JP6369922B2 - 新規抗pad4抗体 - Google Patents
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Description
KLH修飾されたTA0096(配列番号1)を、3ヵ月齢のボリスブラウン3羽に対して、1羽当たり333 μgずつ腹腔に免疫した。TA0096はPAD4(配列番号2)の340〜356位に対応するペプチド抗原である。1次免疫には完全フロイントアジュバンド(Wako、014-09541)、2次及び3次免疫には不完全フロイントアジュバンド(Wako、011-09551)を用いて抗原を免疫した。四次免疫はPBS(phosphate buffered saline)に希釈した抗原を静脈注射した。隔週で翼下静脈より採血を行い、ELISAによって抗体価の確認を行った。3羽に対して3次免疫まで実施し、最も抗体価の上昇が見られた個体1羽に対して、4次免疫を実施し、4次免疫を最終免疫とした。最終免疫から3日後、ニワトリの脾臓を回収し、Ficoll paque PLUS(GE Healthcare、17-1440-03)を用いた密度勾配遠心によりリンパ球を単離し、TRIzole Reagent(Life Technologies、15596026)を用いてRNAを抽出した。抽出したRNAからPrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TAKARA、6210A)を用いたRT-PCRによりcDNAの合成を行い、scFvファージライブラリーを作製した。発現ベクターはpPDSのマウスκ鎖の代わりにニワトリλ鎖を挿入したタイプの発現ベクターを使用した。scFvファージライブラリーの作製は、参考文献:"Nakamura et al., J Vet Med Sci. 2004 Ju;66 (7): 807-814"に記載の方法に従って行った。
(1)ELISA
以下の条件でELISAを行い、A11等のヒト又はマウスPAD4に対する反応性を評価した。
(1-1)材料
・抗原:完全長組換えヒト又はマウスPAD4
・抗体:抗ジニトロフェニル(DNP)抗体(ネガティブコントロール)、L207(WO/2012/026309の実施例に記載の抗PAD4抗体L207-11)、A11、E9、G6、G8、G9、H7
Biacore(GE Healthcare、Biacore T200)を行い、A11等のヒトPAD4に対する親和性を評価した。親和性の測定には、Mouse Antibody Capture Kit(GE Healthcare、BR-1008-38)を用いた。具体的には、メーカー提供の標準プロトコルに従い、NHS/EDCを使用し、CM5チップ表面のフリーカルボキシル基を利用したアミンカップリング法によって、ウサギ抗マウスポリクローナル抗体をCM5チップ表面に固定化した。次に、A11等をウサギ抗マウスポリクローナル抗体にキャプチャーした。L207も同様にキャプチャーした。Biacore T200に種々の濃度のヒトPAD4を供し、カイネティクスセンサーグラムを作成した。
A11等のエピトープをアラニンスキャンにより同定した。具体的には以下(i)〜(iii)の手順で行った。(i)抗原配列(配列番号1)のアミノ酸残基を1アミノ酸ずつアラニンへ置換することで、17個のAla変異体(配列番号27〜43)を合成した。(ii)各Ala変異体と被検抗体の反応性を評価(ELISA)した。(iii)被検抗体が有意な反応性を示さなかったAla変異体の、Ala置換前のアミノ酸残基をエピトープと評価した。
以下の条件でA11等がPAD4のシトルリン化活性を阻害する能力を測定した。
(1)材料
・組換蛋白質:完全長組換えヒト又はマウスPAD4
・基質:BAEE(Nα-ベンゾニル-L-アルギニンエチルエステルヒドロクロリド)
・抗体:マウスIgG(ネガティブコントロール)、抗DNP抗体(ネガティブコントロール)、L207、A11、E9、G6、G8、G9、H7
作製した抗PAD4抗体(L207、A11、E9、G6、G8、G9、H7)、マウスIgG(ネガティブコントロール)、及び抗DNP抗体(ネガティブコントロール)それぞれについて40nMの抗体溶液を調製し、5μL の3.75 ng/μL(50nM)ヒト又はマウスPAD4と全量が44μLになるように1 mM EDTA、1 mM DTTを含む20 mM Tris-HCl 緩衝液(pH 7.6)とを混合した。一晩静置後、攪拌しながら5μLの100 mM BAEE(ベンゾイルアルギニンエチルエステル)を加え、さらに1μLの0.5 M CaCl2を加えてよく攪拌した(全量50μL、BAEEの終濃度は10 mM、カルシウムイオンの終濃度は10 mM)。この溶液を37℃(湯浴)で3時間静置させ、5Mの過塩素酸を12.5μLを加えて反応を停止させた。この溶液を5分間氷冷下で静置し、4℃で5分間遠心(15,000 rpm)後、上清に含まれるシトルリン化されたBAEEを比色定量した。
(1)甲及び関節の評価
コラーゲン抗体誘導関節炎(CAIA)モデルマウスを用いて、G8の薬効評価を行った。CAIAモデルマウスは、関節リウマチ(RA)及び関節炎のモデルマウスである。CAIAモデルマウスの作製方法は、マウス関節炎惹起用抗体カクテル(Chondrex Inc., 53040)のプロトコルに従った。実験条件の概要を図8に示す。0日目に、8週齢の雌Balb/cマウス(5-7マウス/群)の尾静脈に、抗コラーゲン抗体混合液(1.5mg)を投与した。3日目に、マウスに37.5μg LPS(炎症を誘発する物質)を腹膜内投与した。0、2、4、6、8日目に、試験物質としてG8、抗DNP抗体、又はPBSを腹腔内投与(1mg/マウス)した。1-10日に、甲(足蹠)及び関節(アンクル)の腫脹幅を評価した。腫脹幅の数値は、左右両肢の平均値で示した。0-10日に、表8に従って後肢の関節炎スコアを付けた(最大値は8/マウス)。
上記(1)と同様の実験条件において、0、2、5、8、10日目に血液を採取し、血清中の抗CCP抗体価を測定した。このとき、試験物質はG8又は抗DNP抗体を使用した。
上記(1)と同様の実験条件において、10日目に切除した後肢を4%ホルムアルデヒドで固定した後、脱水、パラフィン包埋した。ヘマトキシリンエオジン染色によって、関節の炎症を調べた。このとき、試験物質はG8、抗DNP抗体、又はPBSを使用した。
コラーゲン抗体誘導関節炎(CAIA)モデルマウスを用いて、G8、H7の薬効評価を行った。CAIAモデルマウスは、関節リウマチ(RA)及び関節炎のモデルマウスである。CAIAモデルマウスの作製方法は、マウス関節炎惹起用抗体カクテル(Chondrex Inc., 53040)のプロトコルに従った。実験条件の概要を図13に示す。0日目に、8週齢の雌Balb/cマウス(5-7マウス/群)の尾静脈に、抗コラーゲン抗体混合液(1.5mg)を投与した。3日目に、マウスに37.5μg LPS(炎症を誘発する物質)を腹膜内投与した。0、2、4、6、8日目に、試験物質としてG8、H7、又は抗DNP抗体を腹腔内投与(1mg/マウス)した。1-10日に、甲(足蹠)及び関節(アンクル)の腫脹幅を評価した。腫脹幅の数値は、左右両肢の平均値で示した。0-10日に、関節炎スコアを以下の(i)〜(iii)に従い評価した。(i)評価部位を左右後肢の各指、甲、関節とした。(ii)関節炎スコアは表13に従って付けた。(iii)関節炎スコアは左右後肢指、甲、関節の合計値の平均で示した(最大値は28/マウス)。
(1)ヒト化抗PAD4抗体(IgG1κ)の作製
抗体のヒト化はNishibori et al., Mol Immunol. 2006 Feb;43(6):634-42を参考に実施した。G8及びH7由来のヒト化抗PAD4抗体を作成する際、各H鎖は上記文献中の4.00、4.15、又は4.32のH鎖のテンプレートを使用した。G8のL鎖は4.00、4.06、4.17、又は4.29のテンプレートを使用した。H7のL鎖は4.00、4.06、4.15、4.17、又は4.29のテンプレートを使用した。各抗体のH鎖、L鎖のCDR1, 2, 3の配列について、各CDRが各テンプレートの対応する箇所に組み込まれるようなヒト化抗体の可変領域を設計した。設計した可変領域はinvitrogen社で委托合成を行った。ここで設計したG8由来、H7由来の可変領域をコードする塩基配列は、それぞれ配列番号135〜146である。合成した可変領域はH鎖可変領域増幅用プライマー(1)(2)、L鎖可変領域増幅用プライマー(3)(4)を用いたPCRにより増幅を行った。
rev(2) 5'-TATATGGATCCTCACCTGAGGAGACGGTGA-3' (配列番号148)
L鎖プライマーfor(3) 5'-ATATAGGCGCGCCAGCTATGAGCTGACTCAGCCA-3' (配列番号149)
rev(4) 5'-TATATGGATCCACTCACCCAGGACGGTCAG-3' (配列番号150)
G8及びH7由来のヒト化抗PAD4抗体について、ELISAを行うことで反応性の確認を行った。このとき、3タイプのH鎖と、4タイプのL鎖を使用した(表17)。抗体のクラスはIgG1κである。実験条件を表18に示す。実験結果を図21〜23に示す。いずれのヒト化抗PAD4抗体もヒトPAD4に対する高い親和性を有していた。
G8、H7、A11、及びG9由来のヒト化抗PAD4抗体について、ELISAを行うことで反応性の確認を行った。このとき、可変領域のフレームの組合せは、H鎖がH4.00、L鎖がL4.293で行った。抗体のクラスはIgG1κである。実験条件を表19に示す。実験結果を図24に示す。いずれのヒト化抗PAD4抗体もヒトPAD4に対する高い親和性を有していた。
上記「(1)ヒト化抗PAD4抗体(IgG1κ)の作製」と同様の方法で、H7由来のヒト化抗PAD4抗体(IgG4λ)を作成した。但しこのとき、図25に示すDNA鎖を合成し、ベクターを構築した。H鎖可変領域、定常領域、軽鎖可変領域、定常領域のアミノ酸配列を図26に示す。
G8及びH7由来のヒト化抗PAD4抗体について、Biacore(GE Healthcare、Biacore T200)によって親和性を評価した。このとき、フレームワークは全てH鎖がH4.00、L鎖がL4.29で行った。使用した抗体のクラスはIgG1κである。抗原は完全長組換えヒトPAD4を使用した。親和性の測定には、Human Antibody Capture Kit(GE Healthcare、BR-1008-39)を用いた。具体的には、メーカー提供の標準プロトコルに従い、NHS/EDCを使用し、CM5チップ表面のフリーカルボキシル基を利用したアミンカップリング法によって、ウサギ抗ヒトポリクローナル抗体をCM5チップ表面に固定化した。次に、ヒト化抗PAD4抗体をウサギ抗ヒトポリクローナル抗体にキャプチャーした。Biacore T200に種々の濃度のヒトPAD4を供し、カイネティクスセンサーグラムを作成した。
以下の条件でA11等由来のヒト化抗PAD4抗体がPAD4のシトルリン化活性を阻害する能力を測定した。
(6-1)材料
・組換蛋白質:完全長組換えヒトPAD4
・基質:BAEE(Nα-ベンゾニル-L-アルギニンエチルエステルヒドロクロリド)
・抗体:ヒト化抗DNP抗体(ネガティブコントロール)、A11、G8、G9、H7由来ヒト化抗PAD4抗体クローン(抗体のフレームワークは全てH4.00-L4.29、抗体のクラスはIgG1κ)
作製したヒト化抗PAD4抗体(A11, G8, G9, H7由来)、及び抗DNP抗体(ネガティブコントロール)それぞれについて120、60、30、15、7.5nMの抗体溶液を調製し、5μLの3.75 ng/μL(50nM)ヒトPAD4と全量が44μLになるように1 mM EDTA、1 mM DTTを含む20 mM Tris-HCl 緩衝液(pH 7.6)とを混合した。37℃で30分静置後、攪拌しながら5μLの100 mM BAEE(ベンゾイルアルギニンエチルエステル)を加え、さらに1μLの0.5 M CaCl2を加えてよく攪拌した(全量50μL、BAEEの終濃度は10 mM、カルシウムイオンの終濃度は10 mM)。この溶液を37℃(湯浴)で3時間静置させ、5Mの過塩素酸を12.5μLを加えて反応を停止させた。この溶液を5分間氷冷下で静置し、4℃で5分間遠心(15,000 rpm)後、上清に含まれるシトルリン化されたBAEEを比色定量した。
図28に、抗DNP抗体0 nMでのシトルリン生産量(4.9 nmol/反応液16 μL)を100%とした相対活性を示す。各ヒト化抗PAD4抗体は、濃度依存的にシトルリン化活性阻害能を示した。
(1)材料
D1CCマウス(ヒト関節リウマチの病態を再現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物、国際公開番号WO2005/085438)による関節炎抑制効果の検証実験を、H7由来のヒト化抗PAD4抗体クローン(IgG1κ)と、TNFα阻害剤であるエタネルセプトを用いて行った。
各マウスに初回免疫としてウシII型コラーゲン(10ng)を含むフロイント完全アジュバントを投与し、2次免疫として同じくウシII型コラーゲン(10ng)を含むフロイント不完全アジュバントを投与した。2次免疫投与後上記被験物質を週2回、8週間にわたり腹腔内に投与した。投与後関節部の腫脹を外見的に観察し、スコア化した。
・αDNP Ab: 500μg/mouse (25 mg/kg)
・αPAD4 Ab.100μg: 100μg (5 mg/kg)
・αPAD4 Ab.500μg: 500μg (25 mg/kg)
・ETN.100μg: 100μg (5 mg/kg)
・ETN.500μg: 500μg (25 mg/kg)
・Combination: αPAD4 Ab.100μg + ETN.100μg
ヒト化抗PAD4抗体とTNFα阻害剤の併用投与により、各単剤投与時に比べて有意に高い治療結果が見られた(p<0.05)。またこのとき、併用投与により、各単剤投与時に比べて相乗的な治療効果が見られた。このことから、ヒト化抗PAD4抗体とTNFα阻害剤を併用で使用した場合、投与量を低く設定することができ、安全性及び有効性に優れた治療を実現できることがわかった。また、抗体投与による明らかな副作用は観察されなかった。
以上の実施例により、PAD4の345、347、及び348位を含むエピトープに特異的に結合する抗PAD4抗体が、RAに対して高い治療効果を有していることが明らかとなった。また、この抗体は、従来公知の抗体L207に比べて、PAD4への親和性、及びシトルリン化活性阻害能に優れていた。
Claims (22)
- PAD4(Peptidylarginine deiminase 4)の345、347、及び348位を含むエピトープに特異的に結合する、PAD4のシトルリン化活性を阻害する、抗PAD4抗体。
- PAD4に対するKD(M)が9.0×10-9以下である、請求項1に記載の抗PAD4抗体。
- 前記エピトープは、1アミノ酸置換のアラニンスキャンによって同定されるエピトープである、請求項1又は2いずれかに記載の抗PAD4抗体。
- モノクローナル抗体である、請求項1〜3いずれかに記載の抗PAD4抗体。
- ヒト化抗体である、請求項1〜4いずれかに記載の抗PAD4抗体。
- 抗原結合性断片である、請求項1〜5いずれかに記載の抗PAD4抗体。
- 請求項1〜6いずれかに記載の抗PAD4抗体をコードする、ポリヌクレオチド又はベクター。
- 請求項1〜6いずれかに記載の抗PAD4抗体を含む、組成物。
- 請求項1〜6いずれかに記載の抗PAD4抗体を含む、PAD4のシトルリン化活性阻害剤。
- 請求項1〜6いずれかに記載の抗PAD4抗体を含む、RA又は関節炎の治療用医薬組成物。
- 請求項7に記載のポリヌクレオチド又はベクターを含有する細胞を増殖させる工程を含む、抗PAD4抗体の生産方法。
- 重鎖CDR1〜3及び軽鎖CDR1〜3が、それぞれ配列番号50〜55で示されるアミノ酸配列を含む抗体、
重鎖CDR1〜3及び軽鎖CDR1〜3が、それぞれ配列番号56〜61で示されるアミノ酸配列を含む抗体、
重鎖CDR1〜3及び軽鎖CDR1〜3が、それぞれ配列番号62〜67で示されるアミノ酸配列を含む抗体、
重鎖CDR1〜3及び軽鎖CDR1〜3が、それぞれ配列番号68〜73で示されるアミノ酸配列を含む抗体、
重鎖CDR1〜3及び軽鎖CDR1〜3が、それぞれ配列番号74〜79で示されるアミノ酸配列を含む抗体、及び
重鎖CDR1〜3及び軽鎖CDR1〜3が、それぞれ配列番号80〜85で示されるアミノ酸配列を含む抗体、
からなる群から選ばれる1種以上の抗PAD4抗体。 - PAD4のシトルリン化活性を阻害する、請求項12に記載の抗PAD4抗体。
- ヒト化抗体である、請求項12又は13に記載の抗PAD4抗体。
- PAD4に対するKD(M)が9.0×10-9以下である、請求項12〜14いずれかに記載の抗PAD4抗体。
- モノクローナル抗体である、請求項12〜15いずれかに記載の抗PAD4抗体。
- 抗原結合性断片である、請求項12〜16いずれかに記載の抗PAD4抗体。
- 請求項12〜17いずれかに記載の抗PAD4抗体をコードする、ポリヌクレオチド又はベクター。
- 請求項12〜17いずれかに記載の抗PAD4抗体を含む、組成物。
- 請求項12〜17いずれかに記載の抗PAD4抗体を含む、PAD4のシトルリン化活性阻害剤。
- 請求項12〜17いずれかに記載の抗PAD4抗体を含む、RA又は関節炎の治療用医薬組成物。
- 請求項18に記載のポリヌクレオチド又はベクターを含有する細胞を増殖させる工程を含む、抗PAD4抗体の生産方法。
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