TW200934510A

TW200934510A - Antibodies to GDF8 as uses thereof

Info

Publication number: TW200934510A
Application number: TW097142277A
Authority: TW
Inventors: Edward Roland Lavallie; Lisa Anne Collins-Racie; Christopher John Corcoran; Lioudmila Gennadievna Tchistiakova; John Adam Nowak; Riyez Karim; Xiang-Yang Tan; Kimberly Ann Marquette; Geertruida Machteld Veldman
Original assignee: Wyeth Corp
Priority date: 2007-11-01
Filing date: 2008-10-31
Publication date: 2009-08-16
Also published as: IL205448A0; RU2447084C2; PE20091163A1; US9409981B2; US20140023638A1; CA2704315A1; MX2010004915A; CO6270358A2; US8415459B2; AU2008319265A1; RU2010117018A; US10189896B2; PA8802601A1; US9850301B2; JP5756291B2; SA08290697B1; EP2805970A3; ZA201003876B; ES2514518T3; CN101970487A

Description

200934510 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明之技術領域係關於可用以活體外及/或活體内抑制生長及分化因子-8(GDF8)活性之GDF8特異性抗原決定基及其拮抗劑（例如肽模擬劑、抗GDF8抗體（例如小鼠、人類及人化抗體、其片段等）、重組聚核苷酸、抑制性聚核苷酸等）。該領域進一步係關於用於偵測生物樣品中之GF8 的免疫檢定方法，以及治療、改善、預防、診斷、預測及 /或監測尤其潛在生育女性之GDF8相關病症（例如肌肉病症、神經肌肉病症、骨絡退化性病症、代謝或誘導型骨路病症、脂肪病症、葡萄糖代謝病症或胰島素相關病症）之方法。【先前技術】亦稱為肌肉抑制素（myostatin)之生長及分化因子_ 8(GDF8)為分泌型蛋白質且為結構相關生長因子之轉型生長因子-P(TGF-P)超家族的成員《此超家族之成員具有生長調節及形態發生特性（Kingsley等人（1994) Genes Dev· 8:133-46 ; Hoodless 等人（1998) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 228:235-72)»人類GDF8經合成為形成同源二聚體複合物之375個胺基酸前驅體蛋白質。加工期間，稱為 "潛伏相關肽"（LAP)之胺基-末端前肽裂解且其可保持與該同源二聚體之非共價結合，形成稱為"小潛伏複合物"之無活性複合物（Miyazono 等人（1988) J. Biol. Chem. 263:6407-15; Wakefield 等人（1988) J. Biol. Chem. 263:7646-54; 135384.doc 200934510

Brown 等人（1999) Growth Factors 3:35-43 ; Thies 等人 (2001) Growth Factors 18:251-59 ; Gentry 等人（1990) Biochemistry 29: 6851-57 ; Derynck 等人（1995) Nature 316:701-05 ； Massague (1990) Ann. Rev. Cell Biol. 12:597-641)。諸如卵泡抑素（follistatin)及包括GASP-1之卵泡抑素相關蛋白之蛋白質（Gamer等人（1999) Dev Biol· 208:222-232 ;美國專利公開案第2003-0180306-A1號；美國專利公開案第003-0162714·Α1號）結合成熟GDF8同源二聚體且抑 0 制GDF8生物活性。各種物種之推斷GDF8胺基酸序列的比對證明GDF8高度保守（McPherron 等人（1997) Proc. Natl. Acad· Sci. U.S.A. 94:12457-61)。人類、小鼠、大鼠、豬及雞GDF8之序列在 C末端區域為100%—致，而狒狒、牛及綿羊GDF8在C末端僅3個胺基酸不同。GDF8在物種之間的高保守程度表明 GDF8具有必需生理功能。已證明GDF8在藉由抑制肌母細胞及衛星細胞之增生與 ❹ 分化來調節肌肉發育及内穩定中起重要作用（Lee及

McPherron (1999) Curr. Opin. Genet. Dev. 9:604-7 ； McCroskery等人（2003) J. Cell. Biol. 162:1 135-47)。其早期在發育骨骼肌中表現且持續表現於較佳快收縮類型之成人骨骼肌中。GDF8亦已牽涉於肌肉特異性酶（例如肌酸激酶）之產生及肌母細胞增生中（WO 00/43781)。 GDF8在成年小鼠中之過度表現導致顯著肌肉損失 (Zimmers 等人（2002) Science 296:1486-88)。類似地，各種 135384.doc 200934510 研究表明GDF8表現增加與HIV誘導型肌肉消瘦相關 (Gonzalez-Cadavid等人（1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:14938-43)。相反，GDF8基因剔除轉殖基因小鼠之特徵在於骨骼肌之顯著肥大及增生及皮層骨結構改變 (McPherron 等人（1997) Nature 387:83-90 ; Hamrick 等人 (2000) Bone 27:343-49)。亦已證明使GDF8基因無活性之自然突變引起動物與人類之肥大與增生（前述Lee及 McPherron (1997))。舉例而言，牛之天然GDF8突變中骨 ❹ 路肌質量明顯增加（Ashmore等人（1974) Growth 38:501-07 ; Swatland 等人（1994) J. Anim. Sci. 38:752-57 ;前述 McPherron等人；Kambadur 等人（1997) Genome Res. 7:910-15)。許多人類及動物肌肉及骨骼病症與功能上受損之肌肉組織相關且因此亦可能與GDF8相關。舉例而言，GDF8可涉及於以下病症之發病機制中：肌萎縮性側索硬化 ("ALS")、肌肉萎縮症（"MD";包括杜興氏肌肉萎縮症〇 (Duchenne's muscular dystrophy)、面肩狎型肌肉萎縮症及面肩胛肱型肌肉萎縮症）、肌肉萎縮、腕隧道症候群、器官萎縮、虛弱、充血性阻塞性肺病（COPD)、骨絡肌減少症（sarcopenia)、惡病質及由其他疾病及病狀所引起之肌肉消瘦症候群。亦咸信GDF8參與許多其他生理學過程及相關病症，包括第二型糖尿病發展期間之葡萄糖内穩定、葡萄糖耐受不良、代謝症候群（亦即包括使個體處於第二型糖尿病及/或 135384.doc 200934510 心臟病高風險之一組健康病症（其可包括胰島素抵抗、腹部肥胖症、血脂異常、高血壓、慢性炎症、血栓前病況等）同時出現之症候群（例如症候群x))、胰島素抵抗（例如，由諸如燒傷或氮不平衡之外傷誘發之抗性）及脂肪組織病症（例如肥胖症、血脂異常、非酒精性脂肪性肝病等）（Kim 等人（2000) Biochem Bi〇phys Res c〇mm 281:902-06) ^目前，存在極少治療此等病症之可靠或有效之療法。此等過程之病理學表明GDF8為治療此等相關病 φ 症之潛在標靶。除人類神經肌肉病症之外，亦存在與諸如骨質疏鬆症及骨關節炎之骨骼損失相關的生長因子相關病狀，其主要影響老年人及/或經絕後女性。該等代謝骨骼疾病及病症包括歸因於慢性糖皮質激素療法'生殖腺早衰、雄激素抑制、維生素D缺乏、繼發性曱狀旁腺功能亢進、營養缺乏及神經性厭食症導致之低骨質量。儘管用於此等病狀之許多當前療法藉由抑制骨吸收起作用，但促進骨形成之療法 © 將為適用之替代療法。由於GDF8在骨骼發育以及肌肉發育中起作用’因此GDF8亦為用於療法骨骼退化性病症之優良藥理學標靶。如同轉型生長因子-P(TGF-P)家族之其他成員，gdF8經合成為含有信號序列、N末端前肽域及視為活性分子之c 末端域的376個胺基酸前驅體蛋白質。藉由結合至前肽（潛伏相關肽，LAP)，GDF8以潛伏形式分泌；前肽域與(：末端域之間的蛋白水解加工產生N末端前肽及成熟形式之 135384.doc 200934510 GDF8。未經加工與成熟GDF8形成二硫鍵鍵聯之二聚艘，且經加工GDF8二聚體代表該蛋白質之唯一活性形式。在血清以及骨骼肌中，可發現GDF8與多個能夠調節其活化、分泌或受體結合之蛋白質結合。 GDF8經由跨臈絲胺酸/蘇胺酸激酶異源四聚體受體家族發揮其作用，其活化增強受體轉磷酸作用，引起對絲胺酸/ 棘胺酸激酶活性之刺激。已證明GDF8途彳查包括活性gdF 8 二聚體與高親和力受體ActllRB結合，其接著募集且活化參低親和力受體ALK4/ALK5之轉鱗酸作用。亦已證明蛋白質 Smad 2及Smad 3隨後經活化且與Smad 4形成複合物且接著移位至核’其接著活化標把基因轉錄e Lee及McPherron (Proc Natl Acad Sci USA 2001，98: 9306-9311)已證明由於顯性陰性形式之ActllRB在模擬GDF8基因剔除之小鼠中之表現，ActRIIB受體能夠活體内介導GDF8之影響。已證明在GDF8影響下’ C2C12肌母細胞在細胞週期之 G0/G1及G2期累積’因此降低S期細胞之數目。又，GDF8 Φ 誘導與分化標記物之表現強烈下降相關之肌母細胞分化失敗。GDF8表現在增生與分化條件下亦降低細胞之細胞凋亡速率（Thomas 等人，J. Biol Chem 2000，275:40235-40243)° 對肌肉抑制素（GDF8)表現之抑制引起肌肉肥大及增生 (前述Lee及McPherron ;前述McPherron等人）。肌肉抑制素負調節損傷後之肌肉再生且GDF8無效小鼠中缺少肌肉抑制素導致加速之肌肉再生（McCroskery等人，（2〇05) J. 135384.doc -10- 200934510

Cell. Sci. 118:353 1-41)。已證明人類抗GDF8抗體（美國公開申請案第2004/0142382號）活體外及活體内結合GDF8且抑制GDF8活性，包括與負調節骨骼肌質量及骨密度相關的GDF8活性。舉例而言，肌肉抑制素中和抗體增加野生型小鼠（Whittemore 等人（2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 300:965-71)及mdx小鼠（一種肌肉萎縮症模型）（Bogdanovich 等人（2002) Nature 420:418-21 ; Wagner 等人（2002) Ann· Neurol. 52:832-36)之體重、骨骼肌質量及 _ 骨骼肌中之肌肉尺寸及強度。此外，此等小鼠中之肌肉抑制素抗體降低對隔膜，ALS發病機制期間亦靶向之肌肉之損傷。已假設諸如HGF之生長因子對肌肉之作用可歸因於對肌肉抑制素表現之抑制（前述），由此有助於在正方向上移動再生與退化之間的平衡。然而，此等先前技術抗體對 GDF8並不具特異性，亦即此等抗體對TGF-β超家族之諸如 BMP11的其他成員具有高親和力。迄今為止，GDF8活性之所有已知抑制劑（例如前肽、可〇溶性ActRIIB受體、抗GDF8抗體等）亦中和具有重要生物學功能之其他因子（例如BMP11、活化素（activin)等）之生物活性。舉例而言，活化素與BMP11在胚胎發生期間起重要作用。活化素βΑ經鑑別為關鍵生殖腺生長因子且BMP 11負責主轴骨骼之同源異型轉型。同型接合ΒΜΡ11基因剔除小鼠產期致死；具有一個ΒΜΡ11基因之野生型複本的小鼠可存活，但具有骨骼缺陷。由於活化素及ΒΜΡ11在胚胎發生期間起重要作用，因此抑制GDF8及例如ΒΜΡ11之其他因 135384.doc -11- 200934510 子之拮抗劑造成可作為在所治療患者中之毒性或作為在例如潛在生育女性中之生殖性毒性存在的理論安全性風險。因此，對促進尤其人類肌肉質量及/或強度及/或骨密度總鱧增加，但並不干擾例如BMP11之化合物及治療方法存在需要。換&之，在治療尤其在潛在生育之女性中需要增加肌肉質量、尺寸、強度等的GDF8相關病症中對特異性抑制GDF8活性存在需要。由於發展出使用GDF-8調節劑之方法，因此需要開發監 φ 測及優化向個體投予該等藥劑之方法。詳言之，量測生物流體中GDF-8蛋白質含量之能力對現行臨床試驗具有重要意義。舉例而言’循環GDF-8含量可供診斷可受益於抗 GDF-8療法之病理學病狀，或可預測哪些個體更可能對抗 GDF-8療法作出反應。另外，抗GDF-8治療期間周邊血液中GDF-8含量之變化可為肌肉質量及/或功能中隨後可量測之反應的早期標誌。為實現該等優化目標，需要横測或監測諸如血清及血漿 © 之生物流體中GDF-8蛋白質含量之方法。需要在以gdf_8 調節劑治療之前、治療期間及治療之後監測GDF-8含量以例如鑑別用於該治療之適當個體、監測對治療之反應及跟蹤治療後進展。詳言之，需要允許偵測及/或定量回應投予包括GDF-8抑制劑及抗GDF-8抗體之GDF-8調節劑的内源性GDF-8含量之方法。因此，本發明之首要目標為提供特異性抑制GDF8活性之化合物及方法以及偵測且定量諸如血清及血漿之生物樣 135384.doc -12- 200934510 品中GDF-8含量之免疫學檢定。【發明内容】本發明係基於特異性結合生長及分化因子8(GDF8)之特異性拮抗至少一種GDF8活性（例如，GDF8與其受體之結合或其他GDF8介導之信號傳輸處理過程）的抗體或抗原結合蛋白之發現。本發明亦基於對由此等特異性抗GDF8抗體或抗原結合蛋白所識別的GDF8上抗原決定基之鑑別，此係因為本發明之抗體對GDF8具特異性且不與例如BMP 1 1 Q 特異性結合。除提供GDF8特異性抗原決定基之外，本發明亦提供 GDF8特異性拮抗劑（本文中亦稱為"特異性GDF8拮抗劑"、 "GDF8拮抗劑"及其類似術語），例如特異性拮抗（例如抑制、降低及/或中和）至少一種GDF8活性（例如GDF8介導之信號傳輸處理過程（例如GDF8與其受體（例如其 ALK4/ALK5受體）之結合）），且不顯著拮抗BMP11活性之拮抗劑。本發明亦提供用於偵測且定量生物樣品中之 O GDF-8之方法。在某些實施例中，該等方法包含免疫檢定方法，且樣品為血清及/或血漿。本發明進一步提供適用於本發明之方法中的套組。本發明亦提供在治療（其包括改善、預防、診斷、預測）或監測例如肌肉病症、神經肌肉病症、骨骼退化性病症、代謝或誘導型骨骼病症、脂肪病症、葡萄糖代謝病症、胰島素相關病症等的GDF8相關病症之方法中使用所揭示特異性GDF8拮抗劑之方法。因此，在一態樣中，本發明提供針對GDF8之拮抗劑， 135384.doc -13- 200934510 其中該等拮抗劑包含GDF8結合域之肽模擬劑、編碼GDF8 結合域之肽模擬劑的胺基酸之經分離核酸、GDF8特異性抑制性聚核苷酸及特異性結合GDF8且不特異性結合 BMP11的抗GDF8抗體或抗原結合蛋白中之至少一種》在一實施例中，本發明提供本文所述之拮抗劑，其中該拮抗劑為GDF8結合域之肽模擬劑且係選自基本上由以下胺基酸序列組成之群，該胺基酸序列選自由以下胺基酸序列組成之群：SEQ ID NO:4之胺基酸序列、SEQ ID NO:6 Q 之胺基酸序列、SEQ ID NO:8之胺基酸序列、SEQ ID NO:10之胺基酸序列及SEQ ID NO:12之胺基酸序列。在某些實施例中’本發明提供為如本文所述之肽模擬劑且經環化之拮抗劑。在某些實施例中，本發明提供為如本文所述之肽模擬劑且藉助於二硫鍵環化之拮抗劑。在任一或多個實施例中’本發明提供為如本文所述之具有至少一個〇_胺基酸的肽模擬劑之拮抗劑》在某些實施例中，本發明提供為可用作免疫原之肽模擬劑的拮抗劑。 ® 在另一實施例中，本發明提供本文所述之拮抗劑，其中該拮抗劑為特異性結合GDF8但不特異性結合ΒΜΡ11之抗 GDF8抗體、抗原結合蛋白或其片段’其中該抗體或抗原結合蛋白係選自由以下各物組成之群：多株抗體；單株抗體；單特異性抗體；多特異性抗體；人化抗體；四聚抗體；四價抗體；多重特異性抗體；單鏈抗體；域特異性抗體；單域抗體；域缺失抗體；融合蛋白；ScFc融合蛋白；單鏈抗體；嵌合抗體；合成抗艎；重組抗體；雜交抗體； 135384.doc 14 200934510 突變抗體；CDR接枝抗體；抗體片段，其可包括Fab ; F(ab’)2 ; Fab，片段；Fv片段；單鍵Fv(ScFv)片段；Fd片段；dAb片段；抗原結合蛋白；抗原結合蛋白，其可包括雙功能抗體；CDR3肽；限制性FR3-CDR3-FR4肽；奈米抗體；二價奈米抗體；小模數免疫藥物；鯊魚可變IgNAR 域；及微型抗體。在某些實施例中，本發明之拮抗劑為單株抗體。在某些實施例中，本發明之拮抗劑為人化抗體。在某些實施例中，本發明提供為對GDF8具特異性之抗 φ 體、抗原結合蛋白或其片段之拮抗劑，其包含至少一個包含選自由以下胺基酸序列組成之群的胺基酸序列之互補決定區（CDR) : SEQ ID NO:19之胺基酸序列、SEQ ID NO:20 之胺基酸序列、SEQ ID NO:21之胺基酸序列、SEQ ID NO:22之胺基酸序列、SEQ ID NO:23之胺基酸序列、SEQ ID NO:24之胺基酸序列、SEQ ID NO:25之胺基酸序列、 SEQ ID NO:26之胺基酸序列、SEQ ID NO:27之胺基酸序列、SEQ ID NO:28之胺基酸序列、SEQ ID NO:29之胺基〇酸序列、SEQ ID NO:30之胺基酸序列。在某些實施例中，本發明之拮抗劑為抗GDF8抗體、抗原結合蛋白或其片段，其包含包括第一、第二及第三CDR 之重鏈，其中該第一CDR包含選自SEQ ID NO: 19之胺基酸序列及SEQ ID NO:25之胺基酸序列的胺基酸，該第二CDR 包含選自SEQ ID NO:20之序列及SEQ ID NO:26之胺基酸序列的胺基酸，且該第三CDR包含選自SEQ ID NO:21之胺基酸序列及SEQ ID ΝΟ·.27之胺基酸序列的胺基酸。在某些 135384.doc -15- 200934510 實施例中，本發明之抗體或抗原結合蛋白包含包括選自由 SEQ ID NO:14之胺基酸序列及SEQ ID NO:18之胺基酸序列組成之群的胺基酸序列之重鏈。在某些實施例中，本發明之拮抗劑為抗GDF8抗體或抗原結合蛋白，其包含包括第一、第二及第三CDR之輕鏈，其中該第一 CDR包含選自SEQ ID NO:22之胺基酸序列及 SEQ ID NO:28之胺基酸序列的胺基酸，該第二CDR包含選自SEQ ID NO:23之胺基酸序列及SEQ ID NO:29之胺基酸 II 序列的胺基酸，該第三CDR包含選自SEQ ID NO:24之胺基酸序列及SEQ ID NO:30之胺基酸序列的胺基酸。在某些實施例中，本發明之拮抗劑為抗GDF8抗體或抗原結合蛋白，其包含包括選自由SEQ ID NO: 16之胺基酸序列及SEQ ID ΝΟ:17之胺基酸序列組成之群的胺基酸序列之輕鏈。在某些實施例中，本發明之拮抗劑為抗GDF8抗體或抗原結合蛋白，其包含包括SEQ ID ΝΟ:1 6之胺基酸序列的輕鏈且進一步包含包括SEQ ID NO: 14之胺基酸序列的重鏈。 G 在某些實施例中，本發明之拮抗劑為抗GDF8抗體或抗原結合蛋白，其包含包括SEQ ID ΝΟ:17之胺基酸序列的輕鏈且進一步包含包括SEQ ID NO: 18之胺基酸序列的重鏈。在某些實施例中，本發明提供如本文所述編碼構成本發明之 GDF8拮抗劑的胺基酸中之任一或多者之聚核苷酸。在某些實施例中，本發明之拮抗劑為特異性結合GDF8 且選自由siRNA分子及反義分子組成之群的抑制性聚核苷酸。在某些實施例中，本發明提供本文所述之編碼本發明 135384.doc -16 - 200934510 之拮抗劑的聚核苷酸中之任一或多者。在某些實施例中，本發明提供編碼選自由以下胺基酸序列組成之群的胺基酸序列之聚核苷酸：SEQ ID NO:4之胺基酸序列；SEQ ID NO:6之胺基酸序列；SEQ ID NO:8之胺基酸序列；SEQ ID NO:10之胺基酸序列；及SEQ ID NO:12之胺基酸序列》在另一實施例中’本發明提供聚核苷酸，其中經分離聚核苷酸基本上由選自由以下核酸序列組成之群的核酸序列組成：SEQ ID ΝΟ:3之核酸序列、SEQ ID ΝΟ:5之核酸序 ❹ 列、SEQ ID ΝΟ:7之核酸序列、SEQ ID ΝΟ:9之核酸序列、SEQ ID NO: 11之核酸序列及其片段之核酸序列。在某些實施例中’本發明提供包含本發明之任一或多個聚核苷酸的宿主細胞，其中該聚核苷酸係與調節序列可操作性連接。在另一實施例中，本發明提供包含本發明之任何聚核苷酸的載體。在另一實施例中，本發明提供包含包括本發明聚核苷酸中之任一或多者的載體之宿主細胞。在某些實施例中’本發明提供用於由如本文所述包含本〇發明聚核苷酸中之任一或多者的經培養宿主細胞製備 GDF8拮抗劑及分離由該宿主細胞表現之該（}1)178拮抗劑的方法。在另一實施例中，本發明提供藉由用於製備如本文所述之GDF8拮抗劑之方法製備的經分離GDF8拮抗劑。在本發明之另一態樣中，本發明提供偵測來自受檢者之樣rm中GDF 8之存在的檢定方法，其包含以下步驟：組合 (Ο樣品與（η)特異性結合GDF8之捕捉試劑及（丨⑴特異性結〇 GDF8之偵測試劑且偵測捕捉試劑與GDF8之間是否有特 135384.doc -17- 200934510 異性結合發生’其中對特異性結合之偵測指示樣品中 GDF8之存在。在本發明之一實施例中’使樣品中之GDF8與樣品中存在之GDF8結合蛋白及抗GDF8解離。在一實施例中，如本文所述，本發明之檢定方法進一步包含組合樣品與酸性緩衝液，隨後組合樣品與捕捉試劑。在另一實施例中，本發明檢定方法之酸性緩衝液具有介於約ρΗ ι·〇與pH 6·〇之間的pH值。在另一實施例中，酸性緩衝液之ρΗ值為約 Φ 2·5 ° 在一實施例中，本發明提供本文所述檢定方法中之任一或多者，其中樣品係選自由以下各物組成之群：血清全血、血漿、生檢樣品、組織樣品、細胞懸浮液、唾液、口水（oral fluid)、腦脊髓液、羊膜液、乳液、初乳、乳腺分泌物、淋巴、尿、汗液、淚液、胃液、滑液及黏液。在另一實施例中’本發明規定樣品係選自全血、血清或血漿。在一實施例中’本發明提供本文所述檢定方法中之任一 Ο 或多者，其中偵測步驟包含夾層檢定及競爭性結合檢定中之至少一種。在某些實施例中，偵測步驟包含夾層檢定。在某些實施例中’偵測步驟包含以下步驟中之至少一者：偵測與樣品接觸之固體光學表面的折射率變化；偵測發光變化；量測顏色變化；偵測放射能變化；使用生物層干涉量測法量測；使用懸臂偵測量測；使用無標記本徵成像量測；及使用聲學偵測量測。在某些實施例中，本發明之偵測步驟量測顏色變化。在某些實施例中，偵測步驟包含選 135384.doc 200934510 自由以下檢定組成之群的檢定：酶聯免疫吸附檢定 (ELISA);電化學發光檢定（ECL);放射免疫檢定（RIA); 固相放射免疫檢定（SPRIA);免疫墨點法；免疫沈澱；螢光活化細胞分選（FACS)。在另一實施例中，偵測步驟包括 ELISA。在一實施例中，藉由化合物與特異性結合GDF8的偵測試劑之特異性結合來偵測GDF8之存在，其中該化合物進一步包含可偵測標記。在另一實施例中，該可偵測標記包 _ 含至少一個選自由以下標記組成之群的標記：酶標記；發光標記、蛋白質標記；維生素標記；發色標記；放射性同位素標記及電子密度分子標記。在另一實施例中，可偵測標記為蛋白質標記且進一步包含生物素。在一實施例中，本發明之檢定提供選自由以下各物組成之群的捕捉試劑：抗GDF8抗體、抗原結合蛋白或其片段；GDF8結合蛋白；及GDF8結合域。在另一實施例中，本發明之檢定方法規定捕捉試劑為抗GDF8抗體、抗原結〇合蛋白或其片段且選自由RK35、RK22、MYO-028、MYO-029及JA16組成之群。在某些實施例中，捕捉試劑為 RK35。在某些實施例中，捕捉試劑為RK22。在本發明檢定方法之一實施例中，規定偵測試劑係選自由以下各物組成之群··抗GDF8抗體、抗原結合蛋白或其片段；GDF8結合蛋白及GDF8結合域。在一實施例中，偵測試劑為抗GDF8抗體、抗原結合蛋白或其片段且選自由 RK22及RK35組成之群。在另一實施例中，本發明之檢定 135384.doc •19· 200934510 方法規定偵測試劑為RK35。在另一實施例中，本發明之檢定規定偵測試劑為RK22。在一實施例中，本發明提供捕捉試劑為RK22且偵測試劑為RK35之檢定。在另一實施例中，本發明提供捕捉試劑為RK35且偵測試劑為RK22之檢定。在本發明之另一態樣中，本發明提供定量來自受檢者之樣品中GDF8之存在的檢定方法，其包含以下步驟：組合 (i)樣品與（ii)特異性結合GDF8之捕捉試劑及（iii)特異性結 _ 合GDF8之偵測試劑，偵測捕捉試劑與GDF8之間是否有特異性結合發生且定量樣品中GDF8之含量，其中對特異性結合之偵測指示GDF8存在於樣品中且可定量。在本發明之一實施例中規定使樣品中之GDF8與樣品中存在之GDF8 結合蛋白及抗GDF8解離。在一實施例中，如本文所述，本發明之檢定進一步包含組合樣品與酸性緩衝液，隨後組合樣品與捕捉試劑。在另一實施例中，本發明檢定方法之酸性緩衝液具有介於約pH 1.0與pH 6.0之間的pH值。在另〇一實施例中，酸性緩衝液之pH值為約pH 2.5。在本發明之另一態樣中，本發明提供用於治療（其包括改善及/或預防）受檢者之GDF8相關病症之醫藥組合物，其包含醫藥學上可接受之載劑及至少一種選自由以下各物組成之群的GDF8拮抗劑：GDF8結合域之肽模擬劑、編碼 GDF8結合域之肽模擬劑的胺基酸之經分離核酸、對GDF8 具特異性之抑制性聚核苷酸及特異性結合GDF 8且不特異性結合BMP11之抗GDF8抗體、抗原結合蛋白或其片段。 135384.doc -20· 200934510 在一實施例中，本發明之醫藥組合物包含GDF8特異性結合域之肽模擬劑，其基本上由選自由以下胺基酸序列組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID NO:4之胺基酸序列； SEQ ID NO:6之胺基酸序列；SEQ ID NO:8之胺基酸序列；SEQ ID NO: 10之胺基酸序列；及SEQ ID NO: 12之胺基酸序列。在一實施例中，本發明之醫藥組合物包含編碼GDF8特異性胺基酸之經分離核酸，其基本上由選自由以下核酸序 0 列組成之群的核酸序列組成：SEQ ID NO:3之核酸序列； SEQ ID NO:5之核酸序列；SEQ ID NO:7之核酸序列；SEQ ID NO:9之核酸序列；SEQ ID NChll之核酸序列及其片段之核酸序列。在一實施例中，本發明之醫藥組合物包含特異性結合 GDF8且不特異性結合BMP11之抗GDF8抗體、抗原結合蛋白或其片段，其包含包括SEQ ID NO: 16之胺基酸序列的輕鏈且其中該抗體進一步包含包括SEQ ID ΝΟ:14之胺基酸序〇列的重鏈。在另一實施例中，本發明之醫藥組合物提供特異性結合GDF8且不特異性結合BMP11之抗GDF8抗體、抗原結合蛋白或其片段，其包含包括SEQ ID ΝΟ:1 8之胺基酸序列的輕鏈且其中該抗體、抗原結合蛋白或其片段進一步包含包括SEQ ID NO:17之胺基酸序列的重鏈。在一實施例中，本發明之醫藥組合物包含特異性結合 GDF8且不結合BMP11且包含至少一個互補決定區（CDR)之抗GDF8抗體或抗原結合蛋白，該互補決定區包含選自由 135384.doc -21 - 200934510 以下胺基酸序列組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:19之胺基酸序列、SEQ ID NO:20之胺基酸序列、SEQ ID NO:21之胺基酸序列、SEQ ID NO:22之胺基酸序列、SEQ ID ΝΟ:23之胺基酸序列、SEQ ID NO:24之胺基酸序列、 SEQ ID NO:25之胺基酸序列、SEQ ID NO:26之胺基酸序列、SEQ ID NO:27之胺基酸序列、SEQ ID NO:28之胺基酸序列、SEQ ID NO:29之胺基酸序列、SEQ ID NO:30之胺基酸序列。 @ 在一實施例中，使用本發明之醫藥組合物來治療哺乳動物患者中選自由以下病症組成之群的GDF8相關病症：肌肉病症、神經肌肉病症、骨路退化性病症、代謝或誘導型骨絡病症、脂肪病症、葡萄糖代謝病症及騰島素相關病症。在另一實施例中，本發明之醫藥組合物，其中該 GDF8相關病症係選自由以下病症組成之群··肌肉萎縮症、ALS、肌肉萎縮、器官萎縮、腕隧道症候群、虛弱、充jk性阻塞性肺病、骨絡肌減少症、惡病質、肌肉消瘦症 © 候群、肥胖症、第二型糖尿病、葡萄糖耐受不良、代謝症候群、胰島素抵抗、營養失調、生殖腺早衰、雄激素抑制、繼發性甲狀旁腺功能亢進、骨質疏鬆症、骨質減少、骨關節炎、低骨質量、維生素D缺乏及神經性厭食症。本發明之另一態樣提供治療（其包括改善及/或預防）哺乳動物患者之GDF8相關病症之方法，其包含向該患者投予治療有效量之具有極少至無毒性性之Gdj? §特異性拮抗劑。在另一實施例中，本發明之方法規定本發明之拮抗劑 135384.doc •22· 200934510 係選自由以下各物組成之群：GDF8結合域之肽模擬劑、編碼GDF8結合域之肽模擬劑的胺基酸之經分離核酸、對 GDF8具特異性之抑制性聚核苷酸及特異性結合GDF8且不特異性結合BMP11之抗GDF8抗體、抗原結合蛋白或其片段。在一實施例中，本發明規定本發明之拮抗劑為GDF8結合域之肽模擬劑且GDF8結合域基本上由選自由以下胺基酸序列組成之群的胺基酸序列組成：SEQ ID NO:4之胺基 ^ 酸序列；SEQ ID NO:6之胺基酸序列；SEQ ID NO:8之胺基酸序列；SEQ ID NO:10之胺基酸序列；及SEQ ID NO:12之胺基酸序列。在一實施例中，本發明之治療方法提供本發明之拮抗劑為經分離核酸的治療方法，該經分離核酸編碼GDF8特異性胺基酸，基本上由選自由以下核酸序列組成之群的核酸序列組成：SEQ ID NO:3之核酸序列、SEQ ID NO:5之核酸序列、SEQ ID NO:7之核酸序列、SEQ ID NO:9之核酸 Q 序列、SEQ ID NO: 1 1之核酸序列及其片段之核酸序列。

在一實施例中，本發明提供本發明之拮抗劑為特異性結合GDF8且不特異性結合BMP11且包含包括SEQ ID NO:16 之胺基酸序列的輕鏈且進一步包含包括SEQ ID NO: 14之胺基酸序列的重鏈之抗GDF8抗體、抗原結合蛋白或其片段之治療方法。在某些實施例中，本發明之治療方法規定本發明之拮抗劑為特異性結合GDF8且不特異性結合BMP 11 之抗GDF8抗體、抗原結合蛋白或其片段，其包含包括SEQ 135384.doc -23- 200934510 ID NO: 1 8之胺基酸序列的輕鏈，且其中該抗體、抗原結合蛋白或其片段進一步包含包括SEQ ID NO: 17之胺基酸序列的重鏈。在某些實施例中，本發明之治療方法規定本發明之拮抗劑為特異性結合GDF8且不特異性結合BMP 1 1之抗 GDF8抗體、抗原結合蛋白或其片段，其包含至少一個互補決定區（CDR)，該互補決定區包含選自由以下胺基酸序列組成之群的胺基酸序列：SEQ ID ΝΟ:19之胺基酸序列、 SEQ ID NO:20之胺基酸序列、SEQ ID NO:21之胺基酸序 @ 列、SEQ ID NO:22之胺基酸序列、SEQ ID NO:23之胺基酸序列、SEQ ID ΝΟ··24之胺基酸序列、SEQ ID NO:25之胺基酸序列、SEQ ID NO:26之胺基酸序列、SEQ ID NO:27之胺基酸序列、SEQ ID NO:28之胺基酸序列、SEQ ID NO:29之胺基酸序列、SEQ ID NO:30之胺基酸序列。在本發明之一實施例中，本發明之治療方法規定GDF8 相關病症係選自由以下病症組成之群：受檢者之肌肉病症、神經肌肉病症、骨骼退化性病症、代謝或誘導型骨骼〇病症、脂肪病症、葡萄糖代謝病症及胰島素相關病症。在本發明之某些實施例中，本發明之治療方法規定GDF8相關病症係選自由以下病症組成之群：肌肉萎縮症、ALS、肌肉萎縮、器官萎縮、腕随道症候群、虛弱、充血性阻塞性肺病、骨骼肌減少症、惡病質、肌肉消痩症候群、肥胖症、第二型糖尿病、葡萄糖耐受不良、代謝症候群、胰島素抵抗、營養失調、生殖腺早衰、雄激素抑制、繼發性甲狀旁腺功能亢進、骨質疏鬆症、骨質減少、骨關節炎、低 135384.doc •24· 200934510 骨質量、維生素D缺乏及神經性厭食症。本發明之另一態樣提供診斷、預測或偵測受檢者是否罹患GDF8相關病症之方法，其包含以下步驟：自受檢者獲得第一樣οα ,組合第一樣品與本發明之拮抗劑；伯測第一樣品中GDF8之存在；定量第一樣品中〇1)178之含量；自未罹患GDF8相關病症之受檢者獲得第二樣品；組合第二樣品與拮抗劑；偵測第二樣品中GDF82含量；定量第二樣品中GDF8之含量且比較第一與第二樣品中GDF82含量，〇其中與第一樣品相比第二樣品中GDF8含量之升高、降低或相似指示GDF 8相關病症之嚴重程度是否已改變。本發明之另一態樣提供監測GDF8相關病症之嚴重程度的方法’其包含以下步驟：（i)自受檢者獲得第一樣品； (ii)組合第一樣品與如請求項卜16中任一項之拮抗劑；（iH) 偵測第一樣品中GDF8之存在；（iv)定量第一樣品中gDF8 之含量；（v)自未罹患GDF8相關病症之受檢者獲得第二樣品；（vi)組合第二樣品與拮抗劑；（vii)偵測第二樣品中 ® GDF8之含量；（viii)定量第二樣品中GDF8之含量且（ix)比較第一與第二樣品中GDF8之含量，其中與第二樣品相比第一樣品中GDF8含量之升高、降低或相似指示gDF8相關病症之嚴重程度是否已改變。本發明之另一態樣提供預測受檢者將發展GDF8相關病症之可能性的方法，其包含以下步驟：自受檢者獲得第樣品，（ii)組合第一樣品與如請求項丨_16中任一項之结抗劑；（iii)偵測第一樣品中GDF82存在；（iv)定量第一樣品 135384.doc -25· 200934510 中GDF8之含量；（v)自未罹患GDF8相關病症之受檢者獲得第二樣品；（vi)組合第二樣品與拮抗劑；（vii)偵測第二樣品中GDF8之含量；（viii)定量第二樣品中GDF8之含量且 (ix)比較第一與第二樣品中GDF8之含量，其中與第一樣品相比第二樣品中GDF8含量之升高、降低或相似指示受檢者將發展GDF8相關病症之可能性。本發明之另一態樣提供預測受檢者將發展GDF8相關病症之可能性的方法，其包含以下步驟：（i)自受檢者獲得第 @ 一樣品；（ii)組合第一樣品與如請求項1-16中任一項之拮抗劑；（iii)偵測第一樣品中GDF8之存在；（iv)定量第一樣品中GDF8之含量；（v)自未罹患GDF8相關病症之受檢者獲得第二樣品；（vi)組合第二樣品與拮抗劑；（vii)偵測第二樣品中GDF8之含量；（viii)定量第二樣品中GDF8之含量且 (ix)比較第一與第二樣品中GDF8之含量，其中與第二樣品相比第一樣品中GDF8含量之升高、降低或相似指示受檢者將發展GDF8相關病症之可能性。〇本發明之另一態樣提供醫藥組合物在製備用於治療（其包括改善及/或預防）哺乳動物患者之GDF8相關病症的藥物之用途，其中該醫藥組合物包含醫藥學上可接受之載劑及至少一種選自由以下各物組成之群的GDF8拮抗劑：GDF8 結合域之肽模擬劑、編碼GDF8結合域之肽模擬劑的胺基酸之經分離核酸、對GDF8具特異性之抑制性聚核苷酸及特異性結合GDF8且不特異性結合BMP11之抗GDF8抗體、抗原結合蛋白或其片段。 135384.doc •26- 200934510 本發明之另一態樣提供用於偵測來自受檢者之樣品中 GDF8之存在的套組，該套組包含特異性結合GDF8之捕捉試劑及特異性結合GDF8之偵測試劑，其中對GDF8與捕捉及偵測試劑之特異性結合的偵測指示樣品中GDF8之存在。在某些實施例中，本發明之套組進一步包含酸性緩衝液。本發明之另一態樣提供用於定量來自受檢者之樣品中的 GDF8之套組，該套組包含特異性結合GDF8之捕捉試劑及 φ 特異性結合GDF8之偵測試劑，其中對GDF8與捕捉及偵測試劑之特異性結合的偵測允許定量樣品中之GDF8。在某些實施例中，本發明之套組進一步包含酸性緩衝液。序列簡單說明 DNA及胺基酸序列在序列表中闡明且在表1中列舉。表1 SEQ ID NO 說明 1 胺基酸序列成熟人類GDF8 2 胺基酸序列人類GDF8前驅體 3 DNA序列肽模擬劑(GE1) 4 胺基酸序列肽模擬劑(GE1) 5 DNA序列肽模擬劑(GE2) 6 胺基酸序列肽模擬劑(GE2) 7 DNA序列肽模擬劑(GE3) 8 胺基酸序列肽模擬劑(GE3) 9 DNA序列肽模擬劑(GE4) 10 胺基酸序列肽模擬劑(GE4) 135384.doc -27- 200934510

11 DNA序列肽模擬劑(GE5) 12 胺基酸序列肽模擬劑(GE5) 13 DNA序列 RK22 VH小鼠 14 胺基酸序列 RK22 VH小鼠 15 DNA序列 RK22 VL小鼠 16 胺基酸序列RK22 VL小鼠 17 胺基酸序列RK22 VL人化 18 胺基酸序列 RK22 VH人化 19 胺基酸序列 CDR HI (Kabat) 20 胺基酸序列 CDR H2 (Kabat) 21 胺基酸序列 CDR H3 (Kabat) 22 胺基酸序列 CDR LI (Kabat) 23 胺基酸序列 CDR L2 (Kabat) 24 胺基酸序列 CDR L3 (Kabat) 25 胺基酸序列 CDR HI (AbM) 26 胺基酸序列 CDR H2 (AbM) 27 胺基酸序列 CDR H3 (AbM) 28 胺基酸序列 CDR LI (AbM) 29 胺基酸序列 CDR L2 (AbM) 30 胺基酸序列 CDR L3 (AbM) 31 DNA 序列 RK35VH 32 DNA 序列 RK35VL 33 DNA 序列 MYO-029 VH 34 DNA 序列 MYO-029 VL 35 DNA 序列 ActRIIB 36 胺基酸序列 ActRIIB 【實施方式】 135384.doc -28- 200934510 定義如本說明書及隨附申請專利範圍中所用，除非上下文明顯另外規定’否則單數形式"一"及"該"包括提及複數。如本文中所用’術語"抗體，，係指免疫球蛋白或其片段，且包括（但不限於）：多株抗體、單株抗體、單特異性抗體、多特異性抗體、人化抗體、四聚抗鱧、四價抗體、多重特異性抗鱧、單鏈抗體、域特異性抗體、單域抗體、域缺失抗體、融合蛋白、ScFc融合蛋白、單鏈抗體、嵌合抗〇體、合成抗體、重組抗體、雜交抗體、突變抗體、CDR接枝抗體及抗體片段，其包括：Fab、F(ab，)2、Fab'片段、 Fv片段、單鏈Fv(ScFv)片段、Fd片段及dAb片段或保留抗原結合功能之上述抗鱧的任何經化學或遺傳操縱之對應物。本發明亦^供抗原結合蛋白’其不同於如本文所述之抗體，其包括雙功能抗體、CDR3肽、限制性FR3-CDR3-FR4 肽、奈米抗髖（US專利申請案2008/0107601 )、二價奈米抗 Ο 體、小模數免疫藥物（SMIP)、鯊魚可變igNAR域（w〇 03/014161)、微型抗體及保留抗原結合功能的任何片段或經化學或遺傳操縱之對應物。通常，該等片段將包含抗原結合域。如熟習此項技術者將認識到，該等分子中之任一者’例如”人化"抗體或抗原結合蛋白，可經工程化（例如" 生殖系化"）以降低其免疫原性、增強其親和力、改變其特異性或用於其他目的。可經由例如傳統融合瘤技術（K〇hler等人，Nature 135384.doc •29· 200934510 256:495-499 (1975))、重組 DNA 方法（美國專利第 4,816,567 號）或使用抗體文庫之噬菌體呈現技術（Clackson等人，

Nature 352:624-628 (1991) ; Marks 等人，J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991))製備本發明之抗體。對於各種其他抗體產生技術’參見 Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow等人編，Cold Spring Harbor Laboratory，1988。術語"抗原"係指可刺激動物之抗體產生或T細胞反應或兩者之化合物、組合物或免疫原性物質，包括注射或吸收至動 φ 物中之組合物。可產生針對全分子或分子之一部分（例如抗原決定基或半抗原）之免疫反應。可使用該術語來指個別大分子或抗原大分子之同源或異源群體。抗原與特異性體液及/或細胞免疫性之產物反應《術語"抗原"廣泛包涵包括蛋白質、多肽、抗原性蛋白質片段、核酸、募醣、多酷、有機或無機化學物質或組合物及其類似物之部分。術語”抗原"包括所有相關抗原性抗原決定基。可使用任何數量之此項技術中熟知之抗原決定基定位技術鑑別給定抗原 ^ 之抗原決疋基。參見例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第 66卷（Glenn E. Morris，編，1996) Humana Press, Totowa，N. J.。舉例而言，可藉由（例如）在固相支撐物上同時合成大量肽（該等肽對應於蛋白質分子之部分），且使該等肽在肽仍連接於支持物時與抗體反應來確定線性抗原決定基。該等技術在此項技術中已知且描述於（例如）美國專利第4,7〇8,871號；Geysen等人 (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002 ； Geysen 135384.doc •30· 200934510

G 等人（刪）M〇lec· Immun〇1. 23:7〇97i5中所有該等文獻係以引用的方式全部併人本文中。類似地，諸如藉由（例如射線結晶學及2維核磁共振，藉由測定胺基酸之空間構形易於鑑別構形抗原決定基。纟見例如前述Ep⑹pe Mapping Protoc〇is。此外，出於本發明之目的，"抗原"亦可i括對原生序列之修部，諸如缺失、⑨加及取代（性質上通常保守，但其可為非保守），只要蛋白質保持引發免疫學反應之能力。此等修飾可為有意如經由定點突變誘發或經由特定合成程序或經由遺傳工程方法，或可為偶然的，諸如經由使產生抗原之宿主突變。此外，抗原可來源於或獲自任何病毒、細菌、寄生蟲、原生動物或真菌且可為全有機體。類似地，諸如在核酸免疫應用中表現抗原之寡核苷酸或聚核苷酸亦包括在該定義中。亦包括合成抗原，例如聚抗原決定基、侧接抗原決定基及其他重組抗原或合成獲得之抗原（Bergmann等人（1993) Eur. J. Immunol. 23:2777 2781 ; Bergmann 等人（1996) J. Immunol. 157:3242 3249 , Suhrbier, A. (1997) Immunol, and Cell Biol. 75:402 408; Gardner 等人（1998)第 12 界世界 AIDS 會議（12th World AIDS Conference)，Geneva，Switzerland, 1998年 6 月 28 日-7 月3曰）。術語"抗原結合域"、"抗體之活性片段”或抗原結合蛋白或其類似物係指包含與抗原之部分或全部特異性結合或互補的區域之抗趙或抗原結合蛋白分子之部分。若抗原大，則抗體僅可與抗原之特定部分結合。"抗原決定基"、"抗 135384.doc •31 · 200934510 原決定基之活性片段"或"抗原決定子"或其類似物為負責與抗體之抗原結合域特異性相互作用的抗原分子之一部分。可藉由一或多個抗體可變域（例如由VH域組成之所謂的Fd抗體片段）提供抗原結合域。抗原結合域可包含抗體輕鏈可變域（VL)及抗體重鏈可變域（Vh)(美國專利第 5,565,332號）。 "樣品"為自細胞、組織、器官或有機體收集以供（例如）積測分析物之生物材料。例示性生物樣品包括血清、血 ❹ 液血浆生檢樣品、組織樣品、細胞懸浮液、唾液、口水、腦脊髓液、羊膜液、乳液、初乳、乳腺分泌物、淋巴、尿、汗液、淚液、胃液、滑液、黏液及其他臨床試樣及樣品。術語"捕捉試劑”係指能夠結合生物樣品中待偵測之標靶分子或分析物之試劑，例如抗體或抗原結合蛋白。通常，捕捉試劑經固定於（例如）檢定表面上，例如固體基質或反應容器。"GDF-8捕捉試劑"與GDF-8特異性結合。 ® ”偵測試劑”為用於本發明之免疫檢定方法中以與例如 GDF-8之標靶蛋白特異性結合的試劑，例如抗體或抗原結合蛋白。偵測試劑可視情況包含可偵測標記。偵測試劑通常識別且結合標靶蛋白之不同於捕捉試劑之結合部位或抗 '、''疋基的、σ部位或抗原決定基。可使伯測試劑與可偵測標δ己偶合。"〇〇1?_8偵測試劑"與GDF 8特異性結合。術語"互補決定區"或"CDR"係指抗體或抗原結合蛋白分子之间變區，其由一起形成抗原結合域的三個來自重鏈之 135384.doc -32· 200934510 環及三個來自輕鏈之環組成。以最廣泛意義使用術語"偵測"以包括定性與定量量測標靶分析物’本文中量測諸如GDF-8或BMP-11之特定乾標分子。本文所述之檢定方法可用以鑑別生物樣品中gdf_8或 BMP-11之存在或可用以定量樣品中GDF-8或BMP-l 1之量。 "偵測劑"或"偵測試劑"可用於本發明之方法中以偵測由包含間接標記之偵測抗體或抗原結合蛋白產生之信號。债 φ 測劑或試劑為允許偵測GDF-8調節劑或複合物之蛋白質或小分子。在一較佳實施例中，偵測劑與GDF-8調節劑特異性結合。摘測劑可視情況包含可偵測標記。偵測劑本身亦可藉由包含可偵測標記之物質偵測。舉例而言，藉由本文中提供之方法偵測的GDF-8調節劑亦可用於偵測其他GDF_ 8調節劑之方法中。 "與GDF8活性相關之病症"、"與GDF8相關之病症，，、 "GDF8相關病症"或其類似術語係指可全部或部分由gDF8 G 調節異常（例如GDF8之表現及/或活性異常升高或降低）引起之病症，及/或可藉由調節及/或監測Gdf 8蛋白及/或活性治療、改善、預防、預測及/或監測之病症。GDF8相關病症包括肌肉病症、神經肌肉病症、骨骼退化性病症、代謝或誘導型骨絡病症、脂肪病症 '葡萄糖代謝病症或肤島素相關病症。術語"有效劑量"、”治療有效劑量"或”有效量"係指足以改善個鱧（包括患有GDF-8相關病症之個體）之臨床症狀或 135384.doc -33· 200934510 實現個體之所需生物學結果（例如增加肌肉質量、肌力及/ 或骨路密度）之劑量或含量。舉例而言，該量將足以降低與骨絡肌質量及骨路密度之負調節相關的GDF_8之活性。治療結果及臨床症狀可包括肌肉f量增加、心血管指標改善或葡萄糖代謝調節改善。舉例而言，GDF_8抑制劑可増加肌肉質量、肌力、調節肌肉特異性酶之含量及/或刺激肌母細胞增生。在一較佳實施例中，GDF-8抑制劑減少 GDF-8相關病症之臨床表現。GDF 8調節劑可調節前脂肪〇母細胞分化成脂肪細胞，降低體脂肪蓄積，降低血清甘油二酯含量，降低血清膽固醇含量，調節葡萄糖代謝，調節骨胳密度且降低高血糖症。亦可將GDF_8抑制劑投予個體以增加肌肉質量、增加或加速生長，包括肌肉生長。治療有效量之GDF-8抑制劑係指在單次或多次劑量投予正處於治療之個體後，有效預防、治癒、延遲、降低病症或復發病症之至少一種症狀的嚴重程度或改善病症或復發病症之至少一種症狀，或延長受檢者存活超過該治療不存在情況 ® 下所預期的受檢者存活之量。患有GDF-8相關病症之個體、處於發展GDF_8相關病症之風險中的個體、經歷GDF_8調節劑療法之個體及為投予 GDF-8調節劑之候選者之個體可為本文中提供之方法的候選者。本發明之方法可偵測或預防有害免疫反應及/或評估使用GDF-8調節劑的功效、生物穩定性或適用性。患有GDF-8相關病症（諸如肌肉相關病症或神經肌肉病症）或處於發展該GDF-8相關病症之風險中的個體為本文中 I35384.doc -34- 200934510 所提供之方法的候選者。對GDF-8活性之抑制增加個體之肌肉組織，該等個體包括彼等患有肌肉相關病症者。許多病症與功能上受損之肌肉或神經組織相關，例如（但不限於）肌肉萎縮症、肌萎縮性側索硬化（ALS)、骨骼肌減少症、惡病質、肌肉消痩、肌肉萎縮或虛弱。肌肉萎縮症包括（例如）假性肥大、面肩胛肱型及肢帶型骨萎縮症。例示性肌肉萎縮症包括杜興氏肌肉萎縮症（雷登-莫斯（Leyden-Mobius))、貝克爾肌肉萎縮症（Becker muscular dystrophy)、 ❹艾-德肌肉萎縮症（Emery Dreifuss muscular dystrophy)、肢帶型肌肉萎縮症、脊柱強直症候群、渥里克氏症候群 (Ullrich syndrome)、福山型肌肉萎縮症（Fukuyama muscular dystrophy)、沃-瓦二氏症候群（Walker Warberg syndrome)、肌肉-眼-腦病、面肩狎肢塑肌肉萎縮症（蘭德二氏（Landouzy-Dejerine))、先天性肌肉萎縮症、肌強直萎縮症（斯坦特氏症（Steinart's Disease))及其他肌強直及高樂氏症（Gower’s Disease)。〇 GDF-8相關肌肉病症亦包括選自與心血管疾病相關或繼發於另一疾病或病狀（諸如器官萎縮、器官衰竭、癌症、後天免疫缺陷症候群（AIDS)、臥床休養（bed rest)、固定化、長時間未使用（prolonged lack of use)或亦包括於該術語中之其他疾病或病狀）的肌肉退化之病症。患有例如肥胖症之脂肪組織病症、心血管病症（當與肌肉損失或肌肉消瘦相關時）及胰島素代謝病症或處於發展該等病症之風險中的個體可為候選者。類似地’患有與骨 135384.doc •35- 200934510 骼損失相關的病症（包括骨質疏鬆症，尤其在老年人及/或經絕後女性中，糖皮質激素誘發之骨質疏鬆症、骨質減少、骨關節炎及骨質疏鬆症相關骨折）或處於發展該等病症之風險中的個體為本文中提供之治療方法的候選者。其他GDF-8相關病狀包括特徵在於低骨質量之代謝性骨骼疾病及病症，諸如彼等歸因於慢性糖皮質激素療法、生殖腺早衰、雄激素抑制、維生素D缺乏、繼發性甲狀旁腺功能充進、營養缺乏及神經性厭食症之病症。〇心血管病症之實例包括冠狀動脈病（動脈粥樣硬化）、絞痛（包括急性及不穩定性絞痛）、心臟病發作、中風（包括缺血性中風）、咼血壓相關心血管疾病、心臟衰竭、充血性心臟衰竭、冠狀動脈病、高血壓、高脂質血症、周邊動脈疾病及末稍血管疾病。胰島素代謝病症之實例包括與異常葡萄糖内穩定、第二型糖尿病、糖尿病前期、葡萄糖耐受不良、血脂異常、代謝症候群（例如症候群X)及由諸如燒傷或氮不平衡之外傷誘發之胰島素抵抗相關的病狀。 © 術語"GDF-8"係指特異性生長及分化因子_8且亦可稱作肌肉抑制素。該術s吾係指GDF-8之全長未經加工前驅體形式以及由轉譯後裂解產生的成熟及前肽形式。除非另有說明為"無活性"，否則"GDF-8蛋白"保留一或多種GDF_8生物活性。如本文中所論述，該術語亦指GdF_8之保持至少一種與成熟GDF-8相關的生物活性之任何片段及變體，包括已經修飾之序列。成熟人類GDF-8之胺基酸序列提供於 SEQ ID ΝΟ:1中。本發明係關於來自所有脊椎動物物種之 135384.doc •36· 200934510 GDF-8，該等物種包括（但不限於）人類牛、難小鼠、大鼠、I# 、綿羊、火雞、佛拂及魚（關於序列資訊，參見例如 McPhemm 等人，Pr〇c. Nat. Acad. Sci· U.S.A. 94:12457-12461(1997)) 〇術語"GDF-8活性"係指與活性GDF_8蛋白相關的一或多種生長調節或形態發生生理活性。舉例而言活性GDF-8 為骨骼肌質量之負調節劑。活性GDF_8亦可調節肌肉特異性酶（例如肌酸激酶）之產生、刺激肌母細胞增生且調節前 ❹ 知肪母細胞分化成脂肪細胞。"GDF-8活性"包括"GDF-8結合活性"。舉例而言，成熟GDF-8特異性結合GDF-8之前肽區、ActRIIB、GDF-8受體、活化素、卵泡抑素、含有印泡抑素域之蛋白質、GASP-1及其他蛋白質。諸如抗體或抗原結合蛋白或其部分之GDF-8抑制劑可降低此等結合活性中之一或多者。GDF-8之生物活性為熟習此項技術者所熟知，參見例如美國專利申請案第2004/0223966號之實例5-6 及8-12 。 ® "GDF·8相關病症"為受檢者將受益於投予諸如GDF-8抑制劑之GDF-8調節劑的病症或病狀。GDF_8相關病症包括諸如肌肉相關或神經肌肉病症或病狀之醫學病症，例如肌肉萎縮症、肌萎縮性側索硬化（ALS)、骨骼肌減少症 '惡病質、肌肉消瘦、肌肉萎縮或肌肉退化，包括消瘦、萎縮或虛弱。肌肉萎縮症包括例如假性肥大、面肩胛肱型及肢帶型肌肉萎縮症。例示性肌肉萎縮症包括杜興氏肌肉萎縮症（雷登-莫斯）、貝克爾肌肉萎縮症、艾-德肌肉萎縮症、 I35384.doc -37- 200934510 肢帶型肌肉萎縮症、脊柱強直症候群、渥里克氏症候群、福山型肌肉萎縮症、沃-瓦二氏症候群、肌肉_眼_腦病、面肩胛肱型肌肉萎縮症（蘭德二氏）、先天性肌肉萎縮症、肌強直萎縮症（斯坦特氏症）及其他肌強直及高樂氏症。與心血管疾病相關或繼發於諸如器官萎縮、器官衰竭、癌症' 後天免疫缺陷症候群（aids)、臥床休養、固定化、長期未使用或其他疾病或病狀的另一疾病或病狀之肌肉退化亦包括於該術語中。〇 GDF-8相關病症亦包括脂肪組織病症（例如肥胖症）、心血管疾病或病症（當與肌肉損失或肌肉消瘦相關時）及胰島素代謝病症。GDF-8相關病症亦包括與骨骼損失相關的病症，包括骨質疏鬆症（尤其在老年人及/或經絕後女性中）、糖皮質激素誘發之骨質疏鬆症、骨質減少、骨關節炎及骨質疏鬆症相關骨折。其他病狀包括特徵在於低骨質量之代謝性骨疾病及病症，諸如彼等歸因於慢性糖皮質激素療法、生殖腺早衰、雄激素抑制、維生素D缺乏、繼發性甲 Ο 狀旁腺功能亢進、營養缺乏及神經性厭食症之病症。心血管病症之實例包括冠狀動脈病（動脈粥樣硬化）、絞痛（包括急性及不穩定性絞痛）' 心臟病發作、中風（包括缺灰性中風）、高血壓相關心血管疾病、心臟衰竭、充血性心臟衰竭、冠狀動脈病、高血壓、高脂質血症、周邊動脈疾病及末稍血管疾病。胰島素代謝病症之實例包括與異常葡萄糖内穩定、第二型糖尿病、糖尿病前期、葡萄糖耐受不良、血脂異常、代謝症候群（例如症候群X)及由諸如燒 135384.doc -38- 200934510 傷或氮不平衡之外傷誘發之胰島素抵抗相關的病狀。術語"GDF-8潛伏複合物"係指在成熟GDF-8同源二聚體與GDF-8前肽之間形成的蛋白質之複合物。咸信兩個gdf· 8前肽與同源二聚體中之兩個成熟GDF-8分子締合形成無活性四聚複合物。替代或在該等GDF-8前肽一或多者之外’潛伏複合物亦可包括其他GDF抑制劑。術語"成熟GDF-8"係指自GDF-8前驅體蛋白的叛基末端域裂解之蛋白質。成熟GDF-8可以單體、同源二聚體形式〇存在’或存在於GDF-8潛伏複合物中。視條件而定，成熟 GDF-8可在任何或所有此等不同形式之間確立平衡。成熟 GDF-8之生物活性形式亦稱為"活性GDF-8"。生物活性 GDF-8並不存在於GDF-8潛伏複合物中。如本文中所論述’該術語亦指GDF-8之保持至少一種與成熟gdF-8相關的生物活性之任何片段及變體，包括已經修飾之序列。術語"GDF-8前肽"係指自GDF-8前驅體蛋白的胺基末端域裂解之多肽。GDF-8前肽能夠與成熟GDF-8上之前肽結 ® 合域結合。GDF-8前肽與成熟GDF-8同源二聚體形成複合物。咸信兩個GDF-8前肽與同源二聚體中之兩個成熟 8分子締合形成稱為"潛伏複合物"之無活性四聚複合物。替代或在該等GDF-8前肽中之一或多者之外，潛伏複合物亦可包括其他GDF抑制劑。術語"GDF-8調節劑"包括任何能夠調節gdf-8的活性、表現、加工或分泌之藥劑或其醫藥學上可接受之衍生物。 GDF-8調節劑將增強或降低一或多種gdF_8活性。舉例而 135384.doc -39· 200934510 言，可使用包括"GDF-8抑制劑"之GDF-8調節劑來治療脂肪細胞病症、葡萄糖代謝相關病症或骨骼病症。該術語包涵GDF-8調節劑之生物衍生物。在某些實施例中，GDF-8 調節劑或抑制劑將影響GDF-8與一或多種其生理學結合搭配物之結合，該等搭配物包括（但不限於）受體（例如 ActRIIB)、含有印泡抑素域之蛋白質（例如卵泡抑素、 FLRG、GASP-1、GASP-2)或諸如GDF-8前肽及其突變體及衍生物之GDF-8蛋白。GDF-8調節劑包括例如特異性結合 ◎ GDF-8(包括 MYO-029、MYO-028、MYO-022、JA-16及其片段及衍生物）之抗體、特異性結合GDF-8受體之抗體（參見例如美國專利第6,656,475號、美國專利公開案第 2004/0077053-A1號）、經修飾之可溶性受體（包括受體融合蛋白，諸如ActRIIB_Fc融合蛋白）、特異性結合GDF-8或 BMP-11之其他蛋白質（諸如GDF-8或BMP-11前肽、GDF-8 前肽之突變體及衍生物、卵泡抑素、含有卵泡抑素域之蛋白質及此等蛋白質之Fc融合體）、與GDF-8受體結合之蛋白〇質及此等蛋白質之Fc融合體，且包括模擬劑。術語GDF-8 抑制劑亦包涵非蛋白質性抑制劑（諸如核酸）。GDF-8抑制劑包括特異性抑制GDF-8之蛋白質、抗體、肽、肽模擬劑、核糖核酸酶、反義寡核苷酸、雙股RNA(包括siRNA或 microRNA)及其他小分子。術語"個體"係指任何脊椎動物，包括哺乳動物、鳥、爬行動物、兩棲動物或魚。術語"哺乳動物"包括照此分類之任何雄性或雌性動物，包括人類、非人類靈長類動物、 135384.doc -40- 200934510 狼、犬、馬、貓、綿羊、豬、山羊、牛等*非嘴乳動物之實例包括雞、火雞、鴨、鵝、魚（諸如鮭魚、鯰魚、鱸魚、斑馬魚及鱒魚）及蛙。舉例而言，個體可選自人類或馴養動物、飼養動物、家畜、動物園動物、體育動物、競技動物或寵物。術語"抑制"及"抑制性"係指因GDF-8抑制劑而使GDF-8 之一或多種活性相對於不存在相同抑制劑之情況下的 GDF-8活性降低。活性降低較佳為至少約20%、30%、 0 40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 90% 以上。在某些實施例中，當受一或多種本發明所揭示抑制劑影響時， GDF-8之活性降低至少50%、較佳至少約60%、62%、 64% ' 66% ' 68% ' 70% > 72% ' 74% ' 76% ' 78% > 80% > 820/〇、84%、86%、88%、90%、92%、94%、96%、98%或 99%，且甚至更佳至少95%至100%。術語"中和"係指使一或多種GDF-8活性降低至少80%、85%、90%或95%。可如 Thies等人Growth Factors 18:251-259 (2001)中所述在例如 © 報導基因檢定中或在如以下實例所說明之ActRIIB受體檢定中量測對GDF-8活性之抑制。術語"經分離"係指實質上與其天然環境分離之分子。舉例而言’經分離蛋白質為實質上與其所來源之細胞或組織分離之蛋白質。標記亦可為酶，例如轉化受質之酶，諸如過氧化物酶 (例如辣根過氧化物酶）、鹼性磷酸酶、葡萄糖氧化酶及β_ 半乳糖苷酶。當與可溶性受質（例如3,3|，5,5,四甲基聯苯胺 135384.doc -41. 200934510 (TMB)、鄰笨二胺（OPD)、2,2，_次偶氮基_二[3乙基苯并嗟*»坐琳]確酸醋（ABTS)、魯米諾（iumin〇i)、多盼、0丫咬醋及螢光素）一起培育時，過氧化物酶產生可以光譜方法读測的受質之發色或發光變化。通常，與受質一起培育固定時期後，中止反應（例如藉由酸化）且藉由量測光學密度（吸光率）或發光定量結果。可將吸光率結果與發色反應之線性範圍内之OD值相比較且以相對發光單位（RLU)量測發光免疫檢定。〇標記亦可為生物素、半抗原或抗原決定基標籤（例如組胺酸、HA(血球凝集素肽）、麥芽糖結合蛋白、AviTag⑧或谷胱甘肽-s-轉移酶），其可藉由添加與締合kGdf_8調節劑或偵測劑之標記相互作用之經標記偵測劑偵測。可經由以抗生物素蛋白-酶共輛物及適當發色或發光受質依次培月後，與抗生物素蛋白-酶共軛物（例如抗生物素蛋白辣根過氧化物酶）之相互作用來偵測經生物素標記（"生物素化") 之偵測劑。銪亦為標記。 Ο 如本文中所用，術語"肽模擬劑，，係指在生物學上模擬激素、細胞激素、酶受質、病毒或其他生物分子上的活性決定子且可括抗、刺激或以其他方式調節天然配位體之生理活性之狀。狀模擬劑較佳經定義I具有如同肽的二級結構及視情況其他結構特徵之化合物；其作用方式在很大程度上與原生肽之作用方式類似或相同，然而與原生狀尤其受體或酶相比，其活性（例如作為拮抗劑或抑制劑）可經改良。此外，其可模擬原生肽之作用（促效劑）。在此說明書 135384.doc -42· 200934510 全文中’術語"肽模擬劑"係指由於結構特性而能夠模擬功能性GDF8或非功能性GDF8之生物學功能的分子。在本發明中’提出包含GDF8之結合/二聚化域的GDF8片段對 GDF8起顯性負性作用。GDF8之結合/二聚化域的肽模擬劑本身可以多莫耳過量存在且可"競爭勝過”野生型GDF8且與野生型分子形成異源二聚體，由此對GDF8之生物學功能起顯性負性作用。在此意義上，GDF8功能將被破壞，因此減輕對肌肉生長之抑制。該生長促進GDF8模擬劑活 0 性之活體内生物學檢定之一實例為藉由投予有效量之至少一種本發明之生長促進模擬劑來增強正常小鼠或其他測試動物之骨骼肌質量。術語”經純化"係指實質上不含在天然環境中與分子相關聯之其他物質之分子。舉例而言，經純化蛋白質實質上不含來自其所來源之細胞或組織的細胞物質或其他蛋白質。該術語係指經分離蛋白足夠純而可以治療組合物形式投予，或至少70%至80%(w/w)純、更佳至少80%-90%(w/w) G 純、甚至更佳90-95%純；且最佳至少95%、96%、97%、 98%、99%或 100%(w/w)純之製劑。如本文中所用，術語"siRNA”係指可用於使標靶基因之表現沉默的小干擾RNA分子。siRNA可為具有19-25個核苷酸之dsRNA。可藉由稱為Dicer之RNase III相關核酸酶降解較長dsRNA分子内源性產生siRNA。亦可外源地或藉由轉錄表現構築體將siRNA引入細胞中。形成後，siRNA與蛋白質組份一起裝配為稱為RNA誘導沉默複合物（RISC)之含 135384.doc -43- 200934510 有内切核糖核酸酶之複合物。ATP產生之siRNA松解活化 RISC，其轉而藉由Watson-Crick驗基配對乾向互補mRNA 轉錄產物，由此裂解且破壞mRNA。mRNA之裂解發生在由siRNA股結合之區域的中部附近。此序列特異性mRNA 降解導致基因沉默。可採用至少兩種方式來實現siRNA-介導之基因沉默。首先，siRNA可活體外合成且引入細胞中以瞬時抑制基因表現。siRNA為可包括例如19個RNA核苷酸具有對稱二核苷 @ 酸3'懸垂物之短混合寡核苷酸之雙鏈體。使用合成21 bp siRNA雙鏈體（例如，19個RNA鹼基，接著為UU或dTdT 3' 懸垂物），可在哺乳動物細胞中實現序列特異性基因沉默。此等siRNA可特異性抑制哺乳動物細胞中所靶向之基因轉譯，而不因較長雙股RNA(dsRNA)使DNA依賴性蛋白激酶（PKR)活化，該活化可導致對許多蛋白質轉譯之非特異性抑制。其次，siRNA在活體内自載體表現。可使用此方法來在〇細胞或轉殖基因動物中穩定表現SiRNA。siRNA表現載體經工程化以自聚合酶III(pol III)轉錄單元驅動siRNA轉錄。Pol III轉錄單元適合於髮夾siRNA表現，此係因為其採用引起將2個bp懸垂物（例如UU)添加至髮夾siRNA(有助於siRNA功能之特徵）的短AT富集轉錄終止位點。亦可使用Pol III表現載體來產生表現siRNA之轉殖基因小鼠。 siRNAs亦可以組織特異性方式表現。在此方法下，長 dsRNA首先自所選細胞株或轉殖基因小鼠之核内的啟動子 135384.doc -44 - 200934510 (諸如CMV(pol II))表現。長dsRNA在核中（例如藉由Dicer) 被加工成siRNA。siRNA離開核且介導基因特異性沉默。可結合組織特異性（pol H)啟動子使用類似方法來產生組織特異性基因基因剔除小鼠° 術語"小分子"係指不為大分子之化合物。參見例如Karp， (2000) Bioinformatics Ontology 16:269-85 ； Verkman, (2004) AJP-Cell Physiol. 286:465-74。因此’通常認為小分子為彼等小於1000道爾頓之化合物（例如voet & Voet， ❹ Biochemistry，第二版，N.尺0^編 ’ wiley and S0ns，New York, 14 (1995))。舉例而言，Davis 等人（(2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:5981-86)使用措詞小分子來指示葉酸、曱胺嗓吟及神經肽’而Halpin及Harbury ((2004) PLos Biology 2:1022-30)使用該措詞來指示小分子基因產物，亦即DNA、RNA及肽。天然小分子之實例包括膽固醇、神經傳遞素及siRNA ;合成小分子包括許多市售小分子資料庫中所列之各種化學物質，例如FCD(精製化學藥品〇資料庫（Fine Chemicals Database))、SMID(小分子相互作用資料庫（Small Molecule Interaction Database))、ChEBI (生物目的化+ 學品機構（Chemical Entities of Biological Interest))及 CSD(劍橋結構資料庫（Cambridge Structural Database))(參見例如 Alfarano 等人（2005) Nuc. Acids Res. Database Issue 33:D416-24)。術語"特異性結合"及其類似術語意謂兩個或兩個以上分子形成在生理或檢定條件下可量測且具選擇性之複合物。 135384.doc -45- 200934510 若在經適當選擇條件下該結合實質上不受抑制，而同時非特異性結合受到抑制，則稱抗體或抗原結合蛋白或其他抑制劑與蛋白質"特異性結合"。特異性結合之特徵在於高親和力且對化合物或蛋白質具有選靠。非#異性結合通常具有低親和力。舉例而言，在IgG抗體中結合之特徵通常在於至少約1G-7 Μ或1G_7 M以上，諸如至少約ig_8 Μ或 1〇_8 M以上，或至少約1G_9 Μ或1G_9 Μ以上，或至少約 10-10或1G-1G以上，或至少約1(Μ1 Μ41(Μι μ以上或

至少約ΗΜ2 Μ或Η)]〗Μ以上之親和力。若（例如）抗原結合域對不由許多抗原攜帶的特定抗原決定基具特異性，在該情況下攜帶該抗原結合域之抗體或抗原結合蛋白通常不結合其他抗原，則該術語亦適用。某些方法對特異性結合要求高親和力，而諸如表面電漿共振檢定之其他方法可㈣較不穩定複合物及較低親和力相互作用。必要時，可藉由改變結合條件在實質上不影響特異性結合之情況下，減少非特異性結合。在此項技術中已头該等條件，且熟習此項技術者可使用常規技術選擇適田條件通常根據結合搭配物之濃度、溶液之離子強度、 &度、允許結合之時間、不相關分子之濃度（例如血清白乳路蛋白）等來界定條件。例示性結合條件係闌明於以下實例中。術特異性GDF8拮抗劑"或"特異性GDF8抑制劑，'包括任何能夠抑制、降低及/或中和GDF8之活性、表現、加工一不顯著抑制、降低及/或中和例如TGF-β超家族 135384.doc • 46- 200934510 之其他蛋白質（例如BMP 11)之活性、表現、加工或分泌之藥劑。該等抑制劑包括大分子及小分子，例如特異性抑制 GDF8活性之蛋白質、抗體、肽、肽模擬劑、siRNA、核糖核酸酶、反義募核苷酸、雙股RNA及其他小分子。該等抑制劑據稱特異性"拮抗"（例如"抑制"、"降低”、”減少’'或"中和"）GDF8之生物活性。GDF-8抑制劑將抑制或中和或降低 GDF-8之至少一種生物活性，諸如與活性GDF-8蛋白相關之生理學、生長調節或形態發生活性。舉例而言，GDF-8 q 為骨骼肌生長之負調節劑。GDF_8抑制劑可增加肌肉質量、增強肌力、調節肌肉特異性酶含量、刺激肌母細胞增生、調節前脂肪母細胞分化成脂肪細胞、降低體脂肪蓄積、降低血清甘油三S旨含量、降低企清膽固醇含量、調節葡萄糖代謝及/或降低高血糖症。本文中術語"治療"與術語"治療方法”可互換使用且係指治療性治療及預防治療性/預防性措施。術語治療亦經定義為能夠改善、治療或預防病症。需要治療者可包括已患 Ο 有特定醫學病症之個體以及彼等可最終獲得病症者（亦即需要預防措施者）。除非另有所述，否則本發明之實施將採用此項技術範圍内之習知分子生物學、微生物學、重組DNA及免疫學技術。該等技術於文獻中充分說明。參見例如Sambrook，等人，Molecular Cloning; A Laboratory Manual，第二版 (1989); DNA Cloning，第 I及 II 卷（D.N Glover 編 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J· Gait編，1984) ; Nucleic 135384.doc -47- 200934510

Acid Hybridization (Β· D. Hames & S. J. Higgins編 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins 編 1984) ; Animal Cell Culture (R. I. Freshney編 1986); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986) ; B. Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning (1984);系列叢書 Methods In Enzymology (Academic Press，Inc.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller及 Μ. Ρ· Calos 編 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods in Enzymology 第 1 54 卷及第 155 卷（分別由 Wu 及 Grossman,及 Wu 編）；Mayer 及 Walker 編（1987)，

Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London) ； Scopes, (1987)， Protein Purification: Principles And Practice，第二版（8卩1*111§61·-Verlag，N.Y.)及 Handbook Of Experimental Immunology，第 I-IV卷（D. M. Weir及 C. C. Blackwell編（1986))。 GDF8特異性抗原決定基及針對其之拮抗劑使用特異性GDF8抗體且重疊人類GDF8之13個胺基酸之肽的抗原決定基定位揭示可針對GDF8之特異性拮抗作用加以靶向的GDF8特異性候選抗原決定基（實例4.2)。基於此方法，鑑別出5個獨立的GDF8特異性抗原決定基。本發明提供此等抗原決定基（包括其肽模擬劑）、編碼該等抗原決定基之聚核苷酸、針對其之抑制性聚核苷酸及其相關抗體作為針對GDF8活性之特異性拮抗劑。 GDF8特異性抗原決定基及其肽模擬劑 135384.doc •48- 200934510 本發明提供與抗原決定基同源的新穎經分離且經純化之多肽，該抗原決定基可在生物學上表徵為對GDF8具特異性且因此本文中稱為GDF8特異性抗原決定基。此等GDF8 特異性抗原決定基之肽模擬劑可用作GDF8拮抗劑，亦即以拮抗GDF8活性，例如GDF8與其受體之結合，此為本發明之部分。舉例而言，本發明提供經純化且經分離之聚核苷酸，其編碼5個GDF8特異性結合域（其可包括GDF8之ALK4/ALK4 U 受體結合部位），且其亦可充當GDF8受體拮抗劑/肽模擬劑，在本文中稱為"GE1"、"GE2”、”GE3”、"GE4”及 "GE5"。本發明之核酸可包含DNA或RNA且可為全合成或部分合成。除非上下文另外要求，否則對如本文中闡明之核苷酸序列的提及包涵具有指定序列或染色體組等效物 (例如互補序列）之DNA分子以及具有T經U取代之指定序列之RNA分子。本發明之較佳DNA序列包括染色體組及 cDNA序列及化學合成之DNA序列。〇分別將編碼人類GE1、GE2、GE3、GE4及GE5之稱為人類cDNA的cDNA之核苷酸序列闡明SEQ ID NO:3、5、7、9 及11。本發明之聚核苷酸亦包括在嚴格條件下與具有闡明為SEQ ID ΝΟ··3、5、7、9及11之核苷酸序列或其互補序列及/或基本上由該等核苷酸序列或其互補序列組成的聚核苷酸雜交，及/或編碼分別保留GE1、GE2、GE3、GE4或 GE5之實質生物活性的多肽之聚核苷酸。本發明之聚核苷酸亦包括闡明為SEQ ID ΝΟ··3、5、7、9及11之核苷酸序列 135384.doc -49- 200934510 的包含至少12個連續核苷酸之連續部分。人類GE1、GE2、GE3、GE4、GE5及其模擬多肽之胺基酸序列分別以SEQ ID NO:4、6、8、10及12闡述。本發明之多肽亦包括胺基酸序列為闡明為以SEQ ID NO:4、6、 8、10及12之序列中之任一者的包含至少4個連續胺基酸之連續部分及/或基本上由該等連續部分組成之多肽。本發明之多肽亦包括闡明為SEQ ID NO:4、6、8、10及12之序列中之任一者’包括其連續部分，其中一或多個L-胺基酸〇經其對應D_胺基酸置換。本發明之多肽亦包括SEq ID N〇:4、6、8、10及12之活性片段，亦即保留全長人類 GE1、GE2、GE3、GE4或GE5之實質生物活性的闡明為 SEQ ID NO:4、6、8、10及12之序列中之任一者的任何連續部分，亦即為對GDF8具特異性之結合域及/或模擬劑肽可為GDF8活性之特異性拮抗劑的SEq ID SEQ ID NO:4、 6、8、10及12之任何片段。另外，本發明之多肽可使用熟知方法加以乙醯化及/或醯胺阻斷。除如上所述之彼等聚 © 核苷酸外，本發明之聚核苷酸亦包括編碼闡明為SEQ ID N〇:4、6、8、1〇及12之胺基酸序列中的任一者及其連續部分且僅歸因於遺傳密碼子之熟知簡幷性而不同於如上所述人類來源之聚核苷酸的聚核苷酸。本發明亦提供經純化且經分離之聚核苷酸，其編碼針對 GDF 8特異性抗原決定基之環化模擬肽，該等抗原決定基例如GE1、GE2、GE3、GE4及GE5。本發明之較佳⑽八序列包括染色體組及①^^八序列及化學合成DNA序列。熟習 135384,di •50· 200934510 此項技術者將認識到本發明亦包括其他環化分子，諸如基於其他GDF8特異性結合域之環化模擬肽。另外，本發明之環化模擬肽可使用熟知方法加以乙醯化及/或醯胺阻斷。對GDF8具特異性之抗體本揭示案提供與GDF8特異性相互作用之新穎抗體（例如抗體或抗原結合蛋白片段）。將該等抗體之非限制性說明性實施例稱為RK22。本發明之抗體具有獨特且有益之特 q 徵。首先，此等抗體能夠以高親和力結合成熟GDF8(實例 2)。其次，所揭示抗體與GDF8特異性相互作用，亦即本發明之抗體並不以高親和力結合TGF-β子族之其他成員，例如BMP11(實例2)。第三，如所證明，本發明之抗體活體外及活體内抑制GDF8活性（實例3)。第四，所揭示抗體可抑制與骨骼肌質量及骨骼密度之負調節相關之GDF8活性 (實例3)。在一實施例中，本發明所揭示抗體能夠與GDF8特異性〇相互作用；亦即預期該等抗體將不廣泛地與其他蛋白質反應，該等蛋白質例如彼等屬於TGF-β超家族者（諸如 BMP11)、活化素、苗勒抑制物質（mullerian-inhibiting substance)、神經膠質來源之神經營養因子或除GDF8以外的發育及分化因子。在本發明之一非限制性實施例中，本發明之特異性GDF8抗體或抗原結合蛋白以比其結合 BMP11大5-10倍之偏好性結合GDF8。在本發明之一非限制性實施例中，本發明之特異性抗GDF8抗體或抗原結合 135384.doc 51 200934510 蛋白以比其結合BMP 11大10-100倍之偏好性結合GDF8。在本發明之一非限制性實施例中，所關注之特異性抗 00?8抗體或抗原結合蛋白以比其結合81^^11大10-1000倍之偏好性結合GDF8。在另一實施例中，本發明之特異性抗GDF8抗體或抗原結合蛋白結合GDF8特異性抗原決定基，包括彼等本文中所揭示者（例如具有闡明為SEQ ID NO:4、6、8、10及12之胺基酸序列或其活性片段及/或基本上由該等胺基酸序列或其活性片段組成的GDF8特異性 φ 抗原決定基）。在本發明之一實施例中，所預期抗體與成熟GDF8之所預測ALK4/ALK5結合部位特異性相互作用，該結合部位例如具有闞明為SEQ ID NO:4、6或8的胺基酸序列之GDF8抗原決定基。一般技術者將認識到可使用本發明之抗體來偵測、量測及抑制來源於例如彼等描述於本說明書中之各種物種之 GDF8蛋白。藉由標準比對演算法測定一致性百分數，該等演算法諸如Altschul 等人（（1990) J· Mol. Biol. 215:403-〇 1 0)中所述之基本局部比對工具（Basic Local Alignment Tool，BLAST)、Needleman 等人（（1970) J. Mol. Biol. 48:444-53)之演算法或 Meyers 等人（（1988)Comput. Appl. Biosci. 4:11-17)之演算法。通常，本發明之抗體及抗體或抗原結合蛋白片段可用於保留實質GDF8生物活性且包含與如SEQ ID ΝΟ:1所闡明之成熟形式的GDF8之至少100、 80、60、40、20或15個連續胺基酸的任何序列至少約 70%、80%、90%、95%或95%以上一致之胺基酸序列之任 135384.doc -52- 200934510 何蛋白質。亦稱為免疫球蛋白之完整抗體通常為包含兩個各約25 kDa之輕（L)鏈及兩個各約50 kDa之重（H)鏈的四聚糖基化蛋白質。抗體中存在稱為λ及κ之兩種類型的輕鏈。取決於重鏈恆定域之胺基酸序列，免疫球蛋白指定為5個主要種類：A、D、E、G及Μ，且此等種類中之數種可再分成子類（同型），例如 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 及 IgA2。各輕鏈包含N末端可變（V)域（VL)及恆定（C)域（CL)。各重 0 鏈包含N末端V域（VH)、三或四個C域（CH)及鉸鏈區。最接近VH之CH域稱為CH1。VH及VL域由4個稱為框架區 (FR1、FR2、FR3及FR4)的相對保守序列之區域組成，該等框架區形成三個高變序列區（互補決定區，CDR)之支架。CDR含有負責抗體或抗原結合蛋白與抗原之特異性相互作用之大多數殘基。CDR稱為CDR1、CDR2及CDR3。因此，重鏈上之CDR組份稱為HI、H2及及H3，而輕鏈上之CDR組份稱為LI、L2及L3。CDR3為抗體或抗原結合蛋〇白結合部位中分子多樣性之最大來源。舉例而言，H3可短至兩個胺基酸殘基或大於26個胺基酸。在此項技術中熟知不同種類免疫球蛋白之亞單元結構及三維構型。對於抗髏結構之回顧，請參見 Antibodies: A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory，Harlow等人編，1988。熟習此項技術者將認識到各亞單元結構，例如CH、VH、 CL、VL、CDR及/或FR結構，構成活性片段。舉例而言，活性片段可由結合抗原之VH、VL或CDR亞單元部分，亦 135384.doc -53- 200934510 即抗原結合片段，或結合及/或活化Fc受體及/或補體之^^ 亞單元部分組成。本文中使用之術語”抗體或抗原結合蛋白片段"内包涵的結合片段之非限制性實例包括：（i)Fab片段，由VL、VH、 CL及CH1域組成的單價片段；（u)F(ab，）2片段包含兩個由雙硫橋在鉸鏈區鍵聯之Fab片段之二價片段；（in)由VH 及CH1域組成之pd片段；由抗體之單一臂的乂[及域浚成之Fv片段，（v)由乂^1域組成之dAb片段；及（vi)經分離 ❹ 之CDR此外，儘管Fv片段之兩個域vl及VH由獨立基因編碼，但其可藉由合成連接子重組接合，產生¥1^與¥11域配對形成單價分子之單一蛋白質鏈（稱為單鏈Fv( scFv))。最常用連接子為15個殘基之（Gly4Ser)3肽，但在此項技術中亦已知其他連接子。單鏈抗體亦意欲包涵在術語"抗體或抗原結合蛋白"或抗體之"抗原結合片段"内。該等抗體片段係使用熟習此項技術者已知之習知技術獲得且依完整抗體之相同方式篩選適用片段。藉由編碼可變 © 域之多個生殖系基因與多種體細胞處理過程產生抗體多樣性。體細胞處理過程包括重組可變基因片段與多樣性（D) 及接合（J)基因區段，以製備完整VH域，及重組可變基因片段及接合基因區段，以製備完整乂1域。重組方法本身不精確，導致胺基酸在V(D)J接合點丟失或添加。發展中之B細胞在接觸到抗原之前，即發生此等多樣性機制。經抗原性刺激後，B細胞中之所表現抗體基因經歷體細胞突變。依據生殖系基因區段之估算數目，此等區段之隨機重 135384.doc -54- 200934510 組及隨機VH-VL配對，可產生多違1.6x107種不同抗體 (Fundamental Immunology > 第三版（1993)，Paul編，Raven Press，New York，NY)。當考慮到促進抗體多樣性（諸如體細胞突變）之其他方法時，認為可產生超過lxl〇1G種不同抗體（Immunoglobulin Genes，第二版（1995)，Jonio 等人編， Academic Press, San Diego，CA)。由於產生抗體多樣性中涉及多種方法，因此獨立地獲得之具有相同抗原特異性之單株抗醴不可能具有一致胺基酸序列。 @ 因此，本發明提供與GDF8特異性相互作用之新穎抗體，亦即特異性GDF8抗體。本發明之抗體或抗原結合蛋白片段，例如含有CDR之結構，通常為抗體或抗原結合蛋白重鏈或輕鏈序列或其活性片段，其中CDR係安置於對應於天然存在之VH及VL的CDR之位置。可使用熟知編號法定義例如CDR的免疫球蛋白可變域之結構及位置，該等編號法例如Kabat編號法、Chothia編號法、Kabat與Chothia 之組合（AbM)等（參見例如 Sequences of Proteins of 〇 Immunological Interest，美國健康及公共事業部（U.S. Department of Health and Human Services)(1991)，Kabat等人編；Al-Lazikani等人（1997) J. Mol. Bio. 273: 927-948)。因此，本發明進一步提供新穎CDR。攜帶本發明CDR的結構通常為多肽，例如抗體或抗原結合蛋白重鏈或輕鏈序列或其實質部分，其中CDR位於對應於天然存在之VH及 VL域的CDR之位置。可如例如前述Kabat等人及前述A1-Lazikani等人中所述確定免疫球蛋白可變域之結構及位 135384.doc -55- 200934510 置。可藉由熟習此項技術者所熟知之方法製備能夠與本發明之多肽特異性相互作用之抗體或抗原結合蛋白分子。舉例而言，可藉由根據已知方法產生融合瘤來製備單株抗體。接著使用諸如酶聯免疫吸附檢定（ELISA)& Biacore分析之 4示準方法篩選以此方式形成之融合瘤，以鑑別一或多種可產生與GDF8特異性相互作用（例如結合GDF8)及/或拮抗（例如抑制、降低及/或中和）至少一種GDF8活性（例如GDF8與〇其受體之結合或其他下游GDF8信號傳輸過程）的抗體之融合瘤。可將重組GDF8、天然存在GDF8及GDF8之抗原性肽片段用作免疫原。抗原性肽片段包含至少6個毗連胺基酸且包涵抗原決定基以使得針對該抗原決定基產生之抗體與 GDF 8形成特異性免疫複合物。較佳地，抗原性肽包含至少4個胺基酸殘基。另外，較佳GDF8之抗原性肽片段包含 GDF8特異性抗原決定基（例如，具有闡明為SEq ID Ο ΝΟ:4、6、8、10、12的胺基酸序列或其活性片段及/或基本上由該等胺基酸序列或其活性片段組成之肽）。在本發明之一實施例中，可將全長GDF8多肽用作免疫原’或者可使用多肽之抗原性肽片段。舉例而言，免疫原可為GDF8特異性抗原決定基（例如GDF8特異性抗原決定基’及/或針對其之特異性抗GDF8抗體及/或模擬肽為 GDF8信號傳輸之特異性拮抗劑的抗原決定基（例如，SEQ ID NO :4、6、8、10、12之胺基酸序列中的一或多者及其 135384.doc • 56· 200934510 活性片段））及/或相關肽或環化肽。本發明之多肽的抗原性狀包含至少4個連續胺基酸殘基且包涵抗原決定基以使得針對該抗原決定基產生之抗體與多肽形成特異性免疫複合物。較佳地，抗原性肽包含至少4個胺基酸殘基，更佳至少6個胺基酸殘基且甚至更佳至少9個胺基酸殘基》作為製備單株抗體分泌融合瘤之替代，可藉由篩選具有本發明之多肽的重組組合免疫球蛋白文庫（例如抗體噬菌體呈現文庫）以藉此分離與該多肽結合的免疫球蛋白文庫〇成員來鑑別及分離針對本發明之多肽的單株抗體。熟習此項技術者熟知用於產生及篩選噬菌體呈現文庫之技術及市售套組。另外，尤其適用於產生及篩選抗體或抗原結合蛋白呈現文庫的方法及試劑之實例可見於文獻中。可藉由以例如具有本發明之特異性GDF8抗原決定基的 GDF8、其變體及/或其部分使適當受檢者免疫產生多株血清及抗體。可藉由標準技術（諸如以EUSA)，或藉由使用固定化GDF8或其他標記物蛋白（例如FLag)隨時間監測免 ® 疫受檢者之抗體力價。必要時，可自受檢者或培養基分離針對本發明之多肽的抗體分子且藉由諸如蛋白質A層析之熟知技術進一步純化以獲得IgG部分。另外，可使用標準重組DNA技術產生針對本發明之多狀的包含人類與非人類部分之嵌合、人化及單鏈抗體。亦可使用不能表現内源免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因，但可表現人類重鏈及輕鏈基因之轉殖基因小鼠來產生人化抗鱧。本發明之抗體或抗原結合蛋白分子（其包括片段）(例如與 135384.doc •57· 200934510 GDF8特異性相互作用之抗體或抗原結合蛋白分子）包括（但不限於）單株RK22抗體、其變體（例如人化變體）及其片段。本發明之與GDF8特異性相互作用的抗體或抗原結合蛋白分子亦可為特異性GDF8拮抗劑，且因此此等抗體或抗原結合蛋白分子可適用於預防或治療GDF8相關病症，例如骨骼、肌肉、脂肪及葡萄糖代謝相關病變。因此，本發明亦提供編碼特異性GDF8抗體之區域的經純化且經分離之聚核苷酸，其可拮抗至少一種〇DF8活 Q 性’例如RK22及其變體。本發明之較佳DNA序列包括染色體組、cDNA及化學合成之DNA序列。如以上所討論，編碼本發明之抗體或抗原結合蛋白之區域的聚核苷酸可包含DNA或RNA且可為完全或部分合成。除非上下文另外要求，否則對如本文中闡明之核苷酸序列的提及包涵具有指定序列或染色體組等效物（例如互補序列）之DNA分子以及具有T經U取代之指定序列之rna分子。本發明之核苷酸序列包括彼等編碼鼠類RK22之輕鏈可 G 變域者’例如如SEQ ID NO:15所闡明之核苷酸序列。本發明之核苷酸序列亦包括彼等編碼鼠類RK22之重鏈可變域者，例如如SEQ ID NO:13所闡明之核苷酸序列。本發明之聚核苷酸亦包括在嚴格條件下與具有實質上闞明為沾〇 ID NO:13及15之核酸序列及其互補序列及/或基本上由該等核酸序列及其互補序列組成的聚核苷酸雜交及/或編碼保留 RK22之可變域的實質生物活性之多肽（亦即活性片段）之聚核苷酸。本發明之聚核苷酸亦包括闌明為SEQ ID N〇:13& 135384.doc -58· 200934510 15之序列的包含至少15個連續核苷酸之連續部分。鼠類RK22之輕鏈可變域之胺基酸序列經闡明為SEQ ID NO:16。鼠類RK22之重鏈可變域之胺基酸序列經闡明為 SEQ ID NO:14。人化可變重鏈及輕鏈域之胺基酸序列分別闌明於SEQ ID NO:17及18中。鼠類RK22之重鏈中含有的 CDR之胺基酸序列經闞明為SEQ ID NO:19-21及25-27。鼠類RK22之輕鏈中含有的CDR之胺基酸序列經闡明為SEQ ID NO:22-24及28-30。本發明之多狀亦包括實質上闡明為 ❹ SEQ ID NO:14、16、17、18及19-20之序列中的任一者之包含至少5個連續胺基酸之連續部分。本發明之較佳多狀包括如SEQ ID NO: 14、16、17、18及19-30之活性片段，亦即闡明為SEQ ID NO:14、16、17、18及19-30的任何序列之保留本發明之抗體或抗原結合蛋白之實質生物活性的任何連續部分。除彼等如上所述之聚核苷酸外，本發明亦包括編碼實質上闡明為SEQ ID NO: 14、16、17、18及19-20之胺基酸序列或其連續部分，且僅歸因於遺傳密碼子之 ® 熟知簡幷性而不同於如上所述之抗體或抗原結合蛋白聚核苷酸之聚核苷酸。如上所述’ CDR含有大多數負責與抗原特異性相互作用之殘基’且分別含於VH及VL域’亦即重鏈可變域及輕鍵可變域内。因此，假如抗體包含本發明之抗體或抗原結合蛋白的至少一個CDR，例如包含選自闡明為SEQ 1〇 NO :19-30的胺基酸序列之胺基酸序列之cdr，或其活性抗體或抗原結合蛋白片段，則其為本發明之抗體，亦即與 1353S4.doc -59· 200934510 GDF8特異性相互作用（例如與GDF8結合）及/或特異性拮抗 GDF8活性者。因此，本發明之一實施例包括含有一或多個包含選自闡明為SEQ ID NO: 19-30之胺基酸序列的胺基酸序列或其活性片段之胺基酸序列的CDR之抗體。因此，熟習此項技術者將認識到本發明之抗體包括抗體或抗原結合蛋白，其中VL鏈之CDR為一或多個彼等闡明為SEQ ID NO:22-24及28-30之CDR，及/或VH鏈之CDR為一或多個彼等闞明為 SEQ ID NO:19-21 及 25-27之 CDR。 U 抗原結合片段可為由VH及VL域組成之Fv片段。因此， RK22之Fv片段可構成本發明之抗體，其限制條件為該片段與GDF8特異性相互作用。熟習此項技術者將認識到任何含有RK22之Fv片段之抗體或抗原結合蛋白片段亦可為本發明之抗體。另外’含有一或多個具有選自由闡明為 SEQ ID ΝΟ:19-30的胺基酸序列組成之群的胺基酸序列之 CDR之任何Fv片段、scFv片段、Fab片段或F(ab·)2片段亦可為本發明之抗體或抗原結合蛋白。

〇本發明之某些實施例包含RK22之Fv片段的VH及/或VL 域。可藉由根據在此項技術中熟知之方法裂解例如RK22 之抗體產生本發明之抗體之片段，例如Fab、F(ab')2、Fd 及dAb片段。舉例而言，可藉由分別以例如木瓜蛋白酶及胃蛋白酶之酶處理抗體產生免疫活性Fab及F(ab')2片段。

其他實施例包含本文中所揭示抗體之任何VH域（例如’ RK22之VH域（闞明為SEQ ID NO:14及17))及本文中所揭示抗艎之任何VL域（例如，RK22之VL域（闡明為SEQ ID 135384.doc 200934510 NO: 16及18))的一或多個CDR(例如一或多個闡明為SEQ ID 1^0:19-21及25-27之€01〇。一實施例包含11〖22之乂11域的 H3片段（闡明為SEQ ID N0:21)。為方便起見，將VH及VL域中各CDR之近似位置列於表2 中〇表2 RK22小鼠及人化抗體之可變域内根據Kabat(非斜體）或 AbM(斜體）定義之近似CDR位置 CDR RK22 RK22 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 17 H1 50-54 或 45-54 26-35 H2 69-85 或砂-77 50-66 H3 116-128 或似 99-109 RK22 RK22 SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 18 L1 44-60 或#-仞 24-40 L2 76-82 或 76-S2 56-62 L3 115-123 或/Λ5-7Μ 95-101 〇 ❹ 本發明揭示之抗體可進一步包含抗體或抗原結合蛋白恆定域或其部分。舉例而言，本發明之VL域可在其C末端連接於抗體或抗原結合蛋白輕鏈恆定域，例如人類Ck或(：λ 鏈，較佳（：λ鏈。類似地，可將基於VH域之特異性抗原結合片段在其C末端連接於來源於例如IgG、IgA、IgE及IgM 之任何抗體同型及任一同型子類（尤其IgGl及IgG4)的免疫球蛋白重鏈之所有或部分。在例示性實施例中，抗體包含 135384.doc -61- 200934510 人類IgGU之重鏈及輕鏈的C末端片段。應瞭解歸因於遠傳密碼子之簡幷性，序列之簡短描述1中所列的DNA序列僅表示編碼所關注之胺基酸序列、肽及抗體之核酸且不應理解為具有限制性。本發明之某些實施例包含RK22之Fv片段的VH及/或VL 域。其他實施例包含任何該等VH及VL域之一或多個互補決定區（CDRs)。一實施例包含RK22之VH域之H3片段。在某些實施例中，本發明之VH及VL域經生殖系化，亦即使 φ 用習知分子生物學技術改變此等域之框架區（FR)以匹配人類生殖系基因產物之一致胺基酸序列。其亦稱為人化或生殖系化抗體。在其他實施例中，框架序列保持與生殖系相異。可使用不能表現内源免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因，但能夠表現人類重鏈及輕鏈基因之轉殖基因小鼠產生人化抗體。本發明之另一態樣提供獲得對GDF8具特異性之抗體抗原結合域之方法。熟習此項技術者應瞭解本發明之抗體不 ® 限於如表2中所述之VH及VL域的特定序列，而亦包括保留抗原結合能力的此等序列之變體。該等變體可使用在此項技術中已知之技術獲自所提供序列。可在1?11或(：]：)11中進行胺基酸取代、缺失或添加。儘管框架區之變化通常經設計以提高抗體之穩定性且降低免疫原性，但CDR之變化通常經設計以增加抗體對其標靶之親和力。通常藉由改變cdr 且測試抗體，憑經驗確定該等親和力增加變化。可根據例如 Antibody Engineering，第二版，B〇rrebaeck編，〇xf〇rd 135384.doc -62- 200934510

University Press，1995所述之方法進行該等改變。因此，本發明之抗體或抗原結合蛋白（或其片段）亦包括彼等與GDF8特異性相互作用且在重鏈及輕鏈之恆定域中具有突變者。有時需要使恆定域之某些片段突變且失活。舉例而言，有時需要重恆定域之突變作用來產生具有降低之與Fc受體（FcR)及/或補體結合的抗體；該等突變作用為在此項技術中所熟知。熟習此項技術者亦將認識到必需CL 及CH亞單元之哪一個活性片段之確定將視應用於哪一個 q 本發明之抗體的應用而定。舉例而言，彼此共價相連所涉及的CL及CH亞單元之活性片段在完整抗體之產生中將為重要的。製備為本文中闡明之VH域的胺基酸序列變體之VH域之方法包含以下步驟：在本發明所揭示的VH域之胺基酸序列中添加、缺失、取代或插入一或多個胺基酸，視情況組合因此提供之VH域與一或多個VL域，及測試VH域或一或多個VH/VL組合與GDF8之特異性相互作用，及（較佳地）測〇試該等抗原結合域調節一或多種GDF8相關活性之能力。 VL域可具有實質上如本文中所闡明之胺基酸序列。可使用將本文中所揭示之VL域的一或多個序列變體與一或多個VH域組合之類似方法。本發明之另一態樣提供製備與GDF8特異性相互作用的抗原結合片段之方法。該方法包含：提供編碼包括待置換之CDR(例如CDR3)之VH域，或缺乏CDR(例如CDR3)編碼區之VH域的核酸之起始庫；組合該庫與編碼本發明之供 135384.doc -63- 200934510 體CDR的供體核酸（例如，編碼包含SEQ ID NO:14、16、 17、1 8之活性片段的CDR之供體核酸）以使得供體核酸被插入庫中之CDR(例如CDR3)區中，以便提供編碼VH域的核酸之產物庫；表現產物庫之核酸；選擇對GDF8具特異性之抗原結合片段；及回收該特異性抗原結合片段或編碼其之核酸。又，可採用將本發明之VL CDR(例如L3)與編碼包括待置換之CDR或缺乏CDR編碼區的VL域之核酸之庫組合的類似方法。 @ 可使用重組DNA技術將本發明之CDR(例如CDR3)之編碼序列引入缺乏CDR(例如CD R3)的可變域之庫中。舉例而言，Marks等人（（1992)Bio/Technology 10:779-83)描述產生抗鱧或抗原結合蛋白可變域的庫之方法，其中聯合人類 VH基因之第三框架區的一致引子使用定位於或鄰近於可變域域之5'末端的一致引子以提供缺乏CDR3的VH可變域之庫。可組合該庫與特定抗體之CDR3。使用類似技術，可以缺乏CDR3之VH或VL域的庫改組本發明之來源於〇 CDR3的序列，且組合該經改組之完整VH或VL域與同源 VL或VH域以提供本發明之特異性抗原結合片段。可隨後將該庫呈現於諸如WO 92/01047的噬菌體呈現系統之適當宿主系統中，以便可選擇適當抗原結合片段。

Stemmer((1994) Nature 370:389-91)亦揭示類似改組或組合技術，其描述關於β-内醯胺酶基因之技術，但觀測到可使用該方法產生抗體。另一替代形式係使用一或多個所選 VH及/或VL基因的隨機突變誘發在整個可變域内產生突 135384.doc • 64 - 200934510 變，產生攜帶本發明之來源於CDR的序列之新顆VH或VL 域。藉由使用易錯PCR ’該技術經描述於Gram等人 ((1992)Proe. Natl. Acad· Sci. U.S.A. 89:3576-80)中。另一可用以產生新穎抗體或其片段之方法為對VH或VL基因之 CDR的定向突變誘發。該等技術係揭示於Barbas等人 ((1994) Proc. Natl. Acad· Sci. U.S.A. 91:3809-13)及 Schier 等人（（1996) J. Mol. Biol. 263:551-67)中。類似地，可將一個、兩個或所有三個CDR接枝於VH或 ❹ VL域之庫中，接著篩選其對GDF8具特異性之特異性結合搭配物或結合片段。免疫球蛋白可變域之實質部分將至少包含CDR及視情況其來自如本文中所闌明之抗體片段的插入框架區。該部分亦將包括至少約50%之FR1及FR4中之任一者或兩者，50%為FR1之C末端50%及FR4之N末端50〇/〇。可變域之實質部分的N末端或C末端之其他殘基可為彼等通常與天然存在可變域不相關者。舉例而言，藉由重組 DNA技術進行的本發明之特異性抗體或抗原結合蛋白片段 G 之構築可使得引入由所引入連接子編碼之N或C末端殘基以利於選殖或其他操縱步驟《如下文更詳細論述，其他操縱步驟包括引入連接子以使本發明之可變域與包括免疫球蛋白重鏈、其他可變域（例如，在產生雙功能抗體中）或蛋白質標記之其他蛋白質序列接合。儘管實例中所說明之實施例包含VH與VL域之"匹配” 對’但本發明亦包涵含有來源於VH或VL域序列，尤其VH 域的單一可變域之結合片段，例如dAb片段。在單鏈特異 135384.doc -65- 200934510 性結合域之任一者的情況下，可使用此等域來篩選能夠形成能夠結合GDF8的雙域特異性抗原結合域之互補域。此可藉由嗟菌體呈現篩選法使用如（例如）W〇 92/01047中所揭示之所謂分層雙重組合方法實現。在此技術中，使用含有Η鏈或L鏈純系之個別群落感染編碼另一鏈仏或印的純系之完整文庫，且根據諸如彼等描述於彼參考文獻中之噬菌體呈現技術選擇所得雙鏈特異性抗原結合域。此技術亦揭示於前述Marks等人中。 © 抗體可藉由化學方法與放射性核、藥物、大分子或其他藥剤共軛，且可製成包含本發明之一或多個CDR的融合蛋抗體或抗原結合蛋白融合蛋白含有VHVL對其中此等鏈中之一者（通常為VH)及另一蛋白質經合成為單一多肽鍵。此等類型之產物不同於抗體之處在於其通常具有另一功能要素（例如，小分子之活性部分或共扼或融合大分子之主要分子結構特徵）。 ❹ 上概述之胺基酸序狀變化外，抗體亦可經糖基化聚乙一醇化或與白蛋白或非蛋白質性聚合物連接。舉例而言，可將本發明所揭示之抗體與例如聚乙二醇、聚丙 -醇或聚環氧烧之多種非蛋白質性聚合物中之—者連接。抗體可藉由與聚合物共價共輛經化學修飾，例如以増加其 1環半錢。在此項技術中已知例*性聚合物及將其與肽連接之方法。在其他實施例中’抗體或抗原結合蛋白可經修飾以具有 135384.doc -66 - 200934510 經改變之糖基化模式（亦即相對於原始或原生糖基化模式）。如本文中所用，"經改變”意謂一或多個碳水化合物部分缺失及/或一或多個糖基化部位經添加至原始抗體。藉由改變胺基酸序列以含有糖基化部位一致序列之熟知方法實現將糖基化部位添加至本發明所揭示之抗體。增加抗體上之碳水化合物部分的數目之另一方式係藉由使糖苷與抗體之胺基酸殘基化學偶合或酶促偶合。可如在此項技術中已知以化學或酶促方式實現抗體上所存在之任何碳水化合物部分的移除。本發明之抗體亦可經諸如1311或99Tc之可使用在此項技術令已知之習知化學連接至本發明之抗體的可偵測或功能性標記加以標記。標記亦包括酶標記，諸如辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酶《標記進一步包括諸如生物素之化學部分，其可經由與例如經標記抗生物素蛋白之特異性同源可偵測部分結合加以偵測。本發明之範疇内包涵CDR序列僅非實質上不同於本文中所揭示之抗體的CDR序列的抗體。非實質差異包括微小胺基酸改變’例如取代CDR序列之任5個胺基酸中的一或兩個。通常，胺基酸經具有類似電荷、疏水性或立體化學特徵之相關胺基酸取代。該等取代將在熟習此項技術者之常規技能内。結構框架區（FR)可在無不利地影響抗體之結合特性的情況下比CDR更實質地加以修飾。對|?尺之改變包括 (但不限於）人化非人類來源之框架或工程化對抗原接觸或穩疋結合部位重要之某些框架殘基，例如改變怪定域之種 135384.doc -67- 200934510 類或子類’改變可能改變諸如Fc受體結合的效應功能之特定胺基酸殘基（例如Lund等人（1991) J. Immunoh 147:2657_ 62 ; Morgan 等人（1995) Immunology 86:319-24)，或改變恆定域所來源之物種，抗體在重鏈之CH2域中可具有降低或改變效應功能（例如Fc受體結合及補體活化）之突變。舉例而s，抗體可具有諸如彼等描述於美國專利第5,624,821號及第5,648,260號中之突變。如（例如）Angai等人〇993) M〇l

Immunol. 30:105-08所揭示，抗體亦可具有使免疫球蛋白〇之兩個重鏈之間的二硫鍵穩定之突變，諸如IgG4之鉸鏈區中的突變。本發明之多肽及抗體亦包涵在結構上不同於所揭示多肽及抗體之蛋白質，例如其具有經改變之序列，但生物化學特性實質上與所揭示多肽及抗體相同，例如僅具有功能上非必需氨基酸之改變。該等分子包括含有改變、取代、替換、插入或缺失之天然存在對偶基因變體及刻意工程化變冑。用於該等改變、取代、替換、插入或缺失之技術為熟 © 習此項技術者所熟知。可另外使用經修飾以便回應於抗原激發產生全人類抗體而非動物内源抗體之轉殖基因非人類動物產生本發明之抗體。參見例如PCT公開案W0 94/G2繼。編碼非人類宿主之免疫球蛋白重鏈及輕鏈的内源性基因已經無能化且編碼人類重鍵及輕鍵免疫球蛋白之活性基因座經插入宿主之基因組中。舉例而言，使用 '含有必要人類DNA區段之酵母人染色體併人人類基因。接著藉由雜交含有少於該等修飾 I35384.doc -68- 200934510 之完全互補序列的中間轉殖基因動物，獲得提供所有所需修飾之動物作為子代。如PCT公開案WO 96/33735及WO 96/34096所揭示，該非人類動物之一實施例為小鼠且稱為 XENOMOUSE™。此動物產生分泌全人類免疫球蛋白之B 細胞。可在以所關注免疫原免疫後，以例如多株抗體之製劑形式直接自動物獲得該等抗逋，或者自來源於動物之永生化B細胞（諸如產生單株抗體之融合瘤）獲得該等抗體。另外，可回收編碼具有人類可變域的免疫球蛋白之基因且 U 經表現以直接獲得抗體，或其可經進一步修飾以獲得抗體之類似物，諸如單鏈Fv分子。因此，如本文中所用，術語抗體或抗原結合蛋白包括完整抗體、抗體之片段，例如Fab、F(ab’)2Fd、dAb及scFv片段，及已在恆定及/或可變域中突變（例如，產生嵌合、部分人化或完全人化抗體以及產生具有所需特性（例如GDF8 結合增強及/或FcR結合降低）的抗體之突變）之完整抗體及片段。因而，此等抗體或抗原結合蛋白包括於本發明之範 Q 疇中’其限制條件為抗體或抗原結合蛋白與GDF8特異性相互作用。亦可採用其他蛋白質結合分子來調節GDF8之活性。該等抗原結合分子包括小模數免疫醫藥（SMIPTM)藥物 (Trubion Pharmaceuticals, Seattle，WA)。SMIP為包含諸如抗原、反受體或其類似物的同源結構之結合域、具有一個或無半胱胺酸殘基之鉸鏈區多肽及免疫球蛋白CH2及CH3 域之單鏈多肽。SMIP及其用途及應用經揭示於例如美國 135384.doc -69- 200934510 公開專利申請案第2003/01 18592號、第2003/0133939號、第 2004/0058445號、第 2005/0136049號、第 2005/0175614 號、第 2005/0180970號、第 2005/0186216號、第 2005/0202012 號、第 2005/0202023號、第 2005/0202028號、第 2005/0202534 號及第2005/0238646號及其相關專利族成員中，據此將所有該等專利以引用的方式全部併入本文中。可藉由以下方法量測本發明之抗體或抗原結合蛋白的結合能力：如以下實例申所述之Biacore分析、酶聯免疫吸附 0 檢定（ELISA)、X-射線結晶學、序列分析及掃描突變誘發及在此項技術中熟知之其他方法。可藉由以下方法之非限制性清單量測本發明之抗體或抗原結合蛋白抑制、降低及/ 或中和一或多種GDF8相關活性之能力：量測GDF8依賴型細胞株增生之檢定；量測GDF 8介導之多肽之表現的檢定；量測下游信號傳輸分子之活性的檢定；測試本發明之抗體或抗原結合蛋白預防有關動物模型之肌肉病症之功效的檢定；如以下實例中所述之檢定；及在此項技術中熟知 ❹ 之其他檢定。本發明之另一態樣提供選擇能夠與GDF8特異性相互作用及/或特異性拮抗一或多種GDF8活性的抗體之方法。該方法包含：使複數種抗體與GDF8接觸；選擇與GDF8結合之第二複數種抗體；測試第二複數種抗體結合TGF-β超家族之其他成員的能力；及自第二複數種抗體選擇第三複數種抗體，其中該第三複數種抗體以較小親和力與TGF-β超家族之其他成員結合。 135384.doc -70- 200934510 在另一實施例中，該方法進一步包含以下步驟：測試第三複數種抗體拮抗至少一種GDF8活性（例如防止GDF8與 GDF8受體結合）之能力；及選擇能夠拮抗一或多種GDF8活性（例如防止GDF8與其受體結合）的抗體。本發明之抗GDF8抗體亦適用於分離、純化及/或偵測上清液、細胞溶解產物或細胞表面上之GDF8。可使用本發明所揭示之抗體診斷監測GDF8蛋白含量作為臨床測試程序之部分。另外，本發明之抗體可用於要求中和及/或抑 Q 制一或多種GDF8相關病症之治療，例如對肌肉相關病變之治療。本發明亦提供與針對人類GDF8之新穎抗體相關的新穎經分離且經純化之聚核苷酸及多肽。本發明之基因、聚核苷酸、蛋白質及多肽包括（但不限於）鼠類及人化抗GDF8抗體，例如RK22，及其變體。拮抗劑重組聚核苷酸及多肽如上所述，本發明進一步提供作為特異性GDF8拮抗劑之經分離且經純化之編碼GDF8特異性抗原決定基的核〇酸，或其肽模擬劑或抗體。根據本發明之核酸可包含DNA 或RNA且可為完全或部分合成。除非上下文另外要求，否則對如本文中闡明之核苷酸序列的提及包涵具有指定序列或染色體組等效物之DNA分子以及具有T經U取代之指定序列之RNA分子。本發明之經分離聚核苷酸，例如SEQ ID NO:3、5、7、 9、11、13及15，可用作鑑別及分離具有與彼等編碼所揭示聚核苷酸者相同或類似的序列之核酸的雜交探針及引 135384.doc •71- 200934510 子。作為一非限制性實例，可使用以此方式使用抗體或抗原結合蛋白聚核苷酸分離之聚核苷酸，例如以產生針對 GDF8之特異性抗體或鑑別表現該等抗體之細胞。用於鑑別及分離核酸之雜交方法包括聚合酶鏈反應（PCR)、南方雜交（Southern hybridization)、原位雜交及北方雜交 (Northern hybridization)，且為熟習此項技術者所熟知。雜交反應可在不同嚴格條件下進行。雜交反應之嚴格性包括任何兩個核酸分子彼此雜交之難度。較佳地，各雜交聚核苷酸在低嚴格條件下，更佳在嚴格條件下，且最佳在高嚴格條件下與其對應聚核苷酸雜交。嚴格性條件之實例係展示於下表3中：高嚴格條件為至少如（例如）條件A-F般嚴格之條件；嚴格條件為至少如（例如）條件G-L般嚴格；且低嚴格條件為至少如（例如）條件M-R般嚴格。表3

條件雜交雜交物長度(bp)l 雜交溫度及緩衝液2 洗滌溫度及緩衝液2 A DNA:DNA >50 65°C; lxSSC或 42°C; lxSSC，50% 曱醢胺 65〇C；〇.3xSSC B DNA:DNA <50 TB*; lxSSC TB*; lxSSC C DNA:RNA >50 67°C; lxSSC 或 45〇C； lxSSC, 50% 甲醯胺 67〇C；〇.3xSSC D DNA:RNA <50 TD*; lxSSC TD*; lxSSC 135384.doc •72- 200934510

E RNArRNA >50 70°C; lxSSC或 50°C； lxSSC, 50% 甲醢胺 70〇C；0.3xSSC F RNA:RNA <50 TF*; lxSSC TF*;lxSSC G DNA:DNA >50 65°C;4xSSC 或 42〇C；4xSSC, 50% 甲醯胺 65〇C； lxSSC Η DNA:DNA <50 ΤΗ*; 4xSSC TH*; 4xSSC I DNA-.RNA >50 67°C;4xSSC 或 45〇C； 4xSSC, 50% 甲醯胺 67〇C; lxSSC J DNA:RNA <50 TJ*; 4xSSC TJ*; 4xSSC Κ RNA:RNA >50 70°C;4xSSC 或 50°C; 4xSSC, 50% 曱酿胺 67〇C; lxSSC L RNA:RNA <50 TL*; 2xSSC TL*; 2xSSC Μ DNA:DNA >50 50°C;4xSSC 或 40〇C；6XSSC, 50% 甲醯胺 50〇C；2xSSC Ν DNA:DNA <50 TN*; 6X SSC TN*; 6X SSC Ο DNA:RNA >50 55°C;4xSSC 或 42〇C；6XSSC, 50% 甲醯胺 55〇C；2xSSC Ρ DNA:RNA <50 TP*; 6X SSC TP*; 6X SSC Q RNA:RNA >50 60°C;4xSSC 或 45〇C； 6X SSC, 50% 甲醯胺 60〇C;2xSSC R RNA-.RNA <50 TR*; 4xSSC TR*;4xSSC 1.雜交物長度為雜交聚核苷酸之雜交區域的預期長度。當使聚核苷酸與未知序列之標靶聚核苷酸雜交時，雜交物長度假定為雜交聚核苷酸之長度。當使已知序列之聚核苷 135384.doc -73· 200934510 酸雜交時，可藉由比對聚核苷酸之序列且鑑別具有最佳序列互補性之一或多個區域來測定雜交物長度。 2.在雜交及洗滌緩衝液中可用SSPE(lxSSPE為0.15 Μ NaCl、10mMNaH2PO4及l.25mMEDTA，pH7.4)替換 SSC(lxSSC為0.15 M NaCl及15 mM檸檬酸鈉）；雜交完成後進行洗滌15分鐘。 TB*-TR* :預期長度小於5〇個驗基對之雜交物的雜交溫度應比雜交物之熔融溫度（Tm)低5-10°c ’其中根據以下等 0 式確定Tm。對於長度小於18個鹼基對之雜交物’ Tm(°C) = 2(A+T鹼基之數目）+4(G+C鹼基之數目）。對於長度介於18 與49個鹼基對之間的雜交物，Tm(°C)=81.5 + 16.6(loglONa+)+ 0.41(%G+C)-(600/N)，其中N為雜交物中鹼基之數目且Na+ 為雜交緩衝液中鈉離子之濃度（對於1 x SSC，Na+=0.165 Μ)。聚核苷酸雜交之嚴格條件之其他實例提供於Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第 9章及第〇 11章，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，NY (1989)及Ausubel等人編，Current Protocols in Molecular Biology，第 2.10 節及第 6.3-6.4 節，John Wiley & Sons, Inc. (1995)中，該等文獻係以引用的方式併入本文中〇本發明之經分離聚核苷酸可用作供鑑別及分離具有編碼所揭示聚核苷酸之對偶基因變體的序列之DNA之雜交探針及引子。對偶基因變體為編碼與由所揭示聚核苷酸編碼之 135384.doc -74· 200934510 多肽相同或與該等多肽具有顯著相似性的多肽之所揭示聚核苷酸之天然存在替代形式。較佳地，對偶基因變異體與所揭示聚核苷酸具有至少90%序列一致性（更佳至少95°/〇 — 致性；最佳至少99%—致性）。本發明之經分離聚核苷酸亦可用作供鑑別及分離具有編碼與所揭示聚核苷酸同源之多肽的序列之DNA之雜交探針及引子。此等同源物為自不同於所揭示多肽及聚核苷酸的物種分離之聚核苷酸及多肽，或在相同物種内，但與所揭〇示聚核苷酸及多肽具有顯著序列相似性的聚核苷酸及多肽。較佳地’聚核苷酸同源物與所揭示聚核苷酸具有至少 50%序列一致性（更佳至少75% —致性；最佳至少90% —致性）’而多肽同源物與所揭示抗體/多肽具有至少3〇%序列一致性（更佳至少45% —致性；最佳至少60% 一致性）。較佳地，所揭示聚核苷酸及多肽之同源物為彼等自哺乳動物物種分離者。本發明之經分離聚核苷酸亦可用作供鑑別表現GDF8特 G 異性抗原決定基或本發明抗體之細胞及組織及其表現條件的雜交探針及引子。另外，可使用本發明之經分離聚核苷酸來改變（亦即增強、降低或修飾）對應於本發明之聚核苷酸的基因在細胞或有機體中之表現。此等"對應基因"為本發明之經轉錄以產生本發明之聚核苷酸所來源的mRNA的染色體組DNA序列。可經由使用各種抑制性聚核苷酸實現本發明相關之序列 135384.doc •75- 200934510 在細胞或有機體中之經改變的表現，該等抑制性聚核苷酸諸如反義聚核苷酸、結合及/或裂解自本發明之基因轉錄的mRNA之核糖核酸酶、靶向基因之調節區的三鏈體形成募核苷酸及引起標靶mRNA之序列特異性降解的短干擾 RNA(例如 Galderisi 等人（1999) J. Cell. Physiol· 181:251-57 *» Sioud (2001) Curr. Mol. Med. 1:575-88 ; Knauert及 Glazer (2001) Hum. Mol. Genet. 10:2243-51 ； Bass (2001) Nature 411:428-29)。認為該等抑制性聚核苷酸為本發明之 @ 拮抗劑。熟習此項技術者將認識到本發明之抑制性聚核苷酸應針對如以上所提供之GDF8特異性抗原決定基（且非本發明之拮抗劑抗體）》本發明包涵之抑制性三鏈體形成募核苷酸（TFO)以高特異性及親和力結合於雙鏈體DNA的大溝中（前述Knauert及 Glazer)。可藉由乾向與基因之調節區（亦即啟動子及/或強化子序列）互補的TFO以形成防止基因轉錄的三鏈螺旋結構來抑制本發明之基因的表現。〇在本發明之一實施例中，本發明之抑制性聚核苷酸為短干擾RNA(siRNA)分子（參見例如Galderisi等人（1999) J. Cell Physiol. 181:251-57 ； Sioud (2001) Curr. Mol. Med. 1:575-88)。此等siRNA分子為引起所靶向mRNA之序列特異性降解的短雙鏈體RNA分子。此降解稱為RNA干擾 (RNAi)(例如 Bass (2001) Nature 411:428-29)。已將最初在低級有機體中鑑別出之RNAi有效地應用於哺乳動物細胞且近來已展示在經把向Fas mRNA之siRNA分子處理的小鼠 135384.doc -76- 200934510 中預防暴發型肝炎（Song等人（2003) Nature Med. 9:347- 51)。另外，鞘内傳遞之siRNA近來已報導在兩種大鼠模型 (促效劑誘發之疼痛模型及神經性疼痛模型）中阻斷疼痛反應（Dorn等人（2004) Nucleic Acids Res. 32(5):e49)。本發明之siRNA分子之雙鏈體結構可包含一或多股聚合 RNA，亦即該雙鏈體結構可藉由包含髮夾環或兩個互補股之單一自身互補RNA股形成。亦已發現相對於靶向序列具有插入、缺失及單一點突變之siRNA序列有效抑制所乾向〇序列之表現（Fire等人，美國專利第6,506,559號）。因此，本發明之siRNA分子較佳包含與對應於本發明之所把向 GDF8特異性抗原決定基的!nRNA之至少一部分具有實質序列一致性之核苷酸序列。舉例而言，本發明之siRNA分子的雙鏈體區域可與對應於所靶向GDF8特異性抗原決定基之mRNA的至少部分具有大於90%之序列一致性且較佳 100%序列一致性。或者，實質序列一致性可經定義為 siRNA分子之雙鏈艎區域的至少一個股在至少（例如）如上 © 表3中條件G-L所定義之嚴格條件下與所乾向GDF8特異性抗原決定基之至少一部分雜交的能力。在本發明之一較佳、但非限制性實施例中，siRNA分子在（例如）彼等至少如（例如）上表3中條件A-F般嚴格之高嚴格條件下與所乾向 GDF8特異性抗原決定基之至少一部分雜交。實質—致核發酸序列之長度可為至少10、15、19、21、23、25、50、 100、200、300、400或500個核苷酸，較佳為19·27個核苷酸且最佳為19或21個核苷酸（參見前述Fire等人）。 135384.doc •77· 200934510 可基於在此項技術中熟知之標準（例如，Elbashir等人 (2001) EMBO J. 20:6877-88)及/或藉由使用熟知演算法（例如，公開可獲得之演算法）設計本發明之抑制性聚核苷酸。舉例而言，本發明之抑制性聚核苷酸的靶向部分（例如siRNA分子之雙鏈體區域）較佳應以AA(最佳）、TA、GA 或CA開始；本發明2siRNA分子較佳應包含GC比率為45-55%之序列；本發明之siRNA分子較佳在一列中應不含三 Ο 個相同核苷酸；且本發明之siRNA分子較佳在一列中應不含7個混合G/C。基於此等標準或其他已知標準（例如

Reynolds 等人（2004) Nat. Biotechnol. 22:326-30)’ 一般技術者可設計本發明之靶向GDF8特異性抗原決定基的siRNA 分子。舉例而言，在一實施例中，本發明之SiRNA分子可具有選自由以下核誓酸序列組成之群的核苷酸序列及/或基本上由該核普酸序列組成：SEQlDN〇:3…酸序列、SEQ ID ㈣酸序列、咖1〇 N〇:7之核芽酸姑it始庠列、SEQ ID NO:U之核苦序列、SEQ ID N0:9之核4酸序中，本發明之siRNA分子進酸序列及其片段。在此實施例 τη 一步包含SEQ ID N0:5之核苷酸序列的妥補序列' 列的互補序列、SEQ ID N0:9之

Ν0:3之㈣酸序列的互補序列、SEQID sEq ID NO:7之核苷酸序酸序列的互補序列、 SEQ ID ΝΟ:11之核苷酸序列的多袖 §·序列及其片段之互補序 #股RNA分子黏接到一起向後摺疊以產生必要雙股列。舉例而言，可藉由使兩條立補 (前述Fire等人）或經由使用本身 • 78 _ 135384.doc 200934510 部分的單一髮夾RNA分子（Yu等人（2002) Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 99:6047-52)產生本發明之siRNA分子》siRNA分子可化學合成（Elbashir 等人（2001) Nature 411:494-98)或藉由活體外轉錄使用單股DNA模板（前述Yu等人）產生。或者’可使用以下所述包含與本發明相關之相對於啟動子以有義及/或反義取向的聚核苷酸之表現載體，以生物學方式瞬時（前述 Yu等人；Sui 等人（2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5515-20)或穩定（Paddison 等人（2002) Proc_ Natl. ◎ Acad· Sci· USA 99:1443-48)產生siRNA分子。可使用重組 RNA聚合酶供活體内或活體外轉錄，或經修飾細胞之内源 RNA聚合酶可介導活體内轉錄。近來，使用表現經進一步加工為siRNA分子的髮夾RNA之腺病毒載體證明原代人類細胞中標靶mRNA之含量以有效且序列特異性方式降低 (Arts等人（2003)Genome Res· 13:2325-32)。可使用包括在此項技術中熟知之程序的化學合成及酶促連接反應構築本發明之抑制性聚核苷酸。可修飾化學合成〇之聚核苷酸的核苷鍵聯以增強其抵抗核酸酶介導之降解、避免某些有機體中藉由雙鏈體RN A產生之普遍恐慌反應及/ 或增強其序列特異性之能力。該等鍵聯修飾包括（但不限於）硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、磷醯胺酸酯、硼代磷酸酯、嗎啉基及肽核酸（PNA)鍵聯（前述Galderisi等人； Heasman (2002) Dev. Biol. 243:209-14 ； Micklefield (2001) Curr. Med. Chem. 8:1157-79)。如上所述，可以有義或反義取向將與本發明相關之經分 135384.doc -79- 200934510 離聚核苷酸或其連績部分與表現控制序列可操作性連接及/ 或連接至用於重組表現本發明的抑制性聚核皆酸（例如 siRNA分子）之表現載體中。本發明亦提供i包含如上所述之本發明之至少一種核酸的質體、載體、轉錄或表現序列盒之形式的構築體。可將本發明之經分離聚核苦酸與用於重組性產生本發明之特異性抗原決定基（例如以肽模擬劑形式）或抗體的表現控制序列可操作性連接。另外，熟習此項技術者將認識到 © T將本發明之抗體或抗原結合蛋白編碼聚核苦酸與編碼各種抗體同型之恆定域的熟知核苷酸序列可操作性連接。舉例而&，可將本發明之編碼本發明之輕鏈可變域的聚核苷酸（例如，具有闡明為SEQ ID NO:15之核苷酸序列之聚核苷酸）與編碼κ輕鏈或λ輕鏈之恆定域（或其衍生物）的核苷酸序列可操作性連接，以使得經連接核苷酸之表現將產生具有與GDF8特異性相互作用及/或特異性拮抗(3〇178之可變域之疋整κ或λ輕鏈。類似地，可將本發明之編碼本發明之重 © 鏈可變域的聚核苷酸（例如，具有闞明為SEQ ID \〇:13之核苷酸序列之聚核苷酸）與編碼重鏈同型（或其衍生物）（例如IgM、IgD、lgE、lgG及IgA)之恆定域的核苷酸序列可操作性連接。在此項技術中熟知表現重組蛋白之通用方法。該等重組蛋白可以適用於治療GDF8相關病症的可溶形式表現。本發明之重組表現載體可攜帶額外序列，諸如調節載體在宿主細胞中之複製的序列（例如複製起點），諸如組胺酸之標籤序列及可選擇性標記物基因。可選擇性標記物 135384.doc 200934510 基因促進載體所引入之宿主細胞之選擇。舉例而言，可選擇性標記物基因通常對載體所引入之宿主細胞賦予針對諸如G41 8、勻黴素或甲胺喋呤之藥物之抗性。較佳可選擇性標記物基因包括二氫葉酸還原酶（DHFR)基因（用於dhfr 宿主細胞之甲胺嗓呤選擇/擴增）及neo基因（用於G418選擇）。可選擇或構築含有包括啟動子序列、終止子序列、多聚腺嘌呤序列、強化子序列、標記物基因及視情況其他序列〇的適當調節序列之適當載體。視情況，載體可為質體或病毒’例如噬菌體或噬粒。關於其他詳情，請參見例如

Molecular Cloning: a Laboratory Manual :第二版， Sambrook 等人，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 ° 在 Current Protocols in Molecular Biology，第二版 ’ Ausubel等人編 ’ John Wiley & Sons, 1992 中詳細描述許多例如在製備核酸構築體、突變誘發、定序、將dna引入細胞中及基因表現及蛋白質分析中用於操縱核酸之已知 ❹ 技術及方案。本發明亦提供包含一或多個如上所述之構築體的宿主細胞’例如編碼如本文中所提供之任何GDF8特異性抗原決疋基、CDR(H1、H2、H3、LI、L2 或 L3)、VH 域、VL 域或特異性抗原結合片段之重組核酸形成本發明之態樣β 本發明亦包括藉由在宿主細胞中自編碼核酸表現蛋白質來產生肽之方法。可藉由在適當條件下培養含有核酸之重組宿主細胞實現表現。 135384.doc -81 - 200934510 許多細胞株為用於重組表現本發明之多肽及抗體之適當宿主細胞。哺乳動物宿主細胞株包括（但不限於）cos細胞、CHO細胞、293T細胞、A431細胞、3T3細胞、CV-1細胞、海拉細胞（HeLa cell)、L細胞、BHK21細胞、HL-60細胞、U937細胞、HaK細胞、Jurkat細胞以及來源於原代組織及原代外植體之活體外培養物的細胞株。該等宿主細胞亦允許剪接本發明之由染色體組DNA組成的聚核苷酸。或者，可能在諸如酵母之低級真核生物中或在原核生物 Q 中重組產生本發明之多肽及抗體。潛在適當酵母菌株包括 (但不限於）釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe)、刻魯維拉菌 (Kluyveromyces)菌株及念珠菌屬（Candida)菌株。潛在適當細菌菌株包括大腸桿菌（Escherichia coli)、枯草桿菌 (Bacillus subtilis)及鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium)。若在酵母或細菌中製備本發明之多肽，則可能有必要藉由例如適當部位之磷酸化或糖基化將其加以修飾以獲得功能〇性蛋白質。可使用熟知化學或酶促方法實現該等共價連接。亦可藉由將本發明之經分離聚核苷酸與諸如桿狀病毒載體之一或多種昆蟲表現載體中的適當控制序列可操作性連接且採用昆蟲細胞表現系統重組產生本發明之多肽及抗體。用於桿狀病毒/Sf9表現系統之材料及方法可以套組形式購得（例如，MAXBAC® 套組，Invitrogen，Carlsbad, CA)。 135384.doc -82- 200934510 在適當宿主細胞中重組表現後，可使用諸如凝膠過濾及離子交換層析法之已知純化方法自培養基或細胞提取物純化本發明之多肽及抗體。純化亦可包括以已知結合本發明之多肽及抗體的試劑進行親和力層析。亦可使用此等純化方法自天然來源純化本發明之多肽及抗體。或者，可以利於純化之形式重組表現本發明之多肽及抗體。舉例而言，多肽可經表現為與諸如麥芽糖結合蛋白 (MBP)、谷胱甘肽-S·轉移酶（GST)或硫氧還原蛋白（了尺幻之〇蛋白質之融合體。用於表現及純化該等融合蛋白之套組可分別構自 New England BioLabs (Beverly，MA)、pharmacia (Piscataway，NJ)及Invitrogen。本發明之多肽及抗體亦可經小抗原決定基標記且隨後使用針對該抗原決定基之特異性抗體或抗原結合蛋白鑑別或純化。一較佳抗原決定基為 flag抗原決定基，其可購自Eastman K〇dak(New Haven， CT) ° 亦可藉由已知習知化學合成產生本發明之多肽及抗體β © 熟習此項技術者熟知用於化學合成本發明之多肽及抗體的方法。該等化學合成之多肽及抗體可具有與天然純化多肽及抗體共有之生物特性，且因此可用作天然多肽及抗體之生物活性或免疫學替代物。本發明之另一態樣提供包含如本文所揭示的核酸、多肽、載體或抗鱧及其片段之宿主細胞。另一態樣提供包含將本發明之核酸引入宿主細胞中之方法β引入可採用任何可用技術。對於真核細胞，適用技術可包括磷酸約轉染、 135384.doc •83- 200934510 DEAE葡聚糖、電穿孔、脂質體介導之轉染及使用逆轉錄病毒或例如牛痘或對於昆蟲細胞使用桿狀病毒之另一病毒轉導。對於細菌細胞，適用技術可包括氯化鈣轉型、電穿孔及使用噬菌體感染。引入核酸後，接著可藉由例如在適於基因表現之條件下培養宿主細胞使或允許蛋白質自核酸產生。在此項技術中熟知該等條件。可自例如天然環境以實質上純或均勻形式，或在核酸情 φ 況下’不含或實質上不含除編碼具有所需功能之多肽以外的序列之來源之核酸或基因，提供經分離且經純化之根據本發明之抑制性聚核苷酸、GDF8特異性抗原決定基（例如作為肽模擬劑及/或免疫原）、特異性抗體或抗原結合蛋白片段、VH域及/或VL域及編碼核酸分子及載體。偵測及定量生物樣品中之GDF8的方法本發明係關於偵測及定量生物樣品中之GDF-8的方法。在某些實施例中，該方法包含偵測及定量血清、血液及血 G 漿中的游離與總GDF-8之免疫檢定❶在一種情況下，免疫檢定提供適用作抗GDF-8療法之生物標誌的資料。特定言之’所揭示免疫檢定可適用作抗GDF-8療法之前臨床結果基線之預言性/預測性標誌，作為曝露於抗GDF-8療法之標諸’作為抗GDF-8藥物功效或反應之標誌及作為牵涉於特定疾病病況或生物學過程中之GDF-8之診斷標誌。詳言之’該等方法提供用於偵測、診斷及預測患有 GDF-8相關疾病或病症或處於發展gdF-8相關疾病或病症 135384.doc -84- 200934510 之風險中的哺乳動物之GDF_8_疾病或病症之診斷及/或預測方法。該等方法尤其適料評估人類患者接受CDF』調節劑之適用性’該等調節劑例如彼等與，_8結合或抑制GDF-8之生物活性者。在某些實施例中’本發明提供監測接受GDF_8調節劑或抗GDF-8療法之個體的進展之方法。舉例而言，提供評估個體對GDF-8調節齊卜療法之反應之方&。為評估個趙對療法之反應、，可在投予GDF_8調節劑之前、期間或之後提供〇 t疫檢定方法。本發明亦包涵偵測接受治療性抗體謂_ 029的哺乳動物中GDF-8之存在的方法。在實施例中，本發明之免疫檢定方法偵測游離gdF· 8。舉例而言，游離GDF_8為未與諸如GDF8結合或中和抗體之GDF-8結合蛋白或GDF-8調節劑結合之GDF_8。在另一實施例中，包涵偵測例如游離GDF_8加上任何已結合 GDF-8的總GDF-8之方法。患有肌肉相關病症或處於發展肌肉相關病症之風險中的 Ο 個體為本文中所提供之方法的候選者4GDF.8活性之抑制增加包括彼等患有肌肉相關病症之個體之肌肉質量。許多病症與功此上受損之肌肉組織相關，例如肌肉萎縮症、肌萎縮性侧索硬化（ALS)、肌肉萎縮、器官萎縮、虛弱、充血性阻塞性肺病、心臟衰竭、骨骼肌減少症惡病質及由其他疾病及病狀所引起的肌肉消瘦症候群。另外，希望増加餵養動物之肌肉質量或肌力、増加生長或肌肉組織質量的個體或哺乳動物為本文中所提供之方法的候選者。 135384.doc •85· 200934510 患有脂肪組織、代謝或骨骼相關病症或病狀或處於發展脂肪組織、代謝或骨骼相關病症或病狀之風險中的個體亦為本文中所描述且主張之方法的候選者。該等病症或病狀包括彼等與葡萄糖内穩定相關者，諸如發展第二型糖尿病、葡萄糖耐受不良、代謝症候群（例如症候群X)、由諸如燒傷或氮不平衡之外傷誘發的胰島素抵抗，及脂肪組織病症（例如肥胖症）（Kim等人，Biochem. Biophys. Res. Comm. 281:902-906 (2001))。舉例而言，GDF-8調節前脂 q 肪母細胞分化成脂肪細胞（Id.)且抑制脂肪細胞由間葉細胞前驅體細胞及前脂肪母細胞形成（Rebbapragada等人，Mol. Cell Bio. 23:7230-7242 (2003))。在已全身性投予 GDF-8蛋白之GDF-8基因剔除小鼠及野生型成年小鼠中體脂肪蓄積降低（McPherron 等人，J. Clinical Invest. 109:595-601 (2002) ; Zimmers等人，Science 296:1486-1488 (2002))。本發明方法之其他用途對熟習此項技術者而言將顯而易見且在下文進一步例示。〇免疫檢定本文所述之免疫檢定為使用至少兩種抗GDF-8抗體之夾層型ELISA，一種抗體以對GDF8具特異性之GDF-8捕捉試劑形式存在且一種抗體以對GDF8具特異性之GDF-8偵測試劑形式存在。兩種抗體均能夠結合生物樣品中存在之 GDF-8抗原。抗體中之一者較佳識別GDF-8超過BMP-11。兩種抗體均能夠識別且結合GDF-8。此外，在某些實施例中，該等抗體能夠與以任何生物形式（例如活性GDF-8、潛 135384.doc -86 - 200934510 伏GDF-8、與血清蛋白質結合之GDF-8、與中和抗GDF-8 抗體MYO-029結合之GDF-8)存在之GDF-8結合。在某些實施例中，用於本檢定中之抗體為RK35(參見 SEQ ID NO:31-35及美國申請案US2007/0087000，據此將其以引用的方式併入本文中），其為與GDF-8結合之經分離鼠類單株抗體。在某些實施例中，使用RK35作為捕捉抗體。在本發明之方法中亦可使用與GDF-8結合之RK35之片段。 Q 在某些實施例中，用於本檢定中之第二抗體為RK22，與GDF-8結合之經分離鼠類單株抗體。如以下所例示， RK22不與BMP-11結合。在某些實施例中，使用RK22作為偵測試劑，在某些實施例中其用作捕捉試劑。在本發明之檢定中亦可使用與GDF-8結合之RK22之片段。在另一實施例中，本發明之免疫檢定使用為人類IgGl抗 GDF-8抗體之抗體MYO-029。在免疫檢定中可使用MYO-029(參見SEQ ID NO:33及34，美國公開申請案〇 2006/0240488及2006/0240487，據此將其以引用的方式併入本文中）來阻斷對GDF-8之偵測以獲得可自MYO-029不存在情況下產生的信號扣除之背景含量。可採用此實施例來增加定量檢定之靈敏度及準確度。適用於本發明之方法中的抗體亦包涵抗原結合片段，諸如由VH及VL域組成之Fv片段，由藉由恆定區之間的二硫鍵共價鍵聯之VH-CH1及VL-CL域組成之Fab片段（抗原結合片段）。對於其他可能的抗原結合片段及抗體結構之回 135384.doc -87- 200934510 顧，請參見Antibodies: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow等人，編 1988 ° 以編碼非生殖系化scFv之MYO-029的噬粒載體 pCANTAB6個別轉型之大腸桿菌培養物於2002年10月2日在各別寄存指定編號PTA-4741下寄存於美國典型菌種保藏中心（American Tissue Culture Collection(ATCC))。寄存處之地址為 U.S.A，VA 20110，Manassas, 10801 University Blvd。 0 組合含有GDF8之樣品與捕捉試劑後，藉由洗滌移除任何未結合組份，且接著使組份在適當結合條件下與懷疑含有GDF-8之樣品接觸。洗滌移除任何未結合分子後，在適當結合條件下添加第二抗GDF-8抗體。此第二抗體稱為偵測抗體或試劑。偵測抗體可包括可偵測標記且結合已與捕捉抗體反應之分子。因此，所存在之任何GDF-8將結合與樣品中之GDF8結合之捕捉試劑以及偵測抗體試劑。藉由洗滌移除未結合分子及組份》因此，標記之存在指示生物 ❹ 樣品中GDF-8之存在。更特定言之，可使用夾層ELIS A方法》含有或懷疑含有 GDF-8之生物樣品為對GDF8具特異性之捕捉試劑。培育足以允許GDF-8與捕捉試劑結合之時間後，可洗滌檢定板以移除未結合組份且添加偵測組份。使此等分子與任何經捕捉樣品GDF-8反應，洗滌檢定板且使用在此項技術中熟知之方法偵測標記之存在。上述檢定試劑，包括免疫檢定抗原以及待與所捕捉樣品 135384.doc -88- 200934510 反應的抗體，可與適當用法說明書及其他必需試劑一起提供於套組中’以如上所述進行免疫檢定。視所用特定免疫檢定而定，套組亦可含有適當標記及其他封裝試劑及材料 (亦即洗滌緩衝液及其類似物）。可使用此等套組進行諸如彼等如上所述之免疫檢定。免疫檢定之特定實施例游離GDF-8之分析在一實施例中，本發明包含偵測生物樣品中游離gdf_8 ❹ 之存在的方法。此實施例之一代表性實例描述於圖21中。如本文中所用，術語游離GDF-8包括以活性、成熟狀態存在之GDF-8。成熟GDF-8可為單體、二聚體或同源二聚體。游離GDF-8不包涵潛伏GDF-8(亦即，與GOF-8前狀締合的成熟GDF-8)、與GDF-8結合蛋白締合之GDF-8或與諸如GDF-8結合及中和抗體之抗GDF-8調節劑締合之GDF· 8 ° 在一實施例中’債測及定量游離GDF-8之方法包含以下〇步驟：（a)在當GDF-8存在於生物樣品之中時允許其與一或多種捕捉抗體結合形成捕捉抗體-GDF-8複合物之條件下組合GDF-8捕捉抗體與樣品；在複合物形成條件下添加偵測抗體’其中該偵測抗體結合捕捉抗體_GDF-8複合物；及 (b)偵測捕捉抗體-GDF-8複合物與偵測抗體之間形成的複合物（若存在）’作為生物樣品中GDF-8之指示。偵測抗體或抗原結合蛋白可進一步包含可偵測標記。在某些情況下’偵測抗體未經標記且使用特異性識別偵測抗 135384.doc •89- 200934510 體之偵測劑。總GDF-8之分析在一實施例中，本發明包含偵測生物樣品中總GDF-8之存在的方法。如本文中所用，術語總GDF-8包括以活性、成熟狀態存在之GDF-8及以潛伏形式存在之任何GDF-8(亦即，與GDF-8前肽締合之成熟GDF-8)、與GDF-8結合蛋白締合之GDF-8 或與諸如GDF-8結合與中和抗體之抗GDF-8調節劑締合之 q GDF-8。對總GDF-8之量測包括對由治療性抗體MYO-029 結合的GDF- 8之量測。酸解離在一實施例中，偵測及定量總GDF-8之方法使用酸解離方法，且包含以下步驟：（a)在當GDF-8存在於生物樣品中時允許其與一或多種捕捉抗體結合形成捕捉抗體-GDF-8複合物之酸性條件（介於約pHl.O與約pH 6.0之間，較佳約pH 2.5)下組合GDF-8捕捉抗體與生物樣品；在複合物形成條〇件下添加GDF-8偵測抗體，其中該偵測抗體結合捕捉抗體-GDF-8複合物；且（b)偵測捕捉抗體-GDF-8複合物與偵測抗體之間形成的複合物（若存在），作為生物樣品中GDF-8之指示。偵測抗體或抗原結合蛋白可進一步包含可偵測標記。在某些情況下，偵測抗體未經標記且使用特異性識別偵測抗體之偵測劑。熱解離 135384.doc -90- 200934510 在另一實施例中’偵測及定量總GDF-8之方法使用熱解離方法’且包含以下步驟：使GDF-8捕捉抗體或抗原結合蛋白與固相支撐物之表面接觸；（b)將生物樣品加熱至至少 63°C ’ 諸如 65°C、70°C、75°C、80°C、85°C 或90°C，歷時至少3分鐘’諸如5、7、9、10、12、14或15分鐘，且在當GDF-8存在於生物樣品之中時允許其與一或多種捕捉抗想結合形成捕捉抗體-GDF-8複合物之條件下組合生物樣品與固相支撐物；（c)在複合物形成酸性條件下將偵測抗體添〇加至步驟（b)之固相支撐物中’其中偵測抗體結合捕捉抗體-GDF-8複合物；及（d)偵測在捕捉抗體_(5〇!?_8複合物與偵測抗體之間形成的複合物（若存在），作為生物樣品中 GDF-8之指示。偵測抗體或抗原結合蛋白可進一步包含可偵測標記。在某些情況下，偵測抗體未經標記且使用特異性識別偵測抗體之偵測劑。此方法之一實施例描述於圖12中，其中展示抗體Μγ〇_ © 029抑制由偵測抗體（例如生物素化RK22)產生之信號。以此方式’可計算出檢定背景且自在步驟（d)中所獲得之值中扣除》分析游離及總GDF-8之替代實施例在某些實施例中’例如藉由與表面共價或非共價結合，使捕捉抗體與固相支撐物或反應容器之表面接觸。接觸可為直接或間接接觸。可藉由例如化學或輻射處理來修飾表面以影響表面之結合特徵。 135384.doc -91· 200934510 在某些實施例中’使捕捉抗體與生物樣品接觸後，且洗开条以移除未結合組份。可以阻斷步驟使非特異性相互作用最小，其中將包含至少一種阻斷劑，諸如不與標靶特異性結合之蛋白質的緩衝液添加至反應容器中。舉例而言阻斷緩衝液可包含市售阻斷緩衝液、血清、牛血清白蛋白、乳液、路蛋白、明膠及/或非離子型清潔劑。在某些實施例中，以pH值介於約5與約9之間的缓衝液，諸如檸檬酸鹽緩衝液、磷酸鹽緩衝液、Tris緩衝液或乙酸鹽緩衝液洗滌〇反應容器。或者，例如在偵測及定量總GOF-8之酸解離方法中’緩衝液在約pH 3.0與pH 5.0之間。待在本發明之方法中測試之生物樣品可選自血清、血液、血漿、生檢樣品、組織樣品、細胞懸浮液、唾液、口水、腦脊髓液、羊膜液、乳液、初乳、乳腺分泌物、淋巴、尿液、汗液、滑液及淚液。在某些實施例中，生物樣品為流體。在某些實施例中，生物樣品係選自血液、血清及血漿。在特定實施例中’生物樣品為來自諸如人類、 © 猴、大鼠、小鼠、牛、綿羊或雞血清之血清。在其他實施例中，生物樣品係自一或多個個體分離且視情況在測試之前處理。舉例而言，樣品可經稀釋。稀釋緩衝液可視情況包含恆定量之對照生物樣品，其經選擇以對應於測試生物樣品，例如以控制背景效應或樣品基質之干擾。在一實施例中，在 THST(50 mM Tris-HCl，pH 8.0，含有 1·〇 mM甘胺酸、〇·5 M NaCl 及 0·05% (v/v)Tween 2〇⑧）緩衝液中將人血聚之測試樣品稀釋1:8倍，在THST加上已耗 135384.doc •92· 200934510 盡GDF-8的12.5%人類血清中製備超過8倍之生物樣品稀釋液。可將生物樣品稀釋約2、4、5、8、10、12、14、15、 16、32、64或128倍。在其他實施例中，以1:1.5或1:1.6連續稀釋生物樣品以獲得允許驗證稀釋線性度及基質效應之資料點範圍。對於某些生物樣品基質，可選擇基質干擾及檢定靈敏度經優化之稀釋液。稀釋劑並不受特定限制，但可包含血清，包括（例如）人類jk β、已耗盡G D F - 8之人類血清、小鼠血清、已耗盡 ❹ GDF-8之小鼠血清、去離子水或在約ρΗ 3.0至約pH 9.0範圍内具有緩衝作用之各種緩衝液，此視是否在酸性條件下進行檢定而定。對於在中性pH值下進行之對游離GDF-8之分析，pH值為約6.5至約8.5、約6.5至約7.0、約7.0至約 7.5、約7.5至約8.0或約8.〇至約8.5(例如，檸檬酸鹽緩衝液、填睃鹽緩衝液、Tris緩衝液、乙酸鹽緩衝液或蝴酸鹽緩衝液）°對於在酸性pH值下進行之對總GDF-8的分析， pH值為（例如）約1.〇至約2 5、約2.5至約5.5、約2·5至約〇 3.0、約3.0至約3.5、約3.5至約4.0、約4.0至約4.5或約4.5 至約5.5、約5.5至約6.5。在某些實施例中，可視情況使用熟知方法分級分離或濃縮生物樣品且隨後添加至如本文所述之檢定中以偵測 GDF-8。舉例而言’若在檢定中基質干擾限制對GDF-8調節劑之债測，則可使用分級分離（包括純化）或濃縮。分級分離及浪縮技術包括（但不限於）離心、硫酸銨沈澱、聚乙二醇沈澱、三氣乙酸（TCA)沈澱、親和力技術（諸如使用與 1353S4.doc -93- 200934510 諸如抗體（例如抗GDF-8抗體）之特異性結合搭配物共輛的樹脂之免疫沈澱）、層析技術及其他分離技術。生物樣品可自未處理個體收集，或生物樣品可在投予 GDF-8調節劑之前、期間或之後採集。舉例而言，生物樣品可在投予GDF-8調節劑之後1、2、4、6、7、8、1〇、 12、14、15、20、25、30天或30天以上自個體獲得。生物樣品亦可在投予GDF-8調節劑之後1、2、3、4、6、7、 8、10、12、14、16週或16週以上獲得。在某些情況下， G 至多一年或超過一年之時間點為適當的。可測試生物樣品之游離與總GDF-8。在經GDF_8調節劑處理之個體中對總 GDF-8之为析尤其重要，此係因為此等藥劑可干擾偵測或捕捉試劑結合生物樣品中之GDF_8之能力。因此，對總 GDF-8之分析中所使用的酸或熱解離方法變得尤其重要。在某些實施例中，使待測試生物樣品之等分試樣與捕捉抗體或抗原結合蛋白接觸且歷時一段充分時間（例如2_12〇分鐘或1-4小時）及在適宜條件下（例如23它）培育以允許捕 G 捉抗體與生物樣品中存在之GDF-8(若存在）結合且允許抗體/GDF-8複合物形成。在其他實施例中，在常規用於習知免疫檢定之條件下進rGDF_8/抗體反應。典型程序包含培育或允許包含捕捉抗體及生物樣品之反應系統在不超過 45 C的溫度下（諸如介於約4亡與約4〇。(：之間，或介於約 23 C與約40°C之間）靜置介於約〇 5與4〇小時之間（諸如介於約1與約2 0小時之間）的時間。培育期後’在某些實施例中，以緩衝液洗滌抗體/GDF 8 135384.doc -94· 200934510 複合物以移除未結合溶質。在其他實施例中，進行同時檢定’由此將生物樣品及偵測抗體同時添加至反應容器中。在偵測抗體係於生物樣品後添加之特定實施例中，程序可包含培育或允許包含抗體/gdf_8複合物及偵測抗體之反應系統在不超過45它之溫度下（諸如介於約4。(：與約40°C之間’或介於約25°C與約40°C之間）靜置約0.5與40小時之間，或約1與約20小時之間的時間。在某些實施例中，偵測抗體、抗原結合蛋白或其片段包 Q 含可偵測標記。在其他實施例中，偵測抗體係藉由（例如）偵測劑間接偵測。在某些實施例中，偵測劑過量以便基本上所有存在於反應容器之中的偵測抗體被結合。在某些實施例中，"直接"標記可為在未添加輔助試劑情況下能夠自發地產生可偵測信號的與特異性結合成員結合或共軛之任何分子。一些實例包括放射性同位素（例如 1251、3H、14C)、螢光團（例如螢光素酶、綠色螢光蛋白、異硫氰酸螢光素、四曱基若丹明異硫氰酸鹽 ❹ (tetramethylrhodamine isothiocyanate)、1-N-(2,2,6,6-四甲基-1-烴氧基-4-哌啶基）-5-N-(天冬胺酸酯）-2,4-二硝基苯）、染料（例如藻藍蛋白（phycocyanin)、藻紅蛋白 (phycoerythrin)、德克薩斯紅（Texas Red)、鄰苯二醛）、包括化學發光及生物發光分子之發光分子、膠體金顆粒、膠鱧銀顆粒、其他勝體金屬顆粒、聚苯乙烯染料顆粒、諸如染料溶膠之細小有色顆粒及有色乳膠顆粒。許多其他適當標記分子為熟習此項技術者所熟知且可用於本發明之方法 135384.doc -95- 200934510 中。在某些情況下’標記可為酶’諸如鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶、葡萄糖氧化酶或半乳糖苷酶。在各種實施例中’欲用於特定酶之受質經選擇以在對應酶存在下產生顏色、螢光或發光之可偵測變化。可藉由戊二醛或還原胺化交聯使酶與抗體或抗原結合蛋白共輛。然而，如將易於認識到’多種不同共軛技術存在且易於為熟習此項技術者所用。 φ 在一較佳實施例中’將偵測抗體或抗原結合蛋白生物素化。可如實例1(參見例如實例丨：第I部分，第5分段）所闞明將適用作偵測抗體之抗_GDF_8抗體生物素化◊各種生物素化試劑能夠有效地標記包括抗體之蛋白質。生物素衍生物與抗髏之莫耳比可為約1〇、15、20、40或80:1，且反應時間、反應物濃度及溫度可改變以調整併入反應中的生物素之量°在此項技術中熟知且可獲得生物素衍生物，包括可變間隔劑臂、影響溶解度之修飾及/或允許生物素部分〇裂解之反應性基團。舉例而言，生物素之丁二醯亞胺基酯及其衍生物，包括水溶性磺基丁二醯亞胺酯，可用於 GDF-8之生物素化《為定量所併入生物素之量，使用熟知分析及大小測定技術，其包括例如逆相高壓液相層析質譜等。另外，例如可利用用於藉由比色或螢光檢定定量生物素之商業套組（參見例如，EZTM生物素定量套組， Pierce，使用ΗΑΒΑ(2·(4，-羥基偶氮苯）_苯甲酸））。在一實施例中，生物素化RK_22為用於偵測與RK35結合 135384.doc -96- 200934510 之GDF-8之偵測劑。在一特定實施例中，將諸如抗體或抗原結合蛋白的生物素化及/或酶標記之偵測劑添加至GDF8 /抗體複合物中且允許結合。洗滌除去過量試劑且接著將含有適當受質之溶液添加至反應容器中。受質經歷梅催化反應，產生分光光度法可量測之改變，其指示樣品中存在之GDF8之量。舉例而言，可經由以抗生物素蛋白_酶共軛物及適當發色或螢光受質依次培育後，與抗生物素蛋白酶共軛物（例〇如抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶）之相互作用偵測生物素化偵測抗體或抗原結合蛋白。亦可以銪標記之抗生蛋白鏈菌素偵測生物素化偵測抗體。在某些實施例中，藉由定性或定量評定標記之信號來偵測與反應容器表面締合之抗體/GDF_8/抗體複合物。在一些情況下，例如藉由螢光或發光直接或經由添加受質間接量測標記》在其他情況下，在以另一試劑培育後量測標記。在標記為生物素之實施例中，可在後續步驟中添加抗〇生物素蛋白共軛物（諸如辣根過氧化物酶）。在一特定實施例中’抗生物素蛋白共軛物可與固定化偵測抗體或抗原結合蛋白結合。洗滌除去過量抗生物素蛋白共輛物。接著添加酶之受質’產生例如顏色、螢光或發光之可量測之變化。在一些實施例中，辣根過氧化物酶之受質為3,3，，5,5,_ 四曱基聯苯胺。游離及總GDF-8之定量法可使用熟習此項技術者所熟知之方法定量GDF-8含量。 135384.doc -97· 200934510 在某些實施例中，將生物樣品中之GDF-8含量與諸如藉由例如使用標準曲線獲得之已知含量相比較。在實例15中例不GDF-8標準曲線之產生。標準曲線可包含在緩衝液中稀釋之已知濃度的GDF-8。在某些實施例中，緩衝液為血清’諸如人類血清、小鼠血清、靈長類動物血清、牛血清或綿羊血清。企清在添加已知濃度之GdF_8之前，視情況耗盡内源性GDF-8。血清可獲自天然缺乏GDF-8之比利時藍牛。〇在一實施例中，定量生物樣品中之游離GDF-8之方法包含在當GDF-8存在於生物樣品之中時允許其與一或多種捕捉抗體結合形成捕捉抗體或抗原結合蛋白_(3〇1?_8複合物之條件下組合GDF-8捕捉抗體或抗原結合蛋白與生物樣品；添加經標記之GDF-8偵測抗體或抗原結合蛋白至步驟（b)之固相支撐物中；（d)藉由偵測由GDF-8偵測抗體上的標記所產生之信號偵測捕捉抗體_GE)F_8複合物與偵測抗體之間形成的複合物；及（e)藉由比較由含有經標記GDF-8偵測抗體〇的複合物所產生的信號與藉由測定已知量之GDF-8的對應 ^號強度產生之標準曲線來定量生物樣品中GDF-8之含量° 定3：總GDF-8之方法相似’其例外為在酸性緩衝液中稀釋生物樣品。治療、改善、預防及抑制GDF8相關病症之進程的方法 GDF8在發展及/或調節例如骨骼肌、骨骼、葡萄糖内穩定等之GDF8相關病症中之涉及，及本發明之新穎特異性 -9S - 135384.doc 200934510 GDF8拮抗劑之發現使得能夠實現用於治療、改善或預防 GDF8相關病症之方法，該等病症例如肌肉病症、神經肌肉病症、骨骼退化性病症、代謝或誘導型骨骼病症、葡萄糖代謝病症、脂肪病症及胰島素相關病症。另外，拮抗劑允許藉由量測生物樣品中GDF8之含量來診斷、預測及監測該等病症之進程。詳言之，本發明之拮抗劑GDF8特異性抗原決定基（例如其肽模擬劑、其抑制性聚核苷酸、其抗體、小分子等）可用於治療患有GDF8相關病症之個體， g 或用於區分患者是否患有GDF8相關病症之方法中。本發明之拮抗劑適用於預防、診斷或治療人類或動物之各種GDF8相關醫學病症。可使用拮抗劑來抑制、降低及/ 或中和一或多種與GDF8相關之活性。最佳地，相對於本發明之拮抗劑不存在情況下之GDF8，拮抗劑抑制或降低一或多種GDF8活性。在某些實施例中，相對於未由一或多種抗GDF8抗體結合之成熟GDF8蛋白，本發明之拮抗劑對GDF8之活性抑制至少50%，較佳至少60°/。、62%、 ❹ 64%、66%、68%、70%、72%、72%、76% ' 78%、80%、 82%、84%、86% 或 88%，更佳至少 90%、91%、92%、93% 或94%且甚至更佳至少95%至100%。可在（例如）如前述 Thies等人中所述之pGL3(CAGA)12報導基因檢定（RGA)中及如實例所說明之ActRIIB受體檢定中量測對GDF8活性之抑制或中和。藉由本發明所揭示之拮抗劑所診斷、預測、監測、治療、改善或預防之醫學病症為GDF8相關病症，例如肌肉 135384.doc •99· 200934510 或神經肌肉病症，包括（例如）肌肉萎縮症（MD :包括杜興氏肌肉萎縮症）、肌萎縮性側索硬化（ALS)、肌肉萎縮器官萎縮、虛弱、腕隧道症候群、充血性阻塞性肺病、骨骼肌減少症、惡病質及肌肉消瘦症候群（例如，由其他疾病及病狀所引起）。另外，可藉由咖8抗體所診斷預測、監測、治療、改善或預防之其他醫學病症為諸如肥胖症之脂肪組織病症'第二型糖尿病、葡萄糖耐受不良、代謝症 ❹ 候群（例如症候群X)、藉由外傷（諸如燒傷或氮不平衡）誘發之胰島素抵抗或骨路退化性疾病（例如骨關節炎及骨質疏鬆症）。在本發明之較佳但非限制性實施例中，藉由本發明所揭示之拮抗劑所診斷、預測、監測、治療、改善或預防之醫學病症為肌肉或神經肌肉病症。在本發明之-更佳 2非限制性實施例中’藉由本發明所揭示之括抗劑所診預測、監測、治療、改善或預防之肌肉或神經肌肉病症為MD或ALS。 ❹ 可藉由本發明所揭示之拮抗劑所診斷、治療、改善或預他醫學病症為彼等與骨絡損失相關者，其包括骨質發之哲尤其在老年人及/或絕經後女性中）、糖皮質激素誘骨折症、骨質減少、骨關節炎及骨質疏鬆症相關質激去1^乾代謝骨路疾病及病症包括歸因於慢性糖皮繼發性去生殖腺早衰、雄激素抑制、維生素D缺乏' 骨質量。赫腺功能充進、營養缺乏及神經性厭食症之低、Α 佳使用本發明之拮抗劑來預防、診斷、改善或治療哺乳動物、士* 、人類（例如將或已懷孕之婦女）之該等 135384.doc •100- 200934510 醫學病症。本發明之拮抗劑係以治療有效量投予。通常治療有效量可隨受檢者之年齡、病狀及性別以及該受檢者之醫學病狀的嚴重程度而變化。劑量可由醫師確定且根據需要加以調節以適合所觀測到t治療#用。該等化合物之毒性及治療功效可由在細胞培養物或實驗動物中（例如）用於測定 LD50(使50%之群體致死的劑量）及ED5〇(對5〇%之群體治療有效的劑量）之標準醫藥程序來測定。毒性與治療作用之〇間的劑量比，亦即LD50/ED5〇,為治療指數，且展現大的治療指數之拮抗劑較佳。獲自細胞培養檢定及動物研究之資料可用於調配適用於人類之劑量範圍》該等化合物之劑量較佳位於包括極少或無毒性之ED50的循環濃度範圍内。劑量可視劑量形式及投藥途徑而在此範圍内變化。對於本發明中所用之任何拮抗劑而言’最初可自細胞培養檢定估算治療有效劑量。劑量可於動物模型中調配以獲得包括如在細胞培養物中所確 ® 疋之1C50(例如，獲得對症狀或生物活性之半數最大抑制作用之測試拮抗劑的濃度）的循環血漿濃度範圍。可例如藉由尚效液相層析來量測血漿含量。可藉由適當生物檢定監測任何特定劑量之作用。適當生物檢定之實例包括（但不限於）DNA複製檢定、基於轉錄之檢定、GDF8蛋白/受體結合檢定、肌酸激酶檢定、基於前脂肪母細胞之分化的檢疋、基於脂肪細胞中葡萄糖吸收之檢定及免疫學檢定。通常，投予組合物以便在以下劑量下給予拮抗劑或其結 135384.doc • 101· 200934510 合片段：1 pg/kg至 150 mg/kg、1 pg/kg至 100 mg/kg、1 至 50 mg/kg、1 pg/kg 至 20 mg/kg、1 pg/kg 至 10 mg/kg、1 pg/kg至 1 mg/kg、10 pg/kg至 1 mg/kg' 10 pg/kg 至 100 pg/kg、 100 jig至 1 mg/kg及 500 p^g/kg至 1 mg/kg。較佳地，以單次劑量形式給予拮抗劑以在給藥後，使拮抗劑之循環含量最大歷時最長時間。亦可在單次劑量之前、之後或替代單次劑量，使用連續輸液。鑑別用於GDF8相關病症之治療劑的方法 q 本發明之另一態樣提供鑑別適用於治療（例如）肌肉、葡萄糖代謝、脂肪及骨骼病症的治療劑之方法。在此項技術中已知適當篩選檢定，例如基於ELISA之檢定。在該篩選檢定中，藉由組合拮抗劑、尤其本發明之GDF8特異性抗原決定基之肽模擬劑或抗體或抗原結合蛋白與其配位體 GDF8來形成第一結合混合物，且量測第一結合混合物 (M0)中配位體與抗體之間結合之量。亦藉由組合該拮抗劑、配位體與待篩選化合物或藥劑來形成第二結合混合〇物，且量測第二結合混合物（Ml)中該配位體與該抗體之間的結合之量。接著，例如藉由計算Ml/M0比率來比較第一與第二結合混合物中結合之量。若觀測到與第一結合混合物相比第二結合混合物中之結合下降（亦即M1/M0<1)，則認為該化合物或藥劑能夠與GDF8特異性相互作用。結合混合物之調配及優化在在此項技術之技能層面内；該結合混合物亦可含有增強或優化結合所必需之緩衝劑及鹽，且在本發明之篩選檢定中可包括額外對照檢定。 •102- 135384.doc 200934510 可因此鑑別發現將拮抗劑_配位體結合降低至少約 10%(亦即Μ1/Μ0<0·9)、較佳大於約30%之化合物，且隨後 (若需要）二次篩選其在諸如八以以汨結合檢定之其他檢定中或如實例中所述或在此項技術中所熟知之其他細胞基及活體内檢定中抑制GDF8活性之能力。小分子亦可經由使用拮抗（亦即抑制）GDF8活性之拮抗劑小分子 (通常為有機小分子），實現在罹患(3£^8相關病症（或處於 G GDF8相關病症風險中）之有機體（或受檢者）中或在來自該有機體之牵涉於該等病症中之細胞中抑制GDF8活性。可藉由如上所述之篩選方法鑑別新穎拮抗小分子且其可用於本文所述之本發明之治療方法中。相反地，亦可經由使用促效（亦即增強）GDF8活性之小分子（通常為有機小分子）實現在罹患與GDF8表現及/或活性降低相關的病症或與GDF8含量降低相關的病症（或處於該等病症風險中）之有機鱧（或受檢者）中增強GDF8活性。可 G 藉由篩選方法鑑別新穎促效小分子且其可用於本文所述之本發明之治療方法中。診斷、預測及監測GDF8相關病症進程之方法除治療例如肌肉、骨骼、葡萄糖代謝及脂肪病症之外，本發明亦提供藉由伯測例如血清、血漿 '支氣管肺泡灌洗液、唾液、生檢（例如肌肉組織之生檢）等之生物樣品中 GDF8之降低或升高來診斷該等病症之方法。"診斷"意謂幾別病理病況之存在或不存在。診斷方法包括藉由（例如） 135384.doc •103- 200934510 測定來自受檢者（人類或非人類哺乳動物）的生物樣品中 GDF8多肽之測試量，且比較該測試量與GDF8多肽之正常量或範圍（例如來自已知未患有該病症之個體的量或範圍）來偵測GDF8之存在。儘管特定診斷方法可能不提供對 GDF8相關病症之確定診斷，但若該方法提供輔助診斷之陽性指示，則其足夠。本發明亦提供藉由偵測GDF8之上調預測例如肌肉、骨骼、葡萄糖代謝及脂肪病症之GDF8相關病症之方法。”預 0 測”意謂預言病理病狀之可能發展及/或嚴重程度。預測方法包括測定來自受檢者之生物樣品中GDF8之測試量，且比較該測試量與GDF8之預測量或範圍（例如，患有不同嚴重程度之（例如）ALS的個體之量或範圍）。測試樣品中 GDF8之各種量與對GDF8相關病症之某些預測一致。對特定預測含量GDF8之量的偵測向受檢者提供預測。本發明亦提供藉由偵測GDF8之上調或下調來監測GDF8 相關肌肉、骨骼、葡萄糖代謝及脂肪病症之進程的方法。〇監測方法包括在第一及第二時間測定取自受檢者之生物樣品中GDF8之測試量，且比較該等量。第一與第二時間之間GDF8之量的變化指示GDF8相關病症之進程（例如嚴重程度）之變化。熟習此項技術者將認識到在需要肌肉質量增加之GDF8相關病症中，第一與第二時間之間GDF8蛋白之量及/或活性的下降指示病症好轉，且量增加指示病症發展。相反地，對於需要肌肉質量下降之GDF8相關病症，第一與第二時間之間GDF8蛋白之量及/或活性的下降指示 135384.doc -104- 200934510 病症發展，且量增加指示病症好轉。該等監測檢定亦適用於砰估正治療〇1：)178相關病症的患者中特定治療干預之功效（例如疾病減弱及/或逆轉）。本發明之拮抗劑可藉由活體内或活體外偵測GDF8之存在用於診斷、預測或監測。該等偵測方法為在此項技術中所熟知且包括ELISA、放射免疫檢定、免疫墨點法、西方墨點去、免疫螢光、免疫沈澱及其他相當技術。拮抗劑可進一步提供於併有一或多種供偵測GDF8之此等技術之診〇斷套組中。該套組可含有其他組件、包裝、用法說明書或其他材料以辅助對蛋白質之偵測及套組之使用。若拮抗劑意欲用於診斷、預測或監測目的’則可能需要例如以配位基（諸如生物素）或可偵測標記物基團（諸如螢光基團、放射性同位素或酶）對其加以修飾。必要時拮抗劑 (無論為多株或單株）可使用習知技術加以標記。適當標記包括螢光團、發色團、放射性原子、電子緻密試劑、酶及具有特異性結合搭配物之配位體。酶通常藉由其活性偵〇測。舉例而言’辣根過氧化物酶可藉由可以分光光度計定量的其將四甲基聯苯胺（TMB)轉化為藍色顏料之能力加以偵測。其他適當標記可包括生物素及抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素、IgG及蛋白A，及在此項技術中已知之許多受體-配位體偶。其他改變及可能性對一般技術者將易於顯而易見且視為本發明範鳴内之等效物。醫藥組合物及投藥方法本發明提供包含本發明之本發明所揭示拮抗劑，亦即多 135384.doc -105- 200934510 肽、聚核苷酸、載體、抗體、抗體或抗原結合蛋白片段及小分子的組合物。該等組合物可適於醫藥用途及投予患者。該等組合物通常包含本發明之一或多種分子，較佳為抗體或抗原結合蛋白，及醫藥學上可接受之賦形劑。本發明之拮抗劑可活體外、離體使用，或當與醫藥學上可接受之載劑組合時併入醫藥組合物中。如本文中所用，措詞"醫藥學上可接受之賦形劑"包括與醫藥投藥相容之任何及所有溶劑、溶液、緩衝劑、分散液介質、包衣、抗菌劑及抗〇真菌劑、等張及吸收延遲劑及其類似物。除本發明之拮抗劑及載劑之外，該組合物亦可含有各種稀釋劑、填充劑、鹽、緩衝劑、穩定劑、增溶劑及其他在此項技術中熟知之物質。術語"醫藥學上可接受"意謂不干擾活性成份之生物活性的有效性之無毒物質。载劑之特徵將視投藥途徑而疋。該等介質及藥劑用於醫藥活性物質之用途為此項技術中所熟知。組合物亦可含有其他提供補充、額外或增強之治療功能的活性化合物。醫藥組合物亦可與投藥用法說明〇書一起包括於容器、包裝或分配器中。本發明之醫藥組合物可呈脂質體形式，其中除其他醫藥學上可接受之載劑之外’亦可將本發明之拮抗劑與諸如脂質之當於水溶液中時以如微胞、不溶性單層、液態晶體或 4片層的聚集體形式存在的兩性劑組合。用於脂質調配物之適當脂質包括（但不限於）單甘油酯、甘油二酯、硫脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂苷、膽汁酸及其類似物。該等脂質調配物之製備在此項技術之技能層面内。 135384.doc -106- 200934510 如本文中所用，術語"治療有效量"意謂足以展示有意義之患者益處（例如該等病狀之症狀改善、疾癒或該等錢之疫癒率提高)的醫藥組合物或方法之各活性組份之禅量。當應用於單獨投予之個別活性成份時，該術語係心獨成份。當應用於組合時，該術語係指無論在組合、連續或同時投予情況下，產生治療作用的活性成份之組合量。在實施本發明之治療方法或用途中，將治療有效量之 (例如）對GDF8具特異性之拮抗劑投予例如哺乳動物（例如〇 a類)之受檢者。可根據本發明之方法單獨或與諸如消炎劑之其他療法組合投予本發明之拮抗劑。當與一或多種藥劑共投予時，可與第二藥劑同時或依次投予本發明之枯抗劑。若依次投予，則主治醫師將決定與其他藥劑組合投予本發明之拮抗劑之適當順序。在一實施例中，以組合療法（亦即與例如適用於治療病理病狀或病症的治療劑之其他藥劑組合）投予本發明之拮抗劑’例如其醫藥組合物，該等病理病狀或病症諸如肌肉口 ❹冑症、神經肌肉病症、㈣退化性病症、代謝或誘導型骨絡病症、脂肪病症、葡萄糖代謝病症或胰島素相關病症， f i如μ及過敏性及發炎性病症。在此上下文中之術語"組 «意谓實質上同時期（同時或依次）給予該等藥劑。若依次給予，則在開始投予第二化合物時，兩種化合物之前者較佳在有效濃度下在治療部位或在受檢者中仍可债測。本發明之醫藥組合物經調配以與其預定投藥途徑相容。實現投藥之方法為-般技術者所已知。亦可能獲得可局部 135384.doc -107- 200934510 或經口投予或可能夠跨黏膜傳輸之組合物。可以多種習知方式，諸如經口攝取、吸入、經皮、皮下或靜脈内注射，進行用於醫藥組合物中以實施本發明之方法的本發明之结抗劑的投藥。用於皮内或皮下應用之溶液或懸浮液通常包括以下組份中之一或多者：無菌稀釋劑，諸如注射用水、鹽水溶液、不揮發性/由、I乙一醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌劑’諸如苄醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如〇抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸；緩衝劑，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；及用於調節張力之藥劑，諸如氣化鈉或右旋糖。pH值可經諸如鹽酸或氫氧化鈉之酸或驗調節。該等製劑可封裝於由玻璃或塑膠製成之安瓶、拋棄式注射器或多次劑量小瓶中。適於注射之醫藥組合物包括無菌水溶液或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。對於靜脈内投藥而言，適當醫藥學上可接受之載劑包括生理鹽水、 © ㈣水、Crem_>r™ EL (BASF，Parsippany，NJ)或鱗酸鹽緩衝鹽水（PBS)。在所有情況下，組合物須無菌且應在存在易於注射性之程度上為流體。醫藥學上可接受之載劑須在製造及儲存條件下穩定且須經保存抵抗微生物（諸如細菌及真菌）之污染作用。載劑可為含有（例如）水乙醇、多元醇（例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及其類似物）及其適當混合物之溶劑或分散介質。可(例如)藉由使用包衣(諸如印填脂）、在分散液情況下藉由保持所需粒徑及藉由使 135384.doc -108 - 200934510 用界面活性劑來保持適當流動性。可由例如對氧苯甲酸酯、氣丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞及其類似物之各種抗菌劑及抗真菌劑來實現對微生物作用之預防。在多數情況下，較佳於組合物中包括等張劑，例如糖、多元醇如甘露糖醇、山梨糖醇）及氯化鈉。可藉由在組合物中包括延遲吸收之藥劑（例如單硬脂酸鋁及明膠）來實現可注射性組合物之延長吸收。當藉由（例如）靜脈内、經皮或皮下注射投予治療有效量 e 之本發明之抗體或抗原結合蛋白時，結合劑將呈無熱原質、非經腸可接受之水溶液形式。與pH值、等張性、穩定性及其類似因素具有適當相關性之該等非經腸可接受之蛋白質溶液的製備在此項技術之技能範圍内。除結合劑之外’用於靜脈内、經皮或皮下注射之較佳醫藥組合物亦應含有等張媒劑，諸如氣化鈉注射液、林格氏注射液 (Ringer’s injection)、右旋糖注射液、右旋糖及氣化鈉注射液、乳酸化林格氏注射液或如在此項技術中已知之其他媒〇劑。本發明之醫藥組合物亦可含有穩定劑、防腐劑、緩衝劑、抗氧化劑或熟習此項技術者已知之其他添加劑。本發明之醫藥組合物中本發明拮抗劑之量將視所治療病狀之性質及嚴重程度及患者所經歷之先前治療的性質而定。最終’主治醫師將決定治療各個別患者之拮抗劑的量。最初，主治醫師投予低劑量之拮抗劑且觀測患者反應。可投予較大劑量之拮抗劑直至患者獲得最佳治療作用，且在彼點通常不進一步增加劑量。預期用以實施本發 135384.doc 200934510 明之方法的各種醫藥組合物應含有每公斤體重約〇 ι叫至 50 Mg拮抗劑。使用本發明之醫藥組合物的療法之持續時間將視所治療疾病之嚴重程度及各個別患者之情況及潛在特殊反應而改變。預期拮抗劑之各應用的持續時間將經由（例皮下途徑且在（例如）每週一次範圍内。最終，主治醫師將決定使用本發明之醫藥組合物的療法之適當持續時間。經口組合物通常包括惰性稀釋劑或可食用載劑。可將其〇封裝於明膠膠囊令或錢成鍵劍。出於經口治療投藥之目的，本發明之拮抗劑（例如抗體或抗原結合蛋白、小分子等）可併有賦形劑且以錠劑或膠囊形式使用。可包括醫藥學上可相容之黏結劑及/或佐劑物質作為組合物之部分。、旋劑、丸劑、膠囊及其類似物可含有以下成份或具有類似性質之化合物中之任一者：黏合劑，諸如微晶纖維素、黃笑膠或明膠；賦形劑，諸如澱粉或乳糖；崩解劑，諸如褐藻酸、Prim〇gelTM或玉米澱粉；潤滑劑，諸如硬脂酸鎂或 © 助流劑，諸如膠狀二氧切；甜味劑，諸如薦糖或糖精；或調味劑，諸如胡椒薄荷、水楊酸甲輯或燈味調味劑。當經口投予治療有效量之本發明之醫藥組合物(例如對 GDF8具特異性之拮抗劑）時，結合劑將呈錢劑 '膠囊、散劑、溶液或酏劑之形式。當以錠劑形式投予時本發明醫藥組合物可另外含有諸如明膠之固體載劑或佐劑。= 劑、膠囊及散劑含有約5至95%之結合劑且較佳約^至卿❶ 1353S4.doc -110- 200934510 之結合劑。“χ液體形式投予時，可添加諸如水石由動物或植物來源之油（諸如花生油、碟物油、大豆油或— 麻油)或合成油之液體載劑(考慮個別患者及/或大量個趙：該等液雜載劑之過敏性後）。㈣形式之醫藥組合物可^ 一步含有生理鹽水溶液、右旋糖或其他聽溶液，或諸如乙二醉、丙二醇或聚乙二醇之二醇。當以液趙形式投予時，醫藥組合物含有約〇.5至90重量％之結合劑且較佳約1 50%之結合劑。 ❹

對於藉由吸入投藥而言，以來自含有例如氣體（諸如二氧化碳）的適當推進劑之加壓容器或分配器或霧化器之氣溶膠喷霧形式傳遞本發明之拮抗劑。因此，可藉由吸入至肺部組織投予本文所述之化合物4本文中所用除非另外指示，否則術語，，肺部組織”係指呼吸道之任括上呼吸道及下啤吸道。可與—或多種用於治療肺部疾病之現有形式組合投予特異性GDF8拮抗劑。在投藥之一實例中，化合物經調配以供霧化器用。在一實施例中，化合物可以凍乾形式（例如在室溫下）儲存且在吸入前重構於溶液中。亦可能調配化合物以供使用醫療裝置（例如吸入器（參見例如美國專利第6，102,〇35號（粉末吸入器）及第6,〇12,454號 (乾粉吸入器））吸入。吸入器可包括用於在適於儲存之ρΗ 值下的活性化合物之獨立隔室及用於中和緩衝液之另一隔室及用於在霧化前不久組合該化合物與中和緩衝液之機構°在一實施例中，吸入器為計量劑量吸入器。 135384.doc -111- 200934510 一儘管不必，但可使用諸如界面活性劑之傳遞增強劑來進一步増強肺部傳遞。如本文中所用，”界面活性劑"係指具有藉由與兩個不混溶相之間的界面相互作用促進藥物吸收之親水欧及親脂性部分之化合物。出於例如降低顆粒聚結性、降低巨嗤細胞吞嗔作用等之多種原因，界面活性劑適用於乾燥顆粒。由於諸如DPPC之界面活性劑將極大地促進化合物之擴散，因此當與肺界面活性劑偶合時可實現化口物之更有效吸收。界面活性劑為在此項技術中所熟 ❹知，且包括（但*限於）麟酸甘油8旨，例如鱗脂酿膽鹼、’L 雙棕櫚醯-α-磷脂醯膽鹼（DPPC)及雙磷脂醯甘油（DppG); 十六醇；脂肪酸；聚乙二醇（PEG);聚氧化乙烯_9 ;月桂基醚，棕櫚酸；油酸；脫水山梨糖醇三油酸酯（Span 85); 甘膽酸鹽；表面活性素（surfactin);泊洛沙姆（p〇丨脫水山梨糖醇脂肪酸酯；脫水山梨糖醇三油酸酯；泰洛沙泊（tyloxapol)及碌脂。亦可藉由經黏膜或經皮方式來全身性投藥。舉例而言，〇在包含Fc部分之抗體情況下，組合物可能夠經由FcRn受體介導之途徑跨黏膜（例如腸、口或肺）傳輸（例如美國專利第 6,030,613號）。通常，可例如經由使用含片、經鼻噴霧劑、吸入劑或栓劑實現經黏膜投藥。對於經皮投藥而言’ 如在此項技術中通常已知，可將活性化合物調配成軟膏劑、藥膏、凝膠、貼片或乳膏劑。對於經黏膜或經皮投藥而言，在調配物中使用適於待滲透之障壁的滲透劑。該等滲透劑通常在此項技術中已知且包括（例如）清潔劑、膽汁 135384.doc 112 200934510 鹽及梭鏈抱酸（fusidicacid)衍生物。醫藥組合物亦可由適於基因療法之組合物’亦即包含本文中所揭示的聚核苷酸之組合物組成。在基因療法之情況下’醫藥學上可接受之載劑可包括（例如）脂質、膠原球體、陽離子型乳液系統、水、鹽水緩衝液、病毒載體、乳糜微粒殘餘物、聚合物奈米顆粒（例如明膠-DNA或殼聚糖_ DNA)、金顆粒、聚合物錯合物、脂質複合物（lip〇plex)、聚合複合物（polyplex)等（參見例如Gardlik等人（2005) Med. ❹ Sci. Monit. 11(4):RA110-21)。穩定化及保留在一實施例中’特異性GDF8拮抗劑與在循環中（例如在血液、血清、淋巴、支氣管肺或支氣管肺泡灌洗液或其他組織中）將其穩定化及/或保留提高至少丨5、2、5、10或50 倍之部分物理締合。可用將防止自身體快速消除的載劑製備本發明所揭示之本發明之拮抗劑，諸如控釋調配物，包括植入物及微囊封〇傳遞系統。可使用諸如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酿及聚乳酸之生物可降解、生物相容性聚合物。製備該等調配物之方法對熟習此項技術者將顯而易見。亦可將含有本發明所揭示之拮抗劑的脂質懸浮液用作醫藥學上可接受之載劑。可根據熟習此項技術者已知之方法製備此等載劑。舉例而言’可使特異性GDF8拮抗劑與聚合物締合，該聚合物例如實質上非抗原性聚合物，諸如聚環氧烷或聚環 135384.doc •113- 200934510 氧乙烧。適當聚合物之重量將實質上改變。可使用具有介於約200至約35,000(或約1，〇〇〇至約15,〇〇〇，或約2,〇〇〇至約 12,500)範圍内之數目平均分子量之聚合物。舉例而言，可使特異性GDF8拮抗劑與水溶性聚合物共扼，例如親水性聚乙浠聚合物，例如聚乙烯醇及聚乙烯〇比咯啶酮。該等聚合物之非限制性清單包括聚環氧烷均聚物’諸如聚乙二醇（PEG)或聚丙二醇，聚氧乙烯化多元醇、其共聚物及其嵌段共聚物，其限制條件為保持嵌段共〇聚物之水溶性。其他適用聚合物包括聚氧伸烷基，諸如聚氧乙稀、聚氧丙稀及聚氧乙稀與聚氧丙稀之飯段共聚物 (泊洛尼克（Pluronics));聚甲基丙烯酸酯；卡波姆 (carbomer);分枝或未分枝多醣，其包含醣單體〇甘露糖、D-半乳糖及L-半乳糖、海藻糖、果糖、D_木糖、^阿拉伯糖、D-葡糖醛酸、唾液酸、D_半乳糖醛酸、D_甘露糖醛酸（例如聚甘露糖醛酸或褐藻酸）、D_葡糖胺、D_半乳糖胺、D-葡萄糖及神經胺酸，包括均多醣及雜多醣，諸如乳〇糖、支鏈澱粉、澱粉、羥乙基澱粉、直鏈澱粉、硫酸葡聚糖、葡聚糖、糊精、糖原或酸性黏多醣之多醣亞單元，例 >玻㈣li 合物’諸如聚山梨糖醇及聚甘露糖醇；肝素；等·》亦可將其他化合物連接至相同聚合物，該等其他化合物例如細胞毒素、標記或另一靶向劑，例如另一gdf8拮抗劑或無關配位體。可使用例如單甲氧基封端之聚乙二醇 (mPEG)的單活化、烧氧基封端之聚環氧垸（ρΑ〇)、^樣 135384.doc -114- 200934510 基封端之聚合物及雙活化聚環氧乙烷（二醇）以供交聯（參見例如美國專利第5,951，974號）。在一實施例中，與配位體交聯之前聚合物不必（但較佳）為水溶性的。通常，交聯後，產物為水溶性的，例如展現至少約0.01 mg/ml且更佳至少約OJ mg/ml且更佳至少約！ mg/ml之水溶性。另外，聚合物呈共軛物形式時不應具有兩度免疫原性，亦不應具有與靜脈内輸液、氣溶膠化或注射不相容之黏度，若共輛物意欲藉由該等途徑投予。 © 在一實施例中，聚合物僅含有單一反應性基團。此有助於避免配位體分子彼此交聯。然而，最大化降低配位體分子之間的交聯之反應條件或經由凝膠過濾或離子交換層析法純化反應產物以回收實質上均質之衍生物在本文之範疇内。在其他實施例中，出於使多個配位體與聚合物主鏈鍵聯之目的，聚合物含有兩個或兩個以上反應性基團。再次’可使用凝膠過濾或離子交換層析法回收呈實質上均質形式之所需衍生物。 d 聚合物之分子量可在至多約5〇〇〇〇() D之範圍内，且較佳為至少約20,000 D或至少約3〇,〇〇〇 D或至少約40,000 D。所選分子量可視待獲得之共輥物之有效大小、聚合物之性質（例如結構，諸如線性或分枝）及衍生度而定。可使用共價鍵將特異性GDF8拮抗劑與聚合物連接，例如’與配位體之N末端胺基及配位體之離胺酸殘基上存在之ε胺基，以及其他胺基、亞胺基、羧基、硫氫基、羥基或其他親水性基團交聯。可在不使用多官能（通常雙官能） I35384.doc -115, 200934510 交聯劑之情況下，使聚合物與GDF8拮抗劑直接共價鍵結。藉由基於三聚氣化氰、羰基二咪唑及醛反應性基團 (PEG醇鹽加上溴乙醛之二乙基乙醯基，PEG加上DMSO及乙酸酐，或PEG氣化物加上4-羥基苯甲醛之酚鹽、經活化丁二醯亞胺基酯、經活化二硫代碳酸酯PEG、氣曱酸 2,4,5-三氯苯酯或氯甲酸對硝基苯酯活化之PEG)之已知化學作用實現與胺基之共價結合。可藉由使用碳化二醯亞胺偶合PEG胺使羧基衍生化。可藉由與經順丁烯二醯亞胺基 Q 取代之PEG(例如烷氧基-PEG胺加上4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基）環己烷-1-甲酸磺基丁二醯亞胺酯（參見WO 97/10847) 或PEG-順丁烯二醯亞胺）使硫氫基衍生化。或者，（例如）如 Pedley 等人（1994) Br. J. Cancer 70:1 126-30 中所述，配位體上之游離胺基（例如離胺酸殘基上之ε胺基）可用2-亞胺基-硫雑環戊烷（Traut試劑）硫醇化且隨後與含有順丁烯二醯亞胺之PEG衍生物偶合。可利用（例如）來自 Shearwater Polymers，Inc. (Huntsville, © AL)之可與GDF8拮抗劑連接之官能化PEG聚合物。該等市售PEG衍生物包括（例如）胺基-PEG、PEG胺基酸酯、PEG-醯肼、PEG-硫醇、PEG-丁二酸酯、羧曱基化PEG、PEG-丙酸、PEG胺基酸、PEG 丁二酸丁二酿亞胺醋、PEG丙酸丁二醯亞胺酯、羧甲基化PEG之丁二醢亞胺酯、PEG之碳酸丁二醯亞胺酯、胺基酸PEG之丁二醯亞胺酯、PEG-氧羰基咪唑、PEG-碳酸硝基苯酯、PEG三氟乙磺酸酯、PEG-縮水甘油基醚、PEG-醛、PEG乙烯基砜、PEG-順丁烯二醯亞 135384.doc -116- 200934510 胺、PEG-鄰吡啶基·二疏化物、雜官能peg、PEG乙烯基衍生物、PEG矽烷及PEG磷脂。使此等PEG衍生物偶合之反應條件可視特異性GDF8拮抗劑、所需聚乙二醇化程度及所用PEG衍生物而改變。一些牵涉於peg衍生物之選擇中的因素包括：所需連接點（諸如離胺酸或半胱胺酸尺_基團）、衍生物之水解穩定性及反應性、鍵聯之穩定性、毒性及抗原性、分析適用性等。可自製造商獲得使用任何特定衍生物之特定用法說明。 Ο 可（例如）藉由凝膠過遽或離子交換層析法或例如HPLC之其他層析形式將GDF8拮抗劑與聚合物之共輛物與未反應起始物質分離。以相同方式自彼此純化共軛物之異源物質。歸因於未反應胺基酸之離子特性之差異，不同物質 (例如含有一或兩個PEG殘基）之拆分亦為可能的（參見例如 WO 96/34015)。預期本發明之聚核苷酸及蛋白質展現一或多種本文中鑑別之用途或生物活性（包括彼等與下文引用之檢定相關 ❹ 者）。可藉由投予或使用該等蛋白質，或藉由投予或使用編碼該等蛋白質之聚核苷酸（諸如，在基因療法或適於引入DNA之載體令），提供對於本發明之蛋白質所述的用途或活性。可有利地以便於投藥及劑量均一性之單位劑型調配經口或非經腸組合物。如本文中所用之單位劑型係指適合作為用於欲治療之受檢者的單位劑量之物理離散單位，各單位含有經計算與所需醫藥載劑相關聯產生所需治療作用之預定量 135384.doc -117- 200934510 之活性化合物。藉由且直接取決於活性化合物之獨特特^、待實現之特定治療作用及調配該活性化合物以供治療個體之技術中固有的限制，規定本發明之單位劑型的規格。

因此，本發明之另一態樣係關於例如在存在或不存在其他m療化合物之情況下，用於進行本發明之GDF8拮抗劑的投予之套組，或用於使用01)178拮抗劑作為測定生物樣品中GDF8之存在及/或含量的研究或治療手段之套組，諸如ELISA套組。在一實施例中，該套組包含一或多種經調配於醫藥載劑中之抗GDF8拮抗劑及至少一種適當時調配於一或多種獨立醫藥製劑中之藥劑（例如治療劑）。闡明以下實例以幫助理解本發明，但並不欲且不應解釋為以任何方式限制本發明之範疇。實例並不包括對習知方法之詳細描述，該等習知方法諸如融合瘤形成、ELISA、增殖檢定、流式細胞儀分析及重組DNA技術。該等方法為一般技術者所熟知。本申請案中所引用的所有參考文獻、專利、公開專利申明案及其他專利文件之全部内容係以引用的方式併入本文中。藉由以下實例進一步說明及支持本發明。然而，此等實例決不應視為進一步限制本發明之範疇。相反地，一般技術者將易於瞭解，在不悖離本發明之精神及/或隨附申請專利範圍的範疇之情況下，存在本發明之其他實施例、改進及等效物。實例 135384.doc -118- 200934510 實例1 :產生融合瘤細胞且分離RK22抗GDF8抗體藉由以傳氏完全佐劑（Freund’s complete adjuvant)及如 Lee及 McPherron (1999) Curr. Opin. Genet. Dev. 9:604-07 中所述由CHO細胞條件培養基純化之20 pg重組GDF8二聚體皮下注射使GDF8(肌肉抑制素）基因剔除小鼠（McPherron 等人（1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:12457-61)免疫。以2週間隔給予若干次相同量之GDF8及傳氏不完全輔劑的加強注射。給予最終2 pg PBS之尾靜脈之靜脈内注 Q 射，隨後自小鼠分離脾細胞，顯示高抗GDF8抗體力價° 使經分離之脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞（ATCC寄存編號 P3X63.Ag8.65 3)融合。10-14天後，收集來自融合瘤之上清液且藉由ELISA測試其抗GDF8抗體含量，參見實例2。為確保單株性，藉由重複限制稀釋選殖經選擇用於進一步研究之融合瘤。以實例2所述之檢定測試來自抗GDF8表現融合瘤之上清液及/或使用在此項技術中熟知之標準親和力層析方法由 © 該上清液純化的抗體之特異性。最初測試與GDF8之結合的十三個純系中，在其中選擇RK22以供進一步分析。實例2 : RK22抗體與GDF8特異性相互作用實例2·1 :在ELISA檢定中RK22對GDF8具有比對BMP11高之親和力使用應用GDF8或BMP11之標準ELISA技術來測定RK22 與GDF8結合之特異性，亦即確定抗體對GDF8是否顯示比 BMP11高之親和力。如先前在美國專利公開申請案第 135384.doc • 119- 200934510 2004/0142382號中所揭示，純化且表徵重組人類GDF8(成熟GDF8及GDF8前肽）及BMP11蛋白。將GDF8潛伏複合物及BMP11潛伏複合物在冰上以20莫耳£2-1丨1^8111£〇-：^118-Biotin(Pierce，Rockford，IL，目錄號 21217)比 1 莫耳複合物之比率各自單獨生物素化2小時。藉由使用0.5% TFA降低 pH值而終止反應，且使經生物素化複合物經受C4 Jupiter 25〇χ4·6 mm 管柱（Phenomenex，Torrance，CA)層析以分離成熟蛋白質（例如，自GDF8前肽分離成熟GDF8，或自BMP11 © 前肽分離成熟BMP11)。彙集、濃縮且藉由MicroBCATM蛋白質檢定試劑套組（Pierce, Rockford, IL，目錄號23235)定量以TFA/CH3CN梯度溶離的成熟生物素化GDF8或成熟生物素化BMP11之溶離份。以0.5 pg/ml生物素化GDF8或生物素化BMP11將96孔微量滴定板（以於PBS中之5 pg/ml抗生蛋白鏈菌素在4°C下預塗隔夜）在室溫下塗佈1小時。藉由以含有0. l%(v/v)Tween 20之PBS(PBST緩衝液）洗滌移除過量GDF8或BMP11。在室 ® 溫下，將檢定板在SuperBlockTM溶液（Pierce)中阻斷1小時’且隨後以PBS沖洗。將經GDF8或BMP11塗佈之檢定板在室溫下與100 μΐ自RK22融合瘤收集之預阻斷上清液或各種濃度之經純化RK22抗體一起培育1小時。為控制非特異性結合’使用已展示結合且抑制GDF8與ΒΜΡ11兩者之 RK35抗體（參見美國專利申請案第60/709,704號，據此以引用的方式全部併入本文中）以及已證明不結合GDF8或 BMP 11之不相關抗體（Irr. Ab)，且亦單獨測試對照介質。 135384.doc -120· 200934510 藉由3次PBST洗滌接著3次PBS洗滌移除未結合抗體。將50 μΐ山羊抗小鼠IgG HRP共軛物之1:5000稀釋液添加至各扎中。將檢定板在室溫下培育1小時。將各檢定板以PBST洗滌3次且隨後以PBS洗滌3次，且對於顯色反應藉由添加 TMB(四曱基聯苯胺）試劑顯影。藉由添加100 μΐ 0·18 Μ H2S04終止顯色反應。使用微量滴定板讀取器藉由讀取各孔在450 nm下之光學密度量測所產生之信號。如圖1A及1B中所示，與自對照抗體RK35分離之上清液 0 相比，來自RK22融合瘤之上清液對GDF8比對BMP11具有更強之結合。藉由證明此等抗體對GDF8之較高親和力不具劑量依賴性，證實RK22對GDF8之較高親和力的均一性。如圖1A及B中可見，在各濃度下測試之RK22抗體證明對GDF8比對BMP11更強之結合。RK22展示與BMP11微乎其微之結合，而相反，RK35對照抗體與GDF8與BMP11兩者結合。實例2.2 : RK22對GDF8之結合親和力 © 使用BIAcore電漿共振技術定量分析RK22抗體與GDF-8 之分子動力學相互作用且獲得表觀動力學速率常數。在此等研究中，量測可溶性抗體與固相結合GDF_8之結合。使用生物素化GDF-8(bio-GDF-8)控制經固定GDF-8於生物感測器表面上之表面定向，將該bio-GDF-8固定於抗生蛋白鏈菌素生物感測器晶片上，接著以三重複應用各種濃度之抗體且以時間之函數形式量測結合。自該等量測獲得表觀解離（Kd)與結合（Ka)速率常數，且將其用於計算相互作用 135384.doc -121 - 200934510 之結合親合力常數（Kd) »藉由使用BIAcore在部分傳質限制 (partial mass transport limitation)下，藉由塗佈高表面密度且以不同流速注射抗體，量測能夠與固定於晶片上的bio-GDF-8結合之抗體的分率，測定定義為具有生物學功能的抗體之分率的RK22之有效濃度。使用應用biaevaluation軟體第3·0.2版之整體擬合同時計算各濃度之抗體的結合與解離速率。自 BIAcore ΑΒ，Uppsala, Sweden 獲得 BIAcore 2000 系 0 統、感測器晶片 SA(BR-1000-32)、HBS/EP緩衝液（0.01 Μ HEPES pH.7.4' 0.15 M NaCl ' 3.0 mM EDTAA0.005%^ 山梨醇酯20(v/v)、N-羥基丁二醯亞胺（NHS-EP))。純化人類 bio-GDF8(Lot 25251-15)。在水中製備 0.1% TFA(v/v) (81§11^)。使用81八6乂&1113^〇11軟體第3.0.2版分析來自抗體-抗原相互作用之動力學測定的實驗資料。為製備bio-GDF8表面，在感測器表面上保持HBS/EP緩衝液之連續流。以3次注射（各1分鐘）含有1 M NaCl及25 〇 mM NaOH之溶液來調節感測器表面上之抗生蛋白鏈菌素。對於高密度塗佈（>2000 RU)，將bio-GDF8在HBS/EP 緩衝液中稀釋至1 pg/ml且藉由流經抗生蛋白鏈菌素晶片固定於其上。對於低密度塗佈（20-60 RU)，將GDF-8進一步稀釋至0.1 pg/rnl且根據所要求密度改變所注射bio-GDF-8 之體積。將流動單元上之抗生蛋白鏈菌素表面用作參考表面。作為對照，將第一流動單元用作參考表面以校準整體折射率、基質效應及非特異性結合，以捕獲分子塗佈第 135384.doc -122- 200934510 二、第三及第四流動單元。使用BIAcore在部分傳質限制下分析能夠與固定於晶片上之bio-GDF-8結合之RK22抗體的分率。在此實驗中，以 2、10、30、50 及 100 μΐ/min 之流速注射 200 nM 及 100 nM(基於OD 280量測之濃度）之抗GDF-8抗體。由於斜率隨流速增加而增加，故可藉由目測感測器圖譜偵測傳質限制。使用5 μΐ 0.1% TFA再生生物感測器表面。將RK22抗GDF-8抗體稀釋於HBS-EP緩衝液（Biacore ΑΒ) Q 中，以30 μΐ/min之流速將等分試樣注射於經固定bio-GDF-8上，注射3分鐘後，在BIAcore緩衝液中在相同流速下監測解離10分鐘。所注射抗體之濃度為300、150、75、 37·5、18.7、9.3、4.6、2.3及0 nM;以三重複進行各注射。使用加倍參考扣除各感測器圖譜之空白及緩衝作用。在下一樣品HBS-EP單獨之注射液流經各單元之前，使用5 μΐ 0.1% TFA再生生物感測器表面。以代表RK22之結合質量的共振單位（RU)量測反應。 ® 使用81入6¥&1仙1^〇11軟體3.0.2分析動力學資料。假定二價分析物（Α)與單價配位體（Β)結合。A+B=AB Kal*Kdl ; AB+B=AB2 Ka2*Kd2 ;且單價分析物（A)與單價配位體（B) 結合A+B=AB Kal*Kdl。由感測器圖譜之適當區域計算表觀解離（kd)及結合（ka)速率常數。藉由下式由動力學速率常數計算抗體與GDF8之間相互作用的結合親合力常數：Kd= kd/ka。如在圖2中可見，RK22在三個實驗中顯示平均7 nM iKd 值。 135384.doc -123- 200934510 實例3 : RK22在活體外及活體内抑制GDF8信號傳輸實例3.1 :在細胞基報導基因檢定中使用RK22抑制經純化重組人類GDF-8之生物活性為在活體外細胞基檢定中證明GDF-8之活性，使用表現螢光素酶之報導體載艎PGL3(CAGA)12在TGF-β誘導型啟動子控制下發展報導基因檢定（RGA)。CAGA序列先前經報導為TGF-β誘導型基因PAI-1之啟動子内的TGF-β反應性序列（hies S等人2001)。使用鹼性螢光素酶報導體質體 ❹ pGL3(Promega，Madison，WI)製備含有12個CAGA盒之報導體載體。將來自腺病毒主要晚期啟動子（-35/+10)之TATA 盒及轉錄啟始位點插入Bglll與Hindlll位點之間。將含有 12個CAGA盒AGCCAGACA重複之募核苷酸黏接且選殖入 Xhol位點中。使用FuGENE 6轉染試劑（Boehringer Manheim，Germany)以pGL3(CAGA)12瞬時轉染人類橫紋肌肉瘤細胞株A204(ATCC HTB-82)。轉染後，在96孔板上於補充有2 mM麩胺醯胺、100 U/ml鏈黴素、100 pg/ml青黴 ® 素及10%胎牛血清的McCoy氏5A培養基中將細胞培養16小時。接著在37°C下，在具有麩胺醯胺、鏈黴素、青黴素及 1 mg/mL牛金清白蛋白的McCoy氏5 A培養基中以或不以1 0 ng/ml GDF-8處理細胞6小時。使用螢光素酶檢定系統 (Promega)定量所處理細胞中之螢光素酶。使用1〇 ng/ml BMP-11重複檢定》為測試RK22之抑制活性，以RK22抗體將GDF-8在室溫下預培育1小時。接著，將此混合物添加至經轉染細胞中 135384.doc -124- 200934510 且在37°C下培育6小時。使用螢光素酶檢定系統（Promega) 定量螢光素酶。使用相同方案量測RK22阻斷BMP-11活性之能力。如圖3中所見，當細胞未經處理（bkgd)或經10 ng/ml GDF8在RK22不存在或存在情況下處理時，誘導出 pGL3(CAGA)12報導體活性作為LCPS。此等抗體中之每一者以劑量反應性方式降低至少一種GDF8活性，亦即GDF8 介導之螢光素酶誘導，對於RK22而言IC50值為0.4 nM。對〇照抗體RK35具有0.2 nm之IC50值，且不相關抗體具有大於 100 nM之IC50值。儘管RK22抑制GDF8介導之信號傳輸，但此等抗體並不顯著抑制BMP11之生物活性；RK22抑制 BMP1 1活性之IC50值分別為不可偵測、30 nM及>100 nM。此等資料證明RK22以與非特異性抗體RK35類似之程度活體外特異性抑制GDF8信號傳輸。實例3.2 : RK22活體内抑制GDF8活性為確定RK22抗體是否在活體内拮抗GDF8活性，選擇 © RK22作為用於在成年SCID小鼠中進一步測試之代表性抗體。SCID小鼠患有嚴重組合免疫缺乏症，且因此在注射諸如RK22之抗體後並不產生免疫反應。將RK22注射至SCID 小鼠中歷經4週之時間。投予三種劑量之RK22 :每週1 mg/kg、每週 10 mg/kg及每週 40 mg/kg。將以 1 0每週 mg/kg 之劑量投予的Myo-29用作陽性對照且與所投予之不同濃度的RK22相比較。將肌肉質量用作以RK22處理之小鼠的GDF8活性之指 135384.doc -125 - 200934510 標。移除三個不同肌肉群腓腸肌、脛骨前肌及股四頭肌，且測定肌肉重量。如圖4中所示，rk22在每週10 mg/kg之劑量下顯著增加肌肉質量。與陽性對照Myo29相比，在每週10 mg/kg之RK22與Myo29中肌肉質量均增加約1〇%。實例4 :對RK22結合部位之表徵實例4.1 :對RK22抑制GDF8與ActRIIB結合之評估為確定RK22抗體是否能夠藉由防止GDF8結合其ActRIIB 受體來拮抗GDF8活性，以ActllRB結合檢定（例如中和檢〇定）測試抗體。在96孔微量滴定板檢定中篩選經純化RK22 抗體抑制生物素化GDF8與固定於塑膠上之ActRIIB融合蛋白結合的能力。在4°C下，將重組ActRIIB-Fc嵌合體（R & D Systems，Minneapolis, MN，目錄號 339-RB/CF)以於 0.2 Μ 碳酸鈉緩衝液中1 pg/ml塗佈於96孔平底檢定板（Costar, NY，目錄號3590)上隔夜。接著，以1 mg/mL牛血清白蛋白阻斷檢定板且按照標準ELISA方案加以洗滌。將20 mg/nl生物素化GDF8單獨或在室溫下用各種濃度之RK22預〇培育1小時之20 mg/nl生物素化GDF8添加至經阻斷ELIS A 檢定板中。為如藉由IC50值所量測確立純系效力，添加抗體滴定。包括經不相關抗體或阻斷GDF8與ActllRB之結合的對照抗體預培育之生物素化GDF8作為對照。在室溫下1 小時後，洗滌除去經抗體阻斷之蛋白質複合物，且在時間解析螢光（TRF)檢定中使用DELFIATM試劑套組 (PerkinElmer LifeSciences，Boston，MA)以經銪標記之抗生蛋白鏈菌素偵測與檢定板結合ActllRB結合之GDF8的量。 135384.doc -126- 200934510

ActRIIB中和檢定之結果係展示於圖5中。因此，儘管 RK22抗體有可能藉由抑制GDF8與ActRIIB結合之能力而抑制GDF8信號傳輸，但更可能包括另一機制。實例4.2 : RK22與GDF8特異性抗原決定基結合儘管GDF8與BMP11緊密相關，但RK22對GDF8具特異性。因此，假定由此等抗體所識別之抗原決定基對GDF8 亦具特異性，且因此GDF8特異性抗原決定基可用作拮抗劑（例如作為肽模擬劑）以特異性抑制GDF8信號傳輸及/或 © 篩選或製備GDF8特異性拮抗劑。為確定由抗體RK22所識別之GDF8抗原決定基，使用點合成技術直接在纖維素紙上合成呈現闡明為SEQ ID ΝΟ:1 之成熟GDF8的整個序列之48個重疊13殘基肽（Molina等人 (1996) Peptide Res. 9:151-55; Frank等人（1992) Tetrahedron 48:9217-3 2)。肽之重疊為11個胺基酸。在此陣列中，半胱胺酸殘基經絲胺酸置換以降低由半胱胺酸之存在所引起的化學複雜性。自Abimed(Lagenfeld，Germany)購得經 © 聚乙二酵及Fmoc保護之胺基酸改質的纖維素膜。藉由偶合β-丙胺酸間隔劑將陣列界定於膜上，且如先前所述使用標準DIC(二異丙基羰化二醯亞胺）/HOBt(羥基苯并三唑）偶合化學作用合成肽（前述Molina等人；前述Frank等人）。使用Abimed ASP 222自動儀點潰經活化胺基酸。手動進行洗滌及去保護步驟且在最終合成循環後使肽經N末端乙醯化。肽合成後，將膜在曱醇中洗滌10 min且在阻斷劑 135384.doc -127- 200934510 (TBST(具有 0.1%(v/v)TweenTM 20 之 Tris-缓衝鹽水）及 l°/〇(w/v)酪蛋白）中洗滌10 min。接著，在輕緩震盪下，將膜以於阻斷劑中之2.5 pg/ml RK22抗GDF8抗體培育1小時。以阻斷劑洗滌3次歷時10分鐘後，將膜以經HRP標記之二級抗體（於阻斷劑中0.25 pg/ml)培育30 min。接著，將膜每次以阻斷劑洗滌3次歷時10分鐘，且每次以TBST洗滌 2次歷時10分鐘。使用SUPERSIGNALTM西方試劑（Pierce) 及數位攝像機（Alphananotech Fluoromager)觀測已結合抗 © 體。墨點係展示於圖6中且結果概述於表4中。墨點證明 RK22與具有選自由以下各序列組成之群的胺基酸序列及/ 或基本上由該胺基酸序列組成之GDF8抗原決定基結合： DFGLDS (SEQ ID NO:4) ' FEAFGWDWIIAPKRY (SEQ ID NO:6) ' FVFLQKYPHTLVHQ (SEQ ID NO:8) ' SSGESEFVF (SEQ ID NO:10) > WIIAPKRYKANYSSGESEFVFLQKY (SEQ ID NO: 11)及其潛在子序列《詳言之，RK22之抗原決定基定位至推測與GDF8第一型受體（ALK4/ALK5)相互作用之 ❹ GDF8區域。表4 由小鼠單株抗體結合之人類GDF8的大致區域 RK22 抗原決定基區域 N末端及第一型受體識別區域與SEQIDNO:l之胺基酸相互作用（大致） 1-6; 24-38; 49-63 實例5 : RK22之人化 135384.doc -128- 200934510 實例5.1 :抗體定序自產生RK22抗體之融合瘤細胞選殖編碼^〖22之可變重鏈（VH)及可變輕鏈（VL)基因且隨後測定胺基酸序列。將此等序列作為SEQ ID NO: 14及16列於表1中。實例5.2:生殖系化RK22抗體使用抗體之序列資料來鑑別RK22之重鏈及輕鏈之最接近生殖系序列’例如DP-5及DP-7與RK22 VH分別顯示約 65%及71%—致性（圖7);而DPK 24與RK22 VL顯示約78〇/〇 Ο 一致性（圖8)。.使用標準定點突變誘發技術以適當突變誘發引子進行適當突變。由序列分析證實序列及抗體之突變。根據說明書中;所引用之參考文獻的教示内容最徹底理解說明書，據此將所有參考文獻以引用的方式全部併入本文中。本說明書内之實施例提供對本發明實施例之說明且不應解釋為限制本發明之範疇。熟習此項技術者將認識到所主張發明包涵許多其他實施例。實例6 :用於定量及偵測GDF8之夾層免疫檢定格式使用來自Pierce之EZ Link Sulfo-LC生物素化套組，將以下實例中所述之各抗體生物素化。自先前研究確定過量4〇倍之NHS-生物素最適合使此等兩種抗體生物素化β使用莫耳數過量40倍之生物素將400 各抗體生物素化。此使得每毫莫耳抗體吸收約3至5毫莫耳生物素。生物素化後，在4°C下，所有抗體於PBS中透析隔夜，且藉由bca測定總蛋白質濃度。為測定生物素吸收莫耳比，將生物素化抗體之溶液添加至2-(4，-羥基偶氮苯）苯甲酸（HABA)與抗生物素 135384.doc -129- 200934510 蛋白之混合物中。由於其對抗生物素蛋白之具較高親和力，因此生物素藉由與抗生物素蛋白相互作用而置換 HABA，且在500 nm下之吸光率成比例地降低。可在添加生物素化樣品之前與之後量測HABA-抗生物素蛋白溶液之吸光率，定量與抗體共軛的生物素之量。吸光率之改變與抗體中之生物素吸收量相關。另外，如下所述之研究中所用的血清沒有内源性 GDF8。使用固定於經溴化氰活化之瓊脂糖珠粒上的1 mg Ο MYO-029單株抗體製備用於消耗GDF-8血清之親和性管柱。以0.1 Μ乙酸預洗滌管柱且以含有250 mM NaCI pH 7.2之PBS中和，隨後添加人類血清。由加熱至65°C使潛伏 GDF-8明顯活化，因此將血清預熱至65°C歷時1〇分鐘且隨後通過1 mg MYO-029抗GDF8親和性管柱3次，且在游離及總GDF-8檢定中檢查活性。最初使2.5 ml體積之血清經過管柱。開始測試後，加熱較大體積之血清（每份13 ml試樣）且藉由多次通過親和性管柱，耗盡GDF-8(其間使用0.1 © Μ洗滌管柱）。由此經耗盡之血清作為使用已知濃度的成熟 GDF-8產生標準曲線之基質。實例6.1抗體配對實驗：免疫檢定格式之比較：使用RK22 偵測劑捕捉RK3 5或使用RK3 5偵測劑捕捉RK22 在4°C下，將含在0.1 Μ硼酸鈉中之各抗GDF-8單株抗體分別塗佈於高結合性之96孔板（Immulon 4 ΗΒΧ)上隔夜，或在37°C下以1 pg/ml之濃度塗佈1小時。洗滌檢定檢定板且隨後以Pierce Superblock試劑阻斷10分鐘。將儲備液 135384.doc -130- 200934510 GDF-8(於0.1%三氟乙酸-TFA中，1.77 mg/ml)，在矽化塑膠管中，使用0.1%三氟乙酸（TFA)稀釋至10 pg/ml，再以已耗盡GDF8之人類血清稀釋至12.5 ng/ml至0_2 ng/ml範圍内之濃度，作為產生標準曲線之校準劑。使用檢定板之第 1-3行，以三重複進行標準曲線。在獨立預阻斷之96孔板中，各添加30 μΐ測試血清之等分試樣至含有120 μΐ之THST 緩衝液（最終濃度，20%血清；總體積150 μΐ)的6孔（用於三重複測定）中。進行總GDF-8檢定時，將80 μΐ此溶液轉移〇至96孔PCR板中且加熱至80°c歷時5分鐘。在冰上冷卻經加熱樣品，隨後添加至檢定板中。對於用於標準曲線之孔，將65 μΐ THST緩衝液添加至所有孔中，接著添加10 μΐ校準血清，以使最終體積為1〇〇 μΐ。自製備板將50 μΐ未加熱20%血清樣品移除且添加至檢定板中，最終血清濃度為1 〇%企清，總體積為1 〇〇 μΐ。將 5 0 μΐ 20%血清自經加熱板添加至第二檢定板中。在室溫下伴隨震盪培育此等第二檢定板。1.5小時後，洗滌檢定板 ® 且添加Superblock試劑，歷時5分鐘。在震盪情況下，將生物素化RK22或生物素化RK35以150 ng/ml添加至孔中，歷時1.5小時。洗滌檢定板且再次再阻斷，隨後在室溫下在震盪下添加100 μΐ超敏抗生蛋白鏈菌素-HRP( 1:20,000)稀釋液，歷時1小時。洗滌及再阻斷檢定板，隨後在室溫下在震盪下添加TMB受質歷時15分鐘。藉由添加0-5 M H2S04 終止反應且在Molecular Devices Spectramax檢定板讀取器上在450 nm下讀取。免疫檢定格式之比較：圖9A及9B中 135384.doc -131 - 200934510 可見RK35捕捉/RK22偵測劑或RK22捕捉/RK35偵測劑。如所示，任一格式均能夠偵測THST檢定緩衝液中或1 0%血清中介於100與10 pg/ml之間的GDF8。實例6.2血清對GDF-8檢定之影響先前結果表明視所分析血清樣品而定（資料未圖示），血清背景作用增加0.3 OD單位至約0.5 OD單位之範圍内的吸光率值。藉由以經RK22塗佈或未塗佈（對照）之HBX檢定板測試人類血清，確定信號增加之原因為HAMA作用（亦即人 © 類血清IgG與該檢定中所用之小鼠單株抗體之反應）（圖 10)。無單株抗體之檢定板展示信號未增加，表明背景增加並不歸因於血清與檢定板之非特異性結合，而取決於單株抗體之存在。所進行降低背景之數種嘗試均未成功，包括酸解離及添加過量來自各種物種的IgG來阻斷人類IgG至鼠類IgG之結合（資料未圖示）。市售試劑之添加經特異性設計以降低 HAMA檢定干擾。當添加至以下免疫檢定中時免疫球蛋白 ® 抑制試劑（II R)奏效。將稀釋於0.1 Μ硼酸鈉pH 8.5中之1 pg/ml RK35用作捕捉試劑。將MYO-029滴定於檢定板+/-血清+/-IIR以及250 pg/ml GDF8上且培育1.5小時。在THST 檢定緩衝液中以1:10,000稀釋度添加生物素化RK22且培育 1.5小時。在THST中按1:20,000稀釋100 μΐ抗生蛋白鏈菌素-HRP，接著以ΤΜΒ使反應顯色。如圖1 1中可見，使用 IIR試劑降低HAMA背景。實例6.3抑制GDF8與MYO-029抗體之結合 135384.doc -132· 200934510

My0-029(於2002年10月2日以個別寄存指定編號PTA-4741寄存於美國典型菌種保藏中心（ATCC))為已用於臨床試驗中試圖增加患有肌肉病症之患者的肌力之治療抗體。在如本文所述偵測已投予MYO-029之患者中的GDF8之免疫檢定中，展示檢定抗體RK35與MYO-029對於與GDF-8結合之交叉反應性。為證實此交叉反應性，將MYO-029塗佈於檢定板上。將1200 pg/ml GDF-8添加至各孔中。接著添加遞增濃度之生物素化RK22或生物素化RK35 »如圖12可 © 見，由於此配置中無信號產生，因此未標記GDF-8與生物素化RK35競爭與MYO-029之結合。使用生物素化RK35無信號產生，其指示RK35與MYO-029之間對於與GDF8結合的交叉反應性。實例6.4 MYO-029作為對於GDF8之競爭劑之用途使用兩種檢定配置（RK35/RK22或RK22/RK35)及遞增量之MYO-029治療抗體進行檢定，其中將恆定濃度之GDF-8(250 pg/ml)加入檢定緩衝液或10%人類血清中。如圖13 A ® 可見，將RK22用作捕捉抗體。將250 pg/ml之GDF-8在室溫下與150 ng/ml之生物素化RK35及遞增濃度之MYO-029(0 至20 pg/ml) —起培育1.5小時。甚至在最高濃度之MYO-029下，僅發現約30%抑制。如圖13B中所示，將RK35用作捕捉抗體。將250 pg/ml之GDF-8在室溫下與生物素化RK22 及遞增濃度之MYO-029 —起培育1.5小時。在25 gg/ml之 MYO-029濃度下觀測到接近100%之信號抑制。實例6.5使用RK3S捕捉/RK22偵測格式之人類血清之加標 135384.doc -133- 200934510 回收率在加標回收率實驗中分析三個人類血清樣品之Gdf-8回收率°將各樣品在100%血清中稀釋至6〇〇 pg/ml之成熟 00?-8且連續稀釋兩倍以產生6〇〇、3〇〇及15〇?§/1111之〇〇?-8的樣品。在添加或不添加2〇 μ§/ιη12Μγ〇_〇29的情況下，在RK3 5捕捉/RK22偵測格式中分析此等樣品中之每一者，參見圖14Α。計算因添加Μγ〇·〇29導致之信號降低，參見圖14Β。將此等值與在THST檢定緩衝液中產生之gDF 8標〇準曲線相比較且在圖15中將GDF-8之觀測值比對期望值作圖。觀測值均充分小於期望值，指示單獨緩衝液中之標準曲線並不準確定量血清樣品中存在之Gdf-8值。實例6.6使用血清比對檢定緩衝液供產生標準曲線在此研究中使用正常小鼠血清及GDF-8 KO小鼠血清。使用成熟GDF-8蛋白，使用此等血清以及正常人血清及 THST緩衝液產生標準曲線，參見圖i 5。血清比對緩衝液中產生之標準曲線之間的斜率差異說明當緩衝液為用於產生標準曲線之介質時，加標/回收率實驗之觀測值比對預測值為何如此顯著不同（圖16)β與緩衝液中之標準曲線相比，血4中標準曲線之斜率降低強調血清對所產生信號之基質效應且表明應在血清中產生標準曲線。無法獲得對檢定發展必要之ΚΟ小鼠血清之量且正常小鼠血清具有高内源性GDF-8含量，此將干擾未知血清樣品中gdf_8之預測。正常人類血清亦具有内源性GDF 8含量，雖然低於正常小鼠，此亦增加不當干擾因素。可能的替代方案將為耗 135384.doc -134- 200934510 盡正常人類血清池之GDF-8，以用作檢定校準基質。實例6.7血清中MYO-029之失活/解離先前研究證明MYO-029之存在藉由與抗原決定基對 RK35抗體之交叉反應性干擾RK35/RK22格式中GDF-8之準確定量。假定若可解離樣品中之GDF-8/MYO-029複合物，則可能發展在MYO-029存在下準確量測GDF-8之免疫檢定。現有數種將抗體自其抗原解離之可能性，包括酸解離及加熱變性。基於報導（Brown等人，1990，Growth Factors Q 3，35-43) ’潛伏TGF-β可藉由熱加處理不可逆活化。藉由 GDF-8檢定中之MYO-029抗體所證明’ THST檢定緩衝液中 65。(：至8〇°C之溫度梯度對抑制無效。然而，進行使用正常未添加血清、加有400 pg/ml成熟GDF-8之血清或加有潛伏 GDF-8之血清之預試驗。在此實驗中，將MYO-029抗體加入20%血清中且加熱至80°C歷時7分鐘（參見圖17) »結果指示檢定中之GDF-8活性在該溫度下保留且MYO-029抗體在加熱至80°C之血清中失活。以兩種方式證明此失活：1)在 © MYO-029存在下加熱之血清樣品具有與未添加MYO-029之

對照加熱樣品相同之信號輸出；及2)檢定信號可藉由在樣品加熱後添加新鮮MYO-029再次降低至背景含量。在正常血清、加有成熟GDF.8之血清及加有潛伏GDF.8之血清中觀測到此等結果。加有潛伏GDF-8之血清樣品證明似乎取決於潛伏GDF-8物質而非成熟GDF.8之信號增加》為測定有效失活之更精確持續時間，使用加有5 pg/ml MYO-029 之正常血清進行時程實驗。結果指示MYO-029抗體在80°C 1353S4.doc • 135- 200934510 下在早至3分鐘内完全失活。實例6.8人類血清中之GDF8耗盡為耗盡人類血清之内源性GDF-8，使用經由溴化氰活化共價固定至瓊脂糖珠粒之1 mg MYO-029抗體製備親和柱。將管柱預洗滌且使人類血清之小等分試樣經過管柱且以GDF-8 ELISA檢定測試GDF-8活性。另外，將血清預熱至65°C且隨後在經過管柱之前冷卻。當在GDF-8檢定中操作時，經加熱血清顯示可歸因於血清中潛伏GDF-8之免疫〇活化之信號增加。圖18展示加熱後GDF-8檢定之信號增加以及經加熱/耗盡Η/D血清中信號之耗盡。顯著地，當預熱至80°C時，Η/D血清中未觀測到信號增加。實例6.9 Η/D血清中之標準曲線使用缺乏内源性GDF - 8之血清，在加熱及未加熱條件下使用成熟GDF-8與潛伏GDF-8產生免疫反應性標準曲線。將成熟GDF-8添加至100%血清中且自2500 pg/ml連續稀釋至40 pg/ml。使用50,000 pg/ml至800 pg/ml範圍内之為成 ® 熟GDF8的20倍之蛋白質濃度的潛伏GDF-8(圖19)。此實驗之結果展示當將潛伏GDF-8在100% Η/D血清中加熱至80°C 時，檢定信號顯著增加。應注意在圖18中，加熱至80°C之 Η/D血清未展示在正常血清中所觀測到之特徵信號增加。此提供正常血清中所見之增加係歸因於内源性潛伏GDF-8 的假設之憑證。相反，加熱後，使用成熟GDF-8所產生之信號並不增加且在重複實驗中具有隨在80°C下加熱而降低之趨勢。 135384.doc -136- 200934510 實例6.10對8個正常血清樣品中游離及總GDF8之分析將先前冷凍之8個正常血清樣品解凍且使用室溫檢定（游離）及活化潛伏GDF-8之80°C加熱步驟（總）檢定其游離及總 GDF-8。使用加有已知濃度之作為GDF-8校準劑之成熟 GDF-8蛋白的Η/D血清產生此分析之標準曲線。標準曲線範圍在12,500 pg/ml至188 pg/ml内，且使用相關係數為〇·999(參見圖20)之非線性回歸曲線擬合分析計算8個未知血清樣品中之GDF-8值。如先前所述，藉由添加ΜΥΟ-029 © 誘導之光學密度的變化與樣品中内源性GDF-8之量成正比。圖21為用以測定GDF-8濃度之原始資料的示意圖。此圖說明游離GDF-8信號及其對應藉由添加ΜΥΟ-029抗體降低之信號，以及總GDF-8及其對應藉由添加ΜΥΟ-029降低之信號。圖22呈示檢定再現性實驗之結果。游離及總 GDF8檢定展現高度再現性。此對於游離GDF-8(室溫）檢定而言尤其如此。總（加熱至80°C )檢定中之檢定信號增加係歸因於加熱時間自5分鐘增加至10分鐘。重複觀測到檢定 ® 信號隨樣品加熱持續時間增加之降低且其可反映抗原變性及免疫反應性之喪失。實例6.11在MYO-029存在下不完全偵測加熱活化之内源性 GDF8 在圖23所示之實驗中，在存在或不存在MYO-029之情況下培育人類血清，接著在各種溫度下加熱變性，隨後藉由 ELIS A分析。藉由内插法自由已知濃度之添加至藉由親和力層析耗盡GDF-8的彙集人類血清中之經純化重組GDF-8 135384.doc -137- 200934510 二聚體的稀釋液系列組成的標準曲線之檢定結果進行對測試樣品中GDF-8含量之定量法。在MYO-029不存在情況下 GDF-8之最大偵測值發生在約60°c。MYO-029之存在掩蔽低溫下對血清中GDF-8之偵測。在高於65。(：之溫度下培育部分恢復在MYO-029存在下對GDF-8之偵測。然而，在高於65 C之溫度下GDF-8之計算濃度展示檢定實質上低估血· 清中存在之GDF8之總量。實例6.12在MYO-029存在下在低pH值下偵測GDF8 Ο 當加熱至使MYO-029解離必需之溫度時GDF-8之次最佳偵測促進對替代性方法之評估。圖24證明酸解離ELISA在不存在及存在MYO-029情況下偵測類似GDF-8含量之能力。在先前實驗中，在與捕捉抗體結合之前中和GDF-8/MYO-029混合物。在彼等條件下，中和後MYO-029能夠競爭與捕捉抗體RK3 5之結合。在圖24中，證明當將捕捉條件保持在低酸性pH值下時，RK35仍能夠結合GDF-8，而MYO-029不能，且因此可在存在或不存在治療抗體情況 ® 下實現GDF-8偵測之完全恢復。實例6.13 RK35在酸性條件下結合GDF8 為證實RK35(而非MYO-029)能夠在酸性條件下結合 GDF-8，將RK35及MYO-029單獨滴定於人類血清中且在酸性條件下執行分析物捕捉步驟。增加溶液中RK35之量能夠結合且競爭GDF-8與檢定板結合RK35之結合，導致酸性條件下對GDF-8之偵測降低。與所添加MYO-029之濃度無關，MYO-029不能在接近pH 3.0之溶液中結合GDF-8，使 135384.doc -138- 200934510 GDF-8留在溶液中可用以與塗佈在ELISA孔中之RK35抗體結合（參見圖25)。因此，RK35在MYO-029不能之條件下結合GDF-8之能力充當可用於在MYO-029存在下量測GDF-8 含量之適用屬性。即使逐步提高MYO-029之濃度，MYO-029自GDF-8之酸解離仍有效。圖25之資料展示使MYO-029濃度增加至100 pg/ml並不削弱使用酸解離方案對GDF-8之偵測。此圖亦展示使用加熱解離方案使對GDF-8之偵測明顯降低，圖2 6。〇與先前報導相比，使人類血清酸化產生高的多的對 GDF-8血清含量之估算。為證明血清估算值增加為對GDF-8之較高偵測的結果而不歸因於酸誘導人為因素，分析來自遺傳工程化基因剔除小鼠與天然存在GDF-8基因剔除動物比利時藍牛之血清。圖27展示當在中性或酸性pH值下量測時，來自基因剔除小鼠與比利時藍牛之血清未能產生超過檢定板背景之信號。此處報導之值以光學密度為單位且允許比較性評估，然而校準曲線之缺乏導致不能測定 ❹ GDF-8之絕對量。實例6.14校準曲線擬合為評估酸離解方法之檢定間（inter-assay)及檢定内（intraassay) 變化性，分析加有重組 GDF-8 二聚體之比利時藍色血清之等分試樣。獨立於校準曲線製備4個儲備溶液且在 96孔板之5個不同位置中以三重複檢定。可使用4或5參數對數模型擬合用於此檢定之校準曲線。可使用三重複之算術平均值作為用於模型擬合之原始資 135384.doc -139- 200934510 料。通常，不同濃度含量之方差趨向於不同β為獲得在低與高濃度下準確之校準曲線，應採用加權非線性最小二乘法或相繼採用光學密度資料之方差穩定變換及非加權非線性最小二乘法。圖28A-C對比就校準標準之向後計算濃度的相對誤差而言，關於5個GDF_8 ELISA檢定板之校準曲線擬合的三種不同方法》若採用20%相對誤差作為可容許值，則可使用擬合於光學密度之平方根的4與5參數對數模型。 Ο 實例6.15檢定之精度及準確度為評估酸離解方法之檢定間及檢定内變化性，分析加有重組GDF-8二聚體之比利時藍色血清之等分試樣。獨立於校準曲線製備4個儲備溶液且在96孔板之5個不同位置中以二重複檢定。圖29展示在不同三天處理之5個檢定板之檢定板設計》由藉由5參數對數模型擬合於各檢定板之校準曲線計算加標樣品之濃度。檢定板内及檢定板間變化係數 O(CV)及相對誤差（RE)概述於表1及2中。基於^計算之任一方法’檢定板内與檢定板間精度完全在2〇0/〇以内。表1 加標樣品之檢定板内變化性樣品標稱濃度 (netail) 平板數平均CV#I (%) 丰均CV#2 (%) 平均相每5^~ (〇Δ\ LLOQ L-QC M-QC H-QC 0.5 2.0 10.0 40.0 5 5 5 5 2.9 2.4 2.6 10.2 4.5 3.2 3.2 11.5 — v/〇j 55.0 37.1 23.3 11.7 CV#1=SD/樣品平均值 CV#2=SD/標稱濃度 135384.doc 200934510 表2 加標樣品之檢定板間變化性標稱濃度(netml)

C V #1=檢定板間SD/樣品平均值 CV#2=檢定板間SD/標稱濃度實例7 :對人類丘清中肌肉抑制素濃度之量測〇

使用如上所述之檢定’量測且比較健康人類血清中肌肉抑制素之循環濃度。在一個研究中，評估年輕及年老男性之血清的肌肉抑制素含量。亦檢測使用來自睪固酮劑量反應研究之儲存樣品，睪固酮處理對循環肌肉抑制素含量之影響。在彼研究中，先前已公開之細節（Bhasin S等人J

Clin Endocrinol Metab 2005;90:678-88 ; Bhasin S等人Am J

Physiol Endocrinol Metab 2001 ;281 :E1 172-81 ;及 Storer TVV等人 J Clin Endocrinol Metab 2003;88: 1478-85)，向健

康年輕及年老男性投予分級劑量之睪固酮與骨絡肌質量及強度之劑量依賴型增加相關聯。在另一研究中，評估健康及以手術方式絕經女性之血清。在第一個研究中，jk清樣品係來源於具有正常睪固酮含量的18-35歲齡之健康年輕男性及60-75歲齡之年老男性，其參與如以上所述之睪固酮劑量反應研究。研究方案經 Charles R. Drew University及 Harbor-UCLA Research and Education Institute之機構審查委員會批准。排除標準包括 I35384.doc -141 - 200934510 前列腺癌病史、PSA>4 ng/ml、AUA下尿道症狀調查表之評分>7、血球比容>48%，之前6個月嚴重睡眠呼吸暫停症、糖尿病、充血性心臟衰竭、心肌梗塞，前一年使用雄激素或參與中度至強度鍛煉訓練方案。4週控制期後，將參與者隨機分派至5個治療組中之一組以每月接受GnRH促效劑（亮丙立德（leuprolide)儲藥槽，7.5 mg ; TAP，North Chicago，IL)注射以抑制内源性促性腺激素產生。參與者亦每週接受每週25 mg、50 mg、125 mg或3 00 mg之5種劑 0 量中之一者的睪固酮庚酸鹽（TE，庚酸睪固酮，200 mg/mL ; Savient Pharmaceuticals, Inc·，Iselin，NJ)肌肉内注射。將血清樣品（或比利時藍色血清之校準樣品）與酸解離緩衝液（0.2 Μ甘胺酸-HC1 pH 2.5)以1:13.3之比率混合。對於非解離檢定，替代甘胺酸-HC1緩衝液，將樣品與THST緩衝液（50 mM Tris-HCl pH 8.0，500 mM NaCI，1 mM甘胺酸，0.05% Tween-20 ; pH 8.0)混合。將檢定板（Immulon 4 118乂#3 85 5)與2.〇11^/1111^11反35—起在塗佈緩衝液（10〇1111^ 〇硼酸鈉，pH 9.1)中培育隔夜，洗滌且以每孔200 μΐ之 SuperBlock TBS(Pierce #37535)阻斷。將經稀釋之血清樣品（100 μΐ)轉移至檢定板，在室溫下培育90 min，以THST 洗滌4次，且在室溫下將100 μΐ生物素化RK-22二級抗體 (0.1 pg/ml)添加至各孔中，歷時90分鐘。將檢定板以THST 洗滌4次，且在室溫下添加按1:40,000稀釋於THST緩衝液中之 100 μΐ抗生蛋白鍵菌素-HRP(SouthernBiotech #7100-05)，歷時1小時。將檢定板以THST再洗滌4次，且藉由在 135384.doc -142- 200934510 室溫下添加100 μΐ之TMB受質歷時12分鐘顯色。每孔添加 100 μΐ 0.5Μ H2S04，且在 OD 450 nm 下讀取 EL1SA 檢定板，其中波長校正設定為540 nm» 校準曲線範園：藉由繪示〇D與各校準點之對應濃度產生校準曲線。使用5參數對數擬合來擬合校準曲線。在各檢定之前製備由自73 pg/ml延伸至75,000 pg/ml的重組人類成熟肌肉抑制素於比利時藍色血清中之兩倍稀釋組成之校準曲線。自六個分析操作測定U個校準點的回讀值之檢定 © 内及檢定間不精確性。計算各分析操作（以評估檢定内不精確性）及所有分析操作（以評估檢定間不精確性）之外推濃度之平均值、SD、CV%及偏差％。將定量之下限及上限定義為可以S30%之檢定内Cv%及偏差％量測之最低（LLQ)及最高（ULQ)校準濃度（分別）。製備狳證樣品：使用來自健康受檢者之内源性肌肉抑制素濃度分別在校準曲線之下端及中間範圍的血清樣品製備二組對應於低、中間範圍及高血清濃度之肌肉抑制素的驗證樣品。高驗證樣品為來自健康受檢者之加有重組肌肉抑制素蛋白的血清樣品。檢定内及檢定間不精確性：在5個獨立分析操作中量測3個驗證樣品（低、中、高）中之每一者的6個獨立等分試樣中之檢定内及檢定間CV。自在25個獨立分析操作中，在3個QC樣品中之每一者的23個獨立等分試樣中量測之肌肉抑制素濃度測定QC分析操作容許範圍（總檢定變化平均值+/-2SD)。在樣品之各分析操作中分析樣品 135384.doc -143- 200934510 低、QC-中及QC-高）中之每一者的一個等分試樣。若3個 QC樣品中之2個的肌肉抑制素之量測濃度在所確立之容許範圍内，則分析操作可接受。其他檢定：藉由先前已針對液相層析質譜（LC-MSI/MS) 連用驗證之特異性放射免疫檢定量測血清總睪固酮含量。總T檢定之檢定内及檢定間變化係數分別為8.2%及13.2%。藉由具有0.22 pglml之靈敏度及分別為4.2%及12.3%之檢定内及檢定間變化係數的敏感性放射免疫檢定量測藉由平衡 ❹ 透析程序自血清分離之游離T(Sinha-Hikim等人J Clin

Endocrinol Metab 1998;83:1312-8)。藉由分析在已添加有已知量之T的炭清除血清中製備之樣品比較放射免疫檢定與LC-MS/MS方法。此等量測證明放射免疫檢定與LC-MS/MS量測之間0.99的相關性。藉由具有6.25 nmol/1之靈敏度的免疫螢光檢定量測血清性激素結合球蛋白（SHBG) 含量。在基線下且在第20週期間藉由雙能X射線吸光測定法評估身體組成（DEW，Hologic 4500，Waltham，MA)。使〇用身體組成幻影在各量測之前校準儀器。统計分析：評估所有結果變數之分布及方差齊性；對數轉化不滿足方差齊性或正態分布之假定的變數。若藉由 ANOVA鑑別差異，貝，J以Sheffe測試使用ANOVA評估在單一時點藉由年齡年輕比對年老分級的劑量組之間的差異，以確定那些組顯著不同。以配對T檢驗評估自基線至治療之組内變化。對於測定統計顯著性，將α設定為0.05。除非在圖例中另有指示，否則將資料以平均值+/- SEM或自 135384.doc -144- 200934510 基線+/- SEM之平均值％變化形式提供。肌肉抑制素檢定特徵：線性範面：自用於標準曲線中11 個校準點（73-75,000 pg/ml)中之每一者的6個分析操作測定檢定内及檢定間平均不精確性（下表7)。73 Pg/mL校準點之檢定間CV為36.4%，其大於可接受極限（<30%) °因此’藉由檢定間CV及偏差％分別為19.7%及3.4%之下一個校準點 (147 pg/mL)測定檢定之LLQ。75,000 pg/mL校準點之 32.4%的檢定間CV亦不在可接受極限（<3〇%)内’由此定義 ❹ CV及偏差°/〇分別為3.6%及0.8°/。之下一個最低校準點 (37,500 pg/mL)之ULQ。在生物學相關基質中，檢定的線性定量範圍自143 pg/mL延伸至37,500 pg/mL。表7 肌肉抑制素校準曲線之檢定内及檢定間不精確性檢定内

Ts^m 1^7» 9,373 2^*4 sw 147 73 〇ΐΒτ«ΐίτ| . _ ^cwf ^ n2 50 44 2·9 3S ij6 113 121 7il 141 分析操作编號 2 6 ❹ ~~ 檢定間Oi 7M« MJ50 M7S MW 2>344 1471 挪 2» M7 73 UMP™-/ 分析操作編號來自個別分析操作之平均向後计算濃度 1 77,微 3^353 18.715 秦，m 2^74 um 541 2 39,雜 18,5^ 9^93 4t娜 1,012 60S 93.777 18.865 9JS6 4,706 2怎4 U3P €29 47,567 18,875 9J54 4,674 2.407 US 60S 5 53,495 37,477 18,862 9^24 4.S89 2316 1,076 «11 6 45T9iS 成鄉 4,736 2,420 1,135 524 平均 €1172 37,719 18,796 9,336 4.782 232在 1,124 5S6 19Λ37 1,348 147 15 n 71 79 43 %cv 314 3.6 0.8 ϋΜ 2.0 5.1 7.0 7J 偏差％ UA OS 0.2 -0.4 2-d •ύΜ 0.0 s ΰ a ύ € ΰ ΰ $ ύ IS4107於1.06i® S^4T mlfis15911714919s152^3.46 271271li2612s6273if 135384.doc -145- 200934510 檢定内及檢定間不精確性：5個分析操作中低、中及高驗證樣品中之平均肌肉抑制素濃度（pg/mL，+/_ SD)分別為 3739 +/- 146、7615 +/- 125及 18268 +Λ 948。低、中及高驗證樣品（對於各驗證樣品，n = 5)之所量測檢定内cV分別為4.1%、4.7%及7.2% ’且檢定間CV分別為3.9%、1.6%及 5.2%。檢定特異性：成熟肌肉抑制素蛋白在哺乳動物物種之間具有高度序列保守性（4) ’此允許對包括小鼠、大鼠、犬、〇母牛及猴之許多非人類樣品使用肌肉抑制素檢定。在解離酸性條件下檢定來自肌肉抑制素缺陷型牛（比利時藍色）及在肌肉抑制素基因中具有失活突變（mstn κ〇)的小鼠之灰清樣品’且與相同物種之正常動物相比較（圖29A)。正常小鼠畐含血清肌肉抑制素（約120 ng/ml)，而正常母牛血清平均為約40 ng/ml。相反，在來自比利時藍牛及肌肉抑制素KO小鼠之血清中肌肉抑制素蛋白不可偵測，證實肌肉抑制素檢定之特異性，此係因為此等肌肉抑制素無效動物 ® 中之突變破壞蛋白質之合成。人類受檢者之基線特徵：61位隨機化年輕男性中之52位及60位隨機化年老男性中之51位完成該治療期。可在第2〇週獲得50位年輕男性及48位年老男性之用於肌肉抑制素檢疋的足量也清及身體組成資料；將此等受檢者包括於此次級刀析中且將其基線特徵展示於下表8中。總藥物順應率大於99%。在年輕或年老組中在5個劑量組中在基線處，基線總睪 135384.doc •146· 200934510 固嗣、游離睪_、游離睪賴百分比、隨⑽度並無不同。然而，與年輕男性㈣’年老^性具有較低血清總及游離睪固_，及較高圓。與年輕男性㈣，年老男性之體重、體重指數及脂肪f量百分比較大，而兩者之身南相似。表8 所評估受檢者之基線特徵

Ο

想重0¾) 75,1 ± 10.9 83^ ±11.7 BMI (kg^n2) 24.1 ±3.0 26.9 ± 3.5 瘦體質（kg} 57.6 ±72 57.9 ±6.3 脂肪質量百分比 18.0 ±6.4 26.6 ± 5.4 年輕及年老男性之肌肉抑制素含量：血清肌肉抑制素含量在年輕與年老男性中呈正態分布。與年老男性相比年輕男性具有顯著較高之肌肉抑制素含量（8 〇 +/_ 〇 3比對7 〇 +/- 0.4 ng/mL，P = 〇.03)(圖30A)。血清肌肉抑制素含量與藉由DEXA在年輕或年老男性中量測之瘦體質並不顯著相關（圖30B及30C)。類似地，在肌肉抑制素含量與基線之體重、體重指數或灰清睪固酮含量之間不存在顯著相關性 135384.doc -147- 200934510 (未圖示）。投予睪固酮對男性之肌肉抑制素含量的影響：年輕或年老男性中5個劑量組之間的基線企清肌肉抑制素含量並不顯著不同。在年輕及年老男性中與基線相，血清肌肉抑制素含量在第56天顯著較高（圖31A)。在年輕或年老男性中在5個劑量組中，血清肌肉抑制素濃度之變化並不顯著不同。與年輕男性相比，年老男性體驗顯著較大之肌肉抑制素含量增加百分比（圖31B)。在睪固酮療法期間之肌肉 © 抑制素含量並不持續增加；因此第140天之血清肌肉抑制素含量並不顯著不同於彼等在基線之含量。基線以上肌肉抑制素含量之增量與睪固酮濃度變化相關。自基線至第56天肌肉抑制素含量之變化與年輕，而非年老男性之總（圖32A)及游離（圖32C)睪固酮濃度之變化顯著正相關（圖32B及32D)。如先前所報導，睪固酮治療與瘦體貝之顯著體重增加相關；如先前所述，瘦體質變化與睪固酮劑量及睪固酮濃度顯著相關。然而，瘦體質變化不與 Ο 肌肉抑制素濃度之絕對變化或變化百分比顯著相關（圖3 2E 及32F)。女性之肌肉抑制素含量：在另一研究中，自BioServe， Beltsville，MD購得19-21歲齡之健康、年輕月經女性及67-8 7歲齡之經絕後女性的血清樣品。此等參與者同意參與 IRB批准之Bioserve研究。以手術方式絕經女性年齡為18-55歲，其在登記前至少6個月進行卵巢手術且血清FSH>30 U/L ’ BMI <3 5 kg/m2，之前12個月具有正常PAP塗片及乳 135384.doc -148- 200934510 房X線照片’且其已提供由Boston University IRB批准之書寫知情同意書。年輕女性之血清肌肉抑制素含量並不顯著不同於年輕男性之含量（圖33)。年輕月經女性、以手術方式絕經及天然絕經女性之肌肉抑制素含量並不顯著不同。【圖式簡單說明】圖1A及1B顯示各種濃度（ng/ml ; X軸）來自表現RK22及 RK35(結合GDF8與BMP11之對照抗體）之融合瘤的上清液 0 與 GDF8 或 BMP11 之結合（O.D· 450 nm ; y轴）。圖2展示如藉由BIAcore 2000系統感測器晶片SA所測定 RK22抗體與GDF8之間相互作用的動力學速率常數。圖3展示在缺少（10 mg/ml)或存在各種濃度（M Ig; X轴）之RK22及RK35抗體及結合GDF8及/或BMP11之其他RK抗體（A至E)的情況下，在經10 ng/ml GDF8處理之A204橫紋肌肉瘤細胞中如藉由螢光素酶活性（LCPS ; y轴）所量測，對pGL3 (CAGA)12-TGF-P啟動子報導基因活性之誘導。 ^ 圖4展示在缺少（媒劑）或存在每週1、1〇或40 mg/kg之 RK22或Myo-29的情況下，以媒劑處理4週後自SCID小鼠解剖的腓腸肌（Gastroc)、股四頭肌（Quad)及前脛骨肌（脛骨前肌）之重量（g ; y軸）。圖5展示GDF8單獨或以各種濃度（[Μ] ; X轴）之RK22、非特異性抗體、其他RK抗體（D及E)、阻斷GDF8與ActRIIB (RK35)結合之對照抗艎、對照lgG抗體或可溶性ActRIIB預培養之GDF8與ActRIIB之結合（OD450 ; y轴）。 135384.doc -149- 200934510 圖6展示經代表整個成熟GDF8肽的48個個別且重疊之13 殘基肽培育之20 ng/ml對照抗體、RK22抗鱧的抗原決定基定位墨點法之結果。各墨點下為GDF8之序列，其中抗艎 •之GDF8抗原決定基加下劃線（如各自墨點中所指示）。圖7展示RK22可變重鏈域（RK22_VH)與DP-7(DP-7_germl_VH)及DP-5(DP-5_germl_VH)之人類生殖系框架序列之比對；以星號表示人化RK22可變重鏈域改變之鼠類 RK22可變重鍵域之胺基酸且RK22之CDR經加框且加下劃 ❹ 線。圖8展示RK22可變輕鏈域與DPK 24 VL之人類生殖系框架序列之比對；以星號表示人化RK22可變輕鏈域改變之鼠類RK22可變輕鏈域之胺基酸且RK22之CDR經加框且加下劃線。圖9A展示免疫檢定格式之比較：RK35，捕捉試劑，及生物素化RK22，作為偵測試劑。圖9B展示RK22作為捕捉試劑，生物素化RK35作為偵測抗體。〇圖10證明先前所述之ELISA檢定顯示背景且此背景可能為人類抗小鼠抗體（HAMA)作用。檢定背景係歸因於血清與在ELISA中用作捕捉抗體的單株抗體RK22之交又反應性。當將RK35用作捕捉抗體時觀測到相同作用（資料未圖示）。圖11展示00?-8£1^13八之結果，其中1^35抗體經塗佈於檢定板上，且使用市售試劑IIR(免疫球蛋白抑制試劑-Bioreclamation, NY)降低ELIS A之背景。使用HR之結果有 135384.doc -150- 200934510 利地與僅具有緩衝液之背景比較。圖12展示在MYO-29存在下抗體RK35不與GDF-8結合。將MYO-29抗體塗佈於HBX檢定板上且添加1200 pg/ml之具有遞增濃度之生物素化偵測抗體（RK22或RK35)的GDF-8。使用生物素化RK35無信號產生。結果指示RK35與MYO-029之間對於與GDF-8之結合的交又反應性。圖13A及13B展示在ELISA檢定中MYO-029可用作GDF-8 之抑制劑。經由ELISA檢定遞增濃度之MYO-029中之GDF-〇 8，其中將恆定濃度之GDF-8(250 pg/ml)加入檢定緩衝液或 10%人類血清中。圖13A展示當將RK22用作捕捉抗體時存在約30%之信號抑制。圖13B展示當將RK35用作捕捉抗體時抑制幾乎為100%(自5至20 pg/ml MYO-029)。亦展示藉由使用2IR(亦稱為"IIR”）使背景信號（血清）降低。兩個圖中均展示總信號且未將其轉化成抑制百分數。圖14A及14B展示"加標回收率實驗"之結果，其中將 GDF-8添加至三個獨立血清樣品（血清#1、#2及#3)中之〇 100%血清中。以+/- 20 pg/ml MYO-029分析各樣品。添加 20 pg/ml MYO-029在所有GDF-8測試濃度下阻斷檢定信號 (圖13A)。圖13B展示加標回收率檢定之結果，其中添加血清（但無MYO-029)。結果展示在添加GDF-8之情況下信號線性增加。圖15展示正常小鼠、基因剔除（KO)小鼠及人類血清中所產生的標準曲線之比較。僅使用THST緩衝液之曲線的斜率比血清中所產生的斜率陡得多，且不能用以定量血清中 135384.doc -151 - 200934510 之值。圖16顯示如THST緩衝液中所產生，GDF8值之觀測值與預期值之比較。圖17提供展示當加熱至約80°C時MYO-029可失活/與 GDF-8解離之實驗之結果。向血清樣品中加GDF-8或潛伏 GDF-8 +/-5 pg/ml MYO-029且加熱至80°C。結果展示將 MYO-029樣品加熱恢復偵測GDF-8之能力，表明加熱至 80°C後MYO-029與GDF-8解離且活化。結果亦展示當將〇 MYO-029再次添加至經加熱樣品中時，GDF-8信號再次降低。亦展示加熱後内源性GDF-8信號增加，其在加有潛伏 GDF-8之樣品中甚至比成熟GDF-8樣品更顯著。圖18展示自人類血清耗盡GDF-8前後，GDF-8 ELISA檢定之結果。在室溫（"RT")下且在加熱至80°C後分析正常人類血清+/- 20 pg/ml MYO-029之GDF-8。將此等值與藉由預熱至65°C歷時10分鐘且三次經過1 mg MYO-029親和柱首先耗盡GDF-8之相同樣品相比較。結果指示自人類血清 ❹ 耗盡GDF-8有效降低此ELISA中之GDF-8背景含量。該等結果亦展示加熱經耗盡血清未展示加熱後使用正常血清所觀測到的信號之初始增加。可使用此經加熱/GDF-8耗盡 (Η/D)血清來產生GDF-8標準曲線。圖19展示在經加熱、GDF-8耗盡血清中且接著加有遞增濃度之成熟GDF-8或潛伏GDF-8產生的標準曲線之圖。在室溫下（RT)或加熱至80°C檢定標準曲線。加有潛伏GDF-8 之企清樣品在加熱後展示大的信號增加，此在加有成熟 135384.doc • 152- 200934510 GDF-8之樣品中未觀測到。圖20展示在不同檢定板上進行之接連2天兩個標準曲線之分析。使用具有已知濃度之成熟GDF-8的經加熱/GDF-8 耗盡血清來產生標準曲線。將各曲線之OD值對成熟GDF-8 濃度作圖。對於在經加熱/GDF-8耗盡血清中產生之GDF-8 值，非線性回歸曲線擬合具有更準確相關性。與線性回歸曲線相比，曲線擬合具有較佳相關性係數且具有更大準確度範圍。使用來自Prism Graph之軟體自GDF-8 ELISA檢定 Q 中產生之OD值計算GDF-8濃度。圖21展示量測9個正常血清樣品中游離及總GDF-8之檢定之結果。結果以+/- MYO-029形式顯示。值以pg/ml GDF-8給出且對應於100%血清中GDF-8之内源性含量。圖22展示量測八個正常血清樣品中游離及總GDF-8之檢定之結果。該圖代表在兩個獨立天進行之兩個獨立實驗。在實驗第二天，藉由加熱樣品10分鐘分析總GDF-8(與在實驗第一天進行之5分鐘加熱相比）。游離GDF-8值範圍在227 ® 至1241 pg/ml内且總GDF-8之值範圍在514至4329 pg/ml 内。圖23展示加熱變性後經由ELISA量測GDF-8的檢定之結果。以+/- 10 pg/ml之MYO-029在室溫下將人類血清之等分試樣培育1小時。接著使樣品在梯度熱循環儀中在各種溫度下加熱變性，隨後進行ELISA分析。藉由内插法自標準曲線之檢定結果進行測試樣品中GDF-8含量之定量，該標準曲線係由藉由親和力層析加入耗盡GDF-8的經彙集人 135384.doc -153- 200934510 類血清中之已知濃度的經純化重組GDF-8二聚體之稀釋液系列組成。在MYO-029不存在情況下GDF-8之最大值偵測在約60°C下進行。MYO-029之存在掩蔽低溫下對血清中 GDF-8之偵測，但在高於65°C之溫度下，GDF-8偵測部分恢復。圖24A及24B展示可在MYO-029存在下在低pH值下偵測 GDF-8。在圖24A中，將在THST緩衝液+/- 10 pg/ml之 MYO-029中稀釋之GDF-8二聚體以五倍稀釋於中性pH值之〇檢定緩衝液（THST)、200 mM 乙酸鈉 pH 5.0(NaOAc)、200 mM磷酸鹽-檸檬酸鹽緩衝液PH 3或7(P04Cit)或200 mM甘胺酸-HC1 pH 2.5(Gly)中。接著將樣品1:1稀釋於含有THST 緩衝液或非緩衝Tris之ELISA孔（以RK35抗體塗佈）中。 GDF-8以不同pH值及緩衝能力之溶液之稀釋及於THST或非緩衝Tris中之後續稀釋允許在約3至8之pH範圍量測分析物捕捉步驟之效率。在接近中性pH值之檢定條件下， MYO-029 降低 GDF-8 偵測（THST/THST)。以甘胺酸-HC1 酸 ® 化GDF-8且隨後稀釋於THST緩衝液中保持足夠低pH值以防止MYO-029結合且允許在MYO-029存在或不存在情況下完全偵測GDF-8(Gly/THST)。然而，甘胺酸酸化GDF-8於非緩衝Tris中之稀釋產生pH值大於7之分析物捕捉條件且降低GDF-8在MYO-029存在下之偵測（Gly/非緩衝Tris)。圖 24B展示pH3(左圖）及pH7(右圖）下ELISA檢定之示意圖。圖25提供展示鼠類抗體RK35在酸性條件下與GDF-8結合，而MYO-029並不如此之實驗之結果。將人類血清以 135384.doc -154- 200934510 +/-各種濃度之RK35或MYO-029預培育，且以THST緩衝液 (中性pH值）或甘胺酸-HC1(酸性pH值）稀釋5倍。接著’將血清添加至含有檢定板結合RK35及THST或甘胺酸-HC1緩衝液之ELISA孔中。在RK35或MYO-029不存在情況下’歸因於複合物解離及游離GDF-8蛋白之釋放’在酸性條件下比在中性條件下偵測到更多内源性GDF-8(參見前兩個條柱）。後六個條柱表示在酸性pH值下獲得之資料。增加溶液中RK35之量能夠結合且競爭GDF-8與檢定板結合RK35 〇之結合，導致酸性條件下對GDF-8之偵測降低。接近pH3 時，MYO-029不能結合溶液中之GDF-8，使得溶液中之 GDF-8可用以結合塗佈於ELISA板上之RK35抗體。圖26展示增加MYO-029濃度至100 pg/ml並不削弱使用酸解離ELISA方案對GDF-8之偵測。加熱或酸解離後檢定人類血清+/-10、40、或100 pg/ml之MYO-029。藉由内插法自加入耗盡GDF-8的經彙集人類血清中之重組GDF-8成熟二聚體之標準曲線估算GDF-8之濃度。在MYO-029不存 ® 在情況下，當在接近中性pH值進行分析物捕捉時，血清中 GDF-8之濃度經測定為約1 ng/ml(HS)。在MYO-029不存在情況下，經由加熱解離來彳貞測釋放血清結合蛋白後之 GDF-8 為約 3 ng/ml (HS + Myo，63°C ;無 Ab)。在 MYO-029存在下，甚至在最低測試濃度下，加熱解離未能允許與MYO-029不存在情況下相同程度之偵測（HS + MYO， 73。〇。獨立於所存在MYO-029之量，血清樣品之酸處理偵測到極相似量之GDF-8(HS + MYO，酸）。 135384.doc -155- 200934510 圖27證明分析物捕捉期間之酸性條件並不降低檢定特異性。血清之酸化在所有測試野生型（WT)動物、獼猴（NHP- 31)、小鼠（WT Mm)及乳牛（WT母牛）中產生較大信號檢測 (白色條柱對黑色條柱）。中性或酸性pH下自遺傳工程化 GDF-8基因剔除（κ〇 Mm)小鼠或天然存在GDF-8 KO比利時藍母牛（KO母牛）量測之血清未能產生超過檢定板背景之信號。圖28A-C對比就校準標準之向後計算濃度的相對誤差而

言，擬合5個GDF-8 ELISA板之校準曲線的三種不同方法。將5個GDF-8 ELISA板之結果作圖。相對誤差係定義為（B-N)/Nxl00，其中b為使用校準曲線的標準之向後計算濃度且Ν為標準之標稱濃度。三種曲線擬合法為：”圖 36Α_藉由最小二乘（LS)獲得光學密度之一參數對數模型； 2)圖36B-藉由LS獲得光學密度之平方根的‘參數對數模型；及3)圖36C_藉由LS獲得光學密度之平方根的％參數對數模型。參考線為-20及20。圖29A正常及肌肉抑制素無效動物中之血清肌肉抑制素含量。在解離酸性條件（pH 2.5)下量測比利時藍牛、正常牛⑽母牛）、肌肉抑制素無效小鼠（她κ〇小鼠）及野生型仔畜㈣、鼠）之血清，且自肌肉抑制素缺陷型血清基質中重組人類肌肉抑制素之標準曲線外推出值。條柱表示重複樣品㈣）之平均值仏SD。肌肉抑制素無_物“_ 抑制素濃度低於最低校準樣品之濃度（l47pgg卜圖29B及29C添加遞増濃度之抗肌肉抑制素抗體 135384.doc -156- 200934510 029或可溶性肌肉抑制素受體細跡㈣，在肌素EUSA中在非解離（pH 8,〇，㈣）或解離（pH 25，件下量測之非洲綠猴血料之肌肉抑制素含量^條枝表示重複樣品（n=3)之平均值+/_ SD。屋線指示llq。不

❹ 圖嫩年輕及年老男性中血清肌肉抑制素含量（平均值， SD’中值及第-及第三四分位數值）之盒須圖（Β〇χ _ whisker Pl♦盒内之水平線表示平均值，盒之下部及上部邊界表示第-及第三四分位數，且垂直條柱表示犯。 * ’ P = 0.03。圖30B展示年輕男性中基線肌肉抑制素含量與痩體質之相關性的回_。圖取：展轉^性中基線肌肉抑制素含量與痩體質之相關性的回歸圖。土圖31回應投予分級劑量之睪固酮的年輕男性中基線及第 56天及第140天之肌肉抑制素含量變化(條形圖展示平均值 +/ SEM含量）。圖31八展示基線、治療第％天及第刚天年輕（左圖）及年老男性（右圖）之肌肉抑制素含量。資料為平均值+/ SEM。*，與基線含量相比較之p值。第天之肌肉抑制素3量並不顯著不同於基線含量。圖318展示年輕及年老男性中*清肌肉抑制素含量自基線至第56天之百分數變化。*，p = 〇.〇3。圖32展示年輕及年老男性中肌肉抑制素含量自基線至第 56天之變化與總睪固酮濃度及游離睪固鲷濃度及痩體質之變化之相關性的回歸圖。圖32A展示年輕男性中肌肉抑制素含量自基線至第56天之百分數變化與血清總睪固酮濃度百分數變化之線性回歸圖。圖323展示年老男性中肌肉抑 135384.doc -157- 200934510 制素含量自基線至第56天之百分數變化與血清總睪固酮濃度百分數變化之線性回歸圖。圖32C展示年輕男性中肌肉抑制素含量自基線至第56天之百分數變化與血清游離睪固酮濃度百分數變化之線性回歸。圖32D展示年老男性中肌肉抑制素含量自基線至第56天之百分數變化與血清游離睪固酮濃度百分數變化之線性回歸。圖32E展示年輕男性令肌肉抑制素含量自基線至第56天之百分數變化與瘦體質自基線至第140天之百分數變化的線性回歸。圖32F展示年老 © 男性中肌肉抑制素含量自基線至第56天之百分數變化與血清瘦體質自基線至第140天之百分數變化的線性回歸。圖33年輕月經期、以手術方式絕經及年老女性之肌肉抑制素含量（平均值、SD、中值及第一及第三四分位數值）之盒須圖。盒内之水平線表示平均值，纟之下部及上部邊界表不第-及第三四分位數’且垂直條柱表示SD。三個組之肌肉抑制素含量在統計學上不顯著。 1353B4.doc •158· 200934510 序列表 <110>美商惠氏 <120>抗GDF8抗體及其用途 <130> AM102658 <140> 097142277 <141> 2008-10-31 <150> 61/001783 <151> 2007-11-01 <160> 36

<170> Patentln version B.B <210> 1 <211> 109 <212> PRT <213> 智人

<400> 1

Asp Phe Gly Leu Asp cys Asp Glu His ser Thr Glu ser Arg cys Cys 1 5 10 15

Arg Tyr pro Leu Thr val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp lie lie Ala Pro Lys Arg Tyr uys Ala ash Tyr cys Ser Gly clu cys G!u

Phe val Phe Leu Gin Lys Tyr Pro His Thr His Leu val His Gin A!a

Asn Pro Arg Gly ser Ala Gly pro cys Cys Thr Pro Thr Lys Met ser 65 70 75 80

Pro He Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gin lie lie Tyr Gly 85 90 95

Lys lie Pro Ala Met val val Asp Ar? cys Gly cys ser <210> 2 <211> 375 <212> PRT <213>智人 <400> 2

Met Gin Lys Leu Gin Leu Cys Val Tyr lie Tyr Leu Phe Met Leu lie val Ala Gly Pro val Asp Leu Asn Glu Asn ser Glu Gin Lys Glu Asn 20 25 30 135384-序列表.doc 200934510 val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gin Asn Thr 35 40 45

Lys Ser Ser Arg lie Glu Ala lie Lys lie Gin lie Leu ser Lys Leu 50 55 60

Leu Glu Thr Ala Pro Asn He Ser Lys Asp val lie Arg Gin Leu 70 75 80

Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu lie Asp Gin Tyr Asp Val 85 90 95

Gin Arg Asp Asp ser ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His 100 105 HO

Ala Thr Thr Glu Thr lie lie Thr Met Pro Thr Glu ser Asp Phe Leu 115 120 125 ❹

Met Gin val Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser ser 130 135 140

Lys lie Gin Tyr Asn Lys val val Lys Ala Gin Leu Trp lie Tyr Leu 145 150 155 160

Arg Pro val Glu Thr Pro Thr Thr Val Phe val Gin lie Leu Arg Leu 165 170 175 lie Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly lie Arg Ser Leu 180 185 190

Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly lie Trp Girt ser He Asp val 195 200 205

Lys Thr val Leu Gin Asn Tr^ Leu Lys Gin Pro Glu ser Asn Leu Gly 210 220 ©lie Glu lie Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala val Thr 225 230 235 240

Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu val Lys 245 250 255 val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys 260 265 270

Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val 135384-序列表.doc -2- 200934510 275 280 285

Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp lie lie Ala Pro Lys Arg Ty「 290 295 300

Lys Ala Asn Tyr cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe val Phe Leu Gin 305 310 315

Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gin Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala 325 330 335

Gly pro cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro lie Asn Met Leu Tyr 340 345 350

Phe Asn Gly Lys Glu Gin lie lie Tyr Gly Lys ile Pro Ala Met Val 355 360 365 val

Asp 370

Arg Cys Gly Cys ser 375 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213>智人 18 <400> 3 gattttggtc ttgactgt <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213>智人 <400> 4

Asp Phe Gly Leu Asp Cys O<210> 5 <211> 45 <212> DNA <213> 智人 <400> 5 tttgaagctt ttggatggga ttggattatc gctcctaaaa gatat 45 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> 智人 <400> 6 135384·序列表.doc 200934510

Phe GTu Ala Phe Gly Trp Asp Trp lie He Ala 1 5 10 <210> 7 <211> 45 <212> DNA <213> 智人 <400> 7 tttgtatttt tacaaaaata tcctcatact catctggtac accaa <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> 智人 <400> 8

Phe val Phe Leu Gin Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gin 15 10 15 O<210> 9 <211> 27 <212> DNA <213>智人 <400> 9 tgctctggag agtgtgaatt tgtattt <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> 智人 <400> 10

Cys Ser 6ly Glu Cys Glu Phe val phe <210> 11 <211> 75 <212> DNA 〇 <213>智人 <400> 11 tggattatcg ctcctaaaag atataaggcc aattactgct ctggagagtg tgaatttgta tttttacaaa aatat <210> 12 <211> 25 <212> PRT <213>智人 <400> 12

Trp lie lie Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu 135384-序列表.doc -4- 200934510 10 15

Cys Glu Phe Val Phe Leu Gin Lys Tyr 20 25 <210> 13 <211> 360 <212> DNA <213>小家鼠 <400> 13 caggttcagc tccagcagtc tggggctgag ctggcaagac ctggggcttc agtgaagttg tcctgcaagg cttctggcta cacctttact agctactgga tgcagtgggt aaaacagagg cctggacagg gtctggaatg gattggggct atttatcctg gagatggtga tactaggtac actcagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgcagata aatcctccag cacagcctac atgcaactca gcagcttggc atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaatgggt ggttacgacc ggtactactt tgactactgg ggccaaggca ccactctcac agtctcctca <210> 14 <211> 120 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 14

Gin val Gin Leu Gin Gin ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 15 10 15

Ser val Lys Leu Ser Cys Lys Ala ser Gly Tyr Thr Phe Thr ser Tyr 20 25 30

Trp Met Gin Trp val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45

Gly Ala lie Tyr pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gin Lys Phe 50 55 60

60 120 180 240 300 360

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Th「 Ala Tyr 65 70 75 80

Met Gin Leu Ser ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Met Gly Gly Tyr Asp Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Thr Leu Thr val ser Ser 115 120 135384-序列表.doc 200934510 <210> 15 <211> 339 <212> ONA <213> 小家鼠 <400> 15 60 120 180 240 300 339 gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctggctatgt cagtaggaca gaaggtcact atgagctgca agtccagtca gagcctttta aatagtgcca atcaaaagaa ctatttggcc tggtaccagc agaaaccagg acagtctcct aaacttctgg tatactttgc atccactagg gaatctgggg tccctgatcg cttcataggc agtggatctg ggacagattt cactcttacc atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gattacttct gtcagcaaca ttataacact ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaa <21〇> 16 <211> 113 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 16

Asp lie val Met Thr Gin ser Pro ser ser Leu Ala Met ser val Gly 15 10 15

Gin Lys val Thr Met ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn ser 20 25 30

Ala Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr G1n Gln Lys Pro Gly Gin ser Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly val 50 55 60 pro Asp Arg Phe lie Gly ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 ❺ Ile Se「Ser Val ❾ AU Glu Asp Leu 5卜 Ty「Phe Cys ㉛

His xyr ash Thr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu

Lys <210> 17

<211> 120 <212> PRT 135384-序列表.doc -6- 200934510 <213>智人 <400> 17

Gin val Gin Leu val Gin ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tvr 20 25 3〇 1

Trp Met Gin Trp val Arg Gin Ala pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Ala lie Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gin Lys Phe 50 55 60

Gly Arg val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr ser Thr Val Tyn ▲ Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr cvs ❹ 85 90 95

Ala Arg Met Gly Gly Tyr Asp Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr val ser ser 115 120 <210> 18 <211> 113 <212> PRT <213> 智人 <400> 18

Asp He val Met Thr Gin ser pro Asp ser Leu Ala val Ser Leu Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr He Asn Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu ueu Asn Ser

Ala Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu xle Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Sen cly val pro Asp Arg Phe Ser Gly ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 7〇 75 80 135384* 序列表.doc 200934510 lie Ser ser Leu Gin Ala Glu Asp val Ala val Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95

His Tyr Asn Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys val Glu lie 100 105 110

Lys <210> 19 <211> 5 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 19

Ser Tyr Trp Met Gin ❹ ❹ <210> 20 <211> 17 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 20

Ala lie Tyr Pro Gly Asp G飞y Asp Thr Arg Tyr Thr Gin Lys Phe Lys 15 10 15

Gly <210> 21 <211> 13 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 21

Ala Arg Met Gly Gly Tyr Asp Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr 15 10 <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 22

Lys Ser ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser Ala Asti Gin Lys Asn Tyr Leu 15 10 15

Ala 135384-序列表.doc 200934510 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 23

Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 24

Gin Gin His Tyr Asn Thr Pro Leu Thr <210> 25

<211> 10 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 25

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Gin 1 5 10 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 26

Ala lie Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr <210> 27 <211> IB <212> PRT <213>小家鼠 <400> 27

Ala Arg Met Gly Gly Tyr Asp Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 28 <211> 17 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 28 -9- 135384-序列表.doc 200934510

Lys Ser Ser Gin ser Leu Leu Asn ser Ala Asn Gin Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15

Ala <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 29

Phe Ala Ser Thr Arg

Glu ser o <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 30 Gin Gin His Tyr Asn Thr Pro Leu Thr <210> 31 <211> 348 <212> DNA <213>小家鼠 <400> 31 gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatgcca tgtcttgggt tcgccagact ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtagtg gtggtagtta cacctcctat ccagacagtg tgaagggtcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccatgt attactgtgc aagacaagac tatgctatga actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctca

<210> B2 <211> 300 <212> DNA <213>小家鼠 <400> 32 gacattgaga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt actgctgtag cctggtatca acagaaacca ggacaatctc ctaaactact gctttactcg gcatcctacc ggtacactgg agtccctgat cggttcactg gcagtggatc tgggacggat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 135384-序列表.doc 10- 300 300

200934510 gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatagta ctccgtggac gttcggtgga <210> 33 <211> 351 <212> DNA <213>智人 <400> 33 caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactata tgcactgggt gcgacaggcc cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacccta gtggtggtag cacaagctac gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagacgag aactgggggt tcgacccctg gggccaggga accctggtca ccgtctcgag t <210> 34 <211> 315 <212> DNA <213> 智人 <400> 34 tcctatgagc tgactcagcc accctcagtg tccgtgtctc caggacagac agccaccatt acctgctctg gacatgcact gggggacaaa tttgtttcct ggtatcagca gggatcaggc cagtcccctg tattggtcat ctatgacgat acccagcggc cctcagggat ccctgggcga ttctctggct ccaactctgg gaacacagcc actctgacca tcagcgggac ccaggctatg gatgaggctg actatttttg tcaggcgtgg gacagcagct tcgtattcgg cggagggacc aaggtcaccg tecta <210> 35 <211> 1543 <212> DNA <213> 智人 <400> 35 gaacatgacg gcgccctggg tggccctcgc cctcctctgg ggatcgctgt gcgccggctc tgggcgtggg gaggetgaga cacgggagtg catctactac aacgccaact gggagctgga gcgcaccaac cagagcggcc tggagcgctg egaaggegag caggacaagc ggctgcactg ctacgcctcc tggcgcaaca gctctggcac catcgagctc gtgaagaagg gctgctggct agatgaette aactgctacg ataggeagga gtgtgtggcc actgaggaga acccccaggt gtacttctgc tgctgtgaag gcaacttctg caacgaacgc ttcactcatt tgccagaggc tgggggcccg gaagtcacgt acgagccacc cccgacagcc cccaccctgc tcacggtgct ggcctactca ctgctgccca tcgggggcct ttccctcatc gtcctgctgg ccttttggat 60 120 180 240 300 351 60 120 180 240 300 315 60 120 180 240 300 360 420 480 135384-序列表.doc -π -

200934510 gtaccggcat cgcaagcccc cctacggtca tgtggacatc catgaggacc ctgggcctcc accaccatcc cctctggtgg gcctgaagcc actgcagctg ctggagatca aggctcgggg gcgctttggc tgtgtctgga aggcccagct catgaatgac tttgtagctg tcaagatctt cccactccag gacaagcagt cgtggcagag tgaacgggag atcttcagca cacctggcat gaagcacgag aacctgctac agttcattgc tgccgagaag cgaggctcca acctcgaagt agagctgtgg ctcatcacgg ccttccatga caagggctcc ctcacggatt acctcaaggg gaacatcatc acatggaacg aactgtgtca tgtagcagag acgatgtcac gaggcctctc atacctgcat gaggatgtgc cctggtgccg tggcgagggc cacaagccgt ctattgccca cagggacttt aaaagtaaga atgtattgct gaagagcgac ctcacagccg tgctggctga ctttggcttg gctgttcgat ttgagccagg gaaacctcca ggggacaccc acggacaggt aggcacgaga cggtacatgg ctcctgaggt gctcgaggga gccatcaact tccagagaga tgccttcctg cgcattgaca tgtatgccat ggggttggtg ctgtgggagc ttgtgtctcg ctgcaaggct gcagacggac ccgtggatga gtacatgctg ccctttgagg aagagattgg ccagcaccct tcgttggagg agctgcagga ggtggtggtg cacaagaaga tgaggcccac cattaaagat cactggttga aacacccggg cctggcccag ctttgtgtga ccatcgagga gtgctgggac catgatgcag aggctcgctt gtccgcgggc tgtgtggagg agcgggtgtc cctgattcgg aggtcggtca acggcactac ctcggactgt ctcgtttccc tggtgacctc tgtcaccaat gtggacctgc cccctaaaga gtcaagcatc taa <210> 36 <211> 512 <212> PRT <213> 智人 <400> 36

Met Thr Ala Pro Trp val Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly ser Leu Cys 15 10 15

Ala Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys lie Tyr Tyr 20 25 30

Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gin ser Gly Leu Glu Arg 35 40 45 cys Glu Gly Glu Gin Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg 50 55 60

Asn ser ser Gly Thr lie Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp 65 70 75 80 135384-序列表.doc 12- 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1543 200934510

Asp Phe Asn cys Tyr Asp Arg Gin Glu cys val Ala Thr Glu Glu Asn 85 90 95 pro Gin val Tyr Phe Cys cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg 100 105 110

Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro 115 120 125 pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr val Leu Ala Tyr ser Leu Leu 130 135 140

Pro lie Gly Gly Leu Ser Leu He val Leu Leu Ala Phe Trp Met Tyr 145 150 155 160

Arg His Arg Lys Pro Pro Tyr Gly His Val Asp lie His Glu Asp Pro 165 170 175 ▲ Gly Pro Pro Pro Pro Ser Pro Leu val Gly Leu Lys Pro Leu Gin Leu Q 180 185 190

Leu Glu lie Lys Ala Arg Gly Arg Phe Gly cys val Trp Lys Ala Gin 195 2〇5 205

Leu Met Asn Asp Phe val Ala val Lys lie Phe Pro Leu Gin Asp Lys 210 215 220

Gin Ser Trp Gin Ser Glu Arg Glu He Phe ser Thr Pro Gly Met 225 230 235

His Glu Asn Leu Leu Gin Phe lie Ala Ala Glu Lys Arg Gly ser Asn 245 250 255

Leu Glu Val Glu Leu Trp Leu lie Thr Ala Phe His Asp Lys Gly Ser 260 265 270 〇 Leu Thr Asp Tyr Leu Lys Gly Asn lie lie Thr Trp Asn Glu Leu Cys w 275 280 285

His Val Ala Glu Thr Met Ser Arg Gly Leu ser Tyr Leu His Glu Asp … … 300 290 295 val Pro Trp Cys Arg Gly Glu Gly His Lys Pro ser lie Ala His Ar 305 310 315

Arg 320

Asp Phe Lys Ser Lys Asn val Leu Leu Lys ser Asp Leu Thr Ala Val 325 B30 335 -13- 135384·序列表.doc 200934510

Leu Ala Asp phe Gly Leu Ala val Arg Phe Glu Pro Gly Lys Pro Pro 340 345 350

Gly Asp Thr His Gly Gin val Gly Thr Arg A「g Tyr Met Ala Pro Glu 355 B60 365 val Leu Glu Glv Ala lie Asn Phe Gin Arg Asp Ala phe Leu Arg He 370 375 380

Asp Met Tyr Ala Met Gly Leu val Leu Trp Glu Leu val Ser Arg cys 385 390 395 400

Lys Ala Ala Asp Gly Pro val Asp Glu Tyr Met Leu Pro Phe Glu Glu

Glu lie Gly Gin His Pro ser Leu Glu Glu Leu Gin Glu val val val 420 425 430

His Lys Lys Met Arg Pro Thr lie Lys Asp His Trp Leu Lys His Pro ❹ 4§5 440 445

Gly Leu Ala Gin Leu Cys val Thr iTe Glu Glu Cys Trp Asp His Asp 450 455 460

Ala Glu Ala Arg Leu ser Ala Gly cys val Glu Glu Arg val Ser Leu 465 470 475 480 lie Arg Arg Ser val Asn Gly Thr Thr ser Asp cys Leu val ser Leu 485 490 495 val Thr ser val Thr Asn val Asp Leu Pro Pro Lys Glu ser Ser lie 500 505 510 o 135384-序列表 doc 14·

Claims

200934510 十、申請專利範圍： 1. 一種對生長及分化因子8(GDF8)具特異性之拮抗劑，其中該拮抗劑為特異性結合GDF8且不特異性結合BMP 11之抗GDF8抗體或抗原結合蛋白，且其中該抗體或抗原結合蛋白係選自由以下各物組成之群：多株抗體；單株抗體，·單特異性抗體；多特異性抗體；人化抗體；四聚抗體；四價抗體；多重特異性抗體；單鏈抗體；域特異性抗體；單域抗體；域缺失抗體；融合蛋白；ScFc融合蛋 0 白；單鏈抗體；嵌合抗體；合成抗體；重組抗體；雜交抗體；突變抗體；CDR接枝抗體；抗體片段，其包含 Fab ; F(ab’)2 ; Fab'片段；Fv 片段；單鏈 Fv(ScFv)片段； Fd片段；dAb片段；抗原結合蛋白，其包含雙功能抗體；CDR3肽；限制性FR3-CDR3-FR4肽；奈米抗體；二價奈米抗體；小模數免疫藥物（SMIP);鯊魚可變IgNAR 域；及微型抗體。 2. 如請求項1之拮抗劑，其中該抗體或抗原結合蛋白包含〇至少一個包含選自由以下胺基酸序列組成之群的胺基酸序列之互補決定區（CDR) : SEQ ID NO:19之胺基酸序列、SEQ ID NO:20之胺基酸序列、SEQ ID NO:21之胺基酸序列、SEQ ID NO:22之胺基酸序列、SEQ ID ΝΟ··23之胺基酸序列、SEQ ID ΝΟ:24之胺基酸序列、SEQ ID NO:25之胺基酸序列、SEQ ID NO:26之胺基酸序列、 SEQ ID NO:27之胺基酸序列、SEQ ID NO:28之胺基酸序列、SEQ ID NO:29之胺基酸序列、SEQ ID NO:30之胺基 135384.doc 200934510 酸序列。 3. 如請求項2之拮抗劑，其中該抗體或抗原結合蛋白包含重鏈’且其中該重鏈包含第一、第二及第三互補決定區，其中該第一互補決定區包含選自由SEQ ID NO: 19之胺基酸序列及SEQ ID NO:25之胺基酸序列組成之群的胺基酸序列，其中該第二互補決定區包含選自由SEQ ID NO:20之胺〇基酸序列、SEQ ID NO:26之胺基酸序列組成之群的胺基酸序列，且其中該第三互補決定區包含選自由SEQ ID NO:21之胺基酸序列、SEQ ID NO:27之胺基酸序列組成之群的胺基酸序列。 4. 如請求項i之拮抗劑，其中該抗體或抗原結合蛋白包含包括選自由SEQ ID NO:14之胺基酸序列及SEQ ID NO:18 之胺基酸序列組成之群的胺基酸序列之重鏈。 5. 如請求項2之拮抗劑，其中該抗體或抗原結合蛋白包含輕鏈，且其中該輕鏈包含第一、第二及第三互補決定區，其中該第一互補決定區包含選自由SEQ ID NO:22之胺基酸序列及SEQ ID NO:28之胺基酸序列組成之群的胺基酸序列，其中該第二互補決定區包含選自由SEQ ID NO:23之胺基酸序列及SEQ ID NO:29之胺基酸序列組成之群的胺基 135384.doc 200934510 酸序列，且其中該第三互補決定區包含選自由SEQ ID NO:24之胺基酸序列及SEQ ID NO:30之胺基酸序列組成之群的胺基酸序列。 6. 如請求項1之拮抗劑，其中該抗體或抗原結合蛋白包含包括選自由SEQ ID NO:16之胺基酸序列及SEQ ID NO:17 之胺基酸序列組成之群的胺基酸序列之輕鏈。 7. 如請求項丨之拮抗劑，其中該抗體或抗原結合蛋白包含 © 包括SEQ ID NO:16之胺基酸序列的輕鏈，且其中該抗體進一步包含包括SEQ ID NO :14之胺基酸序列的重鏈。 8. 如請求項1之拮抗劑，其中該抗體或抗原結合蛋白包含包括SEQ ID NO: 17之胺基酸序列的輕鍵，且其中該抗體進一步包含包括SEQ ID NO: 18之胺基酸序列的重鏈。 9，一種聚核苷酸，其編碼構成如請求項丨_8中任一項之 GDF8拮抗劑的胺基酸。

10. —種宿主細胞，其包含如請求項9之聚核苷酸，其中該聚核苷酸係與調節序列可操作性連接。 11. 一種載體，其包含如請求項9之聚核苷酸。 12. —種宿主細胞，其包含如請求項u之載體。 ’其包含培養包含如請求項及分離由該宿主細胞表現之 13. —種產生GDF8拮抗劑之方法 12之聚核苷酸的宿主細胞， GDF8拮抗劑。 14. -種經分離GDF8拮抗劑，其係藉由如請求項以方法產生0 135384.doc -3 - 200934510 15. —種偵測受檢者樣品中GDF8存在的檢定方法，該檢定方法包括以下步驟： (a) 組合 (i) 該樣品； (ii) 特異性結合GDF8之捕捉試劑； (iii) 特異性結合GDF8之偵測試劑；及 (b) 偵測該捕捉試劑與GDF8之間是否發生特異性結合； © 其中對特異性結合之偵測指示該樣品中GDF8之存在。 16. 如請求項15之檢定方法，其進一步包含在（a)之組合之前組合該樣品與酸性緩衝液。 17. 如請求項16之檢定方法，其中該酸性緩衝液之pH值在約 pH 1.0與 pH 6.0之間。 18. 如請求項16之檢定方法，其中該酸性緩衝液之pH值為約 pH 2.5。 19. 如請求項15之檢定方法，其中該捕捉試劑係選自由抗〇 GDF8抗體或抗原結合蛋白、GDF8結合蛋白及GDF8結合域組成之群。 20. 如請求項15之檢定方法，其中該捕捉試劑為抗GDF8抗體或抗原結合蛋白且選自由RK35及RK22組成之群。 21. 如請求項20之檢定方法，其中該捕捉試劑為RK35。 22. 如請求項20之檢定方法，其中該捕捉試劑為RK22。 23. 如請求項15之檢定方法，其中該偵測試劑係選自由抗 GDF8抗體或抗原結合蛋白、GDF8結合蛋白及GDF8結合 135384.doc 200934510 域組成之群。 24. 如請求項23之檢定方法，其中該偵測試劑為抗GDF8抗體或抗原結合蛋白且選自由RK35及RK22組成之群。 25. 如請求項24之檢定方法，其中該偵測試劑為RK35。 26. 如請求項24之檢定方法，其中該偵測試劑為RK22。 27. —種定量受檢者樣品中之GDF8的檢定方法，該檢定方法包含以下步驟： (a) 組合 ◎ (i)該樣品， (ii) 特異性結合GDF8之捕捉試劑； (iii) 特異性結合GDF8之偵測試劑；及 (b) 偵測該捕捉試劑與GDF8之間是否發生特異性結合；及 (c) 定量GDF8之含量；其中可由特異性結合之偵測結果定量樣品中GDF8之存在量。 ® 28.如請求項27之檢定方法，其進一步包含在（a)之組合前組合該樣品與酸性缓衝液。 29. 如請求項28之檢定方法，其中該酸性緩衝液之pH值在約 pH 1.0與 pH 6.0之間。 30. 如請求項28之檢定方法，其中該酸性緩衝液之pH值為約 pH 2.5。 31. —種醫藥組合物，其包含醫藥學上可接受之載劑及GDF8 拮抗劑，其中該拮抗劑為特異性結合GDF8且不特異性結 135384.doc 200934510 合BMP11之抗GDF8抗體或抗原結合蛋白。 32. 如請求項31之醫藥組合物，其中該特異性結合GDF8且不特異性結合BMP 11之抗GDF8抗體或抗原結合蛋白包含包括SEQ ID NO:16之胺基酸序列的輕鏈，且其中該抗體進一步包含包括SEQ ID NO:14之胺基酸序列的重鏈。 33. 如請求項31之醫藥組合物，其中該特異性結合GDF8且不特異性結合BMP11之抗GDF8抗體或抗原結合蛋白包含包括SEQ ID NO:18之胺基酸序列的輕鏈，且其中該抗體進 0 —步包含包括SEQ ID NO:17之胺基酸序列的重鏈。 34. 如請求項31之醫藥組合物，其中該特異性結合GDF8且不結合BMP11之抗GDF8抗體包含至少一個包含選自由以下胺基酸序列組成之群的胺基酸序列之互補決定區 (CDR) : SEQ ID NO:19之胺基酸序列、SEQ ID NO:20之胺基酸序列、SEQ ID NO:21之胺基酸序列、SEQ ID NO:22之胺基酸序列、SEQ ID NO:23之胺基酸序列、 SEQ ID NO:24之胺基酸序列、SEQ ID NO:25之胺基酸序 ❹ 列、SEQ ID NO:26之胺基酸序列、SEQ ID NO:27之胺基酸序列、SEQ ID NO:28之胺基酸序列、SEQ ID NO:29之胺基酸序列、SEQ ID NO:30之胺基酸序列。 35. —種具有極少毒性至無毒性且對GDF8具特異性之拮抗劑之用途，其係用於製備用以治療哺乳動物患者之GDF8相關病症的藥物。 36. 如請求項35之用途，其中該GDF8拮抗劑為特異性結合 GDF8且不特異性結合BMP11之抗GDF8抗體或抗原結合 135384.doc 200934510 蛋白。 3 7.如請求項36之用途，其中該特異性結合GDF8且不特異性結合BMP11之抗GDF8抗體或抗原結合蛋白包含包括SEQ ID ΝΟ:1 6之胺基酸序列的輕鏈，且其中該抗體進一步包含包括SEQ ID NO:14之胺基酸序列的重鏈。 3 8.如請求項36之用途，其中該特異性結合GDF8且不特異性結合BMP11之抗GDF8抗體或抗原結合蛋白包含包括SEQ ID ΝΟ:1 8之胺基酸序列的輕鏈，且其中該抗體進一步包〇含包括SEQ ID NO: 17之胺基酸序列的重鏈。 3 9.如請求項36之用途，其中該特異性結合GDF8且不特異性結合BMP11之抗GDF8抗體或抗原結合蛋白包含至少一個包含選自由以下胺基酸序列組成之群的胺基酸序列之互補決定區（匚01〇:8丑(5 1〇]^0:19之胺基酸序列、8£〇10 NO:20之胺基酸序列、SEQ ID NO:21之胺基酸序列、 SEQ ID NO:22之胺基酸序列、SEQ ID NO:23之胺基酸序列、SEQ ID NO:24之胺基酸序列、SEQ ID NO:25之胺基 ❹ 酸序列、SEQ ID NO:26之胺基酸序列、SEQ ID NO:27之胺基酸序列、SEQ ID NO:28之胺基酸序列、SEQ ID NO:29之胺基酸序列、SEQ ID NO:30之胺基酸序列。 40. —種診斷、測定預後或偵測受檢者是否罹患GDF8相關病症之方法，其包含以下步驟： (a) 自該受檢者獲得第一樣品； (b) 組合第一樣品與如請求項9之拮抗劑； (c) 偵測該第一樣品中GDF8之存在； 135384.doc 200934510 (d) 定量該第一樣品中GDF8之含量； (e) 自未罹患該GDF8相關病症之受檢者獲得第二樣 σ · (f) 組合該第二樣品與該拮抗劑； (g) 偵測該第二樣品中GDF8之含量； (h) 定量該第二樣品中GDF8之含量；且 (i) 比較該第一樣品與該第二樣品中GDF8之含量；與該第二樣品相比，由該第一樣品中GDF8含量升高、降〇低或相似指示該受檢者是否罹患GDF8相關病症。 41. 一種醫藥組合物之用途，其係用於製備用以治療哺乳動物患者之GDF8相關病症的藥物，其中該醫藥組合物包含醫藥學上可接受之載劑及GDF8拮抗劑，其中該GDF8拮抗劑為特異性結合GDF8且不特異性結合BMP1 1之抗 GDF8抗體或抗原結合蛋白。 42. —種用於偵測來自受檢者之樣品中GDF8之存在或定量該樣品中之GDF8的套組，該套組包含特異性結合GDF8之 ® 捕捉試劑及特異性結合GDF8之偵測試劑，其中偵測對 GDF8與該捕捉及偵測試劑之特異性結合，以指示樣品中 GDF8之存在。 43. 如請求項42之套組，其進一步包含酸性緩衝液。 135384.doc