CN105307663A - 光响应化合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了光响应化合物及其使用方法。所述光响应化合物包含光不稳定分子和附加到所述光不稳定分子上的荧光团。本发明还涉及药物递送系统,所述药物递送系统使用红细胞递送用于疾病治疗的光响应化合物。
Description
相关申请
本申请要求于2013年4月8日提交的第61/809,695号美国临时专利申请的优先权,其全部公开内容以引用的方式并入本文。
政府利益
本发明主题取得了美国国立卫生研究院颁发的批准号CA079954,在美国政府的支持下完成。美国政府对本文公开的主题享有一定权利。
技术领域
本发明主题涉及光响应化合物。具体而言,本发明主题涉及光响应钴胺素及使用其的方法。
背景
光响应化合物作为对生化和生物过程进行时空控制的非常强大的工具而备受青睐。就机制而言,光用于介导引发非活性剂(化合物)向生物活性剂转化的键断裂(Lee,H.M.等,2009;Brieke,C.等,2012。Klán,P.等,2013)。尽管光响应试剂已被用于操控细胞内生化途径,并且光敏纳米粒子已被用于位点选择性地递送细胞毒性剂,两者的潜能均受限于光激活(photo-activation)所需要的短波(<450nm)。短波造成生物损伤,并且无法利用某些组织的光学窗口(例如600~1300nm)(Tromberg,B.J.等,2000)。此外,可用于现有化合物的光解的狭窄的波长范围限制了设计能够在不同波长被正交激活的光响应物质家族的能力(Goguen,B.N.等,2011;Hagen,V.等,2005;Kantevari,S.等,2010;Menge,C.等,2011;Priestman,M.A.等,2011)。
作为一种替代,现有技术利用双光子技术光。被双光子光激活的物质已被落入长可见光/近红外光区的波长激活。然而,不存在生物学上有用的双光子双光子笼蔽剂(Bort,G.等,2013)。而且,双光子光对于生物学应用并不总是理想的。因此,依然存在对改良的光响应化合物的需求。
简单概述
本概述对本公开主题的几种实施方案进行了说明,并在多种情况下列出这些实施方案的改变与替换。本概述仅为多种多样的实施方案的示例。对于给定实施方案的一个或多个代表性特征的描述同样为示例性的。这样的实施方案通常能够具有或不具有所述特征(或多个特征)存在;同样地,这些特征可应用于本公开主题的其他实施方案,无论是否在此概述中列出。为了避免过度重复,本概述不列出或提出所有可能的特征组合。
本公开主题提供了一种含有光不稳定分子和第一活性剂的化合物,其中,第一活性剂含有荧光团并被附加到光不稳定分子上。在一些实施方案中,当所述化合物暴露于光中时,第一活性剂和光不稳定分子之间的至少一个键断裂和/或裂解。
在一些实施方案中,所述化合物的光不稳定分子为钴胺素或其类似物的衍生物。在一些实施方案中,所述光不稳定分子为烷基钴胺素。
在一些实施方案中,所述化合物含有第二活性剂。在某些实施方案中,第二活性剂包含生物活性剂。在一些实施方案中,第二活性剂含有第二荧光团。
在一些实施方案中,本发明提供了第二活性剂,所述第二活性剂选自酶、有机催化剂、核酶、有机金属化合物、蛋白质、糖蛋白、肽、聚氨基酸、抗体、核酸、类固醇、抗生素、抗病毒剂、抗霉菌剂、抗癌剂、抗糖尿病剂、抗镇痛剂(anti-analgesicagent)、抗排斥剂、免疫抑制剂、细胞因子、糖类、疏油物质、脂质、细胞外基质、脱矿骨基质、药物、化学治疗剂、细胞、病毒、病毒载体、朊病毒和/或他们的组合。在某些实施方案中,第二活性剂为抗类风湿性关节炎剂。
在本发明的一些实施方案中,所述化合物的荧光团被附加到钴胺素的钴和钴胺素的核糖5'-OH中的至少一个上。
在本公开的一些实施方案中,进一步提供了位于光不稳定分子和第一活性剂之间的连接体。在一些实施方案中,连接体含有烷基、芳基、氨基、硫醚、甲酰胺、酯、醚、或者他们的组合。进一步,在一些实施方案中,连接体含有丙胺、乙二胺、或者他们的组合或衍生物。
在一些实施方案中,本公开提供了位于光不稳定分子和第二活性剂之间的连接体。
本公开主题在一些实施方案中,进一步提供了波长为约500nm至约1000nm的光。在一些实施方案中,所述光的波长为约1000nm至约1300nm。在一些实施方案中,所述光的波长为约500nm至约1300nm。
在一些实施方案中,本发明的所述化合物进一步含有药学上可接受的载体。
在本公开的一些实施方案中,进一步提供了一种治疗疾病的方法。该方法包括如下步骤:将有效量的根据本公开所述的化合物施用到对象的给药部位,然后将给药部位暴露于光中。在一些实施方案中,所述方法包括施用含有作为光不稳定分子的钴胺素的化合物。在一些实施方案中,钴胺素为烷基钴胺素。
在一些实施方案中,本发明进一步提供了一种方法,该方法包括施用进一步含有第二活性剂的化合物。在一些实施方案中,第二活性剂为生物活性剂。在一些实施方案中,第二活性剂含有第二荧光团。在一些实施方案中,第二活性剂选自酶、有机催化剂、核酶、有机金属化合物、蛋白质、糖蛋白、肽、聚氨基酸、抗体、核酸、类固醇、抗生素、抗病毒剂、抗霉菌剂、抗癌剂、抗糖尿病剂、抗镇痛剂、抗排斥剂、免疫抑制剂、细胞因子、糖类、疏油物质、脂质、细胞外基质、脱矿骨基质、药物、化学治疗剂、细胞、病毒、病毒载体、朊病毒和/或他们的组合。
在一些实施方案中,本公开主题提供了了在所述方法(或多种方法)中使用的荧光团被附加到钴胺素的钴中心、钴胺素的核糖5'-OH、或者他们的组合上。
进一步地,在所公开方法的一些实施方案中,所述化合物含有位于钴胺素和第一活性剂之间的连接体。在一些实施方案中,连接体含有烷基、芳基、氨基、硫醚、甲酰胺(carboxamide)、酯、醚、或者他们的组合。在一些实施方案中,连接体含有丙胺、乙二胺、或者他们的组合或衍生物。
本公开的方法的一些实施方案中,所述光的波长为约500nm至约1000nm。在一些实施方案中,所述光的波长为约1000nm至约1300nm。在一些实施方案中,所述光的波长为约600nm至约900nm的波长。
在一些实施方案中,本公开提供了所述给药部位在肿瘤处、肿瘤内或肿瘤附近。在一些实施方案中,待治疗疾病的非限定例子包括类风湿性关节炎、癌症和糖尿病中的至少一种。
在一些实施方案中,本公开提供了一种方法,该方法包括通过口服给药、透皮给药、吸入给药、经鼻给药、局部给药、经阴道给药、眼部给药、耳内给药、脑内给药、直肠给药、肠胃外给药、静脉内给药、动脉内给药、肌内给药、皮下给药及其任意组合中的至少一种施用所述化合物。
在一些实施方案中,进一步提供了一种含有光不稳定分子、生物活性剂和脂质的化合物,其中,生物活性剂和脂质被附加到光不稳定分子上。在一些实施方案中,所述化合物进一步含有附加到光不稳定分子上的荧光团。在一些实施方案中,光不稳定分子为钴胺素。
更进一步,本公开提供了一种细胞膜。该细胞膜包含至少一个膜层和至少一种根据本发明所述的化合物,其中,所述化合物被并入至少一个膜层中。在一些实施方案中,所述细胞膜进一步包含荧光团,其中,该荧光团被并入至少一个膜层中。在一些实施方案中,所述细胞膜为红细胞的膜。
在本公开主题的一些实施方案中,提供了一种药物递送系统。该药物递送系统包括红细胞、含有光不稳定分子、生物活性剂的第一化合物、和/或脂质,其中,生物活性剂和脂质被附加到光不稳定分子上。在一些实施方案中,所述化合物被并入红细胞的细胞膜中。在一些实施方案中,药物递送系统的化合物进一步含有至少一个荧光团。
在本公开的一些实施方案中,提供了一种治疗疾病的方法。该方法包括:将本文所述的化合物、细胞膜和药物递送系统中的至少一种施用到对象的给药部位;然后将对象和/或给药部位暴露于光中,其中,所述光具有本文所述的特定波长。
在一些实施方案中,本公开提供了一种治疗疾病的方法,其中,该方法包括将含有附加到光不稳定分子上的第一活性剂的化合物施用到对象,其中,当所述化合物暴露于具有第一波长的光中时,第一活性剂和光不稳定分子之间的至少一个键断裂,和进一步其中,当所述化合物暴露于具有第二波长的光中时,第一活性剂和光不稳定分子之间的至少一个另外的键断裂。在所公开的方法(或多种方法)的一些实施方案中,所述化合物还含有第二活性剂,该第二活性剂选自荧光团、酶、有机催化剂、核酶、有机金属化合物、蛋白质、糖蛋白、肽、聚氨基酸、抗体、核酸、类固醇、抗生素、抗病毒剂、抗霉菌剂、抗癌剂、抗糖尿病剂、抗镇痛剂、抗排斥剂、免疫抑制剂、细胞因子、糖类、疏油物质、脂质、细胞外基质或其组分、脱矿骨基质、药物、化学治疗剂、细胞、病毒、病毒载体、朊病毒和/或他们的组合。在某些实施方案中,第二活性剂可被附加到光不稳定分子上。进一步,在一些实施方案中,当所述化合物暴露于具有第一波长的光中时,第二活性剂和光不稳定分子之间的至少一个键断裂,和/或当所述化合物暴露于具有第二波长的光中时,第二活性剂和光不稳定分子之间的至少一个键断裂。在所公开的方法(或多种方法)的一些实施方案中,所述光的波长为约500nm至约1300nm、约500nm至约1000nm、和/或约1000nm至约1300nm的第一和/或第二波长。
附图说明
图1显示了小数形式(fractional)的钴胺素缀合物(Χi)作为光解时间函数的曲线图。使用546±10nm带通滤波器进行Cbl-1(10μM,正方形)和Cbl-2(10μM,圆形)光解(Xe闪光灯)。
图2显示了混合物中的四种钴胺素缀合物关于钴胺素缀合物的光解收率的顺序和选择性光解随光解波长变化。顺序照射[(a)777nm→(b)700nm→(c)646nm→(d)546nm]分别顺序地光解Cbl-5、Cbl-6、Cbl-3和Cbl-1。
图3显示了区室化笼蔽(compartmentalizedcaging)的示意图。Cbl-7的钴胺素将线粒体靶向剂650限制于核内体(光解前)。650nm照射使Co-650连接体裂解,使细胞毒素650能够脱离核内体(光解后)并于线粒体内积累(光解后)。
图4显示了在海拉细胞中的650的红色光诱导的易位,其中(a)显示了光解之前的Cbl-7(b)显示了罗丹明B-右旋糖酐核内体标记物(c)显示了(a)和(b)的叠加(d)显示了在光解之后的Cbl-7(e)显示了绿色线粒体标记物,以及(f)显示了(d)和(e)的叠加。海拉细胞基于传送的图像在(a)、(b)和(c)中被廓出。
图5描绘了烷基钴胺素和烷基钴胺素-荧光团缀合物的结构。
图6描绘了方案S1,钴胺素-TAMRA缀合物(Cbl-1)的结构。
图7示出了方案S2,β-(3-乙酰氨基丙基)钴胺素(Cbl-2)的合成。
图8示出了方案S3,钴胺素-荧光团缀合物(Cbl-3、Cbl-4、Cbl-5、Cbl-6和Cbl-7)的常规合成。
图9显示了方案S4,磺基Cy5,羧酸和650,羧酸的结构。
图10示出了方案S5,辅酶B12-TAMRA缀合物(AdoCbl-1)的合成。
图11示出了方案S6,辅酶B12-荧光团缀合物(AdoCbl-2、AdoCbl-3和AdoCbl-4)的常规合成。
图12示出了方案S7,钴胺素-荧光团缀合物(Cbl-1、Cbl-3、Cbl-4、Cbl-5、Cbl-6和Cbl-7)的常规光解。
图13示出了方案S8,AdoCbl-荧光团缀合物(AdoCbl-1、AdoCbl-2、AdoCbl-3和AdoCbl-4)的光解提供羟钴胺素-荧光团(B12a-荧光团)缀合物和腺苷-1和腺苷-2。
图14示出了使用Xe闪光灯,在546±10nm下,MeCbl(10μM,正方形)到羟钴胺素(圆形)的光诱导转化。数据由三次独立试验的标准误的平均值表示。
图15是示出使用Xe闪光灯,在546±10nm下,Cbl-1(10μM,正方形)到羟钴胺素(圆形)的光诱导转化的图。数据表示为三次独立试验的平均值与标准误。
图16是示出使用Xe闪光灯,在546±10nm下,β-(3-乙酰氨基丙基)钴胺素(Cbl-2,10μM,正方形)到羟钴胺素(圆形)的光诱导转化的图。数据表示为三次独立试验的平均值与标准误。
图17是示出使用Xe闪光灯,在646±10nm下,Cbl-3(10μM,正方形)到羟钴胺素(圆形)的光诱导转化的图。数据表示为三次独立试验的平均值与标准误。
图18是显示使用Xe闪光灯,在730±10nm下,Cbl-4(10μM,正方形)到羟钴胺素(圆形)的光诱导转化的图。数据表示为三次独立试验的平均值与标准误。
图19是示出使用Xe闪光灯,在780±10nm下,Cbl-5(10μM,正方形)到羟钴胺素(圆形)的光诱导转化的图。数据表示为三次独立试验的平均值与标准误。
图20是显示使用分光荧光计,通过在546nm下的激发和监测在580nm下的荧光发射,所光解的Cbl-1(1μM)的荧光增强的图。数据表示为三次独立试验的平均值。
图21是显示使用了调整到四个不同波长(546nm持续5分钟、646nm持续5分钟、727nm持续20分钟和777持续10分钟)的分光荧光计所光解的Cbl-1(1μM)的荧光增强的条形图。数据表示为三次独立试验的平均值与标准误。
图22是显示使用分光荧光计,通过在646nm下激发和监测在662nm下的荧光发射,所光解的Cbl-3(1μM)的荧光增强的图。数据表示为三次独立试验的平均值。
图23显示使用调整到四个不同波长(546nm持续5分钟、646nm持续5分钟、727nm持续20分钟和777持续10分钟)的分光荧光计,所光解的Cbl-3(1μM)的荧光增强。数据表示为三次独立试验的平均值与标准误。
图24显示使用分光荧光计,通过在727nm下的激发和监测在752nm下的荧光发射,所光解的Cbl-4(1μM)的荧光增强。数据表示为三次独立试验的平均值。
图25显示使用了调整到四个不同波长(546nm持续5分钟、646nm持续5分钟、727nm持续20分钟和777持续10分钟)的分光荧光计,所光解的Cbl-4(1μM)的荧光增强。数据表示为三次独立试验的平均值与标准误。
图26显示了使用分光荧光计,通过在777nm下的激发和监测在794nm下的荧光发射,所光解的Cbl-5(20μM)的荧光增强。数据表示为三次独立试验的平均值。
图27显示了使用了调整到四个不同波长(546nm持续5分钟、646nm持续5分钟、727nm持续20分钟和777持续10分钟)的分光荧光计,所光解的Cbl-5(20μM)的荧光增强。数据表示为三次独立试验的平均值与标准误。
图28显示了Cbl-1Cbl-3、Cbl-4、Cbl-5和Cbl-6的吸收光谱。
图29显示了使用分光荧光计,通过在700nm下的激发和监测在715nm下的荧光发射,所光解的Cbl-6(1μM)的荧光增强。数据表示为三次独立试验的平均值。
图30显示了使用了调整到四个不同波长(546nm持续5分钟、646nm持续5分钟、710nm持续3分钟和777持续10分钟)的分光荧光计,所光解的Cbl-6(1μM)的荧光增强。数据表示为三次独立试验的平均值与标准误。
图31显示了Cbl-5、Cbl-6、Cbl-3和Cbl-1(各自25nM)的混合物的顺序光解。通过比较由于顺序暴露于波长[777nm持续3分钟(Cbl-5)、700nm持续3分钟(Cbl-6)、650nm持续3分钟(Cbl-3)和546nm持续3分钟(Cbl-1)]而引起的荧光增强与光解对照溶液(546nm持续25分钟)确定光解的相对分数。
图32显示了使用Xe闪光灯,在546±10nm下的AdoCbl(10μM,正方形)到羟钴胺素(圆形)的光诱导转化。数据表示为三次独立试验的平均值与标准误。
图33显示了使用Xe闪光灯,在546±10nm下的AdoCbl-1(10μM,正方形)到羟钴胺素-TAMRA缀合物(圆形)的光诱导转化。数据表示为三次独立试验的平均值与标准误。
图34显示了使用Xe闪光灯,在546±10nm下的AdoCbl(10μM,圆形)和AdoCbl-1(10μM,正方形)的光解。数据表示为三次独立试验的平均值与标准误。
图35显示了使用分光荧光计,通过在646nm下的激发和监测在660nm下的荧光发射,所光解的Cbl-7溶液(100nM)的荧光增强。数据表示为三次独立试验的平均值。
图36显示了使用调整到四个不同波长(546nm持续5分钟、646nm持续5分钟、727nm持续20分钟和777持续10分钟)的分光荧光计,所光解的Cbl-7溶液(100nM)的荧光增强。数据表示为三次独立试验的平均值与标准误。
图37显示了在650nm下光解时,在海拉细胞中的Cbl-7的荧光增强(a)0分钟(b)5分钟(c)10分钟(d)15分钟。使用具有Cy5荧光滤色块(Filtercube)的OlympusIX-81宽场荧光显微镜完成成像和光解。
图38显示了负载Cbl-7的海拉细胞的荧光随时间变化的增强,并使用Cy5荧光滤色块成像。
图39显示了在黑暗中培养时(5h)通过核内体保留海拉细胞中的Cbl-7(a)Cbl-7(500nM;ex/em650/665nm)(b)核内体标记物罗丹明B-右旋糖酐(1mg/mL;ex/em570/590nm)(c)(a)和(b)的叠加。Mander系数=0.81。
图40示出了光响应剂的三个代表性例子:丝切蛋白(3)、光激活的蛋白激酶C(PKC)传感器(4)和天然产物百日青蜕皮酮(5)。
图41示出了有机钴胺素的光解,包括辅酶B12(6;其中R=5’-脱氧腺苷或H)的光敏性、光诱导的Co3+-烷基键的溶血裂解,首先提供Cbl(Co+2)7和烷基自由基8产物(方案1)。
图42示出了在附加荧光团的激发波长下被光解的Cbl-荧光团衍生物,包括含有TAMRA(546nm,9/10)的那些。
图43示出了来自于钴胺素的生物活性物质的光释放的结构:65011、Cbl-cAMP12和Cbl-阿霉素13。
图44示出了Cbl-Cy5(左)和800(右)衍生物分别对646和777nm正交响应。
图45显示了起始荧光团取代的缀合物(14)和光解产物(15)的结构。
图46示出了氨甲喋呤(16)和地塞米松(19)的Cbl衍生物(17和21)的波长依赖性光释放。常规使用两种药物治疗类风湿性关节炎(RA)。16中突出显示的羧酸根对于活性是不需要的,并且多个取代基(包括肽、抗体和聚合物)已经缀合到该位置(Majumdar2012;Wang2007;Everts2002)。与该讨论最相关的是与预期的光解产物(18)类似/相同的抗炎性N-烷基甲酰胺MTX衍生物阵列(X=H、OH)(Heath1986;Rosowsky1986;Piper1982;Rosowsky1981;Szeto1979)。DEX(19)也作为乙酸酯(20)(R=Me)在药学上可获得,与许多其他短链酰化Dex衍生物(例如22)一样,其被设计成促进皮肤/眼睛渗透性(Markovic2012;Civiale2004),或由于其低的水溶性,当作为肌肉内储库(depot)注射时以缓释形式(Samtani2005)起作用。
图47显示了通过在中性、水性、需氧条件下将硫醇暴露于(23)的硫醇-Cbl(24)的合成(方案2)。在空气中的光解产生Co(II)-Cbl产物,该产物被氧化成Co(III)物质和硫自由基,该硫自由基被转化为二硫化物或氧化产物(方案2)(Tahara,2013)。
图48示出了维生素B12谷胱甘肽-Cbl(25)和硫醇-CblsN-乙酰基Cys26的主要细胞内形式之一的结构,以及空气中光解的Co(II)-Cbl产物,该产物被氧化成Co(III)物质和硫自由基,该硫自由基被转化为二硫化物或氧化产物(方案2)。
图49示出了蛋白激酶底物(28)的Cbl-Cys类似物(30-33)的结构。
图50显示了隐藏在细胞膜上的保护性蛋白鞘内的脂化光可释放的生物活性剂(R)。(a)通过单锚(anchor)与膜结合的生物剂R和(b)通过双锚与膜结合的含双Cys的生物活性肽。
图51示出了并入RBC膜的/光可释放衍生物的结构(35)和(36)。
图52示出了赖氨酸衍生物的结构(37)。
图53是示出了穿过内皮单层的白细胞迁移(1→5)的图。抗炎剂将阻止CAM表达、单核细胞-EC相互作用和细胞迁移。根据ref.Muller2008。
图54是示出在RBC表面上的(a)脂质-Cbl-间隔区(spacer)-GRGDSY的图。(b)由于RGD肽和整联蛋白之间的多重相互作用而引起的RBC和Ec之间的高亲和力将阻止单核细胞的试图迁移。
图55示出了相对于从未结合的RBC的药物光释放(a)从结合内皮层的RBC的局部药物释放(黑点)光释放应增强下室中的内皮层和T细胞/滑膜细胞的摄取。
图56显示了药物/荧光团B12缀合物的结构。
图57显示了荧光团天线(flurophoreantennas)的结构。
图58显示了膜锚定点的合成。
图59显示了MTX-C18-B12的合成和纯化。
图60显示了单功能化的钴胺素的合成。
图61显示了MTXB12(Cbl-2)的合成。
图62显示了脱乙酰秋水酰碱的合成。
图63显示了秋水酰碱-C18-B12(Cbl-3)的合成。
图64显示了秋水酰碱-B12(Cbl-4)的合成。
图65显示了地塞米松-C18-B12(Cbl-5)的合成。
图66显示了5-TAMRA-C18-B12(Cbl-6)的合成。
图67显示了5-FAM-C18-B12(Cbl-7)的合成。
图68显示了Cy5-C18(Fl-1)的合成。Cy5-C18(Fl-1)(4)的合成。a)Br(CH2)5CO2H、KI、CH3CN,b)CH3I,c)丙二醛二苯胺、AcOH、Ac2O,d)2,吡啶、AcOH,e)DIC(N,N’-二异丙基碳二亚胺)、TEA、十八烷胺、CH2Cl2、如先前报道合成的Cy5(Kiyose,K.;Hanaoka,K.;Oushiki,D;Nakamura,T.;Kajimura,M.;Suematsu,M.;Nishimatsu,H.;Yamane,T.;Terai,T;Hirata,Y和Nagano,T.JACS.2010,132,15846–15848.)。
图69显示了Cy7-C18(Fl-2)的合成。Cy7-C18(6)的合成。a)N-[5-(苯氨基)-2,4-戊二烯]苯胺单盐酸盐、AcOH、Ac2O,b)7、AcOH、吡啶c)DIC、TEA、十八烷胺、CH2Cl2。
图70显示了Dy800-C18(Fl-4)的合成。Dy800-C18(12)的合成。a)3-甲基丁酮、AcOH;KOH、MeOH、PrOH,b)(10):1,3-丙磺内酯、邻二氯苯(11):Br(CH2)5CO2H、邻二氯苯,c)3-氯-2,4-三亚甲基戊二烯醛缩二苯胺盐酸盐、AcONa、EtOH,d)10,e)苯酚钠、DMFf)DIC、DIPEA、十八烷胺、DMF。
图71示出了从RBC膜光裂解的Cbl-6和Cbl-7。使用525nm光的来自结合至红细胞的钴胺素(分别为Cbl-7和Cbl-6)的荧光素释放和TAMRA释放。
图72示出了使用C18缀合的荧光团将FAM的光裂解延伸到近红外光(NIR)。使用Fl-1(650nm)、Fl-2(700nm)和Fl-3(730nm)释放荧光素(从Cbl-7)。使红细胞负载1μMCbl-7和5μM荧光团-C18。使用上述波长的光进行30分钟光解。注意,钴胺素(akaB12)仅吸收高达550nm左右的光;因此,为了吸收超过该波长的光,需要天线荧光团的存在。
图73示出了使用650nm光确定最佳释放的[Cbl-6]:[Fl-1]比的图。
图74示出了MTX标准曲线。
图75示出了来自于红细胞膜的氨甲喋呤(MTX)的光释放。使用525nm光和650nm光随时间从红细胞(RBCs)释放MTX。每对左侧的柱条表明存在5μMFl-1和1μMCbl-1。每对右侧的柱条仅包含Cbl-1。对于在650nm下的有效的药物释放,明显需要Fl-1。
图76示出了MTXDHFR抑制试验,显示了使用氨甲喋呤(圆形)和光解的氨甲喋呤(三角形)的DHFR抑制。
图77示出了秋水酰碱标准曲线。
图78示出了秋水酰碱-c18-b12(cbl-3)辛醇/h2o迁移。持续使光解的秋水酰碱(从Cbl-3)从辛醇扩散到水中而使其量增加,直到10分钟处的最大光解。由于分子的疏水性质,甚至在裂解之后平衡仍偏向辛醇,但直到裂解发生才检测到向水迁移。
图79示出了秋水酰碱对海拉细胞的影响。其中秋水酰碱作为阳性对照。当加入更多秋水酰碱时,微管蛋白网瓦解。
图80示出了使用负载cbl-3的RBC处理海拉细胞的影响。a)在没有光解的情况下暴露于负载Cbl-3的RBC中的海拉细胞。b)暴露于使用525nm光照射20分钟的、负载Cbl-3的RBC中的海拉细胞。c)没有RBC或光暴露的海拉细胞。d)没有RBC但在525nm下光解20分钟的海拉细胞。
图81示出了使用地塞米松处理海拉细胞的影响。地塞米松对Grα分布的影响。由于地塞米松缺乏,在a)中类固醇受体均匀地分布在细胞溶质中。在b)中加入250nM地塞米松之后,受体迁移到细胞核并在c)中使用500nM地塞米松观察到该受体。
图82示出了使用负载cbl-5的RBC处理海拉细胞的影响。这些是Grα染色的海拉细胞。a)在没有光解的情况下的负载cbl-5的RBC。b)没有RBC和没有光解。c)暴露于525nm光20分钟的负载Cbl-5的RBC。d)没有使用20分钟的525光暴露的RBC。
图83示出了使用负载cbl-5的RBC处理海拉细胞和光解前去除(渗漏测试)的影响。为了确定Cbl-5与RBC和细胞培养物是否处于平衡,将负载Cbl-5的RBC暴露于a)中的海拉细胞,然后在光解之前去除。Grα未受影响,表明地塞米松保留在了RBC上直到光解发生。b)包含暴露于负载Cbl-5的RBC然后不使用光解清洗的细胞。c)包含光解但未暴露于RBC的海拉细胞。
图84示出了在不同波长的光下使用负载cbl-5的RBC处理海拉细胞的结果。海拉细胞暴露于在530和780nm下照射的负载Cbl-5的RBC。
图85示出了使用cbl-5和fl-4RBC处理海拉细胞的结果。C18-地塞米松-B12/Dylight800RBC的780nm释放。
图86示出了溶血研究的结果。在不同浓度的每种亲脂性药物复合物下测量溶血。在每种情况下,RBC稳定的负载5μM或低于5μM的浓度。
图87示出了在通道中和在使用钴胺素加帽的通道中包含药物的介孔二氧化硅纳米粒子。
图88示出了给介孔二氧化硅纳米粒子的通道加帽的荧光团-Cbls结构。
图89示出了荧光素从被钴胺素加帽的介孔二氧化硅纳米粒子的释放(Fl-MSNP)。荧光强度与空白背景样品有关。将样品储存在黑暗中(5h),然后光解(525nm)两个阶段(30分钟)。在每次光暴露之后(2.5h)混合样品。
示例性实施方案详述
在本文件中阐述了本公开的主题的一个或多个实施方案的详细信息。在研究了本文件提供的信息之后,对本文件中所述的实施方案的修改以及其他实施方案对于本领域技术人员而言是显而易见的。本文件中提供的信息,特别是所述示例性实施方案的具体细节,主要是为了清楚理解而提供,并且由此要理解的是,没有不必要的限制。在有冲突的情况下,以本文件的说明书,包括定义为准。
每个例子通过解释说明本公开的方式提供,并且不局限于此。事实上,对于本领域技术人员而言显而易见地是,在不脱离本公开范围的情况下可以对本公开的教导进行各种修改和变型。例如,作为一个实施方案的部分的举例说明或描述的特征可以与另一个实施方案一起使用以产生一个附加的实施方案。
除非与进行参考的上下文另外规定或清楚暗示的相反,否则,本公开的单数特征或限制的所有参考应包括相应的复数特征(或多个复数特征)或限制(或多种限制)。
除非与进行参考的组合的上下文另外规定或清楚暗示的相反,否则可以以任何顺序进行本文所使用的方法或工艺步骤的所有组合。
本公开的方法和组合物,包括其组分,可以包括、由或基本上由本文所述的实施方案的基本要素和限制因素以及本文所述的任何附加或任选组分、或者限制因素或其他有用成分组成。
本公开的主题包括光响应性化合物,特别是某些实施方案包括含有附加到光响应性配体上的钴的化合物。在一些实施方案中,本公开的化合物包含钴胺素。在一些实施方案中,所述光响应性配体是荧光团。
当使本公开的光响应性化合物暴露于光中时,荧光团与钴胺素之间的至少一个键裂解。如本文所使用的,术语“光可裂解的”、“光可释放的”、“光激活的”、“光响应性”等可交换地用于描述在化合物暴露于光中时一个或多个键断裂的化合物。
在某些实施方案中,本公开的化合物包含通过式(I)表示的结构,如下所示:
其中R1和R2可以彼此相同或不同,其中R1和R2中的至少一个包含荧光团、H和/或烷基。
在某些实施方案中,包含式(I)的化合物可以描述为包含活性剂(例如细胞毒性物质)、酶抑制剂、酶激活剂和/或生物传感器。
另外,本公开的主题还包括本文描述的化合物的任何药学上可接受的盐或药学上可接受的衍生物。
如上所讨论的,在一些实施方案中,本公开的化合物(或多种化合物)包含钴胺素。在一些实施方案中,所述钴胺素是取代的钴胺素。例如,本公开的钴胺素可以是烷基钴胺素,如甲基钴胺素。在一些实施方案中,本公开的化合物包含至少一种钴肟,包括取代的钴肟如烷基钴肟。
如本文所使用的,术语“取代的”预期包括有机化合物的所有可允许的取代基。就广义而言,可允许的取代基包括有机化合物、肽、脂质、寡核苷酸和寡糖的非环和环式、支链和非支链、碳环和杂环、以及芳香族和非芳香族取代基。示例性取代基包括,例如本文中描述的那些。对于适当的有机化合物,可允许的取代基可以是一个或多个并且相同或不同。为了本公开的目的,钴胺素可以包含烷基取代基和/或本文所述的有机化合物的任何可允许的取代基,包括在呈现的化合物中诱导应变的那些。本公开不应以任何方式受到有机化合物的可允许取代基的限制。
关于烷基取代基,术语“烷基”是指具有通式CnH2n+1的烷基基团,其中n为约1至约18或更大。该基团可以是直链或支链的。当在本文中使用时,烷基还包含低级烷基,所述低级烷基是指具有通式CnH2n+1的烷基,其中n为约1至约6。在一些实施方案中,n为约1至约3。例子包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、异丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基等。通篇说明书中,“烷基”一般用于指未被取代的烷基基团和被取代的烷基基团,并且该事实适用于本文所述的其他基团(例如,环烷基等)。
再进一步地,本领域已知的任何适合的荧光团可用于本公开主题的实施方案。本文所使用的术语“荧光团”是指可以接受能量和/或通过能量(例如,光)激发的化合物物质,其中所述荧光团在接受能量和/或通过能量激发时产生荧光。
可以用于具体化合物的示例性荧光团包括烷基-四甲基-罗丹明(例如,5-羧基四甲基罗丹明(TAMRA))、磺基-Cy5、ATTO725、Alexa700、650、5-Fam、Cy3、Alexa546、Alexa555、Alexa568、Atto590、594、CF594、Alexa594、ATTO610、Alexa610、德克萨斯红(TexasRed)、ATTO620、CF620、红色630、ATTO633、CF633、Alex633、DyLight633、Alexa635、Cy5、CF640、ATTO647、Alexa647、CF647、650、IRDye650、ATTO655、Alexa660、CF660、Alexa680、IRDye680、Atto680、680、CF680、红色681、Alexa700、Atto700、IRDye700、NIR700、NIR730、ATTO740、Alexa750、Cyto750、CF750、Cy7、IRDye750、DyLight755、Cy7.5、Cyto770、Alexa790、CF770、Cyto780、IRDye800、DyLight800、Cyto840和量子点家族,所述量子点家族包括Qdots、三硝基甲苯(Trilite)纳米晶体、合金量子点、CdS型量子点、CdSe型量子点、核-壳型量子点或他们的组合。
另外,可以用于具体化合物的示例性荧光团包括Alexa610、Alexa633、Alexa647、Alexa660、Alexa680、Alexa700、Alexa750、FL、TMR、493/503、499/508、507/545、530/550、577/618、581/591、630/650、650/665、Cy-2、Cy-3、Cy-5、Cy-7、曙红、Fluo-4、荧光素、荧光黄(Luciferyellow)、NBD、Oregon488、PyMPO、玫瑰红、砜罗丹明、四甲基罗丹明和/或Texas
在一些实施方案中,“荧光团”包括吸收某些波长的光能量和发射不同波长的光能量的分子,所述某些波长的光能量包括例如紫色光、蓝色光、蓝绿色光、绿色光、黄绿色光、黄色光、橙色光、红橙色光、红色光、远红外光、近红外光或红外光的光能量,并且该术语涵盖在各种光谱中发射的那些分子,所述光谱例如包括紫色、蓝色、蓝绿色、绿色、黄绿色、黄色、橙色、红橙色、红色、远红外和/或红外光谱。
在一个实施方案中,荧光团是紫色荧光染料、蓝色荧光染料、蓝绿色荧光染料、绿色荧光染料、黄绿色荧光染料、黄色荧光染料、橙色荧光染料、红橙色荧光染料、红色荧光染料、远红外荧光染料、近红外荧光染料或红外荧光染料。荧光染料的非限制性例子包括衍生自例如以下物质的染料:香豆素、花青、荧光素、异氰酸盐、异硫氰酸盐、吲哚碳菁、吲哚二碳菁、吡啶基噁唑、藻红蛋白、藻青蛋白、邻苯二甲醛和罗丹明。
荧光团和任选的其他分子可以附加在化合物的各种位点上。例如,在包含钴胺素的实施方案中,可以直接地或通过连接体将荧光团附加在钴胺素的钴中心、钴胺素的核糖5’-OH或钴胺素的其他位置,或他们的组合。同样地,在包含钴肟的实施方案中,可以直接地或通过连接体将荧光团附加在钴胺素的钴中心。
在某些实施方案中,化合物与荧光团,或任何其他附加的分子之间的连接体可以是可以缀合两个或更多个分子的任何适合的分子。例如,在一些实施方案中,连接体是烷基、芳基、氨基、硫醚、甲酰胺、酯、醚和/或他们的组合。本领域普通技术人员应当理解的是,在本公开主题的某些实施方案中可以使用其他连接体。因此,连接体可以是结合(例如共价结合到化合物和/或荧光团上的任何原子或分子。示例性连接体包括丙胺、乙二胺或其组合或衍生物。
如本文所使用的术语“芳基”是包含任何基于碳的芳族基的基团,包括但不限于,苯、萘、苯基、二苯基、苯氧基苯等。术语“芳基”还包括二芳基(例如,萘或二苯基)或“杂芳基”,其被定义为具有结合到芳族基环内的至少一个杂原子的芳族基。杂原子的例子包括但不限于,氮、氧、硫和磷。同样地,术语“非杂芳基”也包括在术语“芳基”中,定义为包含不含杂原子的芳族基的基团。芳基基团可以是取代的或未被取代的。可以使用一个或多个以下的基团取代芳基基团,包括但不限于,如本文所述的任选取代的烷基、环烷基、烷氧基、链烯基、环链烯基、炔基、环炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、叠氮化物、硝基、甲硅烷基、磺基-氧(sulfo-oxo)或硫醇。
如本文所使用的术语“酯”通过式—OC(O)A1或—C(O)OA1表示,其中A1可以是任选取代的烷基、环烷基或芳基等。该术语包括“聚酯”,如本文所使用“聚酯”通过式—(A1O(O)C-A2-C(O)O)a—或—(A1O(O)C-A2-OC(O))a—表示,其中A1和A2可以独立地为任选取代的烷基、环烷基或芳基等,并且“a”是1至500的整数。
如本文所使用的术语“醚”通过式A1OA2表示,其中A1和A2可以独立地为任选取代的烷基、环烷基或芳基等。该术语包括“聚醚”,如本文所使用“聚醚”通过式—(A1O-A2O)a—表示,其中A1和A2可以独立地为任选取代的烷基、环烷基或芳基等,并且“a”是1至500的整数。
如本文所使用的术语“硫醇”通过式—SH表示。
在一些实施方案中,荧光团可以是活性剂,如650。术语“活性剂”在本文中用于指改变、促进、加速、延长、抑制、激活、消除或另外影响受试者的生物或化学事件的化合物或实体。再进一步地,本公开的化合物的一些实施方案可以进一步包含第二活性剂,并且,在具体的实施方案中,所述第二活性剂包含第二荧光团。
本公开的活性剂包括但不限于,酶、有机催化剂、核酶、有机金属化合物、蛋白质、糖蛋白、肽、聚氨基酸、抗体、核酸、甾族分子、抗生素、抗病毒药、抗霉菌剂、抗癌剂、镇痛剂、抗排斥剂、免疫抑制剂、细胞因子、糖类、疏油物质(oleophobics)、脂质、细胞外基质和/或其单独组分、脱矿骨基质、药物、化学治疗剂、细胞、病毒、载体和朊病毒。
在一些实施方案中,可以将化合物调整为在特定波长下和/或在给定波长范围内被光激活。在一些实施方案中,可以通过适当地选择化合物中包含的荧光团来将化合物调整为在某些波长下被光激活。
在一些实施方案中,化合物包含活性剂,并且化合物可以保持惰性状态直到被具有特定波长的光激活,从而从化合物裂解得到活性剂。
在一些实施方案中,可以将化合物调整为被以下波长光激活,所述波长相当于通过附加在化合物上的荧光团(或多个荧光团)吸收的光的波长。在一些实施方案中,通过暴露于具有大约相当于附加荧光团的激发光谱的波长的光中来最快速地激活化合物。就这一点而言,在一些实施方案中,当暴露于具有短于激发附加荧光团的波长的光中时,化合物不被光激活,或至少具有降低的光激活速率。
在某些实施方案中,当暴露于具有长于激发附加荧光团的波长的光中时,化合物不被光激活,或至少具有降低的光激活速率。此外,在一些实施方案中,当暴露于具有短于或长于激发附加荧光团的波长的光中时,化合物不被光激活,或至少具有降低的光激活速率。
就此而言,术语“光”在本文中用于指可以激活化合物的任何电磁辐射。在一些实施方案中,光包括紫外光、可见光、近红外光(NIR)或红外光(IR)。被相对长波长的光激活的化合物可以特别良好地适用于靶向肿瘤等,和/或组织深处的其他靶标,因为光在其波长增加时一般进入组织更深处。化合物的一些实施方案具有通过被波长大于500nm的光光激活的令人惊讶的和意想不到的优点。本公开的化合物的其它实施方案可以被具有大于1000nm波长的光光激活。
更具体地,如本文所使用的,光可以指具有约500nm至约1300nm波长的能量。在具体实施方案中,光可以指具有约500nm、约550nm、约600nm、约650nm、约700nm、约750nm、约800nm、约850nm、约900nm、约950nm、约1000nm、约1050nm、约1100nm、约1150nm、约1200nm、约1250nm或约1300nm波长的能量。在其它具体实施方案中,光可以指具有大于约500nm、大于约550nm、大于约600nm、大于约650nm、大于约700nm、大于约750nm、大于约800nm、大于约850nm、大于约900nm、大于约950nm、大于约1000nm、大于约1050nm、大于约1100nm、大于约1150nm、大于约1200nm、大于约1250nm波长和/或甚至更长波长的能量。
本公开的主题进一步包括包含如本文所述化合物的药物组合物。这样的药物组合物可以包含至少一种药学上可接受的载体。就此而言,术语“药学上可接受的载体”是指无菌的含水或不含水溶液、分散液、悬浮液或乳状液,以及仅在使用之前重组于无菌可注射溶液或分散液中的无菌粉末。可以维持适当的流动性,例如通过使用涂覆材料如卵磷脂,在分散液的情况下通过维持需要的粒度,以及通过使用表面活性剂。这些组合物还可以包含佐剂,如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂,如尼泊金、氯丁醇、苯酚、山梨酸等来确保预防微生物作用。也可以希望包含等渗剂如糖、氯化钠等。可以通过包含延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶引起可注射药物形式的延长吸收。通过用生物可降解聚合物如聚交酯-聚乙交酯、聚(原酸酯)和聚(酸酐)形成微胶囊基质来制备可注射储库形式。根据使用的药物与聚合物之比和特定聚合物的性质,可以控制药物释放的速率。储库可注射制剂还通过将药物截留在与身体组织相容的脂质体或微乳状液中来制备。可以对可注射制剂进行消毒,例如通过保留细菌的过滤器过滤,或通过掺入仅在使用之前可以溶解或分散在无菌水或其他无菌可注射介质中的无菌固体组合物形式的灭菌剂。适合的惰性载体可以包括糖,如乳糖。
适合的制剂包括含水和不含水的无菌注射液溶液,所述注射溶液可以包含赋予所述制剂与预期受体的体液等渗的抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、杀菌抗生素和溶质;和含水和不含水的无菌悬浮液,所述悬浮液可以包含悬浮剂和增稠剂。
组合物可以采取诸如在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳状液这样的形式,并且可以包含调配剂(formulatoryagent)如悬浮液、稳定剂和/或分散剂。供选择地,活性成分可以是在使用之前与适合载体,例如无菌无热原水组成的粉末形式。
制剂能够以单位剂量或多次剂量容器提供,例如密封的安瓿和小瓶中,并且可以储存在仅需要在使用之前立即加入无菌液体载体的冷冻或冷冻干燥(冻干)的条件下。
对于口服给药,组合物可以采取例如用药学上可接受的赋形剂通过常规技术制备的片剂或胶囊的形式,所述药学上可接受的赋形剂如粘合剂(例如,预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素);填充剂(例如,乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙);润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或二氧化硅);崩解剂(例如,马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠);或润湿剂(例如,十二烷基硫酸钠)。片剂可以通过本领域已知的方法涂覆。
用于口服给药的液体制剂可以采取例如溶液剂、糖浆剂或悬浮剂的形式,或其可以提供为在使用之前与水或其他适合的载体组成的干燥产品。这样的液体制剂可以与药学上可接受的添加剂通过常规技术制备,所述药学上可接受的添加剂如悬浮剂(例如山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化可食用脂肪);乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯树胶);不含水的载体(例如杏仁油、油性酯、乙醇或分馏的植物油);和防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯,或山梨酸)。根据需要,所述制剂还可以包含缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。可以适合地将用于口服给药的制剂配制成提供活性化合物的控释。对于颊部给药,组合物可以采取以常规方式配制的片剂或锭剂。
也可以将化合物配制成用于植入或注射的制剂。因此,例如可以将化合物与适合的聚合物或疏水性材料(如在可接受的油中的乳状液)或离子交换树脂配制,或作为微溶的衍生物(如微溶的盐)配制。
还可以将化合物配制为直肠用组合物(例如,栓剂或包含常规栓剂基质如可可油或其他甘油酯的保留灌肠剂)、乳油或洗剂,或透皮贴剂。
本公开的主题进一步包括可以包含如本文所述的化合物或药物组合物、与对化合物或组合物给药有用的器械一起包装的试剂盒。本领域技术人员或普通技术人员应当理解的是,适当的辅助给药器械将取决于所选择的化合物或组合物的剂型和/或希望的给药部位。例如,如果化合物或组合物的剂型适合于在受试者中注射,则器械可以是注射器。对于另一个例子,如果希望的给药部位是细胞培养基,则所述器械可以是无菌移液管。
再进一步地,本公开的主题包括用于治疗疾病(或多种疾病)如癌症的方法。在一些实施方案中,所述方法包括,将化合物、包括本文所述的化合物之一,向有需要的受试者的给药部位施用,然后在已经施用化合物之后将受试者的给药部位暴露于光中。如上所述,在一些实施方案中光可以是具有约500nm至约1300nm波长的光。就此而言,更长波长的光对靶向深部组织可以是特别有用的。
在本公开的一些方法中,将多数化合物向受试者施用,然后将给药部位(或多个给药部位)以预设的顺序暴露于具有不同波长的光中。因此,在这样的实施方案中,给药部位可以以预设的顺序,顺序地经历不同活性剂的作用而不用在多个时间点施用化合物。因此,可以通过仅调整给药部位暴露的光的波长使受试者接受不同活性剂的治疗。
再进一步地,在一些方法中,在给药之后通过受试者细胞的核内体途径使化合物内在化。之后,当细胞暴露于光中时,可以从化合物裂解得到活性剂和/或将活性剂从核内体释放到细胞溶质中。通过该过程,一些实施方案直到细胞暴露于具有激活化合物的波长的光中时才能破坏细胞。
术语“施用(administering)”是指向受试者提供化合物和/或其药物组合物的任何方法。一些方法对于本领域技术人员而言是已知的并且包括但不限于,口服给药、透皮给药、通过吸入给药、鼻腔给药、局部给药、阴道内给药、眼内给药、耳内给药、脑内给药、直肠给药,和胃肠外给药,包括可注射给药如静脉内给药、动脉内给药、肌肉内给药、和皮下给药。给药可以是顺序或间歇的。在多个方面,可以治疗性地施用制剂;即给药以治疗现有疾病或病症(例如癌症、肿瘤等)。在进一步的方面,可以预防性地施用制剂;即给药以预防疾病或病症。
在一些实施方案中,向受试者施用有效量的化合物。在这方面,术语“有效量”是指足以实现希望的结果或对不希望的病症具有作用的量。例如,“治疗有效量”是指足以实现希望的治疗结果或对不希望的症状具有作用,但一般不足以引起不良副作用的量。对于任何患者的具体治疗有效剂量水平将取决于多种因素,包括要治疗的疾病和疾病的严重程度;使用的具体组合物;患者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食;给药时间;给药途径;使用的具体化合物的排泄速率;治疗持续时间;与使用的具体化合物组合使用或同时使用的药物等医学领域众所周知的因素。例如,很好地在本领域技术内的是化合物的起始剂量水平低于实现希望的治疗效果所需要的水平并且逐渐增加剂量直到实现希望的效果。如果需要,出于给药的目的,可以将有效的每日一次剂量分成三次剂量。结果,单次剂量组合物可以包含构成每日一次剂量的量或其因数。在任何禁忌症的事件中,剂量可以由个体医师调整。剂量可以变化,并且可以以每日一次或多次剂量给药一天或几天。可以在文献中发现用于给定类别的药物产品的适当的剂量。在进一步的各个方面,可以以“预防有效量”;即用于预防疾病或病症有效的量施用制剂。
此外,术语“受试者”或“有需要的受试者”是指给药的靶标,其任选地显示与特定疾病、病理状态、紊乱等相关的症状。本文公开的方法的受试者可以是脊椎动物,如哺乳动物、鱼类、鸟类、爬行类或两栖类。因此,本文公开的方法的受试者可以是人、非人灵长类动物、马、猪、兔、狗、绵羊、山羊、牛、猫、豚鼠或啮齿动物。该术语不表示特定年龄或性别。因此,旨在覆盖成人和新生儿受试者以及胎儿,而不论男性或女性。患者是指患有疾病或紊乱的受试者。术语“受试者”包括人和兽医受试者。
在一些实施方案中,受试者将患有或被诊断患有一种或多种赘生性或高增生性疾病、紊乱、病理学或病症。因此,受试者待暴露的给药部位可以是紧密靠近这样的疾病、病症等(例如肿瘤)的位置或位于该位置处。这样的疾病、病症等的例子包括包括但不限于,位于结肠、腹部、骨骼、乳腺、消化系统、食管、肝脏、胰腺、腹膜、内分泌腺体(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、子宫颈、胸腺、甲状腺)、眼、头和颈、神经(中枢和外周)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾脏、胸部区域、膀胱和泌尿生殖系统的赘生物(癌症或肿瘤)。其它癌症包括滤泡性淋巴瘤、具有p53突变的癌症,以及激素依赖性肿瘤,包括但不限于结肠癌、心脏肿瘤、胰腺癌、黑素瘤、成视网膜细胞瘤、恶性胶质瘤、肺癌、肠癌、睾丸癌、胃癌、成神经细胞瘤、粘液瘤、肌瘤、淋巴瘤、内皮瘤、成骨细胞瘤、骨巨细胞瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、卡波济氏肉瘤和卵巢癌,或他们的转移。
受试者也可以处于危难之中,原因是他(或她)获得了与异常和增加的细胞存活率相关的疾病或病症,例如但不限于恶性肿瘤和相关的紊乱的进展和/或转移如白血病(包括急性白血病(例如,急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病,包括成髓细胞、早幼粒细胞、髓单核细胞、单核细胞和红白血病)和慢性白血病(例如,慢性髓细胞(粒细胞)白血病和慢性淋巴细胞白血病))、红细胞增多症、淋巴瘤(例如,霍奇金病和非霍奇金病)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病和实体瘤,包括但不限于肉瘤和癌如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索癌、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞癌、胚胎性癌、胚胎性癌肉瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤(menangioma)、黑素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤。以上所述的病症、疾病等,以及对于本领域普通技术人员而言明显的那些在本文中共同成为“癌症”。
术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指意图治愈、缓解、稳定或预防疾病、病理状况或紊乱的受试者的医学管理。该术语包括积极治疗,即具体对于疾病、病理状况或紊乱的改进的治疗,并且还包括病因治疗,即对于相关的疾病、病理状况或紊乱的原因的去除的治疗。此外,该术语包括姑息治疗,即为减轻症状而不是治愈、疾病、病理状况或紊乱而设计的治疗;预防性治疗,即对于最小化或部分或完全抑制相关的疾病、病理状况或紊乱的发展的治疗;和支持性治疗,即用于补充对于改善相关的疾病、病理状况或紊乱的另一种具体疗法的治疗。
关于将给药部位暴露于光的步骤,可以修改暴露的方法以满足特定情况的需要。因此,光可以包括太阳光、光学照相光(photo-opticlight)和/或激光。进一步地,在一些实施方案中,光包含紫外光、可见光、近红外光或红外光。可以从激光光源、钨灯源、光照相光源(photoopticlightsource)等暴露。也可以在相对具体的给药部位提供光并且可以例如通过使用激光技术、纤维、内窥镜、活检针、探头、管等提供光。这样的探头、纤维或管可以直接插入到例如受试者的体腔或开口中或通过受试者的皮肤,以使已经向受试者施用的化合物(或多种化合物)暴露于光。
光源也可以包括染料激光或二极管激光。二极管激光在某些应用中可能是有利的,原因是其相对小和成本有效的设计,易于安装、自动剂量和校准特征,以及更长的操作寿命。某些激光,包括二极管激光,还在相对冷的温度下操作,从而消除了提供额外冷却设备的需要。在一些实施方案中,光源靠电池供电。而且,光源可以使用扩散端(diffusetip)等提供,如具有散射材料(scattingmaterial)的可膨胀气球。
光可以以对于特定应用提供需要的光激活的任何强度和持续时间向受试者提供。在一些实施方案中,本公开中提供的治疗方法包括施用相对低剂量的化合物和/或在几小时或几天的过程中将给药部位暴露于相对低强度的光中。在一些实施方案中,该低剂量技术可以允许卓越的肿瘤控制,同时使正常组织损伤最小化。
类风湿性关节炎(RA)是一种进展性炎性自身免疫疾病,其仅折磨低于1%的美国人群(Majithia,2007)。每年,RA引起25万住院治疗和1千万门诊。2010报告将RA的社会成本定在400亿美元(用2005年美元)(Birnbaum,2010)。RA患者典型地呈现关节疼痛、肿胀、柔软和温暖的症状。尽管潜在的原因保持待确定,但多关节症状是淋巴细胞和单核细胞流入滑膜/关节间隙、产生促炎细胞因子、骨和软骨破坏以及疾病扩散至其他关节和随后的全身反应的结果。最终,这导致不可逆的关节损伤、缺陷和无能。已经知道了超过半个世纪,将抗炎剂直接注射到患病关节提供治疗效果(Hollander,2951)。然而,常规性地多次注射到多个关节不是可行的治疗选择(Mitragotri,2011)。
最新推出的“生物制品”(例如靶向TNFα、IL-1等的抗体)与在诊断时使用其他药物的积极治疗一起降低了RA的发展速率(Kukar,2009)。尽管如此,RA治疗一般需要频繁和长期的给药,通常导致中度至重度的不希望的副作用。例如,对糖皮质激素有依赖性的大约50%的RA患者(Huscher2009)必须处理其长期使用的后果,包括增重、骨质疏松症、糖尿病、高血压、皮肤脆性和由全身性免疫功能不全引起的感染(Basschant,2012)。不出意外地,在可以选择性地递送到RA关节以便降低不希望的全身作用的治疗方法的开发中有显著意义(Mitragotri2011;Fiehn2010;Ulbrich2010)。
由于联合治疗对RA患者是有利的,因此任何递送系统必须足够稳健以使用精细的空间和时间控制来分配不同药物。在癌症管理中已经看到大量应用的一种可能性是使用光激活在患病部位的治疗剂。例如,光动力疗法将局部突发的细胞毒性O2递送到对破坏标记的那些组织(Shirasu2013)。最近,光激活的前药的开发受到了关注(Shamay2011;Thompson2010;Yavlovich2010)。然而,一般后者受到光激活所需要的短波长(<450nm)具有差的组织穿透力的事实的限制。此外,在该窄波长范围内,以波长特异性方式区分不同前药的能力非常有限。
在本公开主题的一些实施方案中,光响应性结构(lightresponsiveconstruct)在组织的光学窗口(600–1000nm)内发挥作用。在一些实施方案中,光响应性结构被编码为以波长特异性方式响应,导致触发不同的生物学作用(例如不同药物的释放)。在一些实施方案中,化合物用于治疗疾病,包括但不限于类风湿性关节炎、癌症和糖尿病。
在本公开的一些实施方案中,公开了使用红细胞(RBC)的药物递送系统。
红细胞已经被描述为“药物递送系统[的]冠军”(Muzykantov2010)他们具有生物相容性、具有高达120天的寿命并且具有大大超过其他药物载体的那些的尺寸,使得可以运送相对大的药物量。然而“从载体RBC(红细胞)的实践上有用的控制释放保持难以达到的目标”(Muzykantov2010)。使用常规对光不稳定的试剂的光控制释放由于存在消耗可见光谱(高达600nm)的短波长区域的血红蛋白,而不可行。
在一些实施方案中,本公开提供了克服该限制的基于RBC的药物递送系统,并且首次提供了以空间和时间控制的方式从RBC的控制释放。
基于肽的RA治疗药物(therapeutics)的新家族由于许诺免疫调节而不是免疫抑制的性质而受到格外关注(Getting2009;Luger2007;Yang2013)。然而,这些肽在血液中快速降解。在一些实施方案中,本公开的主题提供了用于递送肽以治疗对其有需要的受试者的疾病的系统和方法。特别地,本公开的一些实施方案提供了用于稳定保护性鞘中的肽并将肽递送到其想要的作用部位的药物递送系统和方法,肽随后在作用部位暴露于光中时局部释放。
有人认为“成功的新疗法[对于RA]不仅需要在良好或改进的安全性下有效,而且还必须以允许患者自身给药的方式配制”(Minter2013)。在本公开主题的一些实施方案中,提供了与现有的光递送系统结合的治疗方法(例如,在“低水平激光治疗”中使用的技术(Bjordal2008)),将治疗应用置于由患者掌握的炎症部位。
已经报道了许多光可激活形式的生物活性试剂,包括小分子、肽、蛋白质和核酸(Lee2009)。因此,该策略需要(a)对生物活性来说必需的试剂上的关键功能基团的鉴别和(b)使用光可裂解部分对其共价修饰。该策略通常被追溯到描述光可激活的ATP的开创性的1978年论文(Kaplan1978)。后者不被ATP酶识别。然而,在光解(~330nm)时,产生ATP并随后水解。两个标准指示光裂解波长:驻留发色团(例如硝基苄基基团)的光谱和待裂开的键(硝基苄基C-O)的性质。对于任何光敏基团,具有实现有效的光裂解需要的最低能量(Aujard2006)。已经描述了许多其他光可裂解/光可改变的部分(Klan2013),并且尽管其吸收波长在一定程度上变化(350–500nm),但其光解波长依赖性通过以上枚举的两个标准预先确定。
在本公开的一些实施方案中,提供了用于创造光可激活试剂的新策略。该策略表示显著偏离自1978年以来已经投入使用的方法。在一些实施方案中,本公开提供了(a)具有最大组织穿透的波长(例如,600–900nm)用于药物激活,(b)对于不同的光可激活治疗药物(therapeutics)可以编码特定波长,从而使波长依赖性区别成为可能,以及(c)可以将光响应性结果附着到目标药物/试剂的任何位置,从而消除了必须使用光可裂解基团共价修饰的、对生物活性必需的关键功能的限制。
尽管肽类继续受到了对其治疗潜力的大量关注,但大多在血液中快速被清除和/或降解。本公开在一些实施方案中提供了可以“隐藏”在已被证实遮蔽RBC的质膜的蛋白鞘中的蛋白水解(roteolytically)易感肽。后者将与波长编码的结构偶联,从而促进了肽在希望的生物部位的释放,因此限制了在蛋白酶中的暴露。
在一些实施方案中,使用关节炎动脉滑膜关节界面(含有多个人类细胞系)的工程的三维模型来评价波长编码的药物递送技术的有效性。
实施例
本公开的主题通过以下具体而非限制性实施例进行了进一步说明。实施例可以包括数据的汇编,其代表了在与本公开主题相关的开发和实验过程中,在各个时间收集的数据。
此外,以下的实施例描述了附加有荧光团的某些示例性烷基钴胺素化合物的合成和表征。
盐酸羟钴胺(B12a)购买于MPBiomedicals。TAMRA购买于AnaSpec.。磺基Cy5琥珀酰亚胺酯购买于Lumiprobe。650琥珀酰亚胺酯、Green和罗丹明B右旋糖酐(10000MW)购买于Invitrogen。800琥珀酰亚胺酯购买于ThermoFisherScientific。所有其他荧光团和试剂均购买于Sigma-Aldrich。所有荧光团和试剂均在不进一步纯化的情况下使用。546±10nm带通滤波器购买于Newport。646±10、700±10、730±10和780±10nm带通滤波器购买于CheshireOptical。所有成像均在具有LambdaLS3氙弧灯和HamamatsuC8484CCD照相机的OlympusIX81倒置荧光显微镜上进行。
β-(3-氨基丙基)钴胺素1根据文献方法由羟钴胺(hydroxocobalamin)和3-氯丙胺盐酸盐制备(Smeltzer,C.C.;Cannon,M.J.;Pinson,P.R.;Munger,J.D.,Jr.;West,F.G.;Grissom,C.BOrg.Lett.,2001,3,799–801.)。根据文献方法实现纯化,得到橙色固体(0.0154g,68%);C65H98N14O14PCo(M1+):m/z的ESIMS计算值=1388.7,实测值1388.7;(M2+)m/z的ESIMS计算值=694.3,实测值694.5;(M3+):m/z的ESIMS计算值=463.1,实测值462.9(Priestman,M.A.;Shell,T.A.;Sun,L.;Lee,H.-M.;Lawrence,D.S.Angew.Chem.2012,124,7804–7807;Angew.Chem.Int.Ed.2012,51,7684-7687.)。
钴胺素-TAMRA缀合物(Cbl-1)的合成如图6中所示进行:根据文献方法,由β-(3-氨基丙基)钴胺素1和5-羧基四甲基罗丹明(TAMRA)制备Cbl-1。根据文献方法实现纯化,得到红色固体,82%;C90H118N16O18PCo(M2+):m/z的ESIMS计算值=900.4,实测值900.5;(M3+):m/z的ESIMS计算值=600.3,实测值600.3(Priestman,M.A.;Shell,T.A.;Sun,L.;Lee,H.-M.;Lawrence,D.S.Angew.Chem.2012,124,7804–7807;Angew.Chem.Int.Ed.2012,51,7684-7687.)。
β-(3-乙酰氨基丙基)钴胺素(Cbl-2)的合成如图7中所示来完成:将N,N,N′,N′-四甲基-O-(N-琥珀酰亚胺基)四氟硼酸脲(TSTU,0.0242g,80μmol)、乙酸(0.0022g,38μmol)和DIPEA(0.0234g,181μmol)在2:2:1的二甲基甲酰胺:二噁烷:水溶液(250μL)中混合1小时。加入β-(3-氨基丙基)钴胺素1(0.0052g,3.7μmol),并使反应物(reaction)混合18小时。通过HPLC(半制备的C-18柱)纯化目标化合物,所述HPLC使用线性梯度二元溶剂系统(溶剂A:0.1%TFA/H2O;溶剂B:0.1%TFA/CH3CN),A:B的比率从97:3(0分钟)到10:90(40分钟)变化。通过冻干去除溶剂,得到橙色固体(0.0039g,73%);C67H100N14O15PCo(M+):m/z的ESIMS计算值=1430.7,实测值1431.7;(M2+):m/z的ESIMS计算值=715.3,实测值715.5。
钴胺素-荧光团缀合物(Cbl-3、Cbl-4、Cbl-5、Cbl-6和Cbl-7)的合成和表征如图8中所示来完成。
钴胺素-荧光团缀合物的常规合成:将荧光团(1当量)的N-羟基琥珀酰亚胺酯、β-(3-氨基丙基)钴胺素1(1.5当量)和二异丙基乙胺(6当量)在二甲基甲酰胺中混合18小时。通过HPLC(半制备的C-18柱)纯化目标化合物,所述HPLC使用线性梯度二元溶剂系统(溶剂A:0.1%TFA/H2O;溶剂B:0.1%TFA/CH3CN),A:B的比率从97:3(0分钟)到10:90(40分钟)变化。通过冻干去除溶剂,得到固体。
钴胺素-磺基Cy5缀合物(Cbl-3)如图9中所示:蓝色固体,89%;C97H134N16O22PS2Co(M2+):m/z的ESIMS计算值=1014.4,实测值1013.6;(M3+):m/z的ESIMS计算值=676.3,实测值676.4。
钴胺素-ATTO725缀合物(Cbl-4):蓝色固体,66%;C90H118N16O18PCo-ATTO725(M2+):m/z的ESIMS估计值=892.9,实测值893.2;(M3+):m/z的ESIMS估计值=595.3,实测值595.9(已经报道了ATTO725羧酸的配方和准确质量)。
钴胺素800缀合物(Cbl-5):蓝色固体,92%;C90H118N16O18PCo-Dylight800(M2+):m/z的ESIMS估计值=1141.1,实测值1139.8;对于(M3+):m/z的ESIMS估计值=760.7,实测值760.4(已经报道了800,羧酸的配方和准确质量)。
钴胺素-Alexa700缀合物(Cbl-6):蓝色固体,72%,C90H118N16O18PCo-Alexa700(M2+):m/z的ESIMS实测值=1179.9,(M3+):m/z的ESIMS实测值=787.0(已经报道了Alexa700,羧酸的配方和准确质量)。
钴胺素650缀合物(Cbl-7)如图9中所示:蓝色固体,88%,C94H124N18O17PBF2Co(M2+):m/z的ESIMS计算值=957.9,实测值958.7;(M3+):m/z的ESIMS计算值=638.3,实测值638.6。
Cbl-1,其包含烷基-四甲基-罗丹明(TAMRA)部分,被附着在烷基钴胺素的钴中心(Priestman,M.A.,etal.,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2012)和充当光裂解的报道分子。图5包含烷基钴胺素和烷基钴胺素-荧光团缀合物的结构。图6是方案S1,其是钴胺素-TAMRA缀合物(Cbl-1)的结构。在Cbl-1光解时观察到荧光增强,原因是由于钴胺素猝灭附着的荧光团的荧光的能力(Priestman,M.A.,etal.,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2012.Lee,M.;etal.,Org.Lett.2009.Smeltzer,C.C.,etal.,Org.Lett.2001.Jacobsen,D.W.MethodsEnzym.1980.Rosendahl,M.S.;etal.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA1982.Jacobsen,D.W.,etal.,J.Inorg.Biochem.1979.)。后者是荧光团与咕啉环系统之间的接触猝灭的结果(Lee,M.;Grissom,C.B.Org.Lett.2009)。在不受理论或原理限制的情况下,接触猝灭不同于荧光能量共振转移,对于能量转移到发散(transpire),接触猝灭不需要分别为荧光团和猝灭剂(quencher)的发射和吸收波长之间的叠加。考虑到Co-烷基键弱的事实(<30kcal/mol)(Halpern,J.,etal.,J.Am.Chem.Soc.1984.Kozlowski,P.M.,etal.,J.Chem.TheoryComput.2012和其中引用的参考文献),公开了在超过钴胺素吸收的波长下(>560nm)激发的荧光团可以将其激发态能量转移到咕啉环,从而促进Co-C键断开。
Cbl-1中的TAMRA和咕啉部分吸收500–570nm光。相对于甲基钴胺素(MeCbl)和不具有附加荧光团的模型烷基钴胺素,Cbl-2的裂解,TAMRA介导的能量转移机制可以加速Co-C键的裂解。MeCbl和Cbl-2两者以相似速率光解(分别为1.9±0.2和2.1±0.3μM-1/min,图14和15)。相比之下,Cbl-1所被光解的速率是其不含荧光团的相对物、MeCbl和Cbl-2(图1和16)的速率的两倍(3.8±0.3μM-1/min)。因此,附加荧光团可以发挥促进Co-C键的光裂解作用。
使用均长于由咕啉环吸收的激发波长将几个荧光团附加到烷基钴胺素框架。使磺基Cy5衍生物Cbl-3(λex650nm,λem660nm)光解(646±10nm)并完全转化为B12a,如同通过UV-Vis(图17)和LC/MS(表3)评价的。后者显示形成三种磺基Cy5衍生物,即醛、被转化为醛的氢过氧化物,以及烷基产物(方案S4)。相比之下,保持在黑暗中的Cbl-3,以及暴露于646nm(表1)的Cbl-1保持其结构完整性。
与Cbl-1一样,Cbl-3在光解时显示荧光增强(表1和图21)。还制备并研究了Atto725(Cbl-4,λex730nm,λem750nm)和800(Cbl-5,λex775nm,λem794nm)衍生物。Cbl-4和Cbl-5分别在730±10和780±10nm下的光解通过LC/MS验证(图18和19,表4和5)。与Cbl-3相同,Cbl-4和Cbl-5均在黑暗中稳定,如通过LC/MS证实的。此外,将TAMRA衍生物,Cbl-1暴露于这些长波长中对其结构完整性没有显著影响(表1)。
为了评价波长选择性光裂解的潜力,将各个钴胺素-荧光团缀合物暴露于546,646,727,和777nm中,如表1所示。Cbl-1不吸收超过600nm的光,并且其不收暴露于>600nm光中的影响。以类似方式,Cbl-3,Cbl-4,和Cbl-5对暴露于546nm(表1)或暴露于长于由这些化合物吸收的那些的波长显示很小或没有影响。例如,具有吸收650nm光的附加荧光团的Cbl-3对727和777nm照射是惰性的。附加ATTO725的Cbl-4在646nm下具有显著的肩吸收并且777nm下具有非常弱的吸收。Cbl-4通过在646nm下显示中度光解和在777nm下显示非常小的光解以可预测方式响应。最后,800修饰的Cbl-5不受646nm和727nm下光解的影响,但如预期的对777nm作出响应。不受理论或原理的限制,这些测试的示例性实施方案证实了钴胺素-荧光团缀合物对符合附加荧光团的激发光谱的波长作出响应,可以快速光解。
表1.在546nm(5分钟)、646nm(5分钟)、727nm(20分钟)和777nm(10分钟)光下光解时钴胺素-荧光团缀合物的荧光增强百分比,其中,*<6%。
表1中的结果提示,通过应用适当的照射顺序和波长选择,可能选择性地光解钴胺素-取代的衍生物的混合物中的特定化合物。由于Cbl-4在777nm下显示少量的光解,因此使用附加Alexa700的缀合物Cbl-6(于700nm敏感,但于777nm有抗性)取代后者(Cbl-4)。Cbl-5、Cbl-6、Cbl-3、Cbl-1的混合物在777nm下的照射仅提供Cbl-5光解(图2a)。混合物随后暴露于700nm中引起Cbl-6转化为其光产物而不影响Cbl-3或Cbl-1(图2b)。最后,在646和546nm下顺序照射(图2c和2d)分别选择性地光解Cbl-3和Cbl-1。因此,不仅可能调整光释放到特定波长,而且通过荧光团和照射波长顺序的适当选择,以可预测的方式正交地和顺序地光解四种化合物。
进一步地,以下实施例研究了荧光团附加到烷基钴胺素的核糖5′-OH上的化合物的合成和性质。具体地,以下实施例研究了这样的化合物是否可以用于促进Co-烷基键的光裂解(表1,AdoCbl-1–AdoCbl-4)。
辅酶B12-TAMRA缀合物(AdoCbl-1)的合成和表征显示于图10中。
辅酶B12-乙二胺缀合物2的合成:
将辅酶B12(0.0209g,13μmol)和1,1-羰基二-(1,2,4-三唑)(0.0142g,87μmol)加入到烘干的圆底烧瓶。使用Ar净化容器。将干燥的二甲基甲酰胺(0.2mL)加入到烧瓶中并在室温下搅拌混合物1小时。将乙二胺(0.0270g,450μmol)加入到反应混合物中并继续搅拌另外18小时。通过HPLC(半制备的C-18柱)纯化目标化合物,所述HPLC使用线性梯度二元溶剂系统(溶剂A:0.1%TFA/H2O;溶剂B:0.1%TFA/CH3CN),A:B的比率从97:3(0分钟)到10:90(40分钟)变化。通过冻干去除溶剂,得到橙色固体(0.0189g,86%);C75H107N20O18PCo(M2+):m/z的ESIMS计算值=832.9,实测值833.4;(M3+):m/z的ESIMS计算值=555.2,实测值556.2。
辅酶B12-TAMRA缀合物(Ado-Cbl-1)的合成:将N,N,N′,N′-四甲基-O-(N-琥珀酰亚胺基)四氟硼酸脲(TSTU,0.0139g,46μmol)、TAMRA(0.0127g,30μmol)和DIPEA(0.0230g,178μmol)在2:2:1二甲基甲酰胺:二噁烷:水溶液(250μL)中混合2小时。加入辅酶B12-乙二胺缀合物2(0.0039g,2.3μmol),并混合反应物18小时。通过HPLC(半制备的C-18柱)纯化目标化合物,所述HPLC使用线性梯度二元溶剂系统(溶剂A:0.1%TFA/H2O;溶剂B:0.1%TFA/CH3CN),A:B的比率从97:3(0分钟)到10:90(40分钟)变化。通过冻干去除溶剂,得到红色固体(0.0026g,53%);C100H128CoN22O22P(M2+):m/z的ESIMS计算值=1039.4,实测值1039.8;(M3+):m/z的ESIMS计算值=693.0,实测值693.6;(M4+):m/z的ESIMS计算值=519.7,实测值520.5。
辅酶B12-荧光团缀合物(AdoCbl-2、AdoCbl-3和AdoCbl-4)的合成和表征显示在图11中。
钴胺素-荧光团缀合物的常规合成:
将荧光团(1当量)的N-羟基琥珀酰亚胺酯、辅酶B12-乙二胺缀合物2(1.5当量)和二异丙基乙胺(6当量)在二甲基甲酰胺中混合18小时。通过HPLC(半制备的C-18柱)纯化目标化合物,所述HPLC使用线性梯度二元溶剂系统(溶剂A:0.1%TFA/H2O;溶剂B:0.1%TFA/CH3CN),A:B的比率从97:3(0分钟)到10:90(40分钟)变化。通过冻干去除溶剂,得到固体。
辅酶B12-磺基Cy5缀合物(AdoCbl-2):蓝色固体,87%,C107H142N22O26PS2Co(M2+):m/z的ESIMS计算值=1152.5,实测值1152.7;(M3+):m/z的ESIMS计算值=768.3,实测值768.8。
辅酶B12-ATTO725缀合物:蓝色固体(AdoCbl-3),69%,对于C75H106N20O18PCo-Atto725(M2+):m/z的ESIMS估计值=1031.4,实测值1032.3;(M3+):m/z的ESIMS估计值=687.6,实测值688.5(已经报道了ATTO725羧酸的配方和准确质量)。
辅酶B12-800缀合物(AdoCbl-4):蓝色固体,90%,对于C75H106N20O18PCo-800(M2+):m/z的ESIMS估计值=1279.6,实测值1279.6;(M3+):m/z的ESIMS估计值=853.1,实测值853.2(已经报道了800,羧酸的配方和准确质量)。
MeCbl、Cbl-1、Cbl-2、AdoCbl和AdoCbl-1的光解速率比较
常规方法:对于546±10nm的光解,使用选择性带通滤波器,使用OrielXe闪光灯(800mJ,62Hz)进行。通过使用PerkinElemerLambda2UV/Vis分光荧光计,检测混合物在350nm下的吸收来确定烷基钴胺素到羟钴胺素的转化(Taylor,R.T.;Smucker,L.;Hanna,M.L.;Gill,J.Arch.Biochem.Biophys.1973,156,521–533.)。
Cbl-6和Cbl-7光解产物的确定
常规方法:对于分别为700和646±10nm的Cbl-6和Cbl-7的光解,使用选择性带通滤波器,使用OrielXe闪光灯(800mJ,62Hz)进行2小时。通过LC/MS分析所产生的样品(100μL),所述LC/MS使用线性梯度二元溶剂系统(溶剂A:0.1%甲酸/H2O;溶剂B:0.1%甲酸/CH3CN),A:B的比率从97:3(0-5分钟)到3:97(5-18分钟)变化。
使用了辅酶B12(AdoCbl)衍生物(9)。TAMRA-取代的衍生物AdoCbl-1(2.9±0.3μM-1/m)在546nm下的光解速率是其天然存在的未标记相对物AdoCbl(1.7±0.2μM-1/m)的光解速率的近两倍(图32–34),证实了在不受理论或原理的限制的情况下,TAMRA的激发在增加光解中发挥作用。然后制备包含长波长荧光团的AdoCbl-缀合物以确定Co-烷基连接的光裂解是否可以在超过钴胺素部分吸收的波长(即>600nm)下诱导,所述长波长荧光团包括磺基Cy5(AdoCbl-2)、Atto725(AdoCbl-3)和Dylight800(AdoCbl-4)。
已经显示了AdoCbl的光解产生腺苷、腺苷-5′-醛和5′-过氧腺苷(5′-peroxyadenosine)(9)。LC/MS证实了AdoCbl和AdoCbl-1的546nm照射产生这些产物(表6)。相比之下,仅吸收<600nm的光的AdoCbl和AdoCbl-1两者在超过600nm的波长抗光解(表7和8)。具有附加的磺基Cy5(λex650nm)的AdoCbl-2当暴露于546和646nm下时产生腺苷产物,但不受730和780nm光的影响(表9)。AdoCbl-3(Atto725,λex730nm)在暴露于546、646和730nm中时递送腺苷光解产物,但在暴露于780nm中时不递送腺苷光解产物(表10)。此外,尽管AdoCbl-3在546和730nm下经历完全光解,但在暴露于646nm中时保持显著量的起始材料。观察到的部分光解可以与以下事实一致,即包含在AdoCbl-3内的Atto725在646nm区域具有较小的肩吸收。最后,包含Dylight800(λex780nm)-的AdoCbl-4对在546、730和780nm下的照射作出响应,生成预期的腺苷产物(表11)。使用730nm观察到部分光解,并且可能是由于Dylight800的肩吸收。AdoCbl-4在646nm下抗光解,原因是在该波长下缺乏吸收。因此,对于这些示例性实施方案,基于附加到核糖5′-OH上的荧光团的激发光谱,附着到钴胺素的Co上的化合物的光解释放是可调的。
表2-12显示了其中附加到烷基钴胺素的核糖5′-OH上的荧光团的化合物的性质。
表2.在黑暗中储存并在546±10nm下光解(Xe闪光灯)20分钟的Cbl-1缀合物(10μM)。
表3.在黑暗中储存并使用Xe闪光灯在646±10nm下光解20分钟的Cbl-3(10μM)。
表4.在黑暗中储存并使用Xe闪光灯,在730±10nm下光解150分钟Cbl-4(10μM)。
表5.在黑暗中储存并使用Xe闪光灯在780±10nm下光解3小时的Cbl-5(10μM)。
光解条件 | 保留时间(min) | 观察到的质量 | 指定的结构 |
黑暗 | 12.9 | 1139.7(M2+)、760.4(M3+) | Cbl-5 |
780nm | 9.9 | 665.0(M2+) | 羟钴胺素 |
表6.在黑暗中储存之后并使用Xe闪光灯在700±10nm下光解2小时之后的Cbl-6(20μM)。
表7.在黑暗中储存并使用Xe闪光灯,在546±10nm下光解(20分钟)、646nm下光解(20分钟)、730nm下光解(150分钟)和780nm下光解(3小时)的AdoCbl(10μM)。
表8.在黑暗中储存并使用Xe闪光灯,在546±10nm下光解(20分钟)、646nm下光解(20分钟)、730nm下光解(150分钟)和780nm下光解(3小时)的AdoCbl-1(10μM)。
表9.在黑暗中储存并使用Xe闪光灯,在546±10nm下光解(20分钟)、646nm下光解(20分钟)、730nm下光解(150分钟)和780nm下光解(3小时)的AdoCbl-2(10μM)。
表10.在黑暗中储存并使用Xe闪光灯,在546±10nm下光解(20分钟)、646nm下光解(20分钟)、730nm下光解(150分钟)和780nm下光解(3小时)的AdoCbl-3(10μM)。
表11.在黑暗中储存并使用Xe闪光灯,在546±10nm下光解(20分钟)、646nm下光解(20分钟)、730nm下光解(150分钟)和780nm下光解(3小时)的AdoCbl-4(10μM)。
表12.在黑暗中储存并使用Xe闪光灯,在646±10nm下光解2小时的Cbl-7(20μM)。
以下实施例证实了活性剂可以缀合到示例性的化合物上,然后其能够以活性形式从所述化合物释放。具体地,到被光激活为止在生物化学上/生物学上惰性的生物试剂可以通过共价修饰生物活性的功能基团来制备(例如,从临界的羟基转化为硝基苄基醚)。由于Co-烷基键的光解产生通常对于生物活性来说不需要的功能基团(烷基、醛、氢过氧化物),因此单独钴胺素的潜在应用可以受到限制。然而,考虑到细胞的区室化性质,生物活性化合物可以通过使用光改变其亚细胞位置而从非活性形式转化为活性形式。例如,隔绝将线粒体靶向某些其他细胞位点的细胞毒性剂应该会对其毒性造成干扰。随后的光解将能够使细胞毒性剂迁移到其作用的细胞内位点,从而引起细胞死亡。
在该实施例中,制备了Cbl-7,其包含根据基于线粒体的机制为细胞毒性的附加的650荧光团。由于钴胺素衍生物可以被核内体吸收并保留在核内体中,因此,附加的650,潜在的治疗剂是核内体上捕获的。与本文描述的其它实施方案类似,Cbl-7在被附加的荧光团吸收的波长下(在分光荧光计中646nm)遭到光解,产生了相应的荧光增强(220±30%,表1,图35)。基于其激发光谱,Cbl-7对于超过700nm的波长不受影响(图36)。LC/MS数据显示,646nm光主要生成烷基衍生物650-3(图12,方案S7,表12)。
Cbl-7累积在核内体中,如使用罗丹明B-右旋糖酐,核内体标记物证实的(Mander系数0.77)。事实上,甚至在黑暗中5小时之后,Cbl-7仍被保留在核内体中(图39)。使用650nm光照射包含Cbl-7的细胞提供类似于在分光荧光计(220±30%)中观察到的荧光增强(230±6%,图37-38)。此外,650nm光促进了650荧光从核内体到线粒体的转移,如通过线粒体(mitchondrial)标记物,绿色(Mander系数:0.97)评价的。
该实施例描述了可以使用远红外和近红外荧光团来控制波长选择性形式的生物活性。
组织的光学窗口由可见和近红外光谱(600–1000nm)组成,其中光具有其最大组织穿透力。通过循环系统中的血红蛋白和皮肤中的黑色素遮蔽<600nm的区域,而水干扰光穿透>1000nm。这些考虑在用于活体内成像的试剂的设计中发挥重要作用,其可以在活体动物内在细胞和生物化学水平提供信息(Pittet2011)
具有优化特性(光稳定性、亮度、水溶性)的远红外和近红外荧光团的宿主在市场上可买到(Owens1996)其中的一些已经发现临床应用(Ovens1996;East2009;Kiesslich2003)。此外,组织光学窗口的尺寸提供了另外的机会:“~600到1000nm的大的光学成像窗口使在单个实验中能够使用多个荧光探针,而没有在成像通道之间通过的显著出血。多通道成像具有促进同时观察到多个靶标或预后指标的很大潜力,最终导致改进的疾病诊断”(Hilderbrand2010)
与已经对于光学组织窗口成像建立的进展和机会相反,使用光控制生物活性保持限于常规使用短的可见波长的单独试剂。最近已经描述了使用远红外和近红外光控制生物学的策略(Shell2014)此外,该策略利用过多可获得的远红外和近红外荧光团,从而允许研究者以预先设定的波长特异性方式独立地控制多种生物试剂的作用。
光激活的试剂的生物学应用,从生物化学到生物医学,包括光介导的酶抑制剂和传感器,抗癌治疗、生物材料和诊断(Lee2009;Lawrence2005)。例如,制备了酶传感器和抑制剂、基因表达的激活剂和蛋白质的光可激活的类似物以询问细胞内时空事件(Dai2007;Veldhuyzen2003;Wang2006;Wood1998;Lin2002;Singer2005)三个代表性实施例示出了光响应剂的生物学实用性:(a)光可激活形式的肌动蛋白丝切蛋白证实肌动蛋白丝切蛋白充当细胞的方向盘的组分(Ghosh2002;Ghosh2004);(b)光激活的蛋白激酶C(PKC)传感器显示PKCβ在前期是活动的并且对于进入中期是必需的(Dai2007);(c)基于天然产物百日青蜕皮酮5的光激活的基因表达系统示出了在单个细胞中的遗传控制的动态行为(Singer2005;Larson2013)。
硝基苄基部分起到光可移动的作用,如在图40(3-5)中示出的。尽管自报道光敏性硝基苄基修饰的ATP类似物以来的数十年来已经引入了许多其他光响应性基团,但硝基苄基衍生物保留了用于构建光响应剂的标准的光可裂解基团。最近,已经引入双光子技术进行该领域中的努力中(Aujard2006;Gug2008)。某些光可裂解的发色团可以组合两个同时吸收(<1fs)的长波长光子的能量,提供了使用近红外光(例如>700nm)驱动另外的短波长(350nm)现象的机会。然而,双光子技术具有其挑战。首先,双光子横截面局限于窄平面,其限制了可以光释放的物质的量和应用区域的尺寸。更重要的是,如在最近的综述中记载的,既可以被有效地光解又可以在生物学条件下使用的两个光子敏感保护基团的获得“仍然未知”(Bort2013)。
有机钴胺素的光解。自Barker和其同事描述辅酶B12(6;R=5’-脱氧腺苷或H)的光敏性以来已经超过50年(Barker,1958)。从那时起,已经报道了许多烷基化-钴胺素(烷基化-Cbl)(Dolphin,1964)。
光诱导了Co3+-烷基键的均裂,首先提供Cbl(Co+2)7和烷基自由基8产物(图41的方案1)。后者随后形成烷基、醇和/或醛衍生物,而Cbl(Co2+)将与水组合以生成Cbl(Co3+)(OH)。该研究证实了其中RCH2=腺苷基(adenosyl)的这些产物以及许多其他替代物。Cbls和其烷基化对应物在340–380nm的范围内、在~420nm和广泛地500至560nm吸收光。在任意这些波长下的照射诱导Co-烷基键断开及高量子收率(0.1–0.4)(Taylor1973)之前,未使用Co-烷基键的光敏性生成光可激活的生物活性化合物。
有机钴胺素的远红外和近红外光解。Co3+-烷基键较弱(<30kcal/mol),提示超过咕啉环吸收的波长(>560nm)应在能量上足以光裂解。事实上,计算表明与1100nm一样长的波长具有裂解有机-Cbl中的Co-C键所需要的能量。是否可以将“天线(antennas)”附加到Cbl上,用于捕获与长波长光相关的能量并将其转移到Co-咕啉环系统?通过将多个荧光团附加在附着于Co(9)的烷基链上并附加在核糖环羟基部分(10)上探索了“天线”假说(图42)(Shell2014):
(1)所有Cbl-荧光团衍生物在附加的荧光团的激发波长下遭到光解,所述荧光团包括含有TAMRA(546nm,9/10)、磺基Cy5和650(646nm)、Alexa700(700nm)、ATTO725(727nm)和800(777nm)的那些。简言之,基于市场上可获得的荧光团的激发光谱,容易地编码光解波长。
(2)作为(1)的结果,可能通过在适当波长下照射,从高达四种不同的有机Cbl衍生物的混合物选择性地光解单个化合物。
(3)多个R基团(10)可以是光释放的,包括如下所述的生物活性物质。
生物活性物质从钴胺素的光释放。
通常通过使用光可裂解部分修饰对于生物活性必要的功能基团来制备光响应性小分子。然而,构建光响应性化合物的更常规的方法使用Cbl是可行的。Cbl缀合物是细胞不可渗透的,或在该细胞的情况下被核内体摄取(takeup)并保留在核内体中(Bagnato2004;Gupta2008)。核内体隔离和/或细胞的不渗透性二者具有相同的作用:活性物质不能与其预期的细胞内靶标相互作用。出于这种考虑,制备并研究了Cbl缀合物(Shell2014):
Cbl-65011:650是线粒体毒素(Kamkaew2013;Awuah2012),但缀合物在黑暗中无毒性。在650nm下照射快速启动了将650运输(trafficking)到癌细胞内的线粒体。
Cbl-cAMP12:cAMP对细胞的细胞骨架具有深刻影响,但缀合物12在黑暗中对REF52成纤维细胞行为无活性。照射诱导应力纤维的丢失、细胞收缩和变圆,已知为cAMP依赖性蛋白激酶信号传导通路的结果(Oishi2012)。
Cbl-阿霉素13:阿霉素是广泛使用的抗癌剂,其显示不靶向(offtarget)心脏毒性(Patil2008;Volkova2011)将该缀合物在海拉细胞中的细胞毒性作为照射时间的函数进行研究。仅光处理,或在缺乏光解的情况下暴露于13对细胞活性没有影响。相比之下,在13存在下增加照射时间提供了最终概括由单独阿霉素产生的细胞死亡的光剂量依赖性增加。
然后,类似地,远红外和近红外荧光团享有广泛的临床应用。这些荧光团可以用于以波长选择性方式控制生物活性,提供如在下一个实施例中描述的时空控制多个光响应性物质。
该实施例涉及波长-编码的光响应性分子构建体(molecularconstruct)。研究了钴胺素基光响应性结构的范围和限制。获得了在红光、远红外和近红外光中有活性的数组波长控制的钴胺素-药物缀合物。此外,鉴别了在黑暗中促进硫醇钴胺素稳定性病在照射时光裂解的结构特征。评价了硫醇钴胺素作为肽治疗法的载体的应用。
本研究集中于基于Cbl的响应性结构的范围和限制以鉴别正交控制的波长响应性结构组,并研究将用于递送治疗肽的硫醇钴胺素的光化学。
波长编码:正交控制的探索。如在之前的实施例(或多个实施例)中记载的,通过从长到短波长,即777nm、700nm、646nm、546nm的顺序照射光解四种不同的物质(Shell2014)。对于在该具体实验中使用的四个荧光团,由于在激发更短波长荧光团的区域中更长波长荧光团吸收光,因此选择性活化需要顺序光解。如果有光引发情况的希望顺序,则顺序照射是足够的。然而,完全正交控制提供了顺序独立性,因此就生物调节而言更大的灵活性。鉴别了光响应性结构的互不干扰正交对:Cbl-磺基Cy5和Cbl-800在646nm和777nm下在光化学上不同(图44)。因此,其可以在不需要依靠具体照射顺序的情况下单独地进行光操作。该工作的目标是建立光解释放的定量测量并鉴别波长特异性响应器的三和四正交组。在以下的其他实施例中讨论了生物医学基本原理。
有大量的市场上可获得的红色、远红外和近红外荧光团:PromoFluors(Promokine)、DYs(Dyomics)、ATTO(Atto-TEC)、Fluors(AnaSpec)、Alexa(Invitrogen)、(Pierce)等。这些荧光团中的许多的光物理特性概述可在fluorophores.org网站找到。
尽管空间限制排除了许多可能性的详细讨论,但提供(furnished)两个实施例以说明将要进行的策略。三正交组:ATTO594(λex602nm)、IRDye700DX(λex689nm)和Promo-Fluor-840(λex843nm)。四正交组:ATTO594(λex602nm)、IRDye700DX(λex689nm)、DY-751(λex751nm)和Promo-Fluor-840(λex843nm)。荧光团是基于其非叠加的激发波长来进行选择的。如所描述的合成了包含这些荧光团的甲基-Cbl衍生物(14)(如45)(Shell2014)
将评价波长定向的化合物特异性光释放的选择性,其随意设置成20倍。不符合该标准的荧光团-Cbl将被其他市场上可获得的荧光团取代。
尽管吸光度/激发充当预测在任何特定波长下的光敏性的向导,但如荧光团的消光系数、从荧光团到Cbl的能量转移效率和量子收率(Φ)这样的变量将有助于通过其可以区分两个或更多个荧光团-Cbl的程度。对于所有化合物(14),光解速率将作为波长的函数获得以便提供波长选择性在这些衍生物中的定量评价。通过吸收光谱容易地评价产物形成速率;光解产物(15)的光谱与起始烷基-Cbl14的显著不同(图45)。
其次可以确定在引导荧光团-取代的缀合物(14)的指定波长下的Φ。Φ可以提供在作为波长的函数的光敏化/光释放中的任何急下降的定量测量。Φ典型地通过标准(“化学光量计”)的同时光解来确定,然而K3[Fe(C2O4)3](250–500nm)和内消旋-二苯基半日花烯(475–610nm)标准两者缺乏我们技术需要的波长宽度。通过使用从一个方向测量的辐照度的样品照射和在相对于照射源90°下光解产物(15)的定量,发展了对烷基-Cbl的Φ的直接评价。
可以评价氨甲喋呤(16)和地塞米松(19)的Cbl衍生物(17和21)的长依赖性光释放(图46)。两种药物常规地用于RA的治疗。在(16)中突出显示的羧化物对于活性是不需要的并且已经将多个取代基(包括肽、抗体和聚合物)缀合到该位置(Majumdar2012;Wang2007;Everts2002)。与该讨论最相关的是与预期的光解产物(18)类似/相同的抗炎性N-烷基甲酰胺MTX衍生物的阵列(X=H、OH)(Heath1986;Rosowsky1986;Piper1982;Rosowsky1981;Szeto1979)。DEX(19)也可作为乙酸酯(20)(R=Me)在药学上获得,所述乙酸酯与许多其他短链酰化DEX衍生物(例如22)一样,被设计成促进皮肤/眼睛渗透性(Markovic2012;Civiale2004)或由于其低水溶性当作为肌肉内储库注射时用作缓释形式(Samtani2005)。(17)和(21)的波长可辨别形式将在缓冲液中通过LC-MS评价并在随后的实施例中的基于细胞的研究中,通过市售ELISA试剂盒评价。(17)和(21)不被设计成在从Cbl的光释放之前或之后有活性或无活性(图46)。
光响应性硫醇钴胺素。抗炎性基于肽的试剂受到了大量关注(Luger2007;Bohm2012)尽管当前可以将肽偶联到如(17)中的Cbl-氨基柄,或如(20)中的Cbl-羧基柄,但很可能存在于给定的肽框架上的多个亲核试剂或亲电子试剂可以使得这样的合成方法烦琐。出于这种考虑,探索了硫醇钴胺素(硫醇-Cbl)的制备和性质。
硫醇-Cbl(24)易于制备:简单地将硫醇暴露于(23)中性、水性、需氧条件下(图47,方案2)。谷胱甘肽-Cbl(25)是维生素B12的主要细胞内形式之一(Pezacka1990;Brasch1999)描述了少数其他硫醇-Cbl,包括N-乙酰基Cys(26)(图48)(Pezacka1990;Brasch1999)。
在空气中的光解产生Co(II)-Cbl产物,该Co(II)-Cbl产物被氧化成Co(III)物质和硫自由基,该硫自由基被转化为二硫化物或氧化产物(图47,方案2)(Tahara2013)已经研究了荧光团-取代的N-乙酰基Cys-Cbl衍生物(27)的光裂解,结果为未标记的硫醇-Cbl(在(27)中R=CH3)仅在小于400nm的波长下光解。然而(27)的荧光团-取代的衍生物经历在荧光团吸收下的光解裂解。解决了以下问题:
(i)制备光响应性硫醇-Cbl的结构要求是什么?已经制备了蛋白激酶底物(28)的几个Cbl-Cys类似物(30-33)(图49)。除了(33)以外,所有的Cbl-肽在黑暗中稳定。黑暗稳定的Cbl-肽的光裂解速率变化显著:(32)(12x)>(31)(2x)>(30)(1x)。这些结果提示附近的功能性影响光化学裂解速率和黑暗稳定性。特别地,最接近的微环境能够影响光生成的亲密[Co(II)Cbl/thiyl]自由基对分开的能力,所述自由基对已知控制光解收率(Peng2010)。
可以鉴别那些确保黑暗稳定系还促进快速光解释放的Cys-Cbl微环境。这将通过研究Ac-Xaa-Cys-Yaa-酰胺三肽的Cbl缀合物的稳定性和光响应特性来评价。将制备在Xaa和Yaa位置包含19个不同氨基酸的肽文库(Cys将从Xaa和Yaa中排除)。以一个肽每孔形式合成的361-元文库将暴露于(i)HO-CoIII-Cbl以制备相应的肽-S-CoIII-Cbl缀合物(ii)通过作为时间的函数的吸收光谱评价了缀合物在黑暗中的稳定性;和(iii)作为波长(360、440和550nm)的函数的光裂解速率。这提供了关于局部结构如何影响Cys-Cbl黑暗稳定性/光响应性的信息,从而鉴别促进黑暗稳定性和光裂解的那些序列。可能的是还可以探索另外的非天然结构特征(Lee1999;Lee2000;Yeh2001)。
(ii)硫醇-Cbl是否易受波长-定向的正交控制的影响?尽管简单的硫醇-Cbl仅易受短波长光解(<400nm)的影响,但可以通过附着荧光天线(例如,香豆素、Cy3、Atto550;参见27)赋予其在更长波长下的光响应性。延长了在550nm外面的光响应性。可以在(27)上插入远红外和近红外天线阵列,其中将用从肽文库研究鉴别的引导物取代NacCys。试剂的正交波长响应集的黑暗稳定性、光响应性和捕获有待探索。有待获得光解速率和Φ。
(iii)肽基生物活性物质是否能够从硫醇-Cbl中释放?假说鉴别了Xaa-Cys-Yaa的引导序列并假说在远红外/近红外光中正交、波长定向的光释放是可行的,则可以研究附加到两个肽基抗炎药的Cbl-三肽缀合物的黑暗稳定性/光响应性:13个氨基酸α黑素细胞刺激激素(α-MSH)(Getting2009;Luger2007)和膜联蛋白-1肽片段Ac2-26(Yang2013)。
如本文所描述的,评价了包含附加文库鉴定的含Cys的三肽的游离肽的生物活性。在不太可能的情形下肽在生物学上无活性,在Xaa-Cys-Yaa和抗炎肽序列之间的插入间隔区(例如Ser-Gly)可能是必需的。一旦验证了肽的生物活性,将制备常规形式(27)的荧光团-Cbl-肽。对于这些中的每一个记记录了光解的黑暗稳定性和速率作为波长的函数并进行了比较对比。在硫醇-Cbl的光物理性质不足(例如,黑暗中不稳定性、使用红外光照射时的释放差等)的事件中,应当可行的是使用生物正交化学如Huisgen反应将肽附着到适当衍生的烷基-Cbl上(Best2009;Kolb2001)。
该实施例描述了波长-编码的药物递送。已经证实了可以将生物试剂隐蔽在红细胞膜的居群稠密的蛋白鞘中并随后光释放以生成活性物质,包括治疗剂、第二信使和酶传感器。将该验证策略与在其他实施例中开发的波长编码结构偶联以生成药物释放载体的新家族。除了提供分别控制多种药物的时空释放的潜在方式以外,该策略提供了对于血液的光解环境保护治疗肽的可能的常规方法。
波长编码的药物递送。目前使用NSAID、糖皮质激素和疾病修饰抗风湿药物(DMARD)的混合物治疗RA。DMARD使疾病进展变慢并且包含一系列小分子,仅举几例MTX(16)(图46)、氯喹、环孢霉素A、D-青霉胺、多种金盐和柳氮磺吡啶。“生物制品”是相对新的DMARD家族并包括抗体基试剂英夫利昔单抗、依那西普、阿达木单抗、赛妥珠单抗和高利单抗(Golimumab)(Kukar2009)。此外,几种基于肽的试剂已经显示了非凡的DMARD反应,但受到困扰大多数肽的药代动力学性质的限制(Luger2007;Bohm2012)。生成所有这些药物的光可激活形式是不切实际的。而代之以使用糖皮质激素(DEX,19)、DMARD(MTX,16)和两种肽(α-MSH和Ac2-16)来探索波长-编码的药物递送的实用性。以下概括的方法应适用于RA库(arsenal)的许多(如果不是大多数的话)药物。
红细胞作为光可释放表面负载的治疗药物的载体。在这些实施例中概述的工作被设计成探索远红外/近红外光响应性试剂的一个新系列的光物理性质。以不应干扰其活性(即,17、21和肽)的方式将Cbl有意地安装在生物活性剂上。代之以,开发供选择的方法来控制生物活性:将生物试剂隐蔽在细胞膜的居群稠密的蛋白鞘中并随后光释放以生成活性试剂(图50)(Nguyen2013)在该策略中,将光可裂解基团插入在隐蔽的生活试剂和其脂质锚之间。该实施例探寻了将该策略及相关策略应用于构建波长-编码的药物递送载体。
如之前记载的,已经将红细胞描述为“药物递送系统[的]冠军”(Muzykantov2010)包括生物制品的药物可以容易地引入到红细胞内部并附着到细胞表面(Muzykantov2013)如图50中所显示,使用在RBC表面上的常规硝基苄基基团(35)(Nguyen2013)(hν=360nm)的表面策略以及Cbl物质(36)(hν=550nm)来隐藏并光释放蛋白酶和蛋白激酶传感器(图51)。这些研究使用其中去除大多数血红蛋白的RBC血影(ghost)进行。然而,血影缺乏正常红细胞的循环寿命。可以使用超过血红蛋白达到的波长来控制光释放使得普通RBC可以用作光响应性药物载体。
图50脂质锚的主要需要是三倍:(i)疏水性部分,以及(ii)荧光团和(iii)Cbl的附着位点。尽管许多选择可获得,但首先要使用与成功提供并入RBC的/光可释放的衍生物(35)和(36)类似的策略(Nguyen2013;SmithUnpublishedResults)将制备赖氨酸衍生物(37)(图52);合成方案(Leschke1997)提供了用于使用荧光团和脂质阵列的必要的灵活性。其中荧光团=乙酰基的衍生物将被用作对照以比较并对比在不同波长下的光释放速率。药物作为酰胺、(MTX;17)、酯(DEX;21)、硫醇-(肽;27)或其变体将附着到Cbl上。进行了以下探索:(i)生物活性剂从RBC的波长依赖性释放和评价,(ii)波长依赖性正交控制RBC-Cbl-药物混合物。
尽管证实了小分子和肽均可以隐藏在RBC的蛋白鞘内(Nguyen2013),但不清楚更大的肽如α-MSH和Ac2-26,当通过单个位点附加在RBC表面时对于其生物受体是否将不可用。结果(iii)还研究了形成的衍生物:Xaa-Cys(Cbl-脂质)-Yaa-peptide-Xaa-Cys(Cbl-脂质)-Yaa。假定在RBC的两个位点附着将使肽平放在膜上,使其生物上不可用直到光释放。最后(iv)探索了这些衍生物的黑暗稳定性,尤其是在铺平板的(plated)成纤维细胞的存在下(RBC未附着)。具体地,研究了在黑暗中培养时是否发生脂化Cbl从RBC膜到成纤维细胞膜的不期望的转移。这些实验在包含白蛋白的血清的存在下完成,所述白蛋白是可以潜在地从RBC膜中浸出的另一个物质(37)。是否应观察到脂化Cbl从RBC到其他细胞或可溶蛋白的不想要的转移,C18锚将使用以下取代:(a)二酰基磷脂,以增强膜的亲和力或(b)将Cbl部分共价地附加到RBC膜上。
红细胞作为光可释放内部负载的治疗药物的载体。药物也可以负载到红细胞的内部。例如,已经使用RBC顺序地递送相对于单独的自由药物具有增强的寿命的DEX(Rossi2006)。药物负载通过将RBC暴露于低渗溶液中容易地完成,所述暴露在膜中产生小孔。在药物摄取之后,施用等渗溶液以封闭孔。该过程极为温和并保持RBC的功能完整性(Muzykantov2010;Biagiotti2011)。然后,将包含药物的RBC再引入到患者体内。
将DEX负载到RBC作为DEX-21-磷酸酯、一种非扩散性的细胞不可渗透性形式的药物。DEX-21-磷酸酯在RBC中缓慢水解以提供从红细胞中扩散的DEX。DEX的该缓慢释放形式涉及了多个临床试验,包括作为囊性纤维化、共济失调毛细血管扩张、溃疡性结肠炎和克罗恩病的治疗药物(Rossi2004;IEDAT01;Bossa2008;Castro2007)。DEX-21-磷酸酯/RBC用作潜在常规策略的模型:RBC中药物的细胞内隔离。假定由于衍生物不是膜可渗透的,因此荧光团-Cbl-药物不会从RBC渗漏出来。在药物-Cbl键光解时,裂开的药物然后游离以逃出RBC。
探索了以下问题:(i)是否可以通过低渗负载将荧光团-Cbl-生物试剂引入到RBC中并保留在黑暗中?(ii)是否可以在适当波长下照射时释放生物试剂?
另外,可使用多种纳米技术充当适合的RBC替代物。例如,介孔二氧化硅纳米粒子在已经负载多种药物的蜂窝式配置中包含数百个空通道(Vivero-Escoto2010;Li2012;Coll2013)。已经使用包括光可裂解物质的一批部分对这些通道加帽(Croissant2013;Mal2003;Wan2013)。通道加帽剂的光去除引起药物释放。可以改变通道直径以封装从小药物到蛋白质的所有事物(Popat2011)。结果使用荧光团-Cbl加帽的通道提供了以波长限定的方式释放药物、肽和蛋白质的手段。介孔二氧化硅纳米粒子(和其他纳米技术)可以充当光编码策略的应用的有用结构。
该再一个实施例描述了通过波长编码的药物特异性释放以检测按需位点靶向的抗炎控制。使用动脉/滑膜界面的多个人类细胞系基3D模型评价了波长-编码的药物递送策略的有效性。某些结构的光和波长依赖性能力可以阻止在动脉内皮、免疫系统和滑膜的细胞模型中的促炎性信号和细胞粘附分子的表达。研究了这些试剂在剪切流条件下阻止白细胞到模型关节炎滑膜的跨内皮转移的能力。另外,测试了波长-编码的药物递送是否可以用于在脉管系统-滑膜关节界面的3D模型中分配具体治疗药物。
通过波长编码的药物规定的释放:按需位点靶向的抗炎控制的评价。
使用关节炎动脉/滑膜界面的多个人类细胞系基3D模型评价了波长-靶向的药物递送的有效性。充当关节炎滑膜的发炎的内皮脉管系统释放吸引白细胞(例如,单核细胞,CD4+T细胞)的促炎细胞因子。白细胞通过细胞粘附分子(CAM)结合到发炎的内皮并随后通过血管壁迁移到滑膜。另外的细胞内(单核细胞→巨噬细胞)和生物化学(促炎性信号的白细胞释放)事件发生,最终导致对滑膜关节组分的损伤。MTX和DEX阻止这些以及其他促炎性信号/行为。此外,α-MSH和相关的衍生物已经描述为具有“类固醇的重大性质但没有副作用”(Getting2009)。不幸地,α-MSH在血液中被快速蛋白水解(Catania2004)。肽Ac2-26也显示了给人印象深刻的RA抗炎活性(Yang2013)。
研究了四种细胞类型,单独地和在3D组合中两者,以评价一些试剂的性质:(i)HMEC-1是常规被认为是血管内皮的非常好的模型之一的内皮细胞(EC)系。还使用市场上可获得的HUVEC作为供选择的EC系(ii)THP-1单核细胞系,通常用于“提供洞察在血管炎症过程中单核细胞-巨噬细胞与其他血管细胞的互连的作用”。此外,单核细胞(CD14+)使用商业试剂盒从RA外周血液单核细胞(PBMC)中分离(iii)T细胞包含高达50%的滑膜组织细胞,其中大多数是CD4+。他们同样地从RAPBMC中分离(iv)使用来自RA患者的人类滑膜细胞以模仿滑膜细胞环境。
在这些实施例中的光响应性试剂是应为水溶性(ws)的单分子实体,而其它与载体(RBC或介孔二氧化硅)相关。“ws”和“rbc”指定附加Cbl-的药物的性质。例如,MTXws是水溶性Cbl-连接的MTX衍生物。在(i)生物化学和(ii)细胞水平进行了以下的一系列实验,并使用(iii)多波长控制:
(i)生物化学控制:HMEC-1和THP-1细胞系两者通过细胞因子(IL-1α、IL-6、IL-8和TNFα)的产生和释放、细胞表面CAMs(ICAM-1、VCAM-1、E-选择)的表达和NF-κB的激活对炎性激活作出响应;生物化学响应已知受到MTX、DEX、Ac2-26和αMSH的控制(Luger2007;Everts2002;Chan2010;Chen2002;Nehme2008;Joyce1997;Peshavariya2013)。此外,已知MTX促进在HMEC-1和淋巴细胞中的腺苷释放(Morabito1998)。
腺苷的抗炎性质至少部分归因于阻止CAM的产生(Linden2012)。研究了Cbl-试剂以波长-依赖性方式抑制HMEC-1/HUVEC、THP-1/分离的单核细胞和淋巴细胞中的炎症反应的能力。这里明确地讨论了一个例子以例证完成的实验。
MSHrbc:假定隐藏在红细胞表面上的蛋白锚下的αMSH直到光释放才与其他细胞上的其受体相互作用(图50)。此外,评价了MSHrbc的光解稳定性。尽管αMSH的十分有希望的抗炎性质,但当通过IV给药时,由于血清蛋白酶,其半衰期仅几分钟(Bohm2012;Catania2004)。之前报道了其他肽,当隐藏在RBC的蛋白鞘中时,被保护直到光释放才发生蛋白水解(Nguyen2013;SmithUnpublishedResults)。确定了在已知作用于αMSH的存在下,αMSH和MSHrbc的相对蛋白水解稳定性(图50;单-和双位点附着)(Bohm2012)。还评价了血清中的相对稳定性。注意的是可能有必要改变肽上的脂质锚位点以确保其生物沉默和蛋白水解稳定性。最后,与其他抗炎药不同,已知MSH将CD4+转化为调节性T细胞(Tregs),其用于取消免疫应答并将自身免疫性疾病的潜在治疗显著地算在内(Wright2011)。使用之前描述的方案评价了CD4+T细胞到Tregs的光依赖性MSHrbc-转化(Taylor2011)。
这些实施例的大多数Cbl-试剂应在照射(即阻止细胞因子活化和CAM表达)之前和之后具有生物活性。DEX-CblWS很可能是个例外,因为假定Cbl附加物赋予DEX取代膜(substituentmembrane)不可渗透性,从而使其在光解之前不能结合到其细胞内受体。
相比之下,假定RBC-基Cbl试剂被设计成直到光释放才有活性。
(ii)细胞控制:RA的标志是白细胞招募到滑膜/滑液膜并在滑膜/滑液膜中累积。白细胞跨内皮迁移到关节炎滑膜通过白细胞和内皮细胞(EC)两者介导。该迁移行为(和通过药物干预)的体外模型通常由在胶原凝胶上培养的EC单层组成(图53)(Muller2008;Shulman2009)。定量了从RA患者分离的THP-1细胞和单核细胞对化学引诱物(例如,RANTES、MCP-1)做出响应,穿过激活的(TNFα)EC单层的迁移。记载了DEXws、MTXws、MSHws、Ac2-26ws、DEXrbc、MTXrbc、MSHrbc和Ac2-26rbc阻止在黑暗中和预照射时跨内皮迁移的能力。预期抗炎药物的光释放抑制ECCAMs/RANTES-刺激的单核细胞的TNFα-刺激的表达,从而阻止跨内皮迁移。这里明确地讨论了一个实施例。
描述了促进细胞粘附的各种各样的“RGD”肽,包括靶向发炎的RA内皮的几种九肽(Yang2011;Wythe2013;Lee2002)。GRGDSY序列由于已知其结合到EC,甚至在附加到聚合物时,因此用于初步研究(Lin1992)。制备了常规结构脂质-Cbl-间隔区-GRGDSY的各种类似物,并在RBC的细胞表面上插入脂质-肽缀合物(图54a)。然而,将RBC引入到内皮单层迁移测定系统。注意,其他人描述了RGD-修饰的RBC并且这些已经显示结合到EC(Fens2010)。尽管通过将RGD肽共价附着到表面蛋白来制备这些之前描述的RBC,但假定本文描述的脂质锚定的RGD肽以类似方式起作用。结合到内皮单层的RBC通过显微镜并通过以下假说证实,所述假说为单核细胞迁移到凝胶单层将受到结合的RBC的阻止/阻碍(图54b)。RGD肽从细胞表面的光裂解从内皮单层释放RBC并恢复单核细胞结合/迁移。
假定如所述的发生RBC/EC接触,则使用跨室(transswell)格式来评价抗炎药物从与EC接触的RBC(图55a)的光释放是否比从在溶液中游离的RBC(图55b)的光释放具有更强的效果。这通过比较从暴露于等量的图55a和图55b中的RBC的EC[生物化学控制(i)]的炎症性蛋白表达水平来分析。
还评价了RBC释放的抗炎剂下调在激活的(CD3和CD28)T细胞和从RA患者分离的滑膜细胞中的炎性生物化学响应的能力。这些细胞放置在跨室板的下室中,从而充当通过内皮屏障与动脉系统分离的关节炎滑膜的3D模型。αMSH和Ac2-26在RBC释放时是否能够穿过内皮单层并影响下室中的炎性行为?这些实验在上室中在血清存在下进行以激发(challenge)αMSH和Ac2-26的光解稳定性(比较图55a/55b)。最后开发了室,其中上区室具有入口和出口以模拟剪切流条件(Muller2008)。流室可以安装在我们的显微镜上,其使用用于光激活和数字记录图像捕获的板上激光(on-boardlaser)整合。
如在之前小节中讨论的,水溶性Cbl-肽应易受蛋白水解的影响。注意,在小的毛细血管中的长期RBC/EC接触(图55a)可能是有害的;因此,药物排出之后的RBC释放是重要的。
(iii)多波长控制:在一些实施方案中,本公开提供了具有使用特定波长控制不同抗炎剂释放能力的化合物的实施方案。初始实验研究了从包含不同药物的RBC混合物中的波长特异性释放。
DEX(NeogenCorporation)和MTX(AlphaLabs)检测的免疫分析可在市场上获得,并且αMSH和Ac2-26肽通过LC-MS可检测。使用关节炎动脉/滑膜模型,追踪了图55a策略的延伸。
虽然不希望受到理论的限制,人们认为可行的是:将RBC停靠在内皮单层处、使用一种波长卸载药物并使用第二种波长分离RBC。脂化RGD肽与其光可裂解的Cbl(脂质-Cbl-间隔区-GRGDSY,图54a)应经得起该方法的考验。最后,可能通过光诱导的RBC停靠、药物卸载和RBC分离来对此进一步延伸。简言之,该技术由于其赋予单独控制多个生物事件,包括药物扩散的改变、肽/药物从细胞表面的释放和细胞附着/分离的可能性,因此非常灵活。
在本研究中,开发了生成光可激活试剂的一种新策略,该策略代表了与自1978年以来适当的方法的显著背离。这些试剂不仅在组织的光学窗口内操作,而且其还可以被编码以对特定波长作出响应。制备了一系列波长触发的抗炎药物/钴胺素缀合物。后者将使用“药物递送系统[的]冠军”,RBC来递送,其现在由于长波长响应性结构的可用性而是可行的。此外,证实了蛋白水解上易受影响的肽可以“隐藏”在RBC的血浆膜蛋白质鞘内,为递送作为治疗剂的肽提供了潜在常规策略。最后,使用设计为模拟关节炎动脉/滑膜界面的多人类细胞系基3D模型系统研究了时空控制的药物递送的治疗实用性。
接下来,描述了抗炎剂从高度选择性药物递送的红细胞膜的某些示例性近红外介导的释放的合成方法和表征。
图56显示了药物/荧光团B12缀合物的结构,包括Cbl-1(氨甲喋呤)、无脂质尾部的Cb1-2(氨甲喋呤)、Cbl-3(秋水酰碱)、无脂质尾部的Cbl-4(秋水酰碱)、Cbl-5(地塞米松)、Cbl-6(TAMRA)、Cbl-7(荧光素(Fluoroscein)akaFAM)。图57包括荧光团天线的结构。
膜锚定点1的合成(图58):将十八烷基胺基氰钴胺素(1):氰钴胺素(200mg,148μmol,mw=1355)溶解在10mL无水DMSO中并加入CDT(121mg,740μmol,mw=164)。搅拌溶液45分钟。向该溶液中加入十八烷胺(398mg,1.48mmol,mw=269)以快速搅拌溶液。搅拌反应混合物1小时,然后加入到醚(either)/三氯甲烷中。通过离心和倾析收集沉淀物。在真空下干燥沉淀物,并加入10mLEtOH。使十八烷胺二聚形成白色沉淀物,通过离心去除该白色沉淀物,用40mL醚/三氯甲烷沉淀钴胺素并通过离心和倾析收集。将球团溶解在EtOH中并在100gC18闪光柱上,使用线性梯度纯化,所述线性梯度为用8个柱体积,从0–100%的H2O:MeOH梯度。以100%MeOH洗脱C18修饰的钴胺素,收率为75%(Grissom,C;Lee,M.Org.Lett.2009,11,2499-2502)。
十八烷基胺基钴胺素(1):红色固体,75%,C82H125CoN15O15P-(M2+)的ESIMS计算值=825.98(Grissom,C;Lee,M.Org.Lett.2009,11,2499-2502)
膜锚定点:2a的合成(图58):3-氨基丙基十八烷基胺基钴胺素(2a):将1(100mg,61μmol,mw=1651)溶解在10mL的EtOH中并在N2.NH4Br(500mg,5%w/v)下脱气,加入Zn粉(200mg,3mmol),并在N2下搅拌溶液20分钟。向该浆液中加入3-氯丙胺盐酸盐(40mg,305μmol,mw=130)。在连续N2流动下搅拌所产生的混合物3小时。观察到颜色从红色变为橙色。通过离心去除锌,并用醚:三氯甲烷(50mL)再结晶钴胺素两次。通过离心和倾析收集所产生的沉淀物。在真空下干燥沉淀物,并加入10mLEtOH。UV-Vis分析显示烷基化进行完全。2a在100gC18闪光柱上,使用线性梯度纯化,所述线性梯度为用8个柱体积,从0–100%的H2O:MeOH(0.1%TFA)梯度。2a以100%MeOH洗脱。
3-氨丙基十八烷基氨基钴胺素(2a):橙色固体,[收率有疑问],C84H133CoN15O15P-(M2+)的ESIMS计算值=842.96即为实测值。
膜锚定点:2b的合成(图58):将十八烷基氨基钴胺素丁酸酯(Octadecylaminocobalaminbutyrate)b):1(100mg,61μmol,mw=1651)溶于10mL的EtOH,在N2.NH4Br(500mg,5%w/v)下脱气,加入Zn粉(200mg,3mmol),并在N2下搅拌溶液20分钟。向该浆液中加入4-氯丁酸(30μL,305μmol,mw=122,d=1.24)。在连续N2流动下搅拌所产生的混合物3小时。观察到颜色从红色变为橙色。通过离心去除锌,并用醚:三氯甲烷(50mL)再结晶钴胺素两次。所产生的沉淀物i通过离心和倾析收集。在真空下干燥沉淀物,并加入10mLEtOH。UV-Vis分析显示烷基化进行完全。2b在100gC18闪光柱上,使用线性梯度纯化,所述线性梯度为用8个柱体积,从0–100%的H2O:MeOH(0.1%TFA)。2b以100%MeOH洗脱。
C85H133CoN14O17P-(M2+)的ESIMS计算值=855.95即为实测值。
MTX-C18-B12的合成(图59):氨甲喋呤十八烷基胺基钴胺素(cbl-1):将氨甲喋呤(30mg,66μmol,mw=454)、N,N,N′,N′-四甲基-O-(1H-苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸酯(HBTU,25mg,66μmol,mw=379)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA,58μL,332μmol,mw=129,d=0.74)溶解在5mL的DMF中并搅拌5分钟。加入2a(120mg,71μmol,mw=1681),并搅拌溶液过夜。由于2a和Cbl-1不能通过HPLC分离,因此加入1,4,5,6,7,7-六氯-5-降冰片烯-2,3二羧酸酐(37mg,185umol,mw=370)。搅拌溶液30分钟,然后冷冻在-80℃下,小心地直到正好在纯化之前才解冻。Cbl-1在来自Restek的VivaC4制备柱5μm,250x21.2mm上,H2O:CAN,0.1%TFA纯化,洗脱时间46分钟。
氨甲喋呤十八烷基胺基氰钴胺素(Cbl-1):橙色固体,37%,对于C104H153CoN23O19P-(M2+)的ESIMS计算值=1059.7,实测值1060.3;(M3+)计算值=706.5,实测值707.2。
单功能化的钴胺素:3a的合成(图60):3-氨基丙基钴胺素(3a):将氰钴胺素(200mg,148μmol,mw=1355)溶解在10mL的MeOH中并在N2.NH4Br(500mg,5%w/v)下脱气,加入Zn粉(200mg,3mmol),和在N2下搅拌溶液20分钟。向该浆液中加入3-氯丙胺盐酸盐(40mg,305μmol,mw=130)。在连续N2流动下搅拌所产生的混合物3小时。观察到颜色从红色变为橙色。通过离心去除锌,并用醚:三氯甲烷(50mL)再结晶钴胺素两次。所产生的沉淀物通过离心和倾析收集。在真空下干燥沉淀物,并加入10mLEtOH。UV-Vis分析显示烷基化进行完全。3a在100gC18闪光柱上,使用线性梯度,即用8个柱体积,从0–100%的H2O:MeOH(0.1%TFA)梯度纯化。3a以50%MeOH洗脱。
单功能化的钴胺素:3b的合成(图60):钴胺素丁酸酯(3b):将氰钴胺素(200mg,148μmol,mw=1355)溶解在10mL的MeOH中并在N2.NH4Br(500mg,5%w/v)下脱气,加入Zn粉(200mg,3mmol),并在N2下搅拌溶液20分钟。向该浆液中加入3-氯丙胺盐酸盐(40mg,305μmol,mw=130)。在连续N2流动下搅拌所产生的混合物3小时。观察到颜色从红色变为橙色。通过离心去除锌,并用醚:三氯甲烷(50mL)再结晶钴胺素两次。通过离心和倾析收集所产生的沉淀物。在真空下干燥沉淀物,并加入10mLEtOH。UV-Vis分析显示烷基化进行完全。3b在100gC18闪光柱上,使用线性梯度,即用8个柱体积,从0–100%的H2O:MeOH(0.1%TFA)梯度纯化。3b以60%MeOH洗脱。
MTX-B12(Cbl-2)的合成:(图61):氨甲喋呤钴胺素(Cbl-2):将氨甲喋呤(30mg,66μmol,mw=454)、N,N,N′,N′-四甲基-O-(1H-苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸酯(HBTU,25mg,66μmol,mw=379)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA,58μL,332μmol,mw=129,d=0.74)溶解在5mL的DMF中并搅拌5分钟。加入3a(98mg,71μmol,mw=1386),使溶液搅拌过夜。Cbl-2在100gC18闪光柱上,使用线性梯度纯化,即用8个柱体积,从0–100%的H2O:MeOH(0.1%TFA)梯度纯化。
氨甲喋呤钴胺素(Cbl-2):橙色固体,65%,,C86H117CoN21O18P-(M2+)的ESIMS计算值=910.9,实测值912.6;(M3+)=607.2,实测值608.8。
脱乙酰秋水酰碱的合成显示于图62中,如之前描述的(Lebeau,L.;Ducray,P.;Mioskowski,C.SYNTH.COMMUN.1997,27,293-296.)。
秋水酰碱-C18-B12(Cbl-3)的合成显示于图63中。秋水酰碱十八烷基胺基钴胺素(Cbl-3):将2b(63mg,37μmol,mw=1681)、N,N,N′,N′-四甲基-O-(1H-苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸酯(HBTU,10mg,26μmol,mw=379)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA,15μL,86μmol,mw=129,d=0.74)溶解在2mL的DMF中并搅拌5分钟。加入4(10mg,28μmol,mw=1386),并使溶液搅拌过夜。Cbl-3在来自Restek的VivaC4制备柱5μm,250x21.2mm)上,H2O:CH3CN,0.1%TFA纯化,洗脱时间35分钟。
秋水酰碱十八烷基胺基钴胺素(Cbl-3):橙色固体,C105H153CoN15O21P-(M2+)的ESIMS计算值=1025.0,实测值1026.5;(M3+)=683.3,实测值684.5。
秋水酰碱-B12(Cbl-4)的合成显示于图64中:秋水酰碱钴胺素(Cbl-4):3b(58mg,41μmol,mw=1416)、N,N,N′,N′-四甲基-O-(1H-苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸酯(HBTU,10mg,26μmol,mw=379)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA,15μL,86μmol,mw=129,d=0.74)溶解在2mL的DMF中并搅拌5分钟。加入4(10mg,28μmol,mw=1386)并使溶液搅拌过夜。Cbl-4在100gC18闪光柱上,使用线性梯度,即用8个柱体积的0–100%的H2O:MeOH(0.1%TFA)梯度纯化。
秋水酰碱钴胺素(Cbl-4):橙色固体,C86H116CoN14O20P-(M2+)ESIMS的计算值=877.4,实测值878.5;(M3+)=584.9,实测值586.2。
DEX-C18-B12(Cbl-5)的合成显示于图65中。地塞米松琥珀酰十八烷基胺基钴胺素(Cbl-5):将5(6mg,12μmol,mw=492)、N,N,N′,N′-四甲基-O-(1H-苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸酯(HBTU,5mg,12μmol,mw=379)和N,N-二异丙基乙胺(TEA,10μL,57μmol,mw=129,d=0.74)溶解在1mL的DMF中并搅拌5分钟。加入2a(30mg,18μmol,mw=1681)并使溶液搅拌过夜。Cbl-5用Restek、H2O:CH3CN、0.1%TFA在VivaC4制备柱5μm,250x21.2mm)上纯化,洗脱时间62分钟。
地塞米松琥珀酰十八烷基胺基钴胺素(Cbl-5):橙色固体,C110H164CoN15O22P-(M2+)的ESIMS计算值=1078.1,实测值1079.3。
5-TAM-C18-B12(Cbl-6)的合成显示于图66中。5-TAMRA十八烷基胺基钴胺素(Cbl-6):将5-TAMRA(5mg,12μmol,mw=430)、N,N,N′,N′-四甲基-O-(1H-苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸酯(HBTU,4.5mg,12μmol,mw=379)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA,8.3μL,48μmol,mw=129,d=0.74)溶解在5mL的DMF中并搅拌5分钟。加入2a(20mg,12μmol,mw=1681)并使溶液搅拌过夜。Cbl-6在来自Restek的VivaC4制备柱5μm,250x21.2mm)上,H2O:CH3CN、0.1%TFA纯化,洗脱时间46分钟。
5-TAMRA十八烷基胺基钴胺素(Cbl-6):红色固体,C109H154CoN17O19P-(M2+)的ESIMS计算值=1047.5,实测值1048.7;(M3+)=698.3,实测值699.3。
5-FAM-C18-B12(Cbl-7)的合成显示于图67中。5-FAM十八烷基胺基钴胺素(Cbl-7):将5-FAM(5mg,12μmol,mw=430)、N,N,N'N’-四甲基-O-(N-琥珀酰亚胺基)脲四氟硼酸酯(TSTU,3.6mg,12μmol,mw=301)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA,8.3μL,48μmol,mw=129,d=0.74)溶解在5mL的DMF中并搅拌5分钟。加入2a(20mg,12μmol,mw=1681),并使溶液搅拌过夜。Cbl-7在来自Restek的VivaC4制备柱5μm,250x21.2mm)上,H2O:CH3CN,0.1%TFA纯化,洗脱时间46分钟。
5-FAM-十八烷基胺基钴胺素(Cbl-7):橙色固体,C104H143CoN15O19P-(M2+)的ESIMS计算值=1020.0,实测值1021.5;(M3+)=680.0,实测值681.2。
Cy5-C18(Fl-1)的合成显示于图68中。Cy5-C18(4)的合成:a)Br(CH2)5CO2H、KI、CH3CNb)CH3Ic)丙二醛二苯胺、AcOH、Ac2Od)2、吡啶、AcOHe)DIC(N,N’-二异丙基碳二亚胺)、TEA、十八烷胺、CH2Cl2。如之前报道合成Cy5(Kiyose,K.;Hanaoka,K.;Oushiki,D;Nakamura,T.;Kajimura,M.;Suematsu,M.;Nishimatsu,H.;Yamane,T.;Terai,T;Hirata,Y;和Nagano,T.JACS.2010,132,15846–15848.)
Cy7-C18(Fl-2)的合成显示于图69中。Cy7-C18(6)的合成:a)N-[5-(苯氨基)-2,4-戊二烯醛缩]二苯胺盐酸盐、AcOH、Ac2Ob)7、AcOH、吡啶c)DIC、TEA、十八烷胺、CH2Cl2(Kiyose,K.;Hanaoka,K.;Oushiki,D;Nakamura,T.;Kajimura,M.;Suematsu,M.;Nishimatsu,H.;Yamane,T.;Terai,T;Hirata,Y;和Nagano,T.JACS.2010,132,15846–15848.)。
Alexa-700-C18(Fl-3)的合成。Fl-3:将Alexa700NHS-酯(1mg,1μmol,mw=1086)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA,5μL,29μmol,mw=129,d=0.74)和十八烷胺(5mg,19μmol,mw=269)溶解在500μLDMF中并通过搅拌过夜混合。将所产生的混合物倒入5:1H2O:CH2Cl2混合物(5mL)中。用4mLH2O清洗CH2Cl2层。通过闪光色谱硅胶柱(30g)纯化。MeOH:CH2Cl2(0.1%TFA)线性梯度0-80%。通过旋转蒸发浓缩经纯化的脂化荧光团(注释:尚未公开Alexa700的结构,因此仅提供实验)。
Dy800-C18(Fl-4)的合成显示于图70中。Dy800-C18(12)的合成:a)3-甲基丁酮、AcOH;KOH、MeOH、PrOHb)(10):1,3-丙磺内酯、邻二氯苯(11):Br(CH2)5CO2H、邻二氯苯c)3-氯-2,4-三亚甲基戊二烯醛缩二苯胺盐酸盐、AcONa、EtOHd)10e)苯酚钠、DMFf)DIC、DIPEA、十八烷胺、DMF
表13提供了柱C4的HPLC梯度
另外,这些实施例描述了从RBC膜释放荧光团。
使用525nm光证实了从红细胞膜释放的TAMRA和荧光素(FAM):将红细胞用含有1mMMgCl2的1xPBS清洗3次并稀释到10%红细胞压积。向10%红细胞压积的红细胞中加入Cbl-6(释放TAMRA)或Cbl-7(释放荧光素)至终浓度为1μM。然后,在室温下培养红细胞20分钟,之后用含有1mMMgCl2的1xPBS清洗3次。在最终清洗之后,重悬浮红细胞到10%红细胞压积并将其在525nm光中暴露各个时间点。在光解之后,以1,000g离心红细胞溶液,并使用荧光板读数器分析上清液的TAMRA(Ex:550nmEm:580nm)或荧光素(Ex:492nmEm:519nm)释放。
图71显示了从RBC膜光裂解的Cbl-6和Cbl-7。使用525nm光从结合到红细胞的钴胺素的荧光素释放和TAMRA释放。
使用NIR光证实了从红细胞膜释放的TAMRA(从Cbl-6)和荧光素(从Cbl-7)。将红细胞用含有1mMMgCl2的1xPBS清洗3次并稀释到10%红细胞压积。向10%红细胞压积的红细胞中加入Cbl-6或Cbl-7至终浓度为1μM,和加入Fl-1、Fl-2、Fl-3或Fl-4至终浓度为5μM。然后,在室温下培养红细胞20分钟,之后用含有1mMMgCl2的1xPBS清洗3次。在最终清洗之后,重悬浮红细胞到10%红细胞压积并将其在650,700,730或780nm光中暴露30分钟。在光解之后,以1,000g离心红细胞溶液,并使用荧光板读数器分析上清液的TAMRA(Ex:550nmEm:580nm)或荧光素(Ex:492nmEm:519nm)释放。
图72显示了使用C18缀合的荧光团将FAM的光裂解延伸到近红外光(NIR)。使用Fl-1(650nm)、Fl-2(700nm)和Fl-3(730nm)释放荧光素(从Cbl-7)。使红细胞负载1μMCbl-7和5μM荧光团-C18。使用以上提及的光的波长进行光解30分钟。注意,钴胺素(akaB12)仅吸收高达550nm左右的光;因此,为了吸收超过该波长的光,需要天线荧光团的存在。
确定TAMRA最佳释放的Cbl-6与Fl-1的比率。将红细胞用含有1mMMgCl2的1xPBS清洗3次并稀释到10%红细胞压积。向10%红细胞压积的红细胞中加入Cbl-6至终浓度为1μM,和加入Fl-1至终浓度为0,1,5,10和50μM。然后,在室温下培养红细胞20分钟,之后用含有1mMMgCl2的1xPBS清洗3次。在最终清洗之后,重悬浮红细胞到10%红细胞压积并将其在650nm光中暴露30分钟。在光解之后,以1,000g离心红细胞溶液,并使用荧光板读数器分析红细胞溶液的TAMRA(Ex:550nmEm:580nm)。图73证实了使用650nm光确定[Cbl-6]:[Fl-1]最佳释放比率。
另外的实施例描述了MTX红细胞膜的光释放。
表14显示了通过LC-MS确定MTX浓度。使用UV-Vis检测器,1260无限荧光检测器和6110四极质谱计将75μL样品从394孔板注入到1200系列AgilentHPLC上。移动相由H2O:CH3CN(0.1%FA)(在下表14中提供的梯度)组成。使用的柱是来自Restek的VivaC4分析柱5μm,50x21.2mm。通过计算从3.1-3.7分钟的300nm下的UV吸光度踪迹下面积来确定浓度,其中显示MTX裂解产物以洗脱,并将该整合与已知标准进行比较。质量截留为450道尔顿。荧光检测器ex.365nmem.470nm检测光降解的已知产物。
表14
图74显示了MTX标准曲线。以1μM、500nM、100nM、50nM和10nM浓度制备Cbl-1稀释液。将这些在525nm光下光解直到检测不到完整的Cbl-1。然后取100uL等分部分通过LC-MS分析,并计算每个浓度的曲线下面积。这一式三份进行,并且通过与产生的标准曲线比较生成所有[MTX]数据。
氨甲喋呤(MTX)从红细胞膜的光释放。将红细胞用含有1mMMgCl2的1xPBS清洗3次并稀释到10%红细胞压积。向10%红细胞压积的红细胞中加入Cbl-1至终浓度为1μM,和/或5μMFl-1。然后,在室温下培养红细胞20分钟,之后用含有1mMMgCl2的1xPBS清洗3次。在最终清洗之后,重悬浮红细胞到10%红细胞压积并将其在525或650nm光中暴露10,30和60分钟。在光解之后,以1,000g离心红细胞溶液,并通过LC/MS分析上清液的MTX释放。
图75证实了从RBC释放的MTX-C18-B12(CBl-1)。使用525nm光和650nm光随时间从RBC释放MTX。橙色表明存在5μMFl-1和1μMCbl-1。蓝色样品仅包含Cbl-1。因此对于在650nm下的有效药物释放需要Fl-1。
氨甲喋呤DHFR抑制测定。使用Sigma二氢叶酸还原酶测定试剂盒监测二氢叶酸还原酶活性。该试剂盒用于监测NADPH到NADP+的转化。简言之,制备含有1.5mUDHFR,100μMNADPH和1x测定缓冲液(随试剂盒提供)的测定缓冲液。使用荧光板读数器(Ex:340nmEm:450nm)监测在不同浓度MTX或从MTX-C18-B12光解的MTX(在100nm到5μM之间)下的DHFR活性的抑制。
图76显示了MTX的DHFR抑制测定。通过氨甲喋呤(圆形)和光解的氨甲喋呤(三角形)抑制DHFR。
通过LC-MS确定秋水酰碱(表15)。使用UV-Vis检测器,1260无限荧光检测器和6110四极质谱计将75μL样品从394孔板注入到1200系列AgilentHPLC上。移动相由H2O:CH3CN(0.1%FA)(在下表中提供的梯度)组成。使用的柱是来自Restek的VivaC4分析柱5μm,50x21.2mm。通过计算从4.1-4.8分钟的360nm下的UV吸光度踪迹下面积来确定浓度,其中显示秋水酰碱裂解产物以洗脱,并将该整合与已知标准进行比较。质量截留为400道尔顿。
表15
秋水酰碱标准曲线。以5μM、1μM、500nM和100nM浓度的10%烯丙醇和水溶液制备Cbl-3稀释液。将这些在525nm光下光解直到检测不到完整的Cbl-3。然后取100uL等分部分通过LC-MS分析,并计算每个浓度的曲线下面积。这一式三份进行,并且通过与产生的标准曲线比较生成所有后面的秋水酰碱浓度数据。图77显示了秋水酰碱标准曲线。
图78显示了秋水酰碱-C18-B12(Cbl-3)辛醇/H2O迁移。光解的秋水酰碱(从Cbl-3)从辛醇扩散到水中而使其量增加,直至10分钟处的最大光解。由于分子的疏水性质,甚至在裂解之后平衡仍偏向辛醇,但直到裂解发生才检测到向水迁移。
使用负载C18-B12-氨甲喋呤的RBC处理海拉细胞。将海拉细胞以4.4x104细胞/孔的密度铺在12孔组织培养平板中并保持在DMEM(10%FBS、1%Pen-Strep)中,在37℃下、具有5%CO2气氛的湿度控制培养器中。第二天,使用PBS清洗细胞两遍,然后使用在L-15培养基(在5%红细胞压积下5μM负载体积)或300μLL-15(对照细胞)中的300μL负载Cbl-1的RBC悬浮液处理。将细胞保持在黑暗中或暴露于绿色LED光源(PAR38;500–570nm发射;5mW功率)中15分钟。在加入小等分部分的含有FBS的培养基以使血清浓度为0.5%之后,细胞随后被放置在在37℃下的湿度控制培养器中。48小时之后,使用PBS清洗细胞,三次,每次1mL,并且向每个孔中加入400uL的L-15培养基,接着加入80μL的MTS试剂(PromegaCellTiter96AqueousOneSolution)。使用MTS试剂在37℃下培养细胞3小时,并使用平板读数器(PerkinElmerHTS7000)测量492nm下的吸光度。
分区研究(Partitionstudy)。将包含研究分子(5μM)的辛醇(250μL)在1.5mL清澈离心管中使用dH2O(250μL)彻底混合并允许平衡10分钟,然后以21,000g离心10分钟。使用525nmLED光解样品0、1、5、10和20分钟,然后通过震荡混合并允许平衡15分钟。在此之后是21,000g下的10分钟离心。从希望的层(或多个层)中取等分部分,通过对有问题化学品特异的LC-MS法确定每个的浓度。
使用秋水酰碱处理海拉细胞。将海拉细胞以1.5x105细胞/孔的密度铺在6孔玻璃底板(Mattek)上并保持在DMEM(10%FBS,1%Pen-Strep)中,在37℃下、具有5%CO2气氛的湿度控制培养器中。第二天,在湿度控制培养器中,在37℃下使用秋水酰碱(SigmaC9754;1mM储备液的DMSO溶液)或DMSO清洗细胞30分钟或1小时。在培养期完结时,在室温下用1mL的甲醇固定细胞10分钟。用PBS清洗细胞两次,每次1mL,并用5%驴血清封闭1小时。封闭之后,与用抗体稀释缓冲液(1%BSA;0.3%Triton-X-100;PBS)以1:100稀释的小鼠抗微管蛋白抗体(细胞信号传导3873S),在4℃下培养过夜。然后,在与用抗体稀释缓冲液以1:500稀释的抗小鼠Alexa488第二抗体(LifeTechnologiesA21202)培养之前,用PBS清洗细胞(3x5分钟)。在用PBS清洗细胞(3x5分钟)之后,使用配备有HamamatsuC8484照相机、40X相位差物镜和FITC荧光滤色块(Semrock)的倒置OlympusIX81显微镜获得图像。使用Metamorph软件进行图像分析。
图79显示了秋水酰碱对海拉细胞的影响。这是阳性对照。当加入更多秋水酰碱时,微管蛋白网瓦解。
使用负载Cbl-3的RBC处理海拉细胞。将海拉细胞以3.3x104细胞/孔的密度铺在24孔玻璃底板(Mattek)上并保持在DMEM(10%FBS,1%Pen-Strep)中,在37℃下、具有5%CO2气氛的湿度控制培养器中。第二天,用PBS清洗细胞两次,接着加入100uL的L-15培养基。然后使用250μL的负载Cbl-3的红细胞的PBS悬浮液(在5%红细胞压积下,6μM负载体积)处理细胞或用250μLPBS处理细胞(对照细胞)。然后将细胞保持在37℃下在湿度控制的培养器中,或在室温下暴露于530nMLED泛光(PAR38;500–570nm发射;5mW功率)5、10或20分钟。所有细胞在光解之后,在37℃下在湿度控制的培养器中培养1小时。在培养期完结时,用PBS清洗细胞3次,每次1mL,然后在室温下用1mL的甲醇固定细胞10分钟。用PBS清洗细胞两次,每次1mL,并用5%驴血清封闭1小时。封闭之后,与用抗体稀释缓冲液(1%BSA;0.3%Triton-X-100;PBS)以1:100稀释的小鼠抗微管蛋白抗体(细胞信号传导3873S),在4℃下培养过夜。然后,在与用抗体稀释缓冲液以1:500稀释的抗小鼠Alexa488第二抗体(LifeTechnologiesA21202)培养之前,用PBS清洗细胞(3x5分钟)。在用PBS清洗细胞(3x5分钟)之后,使用配备有HamamatsuC8484照相机、40X相位差物镜和FITC荧光滤色块(Semrock)的倒置OlympusIX81显微镜获得图像。使用Metamorph软件进行图像分析。
图80显示了Cbl-3对海拉细胞的影响。a)在没有光解的情况下暴露于负载Cbl-3的RBC中的海拉细胞。b)暴露于使用525nm光照射20分钟的、负载Cbl-3的RBC中的海拉细胞。c)没有RBC或光暴露的海拉细胞。d)没有RBC但在525nm下光解20分钟的海拉细胞。
以下实施例描述了地塞米松的光致释放。将海拉细胞以7.5x104细胞/孔的密度铺在6孔玻璃底板(Mattek)上并保持在DMEM(10%FBS,1%Pen-Strep)中,在37℃下、具有5%CO2气氛的湿度控制培养器中。第二天,在37℃下、在湿度控制的培养器中,使用不同浓度的地塞米松(1mM储备液的DMSO溶液)或DMSO处理细胞1小时。在培养期完结时,在室温下用4%PFA的PBS溶液固定细胞,然后用PBS清洗细胞1次,然后在室温下使用1mL的甲醇处理细胞5分钟。用PBS清洗细胞两次,每次1mL,之后与用抗体稀释缓冲液(1%BSA;0.3%Triton-X-100;PBS)以1:100稀释的兔抗GRα抗体(abcam3580)在4℃下培养过夜。然后,在与用抗体稀释缓冲液以1:500稀释的抗兔Alexa488第二抗体(LifeTechnologiesA21206)在室温下培养1小时之前,用PBS清洗细胞(3x5分钟)。用PBS清洗细胞(3x5分钟),并在另外使用PBS清洗之后施用Hoescht33342(在PBS中100μg/mL)30分钟。之后,使用配备有HamamatsuC8484照相机、40X相位差物镜和FITC荧光滤色块(Semrock)的倒置OlympusIX81显微镜获得图像。使用Metamorph软件进行图像分析。
图81显示了地塞米松对Grα分布的影响。由于地塞米松缺乏,在a)中类固醇受体均匀地分布在细胞溶质中。在b)中加入250nM地塞米松之后,受体迁移到细胞核并在c)中使用500nM地塞米松观察到该受体。
使用负载Cbl-5的RBC处理海拉细胞。将海拉细胞以2.5x104细胞/孔的密度铺在12孔玻璃底板(Mattek)上并保持在DMEM(10%FBS,1%Pen-Strep)中,在37℃下、具有5%CO2气氛的湿度控制培养器中。第二天,用PBS清洗细胞两次,然后使用500μL的负载Cbl-5的红细胞的L-15培养基的悬浮液(在5%红细胞压积下,1μM负载体积)处理细胞或用500μLL-15处理细胞(对照细胞)。然后将细胞保持在37℃下在湿度控制的培养器中的黑暗中,或在室温下暴露于525nMLED泛光(PAR38;500–570nm发射;5mW功率)10、20或30分钟。所有细胞在光解之后,在37℃下在湿度控制的培养器中培养1小时。在培养期完结时,用PBS清洗细胞3次,每次1mL,然后在室温下用4%PFA的PBS溶液固定细胞10分钟,然后用PBS清洗细胞1次,并在室温下用1mL的甲醇处理5分钟。之后用PBS清洗细胞两次,每次1mL,然后将细胞与用抗体稀释缓冲液(1%BSA;0.3%Triton-X-100;PBS)以1:100稀释的兔抗GRα抗体(abcam3580)在4℃下培养过夜。接下来,在使细胞与用抗体稀释缓冲液以1:500稀释的抗兔Alexa488第二抗体(LifeTechnologiesA21206)在室温下培养1小时之前,用PBS清洗细胞(3x5分钟)。最后用PBS清洗细胞(3x5分钟)。之后,使用配备有HamamatsuC8484照相机、40X相位差物镜和FITC荧光滤色块(Semrock)的倒置OlympusIX81显微镜获得图像。使用Metamorph软件进行图像分析。
图82显示了Grα染色的海拉细胞。a)在没有光解情况下的负载Cbl-5的RBC。b)没有RBC和没有光解。c)暴露于525nm光20分钟的负载Cbl-5的RBC。d)没有使用20分钟525光暴露的RBC。
使用负载Cbl-5的RBC处理海拉细胞并在光解前去除(渗漏测试)。将海拉细胞以8.8x104细胞/孔的密度铺在6孔玻璃底板(Mattek)上并保持在DMEM(10%FBS,1%Pen-Strep)中,在37℃下、具有5%CO2气氛的湿度控制培养器中。第二天,用PBS清洗细胞两次,然后使用250μL的负载Cbl-5的红细胞的L-15培养基的悬浮液(在5%红细胞压积下,1μM负载体积)处理细胞或用250μLL-15处理细胞(对照细胞)。然后将细胞在37℃下在湿度控制的培养器中在黑暗中培养。在1小时预培养之后,用PBS清洗细胞3次,每次1mL(黑室;红色安全光),并向每个孔中加入2mL的L-15。然后将经清洗的细胞暴露于绿色LED光源(PAR38;500–570nm发射;5mW功率)中或保持在室温下的黑暗中15分钟。所有细胞在光解之后,在37℃下在湿度控制的培养器中培养1小时。在第二个培养期完结时,用PBS清洗细胞3次,每次1mL,然后在室温下用4%PFA的PBS溶液固定细胞10分钟,然后用PBS清洗细胞1次,并在室温下用1mL的甲醇处理5分钟。之后用PBS清洗细胞两次,每次1mL,然后将细胞与用抗体稀释缓冲液(1%BSA;0.3%Triton-X-100;PBS)以1:100稀释的兔抗GRα抗体(abcam3580)在4℃下培养过夜。接下来,在使细胞与用抗体稀释缓冲液以1:500稀释的抗兔Alexa488第二抗体(LifeTechnologiesA21206)在室温下培养1小时之前,用PBS清洗细胞(3x5分钟)。最后用PBS清洗细胞(3x5分钟)。之后,使用配备有HamamatsuC8484照相机、40X相位差物镜和FITC荧光滤色块(Semrock)的倒置OlympusIX81显微镜获得图像。使用Metamorph软件进行图像分析。
图83显示了地塞米松-RBC渗漏测试的结果。为了确定Cbl-5与RBC和细胞培养物是否处于平衡,将负载Cbl-5的RBC暴露于a)中的海拉细胞,然后在光解之前去除。Grα未受影响,表明地塞米松保留在了RBC上直到光解发生。b)包含暴露于负载Cbl-5的RBC然后不使用光解清洗的细胞。c)包含光解但未暴露于RBC的海拉细胞。
使用负载Cbl-5的RBC在不同波长下处理海拉细胞。将海拉细胞以2.5x104细胞/孔的密度铺在12孔玻璃底板(Mattek)上并保持在DMEM(10%FBS,1%Pen-Strep)中,在37℃下、具有5%CO2气氛的湿度控制培养器中。第二天,用PBS清洗细胞两次,然后使用500μL的负载Cbl-5的RBC的L-15培养基的悬浮液(在5%红细胞压积下,1μM负载体积)处理细胞或用500μLL-15处理细胞(对照细胞)。然后将细胞保持在37℃下、在湿度控制的培养器中的黑暗中,或在室温下暴露于绿色LED光源(PAR38;500–570nm发射;5mW功率)或780nmLED阵列(内部生成;7mw)中15分钟。所有细胞在光解之后,在37℃下在湿度控制的培养器中培养1小时。在培养期完结时,用PBS清洗细胞3次,每次1mL,然后在室温下用4%PFA的PBS溶液固定细胞10分钟,然后用PBS清洗细胞1次,并在室温下用1mL的甲醇处理5分钟。之后用PBS清洗细胞两次,每次1mL,然后将细胞与用抗体稀释缓冲液(1%BSA;0.3%Triton-X-100;PBS)以1:100稀释的兔抗GRα抗体(abcam3580)在4℃下培养过夜。接下来,在使细胞与用抗体稀释缓冲液以1:500稀释的抗兔Alexa488第二抗体(LifeTechnologiesA21206)在室温下培养1小时之前,用PBS清洗细胞(3x5分钟)。最后用PBS清洗细胞(3x5分钟)。之后,使用配备有HamamatsuC8484照相机、40X相位差物镜和FITC荧光滤色块(Semrock)的倒置OlympusIX81显微镜获得图像。使用Metamorph软件进行图像分析。
图84显示了暴露于在530和780nm下照射的负载Cbl-5的RBC的海拉细胞的细胞。
使用Cbl-5和Fl-4RBC处理海拉细胞。将海拉细胞以1.1x105细胞/孔的密度铺在12孔玻璃底培养皿(Mattek)上并保持在DMEM(10%FBS,1%Pen-Strep)中,在37℃下、具有5%CO2气氛的湿度控制培养器中。第二天,用PBS清洗细胞两次,然后使用100μL的负载Cbl-5/Fl-4的RBC的L-15培养基的悬浮液(在5%红细胞压积下,1μM负载体积)处理细胞。将细胞保持在黑暗中,或暴露于780nmLED阵列(7mW功率)中10、20、30、40或50分钟。将所有细胞在光解之后直到收获放置在37℃下、湿度控制的培养器中。在光解间隔完结时,用PBS清洗细胞3次,每次1mL,然后在室温下用4%PFA的PBS溶液固定细胞10分钟,然后用PBS清洗细胞1次,并在室温下用1mL的甲醇处理5分钟。之后用PBS清洗细胞两次,每次1mL,然后与用抗体稀释缓冲液(1%BSA;0.3%Triton-X-100;PBS)以1:100稀释的兔抗GRα抗体(abcam3580)在4℃下培养过夜。接下来,在使细胞与用抗体稀释缓冲液以1:500稀释的抗兔Alexa488第二抗体(LifeTechnologiesA21206)在室温下培养1小时之前,用PBS清洗细胞(3x5分钟)。最后用PBS清洗细胞(3x5分钟)。之后,使用配备有HamamatsuC8484照相机、40X相位差物镜和FITC荧光滤色块(Semrock)的倒置OlympusIX81显微镜获得图像。使用Metamorph软件进行图像分析。
图85显示了C18-地塞米松-B12/Dylight800RBC的780nm释放的结果。
该进一步实施例显示了MTX、秋水酰碱和地塞米松的溶血研究。
用于溶血研究的方法。向包含给定钴胺素药物复合物(Cbl-1、Cbl-3或Cbl-5)的PBS溶液(100μL;5μM、10μM、20μM和40μM)的1.5mLEppendorf中加入100μLRBC的PBS溶液(10%血细胞压积)。三个另外的样品包含使用RBC处理的PBS。三个样品在加入RBC之前包含0.1%SDS。终浓度为0.5%SDS;0μM、2.5μM、5μM、10μM和20μM脂化-B12-药物。在以300g离心的30分钟之前通过闪烁混合细胞。重新均质化样品并允许在4℃培养过夜。以1000g离心沉淀(pelleted)样品5分钟。将150μL上清液铺在96孔板上并通过UV-Vis在550nm分析。SDS样品稀释10倍以准确测量。据认为SDS吸光度乘以10完全溶血,并认为PBS处理的血液完全不变,以及从剩余背景中减去来自这些样品的吸光度。
图86显示了MTX、秋水酰碱和地塞米松的溶血研究结果。在不同浓度的每种亲脂性药物复合物下测量溶血。在每种情况下RBC对负载5μM或低于5μM浓度是稳定的。
该实施例描述了没有必要将药物附着到介孔二氧化硅纳米粒子中的钴胺素上。如图87-89中所显示,通过钴胺素基光响应性结构在介孔二氧化硅纳米粒子中给药物加帽。图89示出了荧光素从钴胺素加帽的介孔二氧化硅纳米粒子的释放(Fl-MSNP)。荧光强度与空白背景样品有关。将样品储存在黑暗中(5h),然后光解(525nm)两个阶段(30分钟)。在每次光暴露之后(2.5h)混合样品。
可以从纳米粒子释放的示例性药物包括但不限于阿霉素、泰素帝、喜树碱(Camptotechin)、各种siRNA、顺铂、利福平和异烟肼、白喉毒素、5-氟尿嘧啶、伊曲康唑、细胞色素C、胰岛素、cAMP、布洛芬(Ibuoprofen)、万古霉素、白藜芦醇、雌二醇、卡托普利、阿司匹林、盐酸伊立替康、庆大霉素、红霉素、阿伦磷酸钠、丹酚酸B。
虽然相信本领域普通技术人员会很好地理解本文使用的以下术语,但阐述了定义以帮助理解本公开主题。
除非另外限定,本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开主题所属技术领域中普通技术人员常规理解的相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法、器械和材料可被用于本公开主题的实践或测试,但现在描述了代表性方法、器械和材料。
以下长期存在的专利法惯例,术语“一个(a/an)”、“一种(a/an)”和“所述(the)”当在本申请、包括权利要求书中使用时是指“一个或多个”。因此,例如,提及的“荧光团”包括多个这样的图像。
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本文所使用的术语“约”当指质量、重量、时间、体积、浓度或百分比的值或量时,旨在包括从指定量开始的变化,在一些实施方案中为±20%、在一些实施方案中为±10%、在一些实施方案中为±5%、在一些实施方案中为±1%、在一些实施方案中为±0.5%、以及在一些实施方案中为±0.1%,因为这样的变化对进行公开的方法是适当的。
如本文所使用的,范围可以表达为从“约”一个特定值和/或到“约”另一个特定值。还应当理解的是有许多本文公开的值,并且每个值本文也公开为“约”除了值自身以外的该特定值。例如,如果公开了值“10”,则也公开了“约10”。还应当理解的是也公开了两个特定单元之间的每个单元。例如,如果公开了10和15,则也公开了11、12、13和14。
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146.Atto725的分子式和精确质量,羧酸未报告(TheformulaandexactmassofAtto725,carboxylicacidhavenotbeenreported)。
147.Dylight800的分子式和精确质量,羧酸未报告(TheformulaandexactmassofDylight800,carboxylicacidhavenotbeenreported)。
148.Alexa700的分子式和精确质量,羧酸未报告(TheformulaandanaccuratemassofAlexa700,carboxylicacidhavenotbeenreported)。
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Claims (43)
1.一种化合物,该化合物包含:
光不稳定分子;和
第一活性剂,所述第一活性剂被附加到所述光不稳定分子上,其中,所述第一活性剂含有荧光团;并且
其中,当所述化合物暴露于光中时,所述第一活性剂和所述光不稳定分子之间的至少一个键断裂。
2.根据权利要求1所述的化合物,其中,所述光不稳定分子为钴胺素或者其衍生物或类似物。
3.根据权利要求1或2所述的化合物,其中,所述光不稳定分子为烷基钴胺素。
4.根据前述权利要求中任一项所述的化合物,该化合物进一步包含第二活性剂。
5.根据权利要求4所述的化合物,其中,所述第二活性剂包含生物活性剂。
6.根据权利要求4所述的化合物,其中,所述第二活性剂包含第二荧光团。
7.根据权利要求4所述的化合物,其中,所述第二活性剂选自酶、有机催化剂、核酶、有机金属化合物、蛋白质、糖蛋白、肽、聚氨基酸、抗体、核酸、类固醇、抗生素、抗病毒剂、抗霉菌剂、抗癌剂、抗糖尿病剂、抗镇痛剂、抗排斥剂、免疫抑制剂、细胞因子、糖类、疏油物质、脂质、细胞外基质、脱矿骨基质、药物、化学治疗剂、细胞、病毒、病毒载体和朊病毒。
8.根据权利要求4所述的化合物,其中,所述第二活性剂包含抗类风湿性关节炎剂。
9.根据前述权利要求中任一项所述的化合物,其中,所述荧光团被附加到所述钴胺素的钴中心和所述钴胺素的核糖5'-OH中的至少一个上。
10.根据前述权利要求中任一项所述的化合物,该化合物进一步包含位于所述光不稳定分子和所述第一活性剂之间的连接体。
11.根据权利要求10所述的化合物,其中,所述连接体包含烷基、芳基、氨基、硫醚、甲酰胺、酯、醚、或者他们的组合。
12.根据权利要求10所述的化合物,其中,所述连接体包含丙胺、乙二胺、或者他们的组合或衍生物。
13.根据前述权利要求中任一项所述的化合物,该化合物进一步包含位于所述光不稳定分子和所述第二活性剂之间的连接体。
14.根据前述权利要求中任一项所述的化合物,其中,所述光的波长为约500nm至约1000nm。
15.根据前述权利要求中任一项所述的化合物,其中,所述光的波长为约1000nm至约1300nm。
16.根据前述权利要求中任一项所述的化合物,该化合物进一步包含药学上可接受的载体。
17.一种治疗疾病的方法,该方法包括:
将有效量的根据前述权利要求中任一项所述的化合物施用到对象的给药部位;以及
随后将给药部位暴露于光中。
18.根据权利要求17所述的方法,其中,所述光不稳定分子为钴胺素。
19.根据权利要求18所述的方法,其中,所述钴胺素为烷基钴胺素。
20.根据权利要求17所述的方法,其中,所述化合物进一步包含第二活性剂。
21.根据权利要求17所述的方法,其中,所述第二活性剂为生物活性剂。
22.根据权利要求17所述的方法,其中,所述第二活性剂含有第二荧光团。
23.根据权利要求17所述的方法,其中,所述第二活性剂选自酶、有机催化剂、核酶、有机金属化合物、蛋白质、糖蛋白、肽、聚氨基酸、抗体、核酸、类固醇、抗生素、抗病毒剂、抗霉菌剂、抗癌剂、抗糖尿病剂、抗镇痛剂、抗排斥剂、免疫抑制剂、细胞因子、糖类、疏油物质、脂质、细胞外基质、脱矿骨基质、药物、化学治疗剂、细胞、病毒、病毒载体和朊病毒。
24.根据权利要求17所述的方法,其中,所述荧光团被附加到所述钴胺素的钴中心和所述钴胺素的核糖5'-OH中的至少一个上。
25.根据权利要求17所述的方法,其中,所述化合物进一步包含位于所述钴胺素和所述第一活性剂之间的连接体。
26.根据权利要求25所述的方法,其中,所述连接体含有烷基、芳基、氨基、硫醚、甲酰胺、酯、醚、或者他们的组合。
27.根据权利要求25所述的方法,其中,所述连接体含有丙胺、乙二胺、或者他们的组合或衍生物。
28.根据权利要求17所述的方法,其中,所述光的波长为约500nm至约1000nm。
29.根据权利要求17所述的方法,其中,所述光的波长为约1000nm至约1300nm。
30.根据权利要求17所述的方法,其中,所述给药部位为肿瘤处、肿瘤内或肿瘤附近。
31.根据权利要求17所述的方法,其中,所述疾病为类风湿性关节炎。
32.根据权利要求17所述的方法,其中,所述疾病为癌症。
33.根据权利要求17所述的方法,其中,所述疾病为糖尿病。
34.根据权利要求17~33中任一项所述的方法,其中,通过下述方式中的至少一种施用所述化合物:口服给药、透皮给药、吸入给药、经鼻给药、局部给药、经阴道给药、眼部给药、耳内给药、脑内给药、直肠给药、肠胃外给药、静脉内给药、动脉内给药、肌内给药、皮下给药及其组合。
35.一种化合物,该化合物包含:
光不稳定分子,
生物活性剂,和
脂质,其中,所述生物活性剂和所述脂质被附加到所述光不稳定分子上。
36.根据权利要求35所述的化合物,该化合物进一步包含附加到所述光不稳定分子上的荧光团。
37.根据权利要求36所述的化合物,其中,所述光不稳定分子为钴胺素。
38.一种细胞膜,该细胞膜包含:
至少一个膜层和权利要求35所述的化合物,其中,权利要求35所述的化合物被并入至少一个膜层中。
39.根据权利要求38所述的细胞膜,该细胞膜进一步包含:
荧光团,其中,所述荧光团被并入至少一个膜层中。
40.根据权利要求38所述的细胞膜,其中,所述膜为红细胞的膜。
41.一种药物递送系统,该药物递送系统包括:
红细胞;
含有光不稳定分子和生物活性剂的第一化合物;以及
脂质,其中,所述生物活性剂和所述脂质附着到所述光不稳定分子上,并且,
其中,所述化合物被并入红细胞的细胞膜中。
42.根据权利要求41所述的药物递送系统,其中,所述化合物进一步包含荧光团。
43.一种治疗疾病的方法,该方法包括:
将根据权利要求38所述的细胞膜或根据权利要求41所述的药物递送系统中的任意一个施用到对象的给药部位;以及随后
将所述对象暴露于光中。
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