背景的若干尝试是不成功的，包括酸解离和添加来自多种物种的过量IgG来封闭人IgG与鼠IgG的结合(数据未显示)。添加至以下免疫检验时，特别被设计未降低HAMA检验干扰的可商业获得的试剂——免疫球蛋白抑制试剂(II R)是成功的。使用在0.1M硼酸钠pH 8.5中稀释的1ug/ml RK35作为捕获试剂。将Myo-029逐步滴加至平板+/-血清+/-IIR以及250pg/ml GDF8，并孵育1.5小时。添加在THST检验缓冲液中1∶10,000稀释的经生物素化的RK22，并孵育1.5小时。添加THST中1∶20,000稀释的100μl链霉亲和素-HRP，然后在TMB中产生反应。如图11中所示，使用IIR试剂降低了HAMA背景。
实施例6.3抑制GDF8与MyO-029抗体的结合
MyO-029(在2002年10月2日在各自的保藏指定号PTA-4741下保藏于美国组织培养物保藏中心(ATCC))是一种治疗性抗体，其在临床试验中被用于提高患有肌肉病症的患者中的肌肉强度。在被施用了Myo-029的患者中检测GDF8的免疫检验中，如本文所述显示了试验抗体RK35与MYO-029结合GDF-8的交叉反应性。为了验证这一交叉反应性，将MYO-029涂覆在试验平板上。向每个孔中1200pg/ml GDF-8。然后添加递增浓度的经生物素化的RK22或者经生物素化的RK35。如图12中所示，未标记的GDF-8与经生物素化的RK35竞争结合MYO-029，因为在这一配置中未产生信号。用经生物素化的RK35未产生信号，这表明RK35和MYO-029之间结合GDF8的交叉反应性。
实施例6.4：MyO-029作为GDF8竞争者的用途
使用两种检验配置(RK35/RK22或RK22/RK35)和与恒定浓度的GDF-8(250pg/ml)一起掺入检验缓冲液或10％人血清的递增量的MYO-029治疗性抗体进行检验。如图13A中所示，使用RK22作为捕获抗体。在室温下将250pg/ml的GDF-8与150ng/ml的经生物素化的Rk35和递增浓度的MYO-029(0到20ug/ml)一起孵育1.5小时。即便在最高浓度的MYO-029下，仅观察到约30％的抑制。如图13B中所示，使用Rk35作为捕获抗体。在室温下将250pg/ml的GDF-8与经生物素化的RK22和递增浓度的MYO-029孵育1.5小时。在MYO-029浓度≥5ug/ml时观察到接近100％的信号抑制。
实施例6.5使用RK35捕获/RK22检测模式时人血清中的掺入回收
在掺入回收试验中针对GDF-8回收分析三种人血清样品。将每种样品在100％成熟GDF-8的血清中稀释至600pg/ml，并系列稀释两杯，得到600、300和150pg/ml GDF-8的样品。通过添加或不添加20μg/ml MYO-029，以RK35捕获/RK22检测的模式分析这些样品中的每一个，见图14A。计算由于添加MYO-029导致的信号降低，见图14B。将这些数值与在THST检验缓冲液中产生的GDF-8标准曲线比较，并在图15中绘制GDF-8的观察值vs.预期值。观察值远低于预期值，表明单独的缓冲液中的标准曲线不准确定量在血清样品中存在的GDF-8值。
实施例6.6血清vs.检验缓冲液用于产生标准曲线的用途
在这一研究中使用正常小鼠血清和GDF-8KO小鼠血清。与正常人血清和THST缓冲液一起使用这些血清来产生使用成熟GDF-8蛋白质的标准曲线，见图15。在血清vs.缓冲液中产生的标准曲线斜率的差异解释了在培养基中使用缓冲液产生标准曲线时掺入/回收实验中观察值vs.预测值为何差异如此明显(图16)与缓冲液中的标准曲线相比，血清中的标准曲线降低的斜率强调了血清对产生的信号的基质影响，并且提示标准曲线应当在血清中产生。KO小鼠血清不能以检验发展所必需的量获得，正常小鼠血清具有高内源GDF-8水平，这会干扰未知血清样品中GDF-8的预测。正常人血清还具有尽管比正常小鼠更低但是也造成不想要的干扰因素的内源GDF-8水平。一种可能的替代方式应当是从正常人血清池中清除GDF-8，来用作检验校正基质。
实施例6.7血清中Myo-029抗体的失活/解离
先前的研究证明MYO-029的存在通过与RK35抗体表位的交叉反应性而干扰RK35/RK22模式中GDF-8的准确定量。假设如果能够将样品中的GDF-8/MYO-029复合物解离，则可能开发出在存在MYO-029时准确测量GDF-8的免疫检验。对于将抗体与其抗原解离而言存在很少的可能性，包括酸性解离和热解离。根据报道(Brown等，1990，Growth Factors 3，35-43)，潜伏的TGF-β可能被热处理不可逆地活化。THST检验缓冲液中从65℃到80℃的温度梯度对GDF-8检验中MYO-029抗体所展示的抑制不具影响。然而，用正常未掺入的血清、掺入400pg/ml成熟GDF-8的血清或掺入潜伏的GDF-8的血清进行指示实验(pilot experiment)。在这一实验中，向20％血清中掺入MYO-029抗体并在80℃加热7分钟(见图17)。结果表明检验中的GDF-8活性在这一温度下保持，并且在加热至80℃的血清中MYO-029抗体被失活。该失活通过两种方式证实：1)在存在MYO-029时加热的血清样品具有与不添加MYO-029的对照经加热的样品相同的信号输出；和2)通过在样品加热后添加新鲜的MYO-029可再次降低检验信号至背景水平。在正常血清、掺入成熟GDF·8的血清和掺入潜伏的GDF·8的血清中观察到这些结果。掺入潜伏的GDF-8的血清样品展示信号的提高，所述提高似乎依赖于潜伏的GDF-8材料而不是成熟的GDF 8。为了测定有效失活的更精确的持续时间，使用掺入5μg/ml MYO-029的正常血清进行时程实验。结果表明MYO-029抗体在早达80℃下三分钟时就被已失活。
实施例6.8人血清中的GDF8清除
为了清除人血清的内源GDF-8，用通过溴化氰活化共价固定在Sepharose珠粒上的1mg MYO-029抗体制备亲和柱。将柱预洗涤，将人血清的小份试样经过柱，并在GDF-8ELISA检验中测试GDF-8活性。另外，将血清预热至65℃然后在过柱之前冷却。在GDF-8检验中运行时，经加热的血清显示提高的信号，这可能归因于血清中潜伏的GDF-8的免疫活化。图18显示加热后GDF-8检验中的信号提高，以及经加热/清除的H/D血清中的信号清除。值得注意的是，预热至80℃时在H/D血清中未观察到信号的提高。
实施例6.9H/D血清中的标准曲线
使用缺乏内源GDF-8的血清，使用成熟GDF-8和潜伏的GDF-8二者在经加热和不经加热的条件下产生免疫反应性标准曲线。将成熟的GDF-8掺入100％血清中并随后从2500pg/ml稀释至40pg/ml。以20倍于成熟GDF8的蛋白质浓度使用潜伏的GDF-8，其范围从约50,000pg/ml到800pg/ml(图19)。这一实验的结果显示，在100％H/D血清中将潜伏的GDF-8加热至80℃时检验信号显著提高。注意在图18中，加热至80摄氏度的血清未显示在正常血清中观察到的特征性信号提高。这导致对下述假设的信任：在正常血清中观察到的提高归因于内源潜伏的GDF-8。相反，用成熟GDF-8产生的信号在加热后不提高，并且在重复的实验中具有随着在80℃加热而降低的趋势。
实施例6.10在八个正常血清样品中分析游离GDF8和总GDF8
将先前冷冻的八个正常血清样品融化，并使用室温检验(游离)和活化潜伏的GDF-8的80℃加热步骤(总)来检验游离GDF-8和总GDF-8。使用掺入已知浓度的成熟GDF-8蛋白质的H/D血清作为GDF-8指示器，产生这一分析的标准曲线。标准曲线的范围从12,500pg/ml到188pg/ml，并使用相关系数0.999(见图20)的非线性回归曲线拟合分析计算八个未知血清样品中的GDF-8值。如前文所述，添加Myo-029诱导的光密度改变与样品中内源GDF-8的量成正比。图21展示了用于测定GDF-8浓度的原始数据。该图阐述了游离的GDF-8信号及其相应的通过添加MYO-029抗体而被降低的信号，以及总GDF-8及其相应的通过添加MYO-029抗体而被降低的信号。图22展示了检验再现性实验的结果。游离GDF8和总GDf8检验显示较高程度的再现性。对于游离GDF-8(室温)检验而言特别是这样。总(加热至80℃)检验中一天天提高的检验信号归因于加热时间从5分钟提高至10分钟。重复观察到检验信号随着样品加热持续时间的提高而降低，并且可反映抗原的变性和免疫反应性的丢失。
实施例6.11在存在MYO-029时热活化的内源GDF8的检测值偏低
在图23中所示实验中，在存在或不存在MYO-029时孵育人血清，然后在多种温度下热变性，之后通过ELISA分析。通过来自标准曲线的检验结果的内插进行测试样品中GDF-8水平的定量，所述标准曲线由掺入合并的人血清中已知浓度的经纯化的重组GDF-8二聚体的稀释系列组成，所述人血清通过亲和色谱清除了GDF-8。不存在MYO-029时的最大GDF-8检测发生于约60℃。MYP-29的存在掩蔽了低温下血清中GDF-8的检测。在大于65℃的温度下孵育部分恢复了存在MYO-029时的GDF-8检测。然而，在大于65℃下计算的GDF-8浓度显示所述检验大幅低估了血清中存在的GDF8的总量。
实施例6.12在低pH下存在Myo-029时检测GDF8
加热至MYO-029解离所需的温度时GDF-8的亚最佳检测提高了替代性方法的评价。图24展示了在不存在和存在MYO-029时酸解离ELISA检测类似水平GDF-8的能力。在先前的实验中，在结合捕获抗体之前中和GDF-8/MYO-029混合物。在这些条件下，中和后MYO-029能够竞争结合捕获抗体RK35。在图24中展示了将捕获条件维持在低酸性pH下时，RK35仍然能够结合GDF-8，而MYO-029则不能，因此可以在存在或不存在治疗性抗体时实现GDF-8检测的完全回收。
实施例6.13RK35在酸性条件下结合GDF8
为了验证RK35(而不是MYO-029)能够在酸性条件下结合GDF-8，将RK35和MYO-029独立地逐步滴加进人血清中，并在酸性条件下进行分析物捕获步骤。溶液中递增量的RK35能够结合GDF-8并和与平板结合的RK35竞争结合GDF-8，导致酸性条件下降低的GDF-8检测。在达到pH 3.0的溶液中，MYO-029不能够结合GDF-8，与添加的MYO-029的浓度无关，使得溶液中的GDF-8能够结合ELISA孔中涂覆的RK35抗体(见图25)。因此，在MYO-029不能发挥有用属性的条件下，RK35结合GDF-8的能力可以被用于测量存在MYO-029时的GDF-8水平。MYO-029与GDF-8的酸解离甚至使用递增浓度的MYO-029也是有效的。图25中的数据展示，使用酸解离方案时，将MYO-029浓度提高至100μg/ml未降低GDF-8的检测。该图还展示使用热解离方案时，GDF-8检测中的显著降低，图26。
人血清的酸化导致比先前报道的GDF-8血清水平大得多的评估。为了证实提高的血清评估是更大的GDF-8检测的结果并且不归因于酸诱导的假象(artifact)。分析来自经遗传改造的敲除小鼠和天然存在的GDF-8敲除动物——Belgian Blue牛的血清。图27展示了在中性或酸性pH任一下测量时，来自敲除小鼠和Belgian Blue牛的血清均不能产生高于平板背景的信号。此处报道的数值以光密度为单位并且允许比较性评估，然而校准曲线的缺乏导致不能测定GDF-8的绝对量。
实施例6.14校准曲线拟合
为了评价酸-解离方法的中间测定(inter-assay)和内部测定(intra-assay)差异性，分析掺入重组的GDF-8二聚体的Belgian Blue血清的小份试样。制备与校准曲线无关的四种储存溶液，并在96孔平板的五个不同位置中一式三份测定。
可以使用4或5-参数对数模型拟合这一检验的校准曲线。一式三份的算术含义可以被用作模型拟合的原始数据。典型地，不同浓度水平下的方差趋向于不同。为了获得在低浓度和高浓度下均准确的校准曲线，应当使用加权的非线性最小方差方法，或在光密度数据的方差-稳定性转化后进行非-加权的非线性最小方差方法。
图28A-C在针对校准标准反算的浓度的相对误差方面，对比了五个GDF-8ELISA平板的三种不同的校准曲线拟合方法。如果我们采取20％的相对误差作为可接受的，则可使用根据光密度的方根拟合的4-参数和5-参数对数模型。
实施例6.15检验的精密度和准确度
为了评价酸解离方法的中间测定和内部测定差异性，分析掺入重组的GDF-8二聚体的Belgian Blue血清的小份试样。制备与校准曲线无关的四种储存溶液，并在96孔平板的五个不同位置中一式三份测定。图29展示了在不同的三天处理的五个平板的平板设计。从通过5-参数对数模型针对每个平板拟合的校准曲线计算掺入的样品的浓度。平板内和平板间差异系数(CV)和相对误差(RE)概括于表1和表2中。以任一CV评价方法为基础，平板内和平板间精密度度充分处于20％内。
表5
掺入的样品的平板内差异性
  样品   标称浓度(netml)   平板数量   平均CV#I(％)   平均CV#2(％)   平均相对误差(％)
  LLOQL-QCM-QCH-QC   0.52.010.040.0   5555   2.92.42.610.2   4.53.23.211.5   55.037.123.311.7
CV#1＝SD/样品均值
CV#2＝SD/标称浓度
表6
掺入的样品的平板间差异性
  样品   标称浓度(netml)   CV#I(％)   CV#2(％)   相对误差(％)
  LLOQ   0.5   7.0   10.8   55.0
  L-QC   2.0   6.0   8.3   37.1
  M-QC   10.0   7.2   8.9   23.3
  H-QC   40.0   12.1   13.5   11.7
CV#I＝平板间SD/样品均值
CV#2＝平板间SD/标称浓度
实施例7
测量人血清中的肌抑制素浓度
使用上文所述检验，测量肌抑制素的循环浓度并在健康人血清中比较。在一个研究中，评价年轻和年老男性的血清肌抑制素水平。还检查了使用来自睾酮剂量应答研究的储存样品的睾酮处理对循环肌抑制素水平的影响。在先前已公开其细节(Bhasin S等J Clin Endocrinol Metab2005；90：678-88，Bhasin S等Am J Physiol Endocrinol Metab 2001；281：El172-81和Storer TVV等J Clin Endocrinol Metab 2003；88：1478-85)的研究中，对健康年轻和年老男性使用分级剂量的睾酮伴随着骨骼肌肉量和强度的剂量-依赖型提高。在另一研究中，评价健康和手术绝经的女性的血清。
在第一个研究中，血清样品来自于健康的、具有正常睾酮水平的、年龄18-35岁的年轻男性和年龄60-75岁的老年男性，他们如上文所述参与睾酮剂量应答研究。研究方案由Charles R.Drew University and Harbor-UCLA Research and Education Institute的机构评审委员会(institutional review board)批准。排除标准包括前列腺癌病史、PSA＞4ng/ml、AUA下泌尿道综合征调查问卷中评分＞7、血细胞比容＞48％、严重的睡眠呼吸暂停、糖尿病、充血性心力衰竭、之前六个月内的心肌梗死、在前一年中使用雄激素、或参与中度到激烈的运动训练方案。在四周对照周期后，将参与者随机指定至五个处理组之一，每月接受GnRH激动剂注射(亮丙瑞林储剂(leuprolide depot)，7.5mg；TAP，North Chicago，IL)来阻抑内源促性腺素生产。参与者还以下述五种剂量之一每周接受肌肉内睾酮庚酸盐注射(TE，Delatestryl，200mg/ml；Savient Pharmaceuticals，Inc.，Iselin，NJ)：每周25mg、50mg、125mg或300mg。
将血清样品(或Belgian Blue血清中的校准样品)与酸解离缓冲液(0.2M甘氨酸-HCl pH 2.5)以1∶13.3的比例混合。对非解离检验而言，将样品与THST缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.0、500mM NaCl、1mM甘氨酸、0.05％Tween-20；pH 8.0)而不是甘氨酸-HCl缓冲液混合。用涂覆缓冲液(100mM硼酸钠，pH 9.1)中2.0mg/ml RK35将检验平板(Immulon 4HBX#3855)在4℃下孵育过夜，洗涤并用200μl/孔的SuperBlock-TBS(Pierce#37535)封闭。将稀释的血清样品(100μL)转移至检验平板，在室温下孵育90分钟，用THST洗涤4次并向每个孔中添加100μl经生物素化的Rk-22第二抗体(0.1μg/ml)，在室温下反应90分钟。将平板用THST洗涤4次，并添加THST缓冲液中1∶40,000稀释的100μL链霉亲和素-HRP(SouthernBiotech#7100-05)，在室温下反应1小时。将平板用THST再洗涤四次，并通过添加100μL TMB底物后在室温下反应12分钟来显影。每孔添加100μl 0.5M H2SO4，并用设置于540nm处的波长校正在OD 450nm处读取ELISA平板。
校准曲线范围：通过绘制OD和每个校准物的相应浓度，产生校准曲线。使用5-参数对数拟合和拟合校准曲线。在每个检验之前制备校准曲线，所述校准曲线由在Belgian Blue血清中从73pg/ml扩大至75,000pg/mL的重组人成熟肌抑制素的2倍稀释液组成。从六次分析运行中测定11个校准物重读(read-back)数值的测定内和测定间不精密性。针对每个分析运行(来评价测定内不精密性)和所有分析运行(来评价测定间不精密性)计算均值、SD、％CV和外推的浓度的％偏移。定量的下限和上限(分别)被定义为能够测量的最低(LLQ)和最高(ULQ)校准物浓度，其中测定内％CV和％偏移≤30％。
制备验证样品：使用来自健康受试者的血清样品制备对应于低、中-范围和高血清肌抑制素浓度的三组验证样品，所述受试者的内源肌抑制素浓度分别在校准曲线的较低端和中-范围内。高验证样品是来自掺入重组肌抑制素蛋白的健康受试者的血清样品。
测定内和测定间不精确性：在五次独立的分析运行中，在三种验证样品(低、中、高)中每一种的六个独立的小份试样中测量测定内和测定间CV。从25个独立分析运行中三种QC样品中每一种的23个独立的小份试样中测量的自肌抑制素测定QC分析运行可信范围(总检验变化均值+/-2SD)。在每个样品分析运行中分析三种QC样品(QC-低、QC-中和QC-高)中每一种的一个小份试样。如果在三种QC样品中的两个中测量的肌抑制素浓度在确定的可信范围内，则接受这一分析运行。
其它检验：通过特异性放射免疫检验测量血清总睾酮水平，所述放射免疫检验先前针对液相色谱串联质谱法(LC-MSI/MS)验证。总T检验的测定内和测定间差异系数分别为8.2％和13.2％。通过具有0.22pglml灵敏度的灵敏的放射免疫检验测量通过平衡透析步骤从血清中分离的游离T，测定内和测定间差异系数分别为4.2％和12.3％(Sinha-Hikim等J ClinEndocrinol Metab 1998；83：1312-8)。通过分析在木炭清除的血清中制备的样品，将放射免疫检验和LC-MS/MS方法与添加了已知量T的相比。这些测量展示了放射免疫检验和LC-MS/MS测量之间具有0.99的相关性。通过具有6.25nmol/L灵敏度的免疫荧光检验测量血清性激素结合球蛋白(SHBG)水平。通过双能量X-射线吸光度法(DEW，Hologic 4500，Waltham，MA)评价基线和第20周期间的身体组成。使用身体组成模型在每次测量之前校准仪器。
统计学分析：针对方差分布和均一性评价所有输出变量；对不满足方差均一性或正常分布假设的变量进行对数转化。使用ANOVA评价通过年龄、年轻vs.年老分级的剂量组之间的差异，如果ANOVA鉴定出差异，则在单个时间点用Sheffe′s检验来测定哪个组显著差异。用成对t-检验评价组内从基线到处理的改变。为了测定统计学显著性，将α设定为0.05。除非在图例中另有说明，将数据表示为均值+/-SEM或相对于基线的平均改变％+/-SEM。
肌抑制素检验特征：线性范围：对标准曲线中11个校准物(73-75,000pg/mL)中每一种而言，在六次分析运行中测定平均测定内和测定间不精确性(下表7)。73pg/mL校准物的测定间CV为36.4％，其超出可测出的界限(＜30％)。因此，通过下一校准物点(147pg/mL)测定检验的LLQ，在该点处测定间CV和％偏移分别为19.7％和3.4％。75,000pg/mL校准物的32.4％的测定间CV也不在可检出的界限内(＜30％)，在这一校准物下CV和％偏移分别为3.6％和0.8％。在生物学相关基质中，检验的线性定量范围从143pg/mL扩大至37,500pg/mL。
表7：
肌抑制素校准曲线的测定内和测定间不精确性
测定的CV
Figure BPA00001176820001031
测定内和测定间不精确性：五次分析运行中低、中和高验证样品中的平均肌抑制素浓度(pg/mL，+/-SD)分别为3739+/-146、7615+/-125和18268+/-948。针对低、中和高验证样品(对每种验证样品而言n＝5)测量的测定内CV分别为4.1％、4.7％和7.2％，并且测定间CV分别为3.9％、1.6％和5.2％。
检验特异性：成熟的肌抑制素蛋白在哺乳动物物种(4)之间具有高的序列保守程度，允许对许多非人样品(包括小鼠、大鼠、狗、牛和猴子)使用肌抑制素检验。在解离性酸性条件下测定来自肌抑制素缺陷型牛(Belgian Blue)和来自肌抑制素基因中具有失活突变的小鼠(mstn KO)的血清样品，并与相同物种的正常动物比较(图29A)。在正常小鼠中血清肌抑制素是丰富的(～120ng/ml)，但是正常牛血清均值约为40ng/mL。相反，在来自Belgian Blue牛和肌抑制素KO小鼠的血清中，肌抑制素蛋白均是不可检出的，证实了检验针对肌抑制素的特异性，因为这些肌抑制素-无效动物中的突变废止了所述蛋白质的合成。
人受试者的基线特征：61位随机化年轻男性中的52位和60位随机化的年老男性中的51位完成了处理期。对50位年轻男性和48位年老男性而言，在第20周可获得用于肌抑制素检验和身体组成数据的足量血清；这些受试者包括在该第二分析中，并且在下表8中展示了他们的基线特征。总体药物顺应率大于99％。
在年轻或年老组任一中，基线处五个剂量组之间基线总睾酮、游离睾酮、游离睾酮百分比、SHBG浓度无差异。然而，年老男性具有比年轻男性更低的血清总睾酮和游离睾酮，以及更高的SHBG。年老男性中的体重、身体质量指数和脂肪质量大于年轻男性，但是两组中高度类似。
表8
评价的受试者的基线特征
 年轻男性(n＝50)  年老男性(n＝48)
  年龄(岁)   26.5±4.6   66.4±4.7
  身高(cm)   176.3±6.4   175.9±5.7
  体重(kg)   75.1±10.9   83.2±11.7
  BMI(kg/m2)   24.1±3.0   26.9±3.5
  无脂肪体重(kg)   57.6±7.2   57.9±6.3
  脂肪量百分比   18.0±6.4   26.6±5.4
  总睾酮水平   578.4±165.2   330.6±96.1
年轻和年老男性中的肌抑制素水平：年轻和年老男性中的血清肌抑制素水平均正常分布。年轻男性具有比年老男性显著更高的肌抑制素水平(8.0+/-0.3vs.7.0+/-0.4ng/mL，P＝0.03)(图30A)。年轻或年老男性中血清肌抑制素水平与通过DEXA测量的无脂肪体重均不显著相关(图30B和30C)。类似地，基线处肌抑制素水平和体重、身体质量指数或血清睾酮水平之间均无显著相关性(未展示)。
睾酮施用对男性中肌抑制素水平的影响：在年轻或年老男性中的五个剂量组间，基线处的血清肌抑制素水平均不显著差异。在年轻和年老男性中，与基线相比低56天的血清肌抑制素水平均显著更高(图31A)。在年轻或年老男性任一的五个剂量组间，血清肌抑制素浓度的改变未显著差异。年老男性经历了比年轻男性显著更高的肌抑制素水平提高百分比(图31B)。睾酮疗法期间肌抑制素水平的提高未保持；因此，第140天的血清肌抑制素水平与基线处的无显著差异。
高于基线的肌抑制素水平提高与睾酮浓度的改变相关。从基线到第56天肌抑制素水平的改变与年轻男性中的总(图32A)和游离(图32C)睾酮浓度显著正相关，但是在年老男性(图32B和32D)中则并非如此。如先前所报道的，睾酮处理与无脂肪身体质量的显著增加相关；无脂肪身体质量的改变与睾酮剂量和睾酮浓度显著相关，如先前所述。然而，无脂肪身体质量不与肌抑制素浓度的绝对改变或百分比改变(图32E和32F)任一显著相关。
女性中的肌抑制素水平：在另一研究中，从BioServe，Beltsville，MD购买健康的年龄19-21岁的年轻行经女性和年龄67-87岁的绝经后女性的血清样品。这些参与者同意参与IRB-批准的Bioserve研究。手术绝经的女性年龄为18-55岁，她们在招募前至少6个月进行了卵巢手术，并且血清FSH＞30U/L、BMI＜35kg/m2、在之前12个月中具有正常的PAP涂片和乳房X线照片(mammogram)，并且提供了Boston University IRB批准的书面知情同意书。
年轻女性中的血清肌抑制素水平与年轻男性中无显著差异(图33)。年轻行经女性、手术绝经和天然绝经女性中的肌抑制素水平无显著差异。
序列表
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<210>1
<211>109
<212>PRT
<213>Homo sapiens
 
<400>1
 
Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys
1               5                   10                  15
Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile
            20                  25                  30
Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu
        35                  40                  45
Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala
    50                  55                  60
Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser
65                  70                  75                  80
Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly
                85                  90                  95
Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser
            100                 105
 
<210>2
<211>375
<212>PRT
<213>Homo sapiens
 
<400>2
 
Met Gln Lys Leu Gln Leu Cys Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile
1               5                   10                  15
Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn
            20                  25                  30
Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr
        35                  40                  45
Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys I1e Gln I1e Leu Ser Lys Leu
    50                  55                  60
Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Val Ile Arg Gln Leu
65                  70                  75                  80
Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val
                85                  90                  95
Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His
            100                 105                 110
Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu
        115                 120                 125
Met Gln Val Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser
    130                 135                 140
Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu
145                 150                 155                 160
Arg Pro Val Glu Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu
                165                 170                 175
Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu
            180                 185                 190
Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val
        195                 200                 205
Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly
    210                 215                 220
Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr
225                 230                 235                 240
Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys
                245                 250                 255
Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys
            260                 265                 270
Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val
        275                 280                 285
Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr
    290                 295                 300
Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys
305                 310                 315                 320
Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala
                325                 330                 335
Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr
            340                 345                 350
Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val
        355                 360                 365
Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser
    370                 375
 
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>Homo sapiens
 
<400>3
gattttggtc ttgactgt                                           18
 
<210>4
<211>6
<212>PRT
<213>Homo sapiens
 
<400>4
Asp Phe Gly Leu Asp Cys
1               5
 
<210>5
<211>45
<212>DNA
<213>Homo sapiens
 
<400>5
tttgaagctt ttggatggga ttggattatc gctcctaaaa gatat             45
 
<210>6
<211>15
<212>PRT
<213>Homo sapiens
 
<400>6
 
Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr
1               5                   10                  15
 
<210>7
<211>45
<212>DNA
<213>Homo sapiens
 
<400>7
tttgtattttt acaaaaata tcctcatact catctggtac accaa             45
 
<210>8
<211>15
<212>PRT
<213>Homo sapiens
 
<400>8
 
Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln
1               5                   10                  15
 
<210>9
<211>27
<212>DNA
<213>Homo sapiens
 
<400>9
tgctctggag agtgtgaatt tgtattt                                 27
 
<210>10
<211>9
<212>PRT
<213>Homo sapiens
 
<400>10
 
Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe
1               5
 
<210>11
<211>75
<212>DNA
<213>Homo sapiens
 
<400>11
tggattatcg ctcctaaaag atataaggcc aattactgct ctggagagtg tgaatttgta     60
tttttacaaa aatat                                                      75
 
<210>12
<211>25
<212>PRT
<213>Homo sapiens
 
<400>12
 
Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu
1               5                   10                  15
Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr
            20                  25
 
<210>13
<211>360
<212>DNA
<213>Mus musculus
 
<400>13
caggttcagc tccagcagtc tggggctgag ctggcaagac ctggggcttc agtgaagttg     60
tcctgcaagg cttctggcta cacctttact agctactgga tgcagtgggt aaaacagagg    120
cctggacagg gtctggaatg gattggggct atttatcctg gagatggtga tactaggtac    180
actcagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgcagata aatcctccag cacagcctac    240
atgcaactca gcagcttggc atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaatgggt    300
ggttacgacc ggtactactt tgactactgg ggccaaggca ccactctcac agtctcctca    360
 
<210>14
<211>120
<212>PRT
<213>Mus musculus
 
<400>14
 
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp GIy Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Met Gly Gly Tyr Asp Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
        115                 120
 
<210>15
<211>339
<212>DNA
<213>Mus Musculus
 
<400>15
gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctggctatgt cagtaggaca gaaggtcact     60
atgagctgca agtccagtca gagcctttta aatagtgcca atcaaaagaa ctatttggcc    120
tggtaccagc agaaaccagg acagtctcct aaacttctgg tatactttgc atccactagg    180
gaatctgggg tccctgatcg cttcataggc agtggatctg ggacagattt cactcttacc    240
atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gattacttct gtcagcaaca ttataacact    300
ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaa                           339
 
<210>16
<211>113
<212>PRT
<213>Mus musculus
 
<400>16
 
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
            20                  25                  30
Ala Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
        35                  40                  45
Ser Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln
                85                  90                  95
His Tyr Asn Thr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
            100                 105                 110
Lys
<210>17
<211>120
<212>PRT
<213>Homo sapiens
 
<400>17
 
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Met Gly Gly Tyr Asp Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
 
<210>18
<211>113
<212>PRT
<213>Homo sapien
 
<400>18
 
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
            20                  25                  30
Ala Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
        35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
                85                  90                  95
His Tyr Asn Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
            100                 105                 110
Lys
<210>19
<211>5
<212>PRT
<213>Mus musculus
 
<400>19
 
Ser Tyr Trp Met Gln
1               5
 
<210>20
<211>17
<212>PRT
<213>Mus musculus
 
<400>20
 
Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
 
<210>21
<211>13
<212>PRT
<213>Mus musculus
 
<400>21
 
Ala Arg Met Gly Gly Tyr Asp Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1               5                   10
 
<210>22
<211>17
<212>PRT
<213>Mus musculus
 
<400>22
 
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Ala Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1               5                   10                  15
Ala
 
<210>23
<211>7
<212>PRT
<213>Mus musculus
 
<400>23
 
Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1               5
 
<210>24
<211>9
<212>PRT
<213>Mus musculus
 
<400>24
 
Gln Gln His Tyr Asn Thr Pro Leu Thr
1               5
<210>25
<211>10
<212>PRT
<213>Mus musculus
 
<400>25
 
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Gln
1               5                   10
 
<210>26
<211>9
<212>PRT
<213>Mus musculus
 
<400>26
 
Ala lle Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr
1               5
 
<210>27
<211>13
<212>PRT
<213>Mus musculus
 
<400>27
 
Ala Arg Met Gly Gly Tyr Asp Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1               5                   10
 
<210>28
<211>17
<212>PRT
<213>Mus musculus
 
<400>28
 
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Ala Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1               5                   10                  15
Ala
 
<210>29
<211>7
<212>PRT
<213>Mus musculus
 
<400>29
 
Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1               5
 
<210>30
<211>9
<212>PRT
<213>Mus musculus
 
<400>30
 
Gln Gln His Tyr Asn Thr Pro Leu Thr
1               5
 
<210>31
<211>348
<212>DNA
<213>Mus musculus
 
<400>31
gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc     60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatgcca tgtcttgggt tcgccagact    120
ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtagtg gtggtagtta cacctcctat    180
ccagacagtg tgaagggtcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac    240
ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccatgt attactgtgc aagacaagac    300
tatgctatga actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctca                 348
 
<210>32
<211>300
<212>DNA
<213>Mus Musculus
 
<400>32
gacattgaga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc     60
atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt actgctgtag cctggtatca acagaaacca    120
ggacaatctc ctaaactact gctttactcg gcatcctacc ggtacactgg agtccctgat    180
cggttcactg gcagtggatc tgggacggat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct    240
gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatagta ctccgtggac gttcggtgga    300
 
<210>33
<211>351
<212>DNA
<213>Homo sapiens
 
<400>33
caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt     60
tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactata tgcactgggt gcgacaggcc    120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacccta gtggtggtag cacaagctac    180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac    240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagacgag    300
aactgggggt tcgacccctg gggccaggga accctggtca ccgtctcgag t             351
 
<210>34
<211>315
<212>DNA
<213>Homo sapiens
 
<400>34
tcctatgagc tgactcagcc accctcagtg tccgtgtctc caggacagac agccaccatt     60
acctgctctg gacatgcact gggggacaaa tttgtttcct ggtatcagca gggatcaggc    120
cagtcccctg tattggtcat ctatgacgat acccagcggc cctcagggat ccctgggcga    180
ttctctggct ccaactctgg gaacacagcc actctgacca tcagcgggac ccaggctatg    240
gatgaggctg actatttttg tcaggcgtgg gacagcagct tcgtattcgg cggagggacc    300
aaggtcaccg tccta                                                     315
 
<210>35
<211>1543
<212>DNA
<213>Homo sapien
<400>35
gaacatgacg gcgccctggg tggccctcgc cctcctctgg ggatcgctgt gcgccggctc     60
tgggcgtggg gaggctgaga cacgggagtg catctactac aacgccaact gggagctgga    120
gcgcaccaac cagagcggcc tggagcgctg cgaaggcgag caggacaagc ggctgcactg    180
ctacgcctcc tggcgcaaca gctctggcac catcgagctc gtgaagaagg gctgctggct    240
agatgacttc aactgctacg ataggcagga gtgtgtggcc actgaggaga acccccaggt    300
gtacttctgc tgctgtgaag gcaacttctg caacgaacgc ttcactcatt tgccagaggc    360
tgggggcccg gaagtcacgt acgagccacc cccgacagcc cccaccctgc tcacggtgct    420
ggcctactca ctgctgccca tcgggggcct ttccctcatc gtcctgctgg ccttttggat    480
gtaccggcat cgcaagcccc cctacggtca tgtggacatc catgaggacc ctgggcctcc    540
accaccatcc cctctggtgg gcctgaagcc actgcagctg ctggagatca aggctcgggg    600
gcgctttggc tgtgtctgga aggcccagct catgaatgac tttgtagctg tcaagatctt    660
cccactccag gacaagcagt cgtggcagag tgaacgggag atcttcagca cacctggcat    720
gaagcacgag aacctgctac agttcattgc tgccgagaag cgaggctcca acctcgaagt    780
agagctgtgg ctcatcacgg ccttccatga caagggctcc ctcacggatt acctcaaggg    840
gaacatcatc acatggaacg aactgtgtca tgtagcagag acgatgtcac gaggcctctc    900
atacctgcat gaggatgtgc cctggtgccg tggcgagggc cacaagccgt ctattgccca    960
cagggacttt aaaagtaaga atgtattgct gaagagcgac ctcacagccg tgctggctga   1020
ctttggcttg gctgttcgat ttgagccagg gaaacctcca ggggacaccc acggacaggt   1080
aggcacgaga cggtacatgg ctcctgaggt gctcgaggga gccatcaact tccagagaga   1140
tgccttcctg cgcattgaca tgtatgccat ggggttggtg ctgtgggagc ttgtgtctcg   1200
ctgcaaggct gcagacggac ccgtggatga gtacatgctg ccctttgagg aagagattgg   1260
ccagcaccct tcgttggagg agctgcagga ggtggtggtg cacaagaaga tgaggcccac   1320
cattaaagat cactggttga aacacccggg cctggcccag ctttgtgtga ccatcgagga   1380
gtgctgggac catgatgcag aggctcgctt gtccgcgggc tgtgtggagg agcgggtgtc   1440
cctgattcgg aggtcggtca acggcactac ctcggactgt ctcgtttccc tggtgacctc   1500
tgtcaccaat gtggacctgc cccctaaaga gtcaagcatc taa                     1543
 
<210>36
<211>512
<212>PRT
<213>Homo sapien
 
<400>36
 
Met Thr Ala Pro Trp Val Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Cys
1               5                   10                  15
Ala Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr
            20                  25                  30
Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg
        35                  40                  45
Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg
    50                  55                  60
Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp
65                  70                  75                  80
Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn
                85                  90                  95
Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg
            100                 105                 110
Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro
        115                 120                 125
Pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Leu Ala Tyr Ser Leu Leu
    130                 135                 140
Pro Ile Gly Gly Leu Ser Leu Ile Val Leu Leu Ala Phe Trp Met Tyr
145                 150                 155                 160
Arg His Arg Lys Pro Pro Tyr Gly His Val Asp Ile His Glu Asp Pro
                165                 170                 175
Gly Pro Pro Pro Pro Ser Pro Leu Val Gly Leu Lys Pro Leu Gln Leu
            180                 185                 190
Leu Glu Ile Lys Ala Arg Gly Arg Phe Gly Cys Val Trp Lys Ala Gln
        195                 200                 205
Leu Met Asn Asp Phe Val Ala Val Lys Ile Phe Pro Leu Gln Asp Lys
    210                 215                 220
Gln Ser Trp Gln Ser Glu Arg Glu Ile Phe Ser Thr Pro Gly Met Lys
225                 230                 235                 240
His Glu Asn Leu Leu Gln Phe Ile Ala Ala Glu Lys Arg Gly Ser Asn
                245                 250                 255
Leu Glu Val Glu Leu Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Asp Lys Gly Ser
            260                 265                 270
Leu Thr Asp Tyr Leu Lys Gly Asn Ile Ile Thr Trp Asn Glu Leu Cys
        275                 280                 285
His Val Ala Glu Thr Met Ser Arg Gly Leu Ser Tyr Leu His Glu Asp
    290                 295                 300
Val Pro Trp Cys Arg Gly Glu Gly His Lys Pro Ser Ile Ala His Arg
305                 310                 315                 320
Asp Phe Lys Ser Lys Asn Val Leu Leu Lys Ser Asp Leu Thr Ala Val
                325                 330                 335
Leu Ala Asp Phe Gly Leu Ala Val Arg Phe Glu Pro Gly Lys Pro Pro
            340                 345                 350
Gly Asp Thr His Gly Gln Val Gly Thr Arg Arg Tyr Met Ala Pro Glu
        355                 360                 365
Val Leu Glu Gly Ala Ile Asn Phe Gln Arg Asp Ala Phe Leu Arg Ile
    370                 375                 380
Asp Met Tyr Ala Met Gly Leu Val Leu Trp Glu Leu Val Ser Arg Cys
385                 390                 395                 400
Lys Ala Ala Asp Gly Pro Val Asp Glu Tyr Met Leu Pro Phe Glu Glu
                405                 410                 415
Glu Ile Gly Gln His Pro Ser Leu Glu Glu Leu Gln Glu Val Val Val
            420                 425                 430
His Lys Lys Met Arg Pro Thr Ile Lys Asp His Trp Leu Lys His Pro
        435                 440                 445
Gly Leu Ala Gln Leu Cys Val Thr Ile Glu Glu Cys Trp Asp His Asp
    450                 455                 460
Ala Glu Ala Arg Leu Ser Ala Gly Cys Val Glu Glu Arg Val Ser Leu
465                 470                 475                 480
Ile Arg Arg Ser Val Asn Gly Thr Thr Ser Asp Cys Leu Val Ser Leu
                485                 490                 495
Val Thr Ser Val Thr Asn Val Asp Leu Pro Pro Lys Glu Ser Ser Ile
            500                 505                 510

Claims (48)

1.生长与分化因子8(GDF8)的特异性拮抗剂，其中所述拮抗剂是特异性结合GDF8并且不特异性结合BMP11的抗-GDF8抗体或抗原结合蛋白，其中所述抗体或抗原结合蛋白选自下述构成的组：多克隆抗体；单克隆抗体；单特异性抗体；多特异性抗体；人源化抗体；四聚体抗体；四价抗体；多样特异性抗体；单链抗体；结构域-特异性抗体；单结构域抗体；结构域-缺失的抗体；融合蛋白；ScFc融合蛋白；单-链抗体；嵌合抗体；合成抗体；重组抗体；杂合抗体；经突变的抗体；CDR-移植的抗体；抗体片段，包括Fab、F(ab′)2、Fab′片段、Fv片段、单-链Fv(ScFv)片段、Fd片段、dAb片段；抗原结合蛋白，包括双抗体、CDR3肽、受约束的FR3-CDR3-FR4肽、微体、二价微体、小模块免疫药物(SMIPs)、鲨鱼可变IgNAR结构域和小体。
2.权利要求1的拮抗剂，其中所述抗体或抗原结合蛋白包含至少一个下述互补性决定区(CDR)，所述互补性决定区包含选自SEQ ID NO：19的氨基酸序列、SEQ ID NO：20的氨基酸序列、SEQ ID NO：21的氨基酸序列、SEQ ID NO：22的氨基酸序列、SEQ ID NO：23的氨基酸序列、SEQ IDNO：24的氨基酸序列、SEQ ID NO：25的氨基酸序列、SEQ ID NO：26的氨基酸序列、SEQ ID NO：27的氨基酸序列、SEQ ID NO：28的氨基酸序列、SEQ ID NO：29的氨基酸序列、SEQ ID NO：30的氨基酸序列构成的组的氨基酸序列。
3.权利要求2的拮抗剂，其中所述抗体或抗原结合蛋白包含重链，并且其中所述重链包含第一、第二和第三互补性决定区，
其中所述第一互补性决定区包含选自SEQ ID NO：19的氨基酸序列和SEQ ID NO：25的氨基酸序列构成的组的氨基酸序列，
其中所述第二互补性决定区包含选自SEQ ID NO：20的氨基酸序列、SEQ ID NO：26的氨基酸序列构成的组的氨基酸序列，
并且其中所述第三互补性决定区包含选自SEQ ID NO：21的氨基酸序列、SEQ ID NO：27的氨基酸序列构成的组的氨基酸序列。
4.权利要求1的拮抗剂，其中所述抗体或抗原结合蛋白包含下述重链，所述重链含有选自SEQ ID NO：14的氨基酸序列和SEQ ID NO：18的氨基酸序列构成的组的氨基酸序列。
5.权利要求2的拮抗剂，其中所述抗体或抗原结合蛋白包含下述轻链，并且其中所述轻链包含第一、第二和第三互补性决定区，
其中所述第一互补性决定区包含选自SEQ ID NO：22的氨基酸序列和SEQ ID NO：28的氨基酸序列构成的组的氨基酸序列，
其中所述第二互补性决定区包含选自SEQ ID NO：23的氨基酸序列和SEQ ID NO：29的氨基酸序列构成的组的氨基酸序列，
并且其中所述第三互补性决定区包含选自SEQ ID NO：24的氨基酸序列和SEQ ID NO：30的氨基酸序列构成的组的氨基酸序列。
6.权利要求1的拮抗剂，其中所述抗体或抗原结合蛋白包含下述轻链，所述轻链包含选自SEQ ID NO：16的氨基酸序列和SEQ ID NO：17的氨基酸序列构成的组的氨基酸序列。
7.权利要求1的拮抗剂，其中所述抗体或抗原结合蛋白包含含有SEQID NO：16的氨基酸序列的轻链，并且其中所述抗体还包含含有SEQ IDNO：14的氨基酸序列的重链。
8.权利要求1的拮抗剂，其中所述抗体或抗原结合蛋白包含含有SEQID NO：17的氨基酸序列的轻链，并且其中所述抗体还包含含有SEQ IDNO：18的氨基酸序列的重链。
9.多核苷酸，其编码包含权利要求1-8中任一项的GDF8拮抗剂的氨基酸。
10.包含权利要求9的多核苷酸的宿主细胞，其中所述多核苷酸与调控序列可操作地连接。
11.包含权利要求9的多核苷酸的载体。
12.包含权利要求11的载体的宿主细胞。
13.生产GDF8拮抗剂的方法，所述方法包括培养权利要求12的包含多核苷酸的宿主细胞，并分离所述宿主细胞表达的所述GDF8拮抗剂。
14.经分离的GDF8拮抗剂，其是通过权利要求13的方法生产的。
15.检测来自受试者的样品中GDF8存在的检验，所述检验包括以下步骤：
(a)将(i)样品；
(ii)特异性结合GDF8的捕获试剂；
(iii)特异性结合GDF8的检测试剂；
合并，并
(b)检测所述捕获试剂与GDF8之间是否发生特异性结合，
其中特异性结合的检测表明所述样品中存在GDF8。
16.权利要求15的检验，所述检验还包括在(a)中合并之前将所述样品与酸性缓冲液合并。
17.根据权利要求16的检验，其中所述酸性缓冲液的pH在约pH 1.0和pH 6.0之间。
18.根据权利要求16的检验，其中所述酸性缓冲液的pH为约pH2.5。
19.权利要求15的检验，其中所述捕获试剂选自：抗-GDF8抗体或抗原结合蛋白；GDF8结合蛋白和GDF8结合结构域构成的组。
20.权利要求19的检验，其中所述捕获试剂是抗-GDF8抗体或抗原结合蛋白，并且选自RK35和RK22。
21.权利要求20的检验，其中所述捕获试剂是RK35。
22.权利要求20的检验，其中所述捕获试剂是RK22。
23.权利要求15的检验，其中所述检测试剂选自抗-GDF8抗体或抗原结合蛋白；GDF8结合蛋白和GDF8结合结构域构成的组。
24.权利要求23的检验，其中所述检测试剂是抗-GDF8抗体或抗原结合蛋白，并且选自RK35和RK22。
25.权利要求24的检验，其中所述检测试剂是RK35。
26.权利要求24的检验，其中所述检测试剂是RK22。
27.定量来自受试者的样品中GDF8的检验，所述检验包括以下步骤：
(a)将(i)样品；
(ii)特异性结合GDF8的捕获试剂；
(iii)特异性结合GDF8的检测试剂；
合并，并
(b)检测所述捕获试剂与GDF8之间是否发生特异性结合，并
(c)定量GDF8水平；
其中特异性结合的检测表明所述样品中GDF8的存在能够被定量。
28.根据权利要求27的检验，所述检验还包括在(a)中合并之前将所述样品与酸性缓冲液合并。
29.根据权利要求28的检验，其中所述酸性缓冲液的pH在约pH 1.0和pH 6.0之间。
30.根据权利要求28的检验，其中所述酸性缓冲液的pH为约pH2.5。
31.包含可药用载体和GDF8拮抗剂的药物组合物，其中所述拮抗剂是特异性结合GDF8但不特异性结合BMP11的抗-GDF8抗体或抗原结合蛋白。
32.如权利要求31所述的药物组合物，其中所述特异性结合GDF8但不特异性结合BMP11的抗-GDF8抗体或抗原结合蛋白包含含有SEQ IDNO：16的氨基酸序列的轻链，并且其中所述抗体还包含含有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的重链。
33.如权利要求31所述的药物组合物，其中所述特异性结合GDF8但不特异性结合BMP11的抗-GDF8抗体或抗原结合蛋白包含含有SEQ IDNO：18的氨基酸序列的轻链，并且其中所述抗体还包含含有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的重链。
34.如权利要求31所述的药物组合物，其中所述特异性结合GDF8但不结合BMP11的抗-GDF8抗体包含至少一个下述互补性决定区(CDR)，所述互补性决定区包含选自SEQ ID NO：19的氨基酸序列、SEQ ID NO：20的氨基酸序列、SEQ ID NO：21的氨基酸序列、SEQ ID NO：22的氨基酸序列、SEQ ID NO：23的氨基酸序列、SEQ ID NO：24的氨基酸序列、SEQ IDNO：25的氨基酸序列、SEQ ID NO：26的氨基酸序列、SEQ ID NO：27的氨基酸序列、SEQ ID NO：28的氨基酸序列、SEQ ID NO：29的氨基酸序列、SEQ ID NO：30的氨基酸序列构成的组的氨基酸序列。
35.用于在哺乳动物患者中治疗GDF8-相关病症的方法，所述方法包括对所述患者施用治疗有效量的几乎无毒到无毒的GDF8特异性拮抗剂。
36.权利要求35的方法，其中所述GDF8拮抗剂是特异性结合GDF8但不特异性结合BMP11的抗-GDF8抗体或抗原结合蛋白。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述GDF8拮抗剂是特异性结合GDF8但不特异性结合BMP11的抗-GDF8抗体或抗原结合蛋白，其包含含有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链，并且其中所述抗体还包含含有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的重链。
38.如权利要求36所述的方法，其中所述GDF8拮抗剂是特异性结合GDF8但不特异性结合BMP11的抗-GDF8抗体或抗原结合蛋白，其包含含有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的轻链，并且其中所述抗体还包含含有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的重链。
39.如权利要求36中所述的方法，其中所述特异性结合GDF8但不特异性结合BMP11的抗-GDF8抗体或抗原结合蛋白包含至少一个下述互补性决定区(CDR)，所述互补性决定区包含选自SEQ ID NO：19的氨基酸序列、SEQ ID NO：20的氨基酸序列、SEQ ID NO：21的氨基酸序列、SEQ IDNO：22的氨基酸序列、SEQ ID NO：23的氨基酸序列、SEQ ID NO：24的氨基酸序列、SEQ ID NO：25的氨基酸序列、SEQ ID NO：26的氨基酸序列、SEQ ID NO：27的氨基酸序列、SEQ ID NO：28的氨基酸序列、SEQ IDNO：29的氨基酸序列、SEQ ID NO：30的氨基酸序列构成的组的氨基酸序列。
40.用于诊断、测定或预测、或检测受试者是否遭受GDF8-相关病症的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)从所述受试者获得第一样品；
(b)将第一样品与如权利要求9所述的拮抗剂合并；
(c)检测所述第一样品中GDF8的存在；
(d)定量所述第一样品中的GDF8水平；
(e)从未遭受GDF8-相关病症的受试者获得第二样品；
(f)将所述第二样品与所述拮抗剂合并；
(g)检测所述第二样品中的GDF8水平；
(h)定量所述第二样品中的GDF9水平并且
(i)比较所述第一样品和所述第二样品中的GDF8水平；
其中与所述第二样品相比，所述第一样品中GDF8水平的提高、降低或类似指示患者是否遭受GDF8-相关病症。
41.药物组合物在制备用于在哺乳动物患者中治疗GDF8-相关病症的药物中的用途，其中所述药物组合物包含可药用载剂和GDF8拮抗剂，其中所述GDF8拮抗剂是特异性结合GDF8但不特异性结合BMP11的抗-GDF8抗体或抗原结合蛋白。
42.用于在来自受试者的样品中检测GDF8的存在或对GDF8进行定量的试剂盒，所述试剂盒包含特异性结合GDF8的捕获试剂，和特异性结合GDF8的检测试剂，其中检测到GDF8对所述捕获和检测试剂的特异性结合指示所述样品中存在GDF8。
43.如权利要求78中所述的试剂盒，其还包含酸性缓冲液。
44.对生长与分化因子8(GDF8)特异性的抗体，其中特异性结合GDF8但不特异性结合BMP11的抗-GDF8抗体或抗原结合蛋白，并且其中所述抗体或抗原结合蛋白选自：多克隆抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体、人源化抗体、四聚体抗体、四价抗体、多样特异性抗体、单链抗体、结构域-特异性抗体、单结构域抗体、结构域-缺失的抗体、融合蛋白、ScFc融合蛋白、单-链抗体、嵌合抗体、合成抗体、重组抗体、杂合抗体、经突变的抗体、CDR-移植的抗体，抗体片段，所述抗体片段包括Fab、F(ab′)2、Fab′片段、Fv片段、单-链Fv(ScFv)片段、Fd片段和dAb片段，抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包括双抗体、CDR3肽、受约束的FR3-CDR3-FR4肽、微体、二价微体、小模块免疫药物(SMIPs)、鲨鱼可变IgNAR结构域和小体构成的组。
45.权利要求44的抗体，其中所述抗体或抗原结合蛋白是单克隆抗体。
46.权利要求45的抗体，其中所述抗体或抗原结合蛋白包含含有SEQID NO：16的氨基酸序列的轻链。并且其中所述抗体还包含含有SEQ IDNO：14的氨基酸序列的重链。
47.权利要求44的抗体，其中所述抗体或抗原结合蛋白是人源化抗体。
48.权利要求47的抗体，其中所述抗体或抗原结合蛋白包含含有SEQID NO：17的氨基酸序列的轻链，并且其中所述抗体还包含含有SEQ IDNO：18的氨基酸序列的重链。
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