JP2011504096A - その使用としてのgdf8に対する抗体 - Google Patents
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Abstract
【図1】
Description
DNAおよびアミノ酸配列を配列表に示し、表1とする。
本明細書および添付の特許請求の範囲中で使用する単数形「a」、「an」および「the」には、内容により明らかにそうでないと指示される場合以外は、複数形へ言及が含まれる。
特異的GDF8抗体およびヒトGDF8の重複を有する13個のアミノ酸のペプチドを用いたエピトープマッピングにより、GDF8の特異的拮抗を標的とし得る、GDF8に特異的な候補エピトープが明らかとなった(実施例4.2)。この手法に基づいて、GDF8に特異的な5個の独立したエピトープを同定した。本発明は、これらのエピトープ(そのペプチド模倣体が含まれる)、エピトープをコードしているポリヌクレオチド、それに対する阻害性ポリヌクレオチド、およびGDF8活性に対する特異的拮抗剤としてそれに関連する抗体を提供する。
本発明は、GDF8に特異的であると生物学的に特徴づけられていてもよく、したがって本明細書中でGDF8に特異的なエピトープと呼ばれる、エピトープに相同的な新規の単離および精製したポリペプチドを提供する。これらのGDF8特異的エピトープのペプチド模倣体を、GDF8拮抗剤として、すなわち、GDF8活性、たとえば、GDF8がその受容体に結合することを拮抗するために使用し得ることが、本発明の一部である。
本開示は、GDF8と特異的に相互作用する新規抗体を提供する(たとえば、抗体または抗原結合タンパク質断片)。そのような抗体の非限定的な例示的な実施形態をRK22と呼ぶ。本発明の抗体は独特かつ有益な特徴を有する。第1に、これらの抗体は、高い親和性で成熟GDF8と結合することができる(実施例2)。第2に、開示した抗体は、GDF8と特異的に相互作用する、すなわち、本発明の抗体は、TGF−βサブファミリー、たとえばBMP11の他のメンバーと高い親和性では結合しない(実施例2)。第3に、本発明の抗体は、実証するように、in vitroおよびin vivoでGDF8活性を阻害する(実施例3)。第4に、開示した抗体は、骨格筋量および骨密度の負の調節に関連するGDF8活性を阻害し得る(実施例3)。
上述のように、本発明は、特異的GDF8拮抗剤として、GDF8に特異的なエピトープをコードしている単離および精製した核酸、またはそれに対するペプチド模倣体もしくは抗体をさらに提供する。本発明による核酸は、DNAまたはRNAを含んでいてよく、全体的または部分的に合成であってよい。本明細書中に記載するヌクレオチド配列への言及には、指定した配列を有するDNA分子またはゲノム均等物、および内容により他のものが必要とされる場合以外はTがUで置換されている指定した配列を有するRNA分子を含む。
本発明は、生体試料中のGDF−8を検出および定量化する方法に関する。一部の実施形態では、この方法は、血清、血液、および血漿中の遊離および全GDF−8の両方を検出および定量化するための免疫アッセイを含む。一例では、免疫アッセイは、抗GDF−8治療のバイオマーカーとして有用なデータを提供する。具体的には、開示した免疫アッセイは、抗GDF−8治療前のベースラインでの臨床成績の予測的/予後的マーカーとして、抗GDF−8治療への曝露のマーカーとして、抗GDF−8薬の有効性または応答のマーカーとして、およびGDF−8が特定の病状または生物学的プロセスに関与していることの診断的マーカーとして、有用であり得る。
本明細書中に記載する免疫アッセイは、少なくとも2個の抗GDF−8抗体を利用するサンドイッチ型ELISAであり、1つはGDF8に特異的なGDF−8捕捉試薬として存在し、1つはGDF8に特異的なGDF−8検出試薬として存在する。どちらの抗体も、生体試料中に存在するGDF−8抗原と結合することができる。抗体の1つは、GDF−8をBMP−11よりも優先的に認識する。どちらの抗体もGDF−8を認識および結合することができる。さらに、特定の実施形態では、抗体は、その生物学的形態のうちの任意のもので存在するGDF−8と結合することができる(たとえば、活性GDF−8、潜在型GDF−8、血清タンパク質と結合したGDF−8、中和抗GDF−8抗体MYO−029と結合したGDF−8)。
一実施形態では、本発明は、生体試料中の遊離GDF−8の存在を検出する方法を含む。本実施形態の代表的な例を図21に示す。
一実施形態では、本発明は、生体試料中の全GDF−8の存在を検出する方法を含む。
一実施形態では、全GDF−8を検出および定量化する方法は、酸解離方法を利用し、(a)GDF−8捕捉抗体を生体試料と、生体試料中に存在する場合にGDF−8が1つまたは複数の捕捉抗体と結合して捕捉抗体−GDF−8の複合体を形成することを可能にする酸性条件下(約pH1.0〜約pH6.0、好ましくは約pH2.5)で合わせ、捕捉抗体−GDF−8の複合体と結合するGDF−8検出抗体)を複合体形成条件下で加えるステップと、(b)存在する場合は、捕捉抗体−GDF−8の複合体と検出抗体との間に形成された複合体を、生体試料中のGDF−8の指標として検出するステップとを含む。
別の実施形態では、全GDF−8を検出および定量化する方法は、熱解離方法を利用し、(a)GDF−8捕捉抗体または抗原結合タンパク質を固体担体の表面と接触させるステップと、(b)生体試料を、少なくとも63℃、たとえば、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、または90℃まで、少なくとも3分間、たとえば、5、7、9、10、12、14、または15分間加熱し、生体試料を固体担体と、生体試料中に存在する場合にGDF−8が1つまたは複数の捕捉抗体と結合して捕捉抗体−GDF−8の複合体を形成することを可能にする条件下で合わせるステップと、(c)捕捉抗体−GDF−8の複合体と結合する検出抗体を、ステップ(b)の固体担体に複合体形成酸性条件下で加えるステップと、(d)存在する場合は、捕捉抗体−GDF−8の複合体と検出抗体との間に形成された複合体を、生体試料中のGDF−8の指標として検出するステップとを含む。
特定の実施形態では、捕捉抗体を、固体担体または反応器の表面、たとえば、表面と共有結合または非共有結合させることによって接触させる。接触は、直接または間接的であり得る。表面は、表面の結合特徴に影響を与えるために、たとえば、化学的または放射線処理によって改変されていてもよい。
GDF−8レベルは、当業者に周知の方法を用いて定量化し得る。特定の実施形態では、生体試料中のGDF−8レベルを、たとえば検量線を用いることによって得られたものなどの既知のレベルと比較する。GDF−8検量線の作成を実施例15に実証する。検量線は、緩衝液で希釈した既知の濃度のGDF−8を含み得る。特定の実施形態では、緩衝液は、たとえば、ヒト血清、マウス血清、霊長類血清、ウシ血清、またはヒツジ血清などの血清である。血清は、既知の濃度のGDF−8を加える前に内在性GDF−8を枯渇させていてもよい。血清は、天然でGDF−8を欠くベルジアンブルー畜牛から得てもよい。
GDF8関連障害、たとえば、骨格筋、骨、グルコース恒常性などの発生および/または調節におけるGDF8の関与、ならびに本発明の新規特異的GDF8拮抗剤の発見は、GDF8関連障害、たとえば、筋肉障害、神経筋障害、骨変性疾患、代謝性または誘導性骨障害、グルコース代謝障害、脂肪障害、およびインスリン関連障害を治療、寛解または予防する方法を可能にする。さらに、拮抗剤は、生体試料中のGDF8のレベルを測定することによって、そのような障害の進行の診断、予後診断および監視を可能にする。特に、本発明のGDF8に特異的な拮抗剤エピトープ(たとえば、それに対するペプチド模倣体、それに対する阻害性ポリヌクレオチド、それに対する抗体、小分子など)を、GDF8関連障害に罹患している個体を治療するために、または患者がGDF8関連障害に罹患しているかどうかを識別する方法において使用し得る。
本発明のさらに別の態様は、たとえば、筋肉、グルコース代謝、脂肪、および骨障害の治療に有用な治療剤を同定する方法を提供する。適切なスクリーニングアッセイ、たとえばELISAに基づいたアッセイが当分野で知られている。そのようなスクリーニングアッセイでは、第1の結合混合物は、拮抗剤、特にGDF8に特異的なエピトープのペプチド模倣体または本発明の抗体もしくは抗原結合タンパク質およびそのリガンド、GDF8を合わせることによって形成し、第1の結合混合物中のリガンドと抗体との結合の量(M0)を測定する。第2の結合混合物も、拮抗剤、リガンド、およびスクリーニング化合物または薬剤を合わせることによって形成し、第2の結合混合物中のリガンドと抗体との結合の量(M1)を測定する。その後、第1および第2の結合混合物中の結合の量を、たとえばM1/M0比を計算することによって比較する。化合物または薬剤は、第1の結合混合物と比較して第2の結合混合物中の結合の減少が観察された場合に(すなわち、M1/M0<1)、GDF8と特異的に相互作用することができるとみなされる。結合混合物の配合および最適化は、当分野の技術レベル内にあり、そのような結合混合物は、結合を増強または最適化するために必要な緩衝液および塩も含有してよく、追加の対照アッセイも本発明のスクリーニングアッセイに含め得る。
また、GDF8関連障害に罹患している(もしくはその危険性にある)生物(もしくは対象)、またはそのような障害に関与しているそのような生物からの細胞におけるGDF8活性の阻害は、GDF8を拮抗する、すなわちその活性を阻害する拮抗剤小分子(通常は有機小分子)の使用によっても達成し得る。新規拮抗性小分子は、上述のスクリーニング方法によって同定してもよく、本明細書中に記載の本発明の治療方法で使用し得る。
たとえば、筋肉、骨、グルコース代謝、および脂肪障害の治療に加えて、本発明は、生体試料、たとえば、血清、血漿、気管支肺胞洗浄液、痰、生検(たとえば筋組織のもの)など中のGDF8の減少または増加を検出することによって、そのような障害を診断する方法を提供する。「診断的」または「診断すること」とは、病的状態の存在または非存在を同定することを意味する。診断方法は、たとえば、対象(ヒトまたは非ヒト哺乳動物)からの生体試料中のGDF8ポリペプチドの試験量を決定し、試験量を、正常な量または範囲(たとえば、そのような障害に罹患していないことが知られている個体(複数可)からの量または範囲)と、GDF8ポリペプチドについて比較することによって、GDF8の存在を検出することを含む。特定の診断方法はGDF8関連障害の明確な診断をもたらさない場合があるが、方法が診断を補助する陽性指標を提供すれば十分である。
本発明は、本明細書中で開示した本発明の拮抗剤、すなわち、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、抗体、抗体または抗原結合タンパク質断片、および小分子を含む組成物を提供する。そのような組成物は、薬学的使用および患者への投与に適している場合がある。組成物は、典型的には、本発明の1つまたは複数の分子、好ましくは抗体または抗原結合タンパク質と、薬学的に許容できる賦形剤とを含む。本発明の拮抗剤は、in vitroで、ex vivoで、または薬学的に許容できる担体と組み合わせた場合は医薬組成物内に取り込まれて使用することができる。本明細書中で使用する語句「薬学的に許容できる賦形剤」には、薬学的投与に適合している任意かつすべての溶媒、溶液、緩衝液、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。そのような組成物は、本発明の拮抗剤および担体に加えて、様々な希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定化剤、可溶化剤、および当分野で周知の他の物質を含有し得る。用語「薬学的に許容できる」とは、活性成分の生物活性の有効性を妨げない無毒性の物質を意味する。担体の特徴は投与経路に依存する。薬学的に活性のある物質のそのような媒体および薬剤の使用は、当分野で周知である。また、組成物は、補足の、追加の、または増強した治療機能をもたらす他の活性化合物も含有し得る。また、医薬組成物は、投与の指示と共に、容器、パック、またはディスペンサー中に含めてもよい。
一実施形態では、特異的GDF8拮抗剤は、循環中、たとえば、血液、血清、リンパ液、気管支肺もしくは気管支肺胞洗浄液、または他の組織中のその安定化および/または保持を、たとえば、少なくとも1.5、2、5、10、または50倍改善する部分と物理的に結合している。
ハイブリドーマ細胞の作製およびRK22抗GDF8抗体の単離
GDF8(ミオスタチン)ノックアウトマウス(McPherronら(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、94:12457〜61)を、LeeおよびMcPherron(1999)Curr.Opin.Genet.Dev.、9:604〜07に記載のように、フロイント完全アジュバントおよび20μgのCHO細胞馴化培地から精製した組換えGDF8二量体を用いた皮下注射によって免疫化した。同じ量のGDF8およびフロイント不完全アジュバントのいくつかの追加免疫注射を、2週間間隔で与えた。2μgのPBSの尾部静脈への最終の静脈内注射を、マウスから脾細胞を単離する前に与え、高力価の抗GDF8抗体が実証された。単離した脾細胞をマウス骨髄腫細胞(ATCC受託番号P3X63.Ag8.653)と融合させた。10〜14日後、ハイブリドーマからの上清を収集し、ELISAによって抗GDF8抗体レベルについて試験した。実施例2を参照されたい。モノクローナル性を確実にするために、さらなる研究用に選択されたハイブリドーマを限界希釈の繰り返しによってクローニングした。
GDF8と特異的に相互作用するRK22抗体
(実施例2.1)
RK22はELISAアッセイにおいてBMP11よりもGDF8に対して高い親和性を有する
GDF8またはBMP11のどちらかを用いた標準のELISA技術を使用して、GDF8と結合するRK22の特異性を決定した、すなわち、BMP11よりもGDF8に対して高い親和性を実証したかどうかを決定した。組換えヒトGDF8(成熟GDF8およびGDF8プロペプチド)ならびにBMP11タンパク質を精製し、米国特許公開出願第2004/0142382号に以前に記載されているように特徴づけた。GDF8潜在型複合体およびBMP11潜在型複合体を、20モルのEZ−linkスルホ−NHS−ビオチン(Pierce、イリノイ州Rockford、カタログ番号21217)対1モルの複合体の比で、氷上で2時間、それぞれ個別にビオチン標識した。0.5%のTFAを用いてpHを低下させることによって反応を停止させ、ビオチン標識した複合体をC4 Jupiter 250×4.6mmのカラム(Phenomenex、カリフォルニア州Torrance)上のクロマトグラフィーに供して、成熟タンパク質(たとえば、GDF8プロペプチドからの成熟GDF8またはBMP11プロペプチドからの成熟BMP11)を分離した。TFA/CH3CNの勾配で溶出させた成熟ビオチン標識GDF8または成熟ビオチン標識MP11の画分をプールし、濃縮し、MicroBCATMタンパク質アッセイ試薬キット(Pierce、イリノイ州Rockford、カタログ番号23235)によって定量化した。
GDF8に対するRK22の結合親和性
RK22抗体とGDF−8との分子動態相互作用は、BIAcoreプラズモン共鳴技術を用いて定量化的に分析し、見かけの動態速度定数を誘導した。これらの研究では、本発明者らは、可溶性抗体と固相結合したGDF−8との結合を測定した。固定したGDF−8のバイオセンサー表面上への表面配向は、ビオチン標識したGDF−8(ビオ−GDF−8)を用いて制御し、ビオGDF−8をストレプトアビジンバイオセンサーチップ上に固定し、その後、様々な濃度の抗体を3つ組で施用し、結合を時間の関数として測定した。これらの測定から、見かけの解離(Kd)および会合(Ka)速度定数を誘導し、これらを用いて相互作用の結合親和定数(Kd)を計算した。生物学的に機能的である抗体の画分として定義されるRK22の活性濃度は、高表面密度をコーティングすることによる部分的質量輸送制限下で、抗体を様々な流速で注入するBIAcoreを用いて、チップ上に固定したビオGDF−8と結合することができる抗体の画分を測定することによって決定した。抗体のそれぞれの濃度の会合速度および解離速度は、biaevaluationソフトウェアバージョン3.0.2で網羅的適合(global fit)を用いて同時に計算した。
RK22はGDF8シグナル伝達をin vitroおよびin vivoで阻害する
(実施例3.1)
RK22を用いた細胞に基づいたレポーター遺伝子アッセイにおける、精製した組換えヒトGDF−8の生物活性の阻害
in vitroの細胞に基づいたアッセイでGDF−8の活性を実証するために、TGF−β誘導性プロモーターの制御下でルシフェラーゼを発現するレポーターベクターpGL3(CAGA)12を用いて、レポーター遺伝子アッセイ(RGA)を開発した。CAGA配列は、TGF−β誘導性遺伝子PAI−1のプロモーター内でTGF−βに応答性の配列であることが以前に報告されている(Thies S他、2001)。12個のCAGAボックスを含有するレポーターベクターを、塩基性ルシフェラーゼレポータープラスミドpGL3(Promega、ウィスコンシン州Madison)を用いて作製した。アデノウイルス主要後期プロモーターからのTATAボックスおよび転写開始部位(−35/+10)をBgIIIおよびHindIII部位の間に挿入した。CAGAボックスAGCCAGACAの12個のリピートを含有するオリゴヌクレオチドをアニーリングし、XhoI部位内にクローニングした。ヒト横紋筋肉腫細胞系A204(ATCC HTB−82)を、FuGENE6形質移入試薬(Boehringer Manheim、ドイツ)を用いてpGL3(CAGA)12と共に一過的に形質移入した。形質移入後、細胞を96ウェルプレート上で、2mMのグルタミン、100U/mlのストレプトマイシン、100μg/mlのペニシリンおよび10%のウシ胎児血清を添加したマッコイの5A培地中で16時間培養した。その後、細胞を、10ng/mlのGDF−8を用いてまたは用いずに、グルタミン、ストレプトマイシン、ペニシリン、および1mg/mlのウシ血清アルブミンを含むマッコイの5A培地中で、6時間、37℃で処置した。ルシフェラーゼアッセイシステム(Promega)を用いてルシフェラーゼを処置した細胞中で定量化した。10ng/mlのBMP−11を用いてアッセイを繰り返した。
RK22はGDF8活性をin vivoで阻害する
RK22抗体がGDF8活性をin vivoで拮抗するかどうかを決定するために、RK22を成体SCIDマウスにおけるさらなる試験のための代表的な抗体として選択した。SCIDマウスは重篤な複合免疫不全に罹患しており、したがって、RK22などの抗体を注射した後に免疫学的反応を生じない。4週間の期間をかけてRK22をSCIDマウスに注射した。3つの用量のRK22を投与した:1mg/kg/週、10mg/kg/週および40mg/kg/週。10mg/kg/週の用量で投与したMyo−29を陽性対照として使用し、様々な濃度の投与したRK22と比較した。
RK22結合部位の特徴づけ
(実施例4.1)
ActRIIBと結合するGDF8のRK22阻害の評価
RK22抗体が、GDF8がそのActRIIB受容体と結合することを防止することによってGDF8活性を拮抗できるかどうかを決定するために、抗体をActIIRB結合アッセイ(たとえば中和アッセイ)で試験した。精製したRK22抗体を、ビオチン標識したGDF8とプラスチック上に固定したActRIIB融合タンパク質との結合を阻害する能力について、96ウェルマイクロタイタープレートアッセイでスクリーニングした。組換えActRIIB−Fcキメラ(R&D Systems、ミネソタ州Minneapolis、カタログ番号339−RB/CF)を、96ウェル平底アッセイプレート(Costar、NY、カタログ番号3590)上に、0.2Mの炭酸ナトリウム緩衝液中に1μg/mlで、終夜4℃でコーティングした。その後、プレートを1mg/mlのウシ血清アルブミンで遮断し、標準のELISAプロトコルに従って洗浄した。単独の、または1時間、室温で様々な濃度のRK22と共にプレインキュベーションした、20ng/mlのビオチン標識したGDF8を、遮断したELISAプレートに加えた。IC50値によって測定したクローンの力価を確立するために、抗体の滴定を加えた。無関係の抗体またはGDF8とActIIRBとの結合を遮断する対照抗体と共にプレインキュベーションしたビオチン標識したGDF8を、対照として含めた。室温で1時間後、抗体−遮断したタンパク質の複合体を洗い流し、プレートと結合したActIIRBと結合したGDF8の量を、ユーロピアムで標識したストレプトアビジンを用いて、DELFIA(商標)試薬キット(PerkinElmer LifeSciences、マサチューセッツ州Boston)を使用して、時間分解蛍光定量化的(TRF)アッセイで検出した。
RK22はGDF8に特異的なエピトープと結合する
GDF8およびBMP11は密に関連しているが、RK22はGDF8に特異的である。したがって、これらの抗体によって認識されるエピトープもGDF8に特異的であると仮定され、したがって、GDF8に特異的なエピトープは、GDF8シグナル伝達を特異的に阻害するためおよび/またはGDF8に特異的な拮抗剤をスクリーニングもしくは作製するための拮抗剤として(たとえばとしてペプチド模倣体)使用し得る。
RK22のヒト化
(実施例5.1)
抗体の配列決定
RK22をコードしている可変重鎖(VH)および可変軽鎖(VL)遺伝子を、RK22抗体を産生するハイブリドーマ細胞からクローニングし、その後、アミノ酸配列を決定した。これらの配列は、表1中に配列番号14および16として記載されている。
RK22抗体の生殖系列化
抗体の配列データを用いて、RK22の重鎖および軽鎖に最も近い生殖系列配列を同定し、たとえば、DP−5およびDP−7は、RK22のVHにそれぞれ約65%および71%の同一性を示し(図7)、DPK24は、RK22のVLに約78%の同一性を示した(図8)。適切な突然変異は、適切な突然変異原性プライマーを用いた標準の部位特異的突然変異誘発技術を使用して行った。配列および抗体の突然変異を配列解析によって確認した。本明細書は、すべてその全体が本明細書中に参考として組み込まれている、本明細書中に引用した参考文献の教示に鑑みて、最も徹底的に理解される。本明細書中の実施形態は、本発明の実施形態の例示を提供し、本発明の範囲を制限すると解釈されるべきでない。当業者は、多くの他の実施形態が特許請求した発明によって包含されることを理解されよう。
GDF8を定量化および検出するためのサンドイッチ免疫アッセイ様式
以下の実施例中に記載する抗体のそれぞれは、PierceのEZ Linkスルホ−LCビオチン化キットを用いてビオチン標識した。以前の研究から、40倍過剰のNHS−ビオチンが、これらの抗体の両方のビオチン化に最適であることが決定されている。400ugのそれぞれの抗体を、40倍モル濃度の過剰のビオチンを用いてビオチン標識した。これにより、1mmoleの抗体あたり約3〜5mmoleのビオチンの取り込みがもたらされた。ビオチン化後、すべての抗体をPBS中で終夜、4℃で透析し、全タンパク質濃度をBCAによって決定した。ビオチンの取込みのモル比を決定するために、ビオチン標識した抗体の溶液を、2−(4’−ヒドロキシアゾベンゼン)安息香酸(HABA)およびアビジンの混合物に加えた。ビオチンのアビジンに対する親和性がより高いため、HABAとアビジンとの相互作用が置き換えられ、500nmの吸光度が比例して減少した。抗体とコンジュゲートしたビオチンの量は、ビオチン標識した試料を加える前および後にHABA−アビジン溶液の吸光度を測定することによって測定することができる。吸光度の変化は、抗体内に取り込まれたビオチンの量に関連する。
抗体対合実験:免疫アッセイ様式の比較:RK22検出を用いたRK35捕捉またはRK35検出を用いたRK22捕捉
それぞれの抗GDF−8モノクローナル抗体を、0.1Mのホウ酸ナトリウム中で、高結合の96ウェルプレート(Immulon 4 HBX)上に、終夜4℃または1時間37℃で、1μg/mlの濃度で個別にコーティングした。プレートを洗浄し、その後、Pierce Superblock試薬で10分間遮断した。ストックGDF−8(0.1%のトリフルオロ酢酸−TFA中に1.77mg/ml)を、シリコン処理したプラスチックチューブ内で0.1%のトリフルオロ酢酸(TFA)で10μg/mlまで希釈し、検量線を作成するための較正物質として、GDF8を枯渇させたヒト血清で12.5ng/ml〜0.2ng/mlの範囲の濃度にさらに希釈した。検量線は、アッセイプレートのカラム1〜3を用いて3つ組で実行した。別の事前に遮断した96ウェルプレートで、30μlアリコートの試験血清を、120μlのTHST緩衝液(最終濃度は20%の血清、合計体積は150μl)を含有する6個のウェルのそれぞれ(3つ組の決定のため)に加えた。全GDF−8アッセイには、80μlのこの溶液を96ウェルのPCRプレートに移し、80℃まで5分間加熱した。加熱した試料を氷上で冷却した後、アッセイプレートに加えた。
GDF−8アッセイに対する血清の効果
以前の結果から、血清バックグラウンド効果により吸光度値を、分析した血清試料に応じて0.3OD単位〜約0.5OD単位の範囲で増加したことが示唆されている(データ示さず)。ヒト血清を、RK22をコーティングしたまたはコーティングしていない(対照)HBXアッセイプレートに対して試験することによって、シグナル増加の原因はHAMA効果(すなわち、ヒト血清IgGとアッセイで使用したマウスモノクローナル抗体との反応)であることが決定された(図10)。モノクローナル抗体を含まないプレートはシグナルの増加を示さず、バックグラウンドの増加は、プレートと非特異的に結合する血清が原因ではなく、モノクローナル抗体の存在に依存することが示唆された。
MyO−029抗体と結合するGDF8の阻害
MyO−029(2002年10月2日に対応する受託指定番号PTA−4741の下でAmerican Tissue Culture Collection(ATCC)に寄託)は、筋肉障害に罹患している患者において筋肉強度を増加させる目的で臨床治験において使用されている治療用抗体である。本明細書中に記載のようにMyo−029を投与した患者においてGDF8を検出する免疫アッセイでは、GDF−8との結合についてアッセイ抗体RK35およびMYO−029の交差反応性が存在することが示された。この交差反応性を確認するために、MYO−029をアッセイプレート上にコーティングした。1200pg/mlのGDF−8をそれぞれのウェルに加えた。その後、漸増濃度のビオチン標識したRK22またはビオチン標識したRK35のいずれかを加えた。図12に見られるように、この構成ではシグナルが生じなかったため、未標識のGDF−8は、MYO−029との結合についてビオチン標識したRK35と競合する。ビオチン標識したRK35ではシグナルが生じず、これは、GDF8との結合についてRK35およびMyo−029の交差反応性を示している。
GDF8の競合相手としてのMyO−029の使用
両方のアッセイ構成(RK35/RK22またはRK22/RK35)を用いてアッセイを行い、一定濃度のGDF−8(250pg/ml)を含む漸増量のMYO−029治療用抗体を、アッセイ緩衝液または10%のヒト血清に添加。図13Aに見られるように、RK22を捕捉抗体として使用した。250pg/mlのGDF−8を1.5時間、室温で、150ng/mlのビオチン標識したRK35および漸増濃度のMYO−029(0〜20ug/ml)と共にインキュベーションした。最高濃度のMYO−029でも、約30%の阻害しか見られなかった。図13Bに示すように、RK35を捕捉抗体として使用した。250pg/mlのGDF−8を、1.5時間、室温で、ビオチン標識したRK22および漸増濃度のMYO−029と共にインキュベーションした。ほぼ100%のシグナルの阻害が、≧5ug/mlのMYO−029濃度で観察された。
RK35捕捉/RK22検出様式を用いたヒト血清における添加回収
3個のヒト血清試料を、添加回収実験でGDF−8の回収について分析した。それぞれの試料を、100%の血清中に600pg/mlの成熟GDF−8まで希釈し、2倍に段階希釈して600、300、および150pg/mlのGDF−8の試料を生成した。これらの試料のそれぞれを、RK35捕捉/RK22検出様式で、20μg/mlのMYO−029を添加してまたは添加せずに分析した。図14Aを参照されたい。MYO−029の添加によるシグナルの低下を計算する。図14Bを参照されたい。これらの値をTHSTアッセイ緩衝液で作成したGDF−8検量線と比較し、GDF−8の観察値対予測値を図15にプロットする。観察値は予測値よりもはるかに低く、これは、緩衝液単独での検量線は血清試料中に見つかるGDF−8値を正確に定量化しないことを示す。
検量線を作成するための血清対アッセイ緩衝液の使用
正常なマウス血清およびGDF−8KOマウス血清を本研究で研究した。これらの血清を、正常なヒト血清およびTHST緩衝液と共に利用して、成熟GDF−8タンパク質を用いた検量線を作成した。図15を参照されたい。血清で作成した検量線と緩衝液で作成したものとの間の傾きの差異により、緩衝液を検量線の作成の媒体として使用した場合に添加/回収実験の観察値対予測値が劇的に異なっていた理由が説明される(図16)。緩衝液中の検量線と比較して血清中の検量線の傾きが低下していることが、生じたシグナルに対する血清のマトリックス効果を明らかにしており、検量線は血清中で作成すべきことを示唆している。KOマウス血清はアッセイ開発に必要な量で入手可能でなく、正常なマウス血清は、未知の血清試料中のGDF−8の予測を妨げる高い内在性レベルのGDF−8を有する。正常なヒト血清も、正常なマウスよりは低いが、内在性レベルのGDF−8を有し、これも所望しない妨害要素を付加する。可能性のある代替物質は、アッセイ較正マトリックスとして使用するために、正常なヒト血清のプールのGDF−8を枯渇させることである。
血清中のMyo−029抗体の不活性化/解離
以前の研究により、RK35抗体のエピトープとの交差反応性によって、MYO−029の存在が、RK35/RK22様式においてGDF−8の正確な定量化を妨害することが実証されている。試料中のGDF−8/MYO−029の複合体を解離させることができれば、GDF−8をMYO−029の存在下で正確に測定する免疫アッセイを開発することが可能であり得ると仮定された。酸解離および熱変性を含めた、抗体をその抗原から解離させるいくつかの可能性が存在する。熱処理によって潜在型TGF−βを不可逆的に活性化させることができるという報告書に基づく(Brownら、1990、Growth Factors、3、35〜43)。THSTアッセイ緩衝液中の65℃〜80℃の温度勾配は、GDF−8アッセイ中のMYO−029抗体によって実証された効果に影響を与えなかった。しかし、正常な無添加の血清、400pg/mlの成熟GDF−8を添加した血清、または潜在型GDF−8を添加した血清を用いたパイロット実験を行った。この実験では、MYO−029抗体を20%の血清に添加し、80℃まで7分間加熱した(図17を参照)。結果により、アッセイにおけるGDF−8活性はこの温度で保持され、MYO−029抗体は80℃まで加熱した血清中で不活性化されたことが示された。この不活性化は2つの方法で実証した:1)MYO−029の存在下で加熱した血清試料は、MYO−029を加えない対照の加熱した試料と同じシグナル出力を有しており、2)アッセイシグナルは、試料の加熱する後に新鮮なMYO−029を加えることによって、再度バックグラウンドレベルまで低下させることができる。これらの結果は、正常な血清、成熟GDF−8を添加した血清、および潜在型GDF8を添加した血清で観察された。潜在型GDF−8を添加した血清試料は、潜在型GDF−8物質に依存し、成熟GDF8に依存しないと考えられるシグナルの増加を実証する。有効に不活性化させるためのより正確な時間を決定するために、5μg/mlのMYO−029を添加した正常な血清を用いた経時変化実験を実施した。結果により、MYO−029抗体は、80℃で3分間という早い時間で完全に不活性化されることが示された。
ヒト血清におけるGDF8枯渇
ヒト血清から内在性GDF−8を枯渇させるために、臭化シアン活性化によってセファロースビーズに共有的に固定した1mgのMYO−029抗体を用いて、親和性カラムを作製した。カラムを事前に洗浄し、小アリコートのヒト血清をカラムに通し、GDF−8 ELISAアッセイでGDF−8活性について試験した。さらに、血清を65℃まで事前に加熱し、その後、カラムに通す前に冷却した。加熱した血清は、GDF−8アッセイで実行した場合に、血清中の潜在型GDF−8の免疫学的活性化が原因であり得る増加したシグナルを示す。図18は、加熱した際のGDF−8アッセイにおけるシグナル増加、また、加熱/枯渇のH/D血清におけるシグナルの枯渇も示す。注目すべきことに、80℃まで再度加熱した場合は、H/D血清中のシグナルの増加は観察されなかった。
H/D血清中の検量線
内在性GDF−8を欠く血清を用いて、加熱および非加熱条件下で、成熟GDF−8および潜在型GDF−8をどちらも使用して免疫反応性検量線を作成した。成熟GDF−8を100%の血清に添加し、2500pg/mlから40pg/mlまで段階希釈した。潜在型GDF−8は、50,000pg/ml〜800pg/mlの範囲の、成熟GDF8の20倍のタンパク質濃度で使用した(図19)。この実験の結果は、潜在型GDF−8を100%のH/D血清中で80℃まで加熱した場合に、アッセイシグナルの顕著な増加を示す。図18で、80℃まで加熱したH/D血清は、正常な血清で観察される特徴的なシグナル増加を示さなかったことに注意されたい。これは、正常な血清で見られる増加が内在性潜在型GDF−8によるものであるという仮説の信用度を高める。対照的に、成熟GDF−8で生じたシグナルは、加熱の際に増加せず、繰り返し実験では、80℃での加熱に伴って減少する傾向にある。
8個の正常な血清試料における遊離および全GDF8の分析
事前に凍結した8個の正常な血清試料を解凍し、室温アッセイ(遊離)および潜在型GDF−8を活性化するために80℃加熱ステップ(全)を用いて、遊離および全GDF−8についてアッセイした。この分析用の検量線は、GDF−8較正物質と同様に既知の濃度の成熟GDF−8タンパク質を添加したH/D血清を用いて作成した。検量線は12,500pg/ml〜188pg/mlの範囲であり、相関係数0.999の非線形回帰曲線のフィッティング分析(図20を参照)を用いて、8個の未知の血清試料中のGDF−8値を計算した。既に記載したように、Myo−029を加えることによって誘導された光学密度の変化は、試料中のGDF−8の内在性量と直接比例する。図21は、GDF−8の濃度を決定するために使用する生データを表す。この図は、遊離GDF−8シグナルおよびMYO−029抗体を加えることによるその対応する低下したシグナル、ならびに全GDF−8およびMYO−029を加えることによるその対応する低下したシグナルを例示する。図22は、アッセイ再現性実験の結果を表す。遊離および全GDF8アッセイは、高い度合の再現性を示す。これは、遊離GDF−8(室温)アッセイに特に当てはまる。全(80℃まで加熱)の日ごとのアッセイの増加したアッセイシグナルは、5から10分間への加熱時間の増加が原因である。試料加熱の時間の増加に伴ったアッセイシグナルの低下が繰り返して観察され、これは抗原の変性および免疫反応性の損失を反映している可能性がある。
熱活性化した内在性GDF8はMYO−029の存在下で過小検出される
図23に示す実験では、ヒト血清をMYO−029の存在または非存在下でインキュベーションし、その後、ELISAによる分析の前に様々な温度で熱変性した。試験試料中のGDF−8レベルの定量化は、GDF−8を枯渇させたプールしたヒト血清内に添加した既知の濃度の精製した組換えGDF−8二量体の希釈系列からなる検量線のアッセイ結果からの内挿によって、アフィニティークロマトグラフィーによって行った。MYO−029を存在させない場合のGDF−8の最大検出は、約60℃で起こった。MYO−029の存在は、低温で血清中のGDF−8の検出をマスキングした。65℃より高い温度でのインキュベーションにより、MYO−029の存在下でのGDF−8の検出が部分的に回復した。しかし、65℃より高い温度でのGDF−8の計算濃度により、アッセイが、血清中に存在するGDF8の合計量を実質的に過小評価したことが示される。
GDF8はMYO−029の存在下で、低pHで検出される
MYO−029の解離に必要な温度まで加熱した場合の最適以下のGDF−8の検出は、代替方法の評価を促した。図24は、MYO−029の非存在および存在下において同様のレベルのGDF−8を検出する、酸解離ELISAの能力を実証する。以前の実験では、GDF−8/MYO−029混合物を、捕捉抗体と結合させる前に中和した。これらの条件下では、MYO−029は、中和された際に捕捉抗体であるRK35との結合について競合することができた。図24では、捕捉条件を低い酸性pHで維持した場合に、RK35は依然としてGDF−8と結合することができるが、MYO−029結合できず、したがって、GDF−8の検出の完全回収を治療用抗体の存在または非存在下で達成できることが実証されている。
RK35は酸性条件下でGDF8と結合する
RK35が酸性条件下でGDF−8と結合できる(MYO−029はできない)ことを確認するために、RK35およびMYO−029をヒト血清中で個別に滴定し、分析物捕捉ステップを酸性条件下で行った。溶液中の漸増量のRK35は、結合してプレートと結合したRK35と結合するGDF−8について競合することができ、酸性条件下でGDF−8の検出の減少がもたらされた。MYO−029は、加えたMYO−029の濃度にかかわらず、pH3.0に近づく溶液中でGDF−8と結合することができず、溶液中のGDF−8は、ELISAウェル上にコーティングしたRK35抗体に利用可能なまま残された(図25を参照)。したがって、MYO−029が有用な属性として役割を果たすことができない条件下でGDF−8と結合するRK35の能力は、MYO−029の存在下でGDF−8レベルを測定するために利用することができる。GDF−8からのMYO−029の酸解離は、増大する濃度のMYO−029でも有効である。図25中のデータは、MYO−029濃度を100μg/mlまで増加することでは、酸解離プロトコルを用いたGDF−8の検出が消失されなかったことを示す。また、この図は、熱解離プロトコルを用いたGDF−8の検出の顕著な低下も示す、図26。
検量線のフィッティング
酸解離方法のアッセイ間およびアッセイ内のばらつきを評価するために、組換えGDF−8二量体を添加したベルジアンブルー血清アリコートを分析した。4つのストック溶液を検量線とは独立して調製し、3つ組で、96ウェルプレートの5つの異なる位置でアッセイした。
アッセイの正確さおよび精度
酸解離方法のアッセイ間およびアッセイ内のばらつきを評価するために、組換えGDF−8二量体を添加したベルジアンブルー血清のアリコートを分析した。4つのストック溶液を検量線とは独立して調製し、3つ組で、96ウェルプレートの5つの異なる位置でアッセイした。図29は、3日の異なる日に処理した5個のプレートのプレート設計を示す。添加した試料の濃度を、5個のパラメータのロジスティックモデルによってそれぞれのプレートにフィッティングさせた検量線から計算した。プレート内およびプレート間の変動係数(CV)および相対誤差(RE)を表1および2に要約する。プレート内およびプレート間の正確さはどちらも、いずれのCV計算の方法に基づいても十分に20%の範囲内にあった。
ヒト血清中のミオスタチン濃度の測定
上述のアッセイを用いて、健康なヒト血清中のミオスタチンの循環濃度を測定および比較した。一研究では、若年および高齢の男性の血清をミオスタチンレベルについて評価した。テストステロン用量応答研究からの保管試料を用いた、循環ミオスタチンレベルに対するテストステロン治療の効果も検査した。詳細が以前に公開されているその研究では(Bhasin Sら、J Clin Endocrinol Metab、2005、90:678〜88、Bhasin Sら、Am J Physiol Endocrinol Metab、2001、281:El 172〜81、およびStorer TVVら、J Clin Endocrinol Metab、2003、88:1478〜85)、健康な若年および高齢の男性への段階づけた用量のテストステロンの投与は、骨格筋量および強度の用量依存性の増加に関連していた。別の研究では、健康な女性および手術閉経女性の血清を評価した。
ATCC P3X63.Ag8.653
ATCC HTB−82
Claims (48)
- 成長および分化因子8(GDF8)に特異的な拮抗剤であって、拮抗剤が、GDF8とは特異的に結合するがBMP11とは特異的に結合しない抗GDF8抗体または抗原結合タンパク質であり、抗体または抗原結合タンパク質が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多特異性抗体、ヒト化抗体、四量体抗体、四価抗体、多特異性抗体、単鎖抗体、ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、融合タンパク質、ScFc融合タンパク質、単鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、突然変異抗体、CDR移植抗体、ならびにFab、F(ab’)2、Fab’断片、Fv断片、単鎖Fv(ScFv)断片、Fd断片、dAb断片を含む抗体断片、ならびに二重特異性抗体、CDR3ペプチド、拘束されたFR3−CDR3−FR4ペプチド、ナノ抗体、二価ナノ抗体、小モジュール免疫医薬品(SMIP)、サメ可変IgNARドメイン、およびミニ抗体を含む抗原結合タンパク質からなる群から選択される拮抗剤。
- 抗体または抗原結合タンパク質が、配列番号19のアミノ酸配列、配列番号20のアミノ酸配列、配列番号21のアミノ酸配列、配列番号22のアミノ酸配列、配列番号23のアミノ酸配列、配列番号24のアミノ酸配列、配列番号25のアミノ酸配列、配列番号26のアミノ酸配列、配列番号27のアミノ酸配列、配列番号28のアミノ酸配列、配列番号29のアミノ酸配列、配列番号30のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含む、請求項1に記載の拮抗剤。
- 抗体または抗原結合タンパク質が重鎖を含み、重鎖が第1、第2、および第3の相補性決定領域を含み、
第1の相補性決定領域が、配列番号19のアミノ酸配列、および配列番号25のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
第2の相補性決定領域が、配列番号20のアミノ酸配列、配列番号26のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
第3の相補性決定領域が、配列番号21のアミノ酸配列、配列番号27のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、
請求項2に記載の拮抗剤。 - 抗体または抗原結合タンパク質が、配列番号14のアミノ酸配列および配列番号18のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項1に記載の拮抗剤。
- 抗体または抗原結合タンパク質が軽鎖を含み、軽鎖が第1、第2、および第3の相補性決定領域を含み、
第1の相補性決定領域が、配列番号22のアミノ酸配列、および配列番号28のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
第2の相補性決定領域が、配列番号23のアミノ酸配列、および配列番号29のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
第3の相補性決定領域が、配列番号24のアミノ酸配列、および配列番号30のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、
請求項2に記載の拮抗剤。 - 抗体または抗原結合タンパク質が、配列番号16のアミノ酸配列および配列番号17のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項1に記載の拮抗剤。
- 抗体または抗原結合タンパク質が配列番号16のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、配列番号14のアミノ酸配列を含む重鎖をさらに含む、請求項1に記載の拮抗剤。
- 抗体または抗原結合タンパク質が配列番号17のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、配列番号18のアミノ酸配列を含む重鎖をさらに含む、請求項1に記載の拮抗剤。
- 請求項1から8のいずれか一項に記載のGDF8拮抗剤を含むアミノ酸をコードしているポリヌクレオチド。
- 調節配列と作動可能に連結している請求項9に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
- 請求項9に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項11に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項12に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養することと、宿主細胞によって発現されたGDF8拮抗剤を単離することとを含む、GDF8拮抗剤を生成する方法。
- 請求項13に記載の方法によって生成された、単離したGDF8拮抗剤。
- (a)
(i)試料、
(ii)GDF8と特異的に結合する捕捉試薬、
(iii)GDF8と特異的に結合する検出試薬
を合わせるステップと、
(b)特異的結合が捕捉試薬とGDF8との間に起こるかどうかを検出するステップと
を含み、特異的結合の検出が試料中のGDF8の存在を示す、対象からの試料中のGDF8の存在を検出するためのアッセイ。 - (a)の合わせるステップの前に試料を酸性緩衝液と合わせることをさらに含む、請求項15に記載のアッセイ。
- 酸性緩衝液のpHが約pH1.0〜pH6.0である、請求項16に記載のアッセイ。
- 酸性緩衝液のpHが約pH2.5である、請求項16に記載のアッセイ。
- 捕捉試薬が、抗GDF8抗体または抗原結合タンパク質、GDF8結合タンパク質、およびGDF8結合ドメインからなる群から選択される、請求項15に記載のアッセイ。
- 捕捉試薬が、抗GDF8抗体または抗原結合タンパク質であり、RK35およびRK22からなる群から選択される、請求項19に記載のアッセイ。
- 捕捉試薬がRK35である請求項20に記載のアッセイ。
- 捕捉試薬がRK22である請求項20に記載のアッセイ。
- 検出試薬が、抗GDF8抗体または抗原結合タンパク質、GDF8結合タンパク質、およびGDF8結合ドメインからなる群から選択される、請求項15に記載のアッセイ。
- 検出試薬が、抗GDF8抗体または抗原結合タンパク質であり、RK35およびRK22からなる群から選択される、請求項23に記載のアッセイ。
- 検出試薬がRK35である請求項24に記載のアッセイ。
- 検出試薬がRK22である請求項24に記載のアッセイ。
- (a)
(i)試料、
(ii)GDF8と特異的に結合する捕捉試薬、
(iii)GDF8と特異的に結合する検出試薬
を合わせるステップと、
(b)特異的結合が捕捉試薬とGDF8との間に起こるかどうかを検出するステップと、
(c)GDF8のレベルを定量化するステップと
を含み、試料中のGDF8の存在を示す特異的結合の検出を定量化することができる、対象からの試料中のGDF8を定量化するためのアッセイ。 - (a)の合わせるステップの前に試料を酸性緩衝液と合わせることをさらに含む、請求項27に記載のアッセイ。
- 酸性緩衝液のpHが約pH1.0〜pH6.0である、請求項28に記載のアッセイ。
- 酸性緩衝液のpHが約pH2.5である、請求項28に記載のアッセイ。
- 薬学的に許容できる担体とGDF8拮抗剤とを含む医薬組成物であって、拮抗剤が、GDF8とは特異的に結合するがBMP11とは特異的に結合しない抗GDF8抗体または抗原結合タンパク質である医薬組成物。
- GDF8とは特異的に結合するがBMP11とは特異的に結合しない抗GDF8抗体または抗原結合タンパク質が、配列番号16のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、抗体が、配列番号14のアミノ酸配列を含む重鎖をさらに含む、請求項31に記載の医薬組成物。
- GDF8とは特異的に結合するがBMP11とは特異的に結合しない抗GDF8抗体または抗原結合タンパク質が、配列番号18のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、抗体が、配列番号17のアミノ酸配列を含む重鎖をさらに含む、請求項31に記載の医薬組成物。
- GDF8とは特異的に結合するがBMP11とは結合しない抗GDF8抗体が、配列番号19のアミノ酸配列、配列番号20のアミノ酸配列、配列番号21のアミノ酸配列、配列番号22のアミノ酸配列、配列番号23のアミノ酸配列、配列番号24のアミノ酸配列、配列番号25のアミノ酸配列、配列番号26のアミノ酸配列、配列番号27のアミノ酸配列、配列番号28のアミノ酸配列、配列番号29のアミノ酸配列、配列番号30のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含む、請求項31に記載の医薬組成物。
- ほぼ無毒から無毒である、治療上有効な量の、GDF8に特異的な拮抗剤を患者に投与することを含む、哺乳動物患者においてGDF8関連障害を治療する方法。
- GDF8拮抗剤が、GDF8とは特異的に結合するがBMP11とは特異的に結合しない抗GDF8抗体または抗原結合タンパク質である、請求項35に記載の方法。
- GDF8拮抗剤が、配列番号16のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、GDF8とは特異的に結合するがBMP11とは特異的に結合しない抗GDF8抗体または抗原結合タンパク質であり、抗体が、配列番号14のアミノ酸配列を含む重鎖をさらに含む、請求項36に記載の方法。
- GDF8拮抗剤が、配列番号18のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、GDF8とは特異的に結合するがBMP11とは特異的に結合しない抗GDF8抗体または抗原結合タンパク質であり、抗体が、配列番号17のアミノ酸配列を含む重鎖をさらに含む、請求項36に記載の方法。
- GDF8とは特異的に結合するがBMP11とは特異的に結合しない抗GDF8抗体または抗原結合タンパク質が、配列番号19のアミノ酸配列、配列番号20のアミノ酸配列、配列番号21のアミノ酸配列、配列番号22のアミノ酸配列、配列番号23のアミノ酸配列、配列番号24のアミノ酸配列、配列番号25のアミノ酸配列、配列番号26のアミノ酸配列、配列番号27のアミノ酸配列、配列番号28のアミノ酸配列、配列番号29のアミノ酸配列、配列番号30のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含む、請求項36に記載の方法。
- (a)対象から第1の試料を得るステップと、
(b)第1の試料を請求項9に記載の拮抗剤と合わせるステップと、
(c)第1の試料中のGDF8の存在を検出するステップと、
(d)第1の試料中のGDF8のレベルを定量化するステップと、
(e)第2の試料をGDF8関連障害に罹患していない対象から得るステップと、
(f)第2の試料を拮抗剤と合わせるステップと、
(g)第2の試料中のGDF8のレベルを検出するステップと、
(h)第2の試料中のGDF8のレベルを定量化するステップと、
(i)第1および第2の試料中のGDF8のレベルを比較するステップと
を含み、第2の試料と比較した第1の試料中のGDF8のレベルの増加、減少、または類似性が、対象がGDF8関連障害に罹患しているかどうかを示す、対象がGDF8関連障害に罹患しているかどうかを診断、予後決定、または検出する方法。 - 哺乳動物患者においてGDF8関連障害を治療するための医薬品の調製における医薬組成物の使用であって、医薬組成物が、薬学的に許容できる担体とGDF8拮抗剤とを含み、GDF8拮抗剤が、GDF8とは特異的に結合するがBMP11とは特異的に結合しない抗GDF8抗体または抗原結合タンパク質である使用。
- 対象からの試料中のGDF8の存在を検出する、またはそれを定量化するためのキットであって、GDF8と特異的に結合する捕捉試薬およびGDF8と特異的に結合する検出試薬を含み、GDF8と捕捉および検出試薬との特異的結合の検出が試料中のGDF8の存在を示すキット。
- 酸性緩衝液をさらに含む、請求項78に記載のキット。
- 成長および分化因子8(GDF8)に特異的な抗体であって、抗GDF8抗体または抗原結合タンパク質が、GDF8とは特異的に結合するがBMP11とは特異的に結合せず、抗体または抗原結合タンパク質が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多特異性抗体、ヒト化抗体、四量体抗体、四価抗体、多特異性抗体、単鎖抗体、ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、融合タンパク質、ScFc融合タンパク質、単鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、突然変異抗体、CDR移植抗体、ならびにFab、F(ab’)2、Fab’断片、Fv断片、単鎖Fv(ScFv)断片、Fd断片、dAb断片を含む抗体断片、ならびに二重特異性抗体、CDR3ペプチド、拘束されたFR3−CDR3−FR4ペプチド、ナノ抗体、二価ナノ抗体、小モジュール免疫医薬品(SMIP)、サメ可変IgNARドメイン、およびミニ抗体を含む抗原結合タンパク質からなる群から選択される抗体。
- 抗体または抗原結合タンパク質がモノクローナル抗体である、請求項44に記載の抗体。
- 抗体または抗原結合タンパク質が、配列番号16のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、抗体が、配列番号14のアミノ酸配列を含む重鎖をさらに含む、請求項45に記載の抗体。
- 抗体または抗原結合タンパク質がヒト化抗体である、請求項44に記載の抗体。
- 抗体または抗原結合タンパク質が、配列番号17のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、抗体が、配列番号18のアミノ酸配列を含む重鎖をさらに含む、請求項47に記載の抗体。
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