CN108137701A - 用于治疗癌症的针对抑制细胞的近红外光免疫疗法(nir-pit) - Google Patents

用于治疗癌症的针对抑制细胞的近红外光免疫疗法(nir-pit) Download PDF

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Abstract

本申请发现靶向CD25的近红外光免疫疗法引起Treg的独特、快速和空间选择性消耗，其导致经处理的肿瘤消退并在未经处理的肿瘤中诱导全身性免疫应答。基于这些观察结果，提供了杀伤免疫抑制细胞以例如治疗癌症的组合物和方法。减少对象中抑制细胞的数量可消除效应T细胞的抑制，例如使用对象自身的免疫系统治疗癌症。在特定实施例中，所述方法包括使具有抑制细胞表面蛋白的抑制细胞与抗体‑IR700分子接触，其中所述抗体特异性地结合抑制细胞表面蛋白，并且在一些实施例中，所述抗体不具有功能性Fc区。随后例如在660至740nm的波长处例如以至少4J cm‑2的剂量辐照所述细胞。

Description

用于治疗癌症的针对抑制细胞的近红外光免疫疗法(NIR- PIT)
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年8月7日提交的美国临时申请No.62/202,252的优先权，该美国临时申请通过引用并入本文。
技术领域
本申请涉及抗体-IR700缀合物及其用于在用近红外(NIR)光辐照后杀伤特异性地结合抗体的抑制细胞的方法。还提供了通过利用这些方法杀伤抑制细胞来治疗癌症的方法。
背景技术
癌症免疫疗法，包括使用免疫调节性抗体、癌症疫苗和基于细胞的疗法，已经成为控制癌症的重要策略(1-4)。这些疗法虽然微创，但仍有改进空间(5,6)。最近，对免疫细胞和癌细胞之间相互作用的理解得到了提高，从而使得显示出显著的治疗效果的免疫检查点抑制剂得以发展(7-9)。已经开发出多种策略来抑制免疫抑制性调节机制，因此增强抗癌免疫应答，然而，在正常器官中对这些相同功能的全身性阻断导致危及生命并因此导致剂量限制性自身免疫副作用(10-13)。一种选择性地和局部地抑制肿瘤中的调节性T细胞而非进行全身地抑制的方法可避免全身性不良作用。
近红外光免疫疗法(NIR-PIT)是一种治疗癌症的方法，其利用由近红外光活化的抗体-光吸收剂缀合物的活化来杀伤细胞(14)。抗体结合至适当的细胞表面抗原，并且光可活化的二氧化硅-酞菁染料(IRDye700DX)在NIR光暴露后诱导对细胞膜的致死性损伤。NIR光暴露(690nm)在几分钟内诱导高度选择性的、坏死的癌细胞死亡而不损伤邻近的细胞。使用靶向肿瘤EGFR的西妥昔单抗-IR700用于治疗无法手术的头颈部癌症而进行的NIR-PIT的I期人类研究目前正在进行中。NIR-PIT似乎特异性地杀伤靶细胞，同时使相邻的正常细胞不受伤害(15-17)。
在癌组织中，识别癌细胞的T细胞和NK细胞常常大量存在，但它们的细胞毒性功能被附近的免疫抑制细胞例如调节性T细胞(Treg)所抑制(21,22)。因此，控制肿瘤浸润性的CD4+CD25+Foxp3+Treg被认为是增强抗癌免疫反应的重要步骤(23-25)。已经采用了各种方法来消耗或消融Treg，但是它们所取得的成功有限(22,26-28)。例如，使用全身性抗CD25抗体消耗Treg也会消耗表达CD25的抗肿瘤效应细胞，从而降低Treg消耗的治疗效果(29)。在研究环境中，通过肿瘤内注射抗CD4抗体实现了消除Treg(30)。或者，已将经遗传工程化的动物模型设计成允许Treg的瞬时条件消融(31-33)。但是，这种方法在临床上不能转化。因此，非常需要能够局部地、选择性地消耗肿瘤浸润性的Treg而不消耗其他细胞类型和/或全身性Treg的实用技术。
发明内容
本发明人采用靶向CD25的NIR-PIT来选择性地消耗肿瘤微环境中的CD4+CD25+Foxp3+Treg，以诱导同系肿瘤模型中抗肿瘤效应细胞的活化。本文示出与光子吸收剂相缀合的靶向抑制细胞(例如，CD4+CD25+foxp3+调节性T细胞(Treg))的试剂(例如，不含Fc区(例如F(ab')2片段)的针对CD4+CD25+foxp3+Treg的抗CD25抗体)只有在体外和体内暴露于近红外光(NIR)后才能选择性地杀伤这些抑制细胞。还示出了这样的治疗可导致快速和有效的肿瘤杀伤。基于这些观察结果，提供了杀伤抑制细胞(例如以治疗肿瘤)的方法。还提供了抗体-IR700分子，其中抗体特异性地结合抑制细胞表面蛋白，并且在一些实施例中不包含功能性Fc区。这样的分子可用于所公开的方法中。
本文提供了杀伤抑制细胞的方法。在特定实施例中，所述方法是特异性的，因为不大量杀伤非靶细胞例如非抑制细胞(例如杀伤小于1％或小于0.1％的非抑制细胞)，但大量杀伤靶抑制细胞。然而，在一些实施例中，并非所有的抑制细胞都在体内被杀伤，因为这可能导致产生自身免疫。因此，在一些实施例中，所述方法将对象的一个区域中的抗体-IR700分子所靶向的抑制细胞的数量减少至少50％、至少60％、至少75％、至少80％、至少90％或至少95％，所述对象的一个区域例如肿瘤区域或曾有肿瘤的区域。在一些实施例中，所述方法将对象中抗体-IR700分子所靶向的抑制细胞的总数减少至少50％、至少60％、至少75％、至少80％、至少90％或至少95％。
在一些实施例中，所述方法包括使表达抑制细胞表面蛋白的抑制细胞与治疗有效量的一种或多种抗体-IR700分子接触，其中抗体特异性地结合至抑制细胞表面蛋白(例如CD25、CD4、4型C-X-C趋化因子受体(CXCR4)、4型C-C趋化因子受体(CCR4)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、糖皮质激素诱导的TNF受体(GITR)、OX40、叶酸受体4(FR4)、CD16、CD56、CD8、CD122、CD23、CD163、CD206、CD11b、Gr-1、CD14、白细胞介素4受体α链(IL-4Ra)、白介素-1受体α(IL-1Ra)、白细胞介素-1诱饵受体、CD103、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、CXCR2、CD33和CD66b)，并且在一些实施例中不包含功能性Fc区(例如，由一个或多个F(ab')2片段组成)。功能性Fc部分的存在可导致自身免疫毒性(例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC))。ADCC的结果是可能会杀伤太多的抑制细胞，而不是仅仅那些暴露于NIR光的抑制细胞。因此，可将抗体的Fc部分突变或去除以显著降低其功能(例如与未突变的Fc区相比，降低Fc功能的至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％，例如与Fcγ受体结合的能力)。
抑制细胞表面蛋白是至少部分地或全部地位于抑制细胞的细胞表面上的使得其可被合适的特异性抗体(或其片段)结合的抑制细胞表面蛋白。例如，抑制细胞表面蛋白可以是跨膜蛋白，其中细胞外结构域可被抗体-IR700分子的抗体(或其片段)结合。在一些实施例中，抑制细胞表面上的蛋白质未显著见于其他细胞(例如非T细胞)上，且因此抗体不会显著结合非靶细胞。可靶向的这样的抑制细胞表面蛋白的实例包括但不限于CD25、CD4、4型C-X-C趋化因子受体(CXCR4)、4型C-C趋化因子受体(CCR4)、GITR、OX40、叶酸受体4(FR4)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、CD16、CD56、CD8、CD122、CD23、CD163、CD206、CD11b、Gr-1、CD14、白细胞介素4受体α链(IL-4Ra)、白细胞介素-1受体α(IL-1Ra)、白细胞介素-1诱饵受体、CD103、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、CXCR2、CD33和CD66b。例如，可在允许一种或多种抗体-IR700分子结合抑制细胞表面蛋白的条件下孵育抑制细胞和一种或多种抗体-IR700分子。然后以至少1Jcm-2的剂量(例如至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少75、或至少100Jcm-2的剂量)以660至740nm(例如660至710nm(例如，680nm或690nm))的波长辐照抑制细胞，从而杀伤暴露于NIR光的抑制细胞。可用该方法靶向的抑制细胞的实例包括但不限于：CD4+CD25+Foxp3+Treg、II型天然杀伤T细胞(II型NKT细胞)、CD8+CD122+Treg、M2巨噬细胞、肿瘤浸润性成纤维细胞、源自骨髓的抑制细胞及其组合(例如，通过使用多个抗体-IR700分子，每个分子对于特定类型的抑制细胞都具有特异性)。在一些实施例中，所述方法杀伤这些类型的抑制细胞中的1、2、3、4、5或全部6种的至少一部分。
这样的方法可在体外进行，例如通过用一种或多种抗体-IR700分子孵育抑制细胞的培养物，并然后以至少1Jcm-2的剂量在660至740nm的波长下辐照细胞从而杀伤抑制细胞。在另一个实例中，抑制细胞存在于对象中，并使抑制细胞与一种或多种抗体-IR700分子接触包括向对象施用治疗有效量的一种或多种抗体-IR700分子(例如，通过注射)。然后以至少4Jcm-2的剂量在660至740nm的波长下辐照对象(例如，对象中的肿瘤或对象的另一部分)，从而杀伤对象中的暴露于NIR光的抑制细胞。例如，所述方法可包括通过使用对象穿戴的装置来辐照抑制细胞，其中所述装置包括NIR发光二极管(LED)，从而杀伤与抗体-IR700分子结合并且暴露于NIR光的抑制细胞。
在一些实施例中公开的方法可用于在体外或体内治疗肿瘤，例如癌症。用所公开的疗法治疗的对象可接受其他治疗，例如其它抗肿瘤疗法。例如，所述方法可将肿瘤的体积、肿瘤的尺寸、肿瘤的重量、转移的数量或其组合相对于没有治疗减少至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少75％、至少90％或至少95％。在一些实施例实例中，相对于未施用抗体-IR700分子和辐照，所述方法延长对象的存活时间。在一些实施例中，例如与在使用所公开的方法治疗之前的转移的体积、转移的尺寸、转移的重量或转移的数量相比，所述方法可将转移的体积、转移的尺寸、转移的重量、转移的数量或其组合减少至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少75％、至少90％或至少95％，即使当转移本身未用NIR光辐照(而是只有原发肿瘤用NIR光辐照)时。
还提供了抗体-IR700分子，其中抗体特异性地结合抑制细胞表面蛋白，并且在一些实施例中不包含功能性Fc区。例如，抑制细胞表面蛋白可以是CD25、CD4、4型C-X-C趋化因子受体(CXCR4)、4型C-C趋化因子受体(CCR4)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、GITR、OX40、叶酸受体4(FR4)、CD16、CD56、CD8、CD122、CD23、CD163、CD206、CD11b、Gr-1、CD14、白细胞介素4受体α链(IL-4Ra)、白细胞介素-1受体α(IL-1Ra)、CD103、白细胞介素-1诱饵受体、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、CXCR2、CD33和CD66b。在一些实施例中，抗体是一个或多个Fab或F(ab')2片段。在一个实施例中，抗体对CD103具有特异性。在一些实施例中，抗体与IR700的比率为约1：3。
通过参考附图进行的若干实施方式的以下详细描述，本公开的前述和其他特征将变得更加明显。
附图说明
图1是示意性地示出抗-CD25-F(ab')2抗体片段是如何产生的图像。
图2A-2C是示出使用抗-CD25-F(ab')2-IR700体外靶向CD25的图像。(A)从对照IgG及其IR700缀合物消化的抗-CD25-F(ab')2和对照-F(ab')2的SDS-PAGE分析。抗-CD25-F(ab')2-IR700和抗-CD25-F(ab')2-IR700条带两者示出了相似的IR700-荧光，其通过(B)荧光强度的定量(n＝3)(*ns，Mann-Whitney检验)来确认。(C)对抗-CD25-F(ab')2-IR700与表达CD25的HT-2A5E细胞的结合的流式细胞术分析。
图3A-3C示出抗-CD25-F(ab')2施用缺乏CD4+CD25+Foxp3+Treg消耗作用，但使用抗-CD25-F(ab')2-IR700的NIR-PIT杀伤靶细胞。(A)静脉内注射的抗-CD25-IgG(100μg)全身性地消耗CD4+CD25+Foxp3+Treg，但在注射后1天，抗-CD25-F(ab')2(100μg)不显著消耗CD4T细胞群体中的这些细胞(n＝3)(*p<0.0001，**ns，不显著，采用Dunnet检验与单向ANOVA)。(B)在NIR光辐照之前和之后0.5小时(4J/cm2)，在显微镜下检查用抗-CD25-F(ab')2-IR700孵育6小时的HT-2A5E细胞(小鼠T淋巴细胞)。如碘化丙锭(PI)染色(标尺＝10μm)所示，NIR光辐照引起细胞溶胀、疱形成和细胞坏死。(C)当通过用PI染色进行的流式细胞术分析测定时，由NIR-PIT诱导的坏死细胞死亡以NIR光剂量依赖性方式增加(左图，n＝3，*：p<0.0001相对于0J/cm2，非配对t检验)。当使用对照-F(ab')2-IR700时(右图，n＝3，**ns，相对于0J/cm2不显著，非配对t检验)，没有检测到显著的细胞杀伤。
图4A-4B是示出使用抗-CD25-F(ab')2-IR700的NIR-PIT以NIR光剂量依赖性方式诱导CD25表达细胞坏死的一系列图。如由通过流式细胞术分析的PI染色所指示的，针对表达CD25的HT-2A5E细胞的体外抗-CD25-F(ab')2-IR700NIR-PIT以NIR光剂量依赖性方式诱导这些细胞的坏死性死亡。
图5A-5I示出体内局部靶向CD25的NIR-PIT诱导经处理的LL/2-luc肿瘤消退。(A)与脾中相比，在肿瘤(LL/2-luc或MC38-luc)中观察到CD4T细胞中增加的CD4+CD25+Foxp3+Treg群体(n＝3)(*p<0.001，**p<0.001，相对于对照，使用单向ANOVA与Dunnet检验)。(B)示出了局部NIR-PIT的方案。(C)示出了如下所述荷瘤小鼠的体内BLI，所述小鼠是未经处理的、在NIR-PIT之后接受了对照-F(ab')2-IR700施用的、仅施用CD25-F(ab')2-IR700的或者用局部靶向CD25的NIR-PIT处理的。在NIR-PIT之前，肿瘤尺寸相等，表现出相似的生物发光，但只有靶向CD25的NIR-PIT示出BLI降低。(D)定量RLU示出实验肿瘤(每组n＝6只小鼠)(*p＝0.0217(第1天)、0.0243(第2天)<0.05、PIT相对于对照，Tukey's检验和ANOVA)。(E)局部靶向CD25的NIR-PIT导致肿瘤体积减小(每组n＝8只小鼠，*p<0.0001，PIT相对于其他，Tukey's检验和ANOVA)。图下方所示的处理时间表与(B)相对应。(F)局部靶向CD25的NIR-PIT导致小鼠的存活延长(每组n＝8只小鼠)(*p<0.0001，PIT相对于对照，对数秩检验和Wilcoxon检验)。(G)由于肿瘤生长，未接受靶向CD25的NIR-PIT的小鼠的体重逐渐增加，相比之下，PIT组在第14天示出显著较低的体重(每组n＝8只小鼠)(*p＝0.0128<0.05，第14天的PIT相对于对照)。(H)局部靶向CD25的NIR-PIT导致肿瘤内CD4+CD25+Foxp3+Treg的消耗，但在脾中并非如此(n＝5)(*p<0.01，ns：不显著，Mann-Whitney检验)。(I)局部靶向CD25的NIR-PIT不显著影响CD8T细胞(CD3+CD8+)或NK细胞(CD3-NK1.1+)的数量(n＝5)(ns：不显著，Mann-Whitney检验)。
图6示出一系列流式细胞术图，其示出了浸润肿瘤的CD8T细胞和NK细胞不表达CD25。对从LL/2-luc、MC38-luc或TRAMP-C2肿瘤收集的CD8T细胞和NK细胞进行的流式细胞术分析表明这些细胞不表达CD25。
图7示出一系列流式细胞术图，其示出了抗-CD25-F(ab')2-IR700不结合肿瘤细胞。通过流式细胞术分析，用LL/2-luc、MC38-luc或TRAMP-C2肿瘤细胞孵育的抗-CD25-F(ab')2-IR700、对照-IgG-F(ab')2-IR700或IR700染料示出未结合。
图8是示出采用局部靶向CD25的NIR-PIT的肿瘤浸润性CD4+CD25+Foxp3+Treg的消耗为NIR-光剂量依赖性的图。在使用递增剂量的NIR光的局部靶向CD25的NIR-PIT之前和之后30分钟从LL/2-luc肿瘤收集淋巴细胞。CD4T细胞中CD4+CD25+Foxp3+Treg群体的流式细胞术分析表明Treg以NIR-光剂量依赖性方式减少(n＝3)(*p<0.005，**p<0.0005，***p<0.0001，相对于0J/cm2，Tukey's检验和ANOVA)。
图9是示出通过局部靶向CD25的NIR-PIT消耗肿瘤浸润性CD4+Foxp3+细胞的图。在局部靶向CD25的NIR-PIT之前和之后立即(30分钟)从LL/2-luc肿瘤收集淋巴细胞。对CD4+Foxp3+细胞数/克的流式细胞术分析表明在局部靶向CD25的NIR-PIT之后，CD4+Foxp3+细胞减少(n＝5)(*p<0.01，Mann-Whitney检验)。
图10A至图10H示出对MC38-luc肿瘤的局部靶向CD25的NIR-PIT诱导肿瘤消退。(A)示出了局部NIR-PIT的方案。(B)示出了荷瘤小鼠的体内BLI，所述小鼠是未经处理的、在NIR-PIT之后接受了对照-F(ab')2-IR700施用的、仅施用CD25-F(ab')2-IR700的或者用局部靶向CD25的NIR-PIT处理的。只有靶向CD25的NIR-PIT导致信号降低。(C)定量RLU示出经NIR-PIT处理的肿瘤中信号的显著降低(每组n＝7只小鼠)(*p<0.0005，**p<0.005，***p＝0.0268(相对于对照)、0.0236(相对于对照-F(ab')2-IR700+NIR-光)、0.0056(相对于抗-CD25-F(ab')2-IR700iv)<0.05、Tukey's检验和ANOVA)。(D)局部靶向CD25的NIR-PIT导致肿瘤体积减小(每组n＝9只小鼠)(*p<0.0001，PIT相对于其他，Tukey's检验和ANOVA)和(E)导致小鼠的存活延长(每组n＝9只小鼠)(*p<0.0001，PIT相对于对照，Long-rank检验和Wilcoxon检验)。(F)各组小鼠在处理过程期间的体重变化未示出显著差异(每组n＝9只小鼠)。(G)肿瘤的局部靶向CD25的NIR-PIT导致CD4群体中CD4+CD25+Foxp3+Treg的消耗(n＝5)(*p<0.01，ns：不显著，Mann-Whitney检验)而不影响脾脏中的Treg。(H)靶向CD25的NIR-PIT不显著影响肿瘤中的CD8T细胞(CD3+CD8+)和NK细胞(CD3-NK1.1+)的数量(n＝5)(ns：不显著，Mann-Whitney检验)。
图11A-11D示出局部靶向CD25的NIR-PIT诱导TRAMP-C2-luc胁腹肿瘤的消退。(A)与脾脏相比，TRAMP-C2-luc肿瘤中CD4T细胞内CD4+CD25+Foxp3+Treg群体部分的百分比增加(n＝3)(*p<0.01，Mann-Whitney检验)。(B)示出局部NIR-PIT的方案。(C)荷瘤小鼠的体内BLI表明通过靶向CD25的NIR-PIT使肿瘤中的生物发光信号降低。(D)定量RLU示出经NIR-PIT处理的肿瘤中的信号显著降低(每组n＝5只小鼠)(*p<0.01，PIT相对于对照，Mann-Whitney检验)。
图12A-12F示出将反复局部靶向CD25的NIR-PIT与肿瘤微环境中的Treg的再增殖同步化使得能够延长对肿瘤生长的抑制。(A)在局部靶向CD25的NIR-PIT后对从LL/2-luc肿瘤收集的淋巴细胞的流式细胞术分析表明肿瘤内CD4+CD25+Foxp3+Treg的消耗持续约4天，之后，它们在瘤床中逐渐再增殖(n＝3)。(B)示出反复局部NIR-PIT的方案。(C)BLI表明，对在白化病小鼠中接种的LL/2-luc肿瘤的重复局部靶向CD25的NIR-PIT能够反复诱导肿瘤消退。(D)定量RLU示出经NIR-PIT处理的肿瘤中的信号显著降低(每组n＝7只小鼠)(*p<0.001，Mann-Whitney检验)。(E)反复局部靶向CD25的NIR-PIT导致肿瘤体积减小(每组n＝7只小鼠)(*p<0.01，**p<0.001，Mann-Whitney检验)和(F)导致小鼠的存活延长(*p<0.0001，Long-rank检验和Wilcoxon检验)。
图13A-13B示出体内局部靶向CD25的NIR-PIT诱导肿瘤内CD8T细胞和NK细胞的快速活化和细胞毒性。(A)在使用或不使用局部靶向CD25的NIR-PIT的情况下，通过流式细胞术分析检查CD8T细胞和NK细胞浸润性LL/2-luc或MC38-luc肿瘤的细胞毒性作用。在PIT之后1.5小时收集的CD8T细胞和NK细胞产生IFNγ和IL-2，并使CD107a暴露于细胞表面，而来自未经处理的肿瘤的细胞未如此(n＝5)(*p<0.01，Mann-Whitney检验)。(B)在局部靶向CD25的NIR-PIT之后1天，CD8T细胞和NK细胞两者中的活化标志物CD69和CD25的表达以及IL-2的产生上调(n＝5)(*p<0.01，Mann-Whitney检验)。
图14A-14C示出反复局部靶向CD25的NIR-PIT在每次处理时诱导CD8T细胞和NK细胞上CD25表达的上调。(A)示出了在反复局部NIR-PIT中对CD25表达的分析方案。(B)在第一局部靶向CD25的NIR-PIT之后，CD25表达的MFI(几何平均荧光强度)增加(n＝3)(*p＝0.0376<0.05，**p<0.0005，非配对t检验)。(C)在第一NIR-PIT之后四天，CD25表达水平恢复至处理前水平。第二局部NIR-PIT再次诱导CD8T细胞和NK细胞上CD25表达的活化和上调(n＝3)(***p<0.001，****p<0.005，非配对t检验)。
图15A-15D示出局部靶向CD25的NIR-PIT诱导肿瘤浸润性树突状细胞及其他抗原呈递细胞的活化。肿瘤浸润性免疫细胞的流式细胞术表明在处理之后1天，靶向CD25的NIR-PIT诱导肿瘤浸润性(A)树突状细胞(CD11c+)、(B)B细胞(CD19+)、(C)单核细胞(CD11b+Ly6Chigh)和(D)巨噬细胞(CD11b+Ly6Clow-int)的活化(n＝3)(*p＝0.0104<0.05，非配对t检验)。分析的群体在左侧的组中示出。
图16是示出局部靶向CD25的NIR-PIT诱导经处理的肿瘤内的粒细胞增加的图。对肿瘤浸润性粒细胞(CD11b+Ly6Clow-intLy6Ghigh)的流式细胞术分析表明，局部靶向CD25的NIR-PIT诱导这些细胞增加(n＝3)(*p＝0.0188(每克肿瘤)、0.0168(每个肿瘤)<0.05，非配对t检验)。示出了每g肿瘤和每个肿瘤的细胞数量。
图17A-17B是示出对肿瘤的NIR光辐照诱导可忽略水平的细胞因子和趋化因子产生的条形图。(A)在相同的小鼠中测量对肿瘤进行NIR光辐照之前和之后1.5小时的血清细胞因子和趋化因子水平。结果表示为增加倍数(n＝3)。(B)比较具有经NIR光辐照的肿瘤的小鼠和具有非NIR光辐照的肿瘤的小鼠的肿瘤内的细胞因子和趋化因子水平。在1.5小时(n＝3)收获肿瘤以收集额外的细胞流体。
图18A-18J是示出局部靶向CD25的NIR-PIT诱导全身性和肿瘤内细胞因子风暴的图。(A)在对相同小鼠进行处理之前和之后，在局部靶向CD25的NIR-PIT之前和1.5小时后测量肿瘤的血清细胞因子和趋化因子水平。结果表示为增加倍数(IL-10和IL-6使用左轴测量，而其他使用右轴测量)(n＝3)。(B)类似地，在NIR-PIT之前和之后1天比较血清细胞因子和趋化因子水平(n＝3)。比较具有经处理的肿瘤的小鼠和具有未经处理的肿瘤的小鼠之间肿瘤内的细胞因子和趋化因子水平。在NIR-PIT后1.5小时(C)和1天(D)收获肿瘤以收集额外的细胞流体(n＝3)。(E-G)(E)IFNγ(F)IL-6和(G)G-CSF的血清浓度(n＝3)。(H-J)(H)IFNγ(I)IL-6和(J)G-CSF的肿瘤内浓度(n＝3)。
图19是示出在靶向CD25的NIR-PIT之后1天没有检测到肺中的CD8T细胞和NK细胞的IFNγ产生的图。通过流式细胞术测定，在靶向CD25的NIR-PIT后1天从肺收集的CD8T细胞和NK细胞中未检测到IFNγ产生。(n＝5)(ns：不显著，Mann-Whitney检验)。
图20A-20K示出局部靶向CD25的NIR-PIT的治疗效果扩展到远处的未经辐照的肿瘤。(A)示出了NIR-PIT的方案。(B)未注射(对照)或用对照-F(ab')2-IR700或抗-CD25F(ab')2-IR700注射具有双侧胁腹肿瘤的小鼠，然后用NIR光辐照仅右侧的肿瘤。(C)体内BLI仅示出响应于局部靶向CD25的NIR-PIT，肿瘤中生物发光信号的变化。在NIR-PIT之前，肿瘤具有大致相同的尺寸并且表现出相似的生物发光。(D)定量RLU示出经NIR-PIT处理的右侧肿瘤和甚至未经辐照的左侧肿瘤中的信号显著降低(每组n＝6只小鼠)(*p<0.001，**p<0.01，***p＝0.0197(PIT：R)，＝0.0142(PIT：L)<0.05，PIT相对于对照-F(ab')2-IR700iv：R，Tukey's检验和ANOVA)。(E)局部靶向CD25的NIR-PIT导致经NIR-PIT处理的右侧肿瘤以及未经辐照的左侧肿瘤(每组中n＝8只小鼠)的尺寸减小(*p<0.0001，**p<0.0005，PIT相对于其他，Tukey's检验和ANOVA)。处理时间示于图下方。(F)局部靶向CD25的NIR-PIT导致小鼠的存活延长(每组n＝8只小鼠)(*p<0.0001，PIT相对于对照，Long-rank检验和Wilcoxon检验)。(G)随访荷瘤小鼠的体重变化。在NIR-PIT后，左右背部均变得水肿，小鼠体重增加(每组n＝8只小鼠)(*p<0.001，PIT相对于其他，Tukey's检验和ANOVA)，从第10天开始消失。(H)对右侧背部肿瘤进行的局部靶向CD25的NIR-PIT引起双侧水肿(箭头)。(I)NIR-PIT消耗在右侧背部经辐照的肿瘤中的CD4+CD25+Foxp3+Treg，而不消耗在左侧未经辐照的肿瘤中的Treg。未注射(对照)或注射了对照-F(ab')2-IR700的小鼠的右侧和左侧肿瘤的Treg群体未示出显著差异(每组n＝5)(*p<0.0001，Tukey's检验和ANOVA)。(J)对右侧背部LL/2-luc肿瘤进行的局部靶向CD25的NIR-PIT在处理后1天引起其他多个LL/2-luc肿瘤的消退。(K)对右侧背部LL/2-luc肿瘤的局部靶向CD25的NIR-PIT在PIT后1天对左侧背部MC38-luc肿瘤具有可忽略的抗肿瘤作用。
图21是数字图像，其示出了靶向CD25的NIR-PIT降低经处理的肿瘤的IR700-荧光，而未降低对侧的未经辐照的肿瘤的IR700-荧光。右侧的LL/2-luc肿瘤在局部靶向CD25的NIR-PIT后IR700荧光下降，但左侧未经辐照的肿瘤未观察到荧光变化。还示出了离体肿瘤的IR700-荧光图像。
图22是数字图像，其示出了对右侧背部肿瘤的局部靶向CD25的NIR-PIT诱导远处多个肿瘤的减少。对右侧背部LL/2-luc肿瘤的局部靶向CD25的NIR-PIT导致在处理后第1天位于远处的其它多个LL/2-luc肿瘤消退(图20J中同一实验的另一只小鼠)。
图23A-23B示出局部靶向CD25的NIR-PIT抑制在对侧攻击的肿瘤的生长。(A)示出了在靶向CD25的NIR-PIT之后1天的肿瘤攻击方案。还示出了示意性图示。(B)与接受对照-F(ab')2-IR700施用和NIR-光辐照的对照小鼠接种的肿瘤相比，对相同种类肿瘤进行局部靶向CD25的NIR-PIT之后1天，接种在对侧的LL/2-luc肿瘤受到抑制(n＝5)。
图24A-24D示出了在同侧的靶向CD25的NIR-PIT之后，活化的CD8T细胞和NK细胞存在于对侧的肿瘤中。(A-D)在处理后一天，分析从接受对右侧背部肿瘤的局部靶向CD25的NIR-PIT的小鼠中收集的未经辐照的左侧背部肿瘤的CD8T细胞和NK细胞的活化标志物的表达。在对右侧肿瘤的靶向CD25的NIR-PIT之后，CD8T细胞和NK细胞产生IFNγ(A)和IL-2(B)并且具有上调的CD25(C)和CD69(D)表达存在于未经辐照的左侧肿瘤中(n＝5)(*p<0.01，Mann-Whitney检验)。
图25A-25C示出在靶向CD25的NIR-PIT后，对侧未经辐照的肿瘤中的细胞因子和趋化因子的水平升高。(A)在治疗后1天，响应于对侧的右侧肿瘤的靶向CD25的NIR-PIT，未辐照的左侧背部肿瘤示出增加的细胞因子/趋化因子水平(n＝3)。(B-C)在左侧未经辐照的肿瘤中，(B)IFNγ(C)G-CSF的浓度升高(n＝3)(*p<0.01，Mann-Whitney检验)。
图26A-26F示出局部靶向CD25的NIR-PIT的抗肿瘤作用部分依赖于NK细胞、CD8T细胞和IFNγ产生中的每一种。(A)示出了在NK或CD8T细胞消耗或IFNγ中和的情况下针对LL/2-luc肿瘤的NIR-PIT方案(消耗Abs i.p.)。(B)体内BLI和(C)定量RLU示出经NIR-PIT处理的肿瘤中的生物发光信号显著降低，然而，NK细胞的消耗(抗NK1.1)或CD8T细胞的消耗(抗CD8)或IFNγ的中和(抗-IFNγ)减弱了该效果。(每组n＝5只小鼠)(*p＝0.0158<0.05，PIT相对于抗NK1.1+PIT，*p<0.0001，PIT相对于对照，Tukey's检验和ANOVA)。(D)类似地，局部靶向CD25的NIR-PIT在抑制肿瘤生长中的作用受到消耗或中和抗体的组合抑制(每组n＝7只小鼠)(*p<0.0001，PIT相对于其他方法，Tukey's检验和ANOVA检验，处理在图下方标出)，导致(E)与PIT组相比，这些组小鼠的存活时间更短(每组n＝7只小鼠)(*p<0.0001相对于对照，长秩序检验和Wilcoxon检验)。(F)体重变化示出组间无显著差异(每组n＝7只小鼠，Tukey's检验和ANOVA)。
图27A-27F示出局部靶向CD25的NIR-PIT的抗肿瘤作用至少部分是IFNγ依赖性的。(A)示出了NIR-PIT的方案。(B)响应于局部靶向CD25的NIR-PIT，野生型(WT)和IFNγ缺陷型(IFNγKO)小鼠中的LL/2-luc肿瘤的体内BLI表明只有WT小鼠中经NIR-PIT处理的肿瘤在第1天示出生物发光信号降低。(C)定量RLU示出WT小鼠中经NIR-PIT处理的肿瘤中RLU显著降低，但是IFNγKO中的那些并非如此(在每组中，v＝5只小鼠)(*p<0.0005，**p＝0.0422(相对于WT-对照)、0.0315(相对于KO-对照)、0.0255(相对于KO-PIT)<0.05、WT-PIT相对于其它，Turkey’s检验和ANOVA)。(D)局部靶向CD25的NIR-PIT导致WT小鼠中经NIR-PIT处理的肿瘤的肿瘤体积减小，而IFNγKO小鼠中局部NIR-PIT的抗肿瘤作用不显著。(每组n＝7只小鼠)(*p<0.0001，WT-PIT相对于其他，Tukey's检验和ANOVA，处理在图下方示出)。(E)在WT和IFNγKO小鼠中，进行了PIT的LL/2-luc荷瘤的小鼠的存活曲线表明IFNγ的缺乏至少部分地消除了治疗作用(每组n＝7只小鼠)(*p<0.0001相对于WT-对照，对数秩检验和Wilcoxon检验)。(F)WT和IFNγKO小鼠的体重未示出显著变化(每组n＝7只小鼠，Tukey's检验和ANOVA)。
图28是示出局部靶向CD25的NIR-PIT诱导的免疫疗法的建议机制的示意图。Treg抑制CD8T细胞和NK细胞活化，为肿瘤生长提供了允许的环境(上图)。一旦在NIR-PIT之后Treg被选择性地消耗，则CD8T细胞和NK细胞被活化抵抗肿瘤(中图)。活化的CD8T细胞和NK细胞可使经处理的肿瘤与释放的细胞因子和趋化因子合作攻击远处的肿瘤(下图)。
具体实施方式
除非另外解释，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与公开的发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。除非上下文另有明确指示，否则单数术语“一”、“一个”和“所述”包括复数指称。类似地，除非上下文另有明确指示，否则词汇“或”旨在包括“和”。“包含”是指“包括”。因此，“包含A或B”意味着“包括A”或“包括B”或者“包括A和B”。
下文中描述了用于实践和/或测试本公开的实施方案的合适的方法和材料。这样的方法和材料只是说明性的，而并不意在限制。可使用与本文所述相似或等同的其他方法和材料，例如以下的那些：Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989；Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Press，2001；Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates，1992(和2000年增刊)；Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methodsfrom Current Protocols in Molecular Biology，第4版，Wiley&Sons，1999；Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1990；以及Harlow和Lane，Using Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，1999。
包括专利和专利申请在内的所有参考文献通过引用并入本文。另外，本文引用的所有登录号相关的序列通过引用并入本文，这些序列是2015年8月7日时可得的序列。
为了便于回顾本公开的各种实施方案，对特定术语提供以下解释：
施用：通过任何有效途径向对象提供或给予诸如抗体-IR700分子的药物(agent)。施用的示例性途径包括但不限于局部、注射(例如皮下、肌内、真皮内、腹腔内、瘤内和静脉内)、口服、眼部、舌下、直肠、透皮、鼻内、阴道和吸入途径。
抗体：包含至少一个轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽配体，其特异性地识别和结合诸如肿瘤特异性蛋白质的抗原的表位。抗体由重链和轻链构成，重链和轻链分别具有可变区，称为重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区。VH区和VL区一起负责结合被抗体识别的抗原。
抗体包括抗体的部分，例如不具有Fc区的那些，如Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、缺失CH2的Ab、单结构域V区Ab、单链Fv蛋白(“scFv”)和二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)。scFv蛋白质是其中免疫球蛋白的轻链可变区和免疫球蛋白的重链可变区通过接头结合的融合蛋白，而在dsFvs中，链被突变以引入二硫键从而稳定链的缔合。所述术语还包括经遗传工程化的形式，例如嵌合抗体(例如人源化的鼠抗体)、异源缀合抗体(例如双特异性抗体)。另参见，Pierce目录ue and Handbook，1994-1995(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)；Kuby，J.，Immunology，第3版，W.H.Freeman&Co.，New York，1997。
在一些实施例中，抗体包括具有被突变或者甚至缺失的Fc区以显著降低Fc区的功能的免疫球蛋白。在一些实施例中，与没有突变的Fc区的功能相比，突变使Fc区的功能(例如，与Fcγ受体结合的能力)降低至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％。
通常，天然发生的免疫球蛋白具有通过二硫键相互连接的重链(H)和轻链(L)。有两种类型的轻链，λ轻链和κ轻链。有五种主要的重链类型(或同种型)，其决定抗体分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。
每条重链和轻链包含恒定区和可变区，(这些区也被称为“结构域”)。在组合时，重链可变区和轻链可变区特异性地结合抗原。轻链可变区和重链可变区含有被三个高变区中断的“框架”区，也称为“互补决定区”或“CDR”。框架区和CDR的范围已被定义(参见Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，美国卫生和人类服务部，1991，其通过引入并入本文)。Kabat数据库现在正在线维护。在诸如人的物种中，不同的轻链或重链的框架区的序列相对保守。抗体的框架区(即组成型轻链和重链的组合框架区)用于在三维空间中定位和对齐CDR。
CDR主要负责与抗原的表位结合。每条链的CDR通常被称为CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序编号，并且通常也通过特定CDR所处的链来识别。因此，VH CDR3位于其被发现的抗体的重链可变结构域中，而VL CDR1是来自其被发现的抗体的轻链可变结构域的CDR1。具有不同特异性(即，不同抗原的不同组合位点)的抗体具有不同的CDR。尽管抗体之间的CDR不同，但CDR内仅有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。将CDR中的这些位置称为特异性决定残基(SDR)。
提及“VH”或“VH”是指免疫球蛋白重链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab的可变区。提及“VL”或“VL”是指免疫球蛋白轻链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab的可变区。
“单克隆抗体”是由B淋巴细胞的单个克隆产生的抗体，或由单个抗体的轻链和重链基因已被转染进其中的细胞产生的抗体。单克隆抗体通过本领域技术人员已知的方法产生，例如通过由骨髓瘤细胞与免疫脾细胞融合产生杂交抗体形成细胞。单克隆抗体包括人源化的单克隆抗体。
“嵌合抗体”具有来自一种物种(例如人)的框架残基和来自另一物种的CDR(其通常赋予抗原结合)，例如特异性地结合间皮素的鼠抗体。
“人源化”免疫球蛋白是包括人框架区和来自非人(例如小鼠、大鼠或合成)免疫球蛋白的一个或更多个CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白称为“供体”，并且提供框架的人免疫球蛋白称为“受体”。在一个实施方案中，所有CDR均来自人源化免疫球蛋白中的供体免疫球蛋白。不需要存在恒定区，但如果它们存在，则它们与人免疫球蛋白恒定区基本上相同，即至少约85-90％、例如约95％或更相同。因此，除可能的CDR以外，人源化免疫球蛋白的所有部分都与天然人免疫球蛋白序列的相应部分基本相同。“人源化抗体”是包含人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白的抗体。人源化抗体与提供CDR的供体抗体结合相同的抗原。人源化免疫球蛋白或抗体的受体框架可具有有限数量的获得自供体框架中的氨基酸替换。人源化或其他单克隆抗体可具有额外的保守氨基酸替换，其对抗原结合或其他免疫球蛋白功能基本上没有影响。人源化免疫球蛋白可通过遗传工程化的手段来构建(参见例如美国专利No.5,585,089)。
“人”抗体(也称为“完全人”抗体)是包含人框架区和来自人免疫球蛋白的全部CDR的抗体。在一个实施例中，框架和CDR来自相同起源人重链氨基酸序列和/或轻链氨基酸序列。然而，来自一个人抗体的框架可被工程化以包含来自不同人抗体的CDR。人免疫球蛋白的所有部分与天然人免疫球蛋白序列的相应部分基本上相同。
“特异性地结合”是指相对于与不相关蛋白质(例如，非抑制细胞蛋白，例如白蛋白)的结合，各个抗体与抗原(例如，抑制细胞表面抗原)特异性地发生免疫反应的能力。例如，CD25特异性结合剂在体外或体内基本上只与CD25蛋白结合。本文所用术语“抑制细胞表面特异性结合剂”包括抑制细胞表面特异性抗体和制剂中基本上只与抑制细胞表面蛋白结合的其他药物(agent)。
结合是抗体分子与T细胞表面分子的抗原决定簇之间的非随机结合反应。期望的结合特异性通常由抗体差异性地结合T细胞表面分子和无关抗原的能力的参考点确定，并且因此区分两种不同的抗原，特别是在两种抗原具有独特表位的情况下。特异性地结合特定表位的抗体被称为“特异性抗体”。
在一些实施例中，抗体或其片段(例如，抗体-IR700分子)以与样品或对象中的其它分子相比高至少10 3M-1、104M-1或105M-1的结合常数特异性地结合靶标(例如，抑制细胞表面蛋白)。在一些实施例中，抗体(例如，单克隆抗体)或其片段具有1nM或更小的平衡常数(Kd)。例如，抗体或其片段以至少约0.1×10-8M、至少约0.3×10-8M、至少约0.5×10-8M、至少约0.75×10-8M、至少约1.0×10-8M、至少约1.3×10-8M、至少约1.5×10-8M或至少约2.0×10-8M的结合亲和力与靶标(例如，抑制细胞表面蛋白)相结合。例如，可通过竞争性ELISA(酶联免疫吸附测定)或使用表面-等离子体共振装置(例如，Biacore T100，其可从Biacore、Inc.，Piscataway，NJ获得)来确定Kd值。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)：一种细胞介导的免疫防御机制，其中免疫系统的效应细胞主动溶解膜表面抗原已被特异性抗体结合的靶细胞。ADCC可由天然杀伤(NK)细胞、单核细胞/巨噬细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞介导。抗体募集细胞免疫系统的杀伤机制的能力取决于抗体Fc结构域和细胞(例如，巨噬细胞和天然杀伤细胞)上发现的Fc受体之间的相互作用。
抗体-IR700分子或抗体-IR700缀合物：一种包括与IR700相缀合的抗体(例如，抑制细胞表面抗体)的分子。在一些实施例中，抗体不具有功能性Fc区(例如，仅具有Fab区或突变的Fc区)。在一些实施例中，抗体是特异性地结合抑制细胞上的表面蛋白的人源化抗体(例如，人源化单克隆抗体)，并且在一些实施例中不具有功能性Fc区(例如，仅具有Fab区或突变的Fc区)。
癌症：以异常或不受控制的细胞生长为特征的恶性肿瘤。通常与癌症相关的其他特征包括转移、干扰邻近细胞的正常功能、以异常水平释放细胞因子或其他分泌产物以及抑制或加重炎性或免疫应答、侵袭周围或远处的组织或器官，例如淋巴结等。“转移性疾病”是指已经离开原始肿瘤部位并且例如经由血流或淋巴系统迁移到身体其他部位的癌细胞。
接触：以直接物理联系(physical association)放置，包括固体形式和液体形式。接触可在体外发生，例如，通过向分离的细胞(例如，抑制细胞)添加试剂，或者通过在体内施用于对象(例如，患有肿瘤的对象)。
减少：为了降低某些物质的质量、数量或强度。在一个实施例中，在用NIR光(例如，在690nm+/-20nm的波长下，例如约680nm)以至少1或至少4J/cm2的剂量辐照细胞后，例如，与在不存在抗体-IR700分子的情况下的应答相比，包含一种或多种抗体-IR700分子的治疗性组合物降低抗体-IR700分子特异性结合的细胞的活力。在一些实施例中，通过杀伤细胞来证明这样的降低。在一些实施例中，相对于用不包含抗体-IR700分子或包含抗体-IR700分子但未暴露于NIR光的组合物所观察到的活力，细胞活力的降低为至少20％、至少50％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或甚至至少99％。在另一些实施例中，将降低表示为倍数变化，例如，相对于用不包含抗体-IR700分子或包含抗体-IR700分子但未暴露于NIR光的组合物观察到的活力，细胞活力降低至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少8倍、至少10倍、或甚至至少15或20倍。这样的降低可使用本文公开的方法来测量。
片段、(抗体的)抗原结合(Fab)区：与抗原结合的抗体的“Y”的“顶部”。它由重链和轻链中的每一个的一个恒定结构域和一个可变结构域构成。木瓜蛋白酶可用于将免疫球蛋白单体切割成两个Fab片段和一个Fc片段。胃蛋白酶或无花果蛋白酶在铰链区下切割，产生F(ab')2片段和pFc'片段。在另一个实施例中，酶IdeS(来自酿脓链球菌的免疫球蛋白降解酶，商品名FabRICATOR)在中性pH下以序列特异性方式切割IgG，产生F(ab')2片段，其可经温和的还原分裂成两个Fab'片段。在实施例1中公开了从完整抗体产生F(ab')2片段的其他方法。
(抗体的)片段、可结晶(Fc)区域：抗体的“Y”的基部，其在调节免疫细胞活性中发挥作用。该区域由两条重链构成，这两条重链根据抗体的类别贡献两个或三个恒定结构域。由于只有重链的恒定结构域构成抗体的Fc区，因此抗体中重链的类别决定了它们的类别效应。抗体中重链的类别包括α、γ、δ、ε和μ，且它们分别定义抗体的同种型IgA、G、D、E和M。Fc区确保每种抗体通过与特定类别的Fc受体及其他免疫分子(例如补体蛋白)结合而对给定抗原产生适当的免疫应答。通过这样做，其可介导不同的生理效应，包括调理颗粒的识别(与FcγR相结合)、细胞裂解(与补体相结合)以及肥大细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞(与FcεR相结合)的脱粒。
IR700(700DX)：具有下式的酞菁染料
还包括这样的分子衍生物，其包括如下所示的酯：
可从LI-COR(Lincoln，NE)商购获得。氨基反应性IR700是相对亲水的染料，并且可与抗体或抗体片段共价地缀合，例如使用IR700的NHS酯。
药物组合物：当适当地施用于对象时，化学化合物或组合物能够诱导期望的治疗或预防效果。药物组合物可包括治疗剂，例如一种或多种抗体-IR700分子。治疗剂或药剂是单独或与其它化合物一起诱导期望的响应(例如，当施用于对象时诱导治疗或预防效果)的治疗剂或药剂。在一个特定实施例中，药物组合物包含治疗有效量的至少一种抗体-IR700分子。
可药用载体：用于本公开的可药用载体(媒介)是常规的。Remington'sPharmaceutical Sciences，E.W.Martin，Mack Publishing Co.，Easton，PA，第19版(1995)描述了适于一种或多种治疗性化合物(例如，一种或多种抗体-IR700分子)的药物递送的组合物和制剂。
一般而言，载体的性质取决于所采用的施用的特定模式。例如，肠胃外制剂通常包含可注射流体，所述可注射流体包括药学上和生理学上可接受的流体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、含水右旋糖、甘油等作为媒介。对于固体组合物(例如粉末、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规的无毒固体载体可包含例如药物级别的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除生物学中性载体之外，待施用的药物组合物可包含少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或月桂山梨坦(sorbitan monolaurate)。
光免疫疗法(PIT)：一种靶向分子的治疗，其利用基于对靶蛋白(例如，抑制细胞表面蛋白)具有特异性的一种或多种抗体(或其它特异性结合剂)相缀合的近红外(NIR)酞菁染料IR700的靶特异性光敏剂，并且在一些实施例中，所述抗体具有基本上非功能性的Fc区(或无Fc区)。本文提供了示例性抑制细胞表面蛋白，并因此PIT可用于杀伤这样的细胞。因此，当抗体-IR700分子结合抑制细胞并用NIR辐照抑制细胞时，细胞发生细胞死亡，而不表达识别抗体-IR700分子的抑制细胞表面蛋白的细胞不以显著数量被杀伤。
对象或患者：包括人和非人哺乳动物的术语。在一个实施例中，对象是人或兽类对象，例如小鼠、猫、狗、大鼠或非人灵长类动物。在一些实施例中，对象是患有癌症或正在接受癌症治疗的哺乳动物(例如，人)。
抑制细胞：调节免疫系统、维持对自身抗原的耐受性和消除自身免疫性疾病的免疫细胞亚群。这些细胞通常抑制或下调其他免疫细胞(例如，效应T细胞、NK细胞和树突状细胞)的诱导、增殖和功能。抑制细胞有多种形式，包括表达CD4、CD25和Foxp3(CD4+CD25+Foxp3调节性T细胞)的那些细胞。可被所公开的疗法靶向的抑制细胞的其它实例包括II型天然杀伤T(NK-T)细胞、CD8+CD122+Treg、M2巨噬细胞、肿瘤浸润成纤维细胞和髓系来源的抑制细胞。抑制细胞表面蛋白是至少部分地在抑制细胞的表面上表达的蛋白质，所述蛋白质可特异性地结合抗体或抗体片段。因此，抑制细胞表面蛋白可以是仅在表面上发现的、或其一部分在表面上的蛋白(例如，具有可特异性地结合适当抗体的具有一个或多个细胞外结构域的跨膜蛋白)。抑制细胞表面蛋白的实例包括但不限于：CD25、CD4、4型C-X-C趋化因子受体(CXCR4)、4型C-C趋化因子受体(CCR4)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、糖皮质激素诱导的TNF受体(GITR)、OX40、叶酸受体4(FR4)、CD16、CD56、CD8、CD122、CD23、CD163、CD206、CD11b、Gr-1、CD14、白细胞介素4受体α链(IL-4Ra)、白细胞介素-1受体α(IL-1Rα)、CD103、白细胞介素-1诱饵受体、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、CXCR2、CD33和CD66b)。
治疗有效量：单独或与一种或多种其它治疗剂(例如化学治疗剂或生物制剂)一起足以在接受药物治疗的对象中或在细胞中达到所期望的效果的组合物的量。药物(例如，抗体-IR700分子)的有效量可取决于几个因素，包括但不限于接受治疗的对象或细胞、特定治疗药物和治疗性组合物的施用方式。在一个实施例中，有治疗效剂量或浓度是足以杀伤抑制细胞或抑制细胞群体的量。在一些实施例中，治疗有效量或浓度是足以防止疾病进展(例如，转移)、延缓进展或引起疾病消退或者能够减轻由疾病(例如，癌症)引起的症状的量或浓度。在一个实施例中，治疗有效量或浓度是足以增加患有肿瘤的患者的存活时间的量或浓度。
在一个实施例中，期望的应答是例如通过杀伤抑制细胞或抑制细胞群减少抑制细胞的数量。抑制细胞或抑制细胞亚群不必完全被消除以使组合物有效。在一个实施例中，与处理前的CD25+/CD4+/Foxp3+调节性T细胞的量相比，使用抗体-IR700分子杀伤了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的这些细胞。在一个实施例中，与处理前的II型NKT细胞的量相比，使用抗体-IR700分子杀伤了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的这些细胞。在一个实施例中，与处理前的CD8+CD122+调节性T细胞的量相比，使用抗体-IR700分子杀伤了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的这些细胞。在一个实施例中，与处理前的M2巨噬细胞的量相比，使用抗体-IR700分子杀伤了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的这些细胞。
在一个实施例中，期望的响应是减少或抑制与癌症相关的一种或多种症状。一种或多种症状不必完全被消除以使组合物有效。例如，与在不存在抗体-IR700分子和NIR辐照的情况下的肿瘤/转移尺寸(或转移的数量)相比，施用含抗体-IR700分子的组合物然后辐照可将肿瘤的尺寸(例如肿瘤的体积或重量或肿瘤的转移)减少例如至少20％、至少50％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、或甚至至少100％。在一个特定实施例中，与在不存在抗体-IR700分子和NIR辐照的情况下的细胞杀伤相比，期望的响应是以期望的量杀伤癌细胞，例如杀伤至少20％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、或甚至至少100％的细胞。在一个实施例中，与在不存在抗体-IR700分子和原发肿瘤的NIR辐照的情况下的转移的体积/重量/数量相比，施用含抗体-IR700分子的组合物然后NIR辐照原发肿瘤可将远处未经辐照的转移的尺寸和/或数量(例如，转移的体积、转移的重量、转移的数量或其组合)减少例如至少20％、至少50％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、或甚至至少100％。在一个特定实施例中，期望的响应是与在不存在抗体-IR700分子和NIR辐照的情况下的存活时间相比，将患有肿瘤的患者(或最近肿瘤被切除的患者)的存活时间增加期望的量，例如将存活时间增加至少20％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、或甚至至少100％。
包含所公开的抗体-IR700分子之一的被施用于人或兽类对象的药物的有量将改变，所述改变取决于与该对象相关的多种因素，例如对象的整体健康状况。可通过改变产品的剂量和测量所得到治疗响应(例如，肿瘤的消退)来确定药物的有效量。有效量也可通过各种体外、体内或原位免疫测定来确定。所公开的药物可根据需要以单剂量或多剂量施用以获得期望的响应。然而，有效量可取决于应用的来源、接受治疗的对象、被治疗的病症的严重程度和类型以及施用方式。
在一些特定实施例中，抗体-IR700分子的治疗有效剂量为每60千克至少0.5毫克(mg/kg)、至少5mg/60kg、至少10mg/60kg、至少20mg/60kg、至少30mg/60kg、至少50mg/60kg、例如0.5至50mg/60kg、例如当静脉内施用时例如1mg/60kg、2mg/60kg、5mg/60kg的剂量、20mg/60kg或50mg/60kg的剂量。在另一个实施例中，抗体-IR700分子的治疗有效剂量为至少10μg/kg，例如至少100μg/kg、至少500μg/kg或至少500μg/kg，例如10μg/kg至1000μg/kg，例如当以瘤内或腹膜内施用时，例如100μg/kg、250μg/kg、约500μg/kg、750μg/kg或1000μg/kg的剂量。在一个实施例中，治疗有效剂量为以在局部用溶液中至少1μg/ml，例如至少500μg/ml、例如20μg/ml至100μg/ml、例如10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml或100μg/ml施用。然而，本领域技术人员将认识到也可使用更高或更低的剂量，例如取决于特定抗体-IR700分子。在一些特定实施例中，每日剂量以一个或多个分开的剂(例如2、3或4个剂)或以单一制剂施用。在特定实施例中，对象接受抗体-IR700分子的多次施用(例如至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少10次、至少15次或至少20次分开施用，例如随时间2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40或50次分开施用，所述时间例如一周、一个月或更多个月、或者一年或更多年)，接着NIR辐照。所公开的抗体-IR700分子可单独施用、在可药用载体的存在下施用、在其他治疗剂(例如，其他抗肿瘤剂)的存在下施用。
通常，在施用抗体-IR700后，合适的辐照剂量为在660至740nm的波长处至少1Jcm-2，例如在660至740nm的波长处至少4Jcm-2、在660至740nm的波长处至少5Jcm-2、在660至740nm的波长处至少10Jcm-2、在660至740nm的波长处至少50Jcm-2、或者至少在660至740nm的波长处至少100J cm-2，例如在660至740nm的波长处1至500J cm-2、在660至740nm的波长处4至50J cm-2、或者在660至740nm的波长处4至8J cm-2、例如在670至710nm的波长处4、5、6、7、8、9或10J cm-2。在一些实施例中，波长是660至710nm。在特定实施例中，在施用抗体-IR700分子后合适的辐照剂量为在690nm+/-20nm(例如，680nm)的波长处至少1.0J cm-2，例如在690nm+/-20nm(例如，680nm)的波长处至少10J cm-2、在690nm+/-20nm(例如，680nm)的波长处至少50J cm-2、或在690nm+/-20nm(例如，680nm)的波长处至少100Jcm-2、例如在690nm+/-20nm(例如，680nm)的波长处1至500 1.0J cm-2。在特定实施例中，在施用抗体-IR700分子后进行多次辐照(例如至少2次、至少3次或至少4次辐照，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10次分开施用)。
处理：当用于指用治疗剂处理细胞或组织时，该术语包括使试剂(例如，抗体-IR700分子)与细胞或组织接触或用该试剂孵育细胞或组织。经处理的细胞是在对于期望的响应而言足够的量和条件下与期望的组合物接触的细胞。在一个实施例中，经处理的细胞是在足以使抗体结合细胞上的表面蛋白然后进行NIR辐照直至达到足够的细胞杀伤的条件下暴露于抗体-IR700分子的细胞。
肿瘤、瘤形成、恶性肿瘤或癌症：新生物是由过度的细胞分裂导致的组织或细胞的异常生长。新生物生长可产生肿瘤。个体中肿瘤的量是“肿瘤负荷”，其可作为肿瘤的数量、体积或重量来测量。不转移的肿瘤称为“良性”。侵袭周围组织和/或可转移的肿瘤称为“恶性”。“非癌性组织”是来自同一器官的组织，其中形成恶性新生物，但没有新生物的特征性病理。一般来说，非癌性组织在组织学上看起来是正常的。“正常组织”是来自器官的组织，其中所述器官不受癌症或该器官的其他疾病或病症的影响。“无癌症”对象未被诊断患有该器官的癌症并且没有可检测到的癌症。
可用所公开的方法处理的示例性肿瘤(例如，癌症)包括实体瘤，例如乳腺癌(例如，小叶癌和导管癌)、肉瘤、肺癌(例如，非小细胞癌、大细胞癌、鳞状细胞癌和腺癌)、肺间皮瘤、结肠直肠腺癌、胃癌、前列腺腺癌、卵巢癌(例如，浆液性囊腺癌和粘液性囊腺癌)、卵巢生殖细胞肿瘤、睾丸癌和生殖细胞肿瘤、胰腺癌、胆管腺癌、肝细胞癌、膀胱癌(包括例如，移行细胞癌、腺癌和鳞状细胞癌)、肾细胞腺癌、子宫内膜癌(包括例如，腺癌和混合Mullerian肿瘤(癌肉瘤))、宫颈内瘤癌、宫颈外瘤癌和阴道癌(例如，腺癌和各自的鳞状细胞癌)、皮肤肿瘤(例如，鳞状细胞癌、基底细胞癌、恶性黑素瘤、皮肤附件肿瘤(skinappendage tumor)、卡波西肉瘤、皮肤淋巴瘤、皮肤附件肿瘤(skin adnexal tumor)和各种类型的肉瘤和梅克尔细胞癌)、食管癌、鼻咽癌和口咽癌(包括鳞状癌和其腺癌)、唾液腺癌、脑和中枢神经系统肿瘤(包括例如，神经胶质、神经元和脑膜起源的肿瘤)、周围神经肿瘤、软组织肉瘤和骨和软骨肉瘤以及淋巴肿瘤(包括B细胞和T细胞恶性淋巴瘤)。在一个实施例中，肿瘤是腺癌。
该方法也可用于治疗液体肿瘤，例如淋巴肿瘤、白血球肿瘤或其他类型的白血病。在一个特定实施例中，被处理的肿瘤是血液肿瘤，例如白血病(例如急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、多毛细胞白血病(HCL)、T细胞幼淋巴细胞白血病(T-PLL)、大颗粒淋巴细胞性白血病和成人T细胞白血病)、淋巴瘤(例如，霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)以及骨髓瘤)。
在足以满足……条件的情况下：用于描述允许期望的活性的任何环境的短语。在一个实施例中，“在足以满足……条件的情况下”包括向对象施用足够的抗体-IR700分子以允许抗体-IR700分子结合抑制细胞上的细胞表面蛋白。在特定实施例中，在细胞的治疗性NIR辐照之后，期望的活性是杀伤抗体-IR700分子结合的细胞。
未经处理的细胞/对象：未与期望的试剂接触的细胞/对象，例如抗体-IR700分子。在一个实施例中，未经处理的细胞/对象是接受其中递送期望的试剂的载体的细胞/对象。
某些特定实施例的公开不意味着排除其他实施方案。此外，本文描述的任何处理不一定排除其他处理，但可与其他生物活性剂或治疗方式组合。
概述
通过抑制免疫抑制剂(例如，用免疫检查点抑制剂)的癌症免疫疗法可用于治疗癌症。然而，这些试剂的问题是全身性自身免疫反应的可能性，因为在靶癌症和正常组织中均可见到免疫系统的活化。因此，需要能够操纵肿瘤内抑制剂和效应细胞之间平衡而不干扰体内其他部位的体内平衡的方法。CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)是在肿瘤免疫逃逸中起关键作用的免疫抑制细胞，并且已经成为全身性免疫疗法的靶标。
在癌症疗法中，抑制免疫抑制细胞和免疫检查点抑制剂的药物的全身性施用虽然在一些患者中提供治疗益处，但通常引起严重的副作用，例如自身免疫样疾病和急性间质性肺炎-急性呼吸窘迫综合征(AIP-ARDS)(36，37)。另一种方法是仅在肿瘤内抑制或杀伤免疫抑制细胞，但不是全身性的。然而，能够选择性地从肿瘤微环境中移除这些细胞而不损伤效应细胞的方法是有限的。
与目前可用的癌症免疫治疗方法相比，所公开的方法使用近红外光免疫疗法(NIR-PIT)来选择性地杀伤抑制细胞，例如在肿瘤微环境中具有特异性的抑制细胞。这通过使用还缀合至NIR光子吸收剂的靶向例如抑制细胞表面上的抗原的抗体或抗体片段(例如，不具有功能性Fc区的抗体或抗体片段)(在本文中为抗体-IR700分子)来实现。施用NIR光后，与抗体-IR700分子结合并暴露于NIR光的抑制细胞从肿瘤的微环境中选择性地消除。因此，靶向抑制细胞的NIR-PIT可诱导导致癌细胞死亡并具有最小全身性自身免疫副作用的高效抗癌宿主免疫活化。
本文的数据显示，对CD25和NIR光具有特异性的抗体-光敏剂缀合物在体外有效地杀伤CD4+CD25+foxp3+Treg并在体内消除来自经NIR-PIT处理的肿瘤的CD4+CD25+foxp3+Treg。此外，所述方法成功地诱导了体内非PIT处理的远处肿瘤(例如，转移)的减少。因此，所公开的方法还可通过引发宿主免疫来处理继发性肿瘤或转移。所公开的方法活化了CD8T细胞和NK细胞并恢复局部抗肿瘤免疫性，这导致经处理的肿瘤消退，但也在相同细胞系衍生的单独的未经处理的肿瘤中诱导响应。因此，靶向CD25的NIR-PIT引起了Treg的空间选择性消耗，由此实现癌症免疫疗法的替代方法。
这种微创方法采用了靶向CD25的抗体-光吸收剂缀合物。缀合物全身施用，但仅在抗体-光吸收剂缀合物与细胞结合并暴露于NIR光的部位活化；为了有效杀伤CD4+CD25+Foxp3+Treg必须满足这两个条件。同时，由于该方法仅局部地消耗Treg，所以Treg在其他器官中保持正常。在肿瘤中Treg的杀伤导致已存在于肿瘤中但被Treg抑制的CD8T细胞和NK细胞的活化。在NIR-PIT时，现有的肿瘤内CD8T细胞和NK细胞不表达CD25。因此，靶向CD25的NIR-PIT选择性地杀伤Treg，同时使肿瘤浸润性未活化的CD8T细胞和NK细胞免受伤害。在局部靶向CD25的NIR-PIT后，肿瘤内CD8T细胞和NK细胞很快被活化并显示出对肿瘤的细胞毒性。只有在此时，在施用NIR-PIT后，这些细胞上调CD25。此外，在反复NIR-PIT的情况下，肿瘤内效应细胞上的CD25在4天的间隔后在反复PIT之前已经下调。因此，Treg的局部靶向CD25的NIR-PIT能够活化效应细胞而不全身性地消除抑制细胞。这些发现与之前报道的全身性施用抗-CD25抗体或IL-2毒素缀合物的全身性Treg消耗的方法(由于这些抗体的长半衰期(29，38)，它们不仅消耗Treg，也消耗活化的效应细胞)相反。因此，使用抗-CD25抗体来全身性消耗Treg的方法仅阻止肿瘤植入，但即使在引起自身免疫样副作用的同时也不会干扰已建立肿瘤的生长(22)。与先前的研究(27，39)一致，当CD8T细胞或NK细胞被消耗或IFNγ被中和时，所公开的局部靶向CD25的NIR-PIT的抗肿瘤作用部分地被消除。
已在患成人T细胞白血病的患者中进行了消耗成熟Treg亚群而非消除所有Treg群体以维持自身耐受性的尝试[28]。使用在终末分化的Treg以及白血病细胞上高表达的靶向C-C趋化因子受体CCR4的抗体的全身性施用作为处理。虽然Th2细胞和一些中央记忆CD8T细胞也表达CCR4，但这种策略避免了伤害幼稚型Treg和前体Treg，其结果是导致白血病细胞数量减少。通过在肿瘤微环境中局部靶向CD25阳性细胞(包括成熟Treg和幼稚型Treg)，与CCR4靶向策略相比，靶向CD25的NIR-PIT可在肿瘤微环境中产生更有效和延长的免疫抑制功能的消除，而不诱导全身性自身免疫样副作用。因此，局部靶向CD25的NIR-PIT可与其它免疫调节疗法例如免疫检查点抑制剂或癌症类型特异性疗法组合使用，或者可被修改为包括两种不同的抗-CD25克隆(40)(例如识别不同的CD25表位的抗体)或用于效应子Treg消耗的靶向CD103的NIR-PIT(41，42)，以增强该方法的疗效(CD103在效应(成熟)Treg细胞上表达)。例如，可使用抗-CD103-IR100缀合物，例如其中IR700缀合物的抗-CD103抗体不具有功能性Fc区的缀合物。在一个实施例中，局部靶向CD25的NIR-PIT包括使用达珠单抗-IR700和巴利昔单抗-IR700，其中IR700缀合物的抗体不具有功能性Fc区。
不同于需要针对每种肿瘤的肿瘤特异性抗体-光吸收剂缀合物的常规的NIR-PIT，靶向CD25的NIR-PIT对于广泛的肿瘤是有效的，因为无论肿瘤的类型，在肿瘤中表达高水平CD25的Treg通常是丰富的。因此，抗-CD25-IR700缀合物可用于许多不同类型的肿瘤(22,26)，而非仅开发一组靶向缀合物。例如，本文示出使用相同缀合物的局部靶向CD25的NIR-PIT在三种不同的癌症模型(肺、结肠、前列腺)中有效。
靶向CD25的NIR-PIT导致通过活化的CD8T细胞和NK细胞快速杀伤肿瘤，并可能诱导肿瘤中多种细胞类型的活化。在处理后的几小时内，不仅在肿瘤内，而且在血清中观察到“细胞因子风暴”(34，35)，其表明在经处理的肿瘤外部的免疫响应的额外活化。细胞因子和趋化因子高度增加，包括具有促炎和抗炎特征的细胞因子和趋化因子，其中一些可能是巨噬细胞来源的。细胞因子(例如IFNγ和IL-2)的释放导致效应细胞的完全活化，这部分地解释了在未直接用NIR-PIT处理的远处肿瘤中的抗肿瘤作用。虽然处理后存在细胞因子风暴可能会引起严重的(如果是暂时的)副作用，但升高的细胞因子/趋化因子(包括IL-6)在治疗的1天内开始下降，且因此是自限性的。因此，基于所观察到的细胞因子/趋化因子的暂时升高，临床副作用可能是温和的且短暂的。如果接受NIR-PIT治疗后在患者中出现症状，则可使用抗细胞因子处理剂，例如IL-6的托珠单抗(tocilizumab)(43)。
本文示出了局部靶向CD25的NIR-PIT可选择性地消耗肿瘤浸润性Treg而不消除其他器官中的局部效应细胞或Treg。这导致CD8T细胞和NK细胞的快速活化引起细胞介导的癌症杀伤。局部靶向CD25的NIR-PIT也导致肿瘤类型特异性的全身性抗肿瘤作用，其改变相同类型的远处肿瘤的生长(图28)。因此，局部靶向CD25的NIR-PIT可用于减少由Treg引起的免疫抑制，从而增强效应细胞介导的肿瘤杀伤。因为表达CD25的Treg存在于许多肿瘤中，所以这种方法在广泛的癌症类型中是有效的，即使在其他组织中维持Treg的自身耐受性。
基于这些观察结果，本文提供了采用NIR-PIT杀伤抑制细胞的方法，其可局部地杀伤包括CD4+CD25+Foxp3+Treg在内的任何选择性靶抑制细胞，具有对周围细胞或未被抗体-IR700分子靶向的其他细胞的最小损伤。由于CD4+CD25+Foxp3+Treg保护癌细胞免受宿主免疫，所以在肿瘤(或患肿瘤的患者)中的这些和/或其他抑制细胞的局部杀伤使用NK细胞和CD8+T细胞诱导了快速和高效的抗肿瘤宿主免疫活化，使得使用对象自身的免疫系统高效地以最小副作用处理各种癌症，局部地以及甚至在远离被处理部位的远处转移两者。如果抑制细胞被全身性地消除，则可采取步骤防止出现不期望的自身免疫。例如，可进行方法以确保并非所有与抗体-IR700分子相结合的抑制细胞都被被杀伤，例如通过减少暴露于NIR的量或面积、通过减少施用的抗体-IR700分子的量、反复暴露于NIR光和/或在肿瘤消除后过继转移离体扩增的CD4+CD25+Foxp3+Treg。这些方法可用于广泛范围的患有各种癌症的患者，包括具有多发性远处转移的患者，因为抑制细胞参与癌症中发现的免疫耐受。在一些实施例中，用所公开的方法处理单个局部部位允许对癌症的全身性宿主免疫，导致经处理部位处以及未经处理的远处转移病灶处的快速肿瘤消退，同时引起最小的副作用。
用于杀伤抑制细胞和处理肿瘤的方法
本公开提供了用于杀伤抑制细胞的方法。抑制细胞在其表面上表达蛋白质，该蛋白质可特异性地结合与光敏剂(例如，IR700)相缀合的抗体(本文中称为抗体-IR700分子)。在允许抗体特异性地结合抑制细胞表面蛋白的条件下，使抑制细胞与治疗有效量的一种或多种抗体-IR700分子相接触(例如，在可药用载体(例如药学上和生理学上可接受的流体)的存在下)。例如，抗体-IR700分子可作为媒介存在于药学上有效的载体中，例如水、生理盐水、平衡盐溶液(例如，PBS/EDTA)、右旋糖水溶液、芝麻油、甘油、乙醇及其组合等。载体和组合物可以是无菌的，并且所述制剂适合施用模式。将抑制细胞暴露于NIR范围内的光下，导致暴露于NIR并与抑制细胞膜抗体-IR700分子结合的抑制细胞的杀伤。尽管抗体-IR700分子可分布在整个身体中，但它仅在施用NIR时才有活性，从而减少了脱靶效应的可能性。
本文提供了杀伤抑制细胞的方法。在特定实施例中，这些方法具有特异性，因为非靶细胞－例如非抑制细胞－不会以显著数量被杀伤。在一些实施例中，与抗体-IR700分子相结合并暴露于合适剂量的NIR光两者的细胞不以任何显著量被杀伤，所述显著量例如小于1％的这样的细胞、小于0.5％或小于0.1％的这样的细胞，但结合至抗体-IR700分子并且暴露于合适剂量的NIR光的抑制细胞以显著量被杀伤。然而，在一些实施例中，并非所有靶向抑制细胞都被杀伤，因为者会导致不期望的自身免疫。因此，在一些实施例中，所述方法减少对象的区域中抗体-IR700分子所靶向的抑制细胞的数量，例如在肿瘤的区域或曾经患有肿瘤的区域中减少至少50％、至少60％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。肿瘤的区域或先前患有肿瘤的区域可包括肿瘤本身或曾经患有肿瘤的区域以及在一些实施例中包括至少1cm、至少2cm、至少3cm、至少4cm或至少5cm围绕肿瘤的区域或之前肿瘤的面积。在一些实施例中，所述方法将对象中抗体-IR700分子所靶向的抑制细胞的总数减少至少50％、至少60％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。
在一些实施例中，所述方法包括使表达抑制细胞表面蛋白的抑制细胞与治疗有效量的一种或多种抗体-IR700分子接触，其中所述抗体特异性地结合抑制细胞表面蛋白，并且在一些实施例中，所述抗体不包含功能性Fc区(例如，由一个或多个Fab或F(ab')2片段组成)。功能性Fc部分的存在可导致自身免疫毒性(例如，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC))。因此，可突变或除去抗体的Fc部分以显著降低其功能(例如，与FcγR结合的能力)。在一些实施例中，与不含突变的Fc区的功能相比，所述Fc区的功能减少了至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％。在一些实施例中，突变或移除抗体的Fc区降低了抗体的半衰期。例如，完整的IgG具有可为约2周的半衰期，而不具有Fc功能区的IgG可具有约1天的更短的半衰期。因此，在一些实施例中，抗体-IR700分子的抗体具有小于14天的半衰期，例如小于10天、小于7天、小于5天、小于4天、小于3天或小于2天，例如1至7天、例如0.5至7天、例如1至3天或0.5至2天。使抗体突变的示例性方法包括在Fc区中缺失、插入和/或替换一个或多个氨基酸，例如缺失、插入和/或替换Fc区的至少10个、至少25个、至少50个、至少100个或至少200个氨基酸。
抑制细胞表面蛋白是至少部分地或完全地位于抑制细胞的细胞表面上使得它可结合适当的特异性抗体(或其片段)的抑制细胞表面蛋白。例如，抑制细胞表面蛋白可以是跨膜蛋白，其中细胞外结构域可结合抗体-IR700分子的抗体(或其片段)。在一些实施例中，其中抑制细胞表面上的蛋白质在其他细胞(例如，上皮细胞)上未显著发现，且因此抗体不会显著地结合非靶细胞。可被靶向的这样的抑制细胞表面蛋白的实例包括但不限于CD25、CD4、4型C-X-C趋化因子受体(CXCR4)、4型C-C趋化因子受体(CCR4)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、糖皮质激素诱导的TNF受体(GITR)、OX40、叶酸受体4(FR4)、CD16、CD56、CD8、CD122、CD23、CD163、CD11b、Gr-1、CD14、白细胞介素4受体α链(IL-4Ra)、白细胞介素-1受体α(IL-1Rα)、白细胞介素-1诱饵受体、CD103、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、CXCR2、CD33和CD66b。在一些实施例中，抑制细胞表面蛋白不是CD25。
例如，可在允许一种或多种抗体-IR700分子结合抑制细胞表面蛋白的条件下孵育抑制细胞和一种或多种抗体-IR700分子。然后以至少1或至少4Jcm-2(例如4至8Jcm-2)的剂量，在660至740nm，例如660至710nm(例如690nm+/-20nm，例如680nm)的波长下辐照抑制细胞，从而杀伤抑制细胞。可用该方法靶向的抑制细胞的实例包括但不限于：CD4+CD25+Foxp3+Treg、II型NKT细胞、CD8+CD122+Treg、M2巨噬细胞、肿瘤浸润成纤维细胞、髓系来源的抑制细胞及其组合(例如，通过使用多个抗体-IR700分子，每个分子对于特定类型的抑制细胞都是特异性的)。因此，在一些实施例中，相对于不存在用一种或多种抗体-IR700分子和NIR处理的情况，所公开的方法杀伤经处理的CD4+CD25+Foxp3+Treg的至少10％，例如至少20％、至少40％、至少50％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％(例如，作为占在处理前对象中CD4+CD25+Foxp3+Treg总数的％或者占肿瘤区域(例如包含肿瘤和在处理之前在肿瘤周围至少1mm(例如至少2mm、至少3mm、至少4mm或至少5mm)的区域)中的CD4+CD25+Foxp3+Treg总数的％)。在一些实施例中，相对于不存在用一种或多种抗体-IR700分子和NIR的处理，所公开的方法在一些实施例中杀伤至少10％，例如至少20％、至少40％、或至少10％、至少50％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的经处理的II型NKT细胞(例如，作为占在处理前对象中II型NKT细胞总数的％或者占肿瘤区域(例如包含肿瘤和至少1mm(例如至少2mm、至少3mm、至少4mm或至少5mm)的区域)中的II型NKT细胞总数的％)。在一些实施例中，相对于不存在用一种或多种抗体-IR700分子和NIR的处理，所公开的方法在一些实施例中杀伤至少10％、例如至少20％、至少40％、至少50％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的经处理的CD8+CD122+Treg(例如，作为在处理之前对象中CD8+CD122+Treg细胞总数的％或者占肿瘤区域(例如包含肿瘤和至少1mm(例如至少2mm、至少3mm、至少4mm、或至少5mm的区域)的CD8+CD122+Treg细胞总数的％)。在一些实施例中，相对于不存在用一种或多种抗体-IR700分子和NIR的处理，所公开的方法在一些实施例中杀伤至少10％、例如至少20％、至少40％、至少50％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的经处理的M2巨噬细胞(例如，作为占在处理之前对象中M2巨噬细胞细胞总数的％或者占肿瘤区域(例如包含肿瘤和至少1mm(例如至少2mm、至少3mm、至少4mm、或至少5mm的区域)的M2巨噬细胞总数的％)。在一些实施例中，相对于不存在用一种或多种抗体-IR700分子和NIR的处理，所公开的方法在一些实施例中杀伤至少10％、例如至少20％、至少40％、至少50％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的经处理的肿瘤浸润成纤维细胞(例如，作为占在处理之前对象中肿瘤浸润成纤维细胞总数的％或者占肿瘤区域(例如包含肿瘤和至少1mm(例如至少2mm、至少3mm、至少4mm、或至少5mm的区域)的肿瘤浸润成纤维细胞总数的％)。在一些实施例中，相对于不存在用一种或更多种抗体-IR700分子和NIR处理，所公开的方法在一些实施例中杀伤至少10％、例如至少20％、至少40％、至少50％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的经处理的髓系来源的抑制细胞(例如，作为占在处理之前对象中M2巨噬细胞总数的％或者占肿瘤区域(例如包含肿瘤和至少1mm(例如至少2mm、至少3mm、至少4mm、或至少5mm的区域)的髓系来源的抑制细胞的总数的％)。实现了这些抑制细胞的组合，例如1、2、3、4、5或全部6种抑制细胞类型。
在一个实施例中，用至少两种不同的抗体-IR700分子处理患者。在一个实施例中，两种不同的抗体-IR700分子对相同的蛋白质(例如CD25)具有特异性，但对蛋白质的不同表位(例如CD25的表位1和表位2)具有特异性。在另一个实例中，两种不同的抗体-IR700分子对两种不同的蛋白质或抗原具有特异性，例如对CD4具有特异性的一种抗体和对CD25具有特异性的另一种抗体。例如，可将抗CD4-IR700和抗CD25-IR700作为混合物一起注射以促进杀伤携带CD4或CD25的细胞。在另一个实施例中，两种不同的抗体-IR700分子对两种不同的蛋白质或抗原具有特异性，例如一种抗体对CD103具有特异性和另一种抗体对CD25具有特异性。例如，可将抗CD103-IR700和抗CD25-IR700作为混合物一起注射以促进杀伤携带CD103或CD25的细胞。可以生成基于表1中信息的特定组合。
这样的方法可在体外进行，例如通过用一种或多种抗体-IR700分子孵育抑制细胞的培养物，并然后以至少1或至少4J cm-2的剂量在660至740nm的波长下辐照细胞从而杀伤与抗体-IR700分子结合并且暴露于NIR光的抑制细胞。在另一个实施例中，抑制细胞存在于对象中，并使抑制细胞与一种或多种抗体-IR700分子接触包括向对象施用治疗有效量的一种或多种抗体-IR700分子(例如通过注射)。然后以至少1或至少4J cm-2的剂量在660至740nm的波长下辐照对象或对象的一部分(例如对象中的肿瘤)，由此杀伤对象中的与抗体-IR700分子相结合并暴露于NIR光的抑制细胞。在一个实施例中，所述方法可包括通过使用对象穿戴的装置辐照血液来辐照抑制细胞，其中所述装置包括近红外(NIR)光发光二极管(LED)。
在允许一个或多个抗体-IR700分子结合它们在抑制细胞表面上的靶标的条件下接触或施用一种或多种抗体-IR700分子后，然后在允许杀伤抑制细胞的条件下辐照抑制细胞，例如以至少1或至少4Jcm-2的剂量在660至740nm的波长下进行辐照。与其表面抗体-IR700分子结合并且已经暴露于NIR光的抑制细胞将会被杀伤。在一个实施例中，在使细胞与抗体-IR700分子接触和辐照之间存在至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少4小时、至少8小时、至少12小时或至少24小时(例如1至4小时、30分钟至1小时、10分钟至60分钟或30分钟至8小时)。NIR激发光波长允许穿透至少数厘米到组织中。例如，通过使用带有漫射器尖端的光纤耦合激光二极管，可在位于身体表面深处的几厘米范围内的其他不可到达的肿瘤内输送NIR光。除了治疗实体癌症之外，可靶向循环肿瘤细胞，因为它们在穿过浅表血管时可被激发(例如使用NIR LED可穿戴装置)。
在一些实施例中公开的方法可用于在体外或在体内治疗肿瘤，例如癌症。示例性的癌症包括乳腺癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、脑癌、子宫颈癌、骨癌、皮肤癌、头颈癌、肺癌和血癌。本文提供了具体的示例性癌症。在一些实施例中，被处理的癌症是转移性癌症。
例如，向具有肿瘤的对象施用一种或多种抗体-IR700分子结合NIR光杀伤表达抑制细胞表面蛋白的抑制细胞，所述抑制细胞表面蛋白可与抗体特异性地结合并且暴露于NIR，由此使Teff细胞杀伤癌细胞。例如，相对于不存在处理，抗体-IR700分子与NIR光组合的使用可将肿瘤的体积、肿瘤的尺寸、肿瘤的重量、转移的数量、转移的体积、转移的尺寸、转移的重量或其组合减少至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在一些实施例中，治疗转移而不直接将其暴露于NIR光，因为用抗体-IR700分子(例如，局部地或全身地)和NIR光处理原发性肿瘤可导致可治疗转移的一般免疫反应(例如，通过减少或除去抑制细胞对Teff细胞的抑制)。在一些实施例中，抗体-IR700分子与NIR光组合使用可减缓肿瘤的生长、减缓或减慢肿瘤的转移(例如通过减少转移的数量或减少转移的重量、体积或尺寸)或其组合。
所公开的方法可导致与肿瘤和/或转移性肿瘤相关的症状减少。例如，相对于不存在施用一种或多种抗体-IR700分子然后施用NIR光，所公开的方法可将肿瘤尺寸、重量、体积和/或转移性肿瘤细胞体积、重量或尺寸(或转移性肿瘤的数量)或其组合减少例如至少10％、例如至少20％、至少40％、至少50％、至少80％、至少85％、至少90％或更多。在一个实施例中，相对于不存在施用抗体-IR700分子然后施用NIR光，所公开组合物的施用可将肿瘤的生长和/或转移减缓例如至少10％、例如至少20％、至少40％、至少50％、至少80％、至少85％、至少90％或更多。在一个实施例中，用抗体-IR700分子与NIR光组合处理的肿瘤和/或转移的体积比未用抗体-IR700分子/NIR光处理的肿瘤的体积小至少2倍、至少3倍、至少4倍或甚至至少5倍(例如在处理后至少7天、至少10天、至少14天、至少30天、至少60天、至少90天或至少120天后)。在一个实施例中，用抗体-IR700分子与NIR光组合处理的肿瘤和/或转移瘤的尺寸比未用抗体-IR700分子/NIR光处理的肿瘤的尺寸小至少2倍、至少3倍、至少4倍或甚至至少5倍(例如在处理后至少7天、至少10天、至少14天、至少30天、至少60天、至少90天或至少120天后)。
所公开的方法可增加细胞因子和趋化因子的产生。例如，相对于不存在施用一种或多种抗体-IR700分子然后施用NIR光，所公开的方法可将肿瘤和/或血清中可检测的细胞因子和趋化因子的产生(例如，图18A和18B中的G-CSF、IL10、IL6、KC、MIP1β、TNF-α以及其他中的一种或多种)增加至少10％，例如至少20％、至少40％、至少50％、至少80％、至少85％、至少90％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％或至少500％。
所公开的方法可活化NK和CD8T细胞，例如如由INFγ、IL2、CD69、CD25、G-CSF、MCP1、MIP2和MIP1α中的一种或多种的表达增加所指示的。例如，相对于不存在施用一种或多种抗体-IR700分子然后施用NIR光，所公开的方法可将肿瘤中的INFγ、IL2、CD69、CD25、G-CSF、MCP1、MIP2和MIP1α中的一种或多种的表达增加至少10％，例如至少20％、至少40％、至少50％、至少80％、至少85％、至少90％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％或至少500％。
所公开的方法可增加树突状细胞(DC)和APC的细胞因子表达。例如，相对于不存在施用一种或多种抗体-IR700分子然后施用NIR光，所公开的方法可使DC的MHCI、CD86和CD40中的一种或多种或者APC的CD69的表达增加至少10％，例如至少20％、至少40％、至少50％、至少80％、至少85％、至少90％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％或至少500％。
所公开的方法可增加肿瘤的粒细胞产生，相对于不存在施用一种或多种抗体-IR700分子然后施用NIR光，肿瘤的粒细胞产生例如增加至少10％，例如至少20％、至少40％、至少50％、至少80％、至少85％、至少90％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％或至少500％。
在一些实施例中，相对于不存在施用抗体-IR700分子和辐照，所述方法增加对象的存活时间。在一个实施例中，用抗体-IR700分子与NIR光组合处理的患有肿瘤的对象的存活时间比未用抗体IR-700分子处理的患有肿瘤的对象的存活时间长至少10％，例如至少20％、至少40％、至少50％、至少80％、至少85％、至少90％、至少100％，至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍或至少10倍(例如，在特定时间段之后，例如在处理后至少14天、至少30天、至少60天、至少90天、至少120天、至少6个月、至少12个月、至少24个月或至少5年，与未用抗体-IR700分子/NIR光处理相比，更多用抗体-IR700分子/NIR疗法处理的对象将存活)。在一些实施例中，相对于不存在施用抗体-IR700分子和NIR光中的平均存活时间，所公开的方法可将对象的存活时间增加至少3个月、至少6个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月、至少36个月或更多。
在一些实施例中，所述方法进一步包括使抑制细胞与一种或多种其它治疗剂相接触(或施用于对象)。可使一种或多种其它治疗剂与PIT同时或依次地接触(或施用于对象)。在一个实施例中，一种或更多种其它治疗剂在辐照后施用，例如在辐照后至少10分钟、至少30分钟、至少60分钟、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少10小时、至少12小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少1周、至少1个月或至少1年，例如在辐照后1小时至10小时、1小时至9小时、1小时至8小时、2小时至8小时、4小时至8小时、1小时至24小时、或1小时至48小时。在另一个实施例中，在辐照之前(例如辐照前约10分钟至120分钟、例如辐照前10分钟至60分钟或10分钟至30分钟)施用其它治疗剂。
在一些实施例中，将抗体-IR700分子/NIR光与其它疗法(例如，抗肿瘤剂)组合增强肿瘤治疗的有效性。例如，将抗体-IR700分子/NIR光与其它疗法(例如，其他抗肿瘤剂)组合可导致的肿瘤体积小于单独用抗体-IR700分子/NIR光处理或单独用额外的疗法处理时的肿瘤体积，即存在协同效应。在一个实施例中，用组合疗法处理的肿瘤和/或转移的体积比单独用抗体-IR700分子/NIR光或单独用其它疗法处理的肿瘤/转移的体积小至少2倍、至少3倍、至少4倍、或甚至至少5倍(例如在处理后至少7天、至少10天、至少14天、至少30天、至少60天、至少90天，或至少120天后)。在一个实施例中，用组合疗法处理的肿瘤和/或转移的尺寸比对照未经处理的肿瘤的尺寸小至少5倍、至少6倍、至少7倍、或甚至至少10倍(例如在处理后至少7天、至少10天、至少14天、至少30天、至少60天、至少90天或至少120天后)。在另一个或其它实例中，将抗体-IR700分子/NIR光与其它疗法(例如，抗肿瘤剂)组合相对于肿瘤用单独的抗体-IR700分子/NIR光或单独的其它疗法处理的情况下对象的存活时间可增加患有肿瘤的对象的存活时间，即存在协同作用。在一个实施例中，用联合疗法处理的患有肿瘤的对象的存活时间比用单独的抗体-IR700分子/NIR光或单独的其它疗法处理的患有肿瘤的对象的存活时间长至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍或至少10倍(例如在特定时间段之后，例如在处理后至少14天、至少30天、至少60天、至少90天、至少120天、至少6个月、至少12个月、至少24个月或至少5年，与用单独的疗法处理相比，更多的用联合疗法处理的对象将存活)。
可使用的示例性的其它治疗剂包括抗肿瘤剂，例如化学治疗剂和抗血管生成剂或疗法例如辐照疗法。在一个实施例中，所述试剂是化疗免疫抑制剂(例如，利妥昔单抗、类固醇)或细胞因子(例如，GM-CSF)。化学治疗剂是已知的(参见例如，Slapak和Kufe，Principles of Cancer Therapy，Harrison's Principles of Internal Medicine，第86章，第14版；Perry等，Chemotherapy，第17章，Abeloff，Clinical Oncology，第2版，2000Churchill Livingstone，Inc；Baltzer和Berkery(编著)：Oncology Pocket Guide toChemotherapy，第2版，St.Louis，Mosby-Year Book，1995；Fischer Knobf和Durivage(编著)：The Cancer Chemotherapy Handbook，第4版，St.Louis，Mosby-Year Book，1993)。可与本文提供的方法一起使用的示例性化学治疗剂包括但不限于卡铂、顺铂、紫杉醇、多西他赛、多柔比星、表柔比星、托泊替康、伊立替康、吉西他滨、iazofurine、吉西他滨、依托泊苷、长春瑞滨、他莫昔芬、伐司朴达(valspodar)、环磷酰胺、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、米托蒽醌、Doxil(脂质体包封的多柔比星)和长春瑞滨。在一个实施例中，可使用的其它治疗剂包括抗体-IR700分子，其中所述抗体特异性地结合肿瘤特异性蛋白质，例如帕尼单抗-IR700分子、曲妥珠单抗-IR700分子、Basilitumab-IR700分子、赛尼哌(Zenapax)-IR700分子、Simitect-IR700分子、西妥昔单抗-IR700分子或J591-IR700分子(例如，参见美国专利No.8,524,239和美国公开No.2014/0120119A1，两者均通过引用并入本文)。本文提供了其他示例性的额外处理。
所公开的方法可用于处理身体中的固定肿瘤以及循环中的肿瘤(例如，白血病细胞、转移、循环肿瘤细胞)。在一个实施例中，使用可穿戴或覆盖身体部位的装置来辐照循环的抑制细胞。例如，这种装置可在短时间或延长的时间内穿戴。可使用包含NIR发光二极管(LED)和电池组的日常可穿戴物品(例如，手表、珠宝(例如项链或手镯)、毯子、衣服(例如，内衣、袜子和鞋插入物)以及其他日常穿戴物品)。这样的装置在期望的时间段内在装置下面的皮肤上产生光，导致浅表血管长时间暴露于光。循环抑制细胞在穿过装置下方的区域时暴露于光。
在施用一种或多种抗体-IR700分子(例如静脉内)后，循环的抑制细胞与抗体-IR700缀合物结合并变得易感于PIT的杀伤。当这些抑制细胞在与存在于日常穿戴物品(例如，手镯或手表)中的LED相邻的血管内流动时，它们暴露于NIR光，使它们易感于细胞杀伤。光剂量可根据诊断和抑制细胞类型进行调整。
在一些实施例中，所述方法还包括监测所述治疗，例如杀伤抑制细胞。在一些实施例中，这是实时完成的。在这样的实施例中，使抗体-IR700缀合物与细胞接触(或施用于对象)并且细胞/对象/肿瘤如上所述被辐照。这样的方法可用于例如确保施用足够量的抗体-IR700分子和/或一种或多种治疗剂或足够量的辐照以实现细胞杀伤。这些方法可允许在形态变化变得明显之前检测到细胞杀伤。在一个实施例中，所述方法包括使具有抑制细胞表面蛋白的抑制细胞与治疗有效量的一种或多种抗体-IR700分子(例如，至少0.01nM、至少0.1nM、至少1nM或至少10nM，例如0.1至2nM、0.5-1.5nM，例如1nM的一种或多种抗体-IR700分子)相接触，其中抗体特异性地结合抑制细胞表面蛋白；以660-740nm的波长和至少20Jcm-2的剂量辐照细胞；并在辐照细胞后约0至48小时(例如辐照细胞后至少1小时、至少2小时、至少4小时、至少6小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少36小时、至少48小时或者至少72小时，例如辐照细胞后1分钟至30分钟、10分钟至30分钟、10分钟至1小时、10分钟至8小时、6小时至24小时或6小时至48小时)用荧光寿命成像(FLI)检测细胞，从而实时检测细胞杀伤。缩短的FLT可作为PIT诱发急性膜损伤的指征。因此，在足以使IR700FLT缩短至少25％、例如至少40％、至少50％、至少60％或至少75％的条件下辐照细胞。在一个实施例中，以660nm至740nm的波长(例如，680nm至700nm)和至少20J cm-2或至少30J cm-2的剂量(例如至少40J cm-2或至少50-2J cm-2或至少60J cm-2，例如30至50J cm-2)辐照细胞。
示例性抑制细胞和抑制细胞表面蛋白
被一种或多种抗体-IR700分子杀伤的抑制细胞可以培养物生长，或存在于待处理的哺乳动物中，例如患有癌症的患者中。可使用所公开的方法杀伤任何类型的抑制细胞。抑制细胞表达细胞表面蛋白，可选择或产生特异性地结合这样的抑制细胞表面蛋白的抗体，以及针对该抑制细胞表面蛋白产生的抗体-IR700分子。表1提供了可用所公开的疗法靶向的示例性抑制细胞和抑制细胞表面蛋白。抗体-IR700分子的抗体或抗体片段可以是特异性地结合表1中列出的抑制细胞表面蛋白或存在于细胞表面上的蛋白的一部分(例如，以下提供的这些蛋白质的登录号所提供的蛋白质的细胞表面表位)。
表1：示例性抑制细胞和抑制细胞表面蛋白
成纤维细胞活化蛋白(FAP)、CXCR2、CD33和CD66b
可被所公开的疗法靶向的抑制细胞的实例包括CD4+CD25+Foxp3+Treg、II型天然杀伤T(NKT)细胞、CD8+CD122+Treg、M2巨噬细胞、肿瘤浸润性成纤维细胞和髓系来源的抑制细胞中的一种或多种。CD4+CD25+Foxp3+Treg是在其细胞表面表达CD25和CD4蛋白并且在细胞内表达转录因子叉状头盒P3(Foxp3)蛋白的一种抑制细胞类型。以CD4、CD25和转录因子Foxp3为特征的调节性T细胞是专门用于免疫抑制的CD4+T细胞的亚群。II型NKT细胞是T细胞的异质组，它们共享T细胞和天然杀伤细胞的特性，是CD1d限制性T细胞，并且共表达α§T细胞受体以及NK1.1。CD8+CD122+Treg参与维持免疫稳态。这样的细胞在其表面上表达CD8和CD122。M2巨噬细胞是一类例如通过代谢鸟氨酸减轻炎症并促进组织修复的巨噬细胞。
抑制细胞表面蛋白是由抑制细胞表达的蛋白质，其中蛋白质的至少一部分在其细胞表面上存在并可检测到。例如，蛋白质可完全存在于表面上，或者可以是具有细胞外部分的跨膜蛋白，所述细胞外部分具有可结合特定抗体或其片段的独特表位(例如，Fab或F(ab')2片段)。在一些实施例中，与其他细胞例如癌细胞相比，抑制细胞表面蛋白质对于抑制细胞是独特的或者在那些细胞上更丰富。示例性抑制细胞表面蛋白(并且可使用对该蛋白质具有特异性的抗体来制备抗体-IR700分子)包括但不限于：CD25、CD4、4型C-X-C趋化因子受体(CXCR4)、4型C-C趋化因子受体(CCR4)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、糖皮质激素诱导的TNF受体(GITR)、OX40、叶酸受体4(FR4)、CD16、CD56、CD8、CD122、CD23、CD163、CD206、CD11b、Gr-1、CD14、白细胞介素4受体α链(IL-4Ra)、白细胞介素-1受体α(IL-1Ra)、白细胞介素-1诱饵受体、CD103、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、CXCR2、CD33和CD66b。
CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞
如果要杀伤/靶向的抑制细胞是CD4+CD25+Foxp3+Treg，则可使用抗-CD4、抗-CD25、抗-CXCR4、抗-CCR4、抗-GITR、抗-OX40、抗FR4和/或抗-CTLA4抗体(例如，没有功能性Fc区)作为抗体-IR700分子的一部分。
CD4(分化簇4)是在一些免疫细胞的表面上发现的糖蛋白，并且充当辅助受体以协助T细胞受体与抗原呈递细胞通信。CD4具有在细胞表面上表达的免疫球蛋白结构域(D1至D4)。已知若干种生物体的CD4序列(例如，参见登录号：NP_000607.1、NP_038516.1、P01730.1、XP_004052630.1和XP_008761502.1)。另外，可从商业来源(例如，来自Santa Cruz Biotechnology，Dallas，TX的目录#sc-514571、sc-514746和sc-07219；来自丹麦Dako的克隆4B12以及来自abcam，Cambridge，MA的目录#ab133616、ab25475和ab51037)公开得到对CD4具有特异性的抗体。例如使用实施例1中描述的方法或胃蛋白酶可修饰CD4抗体以除去/失活Fc区。
CD25是IL-2受体的α链(也称为IL2RA)。它是在活化的T细胞、活化的B细胞、一些胸腺细胞、髓样前体和少突胶质细胞上发现的跨膜蛋白。已知若干种生物体的CD25序列(例如，参见登录号：NP_000408.1、NP_001295172.1、NP_001295171.1、AAI14438.1、NP_999000.1和CAA44297.1)。另外，可从商业来源(例如，来自Santa Cruz Biotechnology，Dallas，TX的目录#sc-376665、sc-365912和sc-1628；和来自abcam，Cambridge，MA的目录#ab8235、ab9496和ab61777)公开得到对CD25具有特异性的抗体。在一个实施例中，CD25抗体是达珠单抗(例如，含有FC部分的)。在一个实施例中，CD25抗体是巴利昔单抗(例如，含有FC部分的)，例如不含功能性Fc区的那种。在一个实施例中，CD25抗体是达珠单抗，例如不含功能性Fc区的那种。例如使用实施例1中描述的方法或胃蛋白酶可修饰CD25抗体以除去/失活Fc部分。在一些实施例中，本文提供的方法使用两种不同的抗-CD25-F(ab')2-IR700分子，例如含有巴利昔单抗和达珠单抗具有非功能性Fc区的抗CD25-IR700分子。
4型C-X-C趋化因子受体(CXCR4)，也称为融合素或CD184，是对间质衍生因子1具有特异性的α趋化因子受体。CXCR4是HIV可用于感染CD4+T细胞的几种趋化因子受体之一。已知若干种生物体的CXCR4序列(例如，参见登录号：CAA12166.1、NP_001008540.1、NP_034041.2、AAZ32767.1和XP_004032646.1)。另外，可从商业来源(例如来自Bristol-Myers Squibb的BMS-936564(MDX-1338)，来自Santa Cruz Biotechnology，Dalla，TX的目录#sc-12764、sc-53534和sc-6279；以及来自abcam，Cambridage，MA的目录#ab2074、ab124824和ab7199)公开得到对CXCR4具有特异性的抗体。例如使用实施例1中描述的方法或胃蛋白酶可修饰CXCR4抗体以除去/失活Fc区。
4型C-C趋化因子受体(CCR4)，也称为CD194，是趋化因子CCL2、CCL4、CCL5、CCL17和CCL22的G蛋白偶联受体。已知若干种生物体的CCR4序列(例如，参见登录号：NP_005499.1、NP_034046.2、P51680.2、NP_598216.2和NP_001252949.1)。此外，可从商业来源(例如，来自Santa Cruz Biotechnology，Dallas，TX的目录#sc-101375和sc-32133；和来自abcam，Cambridge，MA的目录#ab1669、ab1664和ab59550)公开得到CCR4特异性抗体。例如使用实施例1中描述的方法或胃蛋白酶可修饰CCR4抗体以除去/失活Fc区。
糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子(TNF)受体(GITR)是参与抑制调节T细胞的抑制活性并延长效应T细胞存活的表面受体分子。已知若干种生物体的GITR序列(例如，参见登录号：NP_004186.1、NP_033426.1、NP_001171879.1、NP_001019520.2和NP_001026045.1)。另外，可从商业来源(例如，来自Santa Cruz Biotechnology，Dallas，TX的目录#sc-5759、sc-53972和sc-355391；和来自abcam，Cambridge，MA的目录#ab129272、ab86574和ab10030))公开得到对GITR具有特异性的抗体。例如使用实施例1中描述的方法或胃蛋白酶可修饰GITR抗体以除去/失活Fc区。
OX40，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员4(TNFRSF4)或CD134，是次级共刺激免疫检查点分子，在活化后24至72小时后表达。已知若干种生物体的OX40序列(例如，参见登录号：NP_003318.1、CAA59476.1、NP_035789.1、CAB96543.1和NP_037181.1)。另外，可从商业来源(例如，来自Santa Cruz Biotechnology，Dallas，TX的目录#sc-20073、sc-10938和sc-11404；和来自abcam，Cambridge，MA的目录#ab203220、ab119904和ab76000)公开得到对OX40具有特异性的抗体。例如使用实施例1中所述的方法或胃蛋白酶可修饰OX40抗体以除去/失活Fc区。
叶酸受体4(FR4)，也称为Juno和IZUMO1R，位于哺乳动物卵细胞的表面上，它识别其精子-安置对应物(sperm-riding counterpart)IZUMO1，并促进受精。FR4在转化生长因子-β(TGF-β)-诱导的Treg和天然Treg中也以高水平表达。外显子3缺失的FR4转录物变体FR4D3主要在CD4+CD25+Treg细胞中表达。已知若干种生物体的FR4序列(例如，参见登录号：A6ND01.3、XP_006510599.1和XP_006510596.1)。另外，可从商业来源(例如，来自Santa Cruz Biotechnology，Dallas，TX的目录#sc-39969；和来自abcam，Cambridge，MA的目录#ab53682和ab170535)公开得到对FR4具有特异性的抗体。例如使用实施例1中描述的方法或胃蛋白酶可修饰FR4抗体以除去/失活Fc区。
细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)，也称为CD152，是一种用作免疫检查点下调免疫系统的蛋白质受体。在T细胞表面上发现了CTLA4。已知若干种生物体的CTLA4序列(例如，参见登录号：P16410.3、NP_001268905.1、NP_113862.1、NP_001009236.1和T09536)。另外，可从商业来源(例如，来自Santa Cruz Biotechnology，Dallas，TX的目录#sc-1630和sc-909；和来自abcam，Cambridge，MA的目录#ab134090、ab19792和ab102730)公开得到对CTLA4具有特异性的抗体。在一个实施例中，CTLA4抗体是伊匹单抗(例如，含有FC部分的)。在一个实施例中，CTLA4抗体是tremelimumab(例如，含有FC部分的)。例如使用实施例1中描述的方法或胃蛋白酶可修饰CTLA4抗体以除去/失活Fc区。
CD103(分化簇103)，也称为整合素αE(ITGAE)，是在成熟Treg表面上发现的整合素。CD103结合整合素β7(β7-ITGB7)以形成完整的异二聚体整合素分子αEβ7。已知若干种生物体的CD103序列(例如，参见登录号：NP_002199.3、NP_032425.2、AAM27173.1、AAI13437.1和NP_113956.2)。此外，可从商业来源(例如，来自Miltenyl Biotech的单克隆抗体Ber-ACT8和来自abcam，Cambridge，MA的目录#129202和ab128756)公开得到对CD103具有特异性的抗体。例如使用实施例1中所述的方法或胃蛋白酶可修饰CD103抗体以除去/失活Fc区。
II型天然杀伤T细胞
如果要杀伤/靶向的抑制细胞是II型NKT细胞，则可使用抗CD-16和/或抗-CD56抗体(例如，没有功能性Fc区)作为抗体-IR700分子的一部分。
CD16已被鉴定为Fc受体FcγRIIIa(CD16a)和FcγRIIIb(CD16b)。这些受体结合IgG抗体的Fc部分，然后活化NK细胞用于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。已知若干种生物体的CD16序列(例如，参见登录号：NP_001121064.1、NP_001231682.1、NP_034318.2、BAA92348.1和AAH36723.1)。另外，可从商业来源(例如，来自Santa CruzBiotechnology，Dallas，TX的目录#sc-19620、sc-58962和sc-52376；和来自abcam，Cambridge，MA的目录#ab183354、ab203883和ab664)公开得到对CD16具有特异性的抗体。例如使用实施例1中描述的方法或胃蛋白酶可修饰CD16抗体以除去/失活Fc部分。
CD56，也称为神经细胞粘附分子(NCAM)，是Ig-超家族的糖蛋白，其在静息和活化的NK细胞上表达。CD56的胞外结构域由五个免疫球蛋白样(Ig)结构域和两个III型纤连蛋白(FNIII)结构域组成。已知若干种生物体的CD56序列(例如，参见登录号：NP_000606.3、NP_851996.2、NP_001074914.1、NP_851996.2和NP_113709.1)。此外，可从商业来源(例如，来自Santa Cruz Biotechnology，Dallas，TX的目录#sc-71651和sc-7326；和来自abcam，Cambridge，MA的目录#ab191105和ab9018)公开得到对CD56具有特异性的抗体。例如使用实施例1中所述的方法或胃蛋白酶可修饰CD56抗体以除去/失活Fc部分。
CD8+CD122+Treg
如果要杀伤/靶向的抑制细胞是CD8+CD122+Treg，则可使用抗-CD8和/或抗-CD122抗体(例如，没有功能性Fc区)作为抗体-IR700分子的一部分。
分化簇8(CD8)是一种跨膜糖蛋白，其可用作T细胞受体的辅助受体，与I类主要组织相容性复合物(MHC)相结合。有两种同种型－α和β。已知若干种生物体的CD8序列(例如，参见登录号：NP_001139345.1、NP_001074579.1、XP_006505528.1、AAB21671.2和EDK98935.1)。此外，可从商业来源(例如，来自Santa Cruz Biotechnology，Dallas，TX的目录#sc-1177、sc-7970和sc-25277；和来自abcam，Cambridge，MA的目录#ab93278、ab22378和ab34364)公开得到对CD8具有特异性的抗体。例如使用实施例1中描述的方法或胃蛋白酶可修饰CD8抗体以除去/失活Fc部分。
CD122，也称为白细胞介素-2受体亚基β(IL2RB)，是一种参与T细胞介导的免疫应答的I型膜蛋白。已知若干种生物体的CD122序列(例如，参见登录号：NP_000869.1、NP_032394.1、NP_037327.1、NP_001274237.1和P16297.1)。另外，可从商业来源(例如，来自Santa Cruz Biotechnology，Dallas，TX的目录#sc-19583；和来自abcam，Cambridge，MA的目录#ab61195和ab62699)公开得到对CD122具有特异性的抗体。例如使用实施例1中描述的方法或胃蛋白酶可修饰CD122抗体以除去/失活Fc部分。
M2巨噬细胞
如果要杀伤的/靶向的抑制细胞是M2巨噬细胞，则可使用抗-CD23、抗-CD163、抗-CD206、抗-CD11b、抗-Gr-1、抗-CD14、抗-IL-4Ra、抗-IL-1Ra和/或抗-IL-1诱饵受体抗体(例如，不含功能性Fc区)作为抗体-IR700分子的一部分。
CD23，也被称为FcεRII，是IgE的低亲和力受体，并且在抗体反馈调节中起作用。同种型CD23b在T细胞上表达。已知若干种生物体的CD23序列(例如，参见登录号：NP_001193948.2、NP_001240666.1和NP_598234.2)。此外，可从商业来源(例如，来自SantaCruz Biotechnology，Dallas，TX的目录#sc-7023、sc-23923和sc-18910；和来自abcam，Cambridge，MA的目录#ab92495、ab16702和ab135386)公开得到对CD23具有特异性的抗体。例如使用实施例1中描述的方法或胃蛋白酶可修饰CD23抗体以除去/失活Fc部分。
分化簇163(CD163)是血红蛋白-触珠蛋白复合物的跨膜清除受体。已知若干种生物体的CD163序列(例如，参见登录号：CAB45233.1、NP_004235.4、Q86VB7.2、NP_001163866.1和Q2VLH6.2)。此外，可从商业来源(例如，来自Santa Cruz Biotechnology，Dallas，TX的目录#sc20066、sc33715和sc-58965；和来自abcam，Cambridge，MA的目录#ab17051和ab87099)公开得到对CD163具有特异性的抗体。例如使用实施例1中所述的方法或胃蛋白酶可修饰CD163抗体以除去/失活Fc部分。
分化簇206(CD206)，也称为C型甘露糖受体1(MC1)，存在于巨噬细胞、未成熟的树突状细胞的表面和皮肤细胞(例如人真皮成纤维细胞和角质形成细胞)的表面上。已知若干种生物体的CD206序列(例如，参见登录号：NP_002429.1、AAI41339.1和NP_001086907.2)。此外，可从商业来源(例如，来自Santa Cruz Biotechnology，Dallas，TX的目录#sc-58986、sc-70585和sc-70586；和来自abcam，Cambridge，MA的目录#ab8918、ab64693和ab117644)公开得到对CD206具有特异性的抗体。例如使用实施例1中描述的方法或胃蛋白酶可修饰CD206抗体以除去/失活Fc部分。
分化簇11b(CD11b)，也称为整合素αM(ITGAM)，是形成异二聚体整合素α-Mβ-2(αMβ2)分子的一种蛋白质亚基。αMβ2在许多参与先天免疫系统的白细胞的表面上表达，包括单核细胞、粒细胞、巨噬细胞和天然杀伤细胞。已知若干种生物体的CD11b序列(例如，参见登录号：NP_000623.2、NP_001076429.1和EDM17198.1)。此外，可从商业来源(例如，来自Santa Cruz Biotechnology，Dallas，TX的目录#sc-20050、sc-1186和sc-28664；和来自abcam，Cambridge，MA的目录#ab64347、ab52478和ab8878)公开得到对CD11b具有特异性的抗体。例如使用实施例1中描述的方法或胃蛋白酶可修饰CD11b抗体以除去/失活Fc部分。
Gr-1，也称为淋巴细胞抗原6复合物、基因座C1(Ly-6C)或淋巴细胞抗原6复合物，基因座G(LY-6G)，是糖基化磷脂酰肌醇(GPI)连接的蛋白质。它是在粒细胞和巨噬细胞上表达的髓样分化抗原。已知若干种生物体的Gr-1序列(例如，参见登录号：NP_001297367.1、AAA39469.1和P35461.1)。此外，可从商业来源(例如，来自Santa CruzBiotechnology，Dallas，TX的目录#sc-53515和sc-103603；和来自abcam，Cambridge，MA的目录#ab25377、ab171254和ab134775)公开得到对Gr-1具有特异性的抗体。例如使用实施例1中描述的方法或胃蛋白酶可修饰Gr-1抗体以除去/失活Fc部分。
分化簇14(CD14)充当用于检测细菌脂多糖的辅助受体(与Toll样受体TLR 4和MD-2一起)。它由巨噬细胞表达，并且在较小程度上由嗜中性粒细胞和树突状细胞表达。已知若干种生物体的CD14序列(例如，参见登录号：NP_000582.1、P08571.2、NP_033971.1、CAA32166.1和BAA21517.1)。此外，可从商业来源(例如，来自Santa CruzBiotechnology，Dallas，TX的目录#sc-1182、sc-5749和sc-6998；和来自abcam，Cambridge，MA的目录#ab133335、ab183322和ab182032)公开得到对CD14具有特异性的抗体。例如使用实施例1中描述的方法或胃蛋白酶可修饰CD14抗体以除去/失活Fc部分。
IL-4Ra，也称为白细胞介素4受体(IL4R)，是IL4R的α链和I型跨膜蛋白，其可结合白细胞介素4以促进Th2细胞的分化。已知若干种生物的IL-4Ra序列(例如，参见登录号：NP_000409.1、NP_596871.2、NP_001008700.1、P24394.1和NP_001075243.1)。另外，可从商业来源(例如，来自LifeSpan BioSciences，Inc.，Seattle，WA的目录#LS-C70896；和来自abcam，Cambridge，MA的目录#ab131058和ab50277)公开得到对IL-4Rα具有特异性的抗体。例如使用实施例1中描述的方法或胃蛋白酶可修饰IL-4Rα抗体以除去/失活Fc部分。
白细胞介素-1受体α(IL-1Rα)，也称为I型IL1(IL-1R1)和CD121a)，是结合IL1α、IL1β和IL1R拮抗剂的细胞因子受体。已知若干种生物体的IL-1Ra序列(例如，参见登录号：NP_000868.1、NP_001116854.1、JAA43683.1和NP_037255.3)。另外，可从商业来源(例如，来自Santa Cruz Biotechnology，Dallas，TX的目录#sc-688和sc-66054；以及来自abcam，Cambridge，MA的目录#ab106278和ab115497)公开得到对IL-1Ra具有特异性的抗体。例如使用实施例1中描述的方法或胃蛋白酶可修饰IL-1Ra抗体以除去/失活Fc部分。
白介素-1诱饵受体，也称为II型IL1(IL-1R2)和CD121b)，是一种细胞因子受体，其结合IL1α、IL1β和IL-1Ra，并作为抑制其配体活性的诱饵受体。已知若干种生物体的IL-1诱饵受体序列(例如，参见登录号：AAH39031.1、NP_001248348.1、NP_034685.1和AAH91564.1)。另外，可从商业来源(例如，来自Santa Cruz Biotechnology，Dallas，TX的目录#sc-27854和sc-52678；和来自abcam，Cambridge，MA的目录#ab89159和ab97388)公开得到对IL-1诱饵受体具有特异性的抗体。例如使用实施例1中描述的方法或胃蛋白酶可修饰IL-1诱饵受体抗体以除去/失活Fc部分。
肿瘤浸润性成纤维细胞
如果要杀伤/靶向的抑制细胞是肿瘤浸润性成纤维细胞，则可使用抗-成纤维细胞活化蛋白(FAP)抗体(例如，不含功能性Fc区)作为抗体-IR700分子的一部分。
FAP，也称为seprase，是属于丝氨酸蛋白酶家族的同二聚体整合膜明胶酶。FAP在上皮癌的反应性基质成纤维细胞、愈合伤口的肉芽组织以及骨和软组织肉瘤的恶性细胞中选择性表达。已知若干种生物体的FAP序列(例如，参见登录号：AAB49652.1、CAA71116.1、BAI47344.1、JAA21430.1和DAA32677.1)。另外，对FAP具有特异性的抗体可从商业来源(例如来自abcam，Cambridge，MA的目录#ab53066和ab54651)公开得到，并公开在US2012/0258119中。例如使用实施例1中描述的方法或胃蛋白酶可修饰FAP抗体以除去/失活Fc部分。
髓系来源的抑制细胞
如果待杀伤/靶向的抑制细胞是髓系来源的抑制细胞，则可以使用抗-CXCR2、抗-CD11b、抗-CD14、抗-CD33和抗-CD66b抗体(例如，不含功能性Fc区)作为抗体-IR700分子的一部分。
2型C-X-C趋化因子受体(CXCR2)，也称为IL8R8，是白细胞介素8的受体。它通过G蛋白活化的第二信使系统转导信号。该受体还与趋化因子(C-X-C基序)配体1(CXCL1/MGSA)结合，该趋化因子配体1是具有黑素瘤生长刺激活性的蛋白质。另外，它结合配体CXCL2、CXCL3和CXC。已知若干种生物体的CXCR2序列(例如，参见登录号：NP_001548.1、NP_001161770.1、NP_034039.1、NP_058879.1和ABC59060.1)。另外，可从商业来源(例如来自Rockland(Limerick，PA)的目录#600-401-P54；和来自abcam，Cambridge，MA的ab14935和ab61100)公开得到对CXCR2具有特异性的抗体。例如使用实施例1中描述的方法或胃蛋白酶可修饰CXCR2抗体以除去/失活Fc部分。
分化簇11b(CD11b)，也称为整合素αM(ITGAM)，是形成异二聚体整合素α-Mβ-2(αMβ2)分子的一种蛋白质亚基。αMβ2在许多参与先天免疫系统的白细胞的表面上表达，包括单核细胞、粒细胞、巨噬细胞和天然杀伤细胞。已知若干种生物体的CD11b序列(例如，参见登录号：NP_000623.2、NP_001076429.1和EDM17198.1)。此外，可从商业来源(例如，来自Santa Cruz Biotechnology，Dalla，TX的目录#sc-20050、sc-1186和sc-28664；和来自abcam，Cambridge，MA的目录#ab64347、ab52478和ab8878)公开得到对CD11b具有特异性的抗体。例如使用实施例1中描述的方法或胃蛋白酶可修饰CD11b抗体以除去/失活Fc部分。
分化簇14(CD14)用作用于检测细菌脂多糖的辅助受体(与Toll样受体TLR4和MD-2一起)。它由巨噬细胞表达，并且在较小程度上由嗜中性粒细胞和树突状细胞表达。已知若干种生物体的CD14序列(例如参见登录号：NP_000582.1、P08571.2、NP_033971.1、CAA32166.1和BAA21517.1)。此外，可从商业来源(例如，来自Santa CruzBiotechnology，Dallas，TX的目录#sc-1182、sc-5749和sc-6998；和来自abcam，Cambridge，MA的目录#ab133335、ab183322和ab182032)公开得到对CD14具有特异性的抗体。例如使用实施例1中描述的方法或胃蛋白酶可修饰CD14抗体以除去/失活Fc部分。
分化簇33(CD33)，也被称为siglec-3、gp67和p67，是在髓系谱系细胞上表达的跨膜受体，且也在一些淋巴样细胞上发现。已知若干种生物体的CD33序列(例如参见登录号：NP_001076087.1、NP_001171079.1、NP_001763.3、NP_001104528.1和NP_067268.1)。另外，可从商业来源(例如，作为gemiuzumab奥佐米星的一部分的重组人源化抗-CD33单克隆抗体(IgG4κ抗体hP67.6)(来自Pfizer/Wyeth-Ayerst实验室)、作为vadastuximab talirine(SGN-CD33A)Seattle Genetics的一部分的抗-CD33抗体、克隆M195(人源化IgG2a单克隆，参见Caron和Scheinberg，Leuk.Lymphom.11：1-6,2009)；和来自abcam，Cambridge，MA的目录#ab199432和ab19462)公开得到对CD33具有特异性的抗体。例如使用实施例1中所述的方法或胃蛋白酶可修饰CD33抗体以除去/失活Fc部分。
CD66b，也称为癌胚抗原相关粘附分子8(CEACAM8)，属于丝氨酸蛋白酶家族的同二聚体整合膜明胶酶。CD66b在粒细胞上表达并参与细胞粘附、细胞迁移和病原体结合。已知若干种生物体的CD66b(例如，参见登录号：NP_001807.2、AAH26263.1、AAI20205.1和XP_009433977.1)。另外，可从商业来源(例如，来自abcam，Cambridge，MA的目录#ab197678和ab170875和来自Stemcell Technologies，Vancouver，Canada的目录#60086)公开得到对CD66具有特异性的抗体。例如使用实施例1中描述的方法或胃蛋白酶可修饰CD66b抗体以除去/失活Fc部分。
示例性的肿瘤
所公开的使用一种或多种抗体-IR700分子杀伤抑制细胞的方法可用于处理(例如，杀伤)肿瘤细胞，例如癌细胞、例如患有癌症的患者中的细胞。抑制细胞可抑制效应T细胞(Teff)、NK细胞和/或树突状细胞以驱动免疫抑制并防止免疫介导的癌症排斥。因此，通过使用所公开的方法减少可活化的抑制细胞的数量，然后Teff(例如，细胞毒性CD8+细胞)可用于杀伤肿瘤/癌细胞。
可用所公开的方法处理(例如，杀伤)的示例性肿瘤包括但不限于：液体肿瘤例如白血病，包括急性白血病(例如急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病和成髓细胞性白血病、前髓细胞性白血病、骨髓单核细胞性白血病、单核细胞性白血病和红白血病)、慢性白血病(例如慢性髓细胞(粒细胞)白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、Waldenstrdm巨球蛋白血症、重链病)。在另一个实施例中，细胞是实体肿瘤细胞，例如肉瘤和癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、肺癌、结肠直肠癌、头颈癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌(例如胰腺腺癌、结肠腺癌、卵巢腺癌、肺腺癌、乳腺癌、胃腺癌、前列腺癌、宫颈腺癌或食管腺癌)、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、膀胱癌、CNS肿瘤(例如神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、menangioma、黑素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤)。
示例性对象
在一些实施例中，所公开的方法用于治疗患有肿瘤的对象，所述肿瘤例如本文所述的肿瘤。在一些实施例中，肿瘤先前已经被治疗过，例如经外科手术或化学地去除，并且随后使用所公开的方法来杀伤可能留在患者体内的任何残留的不期望的肿瘤细胞。
所公开的方法可用于治疗任何哺乳动物对象，例如患有肿瘤(例如，癌症)或先前已经被去除或被治疗过的人。需要所公开的疗法的对象可包括患有癌症的人对象。例如，所公开的方法可单独用作癌症的初始治疗，或者与辐照或其他化学疗法或生物疗法(例如，单克隆抗体疗法)组合使用。所公开的方法也可用于先前辐照或化疗失败的患者。因此，在一些实施例中，对象是接受过其他疗法的对象，但那些其他疗法未提供期望的治疗响应。所公开的方法也可用于患有局部和/或转移性癌症的患者。
抗体-IR700分子和其他治疗剂的施用
可在体外使抗体-IR700分子和其它治疗剂(例如，抗肿瘤剂)与抑制细胞接触，例如通过将抗体-IR700分子和其它治疗剂添加到细胞在其中生长的生长培养基中；或者可例如通过向待治疗的对象施用抗体-IR700分子在体内使抗体-IR700分子和其它治疗剂与抑制细胞接触。
抗体-IR700分子以及其它治疗剂可采用本领域已知的任何方法局部地或全身地施用，例如施用于患有肿瘤(例如，癌症)的对象或先前已经去除了肿瘤的对象(例如通过手术或其他疗法)。虽然提供了具体的实施例，但本领域技术人员将会理解，可使用所公开的抗体-IR700分子和其它治疗剂的替代性施用方法。这样的方法可包括例如使用导管或可植入泵来提供在需要治疗的对象中持续输注数小时至数天的时间。
在一个实施例中，抗体-IR700分子和其它治疗剂通过肠胃外方式施用，包括直接注射或输注入肿瘤(瘤内)。在一些实施例中，通过将抗体-IR700分子和其它治疗剂施用于肿瘤将抗体-IR700分子和其它治疗剂施用于肿瘤，例如通过将肿瘤浸入含有抗体-IR700分子和其它治疗剂的溶液中或通过将抗体-IR700分子和其它治疗剂倾倒于肿瘤上。
另外或可选地，所公开的组合物(例如，含有一种或多种抗体-IR700分子的那些)以及其它治疗剂可全身地施用到患有肿瘤(例如，癌症)的对象，例如静脉内、肌内、皮下、皮内、腹膜内、皮下或经口。
待施用于对象的抗体-IR700分子(和其他治疗剂)的剂量不受绝对限制，但将取决于组合物及其活性成分的性质及其不需要的副作用(例如，针对抗体的免疫应答)、正在接受治疗的对象和正在治疗的病症的类型以及施用方式。通常，剂量将是治疗有效量，例如足以实现期望的生物效应的量，例如有效减小肿瘤尺寸(例如，体积和/或重量)或减弱肿瘤的进一步生长或减少肿瘤非期望的症状的量。其它治疗剂的剂量在本领域中是已知的。
对于抗体-IR700分子的静脉内施用，用于单次治疗的施用于对象的示例性剂量范围可以是0.5至100mg/60kg体重、1至100mg/60kg体重、1至50mg/60kg体重、1至20mg/60kg体重，例如约1或2mg/60kg体重。在又一个实例中，腹膜内或肿瘤内施用的抗体-IR700分子的治疗有效量可为1kg体重从10μg至5000μg抗体-IR700分子不等，例如10μg/kg至1000μg/kg、10μg/kg至500μg/kg或100μg/kg至1000μg/kg。
在一个实施例中，施用于人患者的抗体-IR700分子的剂量为至少50mg，例如至少100mg、至少300mg、至少500mg、至少750mg或甚至1g，例如50至100mg。
用所公开的抗体-IR700分子(和其它治疗剂)进行治疗可以在一天内完成，或者可以以相同或不同剂量的在多天内重复进行。重复治疗可以在同一天、连续几天或每1至3天、每3至7天、每1至2周、每2至4周、每1至2个月或甚至更长的间隔进行。因此，在一些实施例中，使用所公开的抗体-IR700分子，对象被治疗至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少10次或至少20次(例如2至5次，或3至4次)。
抑制细胞的辐照
在使抑制细胞与一种或多种抗体-IR700分子接触后，对它们进行辐照。辐照方法在本领域中是公知的。由于只有表达一种或多种抑制细胞表面蛋白的抑制细胞才被抗体识别，所以只有那些抑制细胞将具有足够量的抗体-IR700分子与之结合。这减少了不期望的副作用例如杀伤其他免疫细胞的可能性，因为辐照只杀伤抗体-IR700分子结合的细胞，而不会杀伤其他细胞。
在一些实施例中，在体外、例如在组织培养皿中对抑制细胞进行辐照。在其它实施例中，在体内辐照抑制细胞，例如辐照先前已经施用了抗体-IR700分子的对象。在一些实施例中，对象被辐照，例如对象中的肿瘤可被辐照。
在660至710nm，例如660至700nm、680至700nm、670至690nm、670至710nm、例如680nm或690nm的波长下以治疗剂量辐照抑制细胞(例如，在对象中)。在特定实施例中，以如下剂量辐照抑制细胞(例如，在对象中)：至少1J cm-2、至少2J cm-2、至少3J cm-2、至少4Jcm-2、至少5J cm-2、至少6J cm-2、至少7J cm-2、至少8J cm-2、至少9J cm-2、至少10J cm-2、至少30J cm-2、至少50J cm-2、至少60J cm-2、至少100J cm-2、或至少500J cm-2、例如1-1,000J cm-2、1至500J/cm-2、4至10J cm-2、4至8J cm-2、4至65J cm-2、30至50J cm-2、10至100J cm-2或10至50J cm-2。
在施用本文提供的抗体-IR700分子后，可对抑制细胞(或患者)进行一次或多次辐照。因此，辐照可在一天内完成，或者可以相同或不同的剂量在多天内(例如，辐照至少不同的2次、至少不同的3次、至少不同的4次、至少不同的5次或至少不同的10次)反复进行。可在同一天、连续几天或每1至3天、每3至7天、每1至2周、每2至4周、每1至2个月或甚至更长的间隔进行反复辐照。因此，在一些实施例中，用NIR辐照对象至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少10次或至少20次。
额外的治疗
如上所述，在施用一种或多种抗体-IR700分子之前、期间或之后，对象可接受一种或多种其他疗法。在一个实施例中，对象在施用抗体-IR700分子之前接受一种或多种治疗以除去或减小肿瘤。在一个实施例中，对象在施用抗体-IR700分子后接受一种或多种治疗。在一些实施例中，如果在施用一种或多种抗体-IR700分子和NIR辐照后以4至8mg/kg静脉内输注来用一种或多种抗细胞因子试剂(例如tocilizumab)治疗对象，则对象遭受副作用，例如原因是升高的细胞因子/趋化因子。
可与所公开的方法组合使用的这样的疗法的实例包括但不限于用于去除或减小肿瘤的手术治疗(例如手术切除、冷冻疗法或化学栓塞)以及抗肿瘤药物治疗，所述抗肿瘤药物治疗可包括放射治疗剂、抗肿瘤化学治疗剂、抗生素、烷化剂和抗氧化剂、激酶抑制剂、生物制剂(例如，抗体)和其它试剂。
在一些实施例中，其它治疗剂(例如，放射治疗剂、抗肿瘤化疗剂、抗生素、烷化剂、抗氧化剂、激酶抑制剂、生物制剂(例如，抗体，例如单克隆抗体)或其它试剂)缀合至(或以其他方式相关联)纳米颗粒，例如直径为至少1nm(例如，直径为至少10nm、直径为至少30nm、直径为至少100nm、直径为至少200nm、直径为至少300nm、直径为至少500nm、或者直径为至少750nm，例如直径为1nm至500nm、1nm至300nm、1nm至100nm、10nm至500nm或10nm至300nm)。
可使用的其他治疗剂的具体实例包括微管结合剂、DNA嵌入剂或交联剂、DNA合成抑制剂、DNA和/或RNA转录抑制剂、抗体、酶、酶抑制剂和基因调节剂。这些试剂(以治疗有效量施用)和治疗剂可单独使用或组合使用。这样的试剂的方法和治疗剂量是本领域技术人员已知的，并且可由熟练的临床医生确定。
“微管结合剂”是指与微管蛋白相互作用以稳定或去稳定微管形成从而抑制细胞分裂的试剂。可与所公开的抗体-IR700分子疗法联合使用的微管结合剂的实例包括但不限于紫杉醇、多西他赛、长春碱、长春地辛、长春瑞滨(诺维本)、埃坡霉素(epothilones)、秋水仙碱、多拉司他汀15、诺考达唑、鬼臼毒素和根霉素。也可使用这样的化合物的类似物和衍生物并且是本领域普通技术人员已知的。例如，在国际公开No.WO2004/018478中描述了合适的埃博霉素和埃坡霉素类似物。可使用紫杉烷(taxoid)例如紫杉醇和多西紫杉醇以及美国专利No.6,610,860、5,530,020和5,912,264所教导的紫杉醇类似物。
在本公开中公开的方法中可施用以下类别的化合物：合适的DNA和/或RNA转录调节剂，包括但不限于蒽环类家族成员(例如，柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌和戊柔比星)和放线菌素D及其衍生物和类似物也适合与所公开的疗法组合使用。可施用于对象的DNA嵌入剂和交联剂包括但不限于铂化合物(例如，卡铂、顺铂、奥沙利铂和BBR3464)、丝裂霉素例如丝裂霉素C、博莱霉素、苯丁酸氮芥、环磷酰胺以及白消安、达卡巴嗪、氮芥、丙卡巴肼、替莫唑胺、噻替派和乌拉莫司汀及其衍生物和类似物。适合用作治疗剂的DNA合成抑制剂包括但不限于甲氨蝶呤、5-氟-5'-脱氧尿苷、5-氟尿嘧啶及其类似物。合适的酶抑制剂的实例包括但不限于喜树碱、依托泊苷、福美坦、曲古霉素及其衍生物和类似物。影响基因调节的合适的化合物包括导致一种或多种基因(例如，雷洛昔芬、5-氮杂胞苷、5-氮杂-2'-脱氧胞苷、他莫昔芬、4-羟基他莫昔芬、米非司酮及其衍生物和类似物)表达增加或降低的试剂。激酶抑制剂包括防止生长因子磷酸化和活化的伊马替尼、吉非替尼和厄洛替尼。
在一个实施例中，其它治疗剂是叶酸(例如，甲氨喋呤、培美曲塞和雷替曲塞)、嘌呤(例如，克拉屈滨、氯法拉滨、氟达拉滨、巯嘌呤和高鸟嘌呤)、嘧啶(例如，卡培他滨)、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、吉西他滨及其衍生物和类似物。在一个实施例中，其它治疗剂是植物生物碱，例如鬼臼(例如，依托泊苷和替尼泊苷)及其衍生物和类似物。在一个实施例中，其它治疗剂是抗代谢物，例如细胞毒性/抗肿瘤抗生素、博来霉素、利福平、羟基脲、丝裂霉素及其衍生物和类似物。在一个实施例中，其它治疗剂是拓扑异构酶抑制剂，例如拓扑替康、伊立替康及其衍生物和类似物。在一个实施例中，其它治疗剂是光敏剂，例如氨基乙酰丙酸、甲基氨基酮戊酸、卟菲尔钠、维替泊芬及其衍生物和类似物。在一个实施例中，所述其它治疗剂是氮芥(例如，苯丁酸氮芥、甲川氯、环磷酰胺、异环磷酰胺和美法仑)或亚硝基脲(例如，卡莫司汀、福莫司汀、洛莫司汀和链佐星)及其衍生物和类似物。
可落入或不可落入上述类别中的一种或多种的其他治疗剂，例如抗肿瘤剂，也适合与所公开的疗法组合施用。例如，这样的试剂包括阿霉素、芹菜素、雷帕霉素、zebularine、西咪替丁、阿利维A酸、六甲蜜胺、安吖啶、阿那格雷、三氧化二砷、天冬酰胺酶、阿西替尼(axitinib)、贝沙罗汀、贝伐单抗、硼替佐米、塞来昔布、地尼白介素2、雌莫司汀、羟基脲、拉帕替尼、帕唑帕尼、喷司他丁、马索罗酚(masoprocol)、米托坦、培门冬酶、他莫昔芬、索拉非尼、舒尼替尼、vemurafinib、凡德他尼、维甲酸及其衍生物和类似物。
其他治疗剂可包括生物制剂，例如一种或多种治疗性抗体。这些生物制剂的实例包括但不限于单克隆抗体，例如阿仑单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、吉姆单抗、利妥昔单抗、帕尼单抗(panitumumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、曲妥珠单抗、以及表2中所示的那些。其他特定的生物制剂和它们可用于的相应肿瘤示于表2中。
表2：示例性额外治疗
在一个实施例中，可使用的其它治疗剂包括其他抗体-IR700分子，其中该抗体特异性地结合肿瘤特异性蛋白质，例如帕尼单抗-IR700分子、曲妥珠单抗-IR700分子、Basilitumab-IR700分子、赛尼哌-IR700分子、Simitect-IR700分子、西妥昔单抗-IR700分子或J591-IR700分子。与肿瘤特异性蛋白质特异性地结合的其他抗体-IR700分子包括与表2中列出的一种或多种分子缀合的IR700。
在一个实施例中，其它治疗剂包括抗-CD103-F(ab')2-IR700分子。
可与所公开的方法一起使用的化学疗法和生物疗法的具体实例包括但不限于以下中的一种或多种：5-氟尿嘧啶(例如)、(贝伐单抗)、(盐酸伊立替康)、卡培他滨(例如)、奥沙利铂(例如， )、(西妥昔单抗)、甲酰四氢叶酸钙、瑞格菲尼(regorafenib)、(瑞格菲尼)、(帕尼单抗)、(甲酰四氢叶酸钙)和(Ziv-Aflibercept)。
可与所公开的方法组合使用的药物组合的实例包括但不限于：GSK2256098和trametinib；VS-6063和紫杉醇；达沙替尼(dasatinib)和厄洛替尼；达沙替尼和贝伐单抗；以及达沙替尼和达卡巴嗪。
在一些实施例中，例如通过静脉内施用还向接受治疗性抗体-IR700分子组合物的对象施用白细胞介素-2(IL-2)。在一些特定实施例中，在施用肽后当天开始持续至多达5天，每8小时经15分钟的时间以至少500,000IU/kg的剂量静脉内推注施用IL-2(ChironCorp.，Emeryville，CA)。根据对象耐受度，可减少剂量。
在一些实施例中，所公开的抗体-IR700分子与细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(抗-CTLA-4)的完全人抗体共同施用(或在NIR之前或之后不久施用)。在一些实施例中，对象接受至少1mg/kg抗-CTLA-4(例如每3周3mg/kg或3mg/kg作为初始剂量，随后剂量每3周减少至1mg/kg)。
在一个实施例中，在施用所公开的疗法之前(例如施用抗体-IR700分子)，肿瘤的至少一部分(例如转移性肿瘤)被手术移除(例如经由冷冻疗法)、经辐照、化学处理(例如，经由化学栓塞)或其组合。例如，具有转移性肿瘤的对象可在施用所公开的疗法之前手术切除全部或部分肿瘤。在一个实施例中，在用抗体-IR700分子和辐照处理后施用一种或多种化学治疗剂。在另一个特定实施例中，对象患有转移性肿瘤，并且在施用所公开的疗法的同时施用放射疗法、化学栓塞疗法或二者。
包含NIR LED的示例性装置
可使用任何类型的可穿戴或放置在身体上的并且可纳入NIRLED的物品。在一个实施例中，所述装置是患者插入其中的腔室。这样的装置可用于杀伤在血液或淋巴中循环的抑制细胞和/或肿瘤细胞，例如白血病、淋巴瘤以及存在于血液或淋巴中的转移性细胞。
在一个实施例中，在体内循环的抑制细胞在延长的时间内被杀伤，并且在这种情况下，可将装置穿戴一段延长的时间，例如数周或数月。因此，这些装置可被整合到每天的衣服、珠宝和睡衣例如毯子中。这些装置使得使用便携式日用衣物和珠宝物品将患者暴露于NIR光成为可能，以使治疗保持私密性并且不干扰日常活动。例如，整合入NIR LED的项链可根据患者的品味进行定制，并在进行PIT疗法的白天谨慎穿戴(例如通过杀伤通过颈部动脉和颈部其他脉管系统的抑制细胞)。在治疗期间，同一位患者可能会穿戴类似“日常”性质的多种装置(毯子、手镯、项链、内衣、袜子、鞋插入物等)。例如，在睡觉时，患者可使用NIR毯子。这些装置还可包括诸如电池的电源和冷却元件以防止诸如毯子的这类装置过热。
在一个实施例中，所述装置是珠宝，例如戒指、手表、手镯或项链。在另一个实施例中，该物品是服装或附件物品，例如衬衫、腰带、裤子、内衣、袜子、外套、鞋插入物、围巾、帽子、护腕、手套等。在另一个实施例中，所述装置是可覆盖身体的物品，例如毯子或毛巾。在另一个实施例中，所述装置是直接暴露皮肤的全身灯室(这样的装置还可包括电源和/或冷却电源)。
通过穿戴整合有一个或多个NIRLED(例如至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少20个、或至少50个NIRLED)的装置，使存在于血液或淋巴中的待杀伤的抑制细胞暴露于由NIRLED(例如在660至740nm、例如670至700nm或680至720nm下发出的NIRLED)产生的光。从NIR LED发射的光可穿透皮肤和血管(例如，颈动脉或皮肤中的微脉管系统)，从而允许光活化与靶细胞结合的抗体-IR700分子，从而杀伤与抗体-IR700分子相结合的细胞。NIRLED可被布置在装置中以确保靶向皮肤或血管或淋巴系统。
可在本文提供的方法中使用的NIRLED装置是可商购获得的。下文中列出了来自一家制造商Marubeni America的适用产品。第一款产品-模制LED-其功率低，但可在更长的曝光时间内使用。其他选项具有更高的功率，且因此可受益于额外的冷却设备。除了最后一款采用25mm×18mm金属外壳包装外，其他产品适用于诸如手链、项链、内衣、袜子、手套、帽子和其他可穿戴物品的可穿戴装置。全部都可用于毯子、手持装置或腔室。
例如，Marubeni America Corporation(tech-led.com/index.shtml)提供了以下带有镜头选项的NIRLED以设置辐照模式：模制LED(www.tech-led.com/data/L680-AU.pdf)其直径为5毫米，具有总辐照功率4mW，计算功率密度5mW cm-2，且功率要求1.8V 20mA；表面贴装LED为3.5mm×2.7mm，具有总辐照功率为3mW，计算功率密度为32mW cm-2，且功率要求为1.9V 50mA；Super Beam(tech-led.com/Superbeam_LEDs.shtml)，其为7.6mm×7.6mm，具有总辐照功率为20-52mW，计算功率密度为34至90mW cm-2，且功率要求为1.65V 100mA；高功率表面安装(tech-led.com/SMB_BL_LEDs.shtml)，其尺寸为5毫米×5毫米或7毫米直径，具有总辐照功率为90mW，计算功率密度为360mWcm-2，且功率要求为2.4V 500mA；和高功率照明器(tech-led.com/High_Power_Illuminators.shtml)，其尺寸为25mm×18mm，具有总辐照功率为150mW，计算功率密度为33mW cm-2，且功率要求为10V 120mA。或者，可制造这样的装置，其在690nm下发光，功率与短的强间歇脉冲相似。
在体外实验期间，功率密度为2.2mW cm-2(或2.2mJs-1cm-2)的NIR光诱导细胞死亡。假定组织的衰减系数为4cm-1，则光的强度在5.8mm下降低至10％，且在12mm下降低至1％。这表明对于体内施用，功率密度可能需要高10至100倍。也就是说，在一些实施例中，由NIRLED装置发出的光的剂量为至少20mW cm-2，例如至少50mW cm-2、至少100mW cm-2、至少150mWcm-2、至少200mW cm-2或至少300mW cm-2。多个NIRLED可被布置成二维阵列以覆盖更大的区域。在一个实施例中，作为LED的替代品，激光器被用作NIR光源。
可通过使用电源(可能是装置的直接或间接部分)为NIR LED供电。供电要求将取决于装置中LED的数量。例如，可使用一个或多个电池为NIR LED供电。对于一些LED，4节AA电池可为3个串联的LED供电。碱性AA电池的最大额定电流为3000mAh，因此该配置可以20、50和100mA供电长达150、60和30个小时。
在一些实施例中，所述装置还包括冷却装置(其可以是装置的直接或间接部分)。例如，散热器可用于被动或主动冷却。另一种选择是热电效应(Peltier)。这样可增加额外的功率，但它可用于功率要求需要插入式交流适配器的应用中。
可与所公开的方法一起使用的另一种类型的装置是具有NIR LED的手电筒样装置。这样的装置可用于手术期间病变的聚焦治疗，或被整合入内窥镜中以在施用PIT药物后将NIR光施用于身体的各种表面。这样的装置可由医生或合格的卫生人员使用，以指导对身体上的特定靶标的治疗。
使用可穿戴的NIR LED的治疗
如本文所述，所公开的方法对抑制细胞具有高度特异性。在一些实施例中，在穿戴整合有NIR LED的装置的患者中，在体内循环的抑制细胞可被杀伤。在一些实施例中，患者使用至少两个装置，例如白天的衣服或珠宝物品，以及晚上的毯子。在一些实施例中，患者同时使用至少两个装置，例如两件衣物。这些装置使得使用便携式日用衣物和珠宝物品将患者暴露于NIR光成为可能，以使治疗保持私密性并且不干扰日常活动。在一些实施例中，所述装置可在白天进行PIT治疗时谨慎穿着。
在一个实施例中，使用本文所述的方法向患者施用一种或多种抗体-IR700分子。然后患者穿戴整合有NIR LED的装置，允许治疗(例如，杀伤)存在于血液或淋巴中的抑制细胞。在一些实施例中，辐照剂量为至少1J cm-2、至少10J cm-2、至少20J cm-2或至少30J cm-2，例如20J cm-2或30J/cm2。在一些实施例中，在一段时间内(例如，双周或每月一次)重复抗体-IR700分子的施用以确保在体内处于治疗水平。
在一些实施例中，患者穿戴或使用该装置或装置的组合至少1周，例如至少2周、至少4周、至少8周、至少12周、至少4个月、至少6个月、或甚至至少1年。在一些实施例中，患者穿戴或使用该装置或装置的组合至少1小时/天、至少2小时/天、4小时/天、例如至少12小时/天，至少16小时/天、至少18小时/天或24小时/天，例如1至2小时/天、1至4小时/天或30分钟至6小时/天。在治疗期间，同一位患者可能会穿戴多个类似“日常”性质的装置(毯子、手镯、项链、内衣、袜子、鞋插入物)。晚上患者可使用NIR LED毯子或其他覆盖物。
抗体-IR700分子
还提供了可与所公开的方法一起使用的抗体-IR700分子，其中所述抗体特异性地结合抑制细胞表面蛋白，并且在一些实施例中不包含功能性Fc区。在一些实施例中，抗体是一个或多个F(ab')2片段或由一个或多个F(ab')2片段组成。在一些实施例中，抗体是一个或多个Fab片段或由一个或多个Fab片段组成。在一些实施例中，抗体与IR700的比率为约1：3。在一些实施例中，抗体是单克隆抗体或其部分(例如F(ab')2片段或Fab片段)，例如人源化的单克隆抗体或其部分(例如，一个或多个F(ab')2片段或Fab片段)。
在一个实施例中，特异性地结合抑制细胞表面蛋白的抗体对以下具有特异性：CD4、4型C-X-C趋化因子受体(CXCR4)、4型C-C趋化因子受体(CCR4)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、糖皮质激素诱导的TNF受体(GITR)、OX40、叶酸受体4(FR4)、CD16、CD56、CD8、CD122、CD23、CD163、CD206、CD11b、Gr-1、CD14、白细胞介素4受体α链(IL-4Ra)、白细胞介素-1受体α(IL-1Rα)、白细胞介素-1诱饵受体、CD103、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、CXCR2、CD33或CD66b。在一个实施例中，特异性地结合抑制细胞表面蛋白的抗体对CD25具有特异性，并且抗体不包含功能性Fc区。由于抑制细胞表面蛋白质序列是公开可获得的(例如如上所示)，本领域技术人员可制造或购买对这些蛋白质具有特异性的抗体(或可与IR700缀合的其他小分子)。例如，如果选择抑制细胞表面蛋白CD25作为靶标，则可购买或生成对CD25具有特异性的抗体(例如，达珠单抗或巴利昔单抗)并将其附着于IR700染料(例如，参见下面的实施例1)。在一些实施例中，这样的抗体被进一步修饰以去除或失活免疫球蛋白的Fc区。
在一个实施例中，抗体-IR700分子是抗-CD25-F(ab')2-IR700分子，例如包括达珠单抗或巴利昔单抗的分子，例如不含功能性Fc区的达珠单抗或巴利昔单抗。
因此，本公开还提供了抗体-IR700分子、包含该分子的组合物和包含该分子的试剂盒。在一个实施例中，试剂盒包括对以下具有特异性的一种或多种抗体-IR700分子：CD25(例如，巴利昔单抗-IR700或达珠单抗-IR700，例如不具有Fc功能区的那些)、CD4、4型C-X-C趋化因子受体(CXCR4)、4型C-C趋化因子受体(CCR4)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、糖皮质激素诱导的TNF受体(GITR)、OX40、叶酸受体4(FR4)、CD16、CD56、CD8、CD122、CD23、CD163、CD206、CD11b、Gr-1、CD14、白细胞介素4受体α链(IL-4Ra)、白细胞介素-1受体α(IL-1Ra)、白细胞介素-1诱饵受体、CD103、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、CXCR2、CD33或CD66b、以及一种或多种其它抗癌疗法，例如化学治疗剂或生物制剂或其组合。以上提供了可作为该试剂盒的一部分的示例性抗癌疗法。
实施例1
材料和方法
试剂
水溶性硅酞菁衍生物IRDye 700DX NHS酯来自LI-COR Bioscience(Lincoln，NE)。抗小鼠CD25抗体(PC-61.5.3)和大鼠-IgG1(HRPN)来自BioXCell(West Lebanon，NH)。所有其他化学品都是试剂级的。
细胞培养
通过转导RediFect Red-FLuc慢病毒颗粒(PerkinElmer，Waltham，MA)建立表达荧光素酶的MC38(小鼠结肠癌)、LL/2(Lewis肺癌)和TRAMP-C2(前列腺癌)小鼠细胞系(ATCC，Manassas，VA.分别为MC38-luc、LL/2-luc和TRAMP-C2-luc)。利用10次传代证实了荧光素酶高表达。表达IL-2依赖性表达CD25的小鼠T淋巴细胞HT-2克隆A5E细胞(HT-2-A5E)来自ATCC。在补充有10％胎牛血清和100IU/mL青霉素/100μg/mL链霉素(Thermo FisherScientific Inc.)的RPMI 1640培养基(Thermo Fisher Scientific Inc.，Rockford，IL)中培养细胞。对于HT-2-A5E细胞培养物，还加入0.05mM 2-巯基乙醇和0.1nM人IL-2(Roche，Nutley，NJ)。
制备抗-CD25-F(ab')2和对照-F(ab')2
在37℃下，通过使用固定化的无花果蛋白酶(Thermo Fisher Scientific Inc.)在含有4mM半胱氨酸和5mM乙二胺四乙酸的10mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中消化整个抗体26小时而产生作为对照(对照-F(ab')2)的抗小鼠CD25抗体(PC-61.5.3，抗CD25-F(ab')2)和大鼠-IgG1的F(ab')2片段。消化后，使用G2000SWxL柱和磷酸盐缓冲盐水(PBS)作为洗脱液(流速：0.5ml/min)通过高效液相色谱法(HPLC)纯化F(ab')2。
将IR700缀合至抗-CD25-F(ab')2或对照-F(ab')2
在室温下，用0.3ml的0.1mol/L Na2HPO4(pH8.6)中的IR700NHS酯(45.5nmol，LI-CORBioscience)将抗-CD25-F(ab')2或对照-F(ab')2(9.1nmol)孵育1小时。用Sephadex G25柱(PD-10；GE Healthcare，Piscataway，NJ)纯化混合物。通过使用8453值系统(AgilentTechnologies，Santa Clara，CA)测量在595nm处的吸收，使用考马斯加蛋白质测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific Inc.)测定蛋白质浓度。通过测量689nm处的吸收来确定IR700的浓度，并计算与每个F(ab')2分子相缀合的荧光团分子的数量。进行缀合以使平均三个IR700分子结合至单个F(ab')2。
使用SDS-PAGE来确认IR700缀合的F(ab')2的完整性，并且通过检查其与HT-2-A5E细胞的结合来确认生物活性。在37℃下，用抗-CD25-F(ab')2-IR700(10μg/mL)在培养基中孵育细胞(1×105)1至6小时。为了验证结合的特异性，通过添加过量未经处理的抗-CD25抗体(50μg)进行竞争测定。使用CellQuest软件(BD BioSciences)通过流式细胞术(FACSCalibur，BD BioSciences，San Jose，CA)分析细胞。
荧光显微镜
将抗-CD25-F(ab')2-IR700用10μg/mL的10,000HT-2-A5E细胞孵育6小时，用PBS洗涤，并添加2μg/mL的碘化丙锭(PI)(Life Technologies)30分钟。然后将细胞暴露于近红外(NIR)光(4J/cm2)，并使用具有用于IR700荧光的滤波器设备(590-650nm激发滤波器；665-740nm带通发射滤波器)的荧光显微镜(IX61；Olympus America，Melville，NY)获得系列图像。使用ImageJ软件分析图像。
体外NIR-PIT
将10万个HT-2-A5E细胞接种到24孔板中，并在37℃下用10μg/mL的抗-CD25-F(ab')2-IR700孵育6小时。用PBS洗涤细胞后，加入不含酚红的培养基。然后，用发出670至710nm波长的光的NIR LED(L690-66-60；Marubeni America Co.，Santa Clara，CA)辐照细胞。用光学功率计(PM 100，Thorlabs，Newton，NJ)测量实际功率密度(mW/cm2)。为了确定PIT的细胞毒性作用，在辐照后1小时将PI加入到细胞悬液(最终2μg/mL)中，在室温下孵育30分钟，并然后通过流式细胞术分析经PI染色的(死亡)细胞。
动物和肿瘤模型
将六百万个MC38-luc、LL/2-luc细胞或八百万个TRAMP-C2-luc细胞接种到11至15周龄的C57BL/6小鼠或干扰素γ缺陷型(IFNγ-KO)小鼠(Jackson Laboratory，BarHarbor，ME)的右/左背部。实验中使用具有约150mm3(直径6至7mm)的肿瘤的小鼠(接种后约5至7天)。剃刮小鼠的肿瘤部位以进行辐照和图像分析。
使用C57BL/6白化小鼠进行反复局部NIR-PIT，因为C57BL/6小鼠在剃刮后4天内开始具有皮肤色素沉着，并且不适合用于检测萤光素酶活性的实验。每天监测小鼠，并且每周测量肿瘤体积三次，直到肿瘤(当小鼠具有多个肿瘤时的任何肿瘤)直径达到2cm，随后用二氧化碳对小鼠进行安乐死。
体内IR700-荧光成像
用荧光成像仪(Pearl Imager，LI-COR Bioscience)连续采集治疗前后的IR700-荧光图像。
体内局部靶向CD25的NIR-PIT
在对具有一个肿瘤的小鼠进行肿瘤接种后6天或对带有多个肿瘤的小鼠进行肿瘤接种后7天对肿瘤处进行局部靶向CD25的NIR-PIT。除非另有说明，否则向小鼠的右侧肿瘤注射100μg抗-CD25-F(ab')2-IR700或对照-F(ab')2-IR700，并在次日用100J/cm2的NIR光进行辐照。
肿瘤浸润和脾肺淋巴细胞分析
为了确定抗-CD25-F(ab')2的施用对CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的全身性作用，向小鼠静脉内注射100μg的抗-CD25-F(ab')2或抗-CD25-IgG，并在1天后分析脾细胞的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞。为了确定抗-CD25-F(ab')2-IR700NIR-PIT对各种淋巴细胞的作用，在NIR-PIT后的指定时间收集肿瘤和脾脏。为了检查局部靶向CD25的NIR-PIT的潜在副作用，在治疗后1天收集肺。通过将切下的组织通过70μm过滤器，然后进行聚蔗糖离心，制备单细胞悬浮液。
用抗CD3e(145-2C11)、CD8a(53-6.7)、CD4(RM4-5)、CD25(3C7)、NK1.1(PK136)、CD19(1D3)、CD11c(N418)、CD11b(M1/70)、Ly-6C(HK1.4)、Ly-6G(1A8-Ly6g)、CD86(GL1)、CD40(3/23)和H-2Kb(AF6-88.5)的抗体对细胞进行染色。按照制备说明书，使用Foxp3/转录因子固定/通透化浓缩物和稀释剂(Affymetrics)和针对Foxp3(FJK-16s)、IFNγ(XMG1.2)和IL-2(JES6-5H4)的抗体进行Foxp3和细胞内细胞因子染色。所有抗体均来自Affymetrics(San Diego，CA)。将染色的细胞应用于流式细胞仪，并用FlowJo软件(FlowJo LLC，Ashland，OR)分析数据。
血清、组织和瘤内细胞因子分析
按照描述进行肿瘤接种和治疗。在对LL/2-luc肿瘤进行局部靶向CD25的NIR-PIT之前和之后的1.5小时和1天，从小鼠中连续收集血清。收获肿瘤并将通过具有完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的PBS中的70μm过滤器的切下的组织传代来制备单细胞悬浮液。接下来，将它们以5000rpm离心15分钟，并收集上清液并以0.2μm过滤。收获肺或肠并以相同的方式制备样品。使用BCA测定法(Thermo Fisher Scientific Inc.)将所有样品的蛋白质浓度标准化，并通过EVE Technologies(Calgary，AB，Canada)用小鼠细胞因子阵列/趋化因子阵列分析各种细胞因子和趋化因子的浓度。
体内NK细胞和CD8T细胞的免疫消耗和IFNγ的中和
从PIT之前2天开始，每2天分别以25μg、50μg、100μg的剂量腹膜内注射抗-NK1.1(PK136)或抗-CD8a(2.43)消耗抗体或抗-IFNγ(XMG1.2)中和抗体，直到小鼠被安乐死(参见方案，图23A)。所有抗体均来自BioXCell。
统计
数据表示为来自最少四个实验的平均值±标准差，另有说明除外。用统计程序(GraphPad Prism；GraphPad Software，La Jolla，CA)进行统计学分析。对于两组比较，使用Mann-Whitney检验或不成对t检验。对于多组比较，使用Tukey's检验或Dunnett's检验的单因素方差分析(ANOVA)。使用Kaplan-Meier生存曲线分析评估每组中的累积生存可能性，在此确定为肿瘤直径未达到2cm，并将结果与对数秩检验和Wilcoxon检验进行比较。认为P<0.05表示统计学显著性差异。
实施例2
抗-CD25-F(ab')2-IR700的制备
如图1所示产生作为对照的抗小鼠CD25抗体(抗-CD25-F(ab')2)或大鼠-IgG1的F(ab')2片段。所得F(ab')2片段不具有Fc部分，且因此不会在体内产生显著的ADCC应答。
如实施例1中所述将所得抗-CD25-F(ab')2抗体片段与IR700相缀合。所得缀合物(抗-CD25-F(ab')2-IR700)用于下述实验中，其中每一个F(ab')2具有约三个IR700分子。
实施例3
体外表征抗-CD25-F(ab')2-IR700
为了避免Fc介导的抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)，从抗-CD25抗体(抗CD25-F(ab')2)和对照IgG抗体(对照-F(ab')2)产生F(ab')2。使用具有超过90％纯度(约97％)的高效液相色谱法(HPLC)纯化两种F(ab')2且与IR700染料缀合(分别为抗-CD25-F(ab')2-IR700和对照-F(ab')2-IR700)(图2A和2B)。抗-CD25-F(ab')2-IR700证明了与在小鼠T淋巴细胞HT-2克隆株A5E(HT-2-A5E)细胞上表达的CD25特异性地结合(图2C)。这些结果表明抗-CD25-F(ab')2的生物活性和特异性在消化、纯化和缀合过程中保持不变。
通过对小鼠施用抗-CD25-F(ab')2(100μg)并在1天后分析脾CD4+CD25+Foxp3+Treg来确认不存在全身性ADCC或CDC作用。虽然施用完整的抗-CD25-IgG引起CD4T细胞中Treg频率的降低，但Fc缺陷型抗-CD25-F(ab')2的施用不显著消耗Treg(图3A)。用针对HT-2-A5E细胞的抗-CD25-F(ab')2-IR700的体外NIR-PIT诱导细胞溶胀和泡形成(图3B)，以轻剂量依赖性方式导致坏死性细胞死亡(图3C和图4A-4B)。未观察到与单独的NIR-光、单独的抗-CD25-F(ab')2-IR700孵育或对照-F(ab')2-IR700孵育和NIR光(图3C)相关的显著细胞毒性。
因此，抗-CD25-F(ab')2-IR700化合物在体外有效诱导表达CD25的细胞的坏死性细胞死亡。
实施例4
CD4+CD25+Foxp3+Treg在肿瘤中是丰富的
Treg在各种癌症中是丰富的(Colombo和Piconese，Nat.Rev.Cancer7：880-887,2007)。对CD4T细胞中CD25+Foxp3+Treg级分的流式细胞术分析表明，与正常脾脏相比，LL/2-luc(Lewis肺癌)和MC38-luc(结肠癌)肿瘤内的该细胞群增加(5A)。CD8T细胞和NK细胞在肿瘤内也很普遍，其在活化之前是CD25阴性的(图6)。抗-CD25-F(ab')2-IR700不结合肿瘤细胞(图7)。这些数据表明CD4+CD25+Foxp3+Treg在肿瘤内是常见的，并因此是抗-CD25-IR700NIR-PIT的靶标。
实施例5
体内靶向CD4+CD25+Foxp3+Treg的NIR-PIT诱导被治疗的肿瘤消退
使用针对LL/2-luc侧腹肿瘤中的肿瘤内Treg的抗-CD25-IR700(靶向CD25的NIR-PIT)确定体内局部NIR-PIT的作用(图5B)。NIR光剂量递增研究表明，在30分钟内以100J/cm2的光功率发生CD4T细胞中CD25+Foxp3+Treg超过85％的消耗(图8)。用这种轻量剂量，观察到肿瘤中CD4+Foxp3+细胞数量的减少(图9)，这表明该观察不仅仅是Treg上CD25表达的下调，而且是细胞的实际消耗。因此，这种光剂量被选择用于体内治疗。该光剂量被认为是非热量的，并且在暴露于皮肤或肿瘤时不会导致局部过热。
具有LL/2-luc肿瘤的实验组小鼠接受抗-CD25-F(ab')2-IR700注射，然后接受NIR-光暴露(“PIT”组)。该组示出，与三个对照度相比，如第一天的生物发光成像(BLI)所示肿瘤的荧光素酶活性降低，所示三个对照组为：未经处理的小鼠、接受对照-F(ab')2-IR700与NIR-光的小鼠和仅接受抗-CD25-F(ab')2-IR700但不接受光的小鼠(图5C和5D)。对荧光素酶活性的定量分析显示治疗后2天PIT组中的RLU(相对光单位)显著降低(*p<0.05)，而其他组随着肿瘤生长逐渐增加(图5D)。与BLI数据一致，PIT组中的肿瘤生长也受到抑制(图5E)，导致与对照组相比显著延长的小鼠存活(*p<0.0001)(图5F)。在肿瘤接种后多达14天内，小鼠的体重(BW变化)示出组间无显著差异(图5G)。处理后0.5小时肿瘤浸润淋巴细胞和脾淋巴细胞的分析证实CD4+CD25+Foxp3+Treg的消耗仅限于肿瘤，并且其不显著影响CD8T细胞和NK细胞(图5H和5I)。当用局部靶向CD25的NIR-PIT处理MC38-luc侧腹肿瘤时观察到类似的发现(图10A-10H)。此外，在TRAMP-C2-luc前列腺癌模型中观察到增加的肿瘤浸润Treg，并且在该模型中靶向CD25的NIR-PIT成功地诱导了抗肿瘤作用(图11A-11D)。这些数据表明，靶向CD4+CD25+Foxp3+Treg的NIR-PIT局部和特异性地消耗这些细胞，然后减少肿瘤并延长存活时间，而与癌症类型无关。
肿瘤内Treg耗竭持续约4天，此后Treg逐渐重新分布，在治疗后约6天达到治疗前水平(图12A)。还观察到逐渐的肿瘤再生长(图5E)。用靶向CD25的NIR-PIT反复治疗诱导延长的肿瘤抑制和存活(图12B-12F)。
实施例6
肿瘤的体内局部靶向CD25的NIR-PIT诱导肿瘤浸润CD8T细胞和NK细胞的快速活化以及抗原呈递细胞的活化
为了阐明用局部靶向CD25的NIR-PIT特异性消耗肿瘤浸润性Treg如何导致肿瘤消退，确定肿瘤内CD8T细胞和NK细胞在NIR-PIT后是否被活化。
早在治疗后1.5小时，CD8T细胞和NK细胞开始产生干扰素γ(IFNγ)和白细胞介素-2(IL-2)并暴露CD107a，其表明肿瘤细胞的活化和杀伤(图13A)。在治疗后1天，在这些效应细胞上观察到CD69和CD25的上调和IL-2的产生(图13B)，然而，局部靶向CD25的NIR-PIT没有消耗效应细胞，在NIR-PIT之前CD25是阴性的，并且仅在NIR治疗后开始表达CD25(图5I和13B)。因此，NIR-PIT消耗Treg导致肿瘤浸润性CD8T细胞和NK细胞的快速活化，其导致肿瘤消退。在反复的NIR-PIT方案中局部靶向CD25的NIR-PIT之前和之后的CD25表达水平的比较显示在每次PIT治疗后CD25的上调(图14A-14C)。在从第一次PIT开始的4天间隔后进行第二次PIT时，CD25已经下调至治疗前水平。
确定肿瘤内的抗原呈递细胞(APC)是否在Treg的PIT上被活化。在肿瘤中发现的树突状细胞(DC)表达相对高的MHC I分子，然而，局部靶向CD25的NIR-PIT诱导其进一步上调(图15A)。该上调伴随着共刺激分子例如CD86和CD40的上调(图15A)。该活化可能是由于它们暴露于死亡Treg的成分以及还由CD8T细胞和NK细胞杀伤的肿瘤细胞的成分引起的。其他APC例如B细胞、单核细胞和巨噬细胞也表现出CD69的上调，表明它们在局部靶向CD25的NIR-PIT后活化(图15B-15D)。这些发现表明，在靶向Treg的PIT后，肿瘤细胞被效应细胞杀伤，其涉及APC介导的“多抗原疫苗效应”。治疗后也检测到被治疗的肿瘤内的粒细胞增加(图16)。
实施例7
局部靶向CD25的NIR-PIT诱导全身性和瘤内细胞因子风暴
研究局部靶向CD25的NIR-PIT诱导的血清和肿瘤内细胞因子和趋化因子水平的变化。首先，确认NIR光辐照对肿瘤的作用可以忽略不计(图17A和17B)。在治疗后1.5小时，血清和肿瘤中广泛的细胞因子和趋化因子增加(图18A和18B)。NIR-PIT后升高的细胞因子和趋化因子与临床“细胞因子风暴”中报道的那些广泛重叠(34，35)。在治疗次日，除G-CSF外，细胞因子和趋化因子水平突然降低(图18C和18D)。呈现出血清和肿瘤中IFNγ、IL-6、G-CSF浓度的变化(图18E-18J)。
这些数据表明，局部靶向CD25的NIR-PIT导致细胞因子和趋化因子快速但短暂地释放到血清中，在治疗后第1天减少。经历局部靶向CD25的NIR-PIT的小鼠的肺中的淋巴细胞在治疗后第1天没有显示出IFNγ产生的迹象(图19)，并且在治疗次日，肺和肠两者中的IFNγ浓度低于可检测水平。
实施例8
靶向CD25的NIR-PIT的治疗作用以肿瘤特异性方式扩展至远处未经处理的肿瘤
确定经PIT处理的肿瘤的快速抗肿瘤免疫活化和消退是否能够使活化的细胞毒性效应细胞攻击远离经NIR-PIT处理的病变的其他肿瘤位置。局部靶向CD25的NIR-PIT仅对具有双侧LL/2-luc侧腹肿瘤的小鼠的右侧肿瘤进行，而左侧肿瘤被遮光(图20A和20B)。在进行NIR-PIT之前用荧光图像证实了该遮蔽，证明了在两种肿瘤中都存在IR700-荧光，但由于漂白辐照后在PIT-处理侧的荧光立即下降(图21)。在未经处理的左侧，在对侧NIR-PIT后IR700-荧光被维持。然而，在右侧(经PIT处理侧)肿瘤和未接受NIR光的左侧肿瘤二者上肿瘤生物发光显著降低(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.05)。与经PIT处理的肿瘤相比，该未经处理的肿瘤遵循类似的缓慢生长曲线(图20C-20E)。
与对照组相比，局部靶向CD25的NIR-PIT组的小鼠的存活显著延长(*p<0.0001)(图20F)。BW测量显示经局部靶向CD25的NIR-PIT处理的小鼠在处理后1至3天体重增加(图20G)，这可能是由于两侧腹的水肿(图20H)，其在约第4天时得到解决(图20G)。肿瘤浸润性CD4+CD25+Foxp3+Treg仅在经NIR-PIT处理的肿瘤中降低(图20I)。在模拟多种转移的动物模型中，针对一种肿瘤的靶向局部CD25的NIR-PIT在相同细胞类型的远处未经处理的肿瘤中诱导了抗肿瘤作用。在这些部位也注意到水肿(图20J和22)。此外，与用NIR光辐照的对照-F(ab')2-IR700施用相比，在NIR-PIT 1天后，接种在经PIT处理的肿瘤的对侧的肿瘤受到抑制(图23A和23B)。当在小鼠左侧接种不同细胞类型(MC38-luc)的肿瘤并且NIR-PIT针对右侧LL/2-luc肿瘤时，观察到MC38-luc肿瘤的最小变化(图20K)。
这些数据表明，局部靶向CD25的NIR-PIT对远处的肿瘤具有细胞类型特异性抗肿瘤作用。
实施例9
表达活化标志物的CD8T细胞和NK细胞在靶向CD25的NIR-PIT之后存在于未经辐照的肿瘤中
确定对对侧肿瘤上进行CD25靶向的NIR-PIT后，未经辐照的肿瘤是否含有活化的CD8T细胞和NK细胞。在局部靶向CD25的NIR-PIT后一天，在未经辐照的肿瘤内鉴定出产生IFNγ和IL-2并表达上调的活化标志物CD69和CD25的CD8T细胞和NK细胞(图24A-24D)。对未经辐照肿瘤的细胞因子和趋化因子水平的分析还表明G-CSF、IFNγ、IL-2、MCP-1、MIP-2和MIP-1α的增加(图25A-25C)。总体而言，由右侧的靶向CD25的NIR-PIT引发的免疫应答引起位于对侧的未经处理的肿瘤的类似变化。
实施例10
CD25靶向的NIR-PIT的抗肿瘤作用部分地取决于CD8T细胞和NK细胞以及IFNγ产生。
为了进一步阐明效应细胞在局部靶向CD25的NIR-PIT的治疗功效中的作用，通过反复地全身施用抗-NK1.1或抗-CD8抗体来消耗NK细胞或CD8T细胞，或者通过反复注射抗-IFNγ抗体中和IFNγ(图26A)。如具有定量萤光素酶活性的BLI以及肿瘤生长和小鼠存活数据所证明的，NK细胞和CD8T细胞二者的消耗和IFNγ的中和减弱了靶向CD25的NIR-PIT的效力(图26B-26E)。BW测量显示组间没有差异(图26F)。当使用IFNγ缺陷型(IFNγ-KO)小鼠时，再现了IFNγ中和抗体对靶向CD25的NIR-PIT的抑制作用(图27A-27F)。
这些数据表明，局部靶向CD25的NIR-PIT的抗肿瘤效力至少部分地由NK细胞、CD8T细胞和IFNγ产生介导，并且可能由所有这些因子的组合介导。
实施例11
人中肿瘤的处理
在一个实施例中，CD25抗体是达珠单抗(人源化的IgG1，例如来自Hoffmann-LaRoche)。在一个实施例中，CD25抗体是巴利昔单抗(例如来自Novartis的嵌合小鼠-人IgG1)。例如使用实施例1中描述的方法或胃蛋白酶，可修饰那些FDA批准的和/或商业上可获得的抗体以去除或以其他方式使其Fc区失活。使用实施例1中描述的方法可将抗体缀合至IR700。
将所得的达珠单抗-F(ab')2-IR700和/或巴利昔单抗-F(ab')2-IR700化合物以50mg或100mg的剂量(例如，静脉内、腹膜内或瘤内)施用于患有癌症的人(或其他大型哺乳动物，例如狗)。施用后至少4小时(例如至少6小时、至少8小时、至少12小时或至少24小时，例如4至12小时或6至18小时)，随后以至少4J/cm2(例如4至8J/cm2)的剂量用NIR光辐照患者和/或肿瘤。在一些实施例中，进行多轮施用达珠单抗-F(ab')2-IR700和/或巴利昔单抗-F(ab')2-IR700化合物，随后用NIR光辐照，例如至少两次、至少三次、至少四次、至少五次或至少十次。
将监测对象的癌症减轻情况。
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考虑到可以应用本公开的原理的许多可能的实施方案，应当认识到，示出的实施方案仅是本公开的实施例，并且不应被视为限制本发明的范围。相反，本发明的范围由所附权利要求限定。因此，我们要求本发明保护属于这些权利要求的范围和精神的范围内的全部内容。

Claims (24)

1.一种杀伤抑制细胞的方法，包括：
使包含抑制细胞表面蛋白的抑制细胞与治疗有效量的一种或多种抗体-IR700分子接触，其中所述抗体特异性地结合所述抑制细胞表面蛋白，
其中所述抗体不包含功能性Fc区；和/或
其中所述抑制细胞表面蛋白是以下中的一种或多种：分化簇4(CD4)、4型C-X-C趋化因子受体(CXCR4)、4型C-C趋化因子受体(CCR4)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、糖皮质激素诱导的TNF受体(GITR)、OX40、叶酸受体4(FR4)、CD16、CD56、CD8、CD122、CD23、CD163、CD206、CD11b、Gr-1、CD14、白细胞介素4受体α链(IL-4Ra)、白细胞介素-1受体α(IL-1Rα)、白细胞介素-1诱饵受体、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、CD103、CXCR2、CD33和CD66b；和/或
其中所述抑制细胞表面蛋白包含CD25并且所述抗体不包含功能性Fc区；
以660至740nm的波长和至少4J cm-2的剂量辐照所述抑制细胞；从而杀伤所述抑制细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述抑制细胞是CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)、II型天然杀伤T细胞(NKT)、CD8+CD122+Treg、M2巨噬细胞、肿瘤浸润性成纤维细胞、髓系来源的抑制细胞或其组合。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述抑制细胞表面蛋白不是CD25。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中：
所述抑制细胞是CD4+CD25+Foxp3+Treg，并且所述抑制细胞表面蛋白是CD25、CD4、GITR、OX40、FR4、CXCR4、CCL4、CTLA4和CD103中的一种或多种；
所述抑制细胞是II型NKT细胞，并且所述抑制细胞表面蛋白是CD16和CD56中的一种或多种，
所述抑制细胞是CD8+CD122+Treg，并且所述抑制细胞表面蛋白是CD8和CD122中的一种或多种；
所述抑制细胞是M2巨噬细胞，并且所述抑制细胞表面蛋白是CD23、CD163、CD206、CD11b、Gr-1、CD14、IL-4Ra、IL-1Ra和白细胞介素-1诱饵受体中的一种或多种；
所述抑制细胞是肿瘤浸润性成纤维细胞，并且所述抑制细胞表面蛋白是成纤维细胞活化蛋白(FAP)；或
所述抑制细胞是髓系来源的抑制细胞，并且所述抑制细胞表面蛋白是CXCR2、CD33、CD14、CD66b和CD11b中的一种或多种。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述抗体是一个或多个Fab'和/或F(ab')2片段。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述抗体-IR700分子包含抗-CD25-F(ab')2-IR700分子。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中以680nm的波长对所述抑制细胞进行辐照。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述一种或多种抗体-IR700分子包含至少两种不同的抗体-IR700分子，其中第一抗体-IR700分子对第一抑制细胞表面蛋白具有特异性，且第二抗体-IR700分子对所述第一抑制细胞表面蛋白的不同表位具有特异性或对第二抑制细胞表面蛋白具有特异性。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述抑制细胞在对象体内，并且使所述抑制细胞与所述一种或多种抗体-IR700分子接触包括向所述对象施用治疗有效量的所述一种或多种抗体-IR700分子。
10.根据权利要求9所述的方法，还包括：
向所述对象施用治疗有效量的一种或多种其它化学治疗剂、生物制剂或放射剂。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述方法治疗肿瘤。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述肿瘤是癌症。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、脑癌、子宫颈癌、骨癌、皮肤癌、头颈癌或肺癌。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述癌症是血液癌症。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述癌症是转移性癌症。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述抑制细胞在对象体内，并且辐照所述抑制细胞包括：
辐照所述对象；和/或
辐照所述对象体内的肿瘤。
17.根据权利要求9至16中任一项所述的方法，其中相对于无治疗，所述方法将所述肿瘤的重量、体积或尺寸减少至少25％。
18.根据权利要求9至17中任一项所述的方法，其中所述方法将未经660至740nm的波长辐照的转移的重量、体积或尺寸减小至少25％。
19.根据权利要求9至18中任一项所述的方法，其中相对于无所述抗体-IR700施用和辐照，所述方法增加所述对象的存活时间。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中辐照所述抑制细胞包括通过使用由对象穿戴的装置来辐照血液，其中所述装置包括近红外(NIR)发光二极管(LED)。
21.抗体-IR700分子，其中所述抗体特异性地结合抑制细胞表面蛋白，
其中所述抗体不包含功能性Fc区；和/或
其中所述抑制细胞表面蛋白是以下中的一种或多种：CD4、糖皮质激素诱导的TNF受体(GITR)、OX40、叶酸受体4(FR4)、4型C-X-C趋化因子受体(CXCR4)、趋化因子(CC基序)配体4(CCL4)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、CD16、CD56、CD8、CD122、CD23、CD163、CD206、CD11b、Gr-1、CD14、白细胞介素4受体α链(IL-4Ra)、白细胞介素-1受体α(IL-1Ra)、白细胞介素-1诱饵受体、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、CXCR2、CD33和CD66b；和/或
其中所述抑制细胞表面蛋白包含CD25并且所述抗体不包含功能性Fc区。
22.根据权利要求21所述的抗体-IR700分子，其中所述抑制细胞表面蛋白不是CD25。
23.根据权利要求21或22所述的抗体-IR700分子，其中所述抗体是一个或多个Fab'和/或F(ab')2片段。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的抗体-IR700分子，其中抗体与IR700的比率为约1：3。
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